Caroline Mailhes - EPHE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE
ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES
Sciences de la Vie et de la Terre
MEMOIRE
Présenté par
Caroline MAILHES
Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes
ETUDE DU ROLE D’ISLET1 DANS LA SPECIFICATION ET LA MIGRATION
NEURONALE AU SEIN DU TELENCEPHALE VENTRAL
Soutenu le 3 décembre 2010 devant le Jury suivant :
Président – Mireille Rossel
Rapporteur – Alessandra Pierani
Dr. Sonia Garel – Examinateur
Dr. Andras Paldi – Examinateur
Mémoire préparé sous la direction du Dr. Sonia Garel
IBENS
Section Biologie du développement
INSERM U1024, CNRS UMR 8197
46 rue d’ULM
75230 Paris cedex 05
garel@biologie.ens.fr
et du Dr. Andràs Paldi
Laboratoire EPHE de biologie moléculaire « Génétique et Développement »
Généthon, 1 bis rue l’Internationale
BP 60 910002 Evry cedex
paldi@genethon.fr
ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES
SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE
EPHE Banque de Monographies SVT 1

Résumé
ETUDE DU ROLE D’ISLET1 DANS LA SPECIFICATION ET LA MIGRATION
NEURONALE AU SEIN DU TELENCEPHALE VENTRAL
Caroline Mailhes
Soutenu le 3 décembre 2010
La migration cellulaire joue un rôle essentiel dans le développement du cerveau des
mammifères : chaque neurone est généré par une zone proliférative localisée et migre ensuite jusqu’à
leur destination finale. En particulier, de nombreuses migrations neuronales participent à la formation
du cerveau antérieur ou télencéphale, qui contient dorsalement le cortex cérébral et ventralement
plusieurs structures embryonnaires, l’éminence ganglionnaire latérale (LGE), médiane (MGE) et aire
préoptique (POA) (Marin et Rubenstein, 2003). Il a été montré que la MGE et POA produisent des
neurones qui contribuent au télencéphale ventral, mais également des neurones qui migrent
dorsalement pour former la majorité des interneurones du cortex cérébral (Marin et Rubenstein,
2003). Si le facteur de transcription à homéodomaine Nkx2.1 participe à cette décision migratoire
(Nobrega-Pereira et al., 2008), les facteurs impliqués dans d’autres migrations restent encore à
identifier. Les facteurs de transcription LIM-HD ont été impliqués dans de nombreux processus de
spécification et de différenciation cellulaire au cours de l’embryogenèse (Shirazaki et Samuel, 2002).
Dans le télencéphale ventral, le gène Islet1 est spécifiquement exprimé dans des neurones issus de la
LGE et MGE/POA, ce qui en fait un bon candidat pour contrôler la spécification et la migration de
ces cellules.
Pour caractériser la fonction du gène Islet1, j’ai réalisé des expériences de gain de fonction et
d’expression ectopique dans différentes régions du télencéphale ventral par électroporation dans des
tranches de cerveaux embryonnaires de souris. Pour cela, je suis allée me familiariser avec cette
technique dans un laboratoire à l’étranger (Alicante, Espagne) et je l’ai appliquée dans notre institut.
En utilisant ce nouvel outil, j’ai pu montrer que l’expression ectopique et surexpression de Islet1
réduisent la capacité des neurones produits par le télencéphale ventral à envahir le cortex cérébral. En
combinant l’électroporation à la réalisation de greffes en tranches de cerveaux et à la culture
d’explants, j’ai mis en évidence que ce défaut n’était pas dû à une mobilité réduite des cellules dans
un environnement neutre ou dans le cerveau. Enfin, à l’aide de transplantation hétérotopique de cortex
dans le télencéphale ventral, qui exprime de manière endogène Islet1, j’ai montré que le cortex
cérébral est un environnement non permissif à la migration des neurones. Ainsi, l’ensemble de ces
expériences suggère que Islet1 participe à la spécification des propriétés migratoires des neurones du
télencéphale ventral.
Mots Clés : Télencéphale ventral, facteur de transcription, Islet1, Interneurones, migration, LIM-HD,
électroporation.
