Comportement des nanoparticules de silice en milieu biologique ...

tel-00836093, version 1 - 20 Jun 2013
Chapitre 6 : Protocoles expérimentaux
6.2 Comportement des particules en milieu biologique
6.2.1 DISSOLUTION EN MILIEU TAMPON PH 7,4
La dissolution des particules de silice est suivie à pH 7,4 dans un tampon Tris-HCl 0,05 M, en
présence de 10 mM de KCl, concentration en K + proche de celle retrouvée dans le plasma.
Une suspension de 0,6 mg/mL de nanoparticules est mise sous agitation à 37°C dans le
tampon. La dissolution est suivie par deux méthodes : le suivi de l’intensité de fluorescence
de la fluorescéine libérée et le dosage de la silice dissoute.
6.2.1.1 Suivi par fluorescence
Aux temps prédéterminés, de 30 minutes à plusieurs jours, 400 µL de suspension sont
prélevés. L’intensité de fluorescence est mesurée directement (excitation à 485 nm) pour la
moitié du prélèvement. L’autre moitié est mesurée après centrifugation (10 000 rpm, 15
minutes) dans un tube Nanosep 3,5 kD afin d’éliminer les particules et de mesurer
uniquement l’intensité de fluorescence due à la fluorescéine libérée ou aux fragments issus de
la dissolution pouvant traverser les pores du filtre, i.e. de moins de 0,13 nm de diamètre.
6.2.1.2 Dosage de la silice dissoute
Aux temps prédéterminés, on prélève 1,0 mL de suspension pour doser la silice dissoute. Ce
dosage repose sur la capacité de l’acide silicique à réagir avec l’heptamolybdate d’ammonium
pour former un complexe coloré selon l’équation suivante :
12 H6Mo7O24 • 4H2O + 7 Si(OH)4 + 17 H2O 7 H4SiMo12O40 • 29H2O
Le complexe ainsi formé absorbe à 400 nm et peut donc être suivi par spectroscopie UV-
visible.
Protocole : 1 mL de solution à doser est dilué avec 12,5 mL d’eau Milli-Q. 500 µL d’une
solution aqueuse de molybdate d’ammonium tetrahydraté (100 g/L) sont ajoutés sous
agitation, suivis de 300 µL d’acide sulfrique 1,5 M (pour réaliser la réaction à pH 1,5). La
solution est maintenue sous agitation pendant 10 minutes avant de lire l’absorbance à 400 nm.
Si la réaction se poursuit trop longtemps, on ne dose plus uniquement les monomères et
dimères, le résultat est donc faussé.
Une gamme étalon, obtenue à partir de solutions de silicate à différentes concentrations,
permet de déterminer la concentration en silice dissoute à partir de l’absorbance du complexe
188