Comportement des nanoparticules de silice en milieu biologique ...

tel-00836093, version 1 - 20 Jun 2013
(i) Exposition des cellules aux nanoparticules
Chapitre 6 : Protocoles expérimentaux
Après culture et comptage, les cellules sont incubées soit sur des lamelles de verre dans des
plaques 24 puits, à une densité de 10 000 cellules par puits, pour les observations en
microscopie à fluorescence, soit dans des boîtes de culture de 25 cm 2 , 100 000 cellules par
boîte, pour des observations en MET. Après 24 heures passées dans l’incubateur, pour laisser
le temps aux cellules d’adhérer sur le support de culture, le milieu recouvrant les cellules est
remplacé par une suspension à 0,6 mg/mL de particules dans le milieu complet sans rouge
phénol (DMEM sans rouge phénol complémenté par 10% de SVF, une solution de
pénicilline/ streptomycine (en concentration finale de 100 U/mL et 100 µg/mL
respectivement), 1% d’une solution d’antifungique et 1% de GlutaMax). Le volume de
suspension ajouté est de 1,0 mL par puits dans les plaques 24 puits et de 5,0 mL dans les
boîtes de culture. Aux différents temps d’étude, les cellules sont fixées, comme décrit ci-
après, pour être observées.
(ii) Microscopie à fluorescence
Les cellules sont fixées 1 heure avec du PFA (4% dans du PBS 1X) à 4°C avant d’être
observées. L’internalisation est mise en évidence avec un marqueur membranaire : WGA
Alexa Fluor 555. Après fixation, les cellules sont placées dans du tampon HBSS 1X (KCl 0,4
g/L, KH2PO4 0,06 g/L, NaCl 8,0 g/L, Na2HPO4.7H2O 0,09 g/L, D-glucose 1,0 g/L, H2O qsp
1L) pendant 5 minutes puis marquées avec une solution de WGA Alexa Fluor 555 à 1 µg/mL
(dans HBSS 1X) pendant 10 minutes, suivi de 3 rinçages de 5 minutes dans du tampon HBSS
1X.
La localisation intracellulaire des particules est mise en évidence à l’aide du Lysosensor
Yellow-Blue afin de démontrer la présence de nanoparticules dans des compartiments
endosomes-lysosomes. Pour cela, les cellules, après marquage des membranes et rinçage sont
marquées avec une solution de Lysosensor à 10 µmol/L (dans HBSS 1X). Ce marqueur
s’accumule dans les organelles acides sous l’effet de sa protonation. Cette dernière a aussi
pour résultat d’augmenter la fluorescence, quenchée par la chaine latérale faiblement basique
de la sonde fluorescente.
L’absence de particules au niveau du noyau est mise en évidence par marquage de ce dernier
au DAPI (marquage 5 minutes avec une solution à 5 µg/mL) après perméabilisation de la
membrane (10 minutes d’exposition à une solution de PBS 1X contenant 10 mg/mL de BSA
et 0,5%o Triton X-100).
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