cours "exocytose" - la physiologie animale a l'universite de lille i
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L’EXOCYTOSE.<br />
Régu<strong>la</strong>tion calcique <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
neurotransmission<br />
Communication Cellu<strong>la</strong>ire<br />
Licence Biologie Biotechologie<br />
S4<br />
Pascal Mariot<br />
Laboratoire <strong>de</strong> Physiologie Cellu<strong>la</strong>ire SN3<br />
• Introduction : Un peu d’historique<br />
P<strong>la</strong>n<br />
• La synapse : évi<strong>de</strong>nces pour une libération quantique : l’exocytose<br />
• Le coup<strong>la</strong>ge stimu<strong>la</strong>tion-libération<br />
• Le calcium comme second messager<br />
• Le cycle synaptique et l’exocytose<br />
• Les mécanismes molécu<strong>la</strong>ires <strong>de</strong> l’exocytose<br />
– Les protéines et leur localisation<br />
– Le cytosquelette<br />
– Les SNAREs<br />
– Les SNAREs et le cycle synaptique<br />
• Les mécanismes molécu<strong>la</strong>ires <strong>de</strong> l’endocytose<br />
1
Introduction<br />
Le neurone<br />
(Golgi<br />
Ramon y Cajal<br />
Fin 19 ème )<br />
La synapse<br />
(Sherrington début 20 ème )<br />
Nature <strong>de</strong> <strong>la</strong> synapse :<br />
Physiologistes (Eccles)<br />
contre pharmacologistes (Dale)<br />
Concept <strong>de</strong><br />
Neurotransmetteurs<br />
Expériences<br />
d’Otto LOEWI (1921)<br />
Vagustoff<br />
Dale (1914-30) Acétylcholine<br />
Elliott, Langley, Cannon, Uridil, vonEuler (1900-1950) :<br />
Sympathine : Norepinephrine, epinephrine<br />
La libération d’un NT lors d’une stimu<strong>la</strong>tion présynaptique peut<br />
être suivie qu’au travers <strong>de</strong> son effet post-synaptique.<br />
A retenir également : il existe <strong>de</strong>s synapses électriques<br />
Arborisation<br />
Dendritique<br />
Epines<br />
Dendritique<br />
Soma<br />
Axone<br />
Neurone<br />
postsynaptique<br />
2
Endocytose<br />
Exocytose<br />
Exocytose :<br />
mécanisme à <strong>la</strong> base <strong>de</strong><br />
neurotransmission<br />
Membrane<br />
p<strong>la</strong>smique<br />
Vésicule<br />
Vésicule<br />
<strong>de</strong><br />
sécrétion<br />
Molécules et cellules concernées<br />
Quelles sont les évi<strong>de</strong>nces ?<br />
Neurotransmission chimique :<br />
évi<strong>de</strong>nces pour une libération quantale<br />
3
Neurotransmission : libération quantale<br />
Enregistrement <strong>de</strong>s<br />
PPM (potentiel <strong>de</strong> p<strong>la</strong>que motrice)<br />
ou PPSE<br />
= reflet <strong>de</strong> <strong>la</strong> libération du NT<br />
Changeux, Numa (1970-80)<br />
Jonction neuro-muscu<strong>la</strong>ire<br />
Le récepteur nicotinique<br />
1°) condition <strong>de</strong> repos<br />
Enregistrement <strong>de</strong> petites<br />
variations <strong>de</strong> potentiel<br />
Eccles,<br />
Fatt et Katz (1950) P<strong>la</strong>que motrice À 2mm <strong>de</strong> P<strong>la</strong>que motrice<br />
4
Jonction neuro-muscu<strong>la</strong>ire<br />
1°) condition <strong>de</strong> repos<br />
Enregistrement <strong>de</strong> petites<br />
variations <strong>de</strong> potentiel<br />
0,4 mV<br />
PPM miniatures caractérisés par leur amplitu<strong>de</strong> quasi<br />
constante<br />
Apparition aléatoire à une fréquence <strong>de</strong> 1 ou 2 Hertz<br />
Phénomènes tout ou rien (ils sont UNITAIRES)<br />
Eccles,<br />
Fatt et Katz (1950)<br />
Jonction neuro-muscu<strong>la</strong>ire<br />
Stimu<strong>la</strong>tion<br />
électrique lectrique<br />
2°) après stimu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong>s fibres motrices<br />
Enregistrement <strong>de</strong> variations <strong>de</strong> potentiel<br />
<strong>de</strong> gran<strong>de</strong> amplitu<strong>de</strong> (ppm suivi <strong>de</strong> PA)<br />
