Cours de D. Belin, notes de cours
Cours de D. Belin, notes de cours Cours de D. Belin, notes de cours
Notes de génétique moléculaire, cours de Dominique Belin Cahier 1 : Les bactéries, leurs bactériophages et leurs croissances Dans les années 30, l'utilisation des micro-organismes a posé les bases de la biologie moléculaire. • Les champignons: Neurospora • Les bactéries: Escherichia coli • Les bactériophages: T4 et λ (lambda) • Les levures: Saccharomyces cerevisiae (voir plus loin dans le cours) et Schizosaccharomyces pombe La génétique moléculaire étudie la nature du matériel génétique, c'est à dire sa propagation, sa variation et son expression. Elle essaye de mettre en évidence le lien entre le support de l'hérédité et le phénotype. Escherichia coli: Le temps de génération est, en conditions optimales (milieu riche, 37°C), 20 minutes (20') • Génome: 4.639.168 pb (1 chr. circulaire) • ~4173 gènes organisme génétiquement haploide • Le temps de réplication du génome est de 40' (1000 - 2000nt/sec) • La vitesse de transcription est de 60nt/sec • La vitesse de traduction est de 20 acides aminés/ sec (20aa/sec) • => Donc la transcription et la traduction vont à la même vitesse (couplage !!) Pour E. coli, le type sauvage (organisme prototrophe) peut pousser sur un milieu minimum et complètement synthétique. Il lui faut: • des sels • du phosphate • de l'ammonium (source d'azote) • des traces de métaux • une source de carbone (nous allons voir l'utilisation de mutations dans l'opéron lac dans la troisième partie du cours) La vitesse de croissance dépend de la source de carbone: Glucose de préférence, lactose, maltose, arabinose… La température de croissance peut varier de 20°C à 42°C, avec un optimum à 37°C. Escherichia coli est sensible aux antibiotiques. La base de la génétique est la possibilité d'obtenir des variations et d'isoler des mutants : 1
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Notes <strong>de</strong> génétique moléculaire, <strong>cours</strong> <strong>de</strong> Dominique <strong>Belin</strong><br />
Cahier 1 : Les bactéries, leurs bactériophages et leurs croissances<br />
Dans les années 30, l'utilisation <strong>de</strong>s micro-organismes a posé les bases <strong>de</strong> la biologie<br />
moléculaire.<br />
• Les champignons: Neurospora<br />
• Les bactéries: Escherichia coli<br />
• Les bactériophages: T4 et λ (lambda)<br />
• Les levures: Saccharomyces cerevisiae (voir plus loin dans le <strong>cours</strong>) et<br />
Schizosaccharomyces pombe<br />
La génétique moléculaire étudie la nature du matériel génétique, c'est à dire sa propagation, sa<br />
variation et son expression. Elle essaye <strong>de</strong> mettre en évi<strong>de</strong>nce le lien entre le support <strong>de</strong><br />
l'hérédité et le phénotype.<br />
Escherichia coli:<br />
Le temps <strong>de</strong> génération est, en conditions optimales (milieu riche, 37°C), 20 minutes (20')<br />
• Génome: 4.639.168 pb (1 chr. circulaire)<br />
• ~4173 gènes organisme génétiquement haploi<strong>de</strong><br />
• Le temps <strong>de</strong> réplication du génome est <strong>de</strong> 40' (1000 -<br />
2000nt/sec)<br />
• La vitesse <strong>de</strong> transcription est <strong>de</strong> 60nt/sec<br />
• La vitesse <strong>de</strong> traduction est <strong>de</strong> 20 aci<strong>de</strong>s aminés/ sec<br />
(20aa/sec)<br />
• => Donc la transcription et la traduction vont à<br />
la même vitesse (couplage !!)<br />
Pour E. coli, le type sauvage (organisme prototrophe) peut pousser sur un milieu minimum et<br />
complètement synthétique. Il lui faut:<br />
• <strong>de</strong>s sels<br />
• du phosphate<br />
• <strong>de</strong> l'ammonium (source d'azote)<br />
• <strong>de</strong>s traces <strong>de</strong> métaux<br />
• une source <strong>de</strong> carbone (nous allons voir l'utilisation <strong>de</strong> mutations dans l'opéron lac<br />
dans la troisième partie du <strong>cours</strong>)<br />
La vitesse <strong>de</strong> croissance dépend <strong>de</strong> la source <strong>de</strong> carbone: Glucose <strong>de</strong> préférence, lactose,<br />
maltose, arabinose…<br />
La température <strong>de</strong> croissance peut varier <strong>de</strong> 20°C à 42°C, avec un optimum à 37°C.<br />
Escherichia coli est sensible aux antibiotiques.<br />
La base <strong>de</strong> la génétique est la possibilité d'obtenir <strong>de</strong>s variations et d'isoler <strong>de</strong>s mutants :<br />
1
• <strong>de</strong>s mutants nutritionnels (auxotrophe): par exemple: leu - , trp - , his - (donc ces souches<br />
ont besoin <strong>de</strong> ces aci<strong>de</strong>s aminés)<br />
• <strong>de</strong>s mutants d'utilisation <strong>de</strong> sucre: par exemple lac - → Fermentation<br />
• <strong>de</strong>s mutants ne poussant pas toutes les températures: température sensible (ts),<br />
cryosensibles (cs)<br />
• <strong>de</strong>s mutants résistants aux antibiotiques: par exemple Amp R<br />
La croissance <strong>de</strong>s bactéries et <strong>de</strong>s bactériophages<br />
