UNIVERSITE DE PICARDIE JULES VERNE THESE ... - iramis - CEA
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<strong>UNIVERSITE</strong> <strong>DE</strong> <strong>PICARDIE</strong> <strong>JULES</strong> <strong>VERNE</strong><br />
Faculté des Sciences d’Amiens<br />
Laboratoire des Glucides<br />
<strong>THESE</strong> <strong>DE</strong> DOCTORAT<br />
Présentée par<br />
Stéphane MOUTARD<br />
Pour obtenir le grade de<br />
DOCTEUR<br />
De l’Université de Picardie Jules Verne<br />
RELATION ENTRE LA STRUCTURE<br />
ET LES PROPRIÉTÉS D’ORGANISATION<br />
<strong>DE</strong> NOUVELLES CYCLO<strong>DE</strong>XTRINES AMPHIPHILES.<br />
Commission d’examen :<br />
P r . A. MARSURA Rapporteur Université Nancy 1<br />
P r . D. PLUSQUELLEC Rapporteur ENSCR<br />
D r . W. LUTEN Technologie SERVIER<br />
P r . G. <strong>DE</strong>MAILLY UPJV<br />
D r . P. GOD UPJV<br />
P r . E. MONFLIER Membre invité Université D’Artois<br />
P r . F. DJEDAÏNI-PILARD Directeur de Thèse UPJV<br />
D r . B. PERLY Responsable <strong>CEA</strong> <strong>CEA</strong> Saclay
A mes parents<br />
Amasÿur<br />
ALaure
REMERCIEMENTS<br />
Ce travail a été effectué au Commissariat à l’Energie Atomique, dans le cadre d’un contrat<br />
CFR. Je remercie Monsieur Jean-Claude PETIT, Chef du Service de Chimie Moléculaire<br />
(DRECAM / DSM, <strong>CEA</strong> Saclay) de m’avoir accueilli au sein de ce service et de m’avoir<br />
permis de profiter d’excellentes conditions de travail.<br />
Cette thèse a été réalisée sous la direction de Madame Florence DJEDAÏNI-PILARD,<br />
Directrice du Laboratoire des Glucides à l’Université de Picardie Jules Verne (UPJV). Je<br />
tiens à lui exprimer ma profonde reconnaissance pour la confiance et l’amitié qu’elle m’a<br />
toujours témoignées. Ce travail n’aurait pas pu être ce qu’il est sans sa compétence, son<br />
soutien scientifique et sa disponibilité. Qu’elle soit ici assurée de ma profonde amitié.<br />
Je suis également infiniment reconnaissant à Monsieur Bruno PERLY, responsable du<br />
Laboratoire de Chimie Bio-Organique des Molécules Cages, de m’avoir accueilli dans son<br />
laboratoire et de m’avoir encadré tout au long de ce travail auquel je tiens à l’associer. A<br />
travers nos nombreuses discussions scientifiques, il m’a fait partager ses grandes<br />
connaissances et son enthousiasme pour la recherche. Je le remercie pour son amitié, son<br />
aide et sa disponibilité. Qu’il soit également assuré de ma profonde amitié.<br />
Monsieur Alain MARSURA, Professeur à l’Université Henry Poincaré (Nancy I) et Monsieur<br />
Daniel PLUSQUELLEC, Directeur de l’Ecole Nationale Supérieure de Chimie de Rennes,<br />
ont accepté d’être les rapporteurs scientifiques de ce travail. Qu’ils en soient vivement<br />
remerciés.<br />
Je remercie sincèrement Monsieur Gilles <strong>DE</strong>MAILLY, Président de l’UPJV pour l’honneur<br />
qu’il m’a fait en acceptant de présider le jury de cette thèse.<br />
Je remercie également Messieurs Wim LUIJTEN, Responsable du Département d’Analyse<br />
Structurale à Technologie SERVIER, Eric MONFLIER, Professeur à l’Université d’Artois, et<br />
Paul GO<strong>DE</strong>, Maître de Conférence à l’UPJV, pour avoir accepté de faire partie de la<br />
Commission d’Examen.<br />
Je tiens à remercier tout particulièrement mes deux compagnons de route, Monsieur Jean-<br />
Pierre DALBIEZ et Mademoiselle Sandrine WEISSE. Leur amitié, leur soutien<br />
inconditionnel, et leur bonne humeur permanente ont été pour moi une source de motivation<br />
permanente. Chaque jour passé en leur compagnie fut un réel plaisir. Merci Jean-Pierre, Ô<br />
grand Purificateur, d’avoir mis tes compétences chromatographiques à mon service.
Merci à Madame Cécile BAUDIN, Monsieur Christophe FAJOLLES et Monsieur Laurent<br />
MAUCLAIRE qui m’ont accompagnés durant toutes ces années et ont rendu mon séjour<br />
agréable au sein du laboratoire.<br />
Ce travail est le fruit d’une collaboration interdisciplinaire entre de nombreuses équipes qui<br />
ont contribuées de manière importante aux résultats obtenus. Un grand merci à :<br />
Madame Sophie MEUDAL et Monsieur Serge PILARD pour la spectrométrie de masse.<br />
Monsieur Paul GO<strong>DE</strong> pour les mesures de tension de surface.<br />
Monsieur Sylvain <strong>DE</strong>SERT pour la diffusion de la lumière.<br />
Mademoiselle Caroline SULTANEM et Monsieur Jean-Jacques BENATTAR pour les études<br />
de films noirs par rayons X.<br />
Monsieur Sébastien TILLOY et Monsieur Eric MONFLIER pour les études de passage à<br />
travers la Barrière Hémato-Encéphalique.<br />
Madame Marie-Claire NEVERS et Monsieur Christophe CREMINON pour les dosages<br />
immuno-enzymatiques.<br />
Monsieur Michel ROUX, alias “Aldo”, pour les études par RMN du deutérium.<br />
La RMN a été réalisée au Laboratoire Commun de RMN. Je remercie sincèrement Messieurs<br />
Patrick BERTHAULT, Hervé <strong>DE</strong>SVAUX, Gaspar HUBERT et Dominique LE PARC pour<br />
leurs nombreux conseils techniques toujours judicieux, leur disponibilité et leur gentillesse.<br />
Merci à Hélène MOREL, Stéphanie PEDINIELLI et Nathalie THROMAT pour leur<br />
gentillesse et pour leur efficacité à régler tous mes problèmes administratifs.<br />
Merci à Christophe, Rachel, Frédéric, Muriel, Florie, Paco, Séverine, Quitterie, Dorothée,<br />
Philippe, Sophie, Alexandre, Delphine O., Delphine F., Souleymane, Lauriane, Fabienne,<br />
Gwénaëlle et tous les autres stagiaires que j’ai eu la chance de côtoyer plus ou moins<br />
longtemps. Leur sympathie et leur bonne humeur ont apporté un rayon de soleil dans le<br />
Laboratoire. Mention spéciale à Christophe et Sandrine pour nos soirées inoubliables.<br />
Enfin, un très grand merci à ma famille et à mes amis pour m’avoir apporté un soutien sans<br />
faille. Merci à Laure d’avoir toujours été à mes côtés, même dans les moments difficiles, et<br />
d’avoir supporté ma mauvaise humeur.
TABLE <strong>DE</strong>S MATIERES<br />
Liste des abréviations V<br />
INTRODUCTION GENERALE 1<br />
PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE 5<br />
1 ère Partie : PRESENTATION GENERALE <strong>DE</strong>S CYCLO<strong>DE</strong>XTRINES 6<br />
I. Historique 6<br />
II. Caractéristiques structurales et physico-chimiques 7<br />
III. Complexes d’inclusion 10<br />
IV. Applications actuelles et futures 12<br />
2 ème Partie : MODIFICATION SELECTIVE <strong>DE</strong>S CYCLO<strong>DE</strong>XTRINES 14<br />
I. Introduction 14<br />
I.1. Les facteurs qui influencent la sélectivité 15<br />
I.2. Les problèmes liés à la structure de la CD 16<br />
I.3. Les CDs modifiées : présentation générale 18<br />
II. Les persubstitutions 19<br />
II.1. Persubstitution par voie directe 19<br />
II.2. Méthode longue : utilisation de groupements de protection 24<br />
III. Les monosubstitutions 27<br />
III.1. Monosubstitution d’un des hydroxyles en position 6 27<br />
III.2. Monosubstitution de la face secondaire 30<br />
IV. Polysubstitutions 33<br />
IV.1. Disubstitution 33<br />
IV.2. Polysubstitution d’ordre supérieure à 2 34<br />
V. Conclusion 35<br />
I
3 ème Partie : LES CYCLO<strong>DE</strong>XTRINES AMPHIPHILES 36<br />
I. Présentation des cyclodextrines amphiphiles 36<br />
II. Relation entre structure et propriétés physico-chimiques des<br />
cyclodextrines amphiphiles 46<br />
II.1. Influence du degré de substitution 46<br />
II.2. Influence de la nature du substituant 46<br />
II.3. Influence de la nature de la CD 47<br />
II.4. Conclusion 47<br />
RESULTATS ET DISCUSSION 48<br />
1 ère Partie : LES PHOSPHOLIPIDYL-CYCLO<strong>DE</strong>XTRINES 49<br />
I. Introduction 49<br />
II. Synthèse des phospholipidyl-cyclodextrines 50<br />
II.1. Stratégie de synthèse 50<br />
II.2. Synthèse des dérivés CD-espaceur 54<br />
II.3. Etape de couplage entre CD-espaceur et DMPE 57<br />
III. Caractérisation structurale des phospholipidyl-cyclodextrines 65<br />
III.1. Analyse structurale des composés par RMN haut champ 65<br />
III.2. Identification exacte des produits grâce à la spectrométrie de masse<br />
basse et haute résolution 77<br />
III.3. Conclusion 81<br />
IV. Propriétés d’organisation en milieu aqueux des phospholipidylcyclodextrines<br />
méthylées 82<br />
IV.1. Etude RMN 1 H dans l’eau 82<br />
IV.2. Détermination de la CMC par mesures de tension de surface 84<br />
IV.3. Caractérisation des systèmes organisés par diffusion de la lumière 88<br />
IV.4. Conclusion 97<br />
V. Propriétés d’inclusion des phospholipidyl-CDs 98<br />
V.1. Etude par RMN des complexes d’inclusion dans les cyclodextrines 98<br />
V.2. Résultats et discussion 106<br />
V.3. Conclusion 115<br />
II
VI. Comportement des phospholipidyl-cyclodextrines méthylées<br />
dans des systèmes de type membranaire 116<br />
VI.1. Les films noirs : modèle de membrane inversée de phospholipidylcyclodextrines<br />
116<br />
VI.2. Systèmes mixtes DMPC / TRIMEB-Succ-DMPE 14 : mise en évidence<br />
des propriétés détergentes des phospholipidyl-CDs 128<br />
VI.3. Conclusion 136<br />
VII. Etude in vitro des propriétés de passage des phospholipidylcyclodextrines<br />
à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE) 137<br />
VII.1. Introduction 137<br />
VII.2. Etude du passage à travers la BHE 139<br />
VII.3. Résultats et discussion 140<br />
VII.4. Conclusion 145<br />
VIII. Conclusion de la 1 ère partie 147<br />
2 ème PARTIE : LES PEPTIDOLIPIDYL-CYCLO<strong>DE</strong>XTRINES 148<br />
I. Introduction 148<br />
II. Synthèse et caractérisation structurale des peptidolipidylcyclodextrines<br />
149<br />
II.1. Stratégie de synthèse 149<br />
II.2. Préparation des synthons 155<br />
II.3. Couplage avec les cyclodextrines 159<br />
II.4. Caractérisation des peptidolipidyl-cyclodextrines 161<br />
II.5. Conclusion 165<br />
III. Propriétés d’organisation des peptidolipidyl-cyclodextrines 166<br />
III.1. Propriétés d’auto-organisation dans l’eau : mesures de CMC 166<br />
III.2. Insertion des peptidolipidyl-CDs dans des membranes lipidiques<br />
modèles de DMPC : étude par RMN 2 H 167<br />
IV. Conclusion de la 2 ème partie 173<br />
CONCLUSION GENERALE 174<br />
III
PARTIE EXPERIMENTALE 179<br />
I. Matériels et méthodes 180<br />
II. Synthèses 187<br />
ANNEXES 229<br />
Annexe 1 : Liste de spécialités pharmaceutiques commercialisées<br />
contenant des cyclodextrines 230<br />
Annexe 2 : Détermination de la stoechiométrie d’un complexe soluble<br />
CD / “molécule invitée” par la méthode des variations<br />
continues ou méthode de JOB 233<br />
Annexe 3 : Détermination de la constante d’association d’un complexe<br />
1:1 par la méthode de BENESI-HIL<strong>DE</strong>BRAND 235<br />
Annexe 4 : Dosages immunoenzymatiques 237<br />
Annexe 5 : Principe de la RMN du deutérium 250<br />
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 254<br />
IV
LISTE <strong>DE</strong>S ABREVIATIONS<br />
ADC : Anisotropie de Déplacement Chimique<br />
BAM : Brewster Angle Microscopy<br />
BHL : Balance Hydrophile - Lipophile<br />
CCM : Chromatographie sur Couche Mince<br />
CD(s) : Cyclodextrine(s)<br />
CID : Collision Induced Dissociation<br />
CMC : Concentration Micellaire Critique<br />
CPG : Chromatographie en Phase Gazeuse<br />
COSY : COrrelation SpectroscopY<br />
<strong>DE</strong>DL : Détecteur Evaporatif à Diffusion de Lumière<br />
<strong>DE</strong>PT : Distorsionless Enhancement by Polarisation Transfert<br />
DIBAL : Diisobutylaluminium (hydrure de)<br />
DIC : N,N’-diisopropylcarbodiimide<br />
DIMEB : 2,6-di-O-méthyl--cyclodextrine<br />
DLS : Dynamic Light Scattering<br />
DMAP : 4-(diméthylamino)pyridine<br />
DMF : N,N’-diméthylformamide<br />
DMPC : 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine<br />
(ou 1,2-ditétradecanoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine)<br />
DMPE : 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidyléthanolamine<br />
(ou 1,2-ditétradecanoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine)<br />
DMSO : Dimétylsulfoxyde<br />
dp : degré de polymérisation<br />
ESI : Electrospray Ionisation<br />
FAB : Fast Atom Bombardment<br />
FMOC: 9-fluorenylméthoxycarbonyle<br />
HMBC : Heteronuclear Multiple Bound Correlation<br />
HMQC : Heteronuclear Multiple Quantum Correlation<br />
HOBT : N-hydroxybenzotriazole<br />
HPLC : High Performance Liquid Chromatography<br />
HRMS : High Resolution Mass Spectrometry<br />
IRTF : Infra-Rouge à Transformée de Fourrier<br />
LB : Langmuir-Blodgett<br />
MALDI : Mass spectrometry with laser desorption and ionisation<br />
MLV : Mutilamellar Large Vesicle (liposome)<br />
MS / MS : Spectrométrie de masse en tandem<br />
NHS : N-hydroxysuccinimide<br />
POPC: 1-palmitoléyl-2-oléoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine<br />
NOESY : Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY<br />
