Manuscrit - laboratoire PROTEE - Université du Sud - Toulon - Var

Laboratoire PROTEE – Bâtiment R
Université du Sud Toulon – Var, BP 20132
83957 LA GARDE Cedex
UTILISATION DE PARAFAC POUR L’ETUDE DE
LA VARIABILITE DE LA MATIERE ORGANIQUE
NATURELLE FLUORESCENTE (MONF) EN
ENVIRONNEMENT
Période : Du 05/04/2010 au 06/06/2010
Stage suivi par: Dr Stéphane MOUNIER, Maitre de conférence
Email : mounier@univ-tln.fr
Tél : 0494142829
HERMANI ARNAUD
OGOULA OBELEMBYA
Laboratoire PROTEE
14/06/2010
1

RESUME
Ce stage consiste à suivre la variabilité de la matière organique naturelle fluorescente
dans des échantillons d’eaux interstitielles provenant de Croatie (Marina et Martinska) et de
France (Toulon : Campagne CARTOCHIM). Plusieurs analyses telles que le COD (Carbone
organique dissous), spectroscopie de fluorescence, la spéciation etc.… ont été effectuées sur
ces échantillons. Concernent la spectroscopie de fluorescence, sur la quelle mon stage est
essentiellement basé, les analyses ont été effectuées sur le spectrophotomètre HITACHI F-
4500. Chaque campagne a été traitée et analysée séparément, puis une analyse globale a été
faite. De ces analyses, cinq composants indépendants décrivant la fluorescence de la MODF
(Matière organique dissoute fluorescente), ont été globalement extraits. Les pics observées
sont ceux généralement attribuées à la fluorescence des protéines (pics B et T) et des
substances de type humique du type terrestre (pics A’, A, C). On note également la présence
du pic M, qui est dû à la fluorescence des substances humique de type marin.
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Remerciements.
Mes remerciements vont d’abord à l’endroit de mon maitre de stage, M Stéphane MOUNIER,
qui a pu être présent et me suivre durant mon apprentissage. A Monsieur Cédric GARNIER
et Erwan, qui ont pu m’éclairer sur l’origine de mes échantillons.
A nos professeurs qui ont toujours été là pour nous, pour leur patience, leur soutien et leurs
conseils.
Et aussi à Anaëlle, à tous les thésards et stagiaires pour leurs aides et leurs conseils.
A tout le laboratoire PROTEE pour son accueil et sa tolérance.
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Sommaire
RESUME................................................................................................................................... 2
REMERCIEMENTS................................................................................................................ 3
I. Introduction.....................................................................................................................................5
II. Spectroscopie de fluorescence ....................................................................................................6
1. 1. Définition........................................................................................................................ 6
2. 2. Principe de la fluorescence et de la phosphorescence................................................. 6
3. 3. Facteurs influençant l’intensité de la fluorescence........................................................ 6
4. 3.1 Augmentation de la fluorescence ................................................................................ 6
5. 3.2 Diminution de la fluorescence ou quenching.............................................................. 7
6. 4. La spectroscopie de fluorescence 2D et 3D.................................................................. 7
III. Matériels et méthodes..................................................................................................................11
1. Matériels .......................................................................................................................... 11
2. Méthode........................................................................................................................... 11
2.1. Les échantillons................................................................................................................ 11
2.2. PARAFAC et le "dilué Par Deux" ..................................................................................... 12
2.3. Données et prétraitement................................................................................................. 14
2.4 Les analyses de fluorescence ........................................................................................... 15
IV. Résultats et discussion ...............................................................................................................15
IV-1. Résultats ......................................................................................................................... 15
1. Résultats spectraux de PARAFAC du point 9HR................................................................ 15
2. Résultats spectraux de PARAFAC du point 12HR.............................................................. 16
3. Résultats spectraux de PARAFAC du point 15HR.............................................................. 17
4. Résultats spectraux pour l’ensemble des campagnes de la Rade de Toulon .................... 17
5. Résultats spectraux de la campagne MARINA (CROATIE)................................................ 18
6. Résultats spectraux de la campagne MARTINSKA (CROATIE)......................................... 18
7. Résultats spectraux de l’ensemble des campagnes de Croatie. ........................................ 19
8. Résultats spectraux de l’ensemble des campagnes. .......................................................... 20
9. Résumé des MEEF obtenues ............................................................................................. 20
IV-2. Discussion....................................................................................................................... 21
V. CONCLUSION ...............................................................................................................................24
REFERENCE .......................................................................................................................... 25
ANNEXE................................................................................................................................. 26
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I. Introduction
Du 05 Avril 2010 au 06 Juin 2010, j’ai effectué un stage au sein de l’équipe CAPTE
du laboratoire PROTEE (processus de transferts et d'échanges dans l'environnement) à
l’Université du Sud Toulon - Var. Ce laboratoire est dirigé par Le Professeur Yves LUCAS et
est composé de trois équipes :
ISO (Instrumentation en Spectroscopie et Optique) dont les études portent sur la
spectroscopie optique, le traitement du signal optique et d'images, la modélisation,
l'instrumentation et les mesures optiques.
EBMA (Équipe de Biologie des Milieux Aquatiques) dont les études portent sur
l'écologie et la biologie moléculaire marine.
CAPTE (Chimie Analytique et Processus de Transfert dans l'Environnement) dont les
études portent sur les interactions de la Matière Organique Naturelle (MON) avec les
Métaux Traces et le Proton
Le but de ce stage était d’étudier la fluorescence de la matière organique d’eau
interstitielle des sédiments, des échantillons provenant de Croatie (Marina et Martinska) et de
France (Rade Toulon), en utilisant l'algorithme d'analyse factorielle parallèle (PARAFAC),
qui est une technique qui permet de traiter les MEEFs et de donner qualitativement les
variations des composants fluorescents.
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II. Spectroscopie de fluorescence
1. Définition
La fluorescence est la propriété d’une molécule, d’un atome ou d’un ensemble d’atome
d’émettre un photon suite à l’absorption d’un autre photon. (Cours de fluorescence M1, 2010).