Escherichia coli est génétiquement haploï<strong>de</strong> (exceptions voir plus tard). La souche sauvage<br />
est prototrophe.<br />
La croissance <strong>de</strong>s bactéries se reflète par une augmentation <strong>de</strong> la masse cellulaire dans le<br />
milieu <strong>de</strong> culture et ainsi d'une augmentation <strong>de</strong> la turbidité (mais attention, la turbidité<br />
dépend <strong>de</strong> la taille <strong>de</strong>s particules et <strong>de</strong> leur nombre).<br />
Une colonie est un clone: un ensemble d'organismes génétiquement i<strong>de</strong>ntiques (jusqu'à preuve<br />
du contraire...). Ainsi le nombre <strong>de</strong> colonies nous permet <strong>de</strong> mesurer le nombre <strong>de</strong> cellules (au<br />
temps 0) qui donnent lieu à une <strong>de</strong>scendance. Au <strong>cours</strong> du temps il est donc possible <strong>de</strong><br />
mesurer le taux <strong>de</strong> croissance car les divisions sont asynchrones et la croissance apparaît<br />
continue:<br />
Nt = No2 t/tg<br />
tg = t1/2 = temps <strong>de</strong> génération<br />
Il y a 3 phases <strong>de</strong> croissance : Le lag (latence), la phase exponentielle et le plateau = G0<br />
Ceci dépend aussi <strong>de</strong> la phase <strong>de</strong> croissance <strong>de</strong>s cellules:<br />
Le bactériophage<br />
Graphiques semi-logarithmiques<br />
On étale beaucoup (10 6 - 10 8 ) bactéries sur une boîte. Cela donne quoi? Un tapis <strong>de</strong> bactéries<br />
(gazon), parce que toutes les cellules vont faire <strong>de</strong>s micro-colonies confluentes. Mais parfois<br />
il y a une zone claire dans la boîte:<br />
2
Une plaque, une plage ou une zone <strong>de</strong> lyse ou d'inhibition <strong>de</strong> croissance. Cette zone est dûe à<br />
<strong>de</strong>s phages!<br />
Avec les fibres <strong>de</strong> la queue, le phage s'attache sur <strong>de</strong>s<br />
"récepteurs" sur la bactérie. Selon les phages, se sont <strong>de</strong>s protéines bactériennes différentes<br />
(OmpC pour T4, LamB pour le phage λ). C'est donc l'interaction entre <strong>de</strong>s protéines du phage<br />
et la protéine <strong>de</strong> surface <strong>de</strong> la bactérie qui <strong>de</strong>termine la spécificité. La tête contient l'ADN.<br />
Croissance du phage T4: “one-step growth”<br />
• Infection avec une multiplicité <strong>de</strong><br />
1 phage / 10 bactéries, en moyenne<br />
(moi = 0.1)<br />
• Etalement à différents temps<br />
sur un gazon bactérien<br />
• Latence: 1 bactérie infectée va lyser<br />
sur la boîte, libérer sa progéniture et<br />
faire une plaque par cycles successifs<br />
• Après 40 min, les bactéries infectées<br />
ont lysé, et chaque phage libéré<br />
donne une plaque<br />
Centres infectieux=bactéries infectées + phages<br />
libres<br />
3
Cahier 2 : Les mutants T4 et la carte génétique<br />
Les mutants du bactériophage T4<br />
Prenons un phage sauvage (wild type): a + b + h + r + e + 23 + (les lettres et chiffres représentent <strong>de</strong>s<br />
gènes). Normalement les plaques sont légèrement troubles, mais à une rare fréquence (environ<br />
1/1000) apparaissent <strong>de</strong>s plaques gran<strong>de</strong>s et claires:<br />
Les plaques <strong>de</strong>s phages sauvages (r + ) sont petites et troubles.<br />
Les plaques du mutant (r - ) sont gran<strong>de</strong>s et claires. Les plaques claires<br />
et gran<strong>de</strong>s sont dues à une lyse rapi<strong>de</strong>. Les mutant sont nommés: r =<br />
rapi<strong>de</strong><br />
Nous allons isoler d’autres mutants, pour mieux connaître le phage. Ici nous allons d'abord<br />
isoler <strong>de</strong>s bactéries qui ne permettent pas au phage <strong>de</strong> se multiplier et donc <strong>de</strong> causer la lyse<br />
<strong>de</strong> la bactérie (mutations dans le génome bactérien). Ensuite nous allons isoler <strong>de</strong>s mutants du<br />
phage (mutations dans le génome du phage), qui pourront <strong>de</strong> nouveau pousser sur cette<br />
"nouvelle" bactérie (hôte). La colonie qui pousse ne permet donc plus la reproduction du<br />
phage et ne lyse pas. Appelons la B/4 ou T4 R<br />
Si maintenant la souche B/4 est étalée sur une boîte <strong>de</strong> petri et infectée avec 10 7 - 10 8 <strong>de</strong><br />
phages T4, avec un peu <strong>de</strong> chance vous observez une plaque, due à une mutation dans le<br />
génome du phage. Ce phage est capable <strong>de</strong> pousser sur son nouveau hôte: c'est un mutant h.(h<br />
= host range). L'interaction entre phage et bactérie est en fait une interaction entre recepteur et<br />
fibres <strong>de</strong> phage.<br />
En fait, nous observons ici une relation mutant - suppresseur. La mutation suppresseur du<br />
phage permet à ce <strong>de</strong>rnier <strong>de</strong> se multiplier malgré la mutation primaire dans la cellule hôte.<br />
Cet interaction génétique peut être très spécifique. Un autre mutant B/4 ne permettra pas<br />
forcément à ce mutant h <strong>de</strong> pousser. On parle <strong>de</strong> suppression allèle spécifique.<br />
4