QELS : Quasi-Elastic Light Scattering<br />
RMN : Résonance Magnétique Nucléaire<br />
ROESY : Rotating frame Overhauser Effect SpectroscopY<br />
RX : Rayons X<br />
SE : Substitution Electrophile<br />
SLS : Static Light Scattering<br />
SUV : Small Unilamellar Vesicle<br />
TA : Température Ambiante<br />
TBDMS : tert-butyldiméthylsilyle<br />
TEM : Transmission Electronic Microscopy<br />
TMS : Triméthylsilyle<br />
TOCSY: TOtal Correlation SpectroscopY<br />
TOF : Time Of Flight<br />
TRIMEB : 2,3,6-tri-O-méthyl--cyclodextrine<br />
TsCl : Chlorure de p-toluènesulfonyle<br />
UV : Ultraviolet<br />
V
L’administration des médicaments dans l’organisme est effectuée le plus souvent soit par voie<br />
orale, soit par voie parentérale.<br />
Dans le cas d’une administration par voie orale, une perte plus ou moins significative de<br />
l’activité du principe actif est fréquemment observée. En fait, ceci est dû soit à une destruction<br />
partielle du principe actif à travers l’appareil gastro-intestinal, soit à une absorption partielle<br />
car la fenêtre d’absorption est trop étroite.<br />
Dans le cas d’une administration par voie parentérale, le médicament est directement ou<br />
indirectement délivré dans le système sanguin, d’où il peut atteindre son site d’activité.<br />
L’inconvénient de cette méthode réside dans le fait que le principe actif va également<br />
imprégner d’autres organes ou tissus, et provoquer des effets secondaires indésirables,<br />
particulièrement toxiques dans le cas de médicaments tels que des produits antimitotiques. De<br />
tels effets peuvent également être observés par voie orale.<br />
Depuis ces vingt ou trente dernières années, une nouvelle technologie est apparue, qui<br />
consiste à vectoriser les médicaments vers leur site d’absorption, ou encore mieux, vers leur<br />
site d’activité. Dans cette optique, de nouveaux systèmes destinés à la délivrance des<br />
principes actifs ont été mis au point : les liposomes, les nano et microparticules,…<br />
Un des problèmes principaux rencontré avec ces systèmes vésiculaires apparaît durant leur<br />
préparation, et résulte de la faible solubilité dans l’eau des principes actifs, conduisant soit à<br />
un mauvais rendement de chargement, soit à un relargage faible et incomplet du principe actif<br />
dans ces systèmes.<br />
Pour surmonter ces inconvénients, plusieurs auteurs ont proposé l’utilisation des<br />
cyclodextrines (CDs). En effet, les CDs naturelles et modifiées ont la très grande propriété de<br />
solubiliser les principes actifs hydrophobes. Toutefois, au contraire des systèmes vésiculaires,<br />
leur surface externe hydrophile ne leur permet pas d’entrer intimement en contact avec les<br />
membranes biologiques.<br />
Depuis plusieurs années, une attention spéciale a donc été portée sur la synthèse de<br />
cyclodextrines amphiphiles dans le but de les utiliser comme de nouveaux composés pour la<br />
préparation de nouveaux matériaux supramoléculaires (nanoparticules par exemple) ou pour<br />
les insérer dans des membranes phospholipidiques préformées telles que des liposomes. Dans<br />
les deux cas, le principal objectif est de combiner la spécificité de taille de la cavité des CDs<br />
pour des molécules invitées hydrophobes aux propriétés de transport de structures lipidiques<br />
organisées.<br />
2
La littérature traitant de la synthèse de dérivés amphiphiles de cyclodextrines met en lumière<br />
les propriétés de tels composés. Des CDs amphiphiles portant de multiples chaînes<br />
hydrophobes sur la face primaire, sur la face secondaire ou sur les deux faces ont été<br />
largement étudiées. Une autre classe de CDs amphiphiles a été préparée en greffant un seul<br />
groupement hydrophobe (chaîne aliphatique ou stéroïde) sur la face primaire des macrocycles.<br />
Les dérivés polysubstitués forment des systèmes organisés insolubles dans l’eau tels que des<br />
couches de Langmuir-Blodgett. Certains sont utilisés dans la préparation de nanoparticules ou<br />
insérés dans des matrices phospholipidiques préformées. Généralement, les cavités des CDs<br />
ne sont pas accessibles à cause du grand nombre de substituants greffés sur la CD. Les<br />
propriétés des dérivés monosubstitués dépendent fortement de la nature de l’adduit, et de<br />
l’effet de méthylation de la partie CD. Ainsi, les propriétés des cholestéryl-CDs ont été<br />
étudiées en détail, en l’absence et en présence d’une matrice phospholipidique modèle, par<br />
RMN ( 1 H, 2 H, 31 P) et par des techniques de diffusion (diffusion de la lumière, de rayons X, de<br />
neutrons). Il a été montré que ces molécules pouvaient soit s’auto-organiser en micelles, soit<br />
former des films en bicouches mixtes avec les phospholipides, ou bien encore s’insérer dans<br />
les membranes pour former des liposomes mixtes, en fonction des modulations structurales de<br />
la molécule. Il a également été prouvé que la cavité des CDs conservait sa capacité<br />
d’inclusion dans les systèmes organisés. De petites modifications de la structure (présence ou<br />
absence de bras espaceur, taille de la CD, méthylation ou non des groupements hydroxyles)<br />
influencent énormément les propriétés d’organisation. Cet aspect sera développé dans la<br />
partie bibliographique.<br />
La première partie de nos travaux portera sur la synthèse d’une nouvelle famille de<br />
cyclodextrines amphiphiles. Dans cette approche, le stéroïde sera remplacé par un<br />
phospholipide (la 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidyléthanolamine, DMPE) afin de<br />
mimer au plus près les membranes naturelles. Le premier objectif de cette étude consistera à<br />
synthétiser une série raisonnée de glycolipides, nommés phospholipidyl-cyclodextrines, en<br />
greffant la DMPE sur une cyclodextrine dont nous ferons varier le degré de méthylation. La<br />
structure de ces molécules sera entièrement caractérisée par RMN haut champ et par<br />
spectrométrie de masse haute résolution.<br />
Le comportement de ces composés en milieu aqueux sera étudié par différentes techniques<br />
physico-chimiques complémentaires. Les phénomènes d’auto-association des phospholipidyl-<br />
CDs dans l’eau seront mis en évidence par RMN 1 H et par des mesures de tension de surface.<br />
3
Des expériences de diffusion dynamique et statique de la lumière nous renseigneront sur la<br />
forme et la taille de ces assemblages supramoléculaires.<br />
La capacité des cavités macrocycliques des phospholipidyl-CDs à inclure une molécule<br />
invitée modèle (le 4-tertbutylbenzoate de sodium) dans les systèmes organisés dans l’eau,<br />
sera démontrée par des expériences de RMN 1 H.<br />
Nous regarderons par la suite les remarquables propriétés des phospholipidyl-cyclodextrines à<br />
former des bicouches lipidiques grâce à la formation de films noirs, en collaboration avec le<br />
D r J.-J. Benattar du Service de Physique de l’Etat Condensé (DSM / DRECAM, <strong>CEA</strong> Saclay).<br />
La structure de ces films sera étudiée par réflectivité de rayons X aux incidences rasantes.<br />
Leurs propriétés détergentes vis-à-vis de membranes phospholipidiques modèles (liposomes<br />
de DMPC) seront évaluées par RMN du phosphore-31.<br />
Pour mettre en application les propriétés des phospholipidyl-CDs, nous testerons leur capacité<br />
à traverser la barrière hémato-encéphalique à partir d’un modèle in-vitro. Le suivi du passage<br />
sera réalisé grâce à des méthodes de dosages immuno-enzymatiques. Cette étude sera réalisée<br />
en collaboration avec le Laboratoire Mixte Institut Pasteur-Université d’Artois (Faculté Jean<br />
Perrin, LENS) dirigé par le P r E. Monflier et le Laboratoire du D r Créminon, du Service de<br />
Pharmacologie et d’Immunologie (DRM / DSV, <strong>CEA</strong> Saclay).<br />
Dans une deuxième partie, nous traiterons de la synthèse d’une nouvelle famille de CDs<br />
amphiphiles, conçues de façon à mimer les principales caractéristiques structurales des<br />
phospholipidyl-CDs, tout en s’affranchissant des problèmes de stabilité chimique de ces<br />
dernières. Ces glycopeptidolipides, nommés peptidolipidyl-cyclodextrines, seront<br />
caractérisés par RMN et spectrométrie de masse. Leurs propriétés d’auto-organisation dans<br />
l’eau seront évaluées par des mesures de tension de surface. Enfin, leur aptitude à former des<br />
phases mixtes de bicouches lipidiques sera mise en évidence par RMN du deutérium en<br />
collaboration avec le D r M. Roux, Chargé de Recherches CNRS, URA CNRS 2096, Section<br />
de Biophysique des Protéines et des Membranes (DBCM / DSV, <strong>CEA</strong> Saclay).<br />
4
PREMIERE PARTIE<br />
PRESENTATION GENERALE <strong>DE</strong>S CYCLO<strong>DE</strong>XTRINES 1<br />
I. Historique<br />
L’histoire des cyclodextrines (CDs) commence il y a un peu plus de 100 ans, en 1891.<br />
Villiers 2 isole 3 g d’une substance cristalline à partir de la digestion bactériologique de 1000 g<br />
d’amidon. Il détermine la composition de cette substance comme étant (C6H10O5)2,3H2O et la<br />
nomme “cellulosine” car ses propriétés se rapprochent de celles de la cellulose (résistance à<br />
l’hydrolyse acide, propriétés non réductrices). Il observe également l’existence de deux<br />
formes cristallines distinctes correspondant probablement à l’-CD et à la -CD.<br />
Ce n’est que 20 ans plus tard que Shardinger isole la souche microbienne Bacillus<br />
macerans 3,4 , responsable de la formation de ces dextrines cristallisées (les dextrines désignent<br />
l’ensemble des produits de dégradation). Il distingue deux produits cristallins différents, la<br />
“dextrine cristallisée” et la “dextrine cristallisée”, par leurs capacités à former avec les<br />
molécules de diiode des adduits particuliers, de couleurs respectives différentes 5 .<br />
Au début des années 30, l’équipe de Pringsheim, bien que se basant sur des études pouvant<br />
être discutées, découvre la capacité de ces dextrines à former des complexes avec divers<br />
composés organiques 6,7 .<br />
Ce n’est qu’en 1936, que Freudenberg et coll. arrivent à la conclusion que les “dextrines de<br />
Shardinger” sont des oligosaccharides constitués d’un enchaînement d’unités maltoses liées<br />
par des liaisons (14) glycosidiques, et postulent que ces produits sont cycliques 8 . La<br />
structure et la masse moléculaire de l’-CD et de la -CD sont déterminées par French et<br />
Rundle en 1942 alors que la -CD est découverte et sa structure élucidée à la fin des<br />
années 40 9 .<br />
Au début des années 50, les propriétés d’inclusion des CDs sont étudiées de manière intensive<br />
par Cramer et coll. 10 . En 1953, un premier brevet sur l’application des CDs dans la<br />
formulation de composés à visée biologique est déposé par Freudenberg, Cramer et<br />
Plieninger 11 .<br />
A partir des années 70, et après plusieurs études prouvant qu’il n’y a pas de toxicité inhérente<br />
à la CD empêchant son utilisation, les CDs sont produites et utilisées dans l’industrie.<br />
6
Aujourd’hui, la production de -CD est supérieure à 1000 T/an et son prix continue de baisser<br />
(quelques $ par kilogramme). D’autres CDs naturelles ou modifiées sont produites<br />
industriellement. Enfin, le nombre de publications n’a cessé d’augmenter de façon<br />
exponentielle au cours du XX ème siècle. CD-NEWS a recensé plus de 20000 publications<br />
parues entre 1985 et fin 2002 12 .<br />
II. Caractéristiques structurales et physico-chimiques<br />
n = 1 -cyclodextrine<br />
n = 2 -cyclodextrine<br />
n = 3 -cyclodextrine<br />
Figure 1 : Formule développée générale des cyclodextrines et représentation schématique de leur<br />
structure tridimensionnelle.<br />
Les cyclodextrines sont des oligosaccharides cycliques non réducteurs, obtenues<br />
industriellement par la dégradation enzymatique de l’amylose (forme linéaire de l’amidon) à<br />
l’aide d’une enzyme, la cyclodextrine glucosyltransférase (CGTase), d’origine bactérienne<br />
(Bacillus macerans, Alkalophylic bacillus,…). Les trois CDs les plus fréquemment<br />
rencontrées sont l’-, la - et la -CD constituées respectivement de 6, 7 et 8 sous unités<br />
D-glucopyranosiques, liées entre elles par des liaisons glycosidiques (14) (figure 1). Il<br />
existe des CDs de plus grandes tailles (-CD, -CD… respectivement constituées de 9, 10…<br />
unités) et de taille plus petite (la cyclo-(14)-glucopentaoside) qui ont été isolées ou<br />
totalement synthétisées. Différentes nomenclatures sont utilisées dans la littérature pour<br />
7
l’appellation des CDs (la -cyclodextrine se trouve par exemple sous le nom de -dextrin de<br />
Shardinger, cyclomaltoheptaose, cycloheptaglucan, cycloheptaamylose, -CD, BCD ou C7A).<br />
Nous utiliserons le terme de -CD.<br />
