Comportement des nanoparticules de silice en milieu biologique ...
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tel-00836093, version 1 - 20 Jun 2013<br />
Chapitre 6 : Protocoles expérim<strong>en</strong>taux<br />
6.2 <strong>Comportem<strong>en</strong>t</strong> <strong><strong>de</strong>s</strong> particules <strong>en</strong> <strong>milieu</strong> <strong>biologique</strong><br />
6.2.1 DISSOLUTION EN MILIEU TAMPON PH 7,4<br />
La dissolution <strong><strong>de</strong>s</strong> particules <strong>de</strong> <strong>silice</strong> est suivie à pH 7,4 dans un tampon Tris-HCl 0,05 M, <strong>en</strong><br />
prés<strong>en</strong>ce <strong>de</strong> 10 mM <strong>de</strong> KCl, conc<strong>en</strong>tration <strong>en</strong> K + proche <strong>de</strong> celle retrouvée dans le plasma.<br />
Une susp<strong>en</strong>sion <strong>de</strong> 0,6 mg/mL <strong>de</strong> <strong>nanoparticules</strong> est mise sous agitation à 37°C dans le<br />
tampon. La dissolution est suivie par <strong>de</strong>ux métho<strong><strong>de</strong>s</strong> : le suivi <strong>de</strong> l’int<strong>en</strong>sité <strong>de</strong> fluoresc<strong>en</strong>ce<br />
<strong>de</strong> la fluorescéine libérée et le dosage <strong>de</strong> la <strong>silice</strong> dissoute.<br />
6.2.1.1 Suivi par fluoresc<strong>en</strong>ce<br />
Aux temps prédéterminés, <strong>de</strong> 30 minutes à plusieurs jours, 400 µL <strong>de</strong> susp<strong>en</strong>sion sont<br />
prélevés. L’int<strong>en</strong>sité <strong>de</strong> fluoresc<strong>en</strong>ce est mesurée directem<strong>en</strong>t (excitation à 485 nm) pour la<br />
moitié du prélèvem<strong>en</strong>t. L’autre moitié est mesurée après c<strong>en</strong>trifugation (10 000 rpm, 15<br />
minutes) dans un tube Nanosep 3,5 kD afin d’éliminer les particules et <strong>de</strong> mesurer<br />
uniquem<strong>en</strong>t l’int<strong>en</strong>sité <strong>de</strong> fluoresc<strong>en</strong>ce due à la fluorescéine libérée ou aux fragm<strong>en</strong>ts issus <strong>de</strong><br />
la dissolution pouvant traverser les pores du filtre, i.e. <strong>de</strong> moins <strong>de</strong> 0,13 nm <strong>de</strong> diamètre.<br />
6.2.1.2 Dosage <strong>de</strong> la <strong>silice</strong> dissoute<br />
Aux temps prédéterminés, on prélève 1,0 mL <strong>de</strong> susp<strong>en</strong>sion pour doser la <strong>silice</strong> dissoute. Ce<br />
dosage repose sur la capacité <strong>de</strong> l’aci<strong>de</strong> silicique à réagir avec l’heptamolybdate d’ammonium<br />
pour former un complexe coloré selon l’équation suivante :<br />
12 H6Mo7O24 • 4H2O + 7 Si(OH)4 + 17 H2O 7 H4SiMo12O40 • 29H2O<br />
Le complexe ainsi formé absorbe à 400 nm et peut donc être suivi par spectroscopie UV-<br />
visible.<br />
Protocole : 1 mL <strong>de</strong> solution à doser est dilué avec 12,5 mL d’eau Milli-Q. 500 µL d’une<br />
solution aqueuse <strong>de</strong> molybdate d’ammonium tetrahydraté (100 g/L) sont ajoutés sous<br />
agitation, suivis <strong>de</strong> 300 µL d’aci<strong>de</strong> sulfrique 1,5 M (pour réaliser la réaction à pH 1,5). La<br />
solution est maint<strong>en</strong>ue sous agitation p<strong>en</strong>dant 10 minutes avant <strong>de</strong> lire l’absorbance à 400 nm.<br />
Si la réaction se poursuit trop longtemps, on ne dose plus uniquem<strong>en</strong>t les monomères et<br />
dimères, le résultat est donc faussé.<br />
Une gamme étalon, obt<strong>en</strong>ue à partir <strong>de</strong> solutions <strong>de</strong> silicate à différ<strong>en</strong>tes conc<strong>en</strong>trations,<br />
permet <strong>de</strong> déterminer la conc<strong>en</strong>tration <strong>en</strong> <strong>silice</strong> dissoute à partir <strong>de</strong> l’absorbance du complexe<br />
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