Geno Milk Fat

Biologie intégrative de la fonction mammaire
& adaptabilité de la MGL
Impact des facteurs génétiques et alimentaires sur les caractéristiques de la matière
grasse laitière et sur les propriétés techno-fonctionnelles des constituants du lait
Agenae/Genanimal, Tours, 20-22 octobre 2009
Geno
Milk
Fat
(avril 2006 – août 2009)
Centre National
Interprofessionnel
de l'Economie Laitière
(Producteurs & Transformateurs)
Institut de l’élevage
Partenaires
(programme finalisé)
9 équipes
6 UR (4 sites), 3 UE
3 Départements : GA, PHASE, CEPIA
2 secteurs APA & NHSA
Genanimal

Agenae/Genanimal, Tours, 20-22 octobre 2009
Contexte
Socio-économique
• Sur fond de crise : surproduction, dérégulation, …
• Les productions animales stigmatisées (impact
environnemental)
• MGL : teneur élevée en AG saturés (pathologies
cardio-vasculaires)
• Désaffection des consommateurs
• Nouveaux enjeux :
- redonner au lait son image d’aliment
complet, sain et naturel
- valorisation différenciée

Objectifs
Pour remédier à cette situation :
Acquisition de connaissances sur le lait et sa MG
Développer les outils permettant d’adapter le profil en AG
aux recommandations nutritionnelles
Maîtrise des propriétés techno-fonctionnelles des constituants du lait
Agenae/Genanimal, Tours, 20-22 octobre 2009

Matière grasse laitière
à 96% des triglycérides
Agenae/Genanimal, Tours, 20-22 octobre 2009
• AG sont dénommés et classés selon leur
longueur (nombre d’atomes de carbone) et leur
degré de saturation :
– saturés (sans double liaison)
– monoinsaturés (une double bond)
– polyinsaturés (deux doubles liaisons ou plus)
• Avec plus de 400 AG différents, la matière
grasse laitière bovine est considérée comme
l’une des plus complexes
• déséquilibre : AGS (65%) / AGI (35%)

Origine des acides gras du lait
• Deux sources:
– plasmatique (sang)
– synthèse de novo dans la glande mammaire
• C4:0 à C14:0 (C16:0) synthétisés dans la glande
mammaire
• AG à longues chaînes proviennent de l’alimentation
et du métabolisme microbien (lipolyse, isomérisation,
déshydrogénation dans le rumen) et de lipides
endogènes (tissu adipeux)
Agenae/Genanimal, Tours, 20-22 octobre 2009

La matière grasse laitière est sécrétée par
la CEM sous forme de globules gras
(d’après Bauman et al, 2006)
Agenae/Genanimal, Tours, 20-22 octobre 2009
de 0.5 à 20 µm
Triglycérides synthétisés dans le RE
Les gouttelettes lipidiques cytoplasmiques
sont transportées vers la membrane apicale
dont elles vont s’enrober avant d’être libérées
dans la lumière alvéolaire sous forme de GG

Dalgleish et al., 2004
La micelle de caséines
• Particules sphériques : 20 to 300 nm
• Fortement hydratées
• 93% protéines (caséines)
• 7% minéraux : phosphate calcium
• Solution colloïdale, stable au pH du lait
Assemblage des micelles dans
la cellule épithéliale mammaire,
au cours du transit intracellulaire
1 ères étapes également dans le RE
Agenae/Genanimal, Tours, 20-22 octobre 2009

Principaux facteurs avérés qui vont
impacter la composition du lait
• Alimentation (matière grasse)
• Pratiques d’élevage (fréquence de traite)
• Génétique
Agenae/Genanimal, Tours, 20-22 octobre 2009
Exploiter ces leviers pour
moduler la composition du
lait (MG) et maîtriser ses
propriétés technofonctionnelles