5
Libération<br />
spontanée<br />
PA<br />
Libération quantale<br />
PPM<br />
miniatures<br />
PPM<br />
évoqués<br />
Libération<br />
évoquée<br />
Distribution unimodale<br />
<strong>de</strong>s PPM miniatures<br />
Un nombre à peu près<br />
constant <strong>de</strong> molécules sont<br />
libérés en même temps<br />
Histogramme avec<br />
plusieurs pics<br />
correspondant à <strong>de</strong>s<br />
valeurs préférentielles<br />
d’amplitu<strong>de</strong> <strong>de</strong> PPM<br />
6
La transmission quantale<br />
Quel est <strong>la</strong> quantité <strong>de</strong> molécules <strong>de</strong><br />
NT/vésicule?<br />
Une micropipette remplie <strong>de</strong> NT est<br />
approchée <strong>de</strong> <strong>la</strong> membrane<br />
présynaptique. L’application d’une<br />
quantité connue d’ACh déclenche un<br />
PPSE comparable à un PPSE miniature<br />
On a évalué que :<br />
1 quantum d’ACh = 1 paquet d’environ<br />
10 000 molécules<br />
Environ 500 mmole.l -1 d’ACh dans une<br />
vésicule !<br />
100 000 à 500 000 vésicules/synapse <strong>de</strong><br />
motoneurone<br />
A retenir également (anecdotique) : il existe<br />
une libération non quantale<br />
Les étu<strong>de</strong>s au microscope<br />
électronique ont fourni à <strong>la</strong><br />
notion <strong>de</strong> quanta un<br />
support morphologique<br />
preuves <strong>de</strong> <strong>la</strong> libération vésicu<strong>la</strong>ire<br />
7
Microscopie électronique :<br />
Une synapse remplie <strong>de</strong> vésicules synaptiques<br />
Heuser synapse<br />
cytop<strong>la</strong>sme muscu<strong>la</strong>ire<br />
cytop<strong>la</strong>sme axonal<br />
200 nm<br />
A <strong>la</strong> jonction neuromuscu<strong>la</strong>ire, les vésicules synaptiques s’alignent au niveau<br />
<strong>de</strong> zones actives pré-synaptiques, prêtes à fusionner. (Heuser, 1975)<br />
Microscopie électronique :<br />
image en « omega » (Ω)<br />
8
Face E<br />
Face P<br />
Protéines<br />
transmembranaires<br />
stimu<strong>la</strong>tion électrique<br />
Cryofracture ou freeze-fracture<br />
P<strong>la</strong>n <strong>de</strong><br />
fracture<br />
Microscopie<br />
électronique :<br />
Freeze-fracture<br />
(cryofracture)<br />
- « Freeze-fracture »<br />
Congé<strong>la</strong>tion à azote<br />
liqui<strong>de</strong><br />
(-169°C)<br />
Fracture au niveau <strong>de</strong>s<br />
surfaces membranaires<br />
et observation en<br />
microscopie<br />
électronique.<br />
Microscopie<br />
électronique :<br />
Freeze-fracture<br />
(cryofracture)<br />
9
Mb présynaptique<br />
Mb postsynaptique<br />
Détection <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
molécule sécrétée<br />
(ampérométrie)<br />
Face P<br />
Face E<br />
Fente synaptique<br />
Freeze-fracture<br />
particules<br />
puits<br />
Pore <strong>de</strong> fusion<br />
Face E<br />
Face P<br />
Zone active<br />
Vésicules<br />
synaptiques<br />
Mesures électrophysiologiques <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
sécrétion<br />
Mesure <strong>de</strong> <strong>la</strong> surface <strong>de</strong><br />
<strong>la</strong> membrane p<strong>la</strong>smique<br />
(capacité)<br />
10
I amper<br />
C Mem<br />
Mesure électrophysiologique <strong>de</strong> <strong>la</strong> sécrétion<br />
Fusions <strong>de</strong> granules<br />
0 100 200<br />
Time (s)<br />
Courant ampérometrique mesure l’adrénaline libérée<br />
15 million <strong>de</strong><br />
molécules<br />
d’adrénaline<br />
La Capacité mesure <strong>la</strong> surface <strong>de</strong> <strong>la</strong> membrane p<strong>la</strong>smique<br />
2 µm 2 <strong>de</strong><br />
surface<br />
Le patch-ampérometrie d’une cellule chromaffine montre <strong>de</strong>s sauts simultanés <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