Liste des abréviations utilisées :
ADN : Acide DésoxyribonNucléique
ARN : Acide Ribonucléique
BCIP : 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-phosphate
BSA : Sérum albumine bovin
DTT : Dimercapto 2,3-butanediol
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FSP : frontière sous-palliale/palliale
GFP : Green Fluorescence Protein
GP : globus pallidus
HD : homéodomaine
HBSS : Hank’s Balanced Salt Solution
Isl1 : Islet1
LGE : Eminence Ganglionnaire Latéral
LMO : LIM-only
LMP : Low Melting point
MGE : Eminence Ganglionnaire Médiane
Ngn : Neurogenin
NGS : Normal Goat Serum
NLI : « Nuclear LIM interactor »
PCR : Réaction en chaîne par polymérase (Polymerase Chain Reaction)
PD : pallium dorsal
PFA : Paraformaldéhyde
PL/PV : pallium latéral/ventral
PM : pallium médial
Poa/AEP : aire préoptique/aire entopédonculaire
SNC : système nerveux central
SNP : système nerveux périphérique
SVZ : zone sous-ventriculaire
UTP : Uracile triphosphate
VZ : zone ventriculaire
Table des matières
Introduction
1. Anatomie et organisation du système nerveux embryonnaire des vertébrés....... 3
2. Régionnalisation du télencéphale.............................................................................. 4
2.1 Origine embryologique des structures du télencéphale............................................. 4
2.2 Génération des différents types neuronaux............................................................... 5
2.3 Régionalisation moléculaire....................................................................................... 6
3. Les mécanismes de migration neuronale.................................................................. 8
3.1 Mode et guidage de la migration cellulaire neuronale................................................. 8
3.2 Les flux de migrations neuronales à partir du télencéphale ventral........................... 9
3.3 Deux exemples de migration tangentielles dans le télencéphale ventral................... 10
3.3.1 Les interneurones striataux et corticaux générés par la MGE..................... 10
3.3.2 Les neurones du « corridor »....................................................................... 11
Les facteurs de transcription LIM-HD..................................................................... 12
EPHE Banque de Monographies SVT 3

4.
4.1 Structure, activité trancriptionnelle et fonctions..................................................... 12
4.2 Les LIM-HD dans le télencéphale ventral.............................................................. 14
4.3 Le facteur de transcription Islet1............................................................................ 15
Projet EPHE...................................................................................................................... 17
Méthodologies
1. Animaux...................................................................................................................... 18
2. Clonage de la séquence codante du gène Islet1...................................................... 18
3. Transfection cellulaire et Western Blot.................................................................. 20
3.1 Transfection et culture de cellules COS7................................................................ 20
3.2 Extraction protéique de cellules COS7 transfectées................................................ 20
3.3 Western Blot........................................................................................................... 21
4. Immunohistochimie................................................................................................... 21
4.1 Fixation et inclusion des tissus................................................................................ 21
4.2 Immunohistochimie sur coupes et sur lames........................................................... 21
4.3 Immunohistochimie sur lamelle............................................................................... 22
5. Hybridation in situ...................................................................................................... 22
5.1 Synthèse de sonde................................................................................................... 22
5.2 Hybridation in situ.................................................................................................. 23
6. Culture organotypiques et Electroporation............................................................ 23
6.1 Culture de tranches de cerveau embryonnaire par système d’interface.................. 23
6.2 Electroporation en tranche et/ou in toto.................................................................. 24
6.3 Electroporation in utero.......................................................................................... 27
Résultats
1. L’electroporation : outil de manipulation génétique dans le télencéphale........ 29
1.1 L’électroporation in-toto......................................................................................... 29
1.2 L’electroporation en tranche................................................................................... 30
1.3 L’effet de la concentration d’ADN injecté.............................................................. 31
1.4 L’électroporation in utero....................................................................................... 32
2. Etude du profil d’expression du gène Islet1 dans le télencéphale ventral.......... 33
3. Etude de la surexpression et expression ectopique de Islet1 dans le
télencéphale ventral................................................................................................... 35
3.1 Construction d’un vecteur pour exprimer Islet1..................................................... 35
3.2 Surexpression dans la LGE et expression ectopique de la MGE............................ 36
3.3 Conséquences de l’expression ectopique de Islet1 sur l’identité neuronale et leur
morphologie 37
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3.4 Effet de l’expression de Islet1 sur les capacités migratoires................................... 38
3.5 Relation épistatique avec le facteur de transcription Nkx2.1.................................. 41
4. Perte de fonction d’Islet1 par électroporation d’ARN interférent ShRNA : résultats
préliminaires 42
Discussion et perspectives
1. L’électroporation : un outil adapté à l’étude du développement du
télencéphale...................................................................................................................... 44
1.1 L’électroporation en tranches et in toto................................................................... 45
1.2 L’électroporation in utéro....................................................................................... 46
2. Etude du rôle du facteur de transcription Islet1..................................................... 47
2.1 Islet1 régule les propriétés de migration cellulaire.................................................. 47
2.2 Islet1, spécification cellulaire et autres facteurs LIM-HD dans le
télencéphale ventral....................................................................................................... 49
2.3 Cibles potentielles de Islet1.................................................................................... 50
Bibliographie...................................................................................................................... 52
Annexe 1 : protocole d’électroporation en tranches...................................................... 58
Annexe 2 : protocle d’électroporation in toto................................................................. 62
Annexe 3 : protocole d’électroporation in utero............................................................ 63
1. Anatomie et organisation du système nerveux embryonnaire des vertébrés
Le système nerveux est le centre de commandement de tout vertébré. Celui-ci peut être divisé
en deux parties : le système nerveux central (SNC), qui comprend l’encéphale et la moelle épinière et
le système nerveux périphérique (SNP), constitué d’un réseau de nerfs et de ganglions assurant ainsi
la liaison et la communication entre le SNC et le reste de l’organisme.