2. Principe de la fluorescence et de la phosphorescence
Pour bien comprendre le phénomène, il est utile d'étudier le diagramme de Jablonski.
C'est un diagramme énergétique comparant les phénomènes de retour à l’équilibre par
fluorescence et phosphorescence. (lachimie.fr, 2008-2010).
Figure 1 : Digramme de Jablonski (lachimie.fr, 2008-2010)
Lorsque la molécule se trouve dans un état excité suite à l’absorption d’un photon, elle
retourne au plus bas niveau d’énergie de l’état excité le plus bas par relaxation (transfert
d’énergie avec le solvant suite notamment à des collisions). La durée de vie de ces relaxations
vibrationnelles non radiatives est de l’ordre de 10 -12 secondes.
La molécule revient ensuite dans l’état fondamental soit par conversion interne ou externe
(choc avec d’autres molécules) soit par émission de lumière.
Cette émission lorsqu'elle a lieu s'appelle la fluorescence.
Dans le cas de la fluorescence, la multiplicité de spin est conservée.
Dans le cas de la phosphorescence, le passage à l'état excité s'effectue avec un
retournement de spin avec passage à un état triplet.
Le retour à l’état fondamental s’effectue plus lentement avec émission de photons et un
nouveau retournement de spin. L'émission lumineuse dure donc beaucoup plus longtemps
même après arrêt de la lumière incidente. (lachimie.fr, 2008-2010)
3. Facteurs influençant l’intensité de la fluorescence
3.1 Augmentation de la fluorescence
a. Impuretés
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La présence d’impuretés peut être responsable d’une augmentation de la fluorescence.
Il convient d’être vigilant sur la qualité des solvants (utiliser des solvants très purs pour
fluorométrie). Le faite de tenir les Tips avec les mains, peut par exemple provoquer une
augmentation de la fluorescence (Gwenola Burgot, Jean-Louis Burgot, 2002).
b. Complexation
La formation d’un complexe entre la substance fluorescente et un agent chélatant peut
augmenter la rigidité du système moléculaire et de ce fait peut accentuer le phénomène de
fluorescence (Gwenola Burgot, Jean-Louis Burgot, 2002).
3.2 Diminution de la fluorescence ou quenching
a. Quenching de collision
Une molécule d’agent quenchant réagit avec une molécule excitée qui devient inapte à
la fluorescence. Les molécules comportant des groupements halogènes ou oxygénés sont de
tels agents quenchants (Gwenola Burgot, Jean-Louis Burgot, 2002).
b. Quenching par changement de structure
Les substances acido-basiques voient l’intensité de leur fluorescence diminuer ou
augmenter selon le pH de la solution. L’aniline par exemple est fluorescente à pH compris
entre 6 et 14. Si le pH diminue, il se forme l’ion anilinium qui est incapable de fluorescer. Il
est également possible de rencontrer des cas de figures intermédiaires où la forme acide et la
forme basique ont des spectres d’émission et/ou des rendements quantiques différents.
c. Influence de la température
L’augmentation de la température diminue le rendement quantique et donc l’intensité
de fluorescence car elle favorise les chocs entre les molécules et la dissipation de l’énergie
acquise par la forme excitée sous forme thermique (Gwenola Burgot, Jean-Louis Burgot,
2002).
4. La spectroscopie de fluorescence 2D et 3D
La spectroscopie de fluorescence 2D est obtenue en réalisant les spectres d’émission,
d’excitations ou des spectres synchrones.
Spectre d'émission de fluorescence.
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Figure 2: Spectre d'émission de l'Anthracène (Perkin-Elmer LS50B), (cours de fluorescence
M1, 2010).
Les spectres d'émission de fluorescence sont obtenus en étudiant les longueurs d'ondes
émises par une molécule ayant absorbée un photon de longueur d'onde donné. Soit donc un
graphe du type Iémis en fonction de λ pour une longueur d'onde d'excitation donnée, ce qui
donne le spectre ci-dessus. (Cours de fluorescence M1, 2010).
Spectre d'excitation de fluorescence.
Figure 3: Spectre d'excitation de l'Anthracène (Perkin-Elmer LS50B), (Cours de
fluorescence M1, 2010).
Les spectres d'excitation de fluorescence sont obtenus en observant à une longueur
d'onde l'intensité émise en fonction de la longueur d'onde incidente. Comme la longueur
d'onde émise est proportionnelle au nombre de photon absorbés, les spectres d'excitation sont
très proche des spectres d'absorption. Généralement les deux spectres sont symétriques par
rapport à la transition 00 comme le montre l'exemple ci dessous dans le cas de
l'anthracène. (Cours de fluorescence M1, 2010).
Figure 4 : Spectre d'émission et d'excitation de l'Anthracène. (Cours de fluorescence M1,
2010).
Spectre synchrone.
Les spectres synchrones de fluorescence sont obtenus en faisant varier les longueurs
d'onde d'excitation en fonction des les longueurs d'onde d'émission. Ils peuvent avoir soit un
décalage de longueur d'onde constant , soit un décalage d'énergie
constant . Les spectres synchrones donnent une information plus complète
sur les mélanges de fluorophores. En effet plusieurs fluorophores sont concernés par les
couples de longueurs d'onde scannés. Cette technique est souvent utilisée pour des mélanges
ou pour la caractérisation d'un mélange. Pratiques à manipuler et rapides à obtenir ils sont un
bon compromis face au spectre de luminescence totale ou matrice d'excitation et d'émission
de fluorescence. (Cours de fluorescence M1, 2010).
Spectres de fluorescence 3D
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Les matrices de fluorescence sont en fait des cartes de fluorescence de l'ensemble des
fluorophores d'un mélange. Elles permettent de caractériser plusieurs composés (ou
fluorophores) dans un mélange (voir figure suivante).