surface membranaire et <strong>la</strong> libération d’adrénaline. Ceci correspond à <strong>la</strong> libération<br />
quantique <strong>de</strong> granules unitaires. (Albillos,., Almers,., Lindau, 1997)<br />
Exocytose constitutive et régulée<br />
Protéines solubles<br />
nouvellement<br />
synthétisées<br />
Appareil <strong>de</strong> Golgi<br />
Réseau<br />
trans-golgi<br />
Fusion<br />
membranaire<br />
non régulée<br />
Protéines membranaires<br />
nouvellement synthétisées<br />
Signal intracellu<strong>la</strong>ire<br />
Vésicules <strong>de</strong><br />
sécrétion<br />
Cytosol<br />
Lipi<strong>de</strong>s membranaires<br />
Fusion<br />
membranaire<br />
régulée<br />
Milieu extracellu<strong>la</strong>ire<br />
Exocytose<br />
constitutive<br />
Signal : Hormone<br />
Ou neurotransmetteur<br />
Exocytose<br />
régulée<br />
11
Coup<strong>la</strong>ge stimu<strong>la</strong>tion-neurotransmission<br />
(stimu<strong>la</strong>tion-sécrétion)<br />
Rôle du calcium<br />
Que faut-il à une molécule<br />
pour être un (bon !) second messager ?<br />
—Elle doit agir sur un récepteur/senseur/effecteur<br />
Site <strong>de</strong> fixation couplé à un élément <strong>de</strong> réponse.<br />
Réponse physiologique (contraction, sécrétion…)<br />
—Sa concentration doit changer <strong>de</strong> manière<br />
significative en réponse à un autre signal<br />
Système pour création et <strong>de</strong>struction du message.<br />
Niveau du second messager doit changer en réponse<br />
à un stimulus naturel et ceci avant et pendant que<br />
<strong>la</strong> cellule répond.<br />
12
Libération re<strong>la</strong>tive d’adrénaline/15 min<br />
Le Calcium Comme Second Messager<br />
membrane p<strong>la</strong>smique<br />
enzymes<br />
Métaboliques<br />
& kinases<br />
Contrôle d’activités<br />
enzymatiques<br />
Protéines<br />
Récepteurs<br />
Feedback<br />
Signal Intracellu<strong>la</strong>ire :<br />
l’ion calcium !<br />
A<br />
Ca 2+<br />
Protéines <strong>de</strong><br />
régu<strong>la</strong>tion<br />
génique<br />
Modifications<br />
d’expression génique<br />
Canaux<br />
ioniques<br />
Ouverture<br />
Protéines du<br />
Cytosquelette<br />
vésicules <strong>de</strong><br />
Sécrétion<br />
Exocytose<br />
Changement <strong>de</strong> forme<br />
Cellu<strong>la</strong>ire ou dép<strong>la</strong>cement<br />
Exocytose et 2 nd messagers :<br />
Le calcium stimule <strong>la</strong> sécrétion régulée<br />
1.0<br />
0.5<br />
0<br />
Niveau <strong>de</strong><br />
repos<br />
n = 1<br />
Ca 2+<br />
+ Digitonine<br />
Sécrétion d’adrénaline <strong>de</strong><br />
cellules chromaffines<br />
perméabilisées. La pente <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
courbe montre l’action<br />
coopérative <strong>de</strong> plusieurs ions<br />
Ca 2+ sur le senseur Ca 2+ .<br />
10<br />
calcium libre dans le milieu extracellu<strong>la</strong>ire (M)<br />
-8 10-6 10-4 (Baker & Knight, 1981)<br />
13
La sécrétion hormonale est associée à <strong>de</strong>s variations<br />
<strong>de</strong> calcium<br />
Ca 2+ (nM)<br />
glucose 20 mM<br />
2 mM 2 mM<br />
220<br />
110<br />
0<br />
2 min<br />
sécrétion d’insuline<br />
Ca 2+<br />
280<br />
140<br />
0<br />
insulin secretion (pg/islet/min)<br />
La sécrétion hormonale est dépendante<br />
<strong>de</strong>s variations <strong>de</strong> calcium cytosolique<br />
Exemples :<br />
Ilôts <strong>de</strong><br />
Langerhans<br />
chargés avec<br />
du fura-2 pour<br />
mesurer le<br />
calcium<br />
cytop<strong>la</strong>smique<br />
<strong>de</strong>s cellules <strong>de</strong>s<br />
ilôts.<br />
14
La sécrétion hormonale est dépendante <strong>de</strong>s variations<br />
<strong>de</strong> calcium cytosolique<br />
Exemples :<br />
• Hormones hypophysaires : GH, PRL, TSH, FSH,<br />
LH, ACTH sécrétion calcium dépendante<br />
• Hormones parathyroidiennes<br />