Le cerveau ou encéphale est une structure complexe qui joue un rôle majeur dans le traitement
de l’information provenant du système nerveux périphérique, contrôlant ainsi les fonctions cognitives,
motrices et somato-sensorielles. Le cerveau présente une architecture stéréotypée qui se met en place
au cours du développement embryonnaire. Il se forme initialement à partir de subdivisions du tube
neural : trois grandes vésicules primaires, le prosencéphale, le mésencéphale et le rhombencéphale,
qui forment ensuite cinq structures, le télencéphale, le diencéphale, le mésencéphale, le métencéphale
et le myélencéphale (pour revue, Marin O. et Rubenstein JL., 2002). Le télencéphale donnera
naissance à toutes les futures structures constituant le cerveau antérieur.
2. Régionalisation du télencéphale
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2.1. Origine embryologique des structures du télencéphale
Le télencéphale est formé de deux sous domaines. La partie dorsale des vésicules
télencéphaliques ou pallium, donne naissance au cortex cérébral et la partie ventrale, ou sous-pallium,
aux ganglions de la base (Marin. O. et Rubenstein JL., 2002 et 2003 ; Moreno et al., 2009).
Le pallium est organisé en trois grands domaines dorso-ventraux : le pallium médial (PM), le
pallium dorsal (PD) ou isocortex et le pallium latéral/ventral (PL/PV) (Marin O. et Rubenstein JL.,
2002 et 2003). Le pallium participe à la formation du cortex cérébral, une structure laminée impliquée
dans les fonctions sensorimotrices et cognitives supérieures. Plus particulièrement, l’ensemble des
structures palliales donne naissance respectivement à l’hippocampe (PM), à l’isocortex ou néocortex
(PD) et au cortex piriforme, entorhinal et une partie de l’amygdale (PL/PV). Le pallium ventral est à
l’origine d’une « palissade gliale» qui s’étend de la zone ventriculaire près de l’angle du ventricule
latéral à la surface piale et constitue la base morphologique de la frontière sous-palliale /palliale
(FSP) entre les domaines ventraux et dorsaux du télencéphale (Stoykova A. et al., 1997 ; Puelles L. et
al., 2000).
Le sous-pallium (SP) est formé par des reliefs nommés éminences ganglionnaires latérales
(LGE) et médianes (MGE), ainsi que par l’aire préoptique/aire entopédonculaire antérieur (Poa/AEP)
située plus ventralement (Marin O. et Rubenstein JL., 2002 et 2003; Moreno et al., 2009). Ces
structures donnent naissance à une mosaïque de noyaux, les ganglions de la base, qui diffèrent par
leur positionnement, leur morphologie, et leur connectivité et participent notamment au contrôle de la
motricité volontaire. En effet, les zones prolifératives de chaque éminence donnent naissance par
migration à une grande majorité des neurones composant différentes structures sous-palliales
principales, comme le striatum et le globus pallidus ou pallidum. Par exemple, la LGE génère une
grande partie du striatum, et la MGE génère une grande partie du globus-pallidus, (Marin O. et
Rubenstein JL., 2003). Afin de comprendre le lien entre les structures embryonnaires du télencéphale
et la formation des structures adultes, de nombreuses études ont visé à déterminer l’origine
embryonnaire des différentes populations neuronales télencéphaliques (Flames N. et al., 2007).
2.2. Génération des différents types neuronaux
Le télencéphale ventral des vertébrés est constitué de populations très hétérogènes de
neurones, qui diffèrent par leur morphologie, leur structure et leur type cellulaire final. Le processus
qui contrôle la spécification et la différentiation neuronale repose sur l’organisation pseudostratifiée
du neuro-épithélium. Il est subdivisé en trois grandes parties, la zone ventriculaire (VZ), la zone sousventriculaire
(ZSV) et le manteau (pour revue Marin et Rubstein, 2003).
D’un point de vue mécanistique, les progéniteurs présents dans la VZ, ou glies radiaires,
subissent des divisions successives, générant ainsi soit deux progéniteurs, soit un progéniteur et un
neurone, soit un progéniteur et un progéniteur intermédiaire. Les progéniteurs intermédaires se
positionnent dans la SVZ où ils continuent à se diviser pendant quelques cycles et génèrent des
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cellules post-mitotiques (pour revue Oscar M. et Rubenstein J.L.R, 2002 ; Robert F. Hevner et al.,
2006). Les cellules post-mitotiques générées par la glie radiaire de la VZ ou les progéniteurs
intermédiaires de la SVZ migrent dans le manteau où elles achèvent leur différenciation neuronale
(pour revue Marin O. et Rubstein JL., 2003). Ces neurones vont devenir soit des neurones dits « de
projection », soit des interneurones: les neurones de projection envoient des connexions en dehors de
la structure dans laquelle ils se trouvent alors que les interneurones modulent localement la
transmission synaptique (pour revue Marin O. et Rubenstein JLR, 2002 ).