Matériels & méthodes
Deux espèces: vache et chèvre
Régimes : foin, ensilage de maïs avec ou sans supplémentation lipidique
Polymorphismes génétiques bien caractérisés
DGAT1 (bovin) et CSN1S1 (caprin)
Work package 1 : Phenotypage (composition du lait)
Matière grasse (taux, AG, TG, phospholipides,…)
Fraction minérale (Ca, Mg, phosphate, citrate)
Fractions protéiques (RP-HPLC, E2D, MS-Maldi-Tof, LC-MS/MS)
Structures supramoléculaires (taille and potentiel zeta GG et micelles)
WP2 : Génomique (gene expression profiling)
Profiles d’expression (transcriptome & proteome) ;
Biologie cellulaire (intéractions entre GG et micelles de caséines :
biogénèse dans le RE ; morphologie, fractionnement sub-cellulaire, IHC)
WP3 : Intégration des données
mise en relation des données phénotypiques et d’expression
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DGAT1: un QTL affectant principalement
le TB identifié sur BTA14
• Diacyl Glycerol Acyl Transferase (enzyme du RE)
• catalyse l’étape finale de la synthèse des triglycerides
Phosphatidate
phosphohydrolase
Phosphatidic acid H2O Pi 1,2-diacylglycerol CoA-SH Triacylglycerol
KO du gène DGAT1 : absence totale de production laitière
(Cases et al., 1998; Smith et al., 2000)
Double substitution :
…GGCAGGTAAGAAGGCCAAC…
…GGCAGGTGCGAAGGCCAAC…
Diacylglycerol
acyltransferase
232
…Ala-Gly-Lys-Lys-Ala-Asn…
…Ala-Gly-Lys-Ala-Ala-Asn…
Grisart et al. 2001
AA/AA Variant (K232)
GC/GC Variant (A232)
Large réduction du TB avec variant A due à une réduction de
l’efficacité catalytique (Grisart et al., 2002, 2004)
Domaine expérimental du Pin-Au-Haras : Programme QTL (D. Boichard et al.)

Martin and Leroux, 2000
4
1 2 3 5 6 7 8
39
allèle G
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
33 24 54
allèle F
Exon skipping
(mutations ponctuelles)
« RNA Decay »
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Le locus CSN1S1:
mutations responsables de
la variabilité quantitative
LINE insertion
allèle E
457
Délétion (8kb)
Absence de transcrits
388
19
allèle O
KO naturel !

Defective
Micelles & MECells Morphology (TEM)
230 nm
CSN1S1 A/A
199 a.a.
αs1-casein : 7 g/L
whole casein : 27 g/L
CSN2 O/O
Swelling of the Rough Endoplasmic Reticulum :
transit is slowed down
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CSN1S1 O/O
α s1-casein: absent
whole casein : 20 g/L
Fat SCD
?
280 nm
« Wild-type »

Principaux résultats
Granules de
sécrétion
de protéines
Agenae/Genanimal, Tours, 20-22 octobre 2009
v
Globules
lipidiques

Des développemenents méthodologiques (I)
1 - LCM pour approcher l’expression du génome
à l’échelle de la CEM...
Granules de
sécrétion
de protéines
Transcriptomique Protéomique
BUT: Identifier les protéines et les transcrits
exprimés de façon différentielle entre génotypes
v
Globules
lipidiques
2 - les cellules du lait : un
moyen non invasif pour
analyser le transcriptome
de la CEM...

Des développemenents méthodologiques (II)
3 – la 2D-DIGE pour analyser la fraction protéique ...
des laits :
des microsomes (RE) :
« transport » des constituants
du lait dans la CEM
Granules de
sécrétion
de protéines
v
Globules
lipidiques
de la membrane du
globule gras :
2D non-conventionnelle
(16BAC/SDS-PAGE)
couplée à une analyse
quantitative en MS
(spectral counting labelfree
integration)

Selection des acini
Tri cellulaire sélectif sous contrôle morphologique
sur coupe de tissu congelé par
Microdissection laser
Bevilacqua et al., 2007
Impact laser IR
% Intensity
100
50
0
11305.03
11682.00
3000 CEM
13769.35
13997.97
14665.48
RNA
Extraction
β, κ, and α s2 caseins
18168.91
19101.70
23349.19
23870.28
24651.38
Mass (m/z)
10000 22000 30000
~10 ng
RIN >7
Analyse des mRNA (qPCR
Microarrays après amplification)
Analyse directe des
CEM triées en MALDI-Tof-MS
Caséines présentes
seulement chez les O/O
et pas phosphorylées !

α s1-casein deficit: a STRESS factor ?
IRE1α
A site specific endoribonuclease (IRE1)
is activated (dimerization) inducing an
unconventional splicing of the XBP1
(X-box Binding Protein 1) transcript
removing of 26 bases
To finally lead to the synthesis of a
functional « spliced » XBP1 transcription
factor targetting genes that code for
ER-stress response proteins
Accumulation of unfolded or
misfolded (assembled) proteins
in the ER triggers the
Unfolded Protein Response
ER Stress

