Thèse Amandine Martin - EPHE
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UNIVERSITÉ DE BOURGOGNE & ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ÉTUDES<br />
U.F.R. DE MÉDECINE SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE<br />
MINISTÈRE DE L’ENSEIGNEMENT SUPÉRIEUR ET DE LA RECHERCHE<br />
THÈSE<br />
POUR OBTENIR LE TITRE DE<br />
DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE BOURGOGNE ET<br />
DE L’ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ÉTUDES<br />
DISCIPLINE : IMMUNOLOGIE<br />
PRÉSENTÉE ET SOUTENUE PUBLIQUEMENT LE 17 JUIN 2011<br />
PAR<br />
AMANDINE MARTIN<br />
IMMUNOTHÉRAPIE PAR L’OM-174 SEUL OU EN COMBINAISON AVEC<br />
L’OXALIPLATINE DANS UN MODÈLE DE CANCER COLIQUE CHEZ LE RAT<br />
MEMBRES DU JURY :<br />
MME FREDERIQUE PENAULT-LLORCA RAPPORTEUR<br />
M. YVES DELNESTE RAPPORTEUR<br />
M. JEAN-MARC CAVAILLON EXAMINATEUR<br />
MME. THI MY ANH NEILDEZ EXAMINATEUR<br />
M. JEAN-FRANÇOIS JEANNIN CO-DIRECTEUR DE THÈSE<br />
MME CATHERINE PAUL CO-DIRECTRICE DE THESE<br />
Laboratoire <strong>EPHE</strong> « Immunologie et Immunotherapie des tumeurs »<br />
Faculté de médecine Directeur de thèse : Jeannin Jean-François<br />
7 Bd Jeanne d’Arc jean-francois.jeannin@u-bourgogne<br />
21000 Dijon Co-directrice de thèse : Paul Catherine<br />
catherine.Paul@u-bourgogne.fr<br />
1
Immunothérapie par l’OM-174 seul, ou en combinaison avec l’oxaliplatine dans un<br />
modèle de cancer colique chez le rat<br />
Résumé<br />
Afin d’adapter et d’améliorer les traitements par immunothérapie dans les cancers humains, il est<br />
nécessaire de comprendre comment est induit la mort des cellules tumorales. L’immunothérapie par<br />
un lipide A, l’OM‐174, qui a été développé dans le laboratoire, est très efficace et induit la guérison<br />
de 95% de rats porteurs de carcinomatoses coliques.<br />
Dans ce projet, nous avons démontré que les neutrophiles pouvaient jouer un rôle important dans la<br />
régression tumorale. En effet, ils sont capables de tuer des cellules tumorales via l’expression et la<br />
sécrétion de granzyme B induit par les cytokines du microenvironnement tumoral et l’OM‐174.<br />
Lorsque le traitement commence plus tard après l’injection des cellules cancéreuses (J21) et<br />
s’adresse à des tumeurs volumineuses, l’efficacité de l’OM‐174 décroît. Cependant, l'association<br />
oxaliplatine + OM‐174 rétabli cette efficacité, en induisant la guérison de 95% des rats porteurs de<br />
ces carcinomatoses avancées. Nous avons démontré que cette combinaison induisait principalement<br />
une forte augmentation de l’expression de chimioattractants (CXCL) des neutrophiles mais<br />
également d’autres cellules immunitaires, des cytokines de l’inflammation et de la NOS II. Ces<br />
résultats ont été corrélés au recrutement de neutrophiles, macrophages, cellules dendritiques<br />
exprimant la NOS II, et au recrutement de lymphocytes T. L’OM‐174 induit donc une activation<br />
importante du système immunitaire qui est augmentée par l’oxaliplatine.<br />
Mots clés : cancer colique, OM‐174, immunothérapie, oxaliplatine, neutrophiles, granzyme B, CXCL.<br />
Immunotherapy by OM-174 alone or in combination with oxaliplatin in a colon<br />
cancer model in rat<br />
Abstract<br />
To adapt and improve treatment by immunotherapy in human cancers, it is necessary to understand<br />
how induces tumor cell death. Immunotherapy by a lipid A, OM‐174, which was developed in the<br />
laboratory, is highly effective and induces the cure of 95% of rats bearing colon carcinomatoses.<br />
In this project, we demonstrated that neutrophils could play an important role in tumor regression.<br />
Indeed, they are able to kill tumor cells via the expression and secretion of granzyme B induced by<br />
the tumor microenvironment cytokines and OM‐174.<br />
The efficacy of OM‐174 decreases when treatment starts later after injection of cancer cells (J21) and<br />
is intended for large tumors. However, oxaliplatin + OM‐174 combination restored the effectiveness.<br />
This combination induces the cure of 95% of these rats with advanced carcinomatoses. We<br />
demonstrated that this combination induced mainly a strong increase in the expression of<br />
neutrophils chemoattractant (CXCL) but also other immune cells, inflammatory cytokines and NOS II.<br />
These results were correlated to the recruitment of neutrophils, macrophages, dendritic cells<br />
expressing NOS II, and recruitment of T cells. OM‐174 induces a significant activation of the immune<br />
system, which is increased by oxaliplatin.<br />
Keyword: colon cancer, OM‐174, immunotherapy, oxaliplatin, neutrophils, granzyme B, CXCL.<br />
2
Liste des abréviations<br />
Liste des figures<br />
INTRODUCTION<br />
I. Le cancer colorectal<br />
1. Généralités<br />
SOMMAIRE<br />
2. Cancer et santé publique<br />
3. Epidémiologie du cancer colorectal<br />
4. Transformation cellulaire/développement tumoral<br />
5. Classification TNM (Tumeurs, Nodules, Métastases)<br />
B. Traitements<br />
1. Chirurgie<br />
2. Chimiothérapie<br />
3. L’immunothérapie<br />
II. Immunité et cancer<br />
A. Immunité innée<br />
1. Généralités sur le système immunitaire inné<br />
2. Les récepteurs du système immunitaire inné<br />
3. Les cellules du système immunitaire inné<br />
a) Les neutrophiles<br />
b) Les macrophages<br />
c) Les cellules Natural Killer<br />
d) Les cellules myéloïdes suppressives<br />
e) Les cellules dendritiques<br />
3
III. Lipides A et immunothérapie<br />
A. Immunothérapie non spécifique<br />
B. Immunothérapie par les lipides A<br />
Objectif du travail<br />
1. Historique<br />
2. Voie de signalisation des lipides A<br />
a) Récepteurs et protéines de la voie de signalisation<br />
b) Voie de signalisation de TLR4<br />
3. Lipides A et immunité antitumorale<br />
a) Réponses immunitaires générales induites par le lipide A<br />
b) Effets du lipide A sur l’immunité antitumorale<br />
4. Immunothérapie par des lipides A<br />
5. Immunothérapie par l’OM-174<br />
4
5-FU: 5-Fluorouracile<br />
A<br />
LISTE DES ABREAVIATIONS<br />
ADCC: Antibody dependent cellular cytotoxicity<br />
ADN: acide desoxyribonucléotique<br />
ADNc: ADN complémentaire<br />
AEC : 3-amino-9-ethylcarbazole<br />
AG: aminoguanidine<br />
AP-1: activator protein-1<br />
ARG-1: Arginase-1<br />
ARN: acide ribonucleique<br />
ARNc: ARN complémentaire<br />
ARNm: ARN messager<br />
B<br />
BCG: Bacille de Calmette et Guérin<br />
BET: Bromure d’éthidium<br />
BSA: Bovine serum albumine<br />
C<br />
CCL: Chemokine Ligand<br />
CCR: chemokine (C-C motif) receptor<br />
CINC: cytokine-induced neutrophil chemoattractant<br />
CLR: Lectines C<br />
CMH: Complexe majeur d’histocompatibilité<br />
CNTF: Ciliary Neurotrophic Factor<br />
5
CPA: Cellules présentatrices d’antigènes<br />
CPT-11: Irinotecan<br />
CSC: Cancer stem cells<br />
CTL: Lymphocyte T cytotoxique<br />
CXCL: CXC chemokine ligand<br />
CXCR: CXC chemokine receptor<br />
D<br />
DAMP: Danger-associated molecular pattern<br />
DAPI: 4’,6-diamidino-2-phenylindole<br />
DC: Cellule dendritique<br />
DNase: désoxyribonucléase<br />
dNTP :<br />
DO: densité optique<br />
E<br />
EGF: Epidermal growth factor<br />
EDTA: acide éthylène diamine tétraacétique<br />
E.L.I.S.A: Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay<br />
F<br />
FasL: Fas ligand<br />
fMLP: peptides formylés<br />
Folfox: oxaliplatine / 5-Fluorouracile / acide folinique<br />
G<br />
GAPDH: glycéraldéhyde-3-phosphate deshydrogénase<br />
GM-CSF: Granulocyte macrophage colony stimulating factor<br />
6
GPI: glycosylphosphatidylinositol<br />
GRO: growth-regulated protein<br />
GZMB: Granzyme B<br />
H<br />
H: heure<br />
H2O2: peroxyde d’hydrogène<br />
HAM’S:<br />
HBSS: Hank’s balanced salt solution<br />
HCl: Acide chlorhydrique<br />
HES: Hémalun Eosine Safran<br />
HMGB1: high-mobility group box 1<br />
HRP: horseradish peroxydase<br />
HSP: Heat shock protein<br />
I<br />
ICAM: Intercellular adhesion molecule<br />
IFN : Interferon<br />
Ig: immunoglobuline<br />
IHF: immunohistofluorescence<br />
IL: interleukine<br />
IL-1R: interleukin-1 receptor<br />
iNOS: NO synthase inductible<br />
IRAK: interleukin-1 receptor associated kinase<br />
IRF: interferon responsive factor<br />
I.P: intrapéritonéale<br />
I.V: intraveineuse<br />
7
J<br />
J: jour<br />
K<br />
KHCO3: Bicarbonate de potassium<br />
KO: knock-out<br />
L<br />
LAK: Lymphokine activated killer cells<br />
LBP: LPS binding protein<br />
LFA: Leucocyte function associated antigen<br />
LIX: Lipopolysaccharide-Induced CXC Chemokine<br />
LPS: lipopolisaccharides<br />
LRR: Leucine-rich repeats<br />
LT: leucotriène<br />
M<br />
MAPK: mitogen-activated protein kinase kinase<br />
MDSC: myeloid-derived suppressor cells<br />
MgCl2: Chlorure de magnésium<br />
MGG: May-Grünwald Giemsa<br />
Min: minute<br />
MIG: monokine induced by gamma-interferon<br />
MIP: Macrophage Inflammatory Protein<br />
MMP: Matrix metallopeptidase<br />
MPL: Monophosphoryl lipid A<br />
MyD88: myeloid differentiation factor-88<br />
N<br />
8
NaCl: Chlorure de sodium<br />
NaNO2: Sodium de nitrite<br />
NF-κB: nuclear factor κb<br />
NH4Cl: Chlorure d’ammonium<br />
NK: Natural killer<br />
NO: Monoxyde d’azote<br />
NO2 - : Nitrites<br />
