cours "exocytose" - la physiologie animale a l'universite de lille i

L’EXOCYTOSE.
Régulation calcique de la
neurotransmission
Communication Cellulaire
Licence Biologie Biotechologie
S4
Pascal Mariot
Laboratoire de Physiologie Cellulaire SN3
• Introduction : Un peu d’historique
Plan
• La synapse : évidences pour une libération quantique : l’exocytose
• Le couplage stimulation-libération
• Le calcium comme second messager
• Le cycle synaptique et l’exocytose
• Les mécanismes moléculaires de l’exocytose
– Les protéines et leur localisation
– Le cytosquelette
– Les SNAREs
– Les SNAREs et le cycle synaptique
• Les mécanismes moléculaires de l’endocytose
1

Introduction
Le neurone
(Golgi
Ramon y Cajal
Fin 19 ème )
La synapse
(Sherrington début 20 ème )
Nature de la synapse :
Physiologistes (Eccles)
contre pharmacologistes (Dale)
Concept de
Neurotransmetteurs
Expériences
d’Otto LOEWI (1921)
Vagustoff
Dale (1914-30) Acétylcholine
Elliott, Langley, Cannon, Uridil, vonEuler (1900-1950) :
Sympathine : Norepinephrine, epinephrine
La libération d’un NT lors d’une stimulation présynaptique peut
être suivie qu’au travers de son effet post-synaptique.
A retenir également : il existe des synapses électriques
Arborisation
Dendritique
Epines
Dendritique
Soma
Axone
Neurone
postsynaptique
2

Endocytose
Exocytose
Exocytose :
mécanisme à la base de
neurotransmission
Membrane
plasmique
Vésicule
Vésicule
de
sécrétion
Molécules et cellules concernées
Quelles sont les évidences ?
Neurotransmission chimique :
évidences pour une libération quantale
3

Neurotransmission : libération quantale
Enregistrement des
PPM (potentiel de plaque motrice)
ou PPSE
= reflet de la libération du NT
Changeux, Numa (1970-80)
Jonction neuro-musculaire
Le récepteur nicotinique
1°) condition de repos
Enregistrement de petites
variations de potentiel
Eccles,
Fatt et Katz (1950) Plaque motrice À 2mm de Plaque motrice
4

Jonction neuro-musculaire
1°) condition de repos
Enregistrement de petites
variations de potentiel
0,4 mV
PPM miniatures caractérisés par leur amplitude quasi
constante
Apparition aléatoire à une fréquence de 1 ou 2 Hertz
Phénomènes tout ou rien (ils sont UNITAIRES)
Eccles,
Fatt et Katz (1950)
Jonction neuro-musculaire
Stimulation
électrique lectrique
2°) après stimulation des fibres motrices
Enregistrement de variations de potentiel
de grande amplitude (ppm suivi de PA)
5

Libération
spontanée
PA
Libération quantale
PPM
miniatures
PPM
évoqués
Libération
évoquée
Distribution unimodale
des PPM miniatures
Un nombre à peu près
constant de molécules sont
libérés en même temps
Histogramme avec
plusieurs pics
correspondant à des
valeurs préférentielles
d’amplitude de PPM
6

La transmission quantale
Quel est la quantité de molécules de
NT/vésicule?
Une micropipette remplie de NT est
approchée de la membrane
présynaptique. L’application d’une
quantité connue d’ACh déclenche un
PPSE comparable à un PPSE miniature
On a évalué que :
1 quantum d’ACh = 1 paquet d’environ
10 000 molécules
Environ 500 mmole.l -1 d’ACh dans une
vésicule !
100 000 à 500 000 vésicules/synapse de
motoneurone
A retenir également (anecdotique) : il existe
une libération non quantale
Les études au microscope
électronique ont fourni à la
notion de quanta un
support morphologique
preuves de la libération vésiculaire
7