Si cette organisation globale est retrouvée dans l’ensemble du télencéphale, le lieu de
naissance de chaque précurseur détermine de manière étroite l’identité neuronale. En effet, on peut
définir trois grandes catégories de neurones télencéphaliques, classées en fonction du type de
neurotransmetteur utilisé : des neurones de type Glutamatergique issus des progéniteurs du cortex
(pour revue Millen KJ et Gleeson JG., 2008), des neurones Cholinergiques dérivant exclusivement
des progéniteurs de la Poa/AEP (Sussel L. et al., 1999 ; Marin et al., 2000) et des neurones
GABAergiques issus des progéniteurs de la LGE, la MGE et la Poa (Lavdas AA. et al., 1999 ; Sussel
L. et al., 1999). Ainsi, des sous-types neuronaux distincts sont générés localement dans différentes
régions du télencéphale.
2.3. Régionalisation moléculaire
Chaque structure du télencéphale est caractérisée par l’expression précoce de combinaison de
gènes, majoritairement des facteurs de transcriptions, définissant des territoires moléculaires (Marin.
O., et Rubenstein., J.L., 2002). Par exemple, les gènes Neurogenin (Ngn) sont spécifiques du pallium,
et Dlx du sous-pallium (Tuttle R. et al., 1999 ; Garel et al., 2002).
Des gènes caractéristiques de ces sous-domaines sont exprimés dans les progéniteurs mais
également dans les neurones post-mitotiques, comme par exemple Nkx2.1 dans les zones
prolifératives de la MGE et Poa/AEP ainsi que dans leur manteau comme le GP (Sussel L. et al.,
1999 ; Marin O. et al., 2000). Islet1 est exprimé également dans la SVZ et le manteau de la Poa/AEP
ainsi que dans le manteau de la LGE soit le striatum (Marin. O. et Rubenstein JL., 2002).
L’invalidation de certains de ces gènes a montré que leur expression régionalisée contrôle la
prolifération et la spécification des cellules caractéristiques de chaque territoire (Flames N. et al.,
2007), et appuie un modèle de régionalisation du sous-pallium similaire à celui, mieux établi, de la
moelle épinière (Marin O. et Rubenstein JL., 2002). Dans ce modèle, les combinatoires d’expression
des différents facteurs de transcription spécifient au sein de chaque sous-domaine des progéniteurs
différents qui génèrent des sous-types neuronaux présentant des caractéristiques spécifiques,
constituant ainsi la base de la régionalisation moléculaire et fonctionnelle du télencéphale.
3. Les mécanismes de migration neuronale
3.1. Modes et guidage de la migration cellulaire neuronale
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Au sein du SNC, on distingue deux modes de migration pouvant s’établir à partir d’une même
région proliférative initiale : la migration radiaire et la migration tangentielle. D’une part, les neurones
immatures sortant de la zone proliférative peuvent migrer radiairement le long d’un échafaud établi,
formé par les glies radiaires qui constituent les progéniteurs de la VZ (Misson JP. et al., 1988 ;
Halliday AL et Cepko CL., 1992, Rakic P., 1990). Par ce processus, les neurones vont peupler le
manteau en regard de la zone proliférative qui les a générée. D’autre part, certains neurones migrent
indépendamment de cet échafaud radiaire, ce qui permet une migration dans des compartiments
neuronaux adjacents, le long de l’axe rostro-caudal ou dorso-ventral (Rakic P., 1990). Cette migration
peut se produire sur de longues distances, permettant ainsi la redistribution de sous-types neuronaux.
Quel que soit leur mode migratoire, les neurones générés au niveau des zones ventriculaires
suivent une trajectoire stéréotypée jusqu'à destination de leur cible où elles effectueront leurs
connexions. Ces processus migratoires sont orientés par la richesse des signaux présents dans
l’environnement dans lequel elles progressent. En effet, l’environnement comporte de nombreux
indices positionnels permettant de les guider : des cibles intermédaires expriment des signaux
moléculaires leur permettant ainsi de parcourir une succession de petits trajets jusqu'à à leur cible
finale (Tessier-Lavigne M. et Goodman CS., 1996 ; Marin O. et al., 2010).
Deux principaux mécanismes de guidage ont été identifiés: 1/ l’attraction et/ou la répulsion par
contact qui fait intervenir des signaux locaux, en majorité des protéines membranaires ; 2/ la chimioattraction
et/ou répulsion par des facteurs diffusibles produits par des cellules situées à distance. Les
familles de molécules chimiotropiques classiques sont les Ephrines, les Sémaphorines , les Slits et
Nétrines (Dickson BJ., 2002), auxquelles sont venues plus récemment s’ajouter une large palette de
facteurs potentiels, comme les morphogènes, les facteurs de croissance ou encore les facteurs de
transcription (Nobrega Perreira S. et Marin O., 2009). La combinaison de ces molécules présentes
dans l’environnement permet d’orienter des flux de migrations cellulaires qui sont particulièrement
importants dans le télencéphale.