NOS: NO synthase<br />
NP-40: Nonidet p40 (nonylphenoxy polyethoxy ethanol)<br />
O<br />
OCT: Tissu Teck<br />
P<br />
PA : Plasminogène<br />
PAI: inhibiteurs de l’activateur du plasminogène<br />
PAMP: Pathogen-associated molecular pattern<br />
PAF: Platelet-activating factor<br />
PBMC: Peripheral blood mononuclear cell<br />
PBS: phosphate buffer solution<br />
PBS-T: PBS-Tween<br />
PCR: polymerase chain reaction<br />
PMN: Polymorphonuclear<br />
PRR: Pathogen recognition receptor<br />
PSA: pénicilline / streptomycine / amphoctericine<br />
PSGL: P-sélectine ligand<br />
PVDF: Di-fluorure de polyvinyle<br />
9
R<br />
RANTES: regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted<br />
RNase: ribonucléase<br />
ROS: Reactive oxygen species<br />
RT-PCR: reverse transcription- polymerase chain reaction<br />
S<br />
SAB: serum albumine bovine<br />
SDS: sodium dodecyl sulfate<br />
SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophorese<br />
SEM: Standard Error of the Mean<br />
SRN: Sérum de rat normal<br />
SVF: serum de veau fœtal<br />
T<br />
TAE: tris-acétate-EDTA<br />
TdT: Terminal Deoxynucleotidyl Transferase<br />
TGF-β: tumor growth factor β<br />
Th: Lymphocyte T helper<br />
TIMP: Tissue Inhibitor of Metalloproteinases<br />
TIR: toll interleukin-1 receptor<br />
TIRAP: TIR domain containing adapter protein<br />
TLR: toll like receptor<br />
TNM: Tumeurs, Nodules, Métastases<br />
TNF: tumor necrosis factor<br />
TNF-R: TNF-receptor<br />
10
I. Le cancer colorectal<br />
A. Généralités<br />
INTRODUCTION<br />
1. Cancer et santé publique<br />
La lutte contre le cancer en France est devenue une priorité gouvernementale depuis<br />
2003 en faisant l’objet de deux «Plan Cancer» successifs. Le premier « Plan Cancer 2003‐<br />
2007 » se déclinait en 70 propositions regroupées en 6 chapitres : « prévenir, dépister,<br />
soigner, accompagner, enseigner, comprendre et découvrir », suivi du « Plan cancer 2009‐<br />
2013 » qui s’inscrit dans la continuité du précédent. Il se décline en 30 propositions<br />
regroupées en 5 axes : « recherche, observation, prévention‐dépistage, soins, vivre pendant<br />
et après un cancer ». En 2009, les grandes tendances et les évolutions survenues depuis<br />
2007 ont fait l’objet d’un rapport publié par l’Institut National du Cancer 1 . Ainsi, l’analyse<br />
des chiffres montre qu’en 2005, le nombre de nouveaux cas de cancers a été estimé à près<br />
de 320 000 dont 180 000 chez les hommes et 140 000 chez les femmes. Ce nombre a<br />
augmenté de 89 % entre 1980 et 2005 alors que le nombre de décès n’a augmenté que de<br />
13 %. Le cancer du côlon est le second cancer en termes de fréquence chez la femme (après<br />
le cancer du sein) et le troisième chez l’homme (après le cancer du poumon et la prostate).<br />
2. Epidémiologie du cancer colorectal<br />
Chaque année, environ un million de nouveaux cas de cancer colorectaux sont<br />
diagnostiqués dans le monde, et plus de 500 000 décès par an 2, 3, 4 . Avec les progrès des<br />
nouvelles thérapies, de nombreux cancers sont guéris, cependant selon l’avancée des<br />
cancers les traitements sont plus ou moins efficaces.<br />
On distingue plusieurs types de cancers colorectaux. Dans plus de 80 % des cas, il s’agit de<br />
cancers sporadiques, résultant de multiples mutations somatiques au sein de la cellule telles<br />
que des délétions homozygotes, des mutations ponctuelles ou des insertions, des<br />
translocations dans l’ADN 5, 6 . Il existe également des formes héréditaires, telles que le<br />
cancer du côlon non polyposique (HNPCC, 10‐15%), la polypose adénomateuse familiale<br />
(FAP, 10%) et le cancer sans polypose (10%) 7 .<br />
11
Grâce à un dépistage plus précoce et aux progrès des traitements, en France, le taux de<br />
survie à 5 ans est de 57,9%, l’un des meilleurs d’Europe 8 . Les sujets à risque moyen de<br />
cancer colorectal sont les individus de plus de 50 ans. L’incidence du cancer croit avec l’âge;<br />
elle est faible avant 30 ans, elle augmente significativement entre 40 et 45 ans, puis double<br />
tous les 10 ans et est maximale vers 70 ans. En effet, environ 70% des patients ont plus de<br />
65 ans et le cancer du côlon est plutôt rare chez des patients ayant moins de 45 ans (2 pour<br />
100 000 par an). Dans le groupe des patients âgés de 45 à 54 ans, l’incidence est d’environ<br />
de 20 pour 100 000 par an et par la suite, augmente à un taux beaucoup plus élevé : 55 pour<br />
100 000 par an pour les 55 à 64 ans, 150 pour les 65 à 74 ans et supérieur à 250 pour 100<br />
000 par an pour les plus de 75 ans 9 .<br />
En général, la médiane de survie des patients atteints d’un cancer du côlon avancé est<br />
d’environ 5 à 6 mois. En revanche, plus de la moitié des patients présentent ou<br />
présenteront des métastases, et recevront un traitement adjuvant, comme la<br />
chimiothérapie (Folfox), la médiane de survie est alors d’environ 10 à 12 mois mais leur taux<br />
de survie à 5 ans chute à 9% 2, 10 .<br />
3. Transformation cellulaire/développement tumoral<br />
Le cancer est une pathologie des organismes complexes présentant des tissus<br />
renouvelables. Cette maladie complexe peut affecter tous les tissus. Elle se développe suite<br />
à l’accumulation de plusieurs altérations de l’ADN 11 sous l’effet de facteurs divers<br />
(génétiques héréditaires, chimiques, physiques, biologiques et alimentaires) qui provoquent<br />
l’apparition et la progression de la tumeur. Actuellement, environ 384 gènes sont répertoriés<br />
comme pouvant être impliqués dans un cancer humain 12 . Aux altérations diverses de ces<br />
gènes (délétion, translocation…) peuvent s’ajouter, dans le processus de transformation<br />
cellulaire, des modifications épigénétiques comme des méthylations de l’ADN… 13 .<br />
Plus récemment, il a été mis en évidence dans des tumeurs l’existence de cellules possédant<br />
des propriétés de cellules souches (ayant des capacités d’auto‐renouvellement et de<br />
différenciation) qui sont dénommées : « cellules souches cancéreuses » ou « cancer stem<br />
cells » (CSC). Elles seraient à l’origine de la grande variété des cellules différenciées<br />
présentes au sein de la tumeur. Dès 1994, l’équipe de Dick mettait en évidence, au sein de<br />
myélomes murin, l’existence des cellules initiatrices de cancers 14 . Mais c’est bien plus tard,<br />
que ces CSC ont été mises en évidence dans des carcinomes de sein 15 et de tumeurs<br />
12
cérébrales 16 chez des patients. Il semblerait que les tumeurs solides soient constituées de<br />
proportions variables de CSC en fonction des patients 17 et que ces cellules initient le<br />
développement tumoral 18 et maintiennent continuellement la tumorigenèse.<br />
En 2000, D. Hanahan et R. Weinberg ont suggéré que les six principales<br />
caractéristiques des cellules cancéreuses étaient les suivantes : autonomie de croissance,<br />
insensibilité aux inhibiteurs physiologiques de la croissance cellulaire, échappement à<br />
l’apoptose, capacité de se diviser de façon illimitée (immortalisation), forte capacité<br />
angiogénique, d’invasion et de formation de métastases.<br />
Récemment, vu l’importance du rôle de surveillance du système immunitaire dans le<br />
développement des cellules tumorales, l’échappement à l’immunosurveillance a été suggéré<br />
comme septième caractéristique fondamentale des cellules tumorales.<br />
En effet, le développement d’une tumeur au sein d’un organisme est étroitement lié à son<br />
système immunitaire. Il est aujourd’hui bien connu qu’il existe un système<br />
d’immunosurveillance protégeant l’hôte de l’installation d’un foyer tumoral.<br />
Cependant, ce système peut également faciliter dans certains cas la progression tumorale.<br />
Le système immunitaire peut jouer un rôle ambivalent dans les relations entre l’hôte et la<br />
tumeur.<br />
4. Classification TNM (Tumeurs, Nodules, Métastases)<br />
Le système de classification des tumeurs est basé sur la profondeur des tissus envahis<br />
et le nombre de ganglions atteints. La classification TNM est le système international actuel<br />
de référence, proposé par le chirurgien français Pierre Denoix dans les années 1940‐1950, de<br />
façon à classer les cancers selon leur extension anatomique. Dans son principe, cette<br />
classification considère seulement les données cliniques et ne s’applique qu’à des cancers<br />
qui n’ont pas encore été traités.<br />
La lettre T symbolise la tumeur initiale, et la profondeur des tissus envahis. Elle est affectée<br />
de coefficient : de T0 (quand la lésion primitive n’est pas retrouvée) à T4 pour les tumeurs<br />
les plus étendues. Cette cotation dépend du volume tumoral, représenté par le diamètre<br />
maximum de la lésion, et de l’extension aux organes voisins (peau, vaisseaux, nerfs, os, etc.).<br />
La lettre N, de N0 à N3, dépend du territoire ganglionnaire, plus ou moins proche de la<br />
tumeur, de l’importance des adénopathies, du nombre de ganglions envahis. La lettre M est<br />
13
cotée M0 en l’absence de métastases connues ou M1 en leur présence, quel que soit leur<br />
siège, unique ou multiple.<br />
A partir de cette observation, les cancers du côlon ont été classés en quatre stades :<br />
‐ Stade I (T1‐T2, N0, M0)<br />