Microscopie électronique :
Une synapse remplie de vésicules synaptiques
Heuser synapse
cytoplasme musculaire
cytoplasme axonal
200 nm
A la jonction neuromusculaire, les vésicules synaptiques s’alignent au niveau
de zones actives pré-synaptiques, prêtes à fusionner. (Heuser, 1975)
Microscopie électronique :
image en « omega » (Ω)
8

Face E
Face P
Protéines
transmembranaires
stimulation électrique
Cryofracture ou freeze-fracture
Plan de
fracture
Microscopie
électronique :
Freeze-fracture
(cryofracture)
- « Freeze-fracture »
Congélation à azote
liquide
(-169°C)
Fracture au niveau des
surfaces membranaires
et observation en
microscopie
électronique.
Microscopie
électronique :
Freeze-fracture
(cryofracture)
9

Mb présynaptique
Mb postsynaptique
Détection de la
molécule sécrétée
(ampérométrie)
Face P
Face E
Fente synaptique
Freeze-fracture
particules
puits
Pore de fusion
Face E
Face P
Zone active
Vésicules
synaptiques
Mesures électrophysiologiques de la
sécrétion
Mesure de la surface de
la membrane plasmique
(capacité)
10

I amper
C Mem
Mesure électrophysiologique de la sécrétion
Fusions de granules
0 100 200
Time (s)
Courant ampérometrique mesure l’adrénaline libérée
15 million de
molécules
d’adrénaline
La Capacité mesure la surface de la membrane plasmique
2 µm 2 de
surface
Le patch-ampérometrie d’une cellule chromaffine montre des sauts simultanés de la
surface membranaire et la libération d’adrénaline. Ceci correspond à la libération
quantique de granules unitaires. (Albillos,., Almers,., Lindau, 1997)
Exocytose constitutive et régulée
Protéines solubles
nouvellement
synthétisées
Appareil de Golgi
Réseau
trans-golgi
Fusion
membranaire
non régulée
Protéines membranaires
nouvellement synthétisées
Signal intracellulaire
Vésicules de
sécrétion
Cytosol
Lipides membranaires
Fusion
membranaire
régulée
Milieu extracellulaire
Exocytose
constitutive
Signal : Hormone
Ou neurotransmetteur
Exocytose
régulée
11

Couplage stimulation-neurotransmission
(stimulation-sécrétion)
Rôle du calcium
Que faut-il à une molécule
pour être un (bon !) second messager ?
—Elle doit agir sur un récepteur/senseur/effecteur
Site de fixation couplé à un élément de réponse.
Réponse physiologique (contraction, sécrétion…)
—Sa concentration doit changer de manière
significative en réponse à un autre signal
Système pour création et destruction du message.
Niveau du second messager doit changer en réponse
à un stimulus naturel et ceci avant et pendant que
la cellule répond.
12

Libération relative d’adrénaline/15 min
Le Calcium Comme Second Messager
membrane plasmique
enzymes
Métaboliques
& kinases
Contrôle d’activités
enzymatiques
Protéines
Récepteurs
Feedback
Signal Intracellulaire :
l’ion calcium !
A
Ca 2+
Protéines de
régulation
génique
Modifications
d’expression génique
Canaux
ioniques
Ouverture
Protéines du
Cytosquelette
vésicules de
Sécrétion
Exocytose
Changement de forme
Cellulaire ou déplacement
Exocytose et 2 nd messagers :
Le calcium stimule la sécrétion régulée
1.0
0.5
0
Niveau de
repos
n = 1
Ca 2+
+ Digitonine
Sécrétion d’adrénaline de
cellules chromaffines
perméabilisées. La pente de la
courbe montre l’action
coopérative de plusieurs ions
Ca 2+ sur le senseur Ca 2+ .
10
calcium libre dans le milieu extracellulaire (M)
-8 10-6 10-4 (Baker & Knight, 1981)
13