Differential proteomic multiplexed analysis
of goat milks* (2D-DIGE)
Fluorescence labelling
O/O : Cy3 (green)
A/A : Cy5 (red)
α s1 -casein is only present
in A/A milk
Goats of different genotypes
at the CSN1S2 locus
ca. 100 additional proteins are
found in O/O milks (green spots)
in part characterized by MS
GRP 94
ER-Resident proteins: signing a different secretory mechanism (apocrine ?)
* Milks were partially depleted for micellar caseins (centrifugation) before labelling
PDI
BiP
IEF
Isocitrate
deshydrogenase
Beauvallet et al., 2008
SDS-PAGE

Gene expression profiling
4 chèvres AA / 4 chèvres OO
(DyeSwap)
135 gènes différentiellement exprimés (impliqués dans une
grande diversité de fonctions cellulaires)
- 54 up-regulated genes in OO CSN1S1 genotype
Oligo array bovin 22K, CRB
- 81 down-regulated genes in OO CSN1S1 genotype
Badaoui, et al. (2008)

SDS-PAGE
16BAC-PAGE
Cebo et al.,
(soumission imminente)
Protéomique de la membrane des
globules gras du lait de chèvre
Différences avec lait de vache :
– MFG-E8/lactadhérine (une seule chaîne
peptidique)
– présence de caséines
– hypothèse d’un mécanisme de sécrétion
original confortée
Cebo et al., J Dairy Sci (sous presse)
Comparaison des génotypes AA vs. OO
– GG plus petits pour les génotypes défectifs
– 2D non-conventionnelle (16BAC/SDS-PAGE)
couplée à une analyse quantitative en MS
(spectral counting label-free integration)
– 2 protéines différentiellement exprimées :
stomatine & MFG-E8/lactadhérine (formation
et/ou la sécrétion des inclusions lipidiques?)
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Chez les chèvres de
génotypes défectifs (O/O)
• Défaut d’assemblage et accumulation de caséines dans le RE
stress induction réponse UPR (activation du facteur de
transcription XBP1 chaperones : BiP)
• Analyses expressionnelles différentielles (protéomique et
transcriptomique) concordent et révèlent marqueurs de la
réponse UPR (ARMET) et surexpression de CKAP4 (interaction
avec cytosquelette, rôle dans translocation RE vers Golgi)
• Mise en évidence de protéines résidentes du RE dans le lait :
signe un mécanisme sécrétoire original (apocrine ?)
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Impact de la mutation non conservative au
locus DGAT1 (K232A)
2 groups of 7 cows
(full and half-sib)
of opposite genotypes at
the DGAT1 locus
Sampling
(end of lactation)
Gene expression profiling
from mammary biopsies on
oligoarrays (validation by
qPCR)
F. Faucon et al.
(manuscrit en préparation)
DGAT1 GC/GC
(Ala 232A)
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DGAT1 AA/AA
(Lys 232K)
Milk components
FA profiles (GC)
Milk proteins (RP-HPLC)
Size of MFG (Mastersizer)
Size of micelles (Zetasizer)
Dairy traits :
weight (kg)
Milk (kg/j)
Fat content (g/kg)
Protein content (g/kg)
Lactose content (g/kg)
Cells (10 3 /ml)
Fat (g/j)
Protein (g/j)
Lactose (g/j)

La monotraite modifie l’expression de près de 500 gènes
Traite différentielle / vaches Holstein (n=5)
½ mamelle D
Biopsie 2T
J0
CEM purifiées 2T et 1T
½ mamelle G
2T/j J8 1T/j
Biopsie 1T
3- Quantification par PCR en temps
réel sur biopsies et CEM purifiées
(analyses en cours)
Gènes “candidats”
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Analyse des variations de transcriptome entre
biopsies 2T et 1T (oligoarrays bovins 22k CRB)
Familles de transcrits Induits Inhibés Total
Transcrits
différentiellement exprimés 443 44 487
Métabolisme des lipides
(ex : SCD, LPL) 10 9 19
Mort et mouvement
cellulaires (ex : Cath B,
IGFBP-5)
Transports moléculaires
(ex : FABP-3)
58
38
7
8
65
46
Analyse statistique par groupes de variances avec correction de
Benjamini et Hochberg.
Validation en qPCR / 20 transcrits
La monotraite induit la mort cellulaire et un
remodelage du tissu mammaire en modifiant
l’expression d’un grand nombre de gènes

Effet du fourrage : foin/ensilage maïs
111 gènes différentiellement exprimés (foin de prairie naturelle)
36 sur-exprimés (MCAT, LTF, SPP1, CHIP)
75 sous-exprimés (LALBA, CSN1S2)
Interactome ESR1
(récepteur Oestrogènes)
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Performances laitières :
MGL
protéines
quantité de lait
Composition en AG
CLA, C18:2 (c9t11)
C16:0 et ω6/ω3
ω6/ω3
Leroux et al., 2009

