Comportement des nanoparticules de silice en milieu biologique ...

tel-00836093, version 1 - 20 Jun 2013
Chapitre 6 : Protocoles expérimentaux
contraste de phase (Leica). Les cellules sont placées dans un incubateur maintenu à 37°C, en
atmosphère humide contenant 5% de CO2.
Lignée cellulaire et mise en culture :
Les cellules utilisées sont des fibroblastes dermiques humains normaux commerciaux
provenant de chez PromoCell et sont conservées dans l’azote liquide. Les cellules sont
multipliées en les plaçant dans des flacons de culture de 75 cm 2 dans 10 mL de milieu DMEM
complémenté par 10% de SVF, une solution de pénicilline/ streptomycine (en concentration
finale de 100 U/mL et 100 µg/mL respectivement) et 1% d’une solution d’antifungique
(amphotéricine B). Lorsque les cellules arrivent à 70-80% de confluence, elles sont détachées
des flacons de culture pour être de nouveau ensemencées à une densité d’environ 10 6 cellules
par flacon de 75 cm 2 . Pour cela, le milieu de culture est retiré et les cellules sont recouvertes
par 7 mL d’une solution PUCK’S-EDTA pendant 5 minutes afin de favoriser leur
décollement. En effet, l’EDTA chélate les ions divalents (Ca 2+ et Mg 2+ ) qui interviennent
dans l’adhésion des cellules. Après avoir retiré cette solution, les cellules sont placées dans
l’incubateur avec 1 mL d’une solution de Trypsine à 0,1% pendant 5 minutes. La Trypsine va
permettre de rompre les interactions des cellules avec le support. Après décollement, les
cellules sont remises en suspension dans 5 mL de milieu complet. Elles sont centrifugées (5
minutes à 1000 rpm) puis reprises dans 2 mL de milieu complet pour être comptées à l’aide
d’un hémacytomètre.
Solution PUCK’S-EDTA :
NaCl 8,0 g/L , KCl 0,4 g/L , Glucose 1,0 g/L, NaHCO3 0,35 g/L, EDTA 0,2 g/L, H2O Milli-Q
La solution ainsi préparée est stérilisée et conservée à 4°C.
6.2.3.2 Internalisation des nanoparticules
Après exposition aux nanoparticules (0,6 mg/mL), les cellules sont observées en microscopie
à fluorescence ainsi qu’en MET pour déterminer si les nanoparticules ont été internalisées, et
quelle est l’influence sur l’internalisation et sa cinétique des caractéristiques des particules
(taille, charge). De plus, pour déterminer la voie d’internalisation, des expériences sont
menées en présence d’inhibiteurs spécifiques.
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