La sécrétion hormonale est associée à des variations
de calcium
Ca 2+ (nM)
glucose 20 mM
2 mM 2 mM
220
110
0
2 min
sécrétion d’insuline
Ca 2+
280
140
0
insulin secretion (pg/islet/min)
La sécrétion hormonale est dépendante
des variations de calcium cytosolique
Exemples :
Ilôts de
Langerhans
chargés avec
du fura-2 pour
mesurer le
calcium
cytoplasmique
des cellules des
ilôts.
14

La sécrétion hormonale est dépendante des variations
de calcium cytosolique
Exemples :
• Hormones hypophysaires : GH, PRL, TSH, FSH,
LH, ACTH sécrétion calcium dépendante
• Hormones parathyroidiennes
• Hormone médullosurrénaliennes (adrénaline)
• Hormones pancréatiques : insuline, glucagon
• …
Le calcium et la transmission synaptique
PA axonique
(sodique)
Potentiel
d’action
seuil
Potentiel
De repos
PA présynaptique
(sodique, calcique)
15

Repos
Vésicule
synaptique
Récepteur
au NT
Le calcium et la transmission synaptique
Axone
présynaptique
Fente synaptique
Membrane
postsynaptique
Stimulation présynaptique
exocytose calcium dépendante à la synapse
Surface membranaire
Présynaptique
[capacité (pF)]
calcium
Intracellulaire
(nM)
300
200
100
0
exocytose
Influx Ca par
canaux
calciques
VOC
endocytose
clearance du Ca par
transporteurs Ca
Potentiel d’action
neurone bipolaire 10 µm
16

8 gènes :
CACNGx
Structure générale des canaux calciques
voltage-dépendants
Protéines γ(x = 1-8)
10 gènes :
CACNA1X
Protéines α1 (X = A,B,C,D,E,F,G,H,I,S)
4 familles de sous-unités :
•α1 : pore
•β, α2-δ, et γ : sous-unités accessoires
4 (5?) gènes :
CACNA2Dx
Protéines α2δ(x = 1-5)
4 gènes :
CACNBx
Protéines β(x = 1-4)
Le Canal Ca 2+ voltage dependant
Caterall WA (1994) Auxiliary subunits of voltage-gated ion channels
, Neuron 12, 1183-1194, with permission
Campbell KP, Harpold MM et al. (2000) Nomenclature of voltagegated
calcium channels, Neuron 25, 533-535, with permission.
Libération hormonale
Neurotransmission
17

vésicules
synaptiques
Canaux Ca 2+
VOC dans la
membrane
présynaptique
La zone active synaptique :
site de libération présynaptique
Zone active
FibrePost musculaire synaptic
postsynaptique muscle fiber
membrane
présynaptique
Les signaux Calciques sont locaux
Intérieur
Membrane
Extérieur
x5000
[Ca 2+ ] i = 10 -7 M
(0,1 µM)
Canal
calcique
Ca 2+
Site d’arrimage
des vésicules
Vésicule
synaptique
[Ca 2+ ] e = 10 -3 M
100 nm
Représentation d’un
microdomaine au voisinage
du canal calcique
500 µM
sur 0,25 à 0,6 µm 2
Importance de l’élévation
du calcium intracellulaire
18

Membrane
plasmique
Stockage NT
Transit
Une vésicule à proximité
d’un canal calcique peut
être libérée par un seul
potentiel d’action.
Par contre, une bouffée
de potentiel d’action
sera nécessaire pour
libérer les vésicules les
plus éloignées ou les
vésicules les plus
grosses (neuropeptide).
Importance de l’élévation
du calcium intracellulaire
Neurotransmission
Le cycle synaptique
Arrimage Amorçage
Fente synaptique
Bourgeonnement
Fusion/
exocytose
Fusion
endosomale
Translocation
Endocytose
19

Durée des phases
Durée totale 1 minute.
La fusion complète se déroule en moins
d’une milli seconde.
L’endocytose prend 5 secondes
Les 55 secondes restantes sont utilisée
pour les autres étapes
Neurotransmission
Le cycle synaptique
Recrutement
Ciblage
Transit
Arrimage
Amorçage Déclenchement
Recyclage
Les (quelques…) protéines impliquées
dans la neurotransmission
20