‐ Stade II (T3‐T4, N0, M0)<br />
‐ Stade III (Tous T, N1‐N2, M0)<br />
‐ Stade IV (métastases à distance)<br />
Ce système de classification topographique était prépondérant quand les principaux<br />
traitements des cancers, la chirurgie et la radiothérapie, n’avaient que des effets localisés. Sa<br />
pertinence diminue avec les traitements systémiques tels que la chimiothérapie,<br />
l’hormonothérapie, l’immunothérapie, la thérapie géniques…L’intérêt croissant pour de<br />
nouveaux caractères biologiques (degré de malignité, récepteurs hormonaux, modifications<br />
des chromosomes ou d’oncogènes, signature génétique…) participant à l’élaboration de la<br />
stratégie thérapeutique réduit encore davantage la pertinence de ce classement.<br />
B. Traitements<br />
1. Chirurgie<br />
La chirurgie constitue le traitement de première intention du cancer du côlon. Les<br />
cancers très superficiels sont parfois totalement réséqués par voie endoscopique, sans<br />
chirurgie complémentaire si la muqueuse musculaire n’est pas franchie. La chirurgie permet<br />
d'enlever la tumeur et les ganglions environnants. Toutefois, même dans le cas d’une<br />
tumeur bien localisée et délimitée, le seul traitement par chirurgie reste souvent insuffisant.<br />
En effet, les deux tiers des patients souffrant d’un cancer du côlon sont traités par la<br />
chirurgie dans un but curatif. Malheureusement près de 50 % de ces patients développent<br />
des métastases (dans le foie, les poumons…) après l’intervention. Cette seconde atteinte<br />
survient dans 90% des cas durant les 5 années post opératoires 21 .<br />
Il y a quelques années, la chirurgie curative était synonyme de chirurgie mutilante pour le<br />
patient atteint d’une tumeur solide. Avec l’apparition de la chirurgie laparoscopique et de la<br />
microchirurgie endoscopique trans‐anale cela n’est plus le cas 22, 23 . Cependant, ces progrès<br />
ont certes permis de diminuer le nombre de récidives locales mais ne permettent pas de<br />
traiter des cancers ayant déjà développé des métastases. C’est pourquoi dans bien des cas,<br />
on y associe des traitements adjuvants tels que la chimiothérapie, s’il y a des métastases<br />
14
ganglionnaires, hépatiques ou pulmonaires, ou l'application de traitements physiques sur les<br />
métastases : radiothérapie (rare), ablation par radiofréquence (RFA), traitements thermiques<br />
(cryothérapie) plus récemment découverts 24 .<br />
2. Chimiothérapie<br />
La chimiothérapie, quant à elle, est utilisée pour prévenir ou traiter les cancers<br />
métastatiques. Cette thérapie consiste à administrer au malade un médicament cytotoxique<br />
ciblant les cellules ayant une activité mitotique importante, comme les cellules tumorales,<br />
mais malheureusement aussi les cellules normales intestinales et hématopoïétiques et celles<br />
des follicules pileux.<br />
Nous devons la paternité du concept de chimiothérapie à Paul Ehrlich qui proposa en 1909<br />
un traitement de la syphilis, à partir d’un dérivé d’arsenic, le Salvarsan. Mais la recherche<br />
active d’agents chimiothérapeutiques à visée antitumorale n’a débutée que dans les années<br />
1950. Entre 1955 et 1975, le modèle L1210 de leucémie chez la souris a ainsi permis au NCI<br />
(National Cancer Institute) de développer 21 molécules (anthracyclines, taxanes, platines…)<br />
destinées à lutter contre le cancer et approuvées ultérieurement par la FDA (Food and Drug<br />
Administration) pour une utilisation clinique chez l’homme 25 .<br />
Les chimiothérapies classiques regroupent un ensemble de médicaments que l’on peut<br />
classer en quatre catégories suivant leur mode d’action :<br />
‐ Les agents alkylants (ex : dérivés du platine, tel que l’oxaliplatine)<br />
‐ Les antimétaboliques (ex : 5‐Fluorouracile, Méthotrexate, Fludarabine)<br />
‐ Les poisons du fuseau mitotique (ex : vinca‐alcaloides, taxanes (paclitaxel))<br />
‐ Inhibiteurs des topo‐isomérases I (ex : camptothécines) et II (ex : anthracyclines)<br />
Avant les années 1990, la principale molécule active contre les métastases des cancers<br />
colorectaux était le 5‐Fluorouracile (5‐FU). Il est toujours la molécule de référence et entre<br />
dans la quasi totalité des protocoles de chimiothérapie. En monothérapie, le taux de réponse<br />
à un an atteint seulement 10 à 15% avec une faible survie des patients 26,27 . De plus, le 5‐FU<br />
présente des effets toxiques importants (digestifs et hématologiques) qui peuvent être<br />
limitants chez certains patients. Il était donc important de trouver d’autres molécules. Deux<br />
nouvelles molécules ont alors fait leur apparition : l’irinotécan et l’oxaliplatine.<br />
15
L’irinotécan (CPT‐11, Camptosar®) a été identifié dans les années 1980. Son activité comme<br />
inhibiteur de la topoisomérase I semble particulièrement intéressante car elle diffère de<br />
celle du 5‐FU. Dans un premier temps, son activité a été démontrée en seconde ligne<br />
thérapeutique contre des tumeurs réfractaires au 5‐FU. D’autres études ont également<br />
révélé son intérêt dans un traitement combiné CPT‐11 plus 5‐FU. Les toxicités dues à<br />
l’irinotécan sont assez invalidantes, comme des diarrhées profuses et des neutropénies 28‐30 .<br />
La seconde molécule d’intérêt dans le traitement des cancers colorectaux est l’oxaliplatine<br />
(LOHP, Eloxatine®). L’oxaliplatine est un dérivé de platine de troisième génération,<br />
synthétisé dans les années 1970. L'atome de platine est complexé avec un 1,2<br />
diaminocyclohexane (DACH) et un groupe oxalate. C’est un énantiomère unique, le cis‐<br />
[oxalato (trans 1‐1‐1,2‐DACH) platine].<br />
L’oxaliplatine est la première molécule à base de platine, utilisée en monothérapie ou pluri‐<br />
thérapie, ayant une activité clinique contre les cancers colorectaux. Elle possède une action<br />
alkylante inhibant la synthèse et la réplication de l’ADN par formation de ponts intrabrins<br />
entre deux guanines adjacentes. L’oxaliplatine forme des adduits de platine sur l’ADN, créant<br />
des lésions et induisant l’apoptose de la cellule 26 . Des études lui confèrent une activité en<br />
seconde ligne et en monothérapie contre les tumeurs réfractaires au 5‐FU. Mais son<br />
principal intérêt réside dans la synergie développé avec le 5‐FU. Cette combinaison présente<br />
une efficacité qui la place au rang des associations les plus actives dans cette pathologie,<br />
mais là encore au prix d’une toxicité neurologique importante 31‐34 .<br />
En France, l’oxaliplatine a obtenu l’autorisation de mise sur le marché (A.M.M.) en 1996<br />
dans l’indication des cancers colorectaux métastatiques résistants au 5‐FU. Deux ans plus<br />
tard, la combinaison oxaliplatine/5‐FU/Acide folinique (FOLFOX) était acceptée en première<br />
ligne thérapeutique. Aux États‐Unis, le traitement en seconde ligne date de 2003, et<br />
l’approbation de première ligne a été autorisée en janvier 2004 35 . En seulement 8 ans, ce<br />
médicament est placé au rang des traitements de référence dans les cancers colorectaux.<br />
Cependant, le Folfox reste un traitement assez nouveau et ses paramètres d’efficacité et de<br />
tolérance ne sont pas tous établis. L’oxaliplatine a un profil d’activité différent de ses<br />
prédécesseurs (cisplatine et carboplatine), d’une part par son activité antitumorale puisqu’il<br />
est actif contre les tumeurs résistantes au cisplatine et d’autre part pour sa relative bonne<br />
tolérance clinique avec une absence de toxicités rénale et auditive et une faible<br />
hématotoxicité 36‐38 . En revanche des atteintes neurologiques souvent invalidantes sont<br />
16
limitantes. Le risque d'alopécie est plus faible sous oxaliplatine que sous Irinotecan. Par<br />
contre, on observe des neuropathies invalidantes sous oxaliplatine responsables de<br />
dysesthésies (fourmillements) au niveau des doigts et des orteils.<br />
3. L’immunothérapie<br />
Plus récemment devant l’échec relatif des traitements classiques, de nouvelles<br />
stratégies thérapeutiques ont été envisagées telles que les immunothérapies ayant pour<br />
objectif d’induire une réponse immunitaire capable de provoquer le rejet des cellules<br />
tumorales. Il s’agit par exemple, de l’utilisation d’anticorps monoclonaux chimériques ou<br />
humanisés dirigés contre des protéines des voies de signalisation couramment dérégulées<br />
dans les cancers. Notamment, le bevacizumab (Avastin®) dirigé contre le VEGF (Vascular<br />
Endothelial Growth Factor) qui est utilisé dans le cancer du côlon métastatique. Ce<br />
médicament bloque la néo‐vascularisation empêchant l’augmentation de l'apport sanguin à<br />
la tumeur, donc son développement 39 . Le cetuximab (Erbitux®) est un autre anticorps<br />
monoclonal qui bloque l'action du récepteur à l'EGF (Epidermal Growth Factor) des cellules<br />
cancéreuses et améliore significativement le pronostic de certains cancers du côlon 40,41 . Ces<br />
anticorps ont des effets secondaires moins importants que ceux des chimiothérapies<br />
conventionnelles dont ils augmenteraient l’efficacité, même si le gain reste faible (quelques<br />
mois) 42 et le coût très élevé.<br />
17
II. Immunité et cancer<br />
La paternité de l’immunologie est attribuée à Edward Jenner, qui à la fin du XVII e<br />