Les CDs ont une structure tridimensionnelle en forme de cylindre conique (ou en forme de<br />
donuts pour les gourmands) dont la paroi est constituée par les unités glucoses, en<br />
conformation chaise 4 C1 13,14 (figure 2).<br />
Figure 2 : Structures tridimensionnelles des cyclodextrines naturelles (-, -, et -CD de gauche à droite),<br />
avec de haut en bas : une vue de la face des hydroxyles secondaires (“grand côté”), une vue latérale, et une<br />
vue de la face des hydroxyles primaires (“petit côté”). En bas, les dimensions respectives des CD’s<br />
obtenues d’après les données cristallographiques.<br />
Tous les hydroxyles secondaires (OH-2, OH-3) sont situés sur le côté le plus grand du tronc<br />
conique alors que les hydroxyles primaires (OH-6) sont localisés sur le petit côté. La présence<br />
de ces groupements hydroxyles sur les deux bords de la couronne confère à la partie<br />
extérieure de la CD un caractère hydrophile (surface en contact avec le solvant), alors que<br />
l’intérieur de la cavité, tapissée d’atomes d’hydrogène (H-3, H-5, H-6) et de l’oxygène<br />
8
inter-glycosidique (O-4), est hydrophobe (surface en contact avec la molécule invitée). De<br />
plus, les paires d’électrons non liantes des oxygènes inter-glycosidiques sont dirigées vers<br />
l’intérieur de la cavité, y produisant une densité électronique élevée et conférant à la cavité un<br />
caractère de Base de Lewis.<br />
La structure des CDs est stabilisée par une véritable ceinture de liaisons hydrogène inter-<br />
résidus entre les OH-2 d’une unité glucose et les OH-3 de l’unité voisine. Dans le cas de la -<br />
CD, cette ceinture de liaisons hydrogène rend sa structure très rigide et peut justifier de sa<br />
faible solubilité dans l’eau par rapport aux autres CDs. Par contre, elle n’empêche pas la<br />
déformation de la cavité de la -CD. Cette déformation va en s’accentuant avec les CDs dont<br />
le nombre d’unités glucose est supérieur à 8 et agit de façon défavorable sur leur propriétés<br />
d’inclusion.<br />
Les principales caractéristiques structurales et physico-chimiques de l’-, la - et la -CD<br />
sont reportées dans le tableau ci-dessous (tableau 1) :<br />
Tableau 1 : Caractéristiques physico-chimiques des principales CDs<br />
-CD -CD -CD<br />
Nombre d’unités glucoses 6 7 8<br />
Formule brute C36H60O30 C42H70O35 C48H80O40<br />
MM (g.mol -1 ) 972 1135 1297<br />
Solubilité dans l’eau (g.L -1 ) 145 18,5 232<br />
[]D 25 °C (H20, c 1) + 150° 0,5 + 162,5° 0,5 + 177,4° 0,5<br />
Ø cavité (Å)<br />
(petit côté – grand côté)<br />
4,3 – 5,3 6,0 – 6,5 7,5 – 8,3<br />
Hauteur du tore (Å) 7,9 0,1 7,9 0,1 7,9 0,1<br />
Volume approx. cavité (Å 3 ) 174 262 427<br />
Nombre moyen de molécules<br />
d’eau<br />
6 - 8 12 13<br />
9
Les cyclodextrines sont entourées de molécules d’eau d’hydratation qui sont relativement<br />
labiles et peuvent être éliminées par séchage, et de molécules d’eau d’inclusion dans la cavité<br />
qui ne peuvent être que remplacées, mais non éliminées.<br />
Le caractère amphiphile des CDs, lié à leur structure spatiale, leur confère leur propriété<br />
majeure : celle de former des complexes supramoléculaires en solution aqueuse avec une ou<br />
des molécules invitées hydrophobes.<br />
III. Complexes d’inclusion<br />
La cavité apolaire de la CD est occupée par des molécules d’eau, énergétiquement<br />
défavorables (interactions polaire – apolaire). Ces molécules d’eau pourront donc être<br />
facilement substituées par une “molécule invitée” appropriée, moins polaire que l’eau.<br />
Les complexes formés entre la (les) cyclodextrine(s) “hôte(s)” et la (les) molécule(s)<br />
“invitée(s)” peuvent être de plusieurs types 15 (figure 3) : on distingue les complexes<br />
d’inclusion (a-f) et les complexes d’association (g).<br />
Figure 3 : Diverses structures en solution aqueuse de complexes cyclodextrines-invités décrits dans la<br />
littérature (d’après Wenz, 1994) ; a) inclusion complète ; b) inclusion "axiale" ; c) inclusion partielle ;<br />
d) complexe 2:1; e) complexe 1:2; f) complexe 2:2; g) complexe "non-spécifique".<br />
Le plus fréquemment, il s’agit de complexes d’inclusion de type 1:1. En solution, le complexe<br />
étant régi par des forces d’interactions faibles, un équilibre s’établit entre les formes<br />
dissociées et associées. Cet équilibre thermodynamique s’exprime par une constante<br />
10
d’association Ka. Dans le cas d’une CD et d’une molécule invitée A, on peut écrire les<br />
relations suivantes :<br />
CD + A CD.A<br />
Ka : 1)<br />
(1 <br />
11<br />
[CD.A]<br />
[CD] [A]<br />
Les complexes d’inclusion peuvent parfois être isolés comme des substances cristallines<br />
stables.<br />
De nombreuses techniques d’analyses physico-chimiques, telles que la spectroscopie<br />
UV-visible, la spectroscopie de fluorescence, l’analyse cristallographique, la spectroscopie<br />
RMN, la spectrométrie de masse ou bien encore des méthodes d’analyses électrochimiques,<br />
permettent de mettre en évidence, de caractériser et de déterminer les constantes d’association<br />
de ces complexes 16,17,18,19,20 .<br />
La formation d’un complexe d’inclusion entre une CD et une molécule invitée confère à ce<br />
complexe des propriétés physico-chimiques et biologiques différentes de celles de la CD et de<br />
la molécule incluse prises séparément :<br />
Modification de la solubilité dans l’eau ;<br />
Modification des propriétés spectrales ;<br />
Modification de la réactivité chimique due à la molécule hôte (protection à<br />
l’oxydation, réduction chirale, Diels-Alder,…) et à la molécule invitée (orientation de<br />
la régiosélectivité) ;<br />
Diminution de la diffusion et de la volatilité (dans le cas de substances volatiles) ;<br />
Modification des propriétés chirales ;<br />
Modification des propriétés biologiques (par exemple, le caractère hémolytique).<br />
L’exploitation des capacités d’inclusion et la biocompatibilité des CDs ont entraîné un<br />
accroissement du nombre et de la diversité des applications scientifiques et industrielles.
IV. Applications actuelles et futures<br />
C’est cette propriété remarquable qu’ont les CDs de complexer en milieu aqueux un panel<br />
impressionnant de molécules hôtes qui fait que l’on trouve dans la littérature de nombreux<br />
domaines d’application dans la formulation de composés actifs 21,22,23 .<br />
Dans l’industrie, les propriétés des CDs sont largement exploitées dans le milieu<br />
pharmaceutique 24,25 . Une liste des spécialités pharmaceutiques commercialisées est reportée<br />
dans un tableau en annexe (Annexe I, M. Skiba, 2003).<br />
Les principales CDs utilisées à l’heure actuelle par l’industrie pharmaceutique sont des -CD<br />
normales ou modifiées. On trouve quelques exemples avec l’-CD et la -CD. La plupart des<br />
médicaments à base de CDs sont administrés par voie orale (tablettes, dragées, sirops,…).<br />
Cependant, on remarque que toutes les spécialités administrées par voie nasale ou oculaire<br />
utilisent des CDs modifiées (Me--CD, HP--CD). Ces systèmes d’absorption font appel à<br />
des mécanismes de passage transmembranaire. Ces mécanismes sont sans doute facilités par<br />
le caractère amphiphile que confèrent les groupements alkyles greffés sur les CDs employées.<br />
Beaucoup de ces médicaments sont utilisés comme anti-inflammatoires (Piroxicam), mais on<br />
trouve d’autres applications. Le marché des CDs est un marché mondial : les entreprises<br />
pharmaceutiques qui commercialisent ces produits sont européennes (Servier, Novartis, Fabre<br />
(France), Betafarm (Allemagne), Pfizer (Suède),…), américaines (CTD, NCI,…), japonaises<br />
(Takeda, Ono,…) et sud-américaines (Aché (Brésil), Gador (Argentine)).<br />
Il existe également beaucoup d’applications dans les domaines de l’agroalimentaire, de la<br />
cosmétique, des détergents et aussi du textile 26 . Actuellement, les applications des CDs dans<br />
la formulation des pesticides restent encore modestes car l’industrie des pesticides est très<br />
sensible au coût des matières premières. Toutefois, une baisse rapide des coûts de production<br />
de la -CD pourrait rapidement changer la donne dans ce secteur d’activité.<br />
Les applications industrielles faisant appel aux CDs représentent un marché en plein essor. Il<br />
suffit de voir le très grand nombre de brevets nationaux et internationaux déposés ces<br />
dernières années, couvrant l’exploitation de ces applications. Dans ce domaine, le Japon est<br />
un exemple significatif 27 .<br />
Dans les domaines plus fondamentaux et technologiques, les CDs trouvent aussi de<br />
nombreuses applications. En chimie analytique, les CDs ont un potentiel incroyable pour la<br />
12
séparation chirale (HPLC, Electrophorèse capillaire) 28,29 . Elles sont aussi des catalyseurs<br />
chimiques efficaces 30,31,32 et sont utilisées dans la conception d’enzymes artificielles 33,34,35 .<br />
Enfin, les applications des CDs dans les industries chimiques et biotechnologiques sont<br />
également en expansion 36,37 .<br />
13
<strong>DE</strong>UXIEME PARTIE<br />
MODIFICATION SELECTIVE <strong>DE</strong>S CYCLO<strong>DE</strong>XTRINES 38<br />
I. Introduction<br />
La modification chimique des cyclodextrines offre à la fois d’énormes opportunités et de réels<br />
défis pour les chimistes. La modification des CDs peut en effet permettre d’améliorer leurs<br />
propriétés physico-chimiques (e.g. augmenter leur solubilité dans un solvant donné) et/ou le<br />
pouvoir de complexation de leur cavité avec une molécule hôte. C’est également un moyen de<br />
créer des molécules originales avec des fonctions spécifiques, trouvant des applications<br />
variées au-delà des frontières de la chimie classique (e.g. une activité catalytique de type<br />
enzymatique, des propriétés de vectorisation). Le défi qui est posé aux chimistes est celui de<br />
développer des méthodes efficaces pour modifier de manière sélective les nombreuses<br />
fonctions hydroxyles portées par les CDs (figure 4).<br />
n = 1 -cyclodextrine<br />
n = 2 -cyclodextrine<br />
n = 3 -cyclodextrine<br />
1<br />
2<br />
3<br />
4<br />
5<br />
14<br />
SE + , en présence<br />
d’une base faible,<br />
sans inclusion<br />
Réaction anionique<br />
avec une base forte<br />
en présence d’un E + ,<br />
sans inclusion<br />
formation d’un complexe<br />
d’inclusion entre l’E + et<br />
la CD<br />
Position 2 protégée,<br />
puis 1<br />
Position 6 protégée<br />
Puis 1<br />
CD modifiées en -6<br />
CD modifiées en -2<br />
CD modifiées en -2, -3 ou -6<br />
(ou un mélange des 3)<br />
CD modifiées en -6<br />
CD modifiées en -3 ou en -2<br />
Figure 4 : Présentation générale des méthodes de modification chimiques des CDs
I.1. Les facteurs qui influencent la sélectivité<br />
Des facteurs, propres à la nature structurale des CDs, sont susceptibles d’influencer la<br />
sélectivité de ces modifications, les principaux étant la différence de nucléophilie des<br />
groupements hydroxyles et la capacité des CDs à former des complexes avec les réactifs et<br />
solvants utilisés :<br />
Réactivité des hydroxyles :<br />
Les cyclodextrines possèdent trois types de fonctions hydroxyles situées sur les positions 2, 3<br />
et 6 des unités glucoses (figure 5). Seules ces trois positions peuvent être modifiées car les<br />
positions 1 et 4 des glucoses forment les liaisons inter-glycosidiques de la molécule cyclique.<br />
La méthodologie développée sur les monosaccharides est difficilement transposable aux CDs,<br />
car il n’y a pas de chimie d’anomère dans notre cas.<br />
Position 6<br />
HO<br />
4<br />
Position 3<br />
6<br />
O HO<br />
5<br />
3<br />
O<br />
15<br />
O<br />
H<br />
1<br />
O<br />
O<br />
H<br />
4<br />
3<br />
6<br />
5<br />
OH<br />
2<br />
Position 2<br />
Figure 5 : Localisation des hydroxyles sur une des unité -D-glucopyranose de la cyclodextrine<br />
Les hydroxyles en 6 sont des hydroxyles primaires, plus réactifs que les hydroxyles<br />
secondaires en position 2 et 3. De plus, ceux de la position 6 sont aussi les plus basiques, les<br />
plus accessibles et souvent les plus nucléophiles. Ceux de la position 2 sont les plus acides et<br />
ceux de la position 3 les plus inaccessibles et de loin les moins réactifs, d’autant plus que la<br />
couronne d’hydroxyles secondaires est encombrée, moins flexible et rigidifiée par la ceinture<br />
de liaisons hydrogène 39,40 . De plus, la réactivité est souvent modifiée lors de persubstitutions,<br />
en raison de problèmes d’encombrement stérique dus à la structure tridimensionnelle cyclique<br />
de la CD.<br />
O<br />
OH<br />
1<br />
O
Influence de la nature des réactifs :<br />
Un réactif électrophile privilégiera les positions primaires en 6 41 . Toutefois, il est important<br />