Figure 5: Matrice 3D d’un échantillon de la campagne 12HR
L'acquisition de se type de graphe est faite généralement en construisant à partir d'une
série de spectres d'émission, d'excitation ou synchrones la surface de réponse. Ce type
d'acquisition présente toutefois plusieurs défauts :
1) l'acquisition est lente à cause du balayage de longueur d'onde, et une vitesse plus
grande se fait au détriment du signal. (Cours de fluorescence M1, 2010).
2) La précision en longueur d'onde se fait au détriment du temps.
On obtient se type de graphe avec divers appareillage comme le F4500, LS50B ou
Fluorolog 3. Quelques appareils permettent une acquisition rapide des spectres 3D (MEEF) en
moins d'une seconde grâce à un chemin optique perpendiculaire à la figure de diffraction de
l'excitation et un détecteur CCD. Là aussi la vitesse d'acquisition se fait au détriment de la
sensibilité. (Cours de fluorescence M1, 2010).
5. La spectroscopie de fluorescence
La MOD est un mélange hétérogène de polymères aliphatique et aromatique, et sa
composition change dans le temps et dans l'espace selon la proximité des sources et l'exposition à
processus de dégradation. La source principale de MOD est la dégradation des molécules en
provenance du vivant. Elles sont dissoutes et transportées par les estuaires et les fleuves dans
les environnements marins. Les proviennent également des exsudats des usines aquatiques et
leur la dégradation sont également des sources importantes de MOD dans les eaux naturelles.
(Stedmon et autres, 2003)
La fraction optiquement active de MO (Matière Organique) s'appelle matière organique
dissoute chromophorique. Si cette dernière provient du milieu dissout, on ajoute le qualificatif
dissout dans la définition (MODC). La MODC ne représente qu’une petite partie de la MOD.
D’autre part une fraction de cette MODC possède des propriétés de fluorescence, donc une
nouvelle catégorie de matière: la matière organique dissoute fluorescente (MODF). (Cours de
fluorescence M1, 2010; Stedmon et al, 2003).
Dans la littérature, la spectroscopie de fluorescence a très tôt été utilisée pour
caractériser la matière organique dissoute (DOM) dans une variété d’échantillons d’eau
douce, côtière et marine, (Stedmon, 2003 ; Coble, 1996), mais également dans les eaux
interstitielles (Burdige et al, 2004). Plusieurs types de signaux de fluorescence ont été
observés, notamment pour les humiques et les protéines (tyrosine et tryptophane) (Coble,
1996 ; Luciani et autres, 2007). La fluorescence des substances de type humiques se compose
de deux pics, l'un stimulée par les UV (pic A) et l'autre par le visible (pic C).De plus les
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longueurs d’ondes d’excitation et d’émission des composé de type C, sont plus importantes
des les échantillons d’eau douce que dans les échantillons marins (Coble, 1996).
Tableau 1 : Valeurs moyennes des positions des maximas des longueurs d’onde d’excitation
et d’émission (Coble, 1996).
Rivières Eaux Côtiers Eaux marines
transitoires peu
profondes
Eaux marines
eutrophes peu
profondes
340 342 310 299 340
448 442 423 389 438
Tableau 2 : Pics de fluorescence identifiées dans les premiers travaux (Coble, 1996)
Eaux
marines
profondes
Tableau 3 : Pics de fluorescence observées dans les eaux interstitielles étudiées par Burdige
(Burdige et autres, 2004)
Chaque substance organique a un domaine de fluorescence bien spécifique (Voir
figure ci-dessous).
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Figure 6: Domaine de fluorescence dans une MEEF (Smith, 1999, Cours de fluorescence M1).
III. Matériels et méthodes
1. Matériels
Les analyses sont effectuées à l’aide des cuves en quartz de section ou carrée
(Figure 28: en annexe) et d’un spectrophotomètre (HITACHI F-4500) (Figure 30: en annexe),
couplé à un ordinateur pour enregistrer les mesure (Figure 31: en annexe). Le
spectrophotomètre est constitué d’une source lumineuse (Lampe en xénon), d’un
monochromateur d’excitation, d’un monochromateur d’émission, d’un détecteur et traitement
de l’information (qui convertit la lumière émise en courant électrique qui est amplifié et
enregistré sur un écran digital), (Gwenola Burgot, Jean-Louis Burgot, 2002), comme indiqué
sur la figure ci-dessous.
Figure 7: Schéma d’un spectrophotomètre (Gwenola Burgot, Jean-Louis Burgot, 2002)
Le détecteur est placé à 90° par rapport au faisceau d’excitation pour éviter
l’interférence de la lumière diffusée.
2. Méthode
2.1. Les échantillons
Les mesures sont faites sur des échantillons d'eaux interstitielles qui proviennent de 2
sites géographiques différents la Croatie (Šibenik) et la France (Toulon). Dans le cas de
Toulon la campagne de prélèvement concernée est la campagne CARTOCHIM.
a. Campagne CARTOCHIM
Dans cette campagne nommée CARTOCHIM, (dont le but est suivre les apports en
polluant et de faire un bilant historique de la contamination de la rade de Toulon) il était
question de prélever des échantillons dans la grande et la petite rade de Toulon. Ces
échantillons sont des carottes de sédiment qui sont prélevées en double à l’aide d’un tube
plexiglas de 10 cm de diamètre, pour avoir suffisamment d’échantillons lors des analyses.
Le surnageant qui correspond à l'eau interstitielle libre, est récupéré par centrifugation des
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sédiments découpés tout les 2 cm. Les échantillons traités sont ceux des campagnes 9HR,
12HR et 15HR de la petite rade de Toulon (Figures 23, 24, 25 : en annexe). Toutes les
informations concernant le lieu de prélèvement et les caractéristiques des échantillons sont
représentées sur le la figure 8 ci-dessous et dans les tableaux 5, 6 et 7 en annexe.