siècle, découvre que l’inoculation de la variole de la vache (vaccine ou Cowpox) inoffensive<br />
pour les humains les protège contre la variole. Mais en réalité les premières études cliniques<br />
montrant l’efficacité de l’inoculation de la variole datent plutôt du début du XVII e siècle 43 .<br />
Au XIX e siècle Louis Pasteur découvre à son tour les vaccins contre la rage et le choléra. Puis,<br />
au début du XX e siècle, Paul Ehrlich suggère que la prolifération anormale des cellules<br />
cancéreuses peut être contrôlée par notre système immunitaire, idée qui à l’époque fut<br />
rejetée. Enfin, dans les années 1950, Franck M. Burnet et Lewis Thomas, introduisent le<br />
concept d’immunosurveillance des tumeurs, reposant sur le fait que le système immunitaire<br />
a la capacité de détecter les cellules tumorales et de les détruire. A cette époque, la théorie<br />
qui domine est celle de la reconnaissance du « soi » et du « non‐soi » par le système<br />
immunitaire adaptatif. Cependant, elle ne permet pas d’expliquer les phénomènes de<br />
tolérance et de rejet de greffe par exemple, ou la nécessité de la présentation de l’antigène.<br />
C’est alors qu’à la fin des années 1980, Charles Janeway propose le concept d’immunité<br />
innée. La décision de réagir ou non à un agent étranger reposerait sur la reconnaissance de<br />
l’origine étrangère de motifs par des récepteurs, les PRR (Pattern Recognition Receptor).<br />
Puis, Polly Matzinger dans les années 1990, développe la théorie du danger. D’après elle, le<br />
déclenchement de la réponse immunitaire serait la conséquence de la reconnaissance de<br />
motifs moléculaires associés aux organismes pathogènes (PAMP, Pathogen‐Associated<br />
Molecular Pattern) par les PRR. Puis, dans les années 1990, Charles Janeway propose une<br />
théorie suggérant une liaison étroite entre les deux types de réponse innée et adaptative :<br />
les mécanismes moléculaires mis en jeu lors de la reconnaissance des micro‐organismes<br />
contrôleraient la nature de la réponse adaptative 44 .<br />
Enfin, dans les années 2000, différentes équipes suggèrent que le système immunitaire<br />
serait activé, non pas par la reconnaissance du non‐soi, qu’il attaque par opposition au soi<br />
qu’il tolère, mais plutôt par la reconnaissance par les PRR d’un soi endommagé, c'est‐à‐dire<br />
de molécules signalant un danger ou une lésion et regroupées sous le nom de DAMP<br />
(Danger Associated Molecular Pattern) 45, 46,47,48 . Ces molécules sont libérées lors d’une<br />
exposition à un pathogène ou à une toxine, au cours de la mort cellulaire, d’un choc<br />
18
hémorragique ou de l’ischémie : high‐mobility group box 1 (HMGB1), HSP (protéine du choc<br />
thermique), ADN et ARN. D’autres ligands peuvent être libérés suite à une lésion tissulaire<br />
chimique ou physique : fragments de hyaluronate, héparine sulfate, fibronectine et<br />
fibrinogène.<br />
A. Immunité innée<br />
1. Généralités sur le système immunitaire inné<br />
L’immunité innée est une réponse immédiate qui survient en l’absence<br />
d’immunisation préalable, elle constitue la première barrière de défense vis‐à‐vis des agents<br />
pathogènes et assure un rôle de sentinelle vis‐à‐vis des tumeurs. Elle fait intervenir des<br />
barrières physiques (épithéliums digestifs, bronchique et uro‐génital), une composante<br />
cellulaire (neutrophiles, macrophages…) et une composante humorale (facteurs du<br />
complément…). La réponse immunitaire innée élimine les substances étrangères, les cellules<br />
tumorales et leurs débris en les tuant et les phagocytant. Les cellules présentatrices<br />
d’antigènes (CPA) activent le système immunitaire adaptatif de façon spécifique en lui<br />
présentant des antigènes et en le stimulant.<br />
2. Les récepteurs du système immunitaire inné<br />
Les cellules immunitaires naturelles reconnaissent les cellules tumorales par<br />
l'intermédiaire de récepteurs tels que NKG2D qui lie spécifiquement les protéines MICA,<br />
MICB ou ULBP chez l'homme, H‐60 ou RAE chez la souris. L'interaction du récepteur NKG2D<br />
avec son ligand induit l'activité cytotoxique des cellules NK et des macrophages. Les cellules<br />
normales, qui à la suite d'un stress exprimeraient les ligands de NKG2D, sont protégées de<br />
l'activité cytotoxique des cellules NK par les molécules d'histocompatibilité de classes I qui<br />
en se liant à des récepteurs, tels que KIR (Killer cell Ig‐like Receptor), inhibent la signalisation<br />
de NKG2D.<br />
Les antigènes solubles, débris cellulaires ou les corps apoptotiques qui résultent de la mort<br />
des cellules tumorales vont être reconnus et ingérés par les CPA par macro‐pinocytose, endo<br />
ou phagocytose. La macro‐pinocytose ne nécessite pas de récepteur, elle est spontanée et<br />
assure l'ingestion d'une grande partie des protéines. Les récepteurs qui induisent<br />
l'endocytose sont principalement ceux des fragments Fc des immunoglobulines et des<br />
fragments activés du complément qui opsonisent les antigènes ou les pathogènes, les<br />
19
écepteurs de type lectines C (CLR) et les récepteurs scavenger. L'endocytose et la<br />
phagocytose nécessitent une activation des CPA, et notamment les DC immatures. La<br />
présentation de l'antigène n'est efficace que si des DC sont activés ce qui nécessite un<br />
deuxième signal provenant du pathogène ou de la cellule anormale. Ce signal est reconnu<br />
par un autre type de récepteur, les PRRs. Ces récepteurs ont été classés en trois<br />
familles constituées par : les récepteurs d’endocytoses (les récepteurs d’épuration ou<br />
« scavenger receptor » et les récepteurs lectiniques de type‐C), les récepteurs de<br />
signalisation (les molécules « Toll‐like receptors » (TLR) et les récepteurs intracellulaires hors<br />
TLRs comme les « NOD‐like receptor ») et les récepteurs solubles (les collectines, les ficolines<br />
et les pentraxines) 49 . Ces récepteurs sont exprimés constitutivement par les CPA et<br />
reconnaissent des courts motifs communs à des familles de molécules bactériennes, virales,<br />
parasitaires ou fongiques appelés PAMP, mais aussi les DAMP, molécules du soi qui<br />
proviennent des cellules mortes, mourantes ou souffrantes. Plusieurs études ont montré<br />
que ces signaux pouvaient induire l’activation et la maturation des cellules dendritiques<br />
52 .<br />
La liaison de ces signaux « dangers » avec un PRR va aboutir à l’activation de l’immunité<br />
innée. Cette activation peut se traduire par la sécrétion de cytokines inflammatoires (IL‐1β,<br />
TNF‐α, IL‐6…), la migration cellulaire (avec l’acquisition de CCR7 par exemple), l’expression<br />
de molécules de stimulation (CD80, CD86,…) permettant aux cellules de l’immunité innée<br />
d’acquérir la capacité de présenter l’antigène 53, 54 .<br />
Ces dernières années, les TLR qui font partie des PRR ont fait l’objet de nombreuses études.<br />
Treize TLR ont pour l’instant été identifiés chez les mammifères dont dix chez l’homme.<br />
Les TLR présentent une structure particulière très conservée. Il s’agit de glycoprotéines de<br />
type I intégrées à la membrane avec un domaine extracellulaire LRR (Leucine‐Rich Repeats)<br />
et un domaine cytoplasmique TIR (Toll IL‐1 Receptor). Le domaine extracellulaire interagit<br />
avec les structures microbiennes et induit l’oligomérisation des récepteurs. Les domaines<br />
TIR, quant à eux participent au recrutement de molécules adaptatrices qui initient la<br />
signalisation. Les TLR‐1,‐2,‐4,‐5,‐6 sont localisés au niveau de la membrane plasmique, les<br />
TLR‐3,‐7,‐8,‐9, de la membrane endosomale.<br />
L'activation des TLR conduit à celle de NFkB et d'IRF‐3 et à la production de cytokines<br />
inflammatoires et d'IFN, de chimiokines, à l'expression de CD40 et des molécules de co‐<br />
stimulation CD80 et CD86.<br />
50, 51,<br />
20
3. Les cellules du système immunitaire inné<br />
Les cellules de l’immunité innée n’ont pas seulement la responsabilité de surveiller et<br />
d’informer l’hôte mais ont également des fonctions antitumorales dont la lyse des cellules<br />
tumorales et la production de cytokines inhibant la croissance tumorale et bloquant<br />
l’angiogenèse. Les cellules du système immunitaire inné sont les mastocytes, les<br />
polynucléaires, les macrophages, les cellules myélosuppressives, les cellules NK et les cellules<br />
dendritiques. D’autres cellules participent à la croissance tumorale ou à son contrôle, ce sont<br />
celles du stroma : les fibroblastes et les cellules endothéliales principalement. Les récepteurs<br />
de ces cellules mais aussi les facteurs qu’elles produisent y participent également. Il s’agit<br />
des cytokines, des chimiokines, de la protéine C‐réactive, des protéines de la cascade du<br />
système du complément, et des facteurs du micro‐environnement ne provenant pas de la<br />
tumeur tels que l’arginine, des lipides 56, 57, 58, 59 .<br />
a) Les neutrophiles<br />
Le neutrophile, ou leucocyte polymorphonucléaire (PMN), a été décrit pour la<br />
première fois par Paul Ehrlich dans les années 1900. Le diamètre de ces cellules est de 10 à<br />
20µm et il est caractérisé par un noyau polylobé et de nombreux granules cytoplasmiques.<br />
Comme les autres cellules du système immunitaire, le neutrophile se différencie dans la<br />