Les protéines et leur localisation
• Vésicules (ou granules) : protéines associées de
manière stable
Les protéines et leur localisation
• Vésicules (ou granules) : protéines associées
transitoirement
21

Les protéines et leur localisation
unc18
• Cytosol
– NSF, aSNAP, Munc13, Munc18,
Rim, Rabphilin
• NSF : N-ethylmaleimide
sensitive fusion protein
• αSNAP : alpha Soluble NSF
attachment protein
• Munc18 : uncoordinated
protein (syntaxin binding
protein)
• Membrane plasmique
– SNAREs (SNAP25, syntaxine),
N-P/Q Ca2+channels
• SNARE : SNAP Receptor
• SNAP25 : synaptosomalassociated
protein
• Protéines alternant entre
localisation membranaire et
cytosolique
– Rab3a et d, synapsin
Le cytosquelette et le transit des vésicules à la
membrane plasmique
Toxines altérant la polymérisation des filaments
Substances chimiques Mode d’action
spécifiques de l’actine
-Phalloïdine (Amanite -Stabilise les filaments
phalloïde)
-Jasplakinolide (Eponge) -Stabilise les filaments
-- Cytochalasine (mycotoxine) - Dépolymérisation
- Latrunculine (éponge) - Empêche la polymérisation
libération neurohormonale :
Agents stabilisants (phalloidine, jasplakinolide) : inhibition
Agents déstabilisants : stimulation
22

Le cytosquelette et le transit des vésicules à la
membrane plasmique
A
Modèle de barrière physique
Le cytosquelette et le transit des vésicules
Modèle de barrière physique
Modèle impliquant la scindérine Modèle impliquant la synapsine
A B
scinderine
23

Le cytosquelette et le transit des vésicules à la
membrane plasmique
Mais :
1) Effets des toxines plus complexes : dépendants de la concentration
(déstabilisants stimulent à faible concentration et inhibent à forte concentration)
2) Observation en microscopie montrent une redistribution (et pas uniquement
une dépolymérisation) de l’actine dans la cellule lors de l’exocytose
Actine n’est pas uniquement un acteur passif
Modèle de rails
Le cytosquelette et le transit des vésicules
Modèle de rails physiques
Rôle de la Myosine Va
B
24

Le cytosquelette et le transit des
vésicules
Repos
Stimulé
Recrutement
Arrimage
Recyclage
Fusion
Amorçage
SNAREs et le trafic vésiculaire
Chaque classe de vésicule de transport contient une protéine
(v-SNARE) qui est capable de s’associer uniquement et
spécifiquement avec deux protéines récepteur cibles (target)
(t-SNARE) dans la membrane acceptrice appropriée :
mécanisme universel et ubiquitaire de fusion entre
compartiments membranaires
• La libération de neurotransmetteurs utilise des mécanismes
moleculaires communs aux autres trafics membranaires
• Le ciblage des VS/GS (donneurs de membrane) est accompli
par l’interaction de protéines vésiculaires spécifiques (v-
SNAREs) avec les protéines de la membrane plasmique
(membrane acceptrice) (t-SNARE)
• La neurosécrétion est distinguée de la sécrétion constitutive
par sa régulation par le Ca 2+
25

Le modèle SNARE
Compartiment A
ARRIMAGE FUSION
Compartiment B
Les protéines SNARE impliquées dans
l’exocytose
v-SNARE (dans
membrane des
vésicules)
synaptobrévine/VAMP
complexe 7S
t-SNAREs (dans
membrane plasmique)
syntaxine
SNAP-25
1992 : Rothman et Söllner
L’arrimage et la fusion des vésicules à la membrane présynaptique
sont supposées intervenir grâce à une série d’interactions
Protéines-Protéines impliquant la formation d’un complexe
moléculaire très stable (7S).
26

