Comportement des nanoparticules de silice en milieu biologique ...
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tel-00836093, version 1 - 20 Jun 2013<br />
Chapitre 6 : Protocoles expérim<strong>en</strong>taux<br />
Après marquage, les lames sont montées avec lamelles avec une solution SlowFa<strong>de</strong> ® Gold<br />
Antifa<strong>de</strong> Reag<strong>en</strong>t. Les lames sont <strong>en</strong>suite observées à l’ai<strong>de</strong> d’un microscope à fluoresc<strong>en</strong>ce<br />
Zeiss équipé d’une caméra et d’un ApoTome. Les différ<strong>en</strong>ts marqueurs sont repérés <strong>en</strong><br />
utilisant les filtres décrits dans le tableau 6.3.<br />
Filtre Maximum<br />
d’excitation<br />
Largeur<br />
d’excitation<br />
Maximum<br />
d’émission<br />
Largeur<br />
d’émission<br />
Fluorophore<br />
Filtre 43 545 nm 25 nm 605 nm 70 nm Alexa Fluor 555<br />
Filtre 44 475 nm 40 nm 530 nm 50 nm FITC<br />
Filtre 49 365 nm 445 nm 50 nm DAPI<br />
Tableau 6-3: Description <strong><strong>de</strong>s</strong> filtres <strong>de</strong> fluoresc<strong>en</strong>ce utilisés pour les différ<strong>en</strong>ts marqueurs<br />
(iii) Microscopie électronique<br />
Lysos<strong>en</strong>sor<br />
La microscopie électronique permet <strong>de</strong> visualiser la localisation intracellulaire précise <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
<strong>nanoparticules</strong>, leur aspect, l’évolution <strong>de</strong> leur taille au cours du temps et le nombre <strong>de</strong><br />
particules internalisées.<br />
Pour pouvoir être observés <strong>en</strong> microscopie électronique <strong>en</strong> transmission, les échantillons<br />
<strong>biologique</strong>s doiv<strong>en</strong>t être stabilisés par fixation chimique et déshydratation. De plus, les tissus<br />
organiques ayant une faible <strong>de</strong>nsité électronique offr<strong>en</strong>t un contraste trop faible pour être<br />
observés directem<strong>en</strong>t. Il est donc nécessaire <strong>de</strong> leur ajouter <strong><strong>de</strong>s</strong> atomes lourds lors <strong>de</strong> la<br />
fixation pour apporter une <strong>de</strong>nsité électronique importante qui permet <strong>de</strong> les visualiser.<br />
Fixation chimique : cette étape permet <strong>de</strong> figer la structure microscopique <strong><strong>de</strong>s</strong> échantillons à<br />
observer. Le fixateur utilisé est une solution <strong>de</strong> glutaraldéhy<strong>de</strong> à 2,5% dans un tampon<br />
cacodylate (0,033 M, pH 7,4). Ce réactif permet <strong>de</strong> ponter les groupem<strong>en</strong>ts amines libres <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
protéines (collagène et cellules). La fixation est faite p<strong>en</strong>dant 1 heure à 4°C. Puis l’échantillon<br />
est rincé dans trois bains d’un mélange tampon cacodylate (0,05 M, pH 7,4)/saccharose 0,3 M<br />
(tampon <strong>de</strong> rinçage).<br />
Une <strong>de</strong>uxième fixation est effectuée avec du tetraoxy<strong>de</strong> d’osmium. Ce <strong>de</strong>rnier permet <strong>de</strong> créer<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> ponts <strong>en</strong>tre protéines <strong>en</strong> réagissant avec les doubles liaisons, permettant ainsi <strong>de</strong> conserver<br />
les structures et notamm<strong>en</strong>t les membranes. Par ailleurs, l’osmium étant un atome lourd, il<br />
diffuse fortem<strong>en</strong>t les électrons, apportant ainsi un contraste à l’échantillon. En pratique, les<br />
pièces à inclure, déjà fixées au glutaraldéhy<strong>de</strong> sont placées p<strong>en</strong>dant une heure à 4°C dans une<br />
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