moelle osseuse à partir d’une cellule souche hématopoïétique. Les neutrophiles en<br />
circulation et en périphérie ont une durée de vie courte de 7 à 12 heures. Ils sont attirés par<br />
des chimiokines, dont celles qui pourraient être produites dans la tumeur par les cellules<br />
endothéliales, les fibroblastes voire les cellules tumorales.<br />
La migration des neutrophiles des vaisseaux sanguins vers les tissus est contrôlée par une<br />
cascade d’interactions. En condition normale, les neutrophiles s’attachent faiblement aux<br />
cellules endothéliales qui forment la paroi interne du vaisseau sanguin. Ceci est dû à des<br />
molécules d’adhésion de faible affinité, les sélectines et les « mucine‐like », exprimées à la<br />
surface des cellules endothéliales et des neutrophiles (par exemple, respectivement, la P‐<br />
sélectine et le P‐sélectine ligand (PSGL‐1). Emportés par le flux sanguin, ils roulent<br />
littéralement sur la paroi du vaisseau: il s’agit de l’étape de roulement ou «rolling» 60, 61, 62 .<br />
Si, durant cette première étape, les neutrophiles sont en contact avec des produits<br />
bactériens (ex: peptides formylés (fMLP), lipopolysaccharides (LPS)), d’autre molécules<br />
21
proinflammatoire et chimiokines (leucotriène (LT) B4, IL‐8, fragments du complément), les<br />
neutrophiles entrent alors dans la deuxième étape: l’activation 60,62 . Les neutrophiles activés<br />
et les cellules endothéliales en condition inflammatoire vont alors exprimer de nouvelles<br />
molécules à leur surface: des molécules d’adhérences de forte affinité telles que les<br />
intégrines chez les neutrophiles et les molécules de la superfamille des immunoglobulines<br />
sur l'endothélium. Il peut à ce moment y avoir interaction entre LFA‐1 (Leucocyte Function<br />
associated Antigen) et son ligand ICAM‐1 (InterCellular Adhesion Molecule), mais également<br />
entre des sélectines ou ICAM1 et l’intégrine LFA‐1 (CD11a / CD18 ou l'intégrine L2 / CD18)<br />
et ICAM1 et MAC1 (CD11b / CD18 ou l'intégrine M2 / CD18).<br />
Les neutrophiles vont alors se fixer fermement à la paroi du vaisseau sanguin: c’est la<br />
troisième étape d’arrêt et d’adhérence ferme. Enfin la quatrième étape est l'immobilisation<br />
des neutrophiles qui provoque une réaction inflammatoire, qui conduit à leur diapédèse ou<br />
extravasation et à l'infiltration des tumeurs 60,62 . Les neutrophiles sont donc activés par<br />
paliers : ils sont élicités des vaisseaux sanguins, primés puis activés par le chimiotactisme, la<br />
transmigration et le microenvironnement tumoral.<br />
Une tumeur est le siège d'une réaction inflammatoire plus ou moins forte mais permanente<br />
qui conduit à son infiltration plus ou moins importante par des neutrophiles. Mais, le rôle<br />
des neutrophiles sur la croissance tumorale est sujet à discussion. En effet, un certain<br />
nombre de travaux suggèrent un rôle plutôt pro‐tumoral des neutrophiles. Récemment, il a<br />
été montré que la déplétion des neutrophiles provoque un retard de croissance de la<br />
tumeur, notamment en diminuant la quantité de VEGF et de MMP‐9 dans le<br />
microenvironnement tumoral et en réduisant l’angiogenèse 63, 64 . Par contre, d'autres<br />
travaux montrent que la déplétion en neutrophiles (au moyen d’anticorps monoclonaux) et<br />
l’inhibition de leur recrutement a pour conséquence premièrement d’augmenter la vitesse<br />
de croissance des tumeurs 65, 66 , deuxièmement d'augmenter la quantité de cytokines de<br />
type Th2 pro‐tumorales (IL‐4 et IL‐10) et enfin de diminuer la quantité de cytokines de type<br />
Th1 antitumorales (IFN‐γ et IL‐12) 67 . Ces données montrent qu'il n'existe pas de loi générale<br />
régissant le devenir d'une tumeur infiltrée par des neutrophiles mais des situations<br />
individuelles dont l'issue ne dépend pas des seuls neutrophiles mais des autres cellules de la<br />
tumeur et du microenvironnement.<br />
Néanmoins, en situation inflammatoire le comportement du neutrophile est constant. Leur<br />
survie est augmentée, jusqu’à 4 jours 68, 69 . Grâce à leur capacité importante de réponse au<br />
22
chimiotactisme, les neutrophiles sont attirés en très grand nombre sur le site de<br />
l’inflammation où ils sont pleinement activés par des facteurs inflammatoires (GM‐CSF, IL‐8,<br />
GROα, β et γ, IFN‐γ, IL‐4, TNF‐α …). Les neutrophiles ainsi activés deviennent cytotoxiques,<br />
grâce à la production des ROS (Reactive Oxygen Species), et des effecteurs de mort, toxiques<br />
pour toutes les cellules qui n'en sont pas protégées 70 . Le neutrophile lui‐même se protège<br />
de certains facteurs toxiques qu'il produit en les confinant dans des granules 70, 71 . Ces<br />
granules sont classés en quatre catégories :<br />
‐ les granules primaires : les azurophiles. Rarement sécrétés à l'extérieur de la cellule,<br />
fusionnant plutôt avec le phagosome pour y délivrer des enzymes dégradant les débris<br />
cellulaires.<br />
‐ les granules secondaires : ou spécifiques sont riches en lactoférine et métallo‐<br />
protéase inactives, elles sont alors libérées dans le milieu extracellulaire où elles sont<br />
activées.<br />
‐ Les granules tertiaires : ou granules de gélatinases contiennent, comme leur nom<br />
l’indique, des gélatinases.<br />
‐ les granules sécrétés : contiennent des phosphatases alcalines.<br />
Les neutrophiles expriment également à leur surface les récepteurs des fragments Fc des<br />
immunoglobulines (FcγRI et FcγRII), qui leur permettent de s’attaquer aux tumeurs par ADCC<br />
(antibody dependent cellular cytotoxicity). En général, les neutrophiles cherchent à détruire<br />
les pathogènes en les ingérant dans des phagolysosomes et en les soumettant à des<br />
molécules toxiques, des enzymes, des espèces réactionnels de l’oxygène, des anions<br />
superoxydes et du monoxyde d’azote. Les neutrophiles peuvent également sécréter des<br />
molécules toxiques comme les défensines et les enzymes lysosomiales. Si les neutrophiles<br />
n’arrivent pas à ingérer les pathogènes, ils libèrent alors ces médiateurs dans<br />
l’environnement extracellulaire et contribuent ainsi aux dommages cellulaires locaux 72 . La<br />
production de ces facteurs très labiles se fait donc à proximité de la cellule tumorale. Par<br />
contre les effecteurs de mort comme FasL se fixent sur leur récepteur Fas, soit après avoir<br />
été produits dans le milieu extracellulaire soit ancrés à la membrane cellulaire du<br />
neutrophile 73, 74, 75, 76 .<br />
23
) Les macrophages<br />
Les macrophages, obtenus à partir de la différenciation des monocytes circulants,<br />
sont des phagocytes mononuclées présents dans un grand nombre de tissus. Leurs<br />
principales fonctions dans le système immunitaire sont de réguler la réaction inflammatoire<br />
locale par production de cytokines pro‐ ou anti‐inflammatoires, de fournir un premier<br />
mécanisme de défense non spécifique par phagocytose et d’initier le déclenchement d’une<br />
réponse immunitaire adaptative par présentation d’antigènes aux lymphocytes T 77 . Leur<br />
activation dépend de leur état de différenciation, ainsi que de facteurs extérieurs : cytokines<br />
et stimuli inflammatoires ou anti‐inflammatoires. Les macrophages présents in situ peuvent<br />
être activés par différentes cytokines dont l’IFN‐γ, L’IL‐4, le TNF‐α ou encore le Granulocytes<br />
and Macrophages Colony Stimulating Factor (GM‐CSF). Les macrophages disposent de<br />
récepteurs NKG2D qui reconnaissent à la surface des cellules tumorales des ligands MIC A,<br />
MIC B ou ULBP (chez l'homme), H‐60 ou RAE (chez la souris) 78, 79 . Leur interaction active la<br />
cytotoxicité des macrophages qui se traduit par la sécrétion de cytokines cytotoxiques (TNF‐<br />
, IL‐1β, IL‐6…) la production de radicaux libres dont le NO et la sécrétion de protéases<br />
(lysozymes, urokinase, collagènase, élastase…). Les macrophages disposent également de<br />
récepteurs des fragments Fc des immunoglobulines et des fragments activés du complément<br />
qui après liaison avec des antigènes induisent la phagocytose des débris cellulaires et des<br />
cellules tumorales entières 80 .<br />
Les macrophages apprêtent les antigènes tumoraux et sont capables de présenter le même<br />
peptide fixé soit à une molécule du CMH I soit à une molécule du CMH II, ce qui permet le<br />
développement d'une réponse T, ce qui fait des macrophages des CPA. De plus, les<br />
macrophages sont sensibles à l’environnement et adaptent leur activité en réponse aux<br />
différents signaux provenant de la tumeur. En effet, les cytokines de type Th1, telles que<br />
l’IFN‐, l’IL‐1 induisent de la part des macrophages des réponses anti‐tumorales :<br />
cytotoxicité (production de TNF‐, FasL), stimulation de la réponse adaptative (production<br />
d'IL‐12, IL‐23), inhibition de l'angiogénèse (production de MMP‐12), le macrophage est alors<br />
dit de phénotype M1. En revanche, des cytokines Th2 comme l’IL‐4 et l’IL‐13 induisent des<br />
réponses pro‐tumorales : facteurs de croissance (ornithine, polyamines) inhibition de la<br />
réponse adaptative (TGF‐1, IL‐1Ra), angiogénèse (VEGF…) et un phénotype de type plutôt<br />
M2 81, 82, 83, 84, 85, 86 .<br />
24
c) Les cellules Natural Killer<br />