• Hormone médullosurrénaliennes (adrénaline)<br />
• Hormones pancréatiques : insuline, glucagon<br />
• …<br />
Le calcium et <strong>la</strong> transmission synaptique<br />
PA axonique<br />
(sodique)<br />
Potentiel<br />
d’action<br />
seuil<br />
Potentiel<br />
De repos<br />
PA présynaptique<br />
(sodique, calcique)<br />
15
Repos<br />
Vésicule<br />
synaptique<br />
Récepteur<br />
au NT<br />
Le calcium et <strong>la</strong> transmission synaptique<br />
Axone<br />
présynaptique<br />
Fente synaptique<br />
Membrane<br />
postsynaptique<br />
Stimu<strong>la</strong>tion présynaptique<br />
exocytose calcium dépendante à <strong>la</strong> synapse<br />
Surface membranaire<br />
Présynaptique<br />
[capacité (pF)]<br />
calcium<br />
Intracellu<strong>la</strong>ire<br />
(nM)<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
exocytose<br />
Influx Ca par<br />
canaux<br />
calciques<br />
VOC<br />
endocytose<br />
clearance du Ca par<br />
transporteurs Ca<br />
Potentiel d’action<br />
neurone bipo<strong>la</strong>ire 10 µm<br />
16
8 gènes :<br />
CACNGx<br />
Structure générale <strong>de</strong>s canaux calciques<br />
voltage-dépendants<br />
Protéines γ(x = 1-8)<br />
10 gènes :<br />
CACNA1X<br />
Protéines α1 (X = A,B,C,D,E,F,G,H,I,S)<br />
4 familles <strong>de</strong> sous-unités :<br />
•α1 : pore<br />
•β, α2-δ, et γ : sous-unités accessoires<br />
4 (5?) gènes :<br />
CACNA2Dx<br />
Protéines α2δ(x = 1-5)<br />
4 gènes :<br />
CACNBx<br />
Protéines β(x = 1-4)<br />
Le Canal Ca 2+ voltage <strong>de</strong>pendant<br />
Caterall WA (1994) Auxiliary subunits of voltage-gated ion channels<br />
, Neuron 12, 1183-1194, with permission<br />
Campbell KP, Harpold MM et al. (2000) Nomenc<strong>la</strong>ture of voltagegated<br />
calcium channels, Neuron 25, 533-535, with permission.<br />
Libération hormonale<br />
Neurotransmission<br />
17
vésicules<br />
synaptiques<br />
Canaux Ca 2+<br />
VOC dans <strong>la</strong><br />
membrane<br />
présynaptique<br />
La zone active synaptique :<br />
site <strong>de</strong> libération présynaptique<br />
Zone active<br />
FibrePost muscu<strong>la</strong>ire synaptic<br />
postsynaptique muscle fiber<br />
membrane<br />
présynaptique<br />
Les signaux Calciques sont locaux<br />
Intérieur<br />
Membrane<br />
Extérieur<br />
x5000<br />
[Ca 2+ ] i = 10 -7 M<br />
(0,1 µM)<br />
Canal<br />
calcique<br />
Ca 2+<br />
Site d’arrimage<br />
<strong>de</strong>s vésicules<br />
Vésicule<br />
synaptique<br />
[Ca 2+ ] e = 10 -3 M<br />
100 nm<br />
Représentation d’un<br />
microdomaine au voisinage<br />
du canal calcique<br />
500 µM<br />
sur 0,25 à 0,6 µm 2<br />
Importance <strong>de</strong> l’élévation<br />
du calcium intracellu<strong>la</strong>ire<br />
18
Membrane<br />
p<strong>la</strong>smique<br />
Stockage NT<br />
Transit<br />
Une vésicule à proximité<br />
d’un canal calcique peut<br />
être libérée par un seul<br />
potentiel d’action.<br />
Par contre, une bouffée<br />
<strong>de</strong> potentiel d’action<br />
sera nécessaire pour<br />
libérer les vésicules les<br />
plus éloignées ou les<br />
vésicules les plus<br />
grosses (neuropepti<strong>de</strong>).<br />
Importance <strong>de</strong> l’élévation<br />
du calcium intracellu<strong>la</strong>ire<br />
Neurotransmission<br />
Le cycle synaptique<br />
Arrimage Amorçage<br />
Fente synaptique<br />
Bourgeonnement<br />
Fusion/<br />
exocytose<br />
Fusion<br />
endosomale<br />
Translocation<br />
Endocytose<br />
19
Durée <strong>de</strong>s phases<br />
Durée totale 1 minute.<br />
La fusion complète se déroule en moins<br />
d’une milli secon<strong>de</strong>.<br />
L’endocytose prend 5 secon<strong>de</strong>s<br />
Les 55 secon<strong>de</strong>s restantes sont utilisée<br />
pour les autres étapes<br />
Neurotransmission<br />
Le cycle synaptique<br />
Recrutement<br />