3.2. Les flux de migrations neuronales à partir du télencéphale ventral
Au sein du télencéphale, différents flux de migrations radiaires et tangentielles vont permettre
l’élaboration de circuits neuronaux complexes. D’une part, comme mentionnée précédemment, la
migration radiaire donne naissance aux neurones de projection glutamatergiques du cortex cérébral,
aux neurones de projection du striatum et à une grande partie de ceux du pallidum à partir du pallium,
de la LGE et de la MGE, respectivement (Rakic P., 1991 ; Halliday AL. et Cepko CL., 1992 ; pour
revue Oscar M. et Rubenstein JL., 2002). D’autre part, des flux de migration tangentielle, à partir du
télencéphale ventral, vont générer une grande majorité des interneurones de l’ensemble du
télencéphale qui sont majoritairement GABAergiques et également cholinergiques (Pleasure SJ. et al.,
2000 ; pour revue Oscar M. et Rubenstein JL, 2002). Notamment, la MGE produit par migration
tangentielle des interneurones du striatum et du cortex, (Nobrega-Perreira S. et al., 2008). De la même
manière, la Poa/AEP donne naissance à de futurs interneurones du striatum et du cortex cérébral.
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Enfin, il existe également des courants de migration ventraux (Tripodi M. et al., 2004 ; Lopez-
Bendito G. et al., 2006), comme celui généré par la LGE (Lopez-Bendito G. et al., 2006) et qui
restent encore à caractériser en détail.
Ainsi, à partir d’un même territoire donné, on peut observer les deux types de migration
radiaire et tangentielle. Ces observations soulèvent également deux questions reliées : comment ces
flux sont-ils contrôlés ? ces flux de migration ont-ils d’autres fonctions que la redistribution de soustypes
neuronaux au sein du télencéphale ? J’aborderai ces points en détaillant deux exemples: la
migration des interneurones issus de la MGE et le rôle de la migration tangentielle dans le guidage de
connexions axonales (Marin O., et Rubenstein JL., 2002 ; Marin O. et Rubenstein JL., 2003 ; Nery S.
et al., 2002).
3.3. Deux exemples de migration tangentielle dans le télencéphale ventral
3.3.1. Les interneurones striataux et corticaux générés par la MGE
Pour étudier les mécanismes contrôlant la migration des interneurones de la MGE, il faut
comprendre les facteurs impliqués dans la spécification de ce territoire. Chez la souris, le facteur de
transcription à homéodomaine Nkx2.1 est exprimé tôt au cours du développement dans les
progéniteurs du sous-pallium incluant la MGE et la Poa (Sussel L. et al., 1999). Il est donc exprimé
dans tous les progéniteurs de la MGE et son expression est maintenue dans les neurones de projection
du GP et les interneurones produits par la MGE qui restent dans le télencéphale ventral. En revanche,
son expression s’éteint dans les interneurones en route vers le cortex cérébral.
L’inactivation globale et locale de Nkx2.1 chez la souris a montré que ce gène est requis pour
la spécification d’un territoire de type MGE (Sussel L. et al., 1999 ; Flandin P. et al., 2010). Ainsi, en
absence de Nkx2.1, le territoire dans lequel il aurait du s’exprimer acquiert une identité moléculaire
similaire soit à la LGE soit à la Poa. En conséquence, les neurones caractéristiques de la MGE sont
très peu générés (Pleasure SJ. et al., 2000, Abellan A. et Medina L., 2009). Par ailleurs, des
expériences de surexpression de Nkx2.1 par électroporation dans les progéniteurs de MGE montrent
que les cellules qui maintiennent une forte expression de Nkx2.1 restent dans le télencéphale ventral
(Nobrega-Pereira S. et al., 2008). Ainsi, le maintien de l’expression ectopique de Nkx2.1 dans de
futurs interneurones corticaux est suffisant pour maintenir ces neurones au sein du télencéphale
ventral. De manière inverse, l’inactivation de Nkx2.1 dans des neurones post-mitotiques montre que
la perte de ce facteur permet à un nombre accru de neurones de rejoindre le cortex cérébral (Nobrega-
Pereira S. et al., 2008). L’ensemble de ces expériences indique que l’expression de Nkx2.1 dans les
neurones post-mitotiques dérivés de la MGE agit comme « un interrupteur », permettant d’orienter les
interneurones vers le striatum ou le cortex cérébral (Nobrega-Pereira S. et al., 2008).