Il s’agit de grands lymphocytes granuleux capables de lyser spontanément certaines<br />
cellules tumorales sans stimulation antigénique préalable. La fonction des cellules NK est de<br />
reconnaître et de tuer des cellules tumorales ou infectées par des virus en induisant<br />
l’apoptose.<br />
Les cellules NK reconnaissent des ligands chez l’homme comme les protéines MIC A, MIC B,<br />
codées dans le locus HLA, ULBP (UL‐16 binding proteins) ou chez la souris les protéines RAE,<br />
H‐60 à la surface des cellules tumorales, par l'intermédiaire de récepteurs NKG2D qui<br />
transmettent un signal activateur 87 . La particularité de ces différents ligands est d'être<br />
induits dans des circonstances de stress cellulaire ou de transformation tumorale.<br />
Les NK reconnaissant également les molécules du CMH I grâce aux récepteurs KIR qui<br />
inhibent l’action des récepteurs NKG2D 88, 89 , ce qui a pour conséquence de bloquer l'activité<br />
toxique des cellules NK pour les cellules qui expriment le CMH I, c'est‐à‐dire les cellules<br />
normales et certaines cellules tumorales, et une activité toxique des cellules NK pour les<br />
cellules tumorales qui n'expriment pas le CMH I 90, 91, 80 88,89 . L’activation des cellules NK<br />
résulte également d'interactions entre des molécules d'adhérence et leurs ligands, des<br />
cytokines (IL‐2, IFN‐γ, TNF‐…) et leurs récepteurs.<br />
L'activation des cellules NK se fait au niveau de synapses immunologiques, les liaisons<br />
formées activent la production et la sécrétion de granzymes et de perforines dans l'espace<br />
synaptique, de cytokines cytotoxiques (TNF‐, FasL, TRAIL), de cytokines cytotoxiques et<br />
régulatrices (IFN‐), et l'apoptose des cellules tumorales 88, 89, 92, 93 . L'IL‐2 induit la<br />
prolifération et la différenciation de cellules NK cytotoxiques, les Lymphokine Activated Killer<br />
cells qui peuvent être obtenus in vitro et transférées aux patients.<br />
d) Les cellules myéloïdes suppressives<br />
Les cellules myéloïdes suppressives (MDSC pour myeloid‐derived suppressor cells)<br />
sont identifiées chez l’homme et chez la souris comme des cellules immatures capables<br />
d’inhiber les fonctions des lymphocytes T. Elles s’accumulent au cours de la croissance<br />
tumorale chez la souris et chez l’homme et contribuent au développement des tumeurs.<br />
Les MDSC représentent une population hétérogène de la lignée myéloïde de type<br />
monocytes/macrophages à des stades variés de différenciation et sont caractérisés par une<br />
forte capacité à supprimer les différentes fonctions des cellules T. Chez la souris, les MDSC<br />
25
ont été identifiées comme des cellules co‐exprimant les marqueurs membranaires CD11b et<br />
Gr‐1 (Ly6C/G) 94 et une morphologie mixte associant des caractéristiques de monocytes<br />
mononucléés et des polynucléaires neutrophiles 95 . Chez l’homme les MDSC ont été définies<br />
comme des cellules exprimant un marqueur myéloïde commun CD33 et une morphologie de<br />
monocyte ou de polynucléaire neutrophile 96, 94 . Chez les patients atteints de différents types<br />
de cancers, la proportion de ces cellules augmente de façon importante dans le sang<br />
périphérique.<br />
Les MDSC ont démontré leur capacité à inhiber l’activation des lymphocytes T par différents<br />
mécanismes 97 . Elles assimilent et séquestrent l’arginine et la cystéine, privant les<br />
lymphocytes T de ces acides aminés essentiels à leur activation puisqu’ils ne peuvent les<br />
produire eux‐mêmes. En effet, les MDSC utilisent notamment deux enzymes impliquées<br />
dans le métabolisme de la L‐arginine 98, 99, 100 : la NO synthétase inductible (iNOS) qui<br />
convertit la L‐arginine en monoxyde d’azote (NO) et L‐citrulline 101 , et l’arginase. Ces deux<br />
enzymes ont pour effet d’induire l’apoptose des lymphocytes T et elles produisent<br />
également des espèces réactives de l’oxygène (ROS) et des peroxynitrites qui inhibent les<br />
lymphocytes T CD8 en catalysant la nitrosylation des récepteurs a l’antigène 102 .<br />
Les MDSC ont été également montrées comme agissant indirectement en secrétant du TGF‐<br />
β (Transforming Growth Factor β) 103, 104 et de l’IL‐10, cytokines induisant les lymphocytes T<br />
régulateurs eux‐memes exercant une fonction suppressive sur les autres lymphocytes T 105 ,<br />
106 . Enfin, les MDSC participent a la vascularisation tumorale en produisant des facteurs<br />
proangiogeniques comme le VEGF 107 .<br />
e) Les cellules dendritiques<br />
Dans les tissus périphériques, les cellules dendritiques (DCs) sont présentes dans un<br />
état « immature » qui autorise la capture des antigènes par pinocytose, endocytose ou<br />
phagocytose 108 . Une fois les antigènes capturés, les DCs les apprêtent et acquièrent la<br />
capacité de migrer vers les organes lymphoïdes secondaires drainants. L'antigène est le<br />
premier signal qui active les DC, mais pour stimuler les lymphocytes T, les DC doivent<br />
achever leur différenciation ce qui est le fait d'un deuxième signal issu de l'environnement. Il<br />
peut s'agir d'une molécule de stress provenant des cellules tumorales tuées par les cellules<br />
de la réponse innée. Les HSP par exemple libérées par les cellules tumorales activent les DC<br />
par l'intermédiaire des TLR4. Les DC « matures » sont caractérisées par une activité<br />
26
phagocytaire faible, la capacité de présenter l'antigène et celle de stimuler les lymphocytes T<br />
69 . Les DCs présentent un large éventail de molécules de co‐stimulation et d’adhésion<br />
(comme B7‐1, B7‐2, CD40, LFA3 ICAM1, ICAM3) qui, avec le récepteur de l'antigène lié à<br />
l'antigène, participent à l'activation des lymphocytes T 109 . Pour que les lymphocytes T<br />
prolifèrent et se diférencient en T auxilliaires de type 1 (Th1) et en T cytotoxiques un<br />
troisième signal est nécessaire, il est fourni par les cytokines : IL‐2, IFN‐, IL‐12 produites<br />
essentiellement par les cellules de la réponse innée.<br />
III. Lipides A et immunothérapie<br />
L’immunothérapie antitumorale est une stratégie permettant d’activer et d’améliorer<br />
le fonctionnement du système immunitaire afin d’éliminer une tumeur sans affecter les<br />
cellules normales. Elle regroupe des stratégies thérapeutiques très différentes selon qu’elles<br />
mobilisent les ressources du système immunitaire du malade (immunothérapie active) ou au<br />
contraire qu’elles utilisent des réactifs immunologiques ou des cellules immunitaires<br />
apportés de l’extérieur (immunothérapie passive).<br />
A. Immunothérapie non spécifique<br />
L’immunothérapie active est non spécifique lorsqu’elle repose sur l’administration<br />
d’activateurs du système immunitaire comme des agents bactériens ou des cytokines.<br />
Un siècle après le concept initial de Paul Ehrlich et William Coley en 1890 110 , HW Herr a<br />
utilisé le bacille de Calmette et Guérin (BCG) pour infecter des patients atteints de cancer de<br />
la vessie 111 . Bien que le mécanisme précis de l’action de ce bacille ne soit pas connu, il est<br />
probablement en rapport avec l’inflammation vésicale qu’il provoque qui conduit au rejet<br />
des cellules cancéreuses de la paroi vésicale 112 . Aujourd’hui, le traitement standard des<br />
tumeurs superficielles de la vessie est toujours la résection endoscopique suivie de<br />
l’administration de BCG 113 .<br />
Les cytokines qui sont libérées par différentes cellules en réponse à un signal d’activation 114 ,<br />
peuvent être utilisées en immunothérapie pour leur action toxique sur les cellules<br />
tumorales, ou stimulatrice sur la réponse immunitaire déficiente du patient, ou encore pour<br />
améliorer la présentation d’antigènes tumoraux 115 . L’IL‐2 et l’IFN‐α sont les deux principales<br />
cytokines utilisées dans cette approche. L’IFN‐α est utilisé surtout dans les cancers du rein<br />
27
métastatiques 116 , les mélanomes malins 117 et les sarcomes de kaposi asymptomatiques<br />
évolutifs 118 . L’IL‐2 est administrée à des patients atteints de mélanomes 119 et de cancers du<br />
rein métastatiques 120 . L’association des deux cytokines, IL‐2 et IFN‐α, est plus efficace sur les<br />
cancers du rein métastatiques que les cytokines seules 121 . De plus l’activité antitumorale de<br />
l’IL‐12 a été démontrée dans de nombreuses études in vivo dans des modèles murins 122 , elle<br />
a fait l’objet d’une dizaine d’essais cliniques de phase I dans différents types de cancers qui<br />
laissent espérer des réponses encourageantes 123 .<br />
B. Immunothérapie par des lipides A<br />
1. Historique<br />
Vers la fin des années 1870, Robert Koch propose la théorie que chaque maladie<br />
infectieuse est provoquée par un micro‐organisme, puis on découvre que les bactéries<br />
exercent souvent leur pouvoir pathogène en produisant des toxines. Cette activité toxique<br />
étant liée au corps bactérien, elle fut dénommée endotoxine, par opposition aux exotoxines<br />
diphtériques, tétaniques et botuliniques connues à l’époque et présentes dans le surnageant<br />
de culture de bactéries 124 .<br />
L'effet thérapeutique des toxines bactériennes contre les cancers a été observé dès le XIX ème<br />
siècle. Un mélange de toxines provenant de Serratia marcescens (Bacillus prodigiousus,<br />