Cib<strong>la</strong>ge<br />
Transit<br />
Arrimage<br />
Amorçage Déclenchement<br />
Recyc<strong>la</strong>ge<br />
Les (quelques…) protéines impliquées<br />
dans <strong>la</strong> neurotransmission<br />
20
Les protéines et leur localisation<br />
• Vésicules (ou granules) : protéines associées <strong>de</strong><br />
manière stable<br />
Les protéines et leur localisation<br />
• Vésicules (ou granules) : protéines associées<br />
transitoirement<br />
21
Les protéines et leur localisation<br />
unc18<br />
• Cytosol<br />
– NSF, aSNAP, Munc13, Munc18,<br />
Rim, Rabphilin<br />
• NSF : N-ethylmaleimi<strong>de</strong><br />
sensitive fusion protein<br />
• αSNAP : alpha Soluble NSF<br />
attachment protein<br />
• Munc18 : uncoordinated<br />
protein (syntaxin binding<br />
protein)<br />
• Membrane p<strong>la</strong>smique<br />
– SNAREs (SNAP25, syntaxine),<br />
N-P/Q Ca2+channels<br />
• SNARE : SNAP Receptor<br />
• SNAP25 : synaptosoma<strong>la</strong>ssociated<br />
protein<br />
• Protéines alternant entre<br />
localisation membranaire et<br />
cytosolique<br />
– Rab3a et d, synapsin<br />
Le cytosquelette et le transit <strong>de</strong>s vésicules à <strong>la</strong><br />
membrane p<strong>la</strong>smique<br />
Toxines altérant <strong>la</strong> polymérisation <strong>de</strong>s fi<strong>la</strong>ments<br />
Substances chimiques Mo<strong>de</strong> d’action<br />
spécifiques <strong>de</strong> l’actine<br />
-Phalloïdine (Amanite -Stabilise les fi<strong>la</strong>ments<br />
phalloï<strong>de</strong>)<br />
-Jasp<strong>la</strong>kinoli<strong>de</strong> (Eponge) -Stabilise les fi<strong>la</strong>ments<br />
-- Cytocha<strong>la</strong>sine (mycotoxine) - Dépolymérisation<br />
- Latrunculine (éponge) - Empêche <strong>la</strong> polymérisation<br />
libération neurohormonale :<br />
Agents stabilisants (phalloidine, jasp<strong>la</strong>kinoli<strong>de</strong>) : inhibition<br />
Agents déstabilisants : stimu<strong>la</strong>tion<br />
22
Le cytosquelette et le transit <strong>de</strong>s vésicules à <strong>la</strong><br />
membrane p<strong>la</strong>smique<br />
A<br />
Modèle <strong>de</strong> barrière physique<br />
Le cytosquelette et le transit <strong>de</strong>s vésicules<br />
Modèle <strong>de</strong> barrière physique<br />
Modèle impliquant <strong>la</strong> scindérine Modèle impliquant <strong>la</strong> synapsine<br />
A B<br />
scin<strong>de</strong>rine<br />
23
Le cytosquelette et le transit <strong>de</strong>s vésicules à <strong>la</strong><br />
membrane p<strong>la</strong>smique<br />
Mais :<br />
1) Effets <strong>de</strong>s toxines plus complexes : dépendants <strong>de</strong> <strong>la</strong> concentration<br />
(déstabilisants stimulent à faible concentration et inhibent à forte concentration)<br />
2) Observation en microscopie montrent une redistribution (et pas uniquement<br />
une dépolymérisation) <strong>de</strong> l’actine dans <strong>la</strong> cellule lors <strong>de</strong> l’exocytose<br />
Actine n’est pas uniquement un acteur passif<br />
Modèle <strong>de</strong> rails<br />
Le cytosquelette et le transit <strong>de</strong>s vésicules<br />
Modèle <strong>de</strong> rails physiques<br />
Rôle <strong>de</strong> <strong>la</strong> Myosine Va<br />
B<br />
24
Le cytosquelette et le transit <strong>de</strong>s<br />
vésicules<br />
Repos<br />
Stimulé<br />
Recrutement<br />
Arrimage<br />
Recyc<strong>la</strong>ge<br />
Fusion<br />
Amorçage<br />
SNAREs et le trafic vésicu<strong>la</strong>ire<br />
Chaque c<strong>la</strong>sse <strong>de</strong> vésicule <strong>de</strong> transport contient une protéine<br />
(v-SNARE) qui est capable <strong>de</strong> s’associer uniquement et<br />
spécifiquement avec <strong>de</strong>ux protéines récepteur cibles (target)<br />
(t-SNARE) dans <strong>la</strong> membrane acceptrice appropriée :<br />