Figure 8: Carte de prélèvement.
b. Campagne de Croatie
De la même manière, ces échantillons sont des carottes de sédiments, prélevés et
transportés à l’aide d’un tube plexiglas de 10 cm de diamètre. Ils ont été également prélevés
en double à fin d’avoir une quantité suffisante d’échantillon pour les analyses de
fluorescences et de carbone organique dissout (COD).Ici, le surnageant qui correspond à l'eau
interstitielle, et récupéré par centrifugation des sédiments, est découpés tout les 1 cm. Pour ces
échantillons, il ya eu deux sites de prélèvement, effectués en Janvier 2010 : MARINA et
MARTINSKA.
2.2. PARAFAC et le "dilué Par Deux"
L’Analyse Factorielle Parallèle (PARAFAC) est une méthode d’analyse de données
consistant à construire un modèle linéaire, en estimant les spectres d’excitation et d’émissions
de F fluorophores et le coefficient appliqué à chacune de ces matrices, afin de pouvoir
recomposer ou ré-fabriquer le cube de donnée (X. Luciani et al, 2007).
PARAFAC a été initialement développée en 1970 par Harshman pour la psychométrie,
et est couramment employé de nos jours dans divers travaux scientifiques, comme un puissant
algorithme de décomposition. En spectroscopie de fluorescence, on analyse un ensemble
d’échantillon dans lequel chaque FEEM est un mélange de F composants fluorescents
différents. On considère comme l’intensité de fluorescence d'un échantillon i donné,
mesuré au couple de longueurs d’onde d’excitation-émission (j, k), comme facteur de
fluorescence (produit de la concentration et du rendement quantique) du fluorophore f ( f
variant de 1 à F) dans l'échantillon i (variant de 1 à I), comme valeur du spectre
d’absorption du fluorophore f à la longueur d’onde j et comme valeur du spectre
d’émission du fluorophore f à la longueur d’onde k, la loi de Beer–Lambert nous donne (X.
Luciani et Autre, 2007):
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Où ε est la limite d'erreur résiduelle. Ce produit trilinéaire entre une variable mesurée et
les trois autres variables inconnues sont le modèle 3D PARAFAC de rang F.
Pour chaque composant de f, les vecteurs représentent respectivement,
l’évolution de la concentration au travers des échantillons, le spectre d’excitation et le spectre
d'émission. PARAFAC n’est rien d’autre qu’une routine numérique permettant d’estimer les
variables à partir des mesures en minimisant l’écart résiduel avec le
modèle trilinéaire (Thèse X Luciani, 2007) et l’ALS (Alternating least squares) est utilisée
pour fournir une bonne et rapide évaluation de ces vecteurs.
Lors des analyses de fluorescence, la lumière qui est émise par une molécule
fluorescente ne va pas être absorbée par la molécule elle-même, mais par une autre molécule
fluorescente : c’est l’effet d’écran. Ce qui peut provoquer des énormes erreurs sur les
évaluations des pseudo-concentrations, des spectres d’excitations et d’émissions.
Pour résoudre ce problème, il existe deux méthodes principales. Puisque les effets
d’écran peuvent être négligeables pour des faibles absorbances, c à d pour des faibles
concentrations, un procédé commun est de diluer fortement la solution jusqu'à ce que
l'absorbance maximale soit inférieure que 0.1. Il y a un inconvénient évident avec cette
méthode de dilution car un facteur de dilution trop fort réduirait sévèrement le rapport de
signal-bruit. D'ailleurs ce procédé doit être appliqué très soigneusement pour éviter la
contamination ou les changements physico-chimiques (X Luciani et al, 2007).
La deuxième méthode est un prétraitement de l’échantillon (imaginé par X Luciani en
2009). Cette méthode consiste à mesurer l’effet d’écran. Donc, il suffirait de mesurer
l’échantillon brut, à priori très concentré, dans lequel il ya un effet d’écran que l’on suspecte,
et pour le connaitre, on prend l’échantillon et on le diluer deux fois (ou d’un facteur
parfaitement connu), et on fait la mesure des deux échantillons (le dilué et le brut), et un
traitement mathématique permet alors de retrouver la MEEF originale (une estimation de la
MEEF sans effet d’écran). Une fois ce travail effectué, on retrouve le modèle linéaire que
PARAFAC peu traiter. Cette méthode utilise l’équation de Beer–Lambert :
PARAFAC est un programme conçu pour être utilisé sous le logiciel MATLAB. Il
comprend les sous programmes suivants: Auto, Bords, Cleanscan, extraire_donnees, parapide,
pathdef, RecupererDonnees, resolution_cam et version2D. Ceux que l’on rentre l’un après
l’autre pour le traitement sont : Auto, resolution_cam, parapide et RecupererDonnees.
PARAFAC est incapable de nous donner tout seul, le nombre de fluorophore F contenu dans
un échantillon. De ce fait, et par tâtonnement, nous lui donnons des valeurs entières de F
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supérieurs ou égaux à 1, puis à l’aide du core consistency ou corcondia, il nous permet de
décider quel est le nombre de composant le plus judicieux et de calculer les MEEFs de chaque
composant. La bonne valeur de F est obtenue pour un corcondia supérieur à 50%.
Exemple : Corcondia de MEEFs (Point 9HR).
Figure 9 : Corcondia de 57.25% pour F=4 Figure 10 : Corcondia de 7% pour F=5
2.3. Données et prétraitement
Au total, 114 échantillons ont été mesurés par spectroscopie de fluorescence 3D. Les
carottes de sédiment provenant de la petite rade de Toulon et ceux de Croatie ont été
prélevées et transportées dans un tube plexiglas de 10 centimètre de diamètre. Le tube
contentant l’eau surnageante, est mis sous une tente avec de l’azote et posé sur une table.
L’eau surnageante est retirée avec une seringue et coservée,puis à l’aide d’un piston en téflon
la carotte est poussée vers le haut avec un cric pneumatique et découpée tous les deux
centimètre par une plaque en plastique et tous les centimètres pour les échantillons de Croatie.