Gram ‐) et de Erysipelas (Gram +) connu maintenant sous le nom de Streptococcus, filtré et<br />
inactivé par la chaleur, a été utilisé pour traiter des patients atteints de carcinomes et de<br />
sarcomes 125 par William Coley. Walter Morgan et Walther Goebel, dans les années 1930‐<br />
1940, montrèrent que la toxine thermostable de toutes les bactéries Gram négatif contient<br />
des polysaccharides, des lipides et des protéines. Puis Murray Shear en 1943, découvre que<br />
la substance toxique antitumorale dans les toxines de Coley est essentiellement composée<br />
de polysaccharides et de lipides, il la nomme lipopolysaccharide (LPS) 126 . La caractérisation<br />
de la structure des LPS a permis l'identification du lipide A 127 et sa synthèse chimique 128 .<br />
Les endotoxines sont des LPS qui participent à la constitution des parois de bactéries<br />
Gram négatives, elles sont ancrées dans la région hydrophobique de la membrane externe<br />
129 .<br />
Les LPS sont composés de trois régions structurellement et génétiquement distinctes:<br />
28
‐ La chaîne O‐spécifique est constituée de séquences oligosaccharidiques<br />
répétées, responsables de l’activité antigénique. Cette partie permet le sérotypage des<br />
bactéries 130 . Elle forme la partie externe du LPS.<br />
‐ Le noyau oligosaccharidique ou « core » (ou KDO) constitue le lien entre la<br />
chaine O spécifique et le lipide A. Cette région et le lipide A jouent un rôle fondamental dans<br />
la croissance et la survie des bactéries.<br />
‐ Le lipide A ancre la molécule de LPS à la membrane des bactéries, il est le siège<br />
de l’activité inflammatoire des LPS. Le lipide A s’insère entre les phospholipides de la couche<br />
externe de la membrane bactérienne. Le lipide A est moins variable que la chaine O, il est<br />
commun à une espèce bactérienne.<br />
Les Lipides A :<br />
La plupart des lipides A sont toxiques. Le lipide A induit à lui seul l'expression de la<br />
majorité des effets physiopathologiques de la molécule de LPS complète 132 . L’intégrité de la<br />
structure du lipide A est nécessaire à son activité toxique. Il active les cellules du système<br />
immunitaire (monocytes, macrophages, les polynucléaires, les lymphocytes B) et les cellules<br />
endothéliales, qui expriment constitutivement les récepteurs TLR 133 .<br />
Les premières expériences effectuées afin d’élucider la composition de la fraction<br />
responsable de l’effet endotoxinique ont été faites dans les années 1950 par O. Lüderitz et<br />
O. Westphal qui ont soumis les lipopolysaccharides à un traitement acide qui coupe le lien<br />
covalent lipide A‐core. Ils ont ainsi obtenu le premier fragment de LPS qui ne contient plus<br />
de polysaccharides provenant de l’antigène O ou du core. Ce fragment a été dénommé plus<br />
tard lipide A. A la fin des années 1960, plusieurs équipes démontrèrent que les structures qui<br />
ne comportent que le lipide A et le KDO sont aussi toxiques que les structures complètes, et<br />
que la plus grande partie du core ne joue aucun rôle dans la toxicité. Le rôle du lipide A fut<br />
définitivement établi en 1984, quand Tetsuo Shiba et Soichi Kusumoto synthétisèrent la<br />
première molécule de lipide A d’Escherichia coli. Cette molécule synthétique présentait les<br />
mêmes propriétés biologiques que le lipide A naturel, injectée à des animaux, elle stimulait<br />
le système immunitaire 134, 135 . Le lipide A synthétique et sa version naturelle ayant la même<br />
structure et la même activité biologique, il est établi que le lipide A est bien la structure du<br />
LPS responsable de son effet biologique (à l’exception de son antigénicité) et de son effet<br />
antitumoral 136 .<br />
29
Le lipide A utilisé dans notre étude est L’OM‐174, un analogue de lipide A chimiquement<br />
défini, hautement purifié à partir d’une souche mutante d’Escherichia coli produite par les<br />
laboratoires OM Pharma (Meyrin, Suisse). Ce lipide A est une di‐glucosamine comportant 3<br />
chaînes d’acides gras (2 acides hydroxymyristiques fixés chacun sur un groupement amine et<br />
un acide laurique) et deux groupements phosphates 137 .<br />
2. Voie de signalisation des lipides A<br />
a) Récepteurs et protéines de la voie de signalisation<br />
Les récepteurs Toll‐Like sont uniques dans leur capacité à reconnaître les PAMPs des<br />
divers produits microbiens, incluant les lipides A. Il a été montré que les lipides A activaient<br />
les cellules via le récepteur TLR4, probablement via également le récepteur TLR2 et par<br />
l’intermédiaire de complexes formés avec les protéines LBP, CD14 et MD‐2.<br />
LBP et CD14 :<br />
La LBP pour « LPS binding protein » a été la première molécule découverte associée<br />
au lipide A, il s’agit d’une protéine de transport de lipides.<br />
La protéine CD14 est ancrée à la membrane par un glycosylphosphatidylinositol (GPI), elle<br />
est préférentiellement exprimée à la surface des cellules myéloïdes matures (cellules<br />
phagocytaires par exemple) 138 . Elle initie la transduction du signal du lipide A. Le CD14 fixé à<br />
la membrane peut lier le lipide A en absence de LBP, cependant la LBP augmente son<br />
affinité. Ce récepteur CD14 existe également sous forme soluble et peut se fixer sur des<br />
cellules qui en sont déficientes, comme les cellules endothéliales.<br />
La fixation du lipide A sur CD14 induit la translocation nucléaire de NF‐B et la libération du<br />
facteur de transcription c‐Rel codant des cytokines pro‐inflammatoires comme l'IL‐6 139 . De<br />
plus, cette fixation induit aussi l'expression de la NOS II (NO‐synthase inductible) et de l'IL‐1<br />
des macrophages péritonéaux, alvéolaires et des monocytes du sang périphérique chez le rat<br />
140 .<br />
Enfin, l’importance de CD14 dans la réponse au lipide A a été démontrée dans des souris<br />
déficiente en CD14, montrant une diminution de la réponse au lipide A 141 . De plus,<br />
l’utilisation d'anticorps dirigés contre le CD14 inhibe la capacité des lipides A à stimuler les<br />
30
cellules phagocytaires (inhibition de la production de TNF‐) ainsi que les cellules<br />
endothéliales 138, 142 .<br />
CD14 n’a pas le domaine transmembranaire requis pour l’activation cellulaire. Le complexe<br />
LPS‐LBP‐CD14 requiert donc un récepteur supplémentaire pour transduire le signal de la<br />
membrane au cytoplasme. CD14 transfert le signal à d’autres protéines transmembranaires,<br />
notamment à TLR4, et à un moindre degré TLR2.<br />
TLR4<br />
Les TLR sont codés par dix gènes chez l’homme et douze chez la souris 143, 144 . Chaque<br />
TLR reconnaît des PAMPs variés 143, 145 , leur activation induit la production de cytokines<br />
proinflammatoires (IL‐1, IL‐6, TNF‐), de chimiokines (CCL‐20, IL‐8, RANTES), de molécules<br />
cytotoxiques (NO et défensine) et l’expression de molécules de co‐stimulation (CD86, CD80,<br />
B7.1 et B7.2) 145, 146, 147 .<br />
Les souris de souche C3H/HeJ sont connues depuis plus de 30 ans pour leur absence de<br />
réponse aux LPS. Cette déficience a été corrélée à la présence d’une mutation au niveau<br />
d’un gène nommé Lps 148 . Beaucoup plus tard, il a été mis en évidence que ce gène Lps<br />
correspondait à la forme mutée du gène TLR4 149 . La génération de souris déficientes en<br />
TLR4 a peu de temps après confirmé l’implication du TLR4 dans la reconnaissance des LPS<br />
150 .<br />
TLR4 reconnaît non seulement le lipide A mais aussi différents ligands comme par exemple le<br />
taxol 151 , HSP 60 (Heat Shock Protein) 152 , HSP 70 153 ou le hyaluronane 154, 155 . Les LPS et le<br />
lipide A sont des immuno‐stimulateurs, donc TLR4 peut être activé par de petites quantités<br />
de lipide A.<br />
Le récepteur TLR4 est requis, mais cependant n’est pas suffisant pour induire une réponse<br />
vis à vis du lipide A.<br />
MD‐2 :<br />
L’association de la protéine MD‐2 au domaine extracellulaire du TLR4 est nécessaire à<br />
une activation optimale du TLR4 155, 156 . MD‐2 se trouve principalement sous forme soluble,<br />
mais un domaine intra‐membranaire a été identifié dans sa séquence. Même si une<br />
interaction directe MD‐2/Lipide A a été décrite, la fonction de MD‐2 est mal connue. Le<br />
lipide A est transféré au complexe TLR4/MD‐2 par CD14 et interagit avec les 3 composants<br />
31
de ce complexe. MD‐2 semble également interagir dans la reconnaissance du lipide A<br />
159 .<br />
b) Voie de signalisation de TLR4<br />
157, 158,<br />
La voie de signalisation intracellulaire des TLR est proche de celle des récepteurs à<br />
l'IL‐1. Tous les TLR contiennent un domaine TIR (toll IL‐1 receptor) intracellulaire, qui<br />
transmet en aval des signaux en recrutant une ou plusieurs protéines adaptatrices contenant<br />
un domaine TIR, comme la protéine MyD88 (myeloid differentiation primary response<br />
protein 88), TIRAP (TIR domain containing adaptator protein), TRIF (TIR domain containing<br />
adaptator protein inducing IFN‐), TRAM (TRIF related adaptator molecule) , les protéines de<br />
la famille IRAK 143, 160 .<br />
La signalisation des TLR suit deux voies : la voie MyD88‐dépendante et la voie MyD88‐<br />
indépendante.<br />
MyD88 recrute différentes protéines telles que IRAK‐1,‐4 (IL1R associated kinase), et TRAF6<br />