mécanisme universel et ubiquitaire <strong>de</strong> fusion entre<br />
compartiments membranaires<br />
• La libération <strong>de</strong> neurotransmetteurs utilise <strong>de</strong>s mécanismes<br />
molecu<strong>la</strong>ires communs aux autres trafics membranaires<br />
• Le cib<strong>la</strong>ge <strong>de</strong>s VS/GS (donneurs <strong>de</strong> membrane) est accompli<br />
par l’interaction <strong>de</strong> protéines vésicu<strong>la</strong>ires spécifiques (v-<br />
SNAREs) avec les protéines <strong>de</strong> <strong>la</strong> membrane p<strong>la</strong>smique<br />
(membrane acceptrice) (t-SNARE)<br />
• La neurosécrétion est distinguée <strong>de</strong> <strong>la</strong> sécrétion constitutive<br />
par sa régu<strong>la</strong>tion par le Ca 2+<br />
25
Le modèle SNARE<br />
Compartiment A<br />
ARRIMAGE FUSION<br />
Compartiment B<br />
Les protéines SNARE impliquées dans<br />
l’exocytose<br />
v-SNARE (dans<br />
membrane <strong>de</strong>s<br />
vésicules)<br />
synaptobrévine/VAMP<br />
complexe 7S<br />
t-SNAREs (dans<br />
membrane p<strong>la</strong>smique)<br />
syntaxine<br />
SNAP-25<br />
1992 : Rothman et Söllner<br />
L’arrimage et <strong>la</strong> fusion <strong>de</strong>s vésicules à <strong>la</strong> membrane présynaptique<br />
sont supposées intervenir grâce à une série d’interactions<br />
Protéines-Protéines impliquant <strong>la</strong> formation d’un complexe<br />
molécu<strong>la</strong>ire très stable (7S).<br />
26
Complexe 20S<br />
Arrimage (docking):<br />
Le complexe SNARE s’associe<br />
avec <strong>de</strong>s protéines cytosolubles<br />
γSNAP SNAP<br />
NSF<br />
αSNAP SNAP<br />
VESICULE<br />
SYNAPTOBREVINE<br />
SYNTAXINE<br />
SNAP25<br />
Rôle <strong>de</strong>s SNAREs dans l’arrimage ? Non<br />
Exocyste<br />
Vésicules attachées à <strong>la</strong> membrane<br />
p<strong>la</strong>smique grâce à <strong>de</strong>s interactions<br />
selectives protéines-protéines<br />
impliquant l’ exocyste.<br />
A ce sta<strong>de</strong>, complexe réversible.<br />
Arrimage<br />
MEMBRANE<br />
PLASMIQUE<br />
synaptotagmine<br />
vSNARE<br />
synaptobrévine ou VAMP<br />
tSNARE<br />
SNAP 25 , syntaxine<br />
Canal calcique<br />
Exocyste : complexe <strong>de</strong> 734 kD<br />
<strong>de</strong> 8 sous-unités :<br />
sec3, sec5, sec6, sec8, sec10,<br />
sec15, Exo70, Exo84<br />
27
Amorçage : Formation d’un<br />
complexe stable<br />
Complexe très stable<br />
1 vSNARE : synaptobrévine<br />
2 tSNARE : SNAP 25 , syntaxine<br />
+ partenaires :<br />
Synaptotagmine, canal calcique…<br />
Arrimage : Formation <strong>de</strong> l’exocyste<br />
Amorçage<br />
Formation du complexe SNARE:<br />
Les vésicules vont être fixées <strong>de</strong> manière<br />
irréversible à <strong>la</strong> membrane présynaptique.<br />
Le complexe<br />
SNARE<br />
Les v-SNAREs s’associent avec les t-SNAREs pour rapprocher<br />
les membranes et induire <strong>la</strong> fusion (exocytose).<br />
28
(3)<br />
P<br />
Amorçage<br />
Amorçage<br />
• Etape ATP dépendante<br />
• Phosphory<strong>la</strong>tion par <strong>de</strong>s<br />
kinases :<br />
– CamKinaseII<br />
– PKC<br />
– CDK5…<br />
<strong>de</strong> :<br />
– Syntaxine<br />
– Munc13, Munc18 ?<br />
• ...<br />
29
(3)<br />
(4)<br />
P<br />
∆∆∆∆Vm<br />
Entrée <strong>de</strong> calcium<br />
et calcium senseur<br />
Déclenchement <strong>de</strong> <strong>la</strong> fusion,<br />
exocytose<br />
Augmentation <strong>de</strong> calcium<br />
Cible synaptotagmine<br />
(senseur calcique)<br />
Entrée <strong>de</strong> calcium<br />
et calcium senseur<br />
• La dépo<strong>la</strong>risation ouvre<br />
les canaux Ca 2+ voltagedépendants<br />
près <strong>de</strong>s<br />
vésicules.<br />
• Le Ca 2+ entre et<br />
augmente <strong>la</strong><br />
concentration<br />