Complexe 20S
Arrimage (docking):
Le complexe SNARE s’associe
avec des protéines cytosolubles
γSNAP SNAP
NSF
αSNAP SNAP
VESICULE
SYNAPTOBREVINE
SYNTAXINE
SNAP25
Rôle des SNAREs dans l’arrimage ? Non
Exocyste
Vésicules attachées à la membrane
plasmique grâce à des interactions
selectives protéines-protéines
impliquant l’ exocyste.
A ce stade, complexe réversible.
Arrimage
MEMBRANE
PLASMIQUE
synaptotagmine
vSNARE
synaptobrévine ou VAMP
tSNARE
SNAP 25 , syntaxine
Canal calcique
Exocyste : complexe de 734 kD
de 8 sous-unités :
sec3, sec5, sec6, sec8, sec10,
sec15, Exo70, Exo84
27

Amorçage : Formation d’un
complexe stable
Complexe très stable
1 vSNARE : synaptobrévine
2 tSNARE : SNAP 25 , syntaxine
+ partenaires :
Synaptotagmine, canal calcique…
Arrimage : Formation de l’exocyste
Amorçage
Formation du complexe SNARE:
Les vésicules vont être fixées de manière
irréversible à la membrane présynaptique.
Le complexe
SNARE
Les v-SNAREs s’associent avec les t-SNAREs pour rapprocher
les membranes et induire la fusion (exocytose).
28

(3)
P
Amorçage
Amorçage
• Etape ATP dépendante
• Phosphorylation par des
kinases :
– CamKinaseII
– PKC
– CDK5…
de :
– Syntaxine
– Munc13, Munc18 ?
• ...
29

(3)
(4)
P
∆∆∆∆Vm
Entrée de calcium
et calcium senseur
Déclenchement de la fusion,
exocytose
Augmentation de calcium
Cible synaptotagmine
(senseur calcique)
Entrée de calcium
et calcium senseur
• La dépolarisation ouvre
les canaux Ca 2+ voltagedépendants
près des
vésicules.
• Le Ca 2+ entre et
augmente la
concentration
intracellulaire de Ca 2+
près de la vésicule.
• Action sur le Ca senseur
Microdomaines calciques
Association physique entre SNAREs (syntaxine)
et canaux calciques
30

protéine de la membrane
vésiculaire à 2 domaines
Fixe à la fois des ions
calcium et aussi les
phospholipides et à la
syntaxine (SNARE)
ne détecte que les fortes
élévations de [Ca 2+ ]i
Fonction de
frein/accélérateur
(5)
La synaptotagmine
La fusion
Formation d’un pore de
fusion de nature inconnue
(protéine/lipide).
Exocytose
Expulsion (libération) dans le
milieu ambiant
Pore de fusion
31

Mécanisme de la fusion
Ce que l’on se sait pas
Fusion lipidique ou protéique ?
Modèle lipidique : stade intermédiaire d’hémifusion
Mécanisme de la fusion
Ce que l’on se sait pas
Fusion lipidique ou protéique ?
Modèle protéique : type « jonction lacunaire »
Anneau protéolipidique
V 0 V 1 ATPase : H + ATPase
32

Et après la fusion ?
• Vitesse de libération hormonale dépend de :
– Vitesse d’expansion du pore de fusion
– Réversibilité du pore de fusion (libération
incomplète)
– Dilution des produits de sécrétion dans le milieu
externe (lente dissolution de la matrice du cœur
dense dans le milieu externe)
Rôle NSF et SNAPs ?
33

Et après ? Endocytose !
Le flux de membrane pendant l’exocytose et
l’endocytose est un équilibre délicat
RE
Surface originale
Golgi
Lysosome
Endocytose recycle ~2-3% de membrane
par minute…
Toute la membrane est recyclée en moins
d’une heure
Endosome
Blocage de l’endocytose, l’exocytose
continue: Surface cellulaire augmente
Blocage de l’exocytose, l’endocytose
continue: Surface cellulaire diminue
34