La carte génétique du bactériophage T4<br />
Pour localiser les mutations et les gènes correspondants sur une carte génétique, il faut donc<br />
croiser les phages par infection d'une bactérie avec les <strong>de</strong>ux types <strong>de</strong> phages (moi?).<br />
D’après les fréquences <strong>de</strong> recombinaison, on en déduit qu’il y a au moins 3 gènes et que pour<br />
que les distances soient respectées, le génome du bactériophage doit être circulaire !!! C’est<br />
parodoxale au vu <strong>de</strong> la photo du chromosome linéaire <strong>de</strong> T4.<br />
On l’explique par 3 points :<br />
• un capsi<strong>de</strong> contient 102% d'ADN, 100% étant la longueur du génome<br />
• L'ADN répliqué dans la cellule fait plusieurs génomes en longueur,<br />
• Les génomes sont décalés.<br />
En effet, nous parlons d'une molécule, mais nous regardons toute une population <strong>de</strong> phages!<br />
Reprenons l'exemple <strong>de</strong> l'infection d'une bactérie avec <strong>de</strong>s phages r et <strong>de</strong>s phages r + .<br />
Si vous infectez une bactérie avec 5 phages r + et 5 phages r , après 10' vous regar<strong>de</strong>z les<br />
centre infectieux, qu'est- ce que vous observez?<br />
Des plaques "mottled" (panaché):Stent and Calendar, 12-1<br />
Si vous atten<strong>de</strong>z la fin du cycle <strong>de</strong> reproduction, qu'est-ce que vous verrez?<br />
Essentiellement <strong>de</strong>s r + et <strong>de</strong>s r. Mais donc aussi 2% <strong>de</strong> plaques mottled.<br />
Il y a redondance terminale du génome empaqueté! Et l'ADN est présent dans la cellule qui<br />
produit <strong>de</strong>s phages en forme <strong>de</strong> concatemère et introduit dans le capsi<strong>de</strong> du phage selon le<br />
principe "tête pleine". (Vous verrez plus tard un autre mo<strong>de</strong> d'empaquetage).<br />
Après recombinaison entre <strong>de</strong>ux génomes <strong>de</strong> phages différents, cette redondance crée une<br />
hétérozygotie partielle<br />
5
Cahier 3 : Les mutants RII et la structure fine du gène<br />
Les mutants rII<br />
Benzer a utilisé encore une autre souche d'Escherichia coli:, la souche K, qui portait un autre<br />
phage, le phage lambda (λ): K(λ). Lorsqu'il a infecté cette souche avec du phage T4 rII, le<br />
len<strong>de</strong>main il n a pas vu <strong>de</strong> plaque. Il a répété l'expérience et a observé la même chose.<br />
rI rII rIII<br />
E. coli B + + +<br />
E. coli K(λ) + - +<br />
Le phénotype sur K(λ) permet <strong>de</strong> sélectionner <strong>de</strong> très rares r + résultant d’une recombinaison<br />
(croisement) ou d’une réversion.<br />
Les fréquences :<br />
• Taux <strong>de</strong> mutation r+ vers rII: ~0.3-1 x 10-3<br />
• Taux <strong>de</strong> recombinaison: > 10-6<br />
• Taux <strong>de</strong> réversion <strong>de</strong>s mutants rII:<br />
10-3 à 10-8 (mutants ponctuels)<br />
< 10-10 (délétions; environ 10% <strong>de</strong>s mutants rII spontanés)<br />
• Première définition d’une délétion (perte d’ADN)<br />
attention: certaines délétions peuvent “réverter”<br />
voir plus loin dans le <strong>cours</strong><br />
Maintenant nous allons utiliser la souche K(λ) pour analyser <strong>de</strong>s croisements. Avant et après<br />
un croisement nous allons observer la croissance <strong>de</strong>s phage sur les <strong>de</strong>ux types <strong>de</strong> souches:<br />
Donc seulement les recombinants type<br />
sauvage vont pousser sur K(λ).<br />
Comment isoler <strong>de</strong>s phages sauvages à partir <strong>de</strong> phages rII? Soit par réversion, soit par<br />
recombinaison. La fréquence <strong>de</strong> recombinaison augmente avec la distance entre <strong>de</strong>ux<br />
mutations. Il est donc possible d'établir une carte génétique. Mais attention, la fréquence <strong>de</strong><br />
recombinaison et la distance entre <strong>de</strong>ux mutations n'est pas strictement linéaire! Pour <strong>de</strong>s<br />
marqueurs très éloignés, la fréquence est 50%, donc comme <strong>de</strong>ux marqueur non-liés. Dans<br />
6
certains régions d'un génome, la fréquence <strong>de</strong> recombinaison est plus basse que dans d'autre<br />
régions.<br />
Pour faire une carte génétique, il faut isoler beaucoup <strong>de</strong> mutants! Ensuite nous allons les<br />
croiser entre eux, pour déterminer la fréquence <strong>de</strong> recombinaison<br />
Avec n mutants indépendants, il faut : (n 2 +n)/2 croisements!!! Cela nous fait donc pour 1000<br />
mutants: 500'500 croisements, une tâche impossible!!!<br />
Il faut donc arriver à diviser le génome en plusieurs parties et <strong>de</strong> placer les mutations dans<br />
certaines sections pour éviter <strong>de</strong> croiser tous les mutants entre eux:<br />
En utilisant <strong>de</strong>s délétions il est possible <strong>de</strong> grouper les mutants: chaque délétion représente un<br />
mutant qui ne peut pas recombiner pour donner un type sauvage avec plusieurs autres mutants<br />
qui recombinent entre eux.<br />
Définition d'une délétion en terme génétique:<br />