intracellu<strong>la</strong>ire <strong>de</strong> Ca 2+<br />
près <strong>de</strong> <strong>la</strong> vésicule.<br />
• Action sur le Ca senseur<br />
Microdomaines calciques<br />
Association physique entre SNAREs (syntaxine)<br />
et canaux calciques<br />
30
protéine <strong>de</strong> <strong>la</strong> membrane<br />
vésicu<strong>la</strong>ire à 2 domaines<br />
Fixe à <strong>la</strong> fois <strong>de</strong>s ions<br />
calcium et aussi les<br />
phospholipi<strong>de</strong>s et à <strong>la</strong><br />
syntaxine (SNARE)<br />
ne détecte que les fortes<br />
élévations <strong>de</strong> [Ca 2+ ]i<br />
Fonction <strong>de</strong><br />
frein/accélérateur<br />
(5)<br />
La synaptotagmine<br />
La fusion<br />
Formation d’un pore <strong>de</strong><br />
fusion <strong>de</strong> nature inconnue<br />
(protéine/lipi<strong>de</strong>).<br />
Exocytose<br />
Expulsion (libération) dans le<br />
milieu ambiant<br />
Pore <strong>de</strong> fusion<br />
31
Mécanisme <strong>de</strong> <strong>la</strong> fusion<br />
Ce que l’on se sait pas<br />
Fusion lipidique ou protéique ?<br />
Modèle lipidique : sta<strong>de</strong> intermédiaire d’hémifusion<br />
Mécanisme <strong>de</strong> <strong>la</strong> fusion<br />
Ce que l’on se sait pas<br />
Fusion lipidique ou protéique ?<br />
Modèle protéique : type « jonction <strong>la</strong>cunaire »<br />
Anneau protéolipidique<br />
V 0 V 1 ATPase : H + ATPase<br />
32
Et après <strong>la</strong> fusion ?<br />
• Vitesse <strong>de</strong> libération hormonale dépend <strong>de</strong> :<br />
– Vitesse d’expansion du pore <strong>de</strong> fusion<br />
– Réversibilité du pore <strong>de</strong> fusion (libération<br />
incomplète)<br />
– Dilution <strong>de</strong>s produits <strong>de</strong> sécrétion dans le milieu<br />
externe (lente dissolution <strong>de</strong> <strong>la</strong> matrice du cœur<br />
<strong>de</strong>nse dans le milieu externe)<br />
Rôle NSF et SNAPs ?<br />
33
Et après ? Endocytose !<br />
Le flux <strong>de</strong> membrane pendant l’exocytose et<br />
l’endocytose est un équilibre délicat<br />
RE<br />
Surface originale<br />
Golgi<br />
Lysosome<br />
Endocytose recycle ~2-3% <strong>de</strong> membrane<br />
par minute…<br />
Toute <strong>la</strong> membrane est recyclée en moins<br />
d’une heure<br />
Endosome<br />
Blocage <strong>de</strong> l’endocytose, l’exocytose<br />
continue: Surface cellu<strong>la</strong>ire augmente<br />
Blocage <strong>de</strong> l’exocytose, l’endocytose<br />
continue: Surface cellu<strong>la</strong>ire diminue<br />
34
Vue d’ensemble <strong>de</strong> <strong>la</strong> “pinocytose”<br />
(endocytose en phase liqui<strong>de</strong>)<br />
GTP<br />
GDP+P i<br />
Vésicule à<br />
manteau <strong>de</strong><br />
c<strong>la</strong>thrine<br />
Manteau protéique<br />
Puit recouvert<br />
ATP ADP+P i<br />
Perte du manteau<br />
(secon<strong>de</strong>s)…<br />
Apport d’ hydro<strong>la</strong>ses<br />
aci<strong>de</strong>s du RTG…<br />
ATP<br />
H +<br />
~ 1’: endosome précoce<br />
(pH~6)…<br />
~ 5’: endosome tardif<br />
(pH 5.5~6)…<br />
~2500 vésicules/min (~2-3% of<br />
surface)!<br />
ADP+Pi<br />
~30’: Lysosome<br />
(pH
Le manteau protéique est une “cage” <strong>de</strong><br />
c<strong>la</strong>thrine à structure géodésique<br />
Chaine lour<strong>de</strong> <strong>de</strong><br />
C<strong>la</strong>thrin<br />
“chaine” légère<br />
3 chaînes lour<strong>de</strong>s <strong>de</strong><br />
c<strong>la</strong>thrine<br />
(~180-190 kDa)…<br />
…plus…<br />
3 chaines légères<br />
(~40 kDa)…<br />
…forment…<br />
Des “Triskeles”…<br />
Assemb<strong>la</strong>ge en une vésicule géodésique<br />
Composants d’une vésicule recouverte<br />
d’un manteau <strong>de</strong> c<strong>la</strong>thrine<br />
c<strong>la</strong>thrine<br />
cargo<br />
membrane<br />