La plaque de découpe est nettoyée avec de l’eau milliQ et de l’acide nitrique (HNO3 à 10%)
après chaque découpage. Chaque gabarit de carotte est récupéré dans des flacons en HDPE à
l’aide d’un entonnoir à sédiment. De la même manière, on découpe la deuxième carotte et ce
pour chaque hauteur de prélèvement. Chaque morceau de même hauteur est mélangé,
homogénéisé et séparé dans trois tubes de centrifugation. Une fois pesé, puis centrifugée
pendant 10 minutes, à 4500 trs/min aux environs de 20°C. Après la centrifugation, on ramène
les tubes sous la tente, toujours sous azote, et on récupère l’eau extraite à l’aide d’une
seringue, on la filtre à 0,2 µm à l’aide d’un filtre préalablement nettoyé à l‘acide (HNO3 10%)
puis rincé à l’eau milliQ. Pour chaque hauteur de sédiment, on prend 5mL d’eau interstitielle
que l’on met dans différents flacons de trois groupes. Le premier groupe de flacon est celui de
30 mL en HDPE, qui sont acidifiés avec 40 ou 60 µL d’acide supra (HNO3) pour faire
l’analyse des métaux totaux, le deuxième est ceux de 24 mL, en verre, dans lesquels on ajoute
25µL d’azide (NaN3 1M) et 6 ml d’eau milliQ pour l’analyses du COD (Carbone Organique
dissous) car on ne peut pas faire l’analyse que sur 5 mL et le reste a servi à faire les analyses
de spectroscopie de fluorescence. Le troisième groupe de flacon est en HDPE de 30mL dans
lesquels on ajoute de l’azide pour les analyses de spéciation.
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2.4 Les analyses de fluorescence
Les analyses de fluorescences ont été faites sur un spectrophotomètre : HITACHI
F4500, A l’aide du logiciel FL solution, on va choisir les différentes méthodes pour les
analyses. D’abords le RAMAN pour faire le raman de l’eau (Figure 33 : en annexe) afin de
voir l’état de la lampe, puis 3D PARAFAC pour effectuer les analyses de fluorescence. Cette
méthode fixe les paramètres suivant : 200 à 500 comme intervalle nm en excitation et 200 à
600 nm en émission, avec une vitesse de 2400 nm/min et un slit de 5 nm pour l’émission et
l’excitation. On prélève 2 fois 0.8 µL d’échantillon dans une cuve miroité à l’aide d’un
pipetman, donc 1.6 µL .La cuve peu être rincé avec un peu d’échantillon avant l’analyse, si
l’on en a assez, si non, elle est rincée à l’eau milliQ et séchée à l’aide d’une centrifugeuse
(Figure 32 en annexe). L’échantillon est bullé à l’azote pendant 10 min environ (Figure 29, en
annexe), pour enlever l’oxygène dissout. La mesure prend 11 min environ, dans le
spectrophotomètre pour l’analyse de fluorescence. Une fois l’analyse terminée, on récupère la
cuve et on rajoute 2 fois 0.8 µL d’eau milliQ pour la dilution, pour ensuite refaire la mesure
du spectre de fluorescence 3D. Dans le cas le la dilution, il faut faire attention à la formation
des bulles d’air qui donne des taches de fluorescence (Figure 34: en annexe)
IV. Résultats et discussion
IV-1. Résultats
Dans l’ensemble, quatre composants ont été identifiés par l’analyse factorielle
parallèle (PARAFAC), mais leur présence est plus ou moins en fonction du lieu de
prélèvement. Les spectres de fluorescence obtenus sont identifiés à l’aide des tableaux 2 et 3,
et sont généralement attribués à la fluorescence des substances humiques et des protéines.
1. Résultats spectraux de PARAFAC du point 9HR.
Concernant cette campagne, quatre composants correspondants au FEEM présenté ci-
dessous, ont été trouvés. Ils sont tous identifiés à l’aide des pics obtenues par Coble (Coble,
1996) et Burdige (Burdige et autres, 2004) dans les Tableau 2 et 3. Le composant 1 est
composé d’un pic, avec un domaine de longueur d’onde d’environ 250-280/300 nm, qui
correspond au composant de type B. Ce composé correspond à la fluorescence des protéines
(Tyrosine), qui fluorescent généralement entre 220/250 nm en excitation et 304/345 nm en
émission (voir tableau 3). Le deuxième composant est une protéine (Tryptophane), constitué
d’un seul pic de type T, dont les intervalles de longueur d’onde sont 274/275 nm pour
l’excitation et 340/350 nm pour l’émission (voir tableau 2 et 3). Le troisième composant est
constitué de deux cpics non séparées, dont la différence se situe au niveau des longueurs
d’onde d'excitation. Les deux derniers composants, correspondent aux substances humiques
(voir Tableau 3), et le troisième composant est constitué de deux pics correspondent
respectivement aux pics A et M avec pour intervalles de longueurs d’onde respectifs 250/260
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nm et 320/340 nm en excitation et 400/440 nm comme longueur d’onde d’émission commun.
Le dernier composant est également composé de deux pics, mais cette fois, ils sont de type A’
et C, et ont un intervalle de longueur d’onde émission de 440/480 nm et ont respectivement
comme intervalle en excitation 250/260 nm et 360/380 nm (voir figure ci-dessous).
Figure 10 : Les MEEFs obtenus pour le point 9HR.
2. Résultats spectraux de PARAFAC du point 12HR.
Dans cette campagne, trois composants ont été identifiés. Le premier est constitué
d’un pic observé entre 270/280 nm en excitation et 350 nm en émission. Il s’agit d’une
protéine (tryptophane) dont le pic est du type T (voir tableau 2) et l’intensité de fluorescence
est plus importent ici qu’au point 9HR. Les deux autres composants sont des substances
humique, de type A et M pour le composant 2, et A’ et C pour le composant 3. Ces deux
composants sont constitués de deux paires de pics, ils sont tous les deux semblables à ceux
obtenus au point 9HR. La différence réside au niveau de l’intensité de fluorescence ou de
leurs concentrations. Leurs intensités de fluorescence sont plus impotentes que ceux du point
9HR, on peu observer l’augmentation de l’intensité de fluorescence pour le pic C dans cette
campagne.