• ne reverse pas (il y a néanmoins <strong>de</strong>s exceptions)<br />
• ne recombine pas avec aux moins <strong>de</strong>ux mutants qui recombinent entre eux.<br />
Ce qui est en<br />
noir<br />
représente<br />
l’ADN<br />
manquant<br />
dans chaque<br />
délétion!<br />
Del 1241<br />
Gar<strong>de</strong> A1 perd<br />
<strong>de</strong> A2 à B<br />
Del J3 gar<strong>de</strong><br />
A1 et A2, perd<br />
A3 à B<br />
Mutant DAP56<br />
(dans A2)<br />
r +<br />
X<br />
NON<br />
OUI<br />
recombinants<br />
r +<br />
7
Benzer définit 7 segments et 47 sous-segments :<br />
• Les mutants ponctuels qui recombinent entre eux (à une fréquence > taux <strong>de</strong><br />
réversion) définissent <strong>de</strong>s sites distincts<br />
• Les mutants qui ne recombinent pas entre eux sont attribués, provisoirement, au même<br />
site.<br />
• L’ordre <strong>de</strong>s sites dans le sous-segment, et leur distance, ne sont pas déterminés<br />
• La taille d’un segment est arbitrairement définie par le nombre <strong>de</strong> sites i<strong>de</strong>ntifiés<br />
Maintenant la question <strong>de</strong> Monsieur Benzer était:<br />
• Combien <strong>de</strong> particules élémentaires (cela correspondrait à quoi d'après vous?)<br />
• Est-ce que tous les sites sont équivalents? Est-ce que la probabilité <strong>de</strong> mutations est<br />
partout pareille, ou comment est la topographie du gène ?<br />
Voici les mutations qu’il a<br />
analysées :<br />
C.f <strong>cours</strong> pour + <strong>de</strong> détails<br />
Chaque carré représente un mutant<br />
rII d'origine indépendante<br />
Est-ce que ce sont les mêmes<br />
mutants? Est-ce que la fréquence<br />
<strong>de</strong> recombinaison est plus gran<strong>de</strong><br />
que le taux <strong>de</strong> réversion ?<br />
Si on compte les mutants, il y a sur 1612 mutants, 517 mutants à un endroit et 292 mutants à<br />
un <strong>de</strong>uxième endroit. Donc la probabilité n'est pas uniforme. Il a <strong>de</strong>s points chauds, <strong>de</strong>s hot<br />
spots. En regardant la distribution du nombre <strong>de</strong> mutations par site, on s’aperçoit qu’elle suit<br />
une loi <strong>de</strong> poisson ! Donc on peut calculer la probabilité d’avoir un certain nombre <strong>de</strong><br />
mutations par site grâce à cette formule : Pn = (m n e -m ) / n! où m =moyenne.<br />
8
Cahier 4 : Test <strong>de</strong> Complémentation<br />
On cherche combien il y a <strong>de</strong> gènes pour 1 phénotype et si 2 mutants le présentant mutent<br />
pour le même gène. Diffère <strong>de</strong> la recombinaison car donne celle-ci donne une distance et pas<br />
la fonction. La complémentation permet à un organisme avec <strong>de</strong>ux génomes défectifs <strong>de</strong> se<br />
reproduire. On ne peut observer la complémentation que dans le cas <strong>de</strong> mutations récessives<br />
et dans <strong>de</strong>s conditions restrictives.<br />
Si le résultat du test est négatif, il est parfois nécessaire <strong>de</strong> faire un contrôle en cis pour<br />
exclure une toxicité combinée <strong>de</strong>s 2 allèles mutants.<br />
Exemple :<br />
La délétion r1585 couvre à la fois les sites<br />
rIIA et rIIB mais elle est fonctionnellement<br />
rIIA - /rIIB +<br />
Récapitulation: A quoi sert le test <strong>de</strong> complémentation?<br />
• La complémentation nous dit, si <strong>de</strong>ux mutations sont dans le même cistron<br />
• La recombinaison nous donne une distance entre <strong>de</strong>ux mutations. Elles peuvent être<br />
dans le même cistron ou dans <strong>de</strong>ux cistrons.<br />
Elle nous fournit une réponse, combien <strong>de</strong> protéines pour un certain phénotype (nombre<br />
minimal, exacte ou maximal?)<br />
Exception <strong>de</strong> α-complémentation dans LacZ<br />
L'opéron lac: Les mutants lac - ne sont pas capables d'utiliser le lactose. L'opéron consiste en<br />
trois cistrons, Z, Y et A. Si vous prenez une mutation au début <strong>de</strong> lacZ ou une petite délétion,<br />
vous trouverez la complémentation avec <strong>de</strong>s mutations plus distales. On parle <strong>de</strong> la<br />
complémentation intragénique. La complémentation intragénique peut augmenter<br />
artificiellement le nombre <strong>de</strong> gènes d’un locus<br />
Malgré la présence d'une délétion (aci<strong>de</strong>s aminés 12-42) dans le cistron lacZ d'un mutant<br />
(ΔM15) et un mutant qui ne co<strong>de</strong> que pour une petite portion <strong>de</strong> la β-galactosidase (149<br />
aci<strong>de</strong>s aminés sur 1021), la souche est phénotypiquement LacZ + et une activité <strong>de</strong> βgalactosidase<br />
peut être mesurée. Cette complémentation, qu'on appelle aussi la<br />
complémentation α, était à l'origine <strong>de</strong> beaucoup <strong>de</strong> plasmi<strong>de</strong>s utilisés pour le clônage dans la<br />
biologie moléculaire. C.F <strong>cours</strong> 4 dia 9<br />
Une autre exception: Les mutations polaires<br />