Adaptines<br />
(adaptor proteine 2)<br />
Adaptines se lient à <strong>la</strong> c<strong>la</strong>thrine et aux récepteurs possédant une<br />
séquence peptidique spécifique en C-ter (Phe-Arg-X-Tyr).<br />
récepteurs<br />
36
Détachement <strong>de</strong>s vésicules requiert <strong>la</strong> dynamine<br />
ECB 15-19<br />
Récepteur<br />
Formation vésicu<strong>la</strong>ire<br />
Adaptine<br />
Molécules <strong>de</strong> cargo<br />
Puit recouvert<br />
Manteau <strong>de</strong> c<strong>la</strong>thrine<br />
Bourgeonnement<br />
Vésicule recouverte<br />
Dynamine<br />
“détachement”<br />
(dynamine)<br />
La dynamine est une GTPase<br />
GTP<br />
dynamine<br />
GDP<br />
Perte du<br />
manteau<br />
Adaptine<br />
Vésicule<br />
nu<br />
Perte du manteau<br />
37
Vésicules recouvertes <strong>de</strong> C<strong>la</strong>thrine<br />
per<strong>de</strong>nt rapi<strong>de</strong>ment leur manteau<br />
“Puit recouvert”<br />
Adaptine<br />
C<strong>la</strong>thrine<br />
Grâce à <strong>la</strong> “c<strong>la</strong>thrin-uncoating ATPase”<br />
un membre <strong>de</strong> <strong>la</strong> famille <strong>de</strong>s HSP70 <strong>de</strong>s<br />
chaperones (et auxiline, synaptojanine).<br />
Vésicules “nus” envoyés vers les endosomes…<br />
C<strong>la</strong>thrines et adaptines recyclées<br />
Dynamine<br />
C<strong>la</strong>thrin uncoating<br />
ATPase<br />
Vésicule “nu”<br />
Vers endosome…<br />
GTP<br />
GDP + Pi<br />
ATP<br />
ADP + Pi<br />
Endocytose médiée par les récepteurs aux LDL<br />
dynamin<br />
Low <strong>de</strong>nsity lipoprotein (LDL)<br />
GTP<br />
GDP+P i<br />
Vésicule<br />
recouverte<br />
LDL-R<br />
ATP ADP+P i<br />
Uncoating<br />
(HSP70 family)<br />
cholesterol<br />
Fusion<br />
(Snares)<br />
pH ~7-.7.2<br />
Endosome précoce<br />
pH ~6<br />
H<br />
ATP<br />
+<br />
Un seul récepteur peut effectuer<br />
<strong>de</strong>s centaines <strong>de</strong> cycles (~10<br />
min/cycle)<br />
ADP+Pi<br />
Transfert vers<br />
lysosomes<br />
Lysosome<br />
Recyc<strong>la</strong>ge <strong>de</strong>s<br />
récepteurs à <strong>la</strong><br />
membrane<br />
Bourgeonnement <strong>de</strong>s<br />
vésicules <strong>de</strong> transport<br />
pH ~7.2<br />
38
Coating (recouvrement)<br />
Golgi<br />
Endosome tardif<br />
Endosome<br />
précoce<br />
Vésicule<br />
sécrétrice<br />
Membrane<br />
p<strong>la</strong>smique<br />
COP:<br />
Anterogra<strong>de</strong> : RE vers Golgi, intra-Golgi, Golgi vers membrane p<strong>la</strong>smique<br />
Retrogra<strong>de</strong>: intra-Golgi, Golgi vers RE<br />
Endosomal: endosome précoce vers tardif/lysosome<br />
C<strong>la</strong>thrine:<br />
membrane p<strong>la</strong>smique vers endosome précoce (endocytose)<br />
Golgi vers endosome tardif/lysosome<br />
Calcium et exo-endocytose rapi<strong>de</strong> à <strong>la</strong> synapse<br />
Surface membranaire<br />
Présynaptique<br />
[capacité (pF)]<br />
calcium<br />
Intracellu<strong>la</strong>ire<br />
(nM)<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
exocytose<br />
Influx Ca par<br />
canaux<br />
calciques<br />
VOC<br />
neurone bipo<strong>la</strong>ire 10 µm<br />
endocytose<br />
clearance du Ca par<br />
transporteurs Ca<br />
réponse et retour rapi<strong>de</strong> d’une dépo<strong>la</strong>risation <strong>de</strong> 200 msec. (Von Gersdorff &<br />
Matthews, 1994, Nature 367:735.)<br />
39
exocytose<br />
En résumé<br />
Kiss and run<br />
• Le calcium peut stimuler <strong>la</strong> neurosécrétion en<br />
agissant sur <strong>de</strong> multiples cibles :<br />
– Transit vers <strong>la</strong> membrane p<strong>la</strong>smique : action sur le<br />
cytosquelette (CaMKinase)<br />
– Amorçage : action sur <strong>de</strong>s kinases Calcium-dépendantes<br />
– Fusion : action sur <strong>la</strong> synaptotagmine<br />
40