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Figure 11: Les MEEFs obtenus pour le point 12HR.
.
3. Résultats spectraux de PARAFAC du point 15HR.
Pour ce point, on observe la présence de deux composants, une protéine (tryptophane)
et d’une substance humique constitué de deux pics M et A. Ils sont apriori identiques à ceux
obtenus précédemment, mais l’intensité de fluorescence est plus faible ici pour la substance
humique, donc faiblement présence dans ce point, car on peu observer ca disparition ou ca
faible intensité du pics M (voir figure ci-dessous).
Figure 12 : Les MEEFs obtenus pour le point 15HR.
4. Résultats spectraux pour l’ensemble des campagnes de la Rade de Toulon
L’analyse de tous les points de la rade de Toulon, nous donne trois composants, qui
sont vraisemblablement ceux du point 12HR. Ce résultat n’est pas étonnent, car c’est le point
pour lequel l’intensité de fluorescence est plus fort, et les MEEF ont des fortes concentrations.
On peu aussi noter l’absence de la tyrosine dans cette analyse, ce qui est peu être due à sa
faible concentration dans le milieu. (Voir figure ci-dessous).
OGOULA OBELEMBYA. H. A MASTER 1 CHARME 2009 - 2010 Page 17

Figure 13: Les MEEFs obtenus pour l’analyse de tous les points de la rade de Toulon.
5. Résultats spectraux de la campagne MARINA (CROATIE).
Pour cette campagne, trois composants indépendants ont été identifiés, une protéine
pour le composant 1 (tryptophane), dont les intervalles de longueur d’onde sont 260/280 nm
en excitation et 350 nm en émission, et deux substances de type humique constituées de deux
paires de pics. Pour le composant 2, les pics sont colées et ont pour intervalle en excitation
250/270 nm (pic A) et 320/340 nm (pic M) et un intervalle de longueur d’onde d’émission
commun de 400/440 nm. Le composant 3 est constitué d’une paire de pics séparé, dont
l’intervalle de longueur d’onde en excitation est de 250/275 nm (pic A’) et 360/380 (pic C) et
ont un intervalle commun en émission de 460/480 nm (voir figure ci-dessous).
Figure 14 : Les MEEFs obtenus pour la campagne Marina.
6. Résultats spectraux de la campagne MARTINSKA (CROATIE).
Les MEEFs obtenues dans cette campagne, sont au nombre de trois. Le premier
composant est une protéine (Tryptophane) toujours identique à celles obtenus au paravent. Le
composant 2 est une substance humique constitué de deux pics de types A et M, semblable à
celles obtenues précédemment, mais de faible intensité. Le dernier est une MEEF constitué de
OGOULA OBELEMBYA. H. A MASTER 1 CHARME 2009 - 2010 Page 18

deux pics bien définis et d’un troisième faiblement visible. Ces pics ont un intervalle de
longueur d’onde d’émission commun, allant de 460 à 520 nm et des intervalles de longueur
d’onde excitation différents, de 250/275 nm pour le pic 1,de 290/340 nm pour le pic 2 et
360/440 nm pour le pic 3. On peut penser pour ce dernier pic, qu’il s’agit d’un acide fulviques
(pic D) qui fluoresce généralement à 390 nm en excitation et 509 en émission. (Voir figure cidessous).
Figure 15 : Les MEEFs obtenus pour la campagne Martinska.
7. Résultats spectraux de l’ensemble des campagnes de Croatie.
Dans cette analyse cumulée des deux campagnes de Croatie, on peut noter la
disparition des pics A’ et C obtenus dans l’analyse des échantillons de Marina et on peut
visualiser clairement la présence des trois pics inconnus obtenus précédemment. On peut aussi
remarquer la présence de la protéine (tryptophane) qui est toujours présent dans chaque
analyse. (Voir figure ci-dessous).
OGOULA OBELEMBYA. H. A MASTER 1 CHARME 2009 - 2010 Page 19

Figure 16 : Les MEEFs obtenus pour l’analyse de tous les points de Croatie
8. Résultats spectraux de l’ensemble des campagnes.
Les résultats de l’ensemble, nous donne trois différentes MEEF, qui ont été obtenus
dans la plut part des campagnes, tout en notant l’absence de la tyrosine (pic RS) (voir tableau
3).
Figure 17 : Les MEEFs obtenus pour l’analyse de l’ensemble
9. Résumé des MEEF obtenues
Dans le tableau récapitulatif ci-dessous, on peut voir les composants qui et constamment
présent et ceux qui ne le sont pas.
Composants de obtenus
Campagne Pic B Pic T Pic A’/M Pic A/M X (inconnus)
9HR O O O O
12HR O O O
15HR O O
Marina O O O
Martinska O O O
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Ensemble Toulon O O O
Ensemble Croatie O O O
Le tout O O O O
Tableau 4: Tableau récapitulatif.
IV-2. Discussion
a. Campagne 9HR.
Les courbes ci-dessous nous montre l’évolution de chaque chromophore en fonction
de la profondeur. Les composants 2, 3 et 4 varient beaucoup plus que le COD et composant 1
ne participe quasiment pas à la fluorescence sauf pour la profondeur -55cm. Toutefois les
composants ne montrent pas de tendance forte avec la profondeur, il y a des contributions
variables. Trop pour donner même une tendance.
Figure 18 : Point 9HR : Variation des concentrations en fonction de la profondeur et
comparaison avec le COD.
b. Campagne 12HR.
Contrairement au variation précédente, dans las campagne 12HR,tous composants
semblent suivre la même tendence. On observe dont une légère constente de 0 à 15 cm, puis
une augmenttation du carbone accompagné des faibles variations avec la profondeur. On peut
dire que la variation est sensiblement la même que celle du COD.