Vue d’ensemble de la “pinocytose”
(endocytose en phase liquide)
GTP
GDP+P i
Vésicule à
manteau de
clathrine
Manteau protéique
Puit recouvert
ATP ADP+P i
Perte du manteau
(secondes)…
Apport d’ hydrolases
acides du RTG…
ATP
H +
~ 1’: endosome précoce
(pH~6)…
~ 5’: endosome tardif
(pH 5.5~6)…
~2500 vésicules/min (~2-3% of
surface)!
ADP+Pi
~30’: Lysosome
(pH

Le manteau protéique est une “cage” de
clathrine à structure géodésique
Chaine lourde de
Clathrin
“chaine” légère
3 chaînes lourdes de
clathrine
(~180-190 kDa)…
…plus…
3 chaines légères
(~40 kDa)…
…forment…
Des “Triskeles”…
Assemblage en une vésicule géodésique
Composants d’une vésicule recouverte
d’un manteau de clathrine
clathrine
cargo
membrane
Adaptines
(adaptor proteine 2)
Adaptines se lient à la clathrine et aux récepteurs possédant une
séquence peptidique spécifique en C-ter (Phe-Arg-X-Tyr).
récepteurs
36

Détachement des vésicules requiert la dynamine
ECB 15-19
Récepteur
Formation vésiculaire
Adaptine
Molécules de cargo
Puit recouvert
Manteau de clathrine
Bourgeonnement
Vésicule recouverte
Dynamine
“détachement”
(dynamine)
La dynamine est une GTPase
GTP
dynamine
GDP
Perte du
manteau
Adaptine
Vésicule
nu
Perte du manteau
37

Vésicules recouvertes de Clathrine
perdent rapidement leur manteau
“Puit recouvert”
Adaptine
Clathrine
Grâce à la “clathrin-uncoating ATPase”
un membre de la famille des HSP70 des
chaperones (et auxiline, synaptojanine).
Vésicules “nus” envoyés vers les endosomes…
Clathrines et adaptines recyclées
Dynamine
Clathrin uncoating
ATPase
Vésicule “nu”
Vers endosome…
GTP
GDP + Pi
ATP
ADP + Pi
Endocytose médiée par les récepteurs aux LDL
dynamin
Low density lipoprotein (LDL)
GTP
GDP+P i
Vésicule
recouverte
LDL-R
ATP ADP+P i
Uncoating
(HSP70 family)
cholesterol
Fusion
(Snares)
pH ~7-.7.2
Endosome précoce
pH ~6
H
ATP
+
Un seul récepteur peut effectuer
des centaines de cycles (~10
min/cycle)
ADP+Pi
Transfert vers
lysosomes
Lysosome
Recyclage des
récepteurs à la
membrane
Bourgeonnement des
vésicules de transport
pH ~7.2
38

Coating (recouvrement)
Golgi
Endosome tardif
Endosome
précoce
Vésicule
sécrétrice
Membrane
plasmique
COP:
Anterograde : RE vers Golgi, intra-Golgi, Golgi vers membrane plasmique
Retrograde: intra-Golgi, Golgi vers RE
Endosomal: endosome précoce vers tardif/lysosome
Clathrine:
membrane plasmique vers endosome précoce (endocytose)
Golgi vers endosome tardif/lysosome
Calcium et exo-endocytose rapide à la synapse
Surface membranaire
Présynaptique
[capacité (pF)]
calcium
Intracellulaire
(nM)
300
200
100
0
exocytose
Influx Ca par
canaux
calciques
VOC
neurone bipolaire 10 µm
endocytose
clearance du Ca par
transporteurs Ca
réponse et retour rapide d’une dépolarisation de 200 msec. (Von Gersdorff &
Matthews, 1994, Nature 367:735.)
39

exocytose
En résumé
Kiss and run
• Le calcium peut stimuler la neurosécrétion en
agissant sur de multiples cibles :
– Transit vers la membrane plasmique : action sur le
cytosquelette (CaMKinase)
– Amorçage : action sur des kinases Calcium-dépendantes
– Fusion : action sur la synaptotagmine
40