Revenons à une mutation dans lacZ. Cette mutation est tout au début du gène LacZ. Malgré le<br />
fait que la mutation soit dans le cistron lacZ, la souche est aussi phénotypiquement lacY - .<br />
9
C'est un effet polaire <strong>de</strong> la mutation lacZ sur les cistrons plus en aval. Dans ce cas, cela<br />
s'explique par une instabilité accrue <strong>de</strong> l'ARNm.<br />
Cahier 5 : Le problème du co<strong>de</strong>, l’origine <strong>de</strong>s mutations et les mutations<br />
spontanées<br />
Le problème du co<strong>de</strong><br />
Il y a quatre bases et 20 aci<strong>de</strong>s aminés standard = 3 bases/a.a. Le co<strong>de</strong> est non chevauchant<br />
Ceci était trouvé avec:<br />
• analyse <strong>de</strong>s séquences connues :> 256 possibilités (max = 400)<br />
• Mutants TMV (ac nitreux): 1 seul aci<strong>de</strong> aminé changé pour chaque mutant<br />
• Mutants globine: 1 seul aci<strong>de</strong> aminé changé<br />
On sait maintenant que le co<strong>de</strong> est constitué <strong>de</strong> groupes <strong>de</strong> trois bases, les codons, lus à partir<br />
d'un point fixe (codons initial AUG).<br />
Mutations du co<strong>de</strong> :<br />
• Revertant vrai: même séquence d’ADN que le wt (« grand-parent »)<br />
• Revertant « presque vrai »: GAG → UAG → CAG<br />
• Pseudorevertant: phénotype wt mais la mutation original est toujours présente (et peut<br />
être isolée par croisement)<br />
• 2ème mutation est un suppresseur intragénique ou extragénique<br />
• Le suppresseur isolé peut avoir un phénotype mutant mais ce n’est pas obligatoire<br />
Les suppresseurs intragéniques:<br />
Comment vous pouvez distinguer entre les <strong>de</strong>ux? Ils sont tous les <strong>de</strong>ux phénotypiquement wt.<br />
Par croisement avec le vrai parent (wt). Dans le cas d'un revertant vrai, vous n'aurez que <strong>de</strong>s<br />
types sauvages. Dans le cas du pseudorevertant, vous pouvez séparer les <strong>de</strong>ux mutations.<br />
Les recombinants rII sont <strong>de</strong> nouveau croisé<br />
avec FC0:<br />
• pas <strong>de</strong> recombinants dans le cas <strong>de</strong> la<br />
mutation FC0 (reisolée !)<br />
10
• recombinaison avec FCO indique donc la présence d'une mutation suppresseur (ici<br />
FC7)<br />
Pour prouver que le co<strong>de</strong> est à 3(n) nucléoti<strong>de</strong>s on fait une étu<strong>de</strong> statistique :<br />
FC0: mutant <strong>de</strong> signe + (arbitraire), Les suppresseurs <strong>de</strong> FC0: mutant <strong>de</strong> signe - (arbitraire)<br />
Les suppresseurs <strong>de</strong>s suppresseurs <strong>de</strong> FC0 mutant <strong>de</strong> signe +<br />
Toutes les combinaisons + + et - - sont rII<br />
La plupart <strong>de</strong>s combinaisons + - sont type sauvage<br />
Des combinaisons +++ et --- sont r+<br />
Si le co<strong>de</strong> est à 3 bases, il n’y a que 2 types <strong>de</strong> mutants <strong>de</strong> cadre <strong>de</strong> lecture (FC0 et FC7).<br />
Si le co<strong>de</strong> est à 6: FC0 est forcément +/- 2 bases, et FC7 -/+ 2 bases, il <strong>de</strong>vrait exister <strong>de</strong>s<br />
mutants <strong>de</strong> cadre (+1, +3 et +5)<br />
Ces mutants ne <strong>de</strong>vraient supprimer aucun mutant + (FC0 et ses petits enfants) ni aucun<br />
mutant - (FC7, FC9… et leurs petits enfants)<br />
Il y a donc évi<strong>de</strong>nce expérimentale en faveur d’un co<strong>de</strong> à 3 : 6 mutants rII dans rIIB1,<br />
indépendants <strong>de</strong> FC0, sont tous les 6 <strong>de</strong> signe + ou <strong>de</strong> signe –<br />
Mutations<br />
Il y a quatre mo<strong>de</strong>s <strong>de</strong> changements du génome:<br />
• Mutations<br />
• Recombinaison<br />
• Réarrangements chromosomiques; cancer <strong>de</strong>s cellules du sang (pourquoi?)<br />
• Transposition (voir <strong>de</strong>uxième partie)<br />
Les délétions<br />
Les mutations ponctuelles<br />
• insertions et délétions <strong>de</strong> 1 à 4 bases: mutations frameshift (qui changent le cadre <strong>de</strong> la<br />
lecture)<br />
• substitutions <strong>de</strong> bases: transitions ou transversions<br />
Les mutations frameshift (changement du cadre <strong>de</strong> lecture) (bégaiement). C'est l’addition ou<br />
la déletion <strong>de</strong> bases. C'est pendant la polymérisation qu'il y erreur.<br />
Exemples:<br />
• Locus rII du phage T4→ Points chauds = répétition <strong>de</strong> A<br />
• Gène APC → mutation silencieuse : GAA ATA AAC et dans la variation GAA AAA<br />
AAC<br />
• Gène LacI → les répétitions CTGG donnent lieu à <strong>de</strong>s insertions (amplification <strong>de</strong><br />
triplets; vers le haut) ou <strong>de</strong>s déletions (vers le bas)<br />
11
Substitutions spontanées <strong>de</strong> bases<br />
La fréquence <strong>de</strong>s erreurs <strong>de</strong> réplication est <strong>de</strong> 10 -7 - 10 -10 /bp/génération. Donc la réplication<br />
est très fidèle et fait peu d'erreurs.<br />
C’est principalement la DNA polymérase a une activité exonucléase 3'->5', qui corrige les<br />