de noter qu’un réactif “trop efficace” ne réagira pas seulement avec les hydroxyles en 6 mais<br />
aussi avec ceux de la position 2 42 . Pour être très sélectif, il vaut mieux choisir un réactif avec<br />
une réactivité modérée.<br />
Les hydroxyles situés sur la position 2 sont les plus acides et donc les premiers à être<br />
déprotonés. Les alcoolates formés sont alors plus nucléophiles que les hydroxyles primaires<br />
en 6. Une base forte permettra donc une meilleure sélectivité en 2 43 sans toutefois éliminer<br />
totalement une substitution en 2 et 6, conduisant à des mélanges complexes.<br />
Influence de la cavité et du solvant :<br />
La capacité des cyclodextrines à former des complexes peut jouer un rôle important dans la<br />
sélectivité et affecter la chimie classique des groupes hydroxyles. Si un réactif électrophile<br />
forme avec la CD un complexe fort, alors le produit prédominant formé sera dicté par<br />
l’orientation de ce réactif dans le complexe 44 . La nature du solvant et la taille de la cavité de la<br />
CD ont une influence importante sur la force et l’orientation du complexe entre le réactif et la<br />
cyclodextrine, et affectent le produit de réaction. Par exemple, la réaction du chlorure de<br />
p-toluène sulfonyle en milieu aqueux basique avec l’-CD et la -CD donne respectivement<br />
les dérivés 2- et 6-tosylés. Dans la pyridine, le dérivé 6-tosylé est obtenu avec l’-CD 45,46 .<br />
Pour éviter les complications dues à l’orientation inattendue de l’attaque d’un réactif, soumis<br />
à l’influence de la cavité de la CD, la stratégie la plus souvent employée consiste à protéger<br />
temporairement certaines positions hydroxyles 41,47 .<br />
I.2. Les problèmes liés à la structure de la CD<br />
L’ensemble des critères influençant la sélectivité des CDs décrits précédemment ainsi que le<br />
très grand nombre de groupes hydroxyles portés par la CD (18 pour l’-CD, 21 pour la -CD,<br />
24 pour la -CD) rendent compliquée l’obtention de CDs sélectivement modifiées avec un<br />
haut degré de pureté et de bons rendements, en particulier dans le cas de polysubstitutions.<br />
16
Des facteurs statistiques et stériques 48 conduisent à l’obtention d’un mélange de composés<br />
souvent difficile à purifier, même en utilisant des techniques séparatives puissantes telles que<br />
la Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC). La polysubstitution des CDs (di-,<br />
tri-modifications) donne, de manière statistique, de nombreux isomères de position. Le<br />
nombre possible d’isomères pour un substituant est donné par le nombre de positions<br />
possibles sur une unité glucose (i.e. les hydroxyles en position 2, 3 et 6) multiplié par le<br />
nombre d’unités glucoses dans la CD. Le nombre de combinaisons s’accroît rapidement avec<br />
le nombre de substituants (figure 6). Par exemple, pour une -CD disubstituée, il existe 27<br />
isomères de position théoriques !<br />
De plus, la géométrie de la molécule est telle que les interactions stériques provoquées par la<br />
polysubstitution peuvent tendre à inverser la sélectivité initiale des hydroxyles 48 .<br />
Figure 6 : Nombre d’isomères de position, Ni, en fonction du nombre de substituants identiques, Ns, pour<br />
la -CD<br />
La purification des produits issus de la modification chimique des cyclodextrines pose de<br />
nombreux problèmes. En effet, l’élimination des réactifs et des produits secondaires inclus<br />
dans la cavité de la CD (ex : PPh3, OPPh3, I2, Br2,…) est très difficile. Il en va de même pour<br />
les solvants couramment utilisés dans les réactions (pyridine, DMF, DMSO, DMAP), qui<br />
sont, par définition, ceux ayant une grande affinité pour la cavité (condition sine qua non à la<br />
solubilisation des CDs). Par ailleurs, les CDs non protégées sont beaucoup trop polaires pour<br />
être purifiées sur silice. Seules les techniques de précipitations sélectives, l’HPLC et la<br />
chromatographie échangeuse d’ions sont efficaces<br />
Enfin, la caractérisation structurale de ces dérivés devient très délicate dès que la CD est<br />
mono ou polysubstituée, en raison de la perte de symétrie de l’architecture. Par exemple, pour<br />
17
une monosubstitution de la -CD, 35 protons inéquivalents auront un signal de résonance<br />
compris entre 3 et 4 ppm en moyenne. Ceci nécessite l’utilisation de techniques physicochimiques<br />
élaborées, comme la RMN haut champ mono et bidimensionnelle, homo et<br />
hétéronucléaire.<br />
L’analyse élémentaire n’est pas la technique de contrôle la mieux appropriée pour ce genre de<br />
dérivés, notamment à cause du problème de la formation des isomères. Par exemple, si on<br />
compare l’analyse élémentaire théorique d’une -CD monoamine (C 44,40 %, H 6,26 %, O<br />
47,93 %, N 1,23%) et celle d’un mélange contenant 2 % de -CD, 95 % de -CD-NH2 et 3 %<br />
de -CD-(NH2)2 (C 44,3999 %, H 6,2605 %, O 47,9155 %, N 1,2423 %), on constate qu’il<br />
n’y a pas de différence significative entre l’analyse élémentaire du produit pur et celle du<br />
mélange. De plus, la présence de molécules d’eau non labiles dans la cavité peut augmenter<br />
l’erreur de mesure.<br />
Dans ces conditions, la stratégie de caractérisation des cyclodextrines modifiées par RMN et<br />
par couplage LC / HRMS parait être la plus judicieuse.<br />
I.3. Les CDs modifiées : présentation générale<br />
Dans la littérature, les principaux types recensés de fonctionnalisations chimiques effectuées<br />
sur les CDs, peuvent être classés de la façon suivante :<br />
Ethérification (dérivés alkylés et silylés) ;<br />
Estérification (dérivés acylés et sulfonylés) ;<br />
Halogénation ;<br />
Substitution nucléophile de groupes partants (tosylates, halogénures) pour donner des<br />
dérivés azotures, amines, thioalkyles,…<br />
Pour obtenir ces dérivés, les méthodes utilisées peuvent être divisées en trois catégories 38 :<br />
1. La méthode dite “intelligente” exploite la chimie de la CD pour obtenir le produit<br />
désiré à partir d’un schéma réactionnel le plus court possible.<br />
2. La méthode dite “longue” consiste à réaliser une série d’étapes de protection et de<br />
déprotection afin de modifier sélectivement des positions qui n’auraient pas pu être<br />
atteintes autrement.<br />
18
3. La méthode du “rouleau compresseur” où la CD est soumise à un réactif non<br />
discriminatoire, conduisant à un mélange de composés. Le produit désiré est alors<br />
isolé de ses isomères et homologues, de façon souvent laborieuse, par des méthodes<br />
chromatographiques. Cette méthode ne peut pas être exploitée en chimie préparative,<br />
elle sert plutôt à établir des banques de produits ou à obtenir des CDs commerciales 25<br />
(RAMEB, HPCD, SECD,…), la reproductibilité et la répétabilité des produits<br />
devenant un problème majeur.<br />
En fait, malgré le nombre impressionnant de publications traitant de la modification chimique<br />
des CDs, il en ressort que seules quelques réactions de base conduisent à des composés<br />
parfaitement caractérisés, facilement accessibles et avec des rendements acceptables.<br />
Le but de ce chapitre n’est pas de recenser de manière exhaustive tous les dérivés substitués<br />
décrits jusqu’à ce jour. Il existe de nombreuses revues traitant de ce sujet 38,49,50 . Il s’agira<br />
plutôt de présenter de manière synthétique et analytique les différentes méthodes de<br />
substitution possibles sur les CDs et les principaux types de modification chimique des<br />
groupes hydroxyles.<br />
II. Les persubstitutions<br />
II.1. Persubstitution par voie directe<br />
II.1.1. Modification de toutes les positions hydroxyles en 2, 3 et 6<br />
Tous les groupes hydroxyles de la CD peuvent être convertis directement et de façon non<br />
discriminatoire en fonctions esters (acétylation) ou éthers (alkylation, benzoylation, silylation)<br />
en employant des réactifs adaptés, dans des conditions appropriées.<br />
Les esters de cyclodextrines sont obtenus de manière générale par l’attaque d’un chlorure<br />
d’acide organique dans la pyridine ou dans un autre solvant approprié, en présence d’une<br />
amine tertiaire jouant le rôle de base. La taille des groupements alkyles ou aromatiques portés<br />
par les réactifs n’a que très peu d’effet sur la substitution et les produits permodifiés sont<br />
homogènes (pas de produits secondaires sous-substitués).<br />
19
L’acétylation 42,51,52 et la benzoylation 42,48,53 complète des CDs sont respectivement obtenues à<br />
partir de l’anhydride acétique et du chlorure de benzyle, dans la pyridine, avec des temps de<br />
réaction suffisamment longs (plusieurs jours) pour une substitution totale.<br />
Les halogénures d’alkyle réagissent avec les ions alkoxydes des CDs pour produire les éthers<br />
de cyclodextrines correspondants avec de bons rendements 42,54 . Ici non plus, la taille des<br />
substituants n’a pas d’effet sur la sélectivité 55,56,57,58 . La peralkylation des CDs améliore leur<br />
solubilité dans les solvants organiques. De plus, les CDs perméthylées sont beaucoup plus<br />
solubles dans l’eau que leurs homologues naturels 54 .<br />
La silylation complète de toutes les positions est possible avec le chlorure de triméthylsilyle<br />
mais ne présente que peu d’intérêt si ce n’est d’améliorer fortement la solubilité des CDs dans<br />
des solvants organiques variés 48,59 .<br />
II.1.2. Permodification des hydroxyles en 2 et 6<br />
Les cyclodextrines peuvent être sélectivement modifiées sur toutes les positions 2 et 6 sans<br />
affecter les positions 3, du fait de la plus grande réactivité de ces groupements hydroxyles.<br />
Des conditions rigoureuses sont pour cela employées. En général, des sulfates de dialkyle<br />
réagissent avec la cyclodextrine dans un mélange DMF / DMSO en présence d’oxyde de<br />
baryum (BaO) et d’hydroxyde de baryum (Ba(OH)2) pour donner les dérivés<br />
2,6-dialkylcyclodextrines. La taille des groupements alkyles a peu d’effet sur la sélectivité. La<br />
littérature rapporte la préparation d’un grand nombre de dialkylcyclodextrines allant de la<br />
diméthyl-CD jusqu’à la n-dodécyl-CD 60,61,62,63,64,65 . La réaction de dialkylation conduit<br />
toutefois à un mélange de dérivés sous- et sur-alkylés (12 < dp < 16), avec une majorité du<br />
produit désiré (dp = 14). Les conditions de purification doivent donc être drastiques. Par<br />
exemple, la DIMEB est purifiée par une recristallisation dans l’eau à 95 °C (sa solubilité dans<br />
l’eau étant strictement inversement proportionnelle à la température).<br />
II.1.3. Permodification des hydroxyles primaires en 6<br />
Les hydroxyles primaires, situés en position 6, sont plus nucléophiles et réactifs que leurs<br />
homologues secondaires en 2 et 3. Il est donc facile de modifier directement et de manière<br />
sélective ces positions en employant des électrophiles tels que les halogénures d’alkyle, de<br />
silyle, de sulfonyle, ou d’acide carboxylique pour donner des dérivés alkylés, silylés,<br />
20
sulfonatés ou acylés. L’utilisation d’une base faible ou d’un solvant basique permet de<br />
neutraliser l’acide formé lors de la réaction et ainsi, d’éviter la décomposition de la CD, non<br />
stable en milieu acide.<br />
L’introduction de dérivés sulfonylés ou halogénés comme groupes partants est une méthode<br />
très utilisée pour obtenir des perfonctionnalisations variées sur la face primaire des CDs, par<br />
substitution nucléophile de type SN2 (figure 7).<br />
R = N3 48,66,67<br />
R = NHR 68<br />
R = H 69<br />
R n<br />
R = SR’ 70 , SAr 71 , SOR’ 72 , SCnF2n+1 73<br />
R = Thioglycosyl 74 , acide aminé 75 …<br />
R<br />
L<br />
L = Groupe partant<br />
21<br />
n<br />
Base Forte<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
3,6-anhydro-CD<br />
n<br />
n = 6, 7 ou 8<br />
Figure 7 : Présentation générale des perfonctionnalisations possibles à partir des CDs persulfonylées et<br />
perhalogénées sur la face primaire.<br />
II.1.3.1. Les cyclodextrines per-6-tosylées<br />
La synthèse des per(6-O-ptoluènesulfonyle)-CD et -CD est reportée pour la première fois<br />
dans la littérature en 1954 par Lehmann et coll. 76 Le chlorure de para-toluènesulfonyle réagit<br />
en présence de pyridine sur la cyclodextrine pendant 24 h à température ambiante.<br />
Des modifications ont ensuite été apportées à cette procédure par Umezawa et coll. 77 , Cramer<br />
et coll. 78 , Breslow et coll. 79 Cependant, les données analytiques fournies par les auteurs<br />
(pouvoir rotatoire, point de fusion, analyses élémentaires) sont rares et en désaccord. Seul<br />
Umezawa apporte des précisions sur une procédure de purification par colonne de silice<br />
(Benzène / EtOH 4/1 v/v), les autres utilisant des méthodes de recristallisation comme moyen<br />
de purification.