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Figure 19 : Point 12HR : Variation des concentrations en fonction de la profondeur et
comparaison avec le COD.
c. Campagne 15HR
Ici, les variations sont assez indépendantes, il n’y a aucune corrélation ou linéarité
entre le COD et les variations des pseudo-concentrations en fonction de la profondeur.
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Figure 20 : Point 15HR : Variation des concentrations en fonction de la profondeur et
comparaison avec le COD
d. Campagne MARINA
. Pour ce point, les variations sont très diferentes.On observe une variation constante
de 1 à 2 cm de profondeur,puis une augmentation de carbone de 2 à 4 cm. Puis,pour le
composant 1 (Tryptophane), on observe une decroissance à partir de 5 cm de profondeur et
une forte augmentation pour les deux humiques entre 4 et 8 cm, suivi d’une faible
augmentation entre 8 et 10 cm. Ces variation suivent une tendence inverse à celle du COD :
forte augmentation quand celle du COD est faible et faible quand celle du COD est forte
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Figure 21 : Point 12HR : Variation des concentrations en fonction de la profondeur et
comparaison avec le COD.
e. Campagne MARTINSKA
De la même manière que précédemment, on observe des tendances inverses à la variation du
COD dans différent intervalle de profondeur.
Figure 22 : Variation des concentrations en fonction de la profondeur et comparaison avec le
COD
V. CONCLUSION
Au cours ce travail, cinq différents types de composants ont été observés, dont deux
appartenant à la fluorescence des protéines, qui semblent résulter de la fluorescence des
OGOULA OBELEMBYA. H. A MASTER 1 CHARME 2009 - 2010 Page 24

composés aromatiques de type tryptophanes et tyrosines, deux autres, constitués de deux pics
chacun, et qui semblent appartenir à la fluorescence des humiques (pics A, M, A’ et C). Le
dernier composant semble être inconnu. Il est composé de trois pics non identifiés, mais le
premier pic semble être du type terrestre (pic D). Certain résultats de fluorescences tel que le
point 12HR, semble suivent la même tendance que les variations de COD, et d’autres tel que
les campagnes de MARINA et MARTINSKA suivent une tendance plutôt inverse à celle du
COD. L’analyse de l’ensemble des campagnes ne semble pas être une bonne approche pour
l’estimation du nombre total des composants, dans la mesure où l’on perd des informations.
Mais elle s’avère être intéressante car, elle nous permet devoir les composants qui sont
prépondérants car les moins concentrés disparaissent et l’on peut également voir s’ils existent
des composants commun à chaque campagne.
REFERENCE
Kathleen R. Murphy, Colin A. Stedmon, T. David Waite, Gregory M. Ruiz (2007)
Colin A. Stedmon, Stiig Markager, Rasmus Bro, Tracing dissolved organic matter in
aquatic environments using a New approach to fluorescence spectroscopy (2003)
David J. Burdige, Scott W. Kline and Wenhao Chen, Fluorescent dissolved organic
matter in marine sediment pore waters (2004)
X. Luciani, S. Mounier, R Redon, A Bois, A simple correction method of inner filter
effects affecting FEEM and its application
to the PARAFAC decomposition (2009)
X. Luciani, S. Mounier, H. H. M. Paraquetti, R. Redon, Y. Lucas, A. Bois, L. D.
Lacerda, M. Raynaud, M. Ripert, Tracing of dissolved organic matter from the
SEPETIBA Bay (Brazil) by PARAFAC analysis of total luminescence matrices
(2007)
Paula G Coble, Characterization of marine and terrestrial DOM in seawater
using excitation-emission matrix spectroscopy (1995)
http://www.lachimie.fr/analytique/fluorimetrie
Cours de fluorescence 2009 – 2010, module UE2.4E_Chimie Analytique,
Spectroscopie UV – Visible en environnement, enseignent : S. MOUNIER.
Livre : Méthodes instrumentales d’analyse chimique et application, Gwenola Burgot,
Jean-Louis Burgot, Editions TEC & DOC, 2002
OGOULA OBELEMBYA. H. A MASTER 1 CHARME 2009 - 2010 Page 25

Annexe
Figure 23 : Point 9HR Figure 24 : Point 12HR
Figure 25 : Point 15HR Figure 26 : Echantillon Marina
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Figure 27 : Echantillon Martinska Figure 28 : Cuve miroitée
Figure 29 : Echantillon en bullage Figure 30 : Spectrophotomètre
Figure 31 : Echantillon Martinska Figure 32 : Echantillon Martinska
OGOULA OBELEMBYA. H. A MASTER 1 CHARME 2009 - 2010 Page 27

Figure 33 : Spectre de l’eau milliQ Figure 34 : Spectre interrompu par une bulle
d’aire
Tableau 5: Données de la campagne 9HR
200
200 EM(nm)