Comment Nkx2.1 contrôle la trajectoire migratoire des neurones ? Il a été montré
précédemment que l’expression dans le striatum de Sema3A et Sema3E, deux molécules répulsives,
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agissent sélectivement sur la migration des interneurones corticaux et striataux issus de la MGE
(Marin O. et Rubenstein JL., 2001 ou 2002). En effet, contrairement aux interneurones striataux, les
interneurones corticaux expriment Neuropilin1 et 2, deux récepteurs à Sema3A et 3F, ce qui les
maintiennent « en dehors » du striatum et les orientent vers le cortex cérébral. Une activité attractive
de Neurégulin1 contribue également à les attirer vers leur cible (Flames N. et al., 2004). Des
expériences de gain et perte de fonction ont révélé que Nkx2.1 régule l’expression de manière directe
de Neuropilin2, permettant ainsi d’expliquer le rôle de ce facteur de transcription dans le contrôle
migratoire (Nobrega-Pereira S. et al., 2008). Par conséquent, si à partir de la MGE une cellule
exprime Nkx2.1, elle devient soit un interneurone du striatum, et dans ce cas, elle maintient
l’expression de Nkx2.1 et réprime l’expression du récepteur Neuropilin2, soit, elle devient un
interneurone cortical, réprime l’expression de Nkx2.1 et exprime Neuropilin2.
3.3.2. Les neurones du « corridor »
L’importance quantitative des flux migratoires dans le télencéphale ouvre la possibilité que
ceux-ci participent de manière globale à la morphogenèse des structures. Récemment, il a été montré
que la migration tangentielle de neurones du « corridor » est importante pour la formation de tracts
axonaux (Lopez-Bendito G. et al., 2006). Le corridor correspond à un petit territoire cellulaire se
situant entre la SVZ de la MGE et le GP. L’identité moléculaire des cellules présentent dans ce
territoire est caractéristique des neurones dérivés de la LGE (Ebf1, Meis2, Islet1, Sema3A, Sema3F)
et non de la MGE (Nkx2.1, Lhx6). La cinétique des profils d’expression entre E11,5 et E13,5 ainsi que
des expériences de transplantations en tranches organotypiques ont montré que le corridor est formé
par migration tangentielle depuis la LGE (Lopez-Bendito G. et al, 2006). De plus, le corridor
constitue un territoire permissif pour une population d’axones qui véhicule les informations
sensorielles et motrices au néocortex, les projections thalamocorticales. Des expériences de greffes en
culture de tranches organotypiques ont montré que les territoires issus de la MGE sont non-permissifs
aux axones thalamocorticaux et la migration tangentielle des neurones du corridor ouvre un pont
permissif pour ces projections (Lopez-Bendito G. et al, 2006). Ainsi, la migration tangentielle de
neurones à partir du télencéphale ventral participe également à l’établissement des connexions
nerveuses (Lopez-Bendito G., et al., 2006).
4. Les Facteurs de transcription LIM-HD
4.1. Structure, activité transcriptionnelle et fonctions
Les facteurs de transcriptions LIM-HD ont été impliqués dans de nombreux processus de
spécification et de différenciation cellulaire au cours de l’embryogenèse (Shirazaki R. et Plaff SL.
2002 ; Tzchori I. et al., 2009, pour revue Bachy I. et al., 2002). D’un point de vue structural, ils sont
caractérisés par la présence de deux domaines fonctionnels : les domaines LIM et Homéodomaine ou
HD.
Les domaines LIM sont très riches en cystéines et forment un complexe à doigts de Zinc, qui
permet d’établir des interactions protéine /protéine. Ces domaines sont retrouvés dans différentes
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protéines du cytoplasme ou du noyau, en association avec d’autres domaines comme un domaine
kinase (LIM-kinase) ou seul (LMO pour LIM only). Les domaines LIM permettent au LIM-HD
d’interagir avec des co-activateurs (les CLIM), des co-répresseurs, des compétiteurs ou bien d’autres
facteurs de transcription (pour revue Sanchez-Garcia I. et Rabbitts TH., 1994, Dawid IB., 1998, pour
revue Rétaux S. et Bachy I., 2002). D’autre part, l’homéodomaine (HD) est un domaine de liaison à
l’ADN qui permet l’interaction de ce facteur de transcription avec ses cibles.
Différentes études ont permis de montrer que l’activité transcriptionnelle des facteurs LIM-HD
nécessite la présence de co-facteurs, les CLIM autrement appelés « nuclear LIM interactor » (NLI)
(pour revue Matthews JM. et Visvader JE., 2003). Le tétramère actif LIM-HD/CLIM peut être
déstabilisé par la présence d’un compétiteur qui contient des domaines LIM sans le domaine
d’interaction à l’ADN, les LIM only ou LMO (pour revue Rétaux S. et Bachy I., 2002). Ainsi,
l’activité transcriptionnelle des LIM-HD dépend de la présence de facteurs CLIM et LMO.