En 1991, Ashton et coll. 80,81 ont synthétisé des dérivés per-3,6-anhydro d’-CD et de -CD à<br />
partir de dérivés per-6-tosylés. Ils ont mis en évidence le manque de sélectivité de la réaction<br />
de tosylation, qui conduit à un mélange de dérivés sous-tosylés et sur-tosylés. Ils n’ont pu<br />
obtenir des composés purs qu’après des étapes répétées de purification par HPLC en polarité<br />
de phase inversée, la purification sur colonne de Umezawa et les recristallisations se révélant<br />
infructueuses selon eux.<br />
Des -CD per-6-tosylées ont également été synthétisées et purifiées sur gel de silice greffée<br />
aminopropyle par Yamamura et coll. 82,83 La littérature relate aussi la synthèse de CDs<br />
per-6-mésylées 84 .<br />
Le manque de sélectivité de la pertosylation en position 6 conduit à des mélanges de<br />
composés, nécessitant une purification difficile avec des rendements non acceptables. C’est<br />
pourquoi les dérivés per-6-tosylés ont été abandonnés au profit des dérivés per-6-halogénés.<br />
II.1.3.2. Les cyclodextrines per-6-halogénées<br />
L’introduction de groupes halogènes sur la face primaire de la CD est une alternative aux<br />
groupes tosylés qui s’avère très intéressante pour la modification sélective des CDs.<br />
En 1974, des -CD et -CD per-6-bromées ont été réalisées par Takeo et coll. 85 de manière<br />
originale par réaction du bromure de méthanesulfonyle sur la CD dans le DMF, à température<br />
élevée. Les auteurs observent malheureusement un degré de bromation très inférieur à 100 %.<br />
Des produits secondaires sulfonatés sont également formés durant la réaction.<br />
En 1991, Gadelle et coll. 86 montrent que des cyclodextrines non protégées peuvent être<br />
directement halogénées en position 6, avec de hauts rendements, par un réactif de type<br />
Vilsmeier-Haack généré in-situ, à partir de brome ou d’iode en présence de<br />
triphénylphosphine dans le DMF, en chauffant à 80°C pendant 15 h (figure 8). La réaction est<br />
ensuite traitée avec du méthanolate de sodium pour détruire les esters de formiate formés lors<br />
de la réaction. Ces dérivés per-6-halogénés sont utilisés comme intermédiaires pour la<br />
synthèse de per-3,6-anhydro-CD et per-6-désoxy-CD.<br />
22
HO<br />
OH<br />
OH<br />
PPh 3<br />
Br 2<br />
DMF<br />
PPh3 + Br2 Br-+ PPh3Br Br-+ PPh3Br + Me2N-CHO [Me2N-CHBr] + Br- +Ph3PO Figure 8 : Perhalogénation des cyclodextrines par la méthode de Gadelle et coll. et mécanisme de<br />
formation du réactif de Vilsmeier-Haack généré in-situ.<br />
Pour éviter les réactions secondaires de sulfonylation et de formylation, Kahn et coll. 87<br />
forment un complexe de type Vilsmeier-Haack avec des chlorures d’alkylsulfonyle dans le<br />
DMF, en passant par un complexe imidazole-sulfonyle. Cette réaction fonctionne très bien<br />
avec les dérivés chlorés, donnant de très bons rendements (~ 90 %), mais ne conduit pas aux<br />
dérivés bromés et iodés.<br />
Le réactif de type Vilsmeier-Haack a encore été isolé sous forme d’un sel de bromure<br />
([CH3)2NCHBr] + Br - ) 88 . L’avantage de cette méthode est d’éliminer les produits secondaires<br />
apparaissant lors de la formation du réactif, en particulier l’oxyde de triphénylphosphine,<br />
avant de le faire réagir avec la CD.<br />
Une autre méthode de synthèse a été proposée par Chmurski et coll. 89 , utilisant comme réactif<br />
de type Vilsmeier-Haack un chlorure ou un bromure d’halométhylènemorpholinium avec la<br />
CD dans le DMF. Cette réaction est réalisable dans d’autres solvants aprotiques dipolaires<br />
(N-méthyl-2-pyrolidinone, N-N’-diméthylpropylèneurée, N-diméthylacétamide et pyridine)<br />
mais avec des rendements plus modestes.<br />
Les per(6-halogéno-6-désoxy)-CD ont récemment été obtenues avec d’excellents rendements<br />
et une très bonne sélectivité par le traitement d’une CD native avec du N-halosuccinimide et<br />
de la triphénylphosphine dans le DMF 90 (figure 9).<br />
23<br />
HO<br />
OH<br />
Br
HO<br />
OH<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
N<br />
X<br />
2 éq.<br />
PPh 3 / DMF<br />
<br />
HO<br />
24<br />
OH<br />
X<br />
-CD -CD -CD<br />
X = Cl 85 % 96 % 88 %<br />
X = Br 76 % 93 % 93 %<br />
X = I 81 % 89 % 81 %<br />
Figure 9 : Perhalogénation des cyclodextrines par la méthode de Chmurski et coll. Le tableau indique les<br />
rendements obtenus pour chaque produit final.<br />
II.1.4. Permodification des hydroxyles en 2<br />
Une base forte produit sélectivement un ion 2-alcoolate qui peut réagir avec un chlorure<br />
d’alkyle ou de sulfonyle 43 . Mais le caractère discriminatoire de la base est de moins en moins<br />
significatif au fur et à mesure que le degré de substitution augmente, à cause de<br />
l’encombrement stérique. L’électrophilie privilégiera alors de plus en plus les hydroxyles<br />
primaires, plus attractifs, conduisant à des mélanges de dérivés 2- et 6-substitués. Ce<br />
problème est souvent résolu en utilisant une étape préalable de protection.<br />
II.2. Méthode longue : utilisation de groupements de protection<br />
II.2.1. Permodification des hydroxyles en 2 et 3<br />
De nombreuses publications traitent de la permodification complète de la face secondaire des<br />
cyclodextrines.<br />
Parrot-Lopez et coll. 91 ont synthétisé des CDs totalement estérifiées sur la face secondaire.<br />
Les hydroxyles primaires en 6 sont d’abord protégés par des groupements<br />
tert-butyldiméthylsilyles (TBDMS), puis les hydroxyles secondaires sont estérifiés avec des<br />
chlorures d’acyle, dans la pyridine, en présence de DMAP. Enfin, les positions 6 sont<br />
déprotégées grâce à du trifluorure de bore-diéthyl éther (figure 10)
HO<br />
OH<br />
OH<br />
HO<br />
OH<br />
OSi<br />
25<br />
ROCO<br />
OSi<br />
OCOR<br />
ROCO<br />
OH<br />
OCOR<br />
Figure 10 : Peracylation des hydroxyles secondaires en passant par une étape de protection des hydroxyles<br />
primaires (Parrot-Lopez et coll.)<br />
Boger et coll. 48 obtiennent également des CDs peracylées sur les positions 2 et 3 par une étape<br />
de perbenzoylation de tous les hydroxyles, suivi d’une déprotection sélective des benzoates<br />
situés sur la face primaire (figure 11). Ils jouent pour cela sur la différence de réactivité, due à<br />
l’encombrement stérique de la face secondaire, entre les hydroxyles du petit côté et ceux du<br />
grand côté.<br />
HO<br />
OH<br />
OH<br />
PhCOCl<br />
Pyridine<br />
PhOCO<br />
OCOPh<br />
OCOPh<br />
K<br />
O<br />
CH 3<br />
CH 3<br />
2-propanol,<br />
benzène<br />
PhOCO<br />
OH<br />
OCOPh<br />
Figure 11 : Peracylation des hydroxyles secondaires par déprotection sélective des hydroxyles primaires<br />
(Boger et coll.)<br />
II.2.2. Permodification des hydroxyles en 3<br />
La permodification des positions 3 reste un challenge à relever. Ainsi, la protection des<br />
hydroxyles en 6 entraîne la modification privilégiée des hydroxyles en 2 92 . La protection des<br />
positions 2 et 6 par des groupements TBDMS ne permet pas non plus l’attaque des chlorures<br />
de sulfonyle sur les positions 3, probablement à cause de l’encombrement stérique des<br />
fonctions silylées, très volumineuses 93 . De plus, les groupements TBDMS ont tendance à<br />
migrer des hydroxyles en 2 vers ceux en 3 dans des conditions fortement basiques 94 . Enfin,<br />
bien que l’utilisation de groupes triméthylsilyles (TMS) pour la protection des hydroxyles en<br />
2 et 6 diminue l’encombrement stérique, ces fonctions sont facilement hydrolysées dans des<br />
conditions neutres ou acides, ce qui interdit l’obtention de dérivés per-3-tosylés 93 .<br />
Les per-2-sulfonyl-CD donnent, dans des conditions basiques, des per-2,3-époxy-CD qui<br />
servent d’intermédiaires dans la synthèse des altro-CD (cycloaltrine). Dans ce cas, l’attaque
nucléophile des positions 3 sur ces époxydes donnera des cycloaltrines substituées en<br />
position 3 95 .<br />
II.2.3. Amélioration de la sélectivité<br />
Nous avons vu précédemment que les positions 6 et même les positions 2 pouvaient être<br />
directement substituées dans des conditions adaptées. Mais le manque de sélectivité, dû à<br />
l’encombrement stérique causé par l’augmentation du degré de substitution, a contraint les<br />
chercheurs à se servir de groupements protecteurs, temporaires ou définitifs pour obtenir des<br />
dérivés per-6-substitués et per-2-substitués.<br />
Takeo et coll. 47 utilisent ainsi une “méthode longue” pour obtenir des dérivés per-6-tosylés<br />
(figure 12) avec un haut degré de pureté et pour éviter le risque de formation de 3,6-anhydrocyclodextrine.<br />
HO<br />
OH<br />
OH<br />
HO<br />
OH<br />
OSi<br />
AcO<br />
Figure 12 : Pertosylation des hydroxyles primaires par une méthode longue (Takeo et coll.)<br />
Alker et coll. 96 ont réalisé la synthèse de la per(2,3-diméthyl-6-bromo-6-désoxy)-CD, une<br />
version plus soluble dans l’eau de la per(6-bromo-6-désoxy)-CD. Le dérivé per-6-silylé est<br />
méthylé par du iodure de méthyle dans des conditions anhydres pour obtenir la per(2,3diméthyl-6-silyl)-CD.<br />
Le produit final est obtenu après désylilation et bromation des<br />
positions 6 avec du dibromure de triphénylphosphine dans le DMF.<br />
Le recours à la protection des hydroxyles primaires en 6 par des groupes silyles pour persubstituer<br />
les positions 2 est très courant pour éviter les mélanges de produits résultant de la<br />
compétition entre les hydroxyles en 6 et en 2. Cette méthode est employée pour la pertosylation<br />
en 2 par exemple 95,97 .<br />
Une procédure originale consiste également à tirer profit des propriétés de migration des<br />
silyles encombrés. La per(2,6-di-O-TBDMS)-CD réagit avec des halogénures de benzyle ou<br />
26<br />
OSi<br />
OAc<br />
AcO<br />
OH<br />
OAc<br />
AcO<br />
OTs<br />
OAc
d’alkyle dans des conditions basiques fortes pour produire le dérivé per-2-alkyl-3,6-silyle qui,<br />
après désylilation, donne le dérivé per-2-alkylé 94 .<br />
III. Les monosubstitutions<br />
III.1. Monosubstitution d’un des hydroxyles en position 6<br />
L’étape clef pour attacher un groupement fonctionnel sur un des hydroxyles de la face<br />
primaire des CDs est une sulfonylation sélective permettant d’obtenir un dérivé monotosylé.<br />
Ce précurseur important mène à une grande variété de CDs monomodifiées (figure 13).<br />
Le déplacement nucléophile du tosylate par des groupements nucléophiles bien adaptés tels<br />
que des ions halogénures, azotures, des thiolates, des hydroxylamines, des alkyl- ou<br />
poly(alkylamines) donnent 98 des monohalogéno- 99,100 , azido- 99,101 , thio- 102,103 ,<br />
(hydroxylamino)- 104 ou (alkylamino)cyclodextrines 105,106 .<br />
Les monoazido-CD sont synthétisées classiquement à partir des dérivés monotosylés en<br />
présence d’azoture de lithium ou de sodium dans le DMF à reflux 99 . Elles peuvent également<br />
être préparées directement à partir de la CD naturelle en passant par une réaction de type<br />
Vilsmeier-Haack, dans laquelle les CDs réagissent avec de l’azoture de lithium, en présence<br />
de triphénylphosphine, dans le DMF et avec chauffage 107 (cette réaction conduit aussi à la<br />
formation de dérivés polysubstitués). Les dérivés monoamino-CD sont obtenus à partir de<br />
dérivés monoazides par réduction avec de la triphénylphosphine en présence<br />
d’ammoniaque 107 . Le dérivé aminé sert de synthon pour la préparation de nombreuses CDs<br />
modifiées sur la face primaire, grâce notamment au greffage de molécules variées (sucres 108 ,<br />
peptides 109,110 , chaînes alkyles 111 ,...) par un couplage de type peptidique.<br />
27
HO<br />
OH<br />
OTs) 1<br />
OH HO) n OH) n<br />
n-1 N3 ) 1<br />
R) 1<br />
(HO n-1 (HO n-1 (HO<br />
n-1 (HO<br />
n-1 (HO<br />
HO) n<br />
HO) n<br />
HO) n<br />
OH) n<br />
NH 2 ) 1<br />
OH) n<br />
NHR’) 1<br />
OH) n<br />
n-1 (HO<br />
HO) n<br />
OH) n<br />
n-1 (HO<br />
28<br />
HO) n<br />
O<br />
n = 6 : -CD<br />
n = 7 : -CD<br />
n = 8 : -CD<br />
OH) n<br />
HO) n<br />
OH<br />
1<br />
O<br />
H<br />
1<br />
OH) n<br />
n-1 (HO<br />
HO) n<br />
R''<br />
OH) n<br />
R : X, N3, aminoalkyle, thioalkyle, thiosucre…<br />
R’: dérivés de sucres…<br />
R’’: OH, NH-Ph<br />
Figure 13 : Présentation générale des méthodes pour monosubstituer la position 6 des CDs<br />
Des dérivés monothio-CD (groupements thiol, thioalkyle) ont été obtenus à partir du dérivé<br />
monotosylé pour former des films immobilisés sur une surface d’or, et étudier l’orientation<br />
des CDs dans ce film 112 . La synthèse directe de dérivés monothio--CD à partir d’une<br />
cyclodextrine native et de thiols aromatiques a été réalisée par la réaction de Mitsunobu<br />
(triphénylphosphine, diisopropyl azodicarboxylate, pyridine ou DMF). Cette réaction donne<br />
des mélanges de produits mono-, di- et tri-substitués qui sont ensuite purifiés par HPLC 113 .<br />
La -CD monoaldéhyde a été préparée par Czarnik et coll. 114 , par oxydation de la -CD<br />
monotosyle en utilisant la réaction de Nace (DMSO / collidine). Ce monoaldéhyde a ensuite<br />
été employé comme matériel de départ pour donner les dérivés monoacide carboxylique,<br />
1
monooxime et monohydrazone 115 . Bienarz et coll. 116 ont obtenu directement le dérivé<br />
monoaldéhyde en faisant réagir la -CD native avec le réactif de Dess-Martin (DMP).<br />
Par contre, il n’est pas possible d’obtenir directement le monoéther d’alkyle à partir du dérivé<br />
monotosylate. L’ion alkoxyde correspondant, qui sert de nucléophile, est produit en présence<br />
d’une base forte qui va arracher également les protons de la position 3 de la CD et former le<br />
produit secondaire mono-3,6-anhydrocyclodextrine. Les éthers d’alkyle de -CD sont<br />
synthétisés par une méthode “longue” 117 .<br />
Deux méthodes ont été décrites dans la littérature pour préparer la très employée mono-6-Otosyl-cyclodextrine<br />
:<br />
La méthode “classique” consiste à préparer ces monosulfonates en faisant réagir un équivalent<br />
de chlorure de p-toluènesulfonyle avec la CD dans la pyridine, et repose sur un contrôle<br />
rigoureux de l’avancement de la réaction (contrôle de la température, du pH, du temps de<br />
réaction) 99,118 . Ce procédé présente le grand inconvénient de ne pas être sélectif et conduit à<br />
un mélange de produits secondaires correspondant à des dérivés di- et tri-tosylés sur la face<br />
primaire. Il faut passer par de pénibles étapes de purification pour isoler le mono-6-O-tosyl-<br />
CD pur. De plus, des réactions secondaires (attaque des contre-ions chlorures sur les tosylates,<br />
réaction d’élimination conduisant à la formation du dérivé mono-3,6-anhydro) réduisent<br />
d’autant plus le rendement final.<br />
La méthode de choix pour la synthèse des dérivés monotosylés est de faire réagir la CD avec<br />
un chlorure de sulfonyle dans une solution aqueuse alcaline. En série -CD, la monotosylation<br />
est réalisée de manière exclusive sur une seule fonction hydroxyle primaire en utilisant le<br />
chlorure de p-toluènesulfonyle comme réactif 105,119,120 . Cette réaction met en jeu la formation<br />
d’un complexe de type 1:1 -CD / TsCl, suivie d’une réaction “intra-complexe” entre l’une<br />
des fonctions hydroxyles en 6 et le TsCl. Une fois le groupement tosylate greffé sur le<br />
macrocycle, il se forme un complexe intramoléculaire entre le cycle aromatique du groupe<br />
tosyle et la cavité de la CD, empêchant tout risque de formation d’un nouveau complexe<br />
-CD-OTs / TsCl. Le problème de cette méthode reste les faibles rendements obtenus<br />
(~30 %), principalement à cause de l’hydrolyse du tosylate qui conduit à une régénération<br />
partielle de la -CD lors de la réaction. Darcy et coll. 121 ont remplacé le chlorure de<br />
29
p-toluènesulfonyle par du p-toluènesulfonylimidazole, moins sensible à l’hydrolyse<br />
(figure 14). Une monotosylation à partir de l’anhydride de l’acide p-toluènesulfonyle a été<br />
mis en œuvre. En série -CD, le principe est identique mais le réactif utilisé pour former un<br />
complexe 1:1 est le chlorure de 2-naphtalènesulfonyle, et la réaction se fait dans la<br />
pyridine 122 . Récemment, des auteurs 123 ont montré que le chlorure de<br />
2,4,6-triisopropylbenzènesulfonyle donnait de manière efficace le dérivé monotosylé sans<br />
traces de di- ou tri-substitution, avec de bons rendements.<br />
Figure 14 : Mécanisme de monofonctionnalisation de la -CD par le tosylimidazole en milieu aqueux<br />
Une méthode de synthèse inédite, faisant intervenir un complexe du cuivre comme<br />
intermédiaire, est décrite par Defaye et coll 124 avec des rendements satisfaisants (~ 40 %).<br />
III.2. Monosubstitution de la face secondaire<br />
La modification sélective d’un hydroxyle de la couronne secondaire est beaucoup plus<br />
délicate qu’une monosubstitution en face primaire, en particulier quand il s’agit de la<br />
position 3. La bibliographie concernant cette partie est beaucoup plus restreinte.<br />
30
III.2.1. Modification de la position 2<br />
Différentes stratégies ont été élaborées pour tosyler sélectivement un des hydroxyles situés<br />
sur la position 2 des unités glucoses du macrocycle :<br />
Stratégie de transfert 100 : La réaction se fait via la formation d’un complexe. Le groupement<br />
réactionnel est transféré préférentiellement sur la position 2 en raison de l’orientation du<br />
réactif inclus dans la CD.<br />
Substitution directe 43 : Les protons des hydroxyles en 2 sont plus acides que ceux en 6. On<br />
exploite cette caractéristique pour attaquer préférentiellement une des positions 2 en présence<br />
d’une base forte et d’un réactif électrophile dans des conditions anhydres.<br />
Méthode “longue” 125 : La substitution électrophile est précédée d’une étape de protection des<br />
hydroxyles primaires par des groupes silyles en général. Un avantage de cette stratégie est que<br />
les réactions et les purifications peuvent être effectuées dans un grand nombre de solvants<br />
organiques et la déprotection des silyles se fait très aisément.<br />
Le groupement tosyle des dérivés mono-2-tosyl-CD est généralement éliminé en présence<br />
d’une base par le groupe hydroxyle adjacent en C3, pour donner le mono-manno-2,3-époxy-<br />
CD. Ce dernier est ouvert en présence d’un réactif nucléophile ou d’une base pour conduire<br />
au dérivé monosubstitué en 2 correspondant. Dans d’autres cas, certaines bases agissent<br />
directement par une réaction de type SN2 sur la position 2 tosylée (figure 15).<br />
Très récemment, Ueno et coll. 126 ont réalisé une étude sur la monosilylation régiosélective en<br />
position 2 des -, - et -CD non protégées par réaction du TBDMS Imidazole dans le DMF,<br />
avec du tamis moléculaire 4 Å, à 140 °C. Ils montrent que la température de la réaction<br />
influence la régiosélectivité. Ainsi, à 0 °C, l’attaque se fait préférentiellement sur un<br />
hydroxyle primaire.<br />
31
Base<br />
forte<br />
Nu 2<br />
Nu 1<br />
manno-2,3-époxy-CD<br />
III.2.2. Modification de la position 3<br />
32<br />
minoritaire majoritaire<br />
Nu 1 : Imidazole<br />
Le composé minoritaire n’est pas formé<br />
avec la plupart des nucléophiles<br />
Nu 2 : CH 3 NH 2 , imidazole<br />
Figure 15 : Réactions sur la mono-2-tosyl-CD<br />
Des modifications en 3 sont souvent réalisées par réaction d’un nucléophile sur le monomanno-2,3-époxy-CD.<br />
Les mélanges de dérivés mono-2- et mono-3-substitués sont ensuite<br />
séparés par chromatographie.<br />
Les stratégies employées pour accéder à la position 3 des CDs sont résumées figure 16 :<br />
allo-2,3-epoxy-CD<br />
Chromatographie<br />
Nu : NH 3 , imidazole<br />
Sf : sulfonate<br />
Figure 16 : Stratégies pour accéder à des cyclodextines modifiées sélectivement sur une position 3.<br />
L’orientation du groupement sulfonate dans le complexe d’inclusion 1:1 entre la -CD et le chlorure de<br />
dansyle (I) donne préférentiellement le dérivé 3-sulfonaté(II).