600
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500
EX
(nm)
3D_12HR_ES_M_d_
Date latitude Longitude Découpe (cm) Profondeur
moyenne
Novembre 2009 43°06.34450 5°54.61193 ES 5,00
Novembre 2009 43°06.34450 5°54.61193 0-2 -1,00
Novembre 2009 43°06.34450 5°54.61193 2-4 -3
Novembre 2009 43°06.34450 5°54.61193 4-6 -5
Novembre 2009 43°06.34450 5°54.61193 6-8 -7
Novembre 2009 43°06.34450 5°54.61193 8-10 -9
Novembre 2009 43°06.34450 5°54.61193 10-12 -11
Novembre 2009 43°06.34450 5°54.61193 12-14 -13
Novembre 2009 43°06.34450 5°54.61193 14-16 -15
Novembre 2009 43°06.34450 5°54.61193 16-18 -17
Novembre 2009 43°06.34450 5°54.61193 18-20 -19
Novembre 2009 43°06.34450 5°54.61193 20-20 -21
Novembre 2009 43°06.34450 5°54.61193 22-24 -23
Novembre 2009 43°06.34450 5°54.61193 24-26 -25
Novembre 2009 43°06.34450 5°54.61193 26-28 -27
Novembre 2009 43°06.34450 5°54.61193 28-30 -29
Novembre 2009 43°06.34450 5°54.61193 30-32 -31
Novembre 2009 43°06.34450 5°54.61193 32-34 -33
Novembre 2009 43°06.34450 5°54.61193 34-36 -35
Novembre 2009 43°06.34450 5°54.61193 36-38 -37

Novembre 2009 43°06.34450 5°54.61193 38-40 -39
Novembre 2009 43°06.34450 5°54.61193 40-42 -41
Novembre 2009 43°06.34450 5°54.61193 42-44 -43
Novembre 2009 43°06.34450 5°54.61193 44-46 -45
Novembre 2009 43°06.34450 5°54.61193 46-48 -47
Novembre 2009 43°06.34450 5°54.61193 48-50 -49
Novembre 2009 43°06.34450 5°54.61193 50-52 -51
Novembre 2009 43°06.34450 5°54.61193 52-54 -53
Novembre 2009 43°06.34450 5°54.61193 54-56 -55
Novembre 2009 43°06.34450 5°54.61193 56-58 -57
Novembre 2009 43°06.34450 5°54.61193 58-60 -59
Novembre 2009 43°06.34450 5°54.61193 60-62 -61
Novembre 2009 43°06.34450 5°54.61193 62-64 -63
Tableau 6: Données de la campagne 12HR
Date latitude Longitude Découpe (cm) Profondeur
moyenne
Novembre 2009 43°06.54960 5°55.61002 ES 5,00
Juin 2009 43°06.54960 5°55.61002 ES 5,00
Juin 2009 43°06.54960 5°55.61002 0-2 -1,00
Juin 2009 43°06.54960 5°55.61002 2-4 -3
Juin 2009 43°06.54960 5°55.61002 4-6 -5
Juin 2009 43°06.54960 5°55.61002 6-8 -7
Juin 2009 43°06.54960 5°55.61002 8-10 -9
Juin 2009 43°06.54960 5°55.61002 10-12 -11
Juin 2009 43°06.54960 5°55.61002 12-14 -13
Juin 2009 43°06.54960 5°55.61002 14-16 -15
Juin 2009 43°06.54960 5°55.61002 16-18 -17
Juin 2009 43°06.54960 5°55.61002 18-20 -19
Juin 2009 43°06.54960 5°55.61002 20-20 -21
Juin 2009 43°06.54960 5°55.61002 22-24 -23
Juin 2009 43°06.54960 5°55.61002 24-26 -25
Juin 2009 43°06.54960 5°55.61002 26-28 -27
Juin 2009 43°06.54960 5°55.61002 28-30 -29
Juin 2009 43°06.54960 5°55.61002 30-32 -31
Juin 2009 43°06.54960 5°55.61002 32-34 -33
Juin 2009 43°06.54960 5°55.61002 34-36 -35
Juin 2009 43°06.54960 5°55.61002 36-38 -37
Juin 2009 43°06.54960 5°55.61002 38-40 -39
Juin 2009 43°06.54960 5°55.61002 40-42 -41
Juin 2009 43°06.54960 5°55.61002 42-44 -43
Juin 2009 43°06.54960 5°55.61002 44-46 -45
Juin 2009 43°06.54960 5°55.61002 46-48 -47
Juin 2009 43°06.54960 5°55.61002 48-50 -49
Juin 2009 43°06.54960 5°55.61002 50-52 -51
Juin 2009 43°06.54960 5°55.61002 52-54 -53
Juin 2009 43°06.54960 5°55.61002 54-56 -55
Juin 2009 43°06.54960 5°55.61002 56-58 -57
Tableau 7: Données de la campagne 15HR
OGOULA OBELEMBYA. H. A MASTER 1 CHARME 2009 - 2010 Page 29

Date latitude Longitude Découpe (cm) Profondeur
moyenne
Novembre 2009 43°05.36440 5°54.66793 ES 5,00
Juin 2009 43°05.36440 5°54.66793 0-2 -1,00
Juin 2009 43°05.36440 5°54.66793 2-4 -3
Juin 2009 43°05.36440 5°54.66793 4-6 -5
Juin 2009 43°05.36440 5°54.66793 6-8 -7
Juin 2009 43°05.36440 5°54.66793 8-10 -9
Juin 2009 43°05.36440 5°54.66793 10-12 -11
Juin 2009 43°05.36440 5°54.66793 12-14 -13
Juin 2009 43°05.36440 5°54.66793 14-16 -15
Juin 2009 43°05.36440 5°54.66793 16-18 -17
Juin 2009 43°05.36440 5°54.66793 18-20 -19
Juin 2009 43°05.36440 5°54.66793 20-20 -21
Juin 2009 43°05.36440 5°54.66793 22-24 -23
Juin 2009 43°05.36440 5°54.66793 24-26 -25
Juin 2009 43°05.36440 5°54.66793 26-28 -27
Juin 2009 43°05.36440 5°54.66793 28-30 -29
Juin 2009 43°05.36440 5°54.66793 30-32 -31
Juin 2009 43°05.36440 5°54.66793 32-34 -33
Juin 2009 43°05.36440 5°54.66793 34-36 -35
Juin 2009 43°05.36440 5°54.66793 36-38 -37
Juin 2009 43°05.36440 5°54.66793 38-40 -39
Juin 2009 43°05.36440 5°54.66793 40-42 -41
Juin 2009 43°05.36440 5°54.66793 42-44 -43
Juin 2009 43°05.36440 5°54.66793 44-46 -45
Juin 2009 43°05.36440 5°54.66793 46-48 -47
Juin 2009 43°05.36440 5°54.66793 48-50 -49
Juin 2009 43°05.36440 5°54.66793 50-52 -51
Juin 2009 43°05.36440 5°54.66793 52-54 -53
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