Comportement des nanoparticules de silice en milieu biologique ...

tel-00836093, version 1 - 20 Jun 2013
formé.
Chapitre 6 : Protocoles expérimentaux
Dans le cas des particules incorporant de la fluorescéine, il se pose le problème de la
superposition des spectres d’absorption de la fluorescéine et de l’acide silico-molybdique. Il
est tout de même possible d’obtenir la concentration en silice dissoute en effectuant deux
mesures d’absorbance à 400 nm (acide silico-molybdique) et à 440 nm (FITC), ainsi que deux
courbes d’étalonnage. Ces deux courbes permettent d’obtenir les coefficients d’absorption
molaire de la fluorescéine et de l’acide silico-molybdique aux deux longueurs d’ondes.
A(400 nm) = CFITC*εFITC(400 nm) + CSilice*εSilice(400 nm)
A(440 nm) = CFITC*εFITC(440 nm) + CSilice*εSilice(440 nm)
On obtient donc CSilice =
€
A(440nm) *ε FITC (400nm) − A(400nm) *ε FITC (440nm)
ε Silice(440nm) *ε FITC (400nm) −ε Silice(400nm) *ε FITC (440nm)
D’après les gammes étalon, on a εFITC(400 nm) = 3,1.10 4 mol -1 .L.cm -1 , εFITC(440 nm) =
8,7.10 4 mol -1 .L.cm -1 , εSilice(400 nm) = 181 mol -1 .L.cm -1 , εSilice(440 nm) = 41 mol -1 .L.cm -1 .
6.2.2 DISSOLUTION EN MILIEU DE CULTURE
La présence de phosphates dans le milieu de culture perturbe le dosage de la silice dissoute en
réagissant avec le sel de molybdène (Thayer 1930). Le suivi de la dissolution dans le milieu
de culture s’est donc fait uniquement par suivi de la fluorescéine libérée, comme décrit
précédemment.
En parallèle, les particules sont analysées en MET au cours du temps afin de voir s’il y a
évolution de leur taille et/ou de leur structure. Les particules après 24 h, 7 et 14 jours dans le
milieu de culture à 37°C sont déposées sur une grille de cuivre recouverte d’un film de
carbone et observées sur un microscope opérant à 120 kV. Un minimum d’une centaine de
particules est mesuré pour obtenir leur taille.
6.2.3 INTERACTIONS AVEC LES CELLULES
6.2.3.1 Culture cellulaire
Toutes les manipulations de cellules sont effectuées en conditions stériles, sous une hotte à
flux laminaire. L’état des cellules est vérifié régulièrement sous un microscope inversé à
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