erreurs, parce que l'appariment <strong>de</strong>s bases n'est pas suffisant pour garantir cette fidélité.<br />
T4 DNA polymérase mutation mutateur: peu d'activité d'exonucléase<br />
T4 DNA polymérase mutation antimutateur: beaucoup d'activité d'exonucléase<br />
Les transitions spontanées: mécanismes indépendants <strong>de</strong> la réplication<br />
• Une forme rare <strong>de</strong> la cytosine, l’imino-cytosine, s'associe avec adénine au lieu <strong>de</strong> guanine,<br />
impossible à réparer<br />
• Une forme énol rare <strong>de</strong> la guanine s'associe avec thymine, considérée comme normale par<br />
la poly donc pas réparée<br />
L'analyse du gène lacI a démontré <strong>de</strong>s points chauds <strong>de</strong><br />
transition<br />
Sur 15 sites où il est possible <strong>de</strong> créer <strong>de</strong>s mutations amber<br />
par transition GC->AT, les 4 sites à fréquence élevée sont<br />
<strong>de</strong>s méthyl-C<br />
12
Cahier 6 : Mutagenèse, mutagènes et spectre <strong>de</strong> mutations<br />
Mutagènes<br />
Agents physiques :<br />
• UV -> pyrimidine photodimer, forme <strong>de</strong>s cycle à 4 en ajoutant <strong>de</strong>s liaisons H entre 2<br />
pyrimidine adjacentes = pré-mutations car ont lieu avant réplication.<br />
• X-ray -> cassure <strong>de</strong> l'ADN, réparation fautive<br />
Agents intercalants :<br />
• Le bromure d'ethidium (BET) est utilisé au labo pour visualiser l'ADN sous UV→<br />
PCR<br />
• Profavine : induit <strong>de</strong>s mutations du type FC0<br />
Modifications <strong>de</strong> bases :<br />
• Modification par hydroxylamine<br />
(NH2OH) : transition GC → AT<br />
• Aci<strong>de</strong> nitreux : C <strong>de</strong>vient U par<br />
déamination et donc va s'apparier<br />
avec A; A va <strong>de</strong>venir Hypoxanthine,<br />
qui va s'apparier avec C, et non pas<br />
avec T.<br />
2 transitions : GC ↔ AT<br />
Agents akylants :<br />
• EMS, nitrosoguanidine, nitrosamines<br />
Les mutations induites par l'EMS, ne sont<br />
que <strong>de</strong>s transitions (G->A, A->G)!!<br />
Analogues <strong>de</strong> base :<br />
13
• 5-bromouracil<br />
• 2-aminopurine, protonation <strong>de</strong> 2-AP:<br />
Spectre <strong>de</strong> mutations<br />
Les spectres sont différents selon les mutagènes utilisés et les mutations ne sont pas les<br />
mêmes.<br />
Exemples :<br />
• Mutants <strong>de</strong> LacI :<br />
Les mutations spontanées sont toujours là, mais noyées dans les mutations induites par la<br />
mutagenèse!!<br />
• Mutants <strong>de</strong> rII :<br />
isolats<br />
~1600<br />
~800<br />
2AP: 90 mutants<br />
hot spot<br />
spontané (6A)<br />
sites<br />
251<br />
+53<br />
14
Le spectre <strong>de</strong>s réversions induites par un mutagène peut donner une indication sur la<br />
nature <strong>de</strong> la mutation première:<br />
proflavine 2-AP, 5-BU HA<br />
Ins/<strong>de</strong>l + - -<br />
transversion - - -<br />
transition GC->AT - + +<br />
transition AT-> GC - + -<br />
La réversion <strong>de</strong>s mutations peut être utilisée dans l'analyse <strong>de</strong> mutagènes potentiels:<br />
Test d'AMES<br />
Dans le test <strong>de</strong> Bruce Ames, un extrait <strong>de</strong> foie <strong>de</strong> souris est incubé avec un carcinogène<br />
potentiel et ensuite rajouté à une culture <strong>de</strong> Salmonella auxotrophe pour histidine (his - ),<br />
comprenant <strong>de</strong>s mutants frameshift, <strong>de</strong>s transversions et <strong>de</strong>s transitions. Si le carcinogène<br />
induit <strong>de</strong>s mutations, il est possible <strong>de</strong> trouver une fréquence plus élevée <strong>de</strong> réversion his - -><br />
his + . Cela permet <strong>de</strong> voir si un pro-mutagène est métabolisé en agent mutagène.<br />
Mutagène<br />
sur un disque <strong>de</strong><br />
papier buvard<br />
Gradient <strong>de</strong> concentration<br />
du mutagène (diffusion):<br />
-trop près du disque, dose léthale<br />
-trop loin du disque, dose inefficace<br />
Sans mutagène:<br />
revertants spontanés<br />
15
Les mutants non-sens et les ARNt suppresseur<br />
Mutants non-sens<br />
La séquence est lue par groupes <strong>de</strong> 3 bases à partir d’un point fixe (codon start),le co<strong>de</strong><br />
génétique n’est pas entièrement dégénéré,les codons stop ne spécifient pas d’aci<strong>de</strong> aminé et<br />
provoquent la terminaison <strong>de</strong> la traduction<br />
Il en existe 3 : co<strong>de</strong> standard: UAG (ambre), UAA (ochre) et UGA (opal)<br />
Evi<strong>de</strong>nces génétiques <strong>de</strong>s codons stop (non sens) :<br />
Il existe <strong>de</strong>s mutations réversibles pour 2-<br />
AP dans rIIB1, une région non-essentielle<br />
où on n'attend pas <strong>de</strong> mutations faux sens.<br />
Utilisation <strong>de</strong> mutations dans rIIA et la<br />
déletion D1589 (qui ne fait pas <strong>de</strong> rIIA<br />
fonctionnel)<br />
L'utilisation <strong>de</strong>s différentes souches E. coli<br />
K(λ) a permis d'étudier les mutants rII<br />