Par ailleurs, il a été montré que la combinatoire d’expression de différents facteurs LIM-HD
permet la formation d’autres complexes. En effet, les facteurs Lhx3, Islet1 et CLIM sont capables de
former des hexamères, en plus des tétramères Lhx3/CLIM ou Isl1/CLIM. De manière remarquable,
les hexamères et tétramères reconnaissent des séquences régulatrices différentes (Seunghee Lee et al.,
2008), permettant ainsi d’activer des programmes génétiques différents dans des cellules exprimant
différentes combinatoires de LIM-HD.
Si les facteurs LIM-HD participent à de très nombreux processus biologiques, ils ont été plus
particulièrement impliqués dans le développement de sous-populations de motoneurones de la moelle
épinière (Song MR. et al., 2009). Dans ce système, la combinatoire d’expression des LIM-HD, Lhx3,
Lhx4 et Islet1 (Isl1) permet de définir différents « pools » de motoneurones qui sont localisés dans
des régions différentes de la corne ventrale de la moelle épinière et qui envoient des projections
axonales distinctes. Des études de perte et de gain de fonction ont mis en évidence que les facteurs
LIM-HD jouent un rôle essentiel dans la spécification des sous-types neuronaux ainsi que dans
l’acquisition d’une trajectoire axonale associée à ces sous-types neuronaux (Thor S. et al., 1999).
4.2. Les LIM-HD dans le télencéphale ventral
Dans le télencéphale ventral, différents facteurs de transcription LIM-HD sont exprimés dans
des territoires spécifiques : Lhx6, Lhx7 aussi appelé Lhx8, et Isl1 (Grigoriou, et al., 1998). Nous
détaillerons ici les rôles de Lhx6 et Lhx7, qui ont été relativement bien étudiés.
Lhx6 est exprimé dans les cellules de la VZ et SVZ de la MGE et Poa/AEP (Grigoriou, et al.,
1998 ; Flames N., et al., 2007) sous le contrôle transcriptionnel de Nkx2.1 (Sussel L. et al., 1999 ; Du
T., et al., 2008). L’expression de Lhx6 est maintenue dans la plupart des neurones de projection et
interneurones issus de ces régions (Grigoriou et al., 1998 ; Lavdas et al., 1999), dont les
interneurones qui migrent au cortex cérébral ainsi que ceux qui migrent dans le striatum. Des études
faites chez la souris montrent que l’expression de Lhx6 dans les cellules de MGE n’est pas suffisante
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pour que celles-ci migrent au cortex cérébral (Anderson SA. et al., 1997 ; Colombo E. et al., 2007).
En revanche, des expériences de perte et gain de fonction montrent que Lhx6 contrôle la capacité
migratoire des neurones de MGE (Yangu Zhao et al., 2008). De manière cohérente, le mutant Lhx6-/ présente un défaut de migration tangentielle des cellules de la MGE et une diminution d’un sous-type
d’interneurones GABAergiques dans le cortex (Liodis P. et al., 2007). Ainsi, Lhx6 régule les
propriétés migratoires des interneurones corticaux GABAergiques et la spécification de certains soustypes
(Liodis P. et al., 2007).
Lhx7 est également exprimé dans la MGE et Poa/AEP (Grigoriou M. et al., 1998). Le transcrit
de Lhx7 est restreint à une sous-population de neurones ventraux, comprenant les neurones
cholinergiques de projection et des interneurones cholinergiques du striatum (Asbreuk CH. et al.,
2002 ; Zhao Y. et al., 2003 ; Fragkouli A. et al., 2005 ). Des expériences de lignage cellulaire utilisant
une lignée Lhx6-Cre, ont permis de montrer que Lhx7 est exprimé dans une sous-partie des
précurseurs ayant exprimé Lhx6, mais qui ne maintiennent pas l’expression de Lhx6. Ainsi, si tous les
précurseurs d’interneurones expriment Lhx6, les interneurones GABAergiques maintiennent
l’expression de Lhx6 et les interneurones cholinergiques maintiennent celle de Lhx7. Des expériences
faites chez le Xénope montrent que Lhx7 est également sous le contrôle transcriptionnel de Nkx2.1
(Bachy I. et Rétaux S., 2006). Par ailleurs, l’expression ectopique de Lhx7 chez la souris est
suffisante pour induire un phénotype cholinergique dans des neurones en différenciation (Fragkouli
A. et al., 2009). Inversement, l’analyse du mutant Lhx7-/- et Lhx7Lacz/Lacz montre une réduction
drastique du nombre de neurones cholinergiques dans le télencéphale ventral, notamment dans le
striatum (Asbreuk et al., 2002). L’utilisation du gène LacZ permet de mettre en évidence que les
neurones mutants LacZ+ expriment Lhx6 et ont acquis un phénotype GABAergique au lieu de devenir
cholinergiques (Fragkouli A. et al., 2009). Ainsi, Lhx7 joue un rôle essentiel dans l’acquisition d’un
phénotype cholinergique (Fragkouli A. et al., 2005). Enfin, l’expression ectopique de Lhx6 est capable
de réduire la capacité de Lhx7 à induire un phénotype cholinergique, suggérant un antagonisme entre
les deux facteurs (Frakgouli A. et al., 2009).