Conclusions
• Le régime, la fréquence de traite et la génétique impactent fortement
le profil d’expression génique du tissu mammaire et la composition
du lait, notamment de sa matière grasse
• Le déficit en caséine αs1 perturbe le fonctionnement de la CEM et
induit un stress du RE par défaut d’assemblage et de transport des
caséines (réponse UPR) – la CEM s’en accommode !
• Relation étroite entre biosynthèse, transport et sécrétion des
structures supramoléculaires du lait (micelles de caséines et
globules gras)
• Le polymorphisme au locus DGAT1 modifie le profil en AG du lait :
plus d’AG longs et insaturés avec le génotype GC/GC (A232)
• Avancées significatives sur la compréhension des mécanismes de
synthèse, de transport et de sécrétion de la matière grasse laitière
• Des outils pour moduler la composition de la MGL et envisager une
valorisation différenciée
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Les acteurs
Unité de Recherches sur les Herbivores (URH)
Dir. : Jean François Hocquette (J-B Coulon)
1 équipe Tissu adipeux et lipides du lait (TALL) + Inst. Exp.
Responsable projet : Christine Leroux
UMR Science et Technologie du Lait et de l’Oeuf (STLO)
Dir. : Sylvie Lortal
1 équipe : Biochimie
Responsable projet : Joëlle Léonil
Rennes
Génomique & Physiologie de la Lactation (GPL)
Dir : Eve Devinoy (Michèle Ollivier)
3 équipes : Génomique Expressionnelle & Lait (GEL)
Transduction et Activation du Génome (TAG)
Biologie des Transports Cellulaires (BTC)
Responsable projet : Patrice Martin
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Theix
Unité Expérimentale « Génétique et expérimentation en
productions animales » - Lusignan (86)
Jouy

UMR INRA/ENSAR sur la Production du Lait (UMRPL)
Dir: P. Faverdin (Jean-Louis Peyraud)
1 équipe : Qualait
Responsable projet : Marion Boutinaud
Station de Génétique Quantitative et Appliquée
(SGQA/GABI) Dir. : Jean-Pierre Bidanel
1 équipe : « Bovins laitiers »
Responsable projet : Didier Boichard/Hélène Larroque
Jouy
Domaine Expérimental du Pin. Le Pin-au-Haras (61)
1 équipe : « Génétique laitière »
Responsable projet : Yves Gallard
Station d’Amélioration Génétique des Animaux (SAGA)
Dir. : Alain Ducos / Christèle Robert
2 équipes : « Petits ruminants » & « Méthodologie »
Responsable projet : Eduardo Manfredi (Hugues Caillat)
Rennes
Toulouse
Domaine Expérimental de Bourges - La Sapinière. Osmoy (18)
1 équipe : « Caprins »
Responsable projet : Frédéric Bouvier
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Remerciements
SIGENAE (Cédric Cabau)
CRB GADIE
PiCT
Financeurs
Genanimal
Programme CASDAR
Bourse Cifre Thèse F. Faucon
Programme EST Marie Curie (UE)
Thèse B. Badaoui

Functional approach: gene expression
profiling on oligoarrays
Agilent bovine 4x44K
What are the cellular mechanisms
underlying variations in fat content and
fatty acid profiles ?
Expected : genes involved, functional
networks ?
14 567 “genes” having an Ingenuity
Pathway Analysis annotation entry
Comparative analysis using 6 pairs of cows of opposite genotypes
574 gènes (IPA) differentially expressed
294 genes over expressed with A232 genotype (phospholipid metabolism)
283 genes over expresed with K232 genotype (apoptosis, cellular death)
Agenae/Genanimal, Tours, 20-22 octobre 2009

DGAT1: statut
confirmé
• Synthèse réduite de triglycérides : réduction de l’activité catalytique
de DGAT1 A232 (mais aussi du niveau d’expression du gène)
• En marge fort impact sur le TB, le polymorphisme DGAT1 K232A
affecte la composition en AG et le taux d’insaturation (plus d’AG
longs et insaturés). Altération de la spécificité de DGAT1?
• Possible voie alternative de synthèse des triglycérides (DGAT2 ?)
mise en évidence (profils d’expression) et surexpression de gènes
spécifiant des enzymes de la biosynthèse des phospholipides
(production accrue de membranes nécessaires à l’enrobage de
globules gras plus petits)
Agenae/Genanimal, Tours, 20-22 octobre 2009