Comportement des nanoparticules de silice en milieu biologique ...

tel-00836093, version 1 - 20 Jun 2013
Chapitre 6 : Protocoles expérimentaux
Après marquage, les lames sont montées avec lamelles avec une solution SlowFade ® Gold
Antifade Reagent. Les lames sont ensuite observées à l’aide d’un microscope à fluorescence
Zeiss équipé d’une caméra et d’un ApoTome. Les différents marqueurs sont repérés en
utilisant les filtres décrits dans le tableau 6.3.
Filtre Maximum
d’excitation
Largeur
d’excitation
Maximum
d’émission
Largeur
d’émission
Fluorophore
Filtre 43 545 nm 25 nm 605 nm 70 nm Alexa Fluor 555
Filtre 44 475 nm 40 nm 530 nm 50 nm FITC
Filtre 49 365 nm 445 nm 50 nm DAPI
Tableau 6-3: Description des filtres de fluorescence utilisés pour les différents marqueurs
(iii) Microscopie électronique
Lysosensor
La microscopie électronique permet de visualiser la localisation intracellulaire précise des
nanoparticules, leur aspect, l’évolution de leur taille au cours du temps et le nombre de
particules internalisées.
Pour pouvoir être observés en microscopie électronique en transmission, les échantillons
biologiques doivent être stabilisés par fixation chimique et déshydratation. De plus, les tissus
organiques ayant une faible densité électronique offrent un contraste trop faible pour être
observés directement. Il est donc nécessaire de leur ajouter des atomes lourds lors de la
fixation pour apporter une densité électronique importante qui permet de les visualiser.
Fixation chimique : cette étape permet de figer la structure microscopique des échantillons à
observer. Le fixateur utilisé est une solution de glutaraldéhyde à 2,5% dans un tampon
cacodylate (0,033 M, pH 7,4). Ce réactif permet de ponter les groupements amines libres des
protéines (collagène et cellules). La fixation est faite pendant 1 heure à 4°C. Puis l’échantillon
est rincé dans trois bains d’un mélange tampon cacodylate (0,05 M, pH 7,4)/saccharose 0,3 M
(tampon de rinçage).
Une deuxième fixation est effectuée avec du tetraoxyde d’osmium. Ce dernier permet de créer
des ponts entre protéines en réagissant avec les doubles liaisons, permettant ainsi de conserver
les structures et notamment les membranes. Par ailleurs, l’osmium étant un atome lourd, il
diffuse fortement les électrons, apportant ainsi un contraste à l’échantillon. En pratique, les
pièces à inclure, déjà fixées au glutaraldéhyde sont placées pendant une heure à 4°C dans une
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