L’ensemble de ces résultats suggère l’existence d’une cascade moléculaire dans laquelle
Nkx2.1 induit l’expression de Lhx6, le maintien de cette expression induit une différenciation de type
GABAergique, alors que l’induction de Lhx7 et l’extinction couplée de Lhx6 entraînent les neurones
dans une voie de différenciation cholinergique (Fragouli A et al., 2009).
4.3. Le facteur de transcription Islet1
Isl1 est un facteur de transcription LIM-HD initialement identifié dans le pancréas où il joue
un rôle dans l’induction du gène de l’Insuline (Karlsson et al., 1990 ; Ahlgren U. et al., 1997). Isl1 est
également exprimé dans de multiples structures qui incluent des progéniteurs cardiaques, la thyroïde,
les motoneurones de la moelle épinière, des noyaux du mésencéphale et diencéphale ainsi que dans le
télencéphale ventral (Cai et al., 2003 ; Thor S et al., 1999 ; Westerlung J. et al., 2008 ; Pfaff SL. et al.,
1996). Si Isl1 joue un rôle essentiel dans les progéniteurs cardiaques (Cai et al., 2003), son expression
dans le SNC est majoritairement détectée dans des neurones post-mitotiques (Tsuchida T. et al.,
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1994). Dans la moelle épinière, il est notamment exprimé dans une grande partie des « pools » de
motoneurones (Ericson J. et al., 1992 ; Tsuchida T. et al., 1994). Dans ce système, il agit en
coopération avec d’autres facteurs LIM-HD comme Lhx3 dans la spécification de sous-types
neuronaux (motoneurones versus interneurones) (Seunghee Lee et al., 2008), et en coopération avec le
facteur Forkhead Foxp1 dans la spécification d’un sous-type de motoneurones (Palmesino E. et al.,
2010).
Dans le télencéphale, Isl1 est exprimé dans un vaste territoire qui inclut des neurones
GABAergiques du striatum et du couloir et des neurones cholinergiques dans la Poa/AEP (Gittis AH.
et al., 2010). L’inactivation conditionnelle de Isl1 dans la MGE et Poa/AEP à l’aide de la lignée Six3cre
conduit à une diminution du nombre de neurones cholinergiques dans le télencéphale ventral
(Yasser Elshotory et Lin Gan, 2008). Ainsi, Isl1 pourrait agir de manière coopérative avec Lhx7 dans
l’induction du phénotype cholinergique dans les neurones dérivés de la MGE et Poa/AEP (Flames et
al., 2007 et Frakgouli et al., 2009). En revanche, sa fonction dans les neurones GABAergiques reste
entièrement à élucider.
Projet EPHE
Le fonctionnement du cerveau repose sur la formation de réseaux de neurones aux propriétés
cellulaires diverses. La migration neuronale est essentielle au développement de ces réseaux car elle
permet d’augmenter la diversité neuronale par un processus de redistribution cellulaire. Dans le
cerveau antérieur, des flux de migrations neuronales à partir des éminences ganglionnaires vont
générer des neurones ventraux et des neurones corticaux dorsaux. Différentes études ont mis en
évidence le rôle de certains facteurs de transcription dans la spécification de ces neurones corticaux et
de leurs propriétés migratoires, comme le facteur de transcription à homéodomaine Nkx2.1 et le
facteur LIM à homéodomaine (LIM-HD) Lhx6. Néanmoins, comment les différentes populations
neuronales qui migrent à partir des éminences ganglionnaires sont spécifiées, restent largement à
caractériser.
Afin de caractériser les facteurs intrinsèques contrôlant la spécification et migration neuronale, j’ai
examiné le rôle du facteur de transcription Islet1 lors du développement du télencéphale ventral. En
effet, ce facteur a été impliqué dans des étapes de spécification cellulaire et migration dans d’autres
systèmes comme celui du développement du pancréas, de la thyroïde et des motoneurones de la
moelle épinière. Pour caractériser le rôle de ce facteur dans le cerveau antérieur, j’ai analysé de
nouveau en détail son profil d’expression et entrepris des expériences de perte et de gain de fonction
grâce à la technique d’électroporation. Dans un premier temps, j’ai développé les outils génétiques et
techniques nécessaire à cette étude, en sous-clonant la séquence codante du gène Islet1 dans un
vecteur d’expression de type pCAAGS-IRESII-EGFP, puis j’ai importé et instauré au laboratoire la
technique d’électroporation ciblée (électroporation in toto ; en tranches de cerveaux embryonnaires et
in utero). Dans un deuxième temps, j’ai utilisé les outils développés, pour étudier l’effet de perte et
gain de fonction de Islet1 au sein de territoire ciblé du télencéphale ventral.
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EPHE Banque de Monographies SVT 18