Comportement des nanoparticules de silice en milieu biologique ...
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tel-00836093, version 1 - 20 Jun 2013<br />
(i) Exposition <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules aux <strong>nanoparticules</strong><br />
Chapitre 6 : Protocoles expérim<strong>en</strong>taux<br />
Après culture et comptage, les cellules sont incubées soit sur <strong><strong>de</strong>s</strong> lamelles <strong>de</strong> verre dans <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
plaques 24 puits, à une <strong>de</strong>nsité <strong>de</strong> 10 000 cellules par puits, pour les observations <strong>en</strong><br />
microscopie à fluoresc<strong>en</strong>ce, soit dans <strong><strong>de</strong>s</strong> boîtes <strong>de</strong> culture <strong>de</strong> 25 cm 2 , 100 000 cellules par<br />
boîte, pour <strong><strong>de</strong>s</strong> observations <strong>en</strong> MET. Après 24 heures passées dans l’incubateur, pour laisser<br />
le temps aux cellules d’adhérer sur le support <strong>de</strong> culture, le <strong>milieu</strong> recouvrant les cellules est<br />
remplacé par une susp<strong>en</strong>sion à 0,6 mg/mL <strong>de</strong> particules dans le <strong>milieu</strong> complet sans rouge<br />
phénol (DMEM sans rouge phénol complém<strong>en</strong>té par 10% <strong>de</strong> SVF, une solution <strong>de</strong><br />
pénicilline/ streptomycine (<strong>en</strong> conc<strong>en</strong>tration finale <strong>de</strong> 100 U/mL et 100 µg/mL<br />
respectivem<strong>en</strong>t), 1% d’une solution d’antifungique et 1% <strong>de</strong> GlutaMax). Le volume <strong>de</strong><br />
susp<strong>en</strong>sion ajouté est <strong>de</strong> 1,0 mL par puits dans les plaques 24 puits et <strong>de</strong> 5,0 mL dans les<br />
boîtes <strong>de</strong> culture. Aux différ<strong>en</strong>ts temps d’étu<strong>de</strong>, les cellules sont fixées, comme décrit ci-<br />
après, pour être observées.<br />
(ii) Microscopie à fluoresc<strong>en</strong>ce<br />
Les cellules sont fixées 1 heure avec du PFA (4% dans du PBS 1X) à 4°C avant d’être<br />
observées. L’internalisation est mise <strong>en</strong> évi<strong>de</strong>nce avec un marqueur membranaire : WGA<br />
Alexa Fluor 555. Après fixation, les cellules sont placées dans du tampon HBSS 1X (KCl 0,4<br />
g/L, KH2PO4 0,06 g/L, NaCl 8,0 g/L, Na2HPO4.7H2O 0,09 g/L, D-glucose 1,0 g/L, H2O qsp<br />
1L) p<strong>en</strong>dant 5 minutes puis marquées avec une solution <strong>de</strong> WGA Alexa Fluor 555 à 1 µg/mL<br />
(dans HBSS 1X) p<strong>en</strong>dant 10 minutes, suivi <strong>de</strong> 3 rinçages <strong>de</strong> 5 minutes dans du tampon HBSS<br />
1X.<br />
La localisation intracellulaire <strong><strong>de</strong>s</strong> particules est mise <strong>en</strong> évi<strong>de</strong>nce à l’ai<strong>de</strong> du Lysos<strong>en</strong>sor<br />
Yellow-Blue afin <strong>de</strong> démontrer la prés<strong>en</strong>ce <strong>de</strong> <strong>nanoparticules</strong> dans <strong><strong>de</strong>s</strong> compartim<strong>en</strong>ts<br />
<strong>en</strong>dosomes-lysosomes. Pour cela, les cellules, après marquage <strong><strong>de</strong>s</strong> membranes et rinçage sont<br />
marquées avec une solution <strong>de</strong> Lysos<strong>en</strong>sor à 10 µmol/L (dans HBSS 1X). Ce marqueur<br />
s’accumule dans les organelles aci<strong><strong>de</strong>s</strong> sous l’effet <strong>de</strong> sa protonation. Cette <strong>de</strong>rnière a aussi<br />
pour résultat d’augm<strong>en</strong>ter la fluoresc<strong>en</strong>ce, qu<strong>en</strong>chée par la chaine latérale faiblem<strong>en</strong>t basique<br />
<strong>de</strong> la son<strong>de</strong> fluoresc<strong>en</strong>te.<br />
L’abs<strong>en</strong>ce <strong>de</strong> particules au niveau du noyau est mise <strong>en</strong> évi<strong>de</strong>nce par marquage <strong>de</strong> ce <strong>de</strong>rnier<br />
au DAPI (marquage 5 minutes avec une solution à 5 µg/mL) après perméabilisation <strong>de</strong> la<br />
membrane (10 minutes d’exposition à une solution <strong>de</strong> PBS 1X cont<strong>en</strong>ant 10 mg/mL <strong>de</strong> BSA<br />
et 0,5%o Triton X-100).<br />
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