portant un codon stop:<br />
rII rII ambre rII <strong>de</strong>l,fs<br />
K(λ) + - -<br />
K(λ) suam + + -<br />
B + - +<br />
Dans les souches suam, le codon non-sens<br />
co<strong>de</strong> pour un aci<strong>de</strong> aminé<br />
Différents suppresseurs <strong>de</strong> codons nonsens<br />
insèrent différents aci<strong>de</strong>s aminés:<br />
suam: suI = sérine, suII = glutamine, suIII = tyrosine, etc…<br />
suoc: suD= sérine, suE = glutamine, etc...<br />
Donc, les mutants rII ne poussent pas sur K(λ), comme prévu. Mais dans certaines souches<br />
K(λ) il y a croissance <strong>de</strong> l'un ou l'autre phage rII. Ce sont <strong>de</strong>s mutants ambivalents. Ce sont<br />
<strong>de</strong>s souches suppresseurs.<br />
Illustration :Les codons liés au codon ambre (UAG)<br />
Protéines produites dans <strong>de</strong>s souches suam<br />
Protéines codées par <strong>de</strong>s révertants <strong>de</strong> mutants ambre<br />
Selon les schémas ci-<strong>de</strong>ssous, sur tous les 20 aa, il n'y a que 7 (8 codons) qui peuvent donner<br />
un codon UAG par une substitution <strong>de</strong> base<br />
Les différentes transitions possibles autour d'un codon stop. Les différentes transversions<br />
possibles autour d'un codon stop.<br />
16<br />
mutants rIIA<br />
révertibles par<br />
2AP<br />
combinés avec<br />
r1589
La suppression <strong>de</strong>s codons stop par <strong>de</strong>s ARNt mutés<br />
Le co<strong>de</strong> génétique est déterminé par le génome <strong>de</strong> l’organisme: tRNAs, aminoacyl-tRNA<br />
synthases, facteurs <strong>de</strong> terminaison…<br />
Le co<strong>de</strong> peut être modifié par:<br />
• suppresseurs <strong>de</strong> non-sens: suam, suoc, suop<br />
• mutateurs: tRNA modifiés proquant <strong>de</strong>s faux-sens (révélés par leur effet sur mutD)<br />
• su + : suppresseur extragénique supprimant une classe <strong>de</strong> mutants, aussi bien dans rII<br />
que dans phoA ou lacZ.<br />
• tRNA muté dans l’anticodon lit un codon non-sens<br />
Illustration du wobble :<br />
Codon stop<br />
UAG<br />
Souche wt (su0) Souche suam<br />
tRNAtyr mineur<br />
anticodon AUG5’<br />
codons 5’UAU<br />
UAC<br />
L'utilisation <strong>de</strong> mutagènes pour induire les revertants a aidé à déterminer la séquence<br />
<strong>de</strong>s codons stops:<br />
• Hydroxylamine, n'a pas d'effet sur la reversion:<br />
rIIambre --> r +<br />
rIIochre --> r +<br />
Donc, il n'y a pas <strong>de</strong> G/C!! Ou, les G/C sont liés à d'autre codons stop par une transition<br />
• Mutants d'une souche rIIochre isolés sur K(λ) su + am<br />
Mutation<br />
<strong>de</strong> l’anticodon<br />
AUC5’<br />
17
La réversion et la pseudoreversion en rIIam sont induit par 2-AP, mais la fréquence reste la<br />
même après un traitement Hydroxylamine. Donc une transition suffit. Donc:<br />
les codons amber et ochre ont <strong>de</strong>ux bases i<strong>de</strong>ntiques<br />
le codon amber a un G/C<br />
le codon ochre a un A/U<br />
• Mutagenèse HA induit rIIoc et rIIam: il y a donc au moins un A ou au moins un U!!<br />
• le gène r + est nécessaire avant la réplication car les effets sont différents sur le brin m<br />
et le brin c<br />
==>> donc il y a un U et un A dans un codon amber!!<br />
amber => U et A et (G ou C)<br />
ochre => U et A et (A ou U)<br />
on sait aujourd'hui que:<br />
N97 : UGG -> UAG<br />
EM84: CAG -> UAG<br />
18
Cahier 8 : Le développement <strong>de</strong>s phages T4, T7 et λ ; le test <strong>de</strong> fluctuation<br />
Développement <strong>de</strong>s phages<br />
T4 :<br />
• Premier organisme où tous les gènes essentiels sont i<strong>de</strong>ntifiés (1961)<br />
• Type sauvage pousse à 30° et 42°, sur <strong>de</strong>s souches su0 et su+am<br />
• Mutagenèse, collection <strong>de</strong> mutants ts et am, les am ne poussent que sur une souche<br />
su + am, les ts ne poussent qu’à 30°<br />
• Classer les mutants par gène (complémentation)<br />
• Localiser les mutants sur la carte<br />
• Etu<strong>de</strong>s fonctionnelles: génétique du développement<br />
Les étu<strong>de</strong>s fonctionnelles se fon<strong>de</strong>nt sur:<br />
• synthèse <strong>de</strong> l'ADN: dna + , dna -<br />
• synthèse d'antigènes <strong>de</strong> fibres<br />
• particules <strong>de</strong> phages en microscopie électronique => têtes, queues, particules entières<br />
Il est donc possible <strong>de</strong> classer les mutations et <strong>de</strong> leurs accor<strong>de</strong>r une "fonction", et à l'ai<strong>de</strong> <strong>de</strong><br />
tests quantitatifs <strong>de</strong> recombinaison <strong>de</strong> les placer sur la carte génétique :<br />
am ADN Ag Tête Queue Virion<br />
43 no no no no no<br />
33 + no no no no<br />
23 + + no + no<br />
19 + + + no no<br />
34am<br />
34ts<br />
+<br />
+<br />
no<br />
+<br />
Carte <strong>de</strong> T4 :<br />
(+)<br />
(+)<br />
(+)<br />
(+)<br />
+<br />
+<br />
-Gènes précoces, nécessaires pour la réplication<br />
-Sans réplication (gp43 = DNA polymérase), pas d’expression<br />