(TNFR associated factor 6), activant la voie des MAP kinases (p38, JNK1/2 et ERK1/2), ce qui<br />
conduit à la translocation du facteur de transcription NF‐B (p50/p65) dans le noyau, à<br />
l’activation d’AP‐1 (c‐Fos/c‐Jun) 161, 146 et à la synthèse de différents composés :<br />
‐ Des cytokines pro‐inflammatoires telles que TNF‐α, IL‐1, IL‐6<br />
‐ Des cytokines anti‐inflammatoires comme l’IL‐10<br />
‐ Des médiateurs lipidiques, métabolites de l’acide arachidonique tels que les<br />
prostaglandines, thromboxanes, leucotriènes ou le platelet‐activating factor (PAF‐1).<br />
La voie MyD88‐indépendante ou TRIF‐dépendante aboutit plus tardivement à l’expression<br />
de cytokines pro‐inflammatoires et à l’expression d’IFN‐ en activant IRF‐3 162 . Cette<br />
dernière voie de signalisation peut activer d’une manière tardive les voies de NF‐B et des<br />
MAPK.<br />
3. Lipides A et immunité antitumorale<br />
a) Réponses immunitaires générales induites par le lipide A<br />
Toutes les cellules exprimant TLR4 sont capables de répondre au lipide A : les<br />
monocytes circulants 164 , les neutrophiles 165 mais aussi les cellules endothéliales 166 . Le<br />
lipide A se fixe sur les PBMCs (peripheral blood mononuclear cell) qui sécrètent alors des<br />
cytokines pro‐inflammatoires comme l’IL‐1β, l’IL ‐6, le TNF‐α 167, 168, 136, 169 l’IL‐8, le PAF. Ces<br />
32
différentes cytokines vont activer la production des médiateurs de l’inflammation, comme<br />
les prostaglandines 170 et les leukotriènes, mais également les cascades du complément et<br />
de la coagulation.<br />
De plus, il a été montré que des analogues de lipide A induisent la production de fortes<br />
concentrations d’anions superoxydes (O2 ‐ ) et de peroxyde d’hydrogène (H2O2) par des<br />
monocytes humains 171 et des granulocytes 172 . L’expression de la NOSII et la production de<br />
monoxyde d'azote (NO), médiateur toxique notamment pour les cellules tumorales, est<br />
également augmentée par le lipide A dans les monocytes humains, murins et de rats<br />
175, 176 .<br />
b) Effets du lipide A sur l’immunité antitumorale<br />
173, 174,<br />
Il a été montré qu’après injection du lipide A de P.gingivalis chez la souris, les NK ont<br />
une activité cytotoxique in vitro augmentée 177 . De plus, un analogue du lipide A, le MPL<br />
(MonoPhosphoryl Lipid A), induit la maturation des DCs dérivant de monocytes et la<br />
production d’IL‐12 par ceux‐ci, ainsi que l’augmentation de l’expression de molécules de co‐<br />
stimulation CD40, CD80, CD86 et du marqueur de maturation CD83 178 .<br />
L'IL‐1β, principalement sécrétée par les macrophages, peut aussi être libérée par les cellules<br />
dendritiques, les cellules endothéliales, les NK, et les lymphocytes lors du traitement par un<br />
lipide A. Cette cytokine a un effet directement cytotoxique pour les cellules tumorales et son<br />
efficacité en association avec l'IFN‐γ a été démontrée in vivo contre le mélanome B16 chez la<br />
souris C57BL/6 179 .<br />
4. Immunothérapie par des lipides A<br />
Des essais cliniques de phase I ont été réalisés sur des patients atteints de cancer<br />
avec des lipides A préparés à partir de S. typhimurium ou S.minnesota 180 : MPL, ou avec des<br />
lipides A synthétiques comme SDZ MRL 953 181 et ONO‐4007 182 .<br />
Dans ces études, le MPL a bien été toléré et les toxicités cliniques majeures ont été la fièvre,<br />
les frissons et une certaine rigidité du corps qui apparaissent dans 50% des cas à la dose de<br />
250 µg/m 2 sans toxicité rénal ou hépatique. Concernant le SDZ MRL 953, il a été injecté en<br />
injection unique à des doses croissantes, il a été bien toléré et a induit une augmentation du<br />
nombre de granulocytes associée à une augmentation de la concentration de G‐CSF et d’IL‐6<br />
dans le sérum des patients, mais de façon surprenante les concentrations de TNF‐α, d’IL‐1β<br />
33
ou d’IL‐8 n’ont pas variées. Dans l’essai clinique utilisant l’ONO‐4007, une augmentation<br />
significative des concentrations de TNF et d’IL‐6 a été retrouvée dans le sérum de patients.<br />
Malheureusement, dans tous ces essais cliniques, aucune activité antitumorale des<br />
différents lipides A n’a été détectée chez les patients.<br />
5. Immunothérapie par l’OM-174<br />
L’activité antitumorale de l’OM‐174 a été étudiée dans un modèle de cancer colique.<br />
Les cellules cancéreuses coliques PROb injectées à des rats BDIX induisent des<br />
carcinomatoses péritonéales, qui en absence de traitement induisent la mort de tous les rats<br />
après quelques semaines. Des injections intraveineuses répétées d’OM‐174, tous les deux ou<br />
trois jours, guérissent 90 à 100 % des rats 183 . Les cellules tumorales meurent, au moins en<br />
partie, par apoptose, les tumeurs régressent et les animaux sont immunisés 184 . Cet effet<br />
antitumoral a été corrélé à l’expression de la NOS II (ARNm et protéine) et à la production de<br />
NO dans les tumeurs, à la production de cytokines de l’inflammation (IL‐1β, TNF‐α et IFN‐γ),<br />
ainsi qu’à l’inhibition de l’expression de TGF‐β1 dans les tumeurs 185 .<br />
L’OM‐174 a également un effet antitumoral dans un modèle de cancer mammaire<br />
chez la souris. Les cellules cancéreuses mammaires EMT‐6 injectées par voie i.v. à des souris<br />
syngéniques BALB/c provoquent des nodules pulmonaires. Les souris non traitées meurent<br />
de leurs tumeurs en quelques semaines, alors que des injections en intraveineuses d’OM‐<br />
174 répétées tous les 5 jours, augmentent leur survie, diminuent le nombre et le volume des<br />
nodules pulmonaires et les souris guéries de leurs tumeurs sont immunisées (résultats non<br />
publiés). Ce traitement est efficace chez des souris BALB/c KO pour la NOS II, il ne dépend<br />
donc pas de la NOS II des cellules de la souris. Par contre, il n’est plus efficace chez des souris<br />
KO pour la NOS II traitées par de l’aminoguanidine (AG). Donc l’efficacité du traitement<br />
dépend de la NOS II des cellules tumorales (résultats non publiés). Ces résultats sont<br />
cohérents avec le fait que des clones de cellules EMT‐6 (dont le clone EMT‐6J) répondant<br />
fortement à l’IL1 pour produire beaucoup de NO sont peu tumorigènes tandis que des<br />
clones de cellules EMT‐6 (dont le clone EMT‐6H) répondant faiblement à l’IL1 et produisant<br />
peu de NO, sont très tumorigènes. L’utilisation de ces clones, des souris KO pour la NOS II ou<br />
sauvages et de l’AG nous a permis de montrer que la NOS II des cellules de la souris facilite la<br />
croissance tumorale, alors que la NOS II des cellules tumorales s’oppose à la croissance<br />
tumorale 186 .<br />
34
Ces données ont été suffisamment convaincantes pour que des essais cliniques<br />
soient envisagés avec l’OM‐174. Des essais de phase I et I/II ont eu lieu, afin de déterminer<br />
sa toxicité et sa pharmacocinétique. Un premier essai explorait des doses croissantes d’OM‐<br />
174 (600, 800, 1000 et 1600 µg/m 2 ) en une injection unique, un second essai explorait un<br />
nombre d’injections croissant d’OM‐174 administré à différentes doses données. Les<br />
résultats ont montré que l’OM‐174 pouvait être injecté à une dose de 1000 µg/m 2 , 15 fois de<br />
suite à 2 ou 3 jours d’intervalle sans toxicité importante, mais avec une production de TNF et<br />
d’IL‐6 chez certains patients.<br />
Objectif du travail<br />
Le laboratoire à développé un protocole utilisant l’OM‐174, dans un modèle de<br />
carcinomatoses obtenues par injection intrapéritonéale de cellules cancéreuses (cellules<br />
PROb) générant des tumeurs progressives chez le rat BD‐IX. Nous avons montré que ce lipide<br />
A guérit 95 % des rats porteurs de carcinomatoses péritonéales macroscopiques (tumeurs<br />
constituées de dizaines de nodules de 3 à 5 mm) quand le traitement commence à 14 jours<br />
après l’injection des cellules cancéreuses, alors que les rats non traités meurent tous de<br />
leurs tumeurs. Cet effet antitumoral a été corrélé à l’expression de la NO synthase inductible<br />
(NOS II, ARNm et protéine), à la production de NO dans les tumeurs, à la production de<br />
cytokines de l’inflammation (IL‐1β, TNF‐α et IFN‐γ), ainsi qu’à l’inhibition de l’expression de<br />
TGF‐β dans les tumeurs 183, 184 .<br />
Cependant, lorsque le traitement commence plus tard après l’injection des cellules<br />
cancéreuses (J28) et s’adresse à des tumeurs de plus en plus volumineuses, l’efficacité de<br />
l’OM‐174 décroît. L'association oxaliplatine (un agent chimiothérapeutique couramment<br />
utilisé en combinaison avec le 5‐FU dans les traitements des cancers coliques avancés) plus<br />
OM‐174 rétablie cette efficacité. En effet, chez des rats porteurs de carcinomatoses<br />
péritonéales envahissant tout le péritoine (tumeurs de plusieurs centimètres de diamètre)<br />
une injection à J21 par voie intrapéritonéale d’oxaliplatine suivie à partir de J28 d’injections<br />
par voie intraveineuse d’OM‐174 guérit tous les animaux, alors que le traitement par<br />
l’oxaliplatine seul ou le lipide A seul n'est pas efficace.<br />
Mon projet à donc consisté à étudier les mécanismes de l’immunothérapie par l’OM‐174<br />
seul ou en combinaison avec l’oxaliplatine dans ce modèle de cancer colique chez le rat.<br />
35
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