La monosubstitution en position 2 ou 3 reste difficile d’accès, les rendements obtenus étant<br />
généralement trop faibles pour une première étape de synthèse (< 10 %).<br />
IV. Polysubstitutions<br />
IV.1. Disubstitution<br />
La disubstitution des cyclodextrines peut être obtenue en utilisant plus d’un équivalent de<br />
réactif avec la CD, dans des conditions appropriées, pour donner un mélange de produits qui<br />
sont ensuite séparés par HPLC 127 . Ce procédé est évidemment extrêmement lourd et<br />
complexe et d’autres méthodes plus pertinentes ont été élaborées.<br />
Une stratégie, initialement proposée par Tabushi 128 , permet de synthétiser des dérivés bifonctionnalisés<br />
par la méthode dite de “capping”. Il s’agit d’agrafer deux hydroxyles de la<br />
cyclodextrine par un réactif présentant deux sites de liaisons, pour conduire en général à la<br />
formation d’une cyclodextrine disulfonatée (figure 17). Le déplacement de cette attache<br />
temporaire par un nucléophile 129 ou la conversion en dérivé diiodé 130 permet d’obtenir une<br />
double fonctionnalisation avec rétention de l’isomérie de position. En jouant sur la taille et sur<br />
le site réactif de l’agrafe, des isomères AB 131 , AC et AD 132 ont été préparés sur les positions<br />
6 131 , 2 132 et 3 des CDs. Cependant, les rendements ne dépassent jamais 10 %.<br />
Figure 17 : Utilisation de la géométrie des réactifs pour disubstituer régiospéciquement les cyclodextrines<br />
33
La déprotection sélective des cyclodextrines perbenzylées et perméthylées conduit également<br />
à l’obtention de CDs bifonctionnalisées. Pearce et coll. 133 ont effectué la bis-dé-O-benzylation<br />
de la face primaire d’une -CD et d’une -CD perbenzylées avec d’excellents rendements en<br />
utilisant l’hydrure de diisobutylaluminium (DIBAL) dans des conditions optimisées<br />
(figure 18). L’unique diol AD obtenu parmi les très nombreux régioisomères statistiquement<br />
possibles sur les macrocycles prouve la très grande régiosélectivité de la réaction. Cette<br />
déprotection sélective est un moyen de disubstituer facilement les CDs. De plus, la grande<br />
solubilité dans les solvants organiques de ces composés, grâce aux groupements benzyles,<br />
simplifie les étapes réactionnelles et la purification.<br />
(OBn) 18<br />
34<br />
OH HO<br />
DIBAL (0.5 M, 120 éq.)<br />
A<br />
<br />
Toluène, 50°C, 2h<br />
82 %<br />
<br />
(OBn) 21<br />
OH HO<br />
DIBAL (0.5 M, 140 éq.)<br />
A<br />
<br />
Toluène, 30°C, 2h<br />
83 %<br />
<br />
D<br />
(OBn) 16<br />
D<br />
(OBn) 19<br />
Figure 18 : Déprotection sélective des CDs perbenzylées (Pearce et coll.)<br />
Wang et coll. 134 ont utilisé le DIBAL sur une cyclodextrine “mixte” (perméthylée sur le bord<br />
primaire et perbenzylée sur le bord secondaire). Ils obtiennent une bis-dé-O-méthylation sur<br />
la face primaire. De Roizel et coll. 135 ont étudié l’action du DIBAL sur une CD perméthylée.<br />
Ils ont mis en évidence la formation de deux produits : un composé majoritaire bis-dé-Ométhylé<br />
sur la face secondaire en position 2A et 3B, et un composé minoritaire dé-O-méthylé<br />
sur la face secondaire.<br />
IV.2. Polysubstitution d’ordre supérieur à 2<br />
Au-delà d’une disubstitution, les CDs polysubstituées sont obtenues par des méthodes de<br />
criblage 136 . Le nombre important d’isomères de position possibles ne permet pas actuellement<br />
de faire des modifications sélectives avec des méthodes simples.
V. Conclusion<br />
De nombreuses méthodes sont décrites dans la littérature pour modifier sélectivement une ou<br />
plusieurs positions spécifiques sur les cyclodextrines. Malgré cela, il reste beaucoup de travail<br />
à accomplir au niveau de la méthodologie de synthèse pour améliorer l’efficacité des réactions<br />
(meilleure sélectivité, meilleurs rendements). De plus, la structure tridimensionnelle et la<br />
capacité d’inclusion des cyclodextrines leur confèrent une réactivité particulière qui peut être<br />
exploitée pour réaliser des modifications chimiques par des voies de synthèse qui sortent de la<br />
chimie classique, comme par exemple l’inclusion des réactifs pour orienter la<br />
fonctionnalisation, la déprotection sélective, ou encore l’utilisation du capping. Ces méthodes,<br />
encore balbutiantes, sont peut-être appelées à se développer, aidées par des instruments de<br />
prédiction tels que la modélisation moléculaire.<br />
La recherche de méthodologies de synthèse toujours plus performantes est importante. Elle<br />
fournit de nouveaux outils, mieux adaptés, pour construire plus facilement et avec une plus<br />
grande efficacité des molécules cibles avec des propriétés bien définies (amélioration de la<br />
solubilité dans l’eau, activité enzymatique, catalyseur chimique, propriétés de<br />
vectorisation…), qui peuvent aboutir à de nombreuses applications.<br />
Depuis plusieurs années, une attention particulière a été portée sur l’utilisation de<br />
cyclodextrines modifiées pour le ciblage des médicaments. Le principe consiste à greffer sur<br />
la cyclodextrine une ou plusieurs antennes destinées à assurer une fonction de vectorisation<br />
vers un site d’action privilégié, la CD jouant le rôle de véhicule moléculaire pour le principe<br />
actif. Différentes approches ont été envisagées dans le choix du vecteur. Celui-ci peut avoir<br />
un mode de reconnaissance spécifique pour des récepteurs membranaires (antennes<br />
polysaccharidiques ou peptidiques) ou non spécifique, privilégiant le passage<br />
transmembranaire et destiné à des applications topiques (antennes de type lipidique). Le<br />
chapitre suivant traitera de cette dernière classe de composés : les cyclodextrines amphiphiles.<br />
35
TROISIEME PARTIE<br />
LES CYCLO<strong>DE</strong>XTRINES AMPHIPHILES<br />
I. Présentation des cyclodextrines amphiphiles<br />
Les cyclodextrines amphiphiles sont obtenues par greffage de un ou plusieurs groupements<br />
lipophiles sur la CD. De tels composés peuvent être utilisés en tant que nouveaux matériaux<br />
(nanoparticules par exemple), ou peuvent s’insérer dans des matrices lipidiques préformées<br />
telles que des liposomes. Dans les deux cas, l’objectif principal de cette approche est de<br />
combiner la spécificité de taille de la CD pour inclure de petites molécules hydrophobes et les<br />
propriétés de transport des structures lipidiques (liposomes ou analogues).<br />
Il existe plusieurs grandes familles de cyclodextrines amphiphiles selon la position et le<br />
nombre de groupements hydrophobes portés par la CD :<br />
Persubstitution sur la face primaire (en 6) : Les “médusa-like”<br />
Persubstitution sur la face secondaire (en 2 et 3) : Les “skirt-shaped”<br />
Persubstitution en 2 et en 6 : Les “molécules bouquets”<br />
Persubstitution sur toutes les positions (2, 3 et 6)<br />
Monosubstitution sur un des hydroxyles de la face primaire<br />
Ces composés sont obtenus à partir de cyclodextrines sélectivement fonctionnalisées selon les<br />
méthodes de synthèse qui ont été décrites dans le chapitre précédent. Le but de cette partie<br />
bibliographique est d’établir une relation entre la structure de ces dérivés et leurs propriétés<br />
physico-chimiques et biologiques. Afin d’éviter une description exhaustive de toutes les<br />
cyclodextrines amphiphiles recensées dans la littérature, le tableau suivant récapitule les<br />
principales caractéristiques de ces composés (structure, méthodes de caractérisation<br />
structurale, degré de substitution, types de systèmes organisés obtenus et techniques utilisées<br />
pour les caractériser, solubilité dans l’eau, mise en évidence de complexes d’inclusion dans<br />
les systèmes organisés, applications biologiques potentielles).<br />
36
Appl.<br />
Bio.<br />
Mise en évidence de<br />
l’inclusion dans les<br />
systèmes organisés<br />
Solubilité<br />
dans l’eau<br />
(CMC)<br />
Systèmes organisés<br />
Techniques de<br />
caractérisation<br />
d° subst.<br />
(dp) Type<br />
Réf. Structure Caractérisation<br />
structurale<br />
O<br />
R<br />
S<br />
Subst.<br />
partielle<br />
O<br />
n.c.<br />
(non<br />
communiqué)<br />
HO<br />
OH<br />
137,<br />
non non non<br />
Mesures des<br />
isothermes de pression<br />
de surface – Aire<br />
( - A)<br />
Films de LB i,ii<br />
7<br />
O<br />
138<br />
dp < 7<br />
R = -C12H25 R = -C8H17 R = -C4H9 O<br />
R<br />
S<br />
Subst.<br />
partielle<br />
O<br />
137,<br />
AcO<br />
138,<br />
non<br />
2-aminonaphtalène /<br />
dérivé C12H25 139<br />
non<br />
• Mesures des<br />
isothermes – A<br />
• Spectroscopie IR<br />
polarisé (orientation<br />
moléculaire dans le<br />
film)<br />
Films de LB i,ii<br />
Aire par molécule à la<br />
pression d’effondrement<br />
(A0) régie par la partie CD<br />
(A0 augmente quand CD<br />
peracétylée en 2 et 3)<br />
n.c.<br />
7<br />
OAc<br />
O<br />
139,<br />
dp < 7<br />
140<br />
R = -C12H25 R = -C8H17 R = -C4H9 SR<br />
Subst.<br />
partielle<br />
O<br />
AcO<br />
137,<br />
non non non<br />
Mesures des<br />
isothermes – A<br />
Films de LB i,ii<br />
Remplacement du groupe<br />
sulfonyle par un groupe<br />
sulfure : pas d’influence<br />
sur les isothermes – A<br />
n.c.<br />
7<br />
OAc<br />
O<br />
138<br />
dp < 7<br />
R = -C12H25 R = -C8H17 R = -C4H9 137,138 : n.c.<br />
SR<br />
O<br />
Subst.<br />
partielle<br />
HO<br />
OH<br />
137,<br />
n<br />
O<br />
non non non<br />
• Mesures des<br />
isothermes – A<br />
• BAM(Brewster<br />
Angle Microscopy)<br />
Films de LB i,ii<br />
monocouches<br />
multicouches 141<br />
141 :<br />
• HR-MS<br />
• RMN 1 H et<br />
13<br />
C<br />
• Analyse<br />
élémentaire<br />
138,<br />
141<br />
dp < 7<br />
n = 7<br />
R = -C 12H 25<br />
n = 6<br />
n = 7<br />
R = -C 18H 37<br />
n=8<br />
i : monocouches à l’interface air/eau, stables pour des chaînes à 8 C ou plus, instables pour des chaînes inférieures à 8 C.<br />
ii : Le cône cylindrique de la CD est orienté parallèlement au plan du film et les chaînes hydrocarbonées verticalement.<br />
37
Appl.<br />
Bio.<br />
Mise en évidence de<br />
l’inclusion dans les<br />
systèmes organisés<br />
Solubilité<br />
dans l’eau<br />
(CMC)<br />
Systèmes organisés<br />
Techniques de<br />
caractérisation<br />
d° subst.<br />
(dp) Type<br />
Réf. Structure Caractérisation<br />
structurale<br />
• Azobenzènes iii,iv :<br />
139,<br />
Y<br />
NHR<br />
140,<br />
N N<br />
X<br />
139,140,142<br />
-148 : n.c.<br />
O<br />
141,<br />
Y = COOH<br />
Y = COOH ou COONa<br />
X = H<br />
X = NMe2 • Films de LB :<br />
Monocouches i,ii<br />
Multicouches 141<br />
Subst.<br />
partielle<br />
HO<br />
142,<br />
• Mesures des<br />
isothermes – A<br />
• BAM<br />
141 :<br />
• HR-MS<br />
• RMN 1 H et<br />
13<br />
C<br />
• Analyse<br />
élémentaire<br />
OH<br />
n<br />
O<br />
143,<br />
non<br />
Y = SO 3Na<br />
X = NMe 2<br />
• 2-naphtalènesulfonate<br />
iv, 139<br />
de Na<br />
• Inclusion du cholestérol<br />
dans les films mixtes<br />
avec le dérivé de -CD 147<br />
non<br />
144,<br />
• Films de LB mixtes :<br />
CD / Cholestérol 147<br />
CD / Phospholipides 148<br />
dp < 7<br />
n = 6<br />
n = 7<br />
R = -C 12H 25<br />
145,<br />
R = -C 16H 33<br />
146,<br />
n = 6<br />
n = 7<br />
n=8<br />
147,<br />
148<br />
(CH 2)9 CH3<br />
Subst.<br />
partielle<br />
(CH 2) 8<br />
O<br />
non non non<br />
• Mesures des<br />
isothermes – A<br />
• Spectr. UV-Visible<br />
• CPG<br />
Films de LB ii<br />
Photopolymérisation<br />
intermoléculaire sous<br />
irradiation UV du film<br />
n.c.<br />
NH<br />
149<br />
O<br />
dp < 7<br />
HO<br />
OH<br />
7<br />
O<br />
Diace-CD<br />
(CH 2) 20<br />
O<br />
Subst.<br />
partielle<br />
NH<br />
non non non<br />
• Mesures des<br />
isothermes – A<br />
• Spectr. IR<br />
• Films de LB ii<br />
• Films de LB mixtes :<br />
Vinyl-CD / TA<br />
(TA : HOOC(CH2) 20CH CH2) Photopolymérisation<br />
intermoléculaire sous<br />
irradiation UV des<br />
n.c.<br />
O<br />
150<br />
HO<br />
OH<br />
dp < 7<br />
7<br />
O<br />
films v<br />
Vinyl-CD<br />
iii : Stabilisation de l’isomère cis des azobenzènes (isomérisation thermique cis-trans rapide) dans la cavité de la CD. Excellent comportement photochromique dans les films<br />
de LB.<br />
iv : Influence des interactions coulombiennes (entre la jonction amino- et les motifs –COOH et -SO3Na des dérivés azobenzènes et naphtalènes) et de l’isomérie de position<br />
des groupes substitués sur les aromatiques dans les phénomènes de complexation et de stabilisation.<br />
v : La polymérisation dans les films mixtes de composition vinyl-CD / TA 1:1 et 1:5 (80 – 90 % de conversion, rapide) est meilleure que celle dans des films de vinyl-CD<br />
seule (50 – 60 % de conversion, lent). Les molécules de TA s’intercalent entre les interstices formés dans les films de CD, accélérant le processus par un phénomène de<br />
copolymérisation.<br />
38
Appl.<br />
Bio.<br />
Mise en évidence de<br />
l’inclusion dans les<br />
systèmes organisés<br />
Solubilité dans<br />
l’eau (CMC)<br />
Systèmes organisés<br />
Techniques de<br />
caractérisation<br />
d° subst.<br />
(dp) Type<br />
Réf. Structure Caractérisation<br />
structurale<br />
• Films de LB :<br />
monocouches stables 1- 5,<br />
(1 : tendance à former des<br />
multicouches pendant la<br />
compression)<br />
SR<br />
• Mesures des<br />
isothermes – A<br />
• Calorimétrie<br />
différentielle (DSC)<br />
• Microscopie optique<br />
O<br />
HO<br />
• RMN 1 H et<br />
13<br />
C<br />
• Analyse<br />
élémentaire<br />
OH<br />
Nulle ou<br />
quasi-nulle<br />
7<br />
O<br />
non non<br />
dp = 7<br />
151<br />
• Cristal liquide<br />
thermotropique<br />
R = -C2H5 1<br />
R = -C4H9 2<br />
R = -C10H21 3<br />
R = -C16H33 4<br />
R = -C18H37 5<br />
Vésicules (SUV) vi :<br />
50 < Ø < 300 nm (2 h de<br />
sonication à 50°C)<br />
(pour le dérivé -C12H25,<br />
Ø ~ 60 nm après 9h de<br />
sonication)<br />
SR<br />
• Diffusion de lumière<br />
(DLS)<br />
• Microscopie à<br />
transmission<br />
électronique (TEM)<br />
Face I aire :<br />
dp = 7<br />
• RMN 1 H et<br />
13<br />
C<br />
• ES-MS<br />
• Analyse<br />
élémentaire<br />
O<br />
O<br />
152,<br />
oui non non<br />
O<br />
7<br />
O<br />
153<br />
Face II aire :<br />
partielle<br />
OH<br />
OH<br />
R = -C12H25 R = -C16H33 • 2 : Nanoparticules<br />
polydisperses (30-60<br />
min. de sonication à<br />
TA) : 50 < Ø < 150 nm<br />
SR<br />
oui (1 et 3)<br />
En 6 :<br />
dp = 7<br />
• RMN 1 H et<br />
13<br />
C, 2D<br />
• ES-MS<br />
• Analyse<br />
élémentaire<br />
O<br />
• Mesures de tension<br />
de surface<br />
• DLS<br />
• TEM<br />
HO<br />
O<br />
153,<br />
CMC :<br />
1 : 3,4.10 -6 M -1<br />
2 : pas de cmc<br />
3 : 1,3.10 -6 M -1<br />
7<br />
O<br />
non non<br />
154,<br />
• 1 et 3 : micelles<br />
allongées (dissolution<br />
spontanée)<br />
• 1 : nanoparticules très<br />
polydisperses vii ,<br />
(120 < Ø < 1000 nm).<br />
Hétéroaggrégats avec<br />
porphyrines.<br />
En 2 :<br />
dp = 7<br />
O<br />
n<br />
H<br />
n ~ 2 1<br />
n ~ 3 2<br />
n ~ 4 3<br />
155<br />
R = -C2H5 R = -C6H13 R = -C6H13 SR<br />
En 6 :<br />
dp = 7<br />
O<br />
• RMN 1 H et<br />
13<br />
C, 2D<br />
• ES-MS<br />
• Analyse<br />
élémentaire<br />
HO<br />
153,<br />
O<br />
7<br />
O<br />
156,<br />
non non oui vii<br />
• DLS<br />
• TEM<br />
En 2 :<br />
dp = 7<br />
O<br />
157,<br />
n<br />
• 2 : Vésicules (SUV)<br />
monodisperses, Ø ~ 30-<br />
35 nm<br />
158<br />
ClH.H2N<br />
R = -C6H13 n ~ 2 1<br />
R = -C16H33 n ~ 1 2<br />
vi : Mise en évidence de l’encapsulation d’un colorant fluorescent (CF) et de dextranes marquées par fluorescence dans les SUVs (petites vésicules unilamellaires). Meilleure<br />
encapsulation des vésicules obtenues à partir du dérivé –C16H33.<br />
vii : Effets inhibiteurs des nanoparticules de SC6CDNH2 sur la réaction photochimique qui conduit à la dégradation du diflunisal (DF, un médicament photosensible) en un<br />
produit secondaire toxique.<br />
39
Réf. Structure<br />
159<br />
160,<br />
161<br />
162,<br />
163,<br />
164<br />
165<br />
HO<br />
Br<br />
O<br />
n = 6, 7 ou 8<br />
HO<br />
N 3<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
n = 6, 7 ou 8<br />
R<br />
HO<br />
S<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
R = H<br />
R = Br<br />
R = O-n-C 4H 9<br />
R = n-C 5H 11<br />
R = NO 2<br />
n = 6,7 ou 8<br />
AcO<br />
SCF 3<br />
O<br />
OAc<br />
O<br />
n<br />
n<br />
n<br />
7<br />
Caractérisation<br />
structurale<br />
• RMN 1 H et<br />
13 C<br />
• ES-MS<br />
• Analyse<br />
élémentaire<br />
• RMN 1 H,<br />
1D et 2D<br />
• IR<br />
• RMN 1 H et<br />
13 C<br />
• ES-MS<br />
• Analyse<br />
élémentaire<br />
• RMN 1 H,<br />
13 C et 19 F<br />
• ES-MS<br />
d° subst.<br />
(dp) Type<br />
dp = 7<br />
dp = 7<br />
dp =7<br />
dp = 7<br />
Films de LB :<br />
monocouche à<br />
l’interface air-eau de<br />
faible stabilité<br />
Films de LB :<br />
• CD-N3 et CD-N3 :<br />
triple couche, non<br />
structuré, peu stable<br />
• CD-N3 : Triple couche,<br />
grande rigidité, structure<br />
hexagonale<br />
Films de LB<br />
• Séries et -CD :<br />
La stabilité des films<br />
varie avec la nature des<br />
substituants viii<br />
• Série -CD :<br />
Monocouches très<br />
stables et indépendant de<br />
la nature du<br />
substituant viii<br />
Films de LB<br />
monocouche stable<br />
Systèmes organisés<br />
Techniques de<br />
caractérisation<br />
40<br />
Mesures des<br />
isothermes – A<br />
• Mesures des<br />
isothermes – A<br />
• Scanning Force<br />
Microscopy (SFM)<br />
Solubilité<br />
dans l’eau<br />
(CMC)<br />
Mesures des<br />
isothermes – A non<br />
Mise en évidence de<br />
l’inclusion dans les<br />
systèmes organisés<br />
Appl.<br />
Bio.<br />
non non non<br />
non non non<br />
Auto- inclusion du cycle<br />
aromatique des dérivés<br />
thiophényl-, et CD<br />
dans le DMF<br />
non<br />
Mesures des<br />
isothermes – A non non non<br />
viii : Pour les séries - et -CD, l’ordre croissant du degré d’organisation et de stabilité des films en fonction de la nature des substituants est le suivant : S-Ph < S-Br
Appl.<br />
Bio.<br />
Mise en évidence de<br />
l’inclusion dans les<br />
systèmes organisés<br />
Solubilité<br />
dans l’eau<br />
(CMC)<br />
Systèmes organisés<br />
Techniques de<br />
caractérisation<br />
d° subst.<br />
(dp) Type<br />
Réf. Structure Caractérisation<br />
structurale<br />
Mise en évidence d’une<br />
inclusion partielle de la<br />
progestérone, du<br />
bifonazole et du<br />
clotrimazole dans la<br />
cavité des 6-N-CAPRO -<br />
CD formant les<br />
nanosphères chargées<br />
R<br />
O<br />
• Spectroscopie à<br />
corrélation de photons<br />
(taille des particules)<br />
• Potentiel zeta<br />
• TEM<br />
Nanosphères obtenues par<br />
nanoprécipitation<br />
(solubilisation dans un<br />
solvant organique puis<br />
précipitation dans l’eau) ix<br />
• RMN 1 H<br />
• FAB-MS<br />
• IRTF<br />
• DSC<br />
• Analyse<br />
élémentaire<br />
X<br />
O<br />
166,<br />
HO<br />
167,<br />
oui<br />
non<br />
dp = 7<br />
OH<br />
7<br />
O<br />
168,<br />
169<br />
X = O, R = C5H9 : 6-O-CAPRO-CD<br />
X = NH, R = C5H9 : 6-N-CAPRO-CD<br />
X = NH, R = C13H27 : 6-N-MYRISTO-CD<br />
X = NH, R = CH2-CH(CH3)3 : ramified-CD<br />
170,<br />
OH<br />
171,<br />
O<br />
172,<br />
O<br />
O<br />
O<br />
O<br />
173,<br />
O n<br />
R<br />
• CCM<br />
R<br />
174,<br />
• Pouvoir<br />
175,<br />
rotatoire<br />
R = -CH3 n = 7 : -CD-C2<br />
176, R = -C5H11 n = 7 :-CD-C6 • RMN<br />
R = -C7H15 n = 7 :-CD-C8<br />
177, R = -C9H19 n = 7 : -CD-C10<br />
R = -C<br />
178,<br />
11H23 n = 7 : -CD-C12<br />
R = -C13H27 n = 7 :-CD-C14<br />
179 R = -C13H27 n = 6 : -CD-C14<br />
R = -C13H27 n = 8 :-CD-C14<br />
41<br />
1 • Vésicules mixtes -CD-<br />
C6 / DMPC instables<br />
• formation de structure<br />
lamellaire en milieu<br />
organique (THF, pyridine)<br />
• Films LB<br />
dp ~ 14<br />
(mélange<br />
de sous-<br />
H et de sur-<br />
(caract. faible) acylation)<br />
x , LB mixtes 179<br />
• Dépôts de monocouches<br />
d’-, de - et de -CD-C14<br />
sur une surface en silicone,<br />
étude de l’empilement des<br />
CDs dans le film<br />
• Nanoparticules xi<br />
• DLS<br />
• Mesures des<br />
isothermes – A<br />
• Mesures de tension<br />
de surface<br />
• RMN<br />
(nanosphères ou<br />
nanocapsules) avec<br />
-CD-C6, -C12, -C14 et<br />
CD-C6<br />
1 Dans le cas des<br />
nanosphères, une partie<br />
H<br />
des molécules de<br />
• Diffusion de rayons<br />
non principes actifs<br />
X<br />
encapsulées<br />
• Spectroscopie à<br />
corrélation de photons<br />
• potentiel zeta<br />
• Microscopie<br />
électronique à<br />
cryofracture<br />
xi oui<br />
peuvent se<br />
trouver incluses dans la<br />
cavité.<br />
xi<br />
ix : La formation et les caractéristiques physico-chimiques des nanoparticules dépendent fortement des propriétés structurales de la CD modifiée (comportement à l’interface<br />
huile-eau, viscosité et miscibilité du solvant organique avec l’eau). Le dérivé 6-N-CAPRO-CD donne les nanoparticules les plus homogènes et de plus petites tailles<br />
(diamètre moyen ~ 300 nm).<br />
x : De manière surprenante, la valeur de pression de surface ne corrèle pas avec la longueur des chaînes hydrocarbonées et le dérivé -CD-C6 possède la pression de surface<br />
d’effondrement la plus élevée (plus grande stabilité).<br />
xi : Plusieurs principes actifs, hydrophiles ou lipophiles, ont été encapsulés dans les nanosphères (la doxorubicine sous forme de sel de chlorhydrate et la progestérone) ainsi<br />
que dans les nanoparticules (l’indométhacine, la progestérone et l’amphotéricine B).
Appl.<br />
Bio.<br />
Mise en évidence de<br />
l’inclusion dans les<br />
systèmes organisés<br />
Solubilité<br />
dans l’eau<br />
(CMC)<br />
Systèmes organisés<br />
Techniques de<br />
caractérisation<br />
d° subst.<br />
(dp) Type<br />
Réf. Structure Caractérisat°<br />
structurale<br />
• Films de LB (série -CD)<br />
• Films de LB mixtes :<br />
2 / Phospholipides 182,183<br />
mélange de CDs<br />
amphiphiles xii,179<br />
NH3 + Cl -<br />
O<br />
179,<br />
O<br />
O<br />
R<br />
180,<br />
n<br />
O<br />
R<br />
non<br />
Complexe entre 2 et le<br />
N-acétylphénylalanine<br />
dans le CHCl3 180<br />
non<br />
• Mesures des<br />
isothermes – A<br />
• DLS<br />
• Electrochimie<br />
• IRTF<br />
• BAM<br />
• 4 : Agrégats<br />
monodisperses dans le<br />
THF (Ø ~ 350 nm) 180<br />
• Auto-association des<br />
dérivés -, -, et -CD-C6<br />
(1, 2 et 3) en multicouches<br />
sur une surface d’or<br />
modifiée 181<br />
n.c. n.c.<br />
181,<br />
182,<br />
R = -C6H13 n = 6 1<br />
R = -C6H13 n = 7 2<br />
R = -C6H13 n = 8 3<br />
R = -C12H25 n = 7 4<br />
183<br />
oui<br />
Face I aire :<br />
1,3 dp = 7<br />
2 dp = 4<br />
- +<br />
OSO3 Na<br />
O<br />
O<br />
non non<br />
CMC :<br />
1 : 10 -4 M -1<br />
2 : 10 -4 M -1<br />
3 : 10 -6 M -1<br />
• Mesures de tension<br />
de surface<br />
Auto-organisation en<br />
agrégats micellaires<br />
• RMN 1 H<br />
et 13 C<br />
• ES-MS<br />
• CCM<br />
• Pouvoir<br />
rotatoire<br />
O<br />
7<br />
O<br />
O<br />
C5H11<br />
O<br />
184<br />
Face II aire :<br />
1,2 dp = 14<br />
3 dp > 14<br />
C 5H 11<br />
peracylé, persulfaté 1<br />
peracylé, sous-sulfaté 2<br />
sur-acylé, persulfaté 3<br />
- N + H(CH3) 3<br />
OSO3 O<br />
O<br />
non non non<br />
• Mesures des<br />
isothermes – A<br />
• TEM<br />
• Films de LB :<br />
monocouche stable<br />
• vésicules mixtes<br />
phospholipide (DMPC) /<br />
Cholestérol / dérivé -CD<br />
Face II aire :<br />
dp = 14<br />
• RMN<br />
• MALDI-<br />
TOF-MS<br />
• Analyse<br />
élémentaire<br />
• DLS<br />
O<br />
n<br />
O<br />
O<br />
185<br />
O<br />
R<br />
R<br />
R = CO(CH2) 14CH3 n = 6<br />
n = 7<br />
n= 8<br />
xii : Observation (isothermes de compression, microscopie à angle de Brewster) de films de Langmuir-Blodgett mixtes entre les per-6-ammonium-6-désoxy-per-2,3-di-Ohexyl--CD<br />
(ci-dessus) et les per-2,3-di-O-hexanoyl--CD (-CD-C6, Tableau page précédente) 179 .<br />
42
Appl.<br />
Bio.<br />
Mise en évidence de<br />
l’inclusion dans les<br />
systèmes organisés<br />
Solubilité<br />
dans l’eau<br />
(CMC)<br />
Systèmes organisés<br />
Techniques de<br />
caractérisation<br />
d° subst.<br />
(dp) Type<br />
Réf. Structure Caractérisation<br />
structurale<br />
• Spectroscopie à<br />
corrélation de photons<br />
• Potentiel zeta<br />
• TEM<br />
Nanocapsules sphériques<br />
et homogènes (Ø moyen =<br />
335 nm) : PFC-NC<br />
Stables 35 j, à 4 et 25°C<br />
• CCM<br />
• IRTF<br />
• DSC<br />
• Analyse<br />
élémentaire<br />
• TOF-MS<br />
OH<br />
dp = 14<br />
(> 95 %)<br />
O<br />
non non oui xiii<br />
186<br />
O<br />
O<br />
n<br />
O<br />
O<br />
C7F15 O<br />
C 7F 15<br />
ROOC<br />
X<br />
X<br />
X<br />
O<br />
O<br />
O<br />
187,<br />
O<br />
O<br />
O 7<br />
O<br />
HO<br />
188,<br />
non non oui xiv<br />
• Spectroscopie UV<br />
• RMN 23 Na<br />
• RMN 7 Li<br />
Incorporation dans des<br />
bicouches<br />
phospholipidiques xiv :<br />
vésicules mixtes (LUV)<br />
dp ~ 14<br />
• CCM<br />
• pouvoir<br />
rotatoire<br />
• RMN 1 H et<br />
13<br />
C<br />
• ES-MS<br />
• Analyse<br />
élémentaire<br />
O<br />
189,<br />
X<br />
190<br />
X<br />
X<br />
ROOC<br />
X = CH2 R = H, Et ou Bn 1<br />
X = O R = H, Et ou Bn 2<br />
OR 6<br />
O<br />
R 3O<br />
non non non<br />
• Mesures des<br />
isothermes – A<br />
• IRTF (réflexion)<br />
• Microscopie à Force<br />
Atomique<br />
Films de LB :<br />
Monocouches<br />
Multicouches<br />
dp = 14<br />
ou 21<br />
n.c.<br />
OR 2<br />
191<br />
n<br />
O<br />
R2 = C8H17ou C12H25 R3 = H, CH3, C2H5 ou C8H17 R 6 = C 8H 17 ou C 12H 25<br />
xiii : Etude in vitro de la cinétique de délivrance de l’oxygène encapsulés dans les PFC-NC.<br />
xiv : Ces composés ont été conçus dans le but d’obtenir des canaux transmembranaires artificiels pour améliorer le transport des ions à travers les membranes cellulaires.<br />
Malgré un taux d’insertion relativement élevé dans les modèles de membranes, ces molécules n’améliorent pas de façon significative le passage des ions métalliques<br />
(Na + , Li + ).<br />
43
Appl.<br />
Bio.<br />
Mise en évidence de<br />
l’inclusion dans les<br />
systèmes organisés<br />
Solubilité dans<br />
l’eau (CMC)<br />
Systèmes organisés<br />
Techniques de<br />
Type<br />
caractérisation<br />
d°<br />
subst.<br />
(dp)<br />
Réf. Structure Caractérisation<br />
structurale<br />
oui<br />
(à pH
Appl.<br />
Bio.<br />
Mise en évidence de<br />
l’inclusion dans les<br />
systèmes organisés<br />
Solubilité dans<br />
l’eau (CMC)<br />
Systèmes organisés<br />
Techniques de<br />
caractérisation<br />
d° subst.<br />
(dp) Type<br />
Réf. Structure Caractérisat°<br />
structurale<br />
Pour DIMEB-Chol :<br />
• Mise en évidence de<br />
l’inclusion de<br />
molécules invitées<br />
(ex : dosulépine) à<br />
l’intérieur des cavités<br />
des CDs, dans les<br />
micelles 197<br />
• Inclusion de la<br />
dosulépine dans les<br />
films noirs mixtes 198<br />
-CD-Chol :<br />
Incorporation dans une<br />
membrane modèle de<br />
DMPC xvii,194,199<br />
-CD-Chol :<br />
insoluble<br />
• DSC<br />
• RMN 31 P<br />
• Diffusion de lumière<br />
dynamique (DLS) et<br />
statique (SLS)<br />
• SAXS (Diffusion de<br />
rayons X aux petits<br />
angles)<br />
• SANS (Diffusion de<br />
neutrons aux petits<br />
angles)<br />
•RMN 1 H (techniques<br />
de diffusion)<br />
• RMN 2 H<br />
• Réflectivité de<br />
rayons X (films noirs)<br />
DIMEB-Chol :<br />
Formation spontanée de<br />
micelles sphériques<br />
monodisperses constituées<br />
de 24 monomères 196,197<br />
• HPLC<br />
• ESI-<br />
HRMS<br />
• RMN 1 H<br />
et 13 C, 2D<br />
• Analyse<br />
élémentaire<br />
194,<br />
HN<br />
195,<br />
O<br />
O<br />
DIMEB-Chol<br />
soluble<br />
(800 g.L -1 )<br />
CMC :<br />
5 × 10 -6 M<br />
NH<br />
196,<br />
non<br />
dp = 1<br />
OR<br />
O<br />
O HO<br />
O<br />
OR<br />
O<br />
HO<br />
OR O<br />
197,<br />
6<br />
Cholestéryl-CD<br />
R = H CD-Chol<br />
R = CH3 DIMEB-Chol<br />
198,<br />
Solubilisation de vésicules<br />
de DMPC pour donner des<br />
micelles mixtes<br />
199<br />
Films noirs mixtes<br />
DIMEB-Chol/DMPC 198<br />
• HPLC<br />
HN<br />
200 • ES-MS<br />
O<br />
OAc<br />
O<br />
AcO<br />
OAc<br />
O<br />
O • RMN AcO<br />
OAc<br />
O<br />
Chol-CD-Ac<br />
1 H<br />
et 13 dp = 1<br />
Acétylation<br />
C partielle xviii<br />
• Spectroscopie à<br />
Nanocapsules rigides et<br />
corrélation de photon<br />
Propionate de<br />
monodisperses<br />
non<br />
oui<br />
• Potentiel zeta<br />
Vitamine A (PVA)<br />
(Ø ~ 100 nm)<br />
• HPLC<br />
xix<br />
xvii : Coexistence de deux phases lamellaires stables : une phase de DMPC pure (L) et une autre riche en -CD-Chol (LCD)<br />
xix : Le degré d’acétylation de la Chol-CD-Ac varie en fonction du temps de réaction : à t = 8 h, dp ~ 14, 15 et 16, à t = 24 h, dp ~ 16, 17 et 18, à t = 72 h, dp ~ 18, 19 et 20<br />
(dp = 20 correspondant au dérivé peracétylé). Le dérivé acétylé sur 14, 15 et 16 positions est celui qui permet d’obtenir les nanoparticules les plus stables.<br />
xx : Encapsulation de la vitamine A dans les nanocapsules de Chol-CD-Ac et étude de pénétration dans la peau.<br />
45
II. Relation entre structure et propriétés<br />
physico-chimiques des cyclodextrines amphiphiles<br />
II.1. Influence du degré de substitution<br />
Les cyclodextrines persubstituées par des groupements hydrophobes sur la face primaire,<br />
secondaire, ou bien sur les deux côtés ne sont en général pas solubles dans l’eau. Elles ne<br />
s’organisent pas de manière spontanée. Les deux types de systèmes organisés obtenus à partir<br />
de ces composés sont des films de Langmuir-Blodgett (monocouches ou multicouches)<br />
insolubles à l’interface air/eau et des nanoparticules. Ces systèmes sont hétérogènes. De plus,<br />
l’effondrement des chaînes sur elles-mêmes rend la cavité de ces CDs inaccessible à toute<br />
molécule invitée.<br />
Contrairement aux dérivés persubstitués, les CDs monosubstituées sont souvent solubles en<br />
milieu aqueux, dans lequel elles peuvent s’organiser spontanément (formation de micelles<br />
avec la DIMEB-Chol). Le faible degré de substitution et la solubilité dans l’eau permettent à<br />
la cavité de ces molécules d’être très accessible aux molécules organiques pour former des<br />
complexes d’inclusion.<br />
Le Rapport Hydrophilie-Lipophilie (HLB) des CDs modifiées joue un rôle très important dans<br />
leur caractère amphiphile et influence de manière considérable leurs propriétés physicochimiques<br />
(solubilité dans l’eau, type d’organisation).<br />
II.2. Influence de la nature du substituant<br />
Des substituants de nature différente ont été greffés sur les CDs. Leur caractère plus ou moins<br />
hydrophobe et leur structure influencent les propriétés d’organisation. Par exemple, dans le<br />
cas des CDs persubstituées, l’introduction de groupements dioxyde d’éthyle à la place des<br />
chaînes aliphatiques augmente le caractère amphiphile. Ainsi, Darcy et coll. arrivent à former<br />
des vésicules et même des micelles allongées à partir de dérivés persubstitués. Encore une<br />
fois, on joue sur le HLB des CDs amphiphiles pour influer sur le type d’organisation.<br />
Récemment, des auteurs ont remplacé les chaînes hydrocarbonées par des chaînes<br />
fluorocarbonées 165,201 , afin de diminuer l’hydrophobie des chaînes.<br />
46
II.3. Influence de la nature de la CD<br />
Les travaux d’Auzély et coll. illustrent très bien l’influence de la nature de la tête polaire sur<br />
les propriétés d’organisation des cyclodextrines amphiphiles. Selon que la partie<br />
cyclodextrine soit méthylée ou non, les dérivés cholestéryl-cyclodextrines ont des propriétés<br />
physico-chimiques totalement différentes. Alors que la CD-Chol est totalement insoluble<br />
dans l’eau et s’insère dans des membranes modèles de DMPC, la DIMEB-Chol se dissout<br />
spontanément pour former à très faible concentration des micelles monodisperses. Elle<br />
possède en outre de bonne propriétés détergentes vis-à-vis des vésicules de DMPC.<br />
II.4. Conclusion<br />
Il existe une étroite relation entre la structure des cyclodextrines amphiphiles et leur propriétés<br />
physico-chimiques, dépendant du degré de substitution, de la nature du substituant et de la<br />
nature de la CD. On peut noter également que la nature et la longueur de la jonction entre la<br />
CD et le substituant hydrophobe peuvent avoir