<strong>de</strong>s gènes tardifs<br />
-Un gène régulateur au moins (nouveau σ et<br />
coactivateurs dont gp33)<br />
-Synthèse et assemblage indépendant <strong>de</strong>s structures<br />
La morphogenèse du phage T4: Si la synthèse <strong>de</strong>s différentes composantes est<br />
indépendante, on <strong>de</strong>vait donc pouvoir assembler <strong>de</strong>s phages dans un tube à essai? On isole <strong>de</strong>s<br />
particules sans fibres (infection dans <strong>de</strong>s conditions non-permissives avec un mutant 34am), et<br />
un lysat contenant <strong>de</strong>s fibres (mutant 23 - )<br />
19
Assemblage in vitro:<br />
Phage T7 :<br />
Dégradation <strong>de</strong> l’ADN cellulaire nouvelle RNA polymérase. Contrairement à la polymérase<br />
<strong>de</strong> la bactérie, cette polymérase à ARN est résistante à l'antibiotique rifampicin.<br />
Et en synthèse <strong>de</strong> protéines cela se présente ainsi:<br />
Phage λ :<br />
Le phage λ n'utilise pas une autre polymérase à ARN, mais change le processus <strong>de</strong><br />
terminaison <strong>de</strong> la transcription en produisant <strong>de</strong>s protéines anti-terminateurs, N et Q. Le<br />
mo<strong>de</strong> d'action <strong>de</strong> N implique une liaison <strong>de</strong> l'ARN et ressemble à celui <strong>de</strong> la protéine TAT du<br />
virus HIV.<br />
20
Le test <strong>de</strong> fluctuation<br />
Quand on voit apparaître <strong>de</strong>s mutants sur un milieu sélectif, il faut se poser la question si les<br />
mutations sont induites par la sélection (présence <strong>de</strong> phage, absence d'aci<strong>de</strong> aminé, présence<br />
d'un antibiotique) ou si c'est <strong>de</strong>s changement du matériel génétique qui se produisent<br />
spontanément en <strong>cours</strong> <strong>de</strong> temps au hasard et indépendamment <strong>de</strong> l'agent sélectif. Pour<br />
distinguer entre les <strong>de</strong>ux, Salvador Luria et Max Delbrück ont développé le test <strong>de</strong><br />
fluctuation (variation).<br />
Pour cela nous étalons <strong>de</strong>s bactéries sur <strong>de</strong>s boîtes contenant un excès <strong>de</strong> phages T1. Nous<br />
allons voir la fréquence <strong>de</strong>s résistants (Ton R ).<br />
Si c'est une adaptation, nous attendons quelques cellules qui vont s'adapter (<strong>de</strong>venir résistant<br />
au phage T1) et donner lieu à <strong>de</strong>s colonies:<br />
Si c'est un événement spontané, nous attendons ceci:<br />
On va comparer le résultat <strong>de</strong> cette expérience avec une culture que vous avez partagé en 20<br />
avant d'étaler. Vous verrez moins <strong>de</strong> variation. Le test <strong>de</strong> fluctuation est une comparaison <strong>de</strong><br />
la variance et <strong>de</strong> la moyenne dans un échantillon <strong>de</strong> n cultures:<br />
Taux <strong>de</strong> mutation = probabilité <strong>de</strong><br />
mutation/réplication, déterminé à partir <strong>de</strong>s cultures<br />
sans mutant (classe P0)<br />
Fréquence <strong>de</strong> mutants = nb <strong>de</strong> mutants /nb total <strong>de</strong><br />
cellules, déterminé avec <strong>de</strong>s cultures contenant bcp <strong>de</strong><br />
mutants<br />
La fréquence augmente à chaque génération<br />
21
Fréquences <strong>de</strong> mutants :<br />
• Fréquence mesure les mutations, qui donnent naissance à <strong>de</strong>s mutants, ET les<br />
<strong>de</strong>scendants <strong>de</strong> ces mutants<br />
• Pour simplifier, assumons une population synchronisée<br />
• Les wt et les mutants se divisent à la même vitesse<br />
• On part d’un inoculum petit, sans mutant<br />
• Le taux <strong>de</strong> réversion est égal ou < que le taux <strong>de</strong> mutation<br />
Nouveaux mutants apparaissent à génération g : ∆mg = a x Ng / 2<br />
(nouvelles mutations) nb <strong>de</strong> divisions pour avoir N cellules = N /2<br />
Nouveaux mutants à génération précé<strong>de</strong>nte (g-1): ∆mg-1 = a x Ng / 4<br />
= ∆mg / 2<br />
Nb total <strong>de</strong> mutations à génération g :<br />
Σ ∆m = ∆mg+ Dmg/2 + ∆mg/4 + ∆mg/8….. ~2 ∆mg = a x Ng<br />
Nb total <strong>de</strong> mutants: ∆mg + ∆mg + ∆mg + ∆mg ….. = g x a x N/2<br />
Plus tard, en 1952, Joshua et Esther Le<strong>de</strong>rberg ont confirmé cette hypothèse par la métho<strong>de</strong><br />
<strong>de</strong> "replica plating". Ils ont étalé <strong>de</strong>s bactéries sur un milieu non-sélectif et ensuite répliqué les<br />
colonies sur milieu sélectif. Comme attendu pour <strong>de</strong>s mutations spontanées, on a pu ainsi<br />
isoler <strong>de</strong>s mutants qui n'avaient jamais vu l'agent sélectif.<br />
Le réétalement <strong>de</strong> Newcombe pour montrer que les<br />
mutations préexistent la sélection: Plus la culture pousse,<br />
plus la taille <strong>de</strong>s clones mutants augmente et plus il y a<br />
<strong>de</strong>s clones mutants provenant d'événements mutationnels<br />
indépendants.<br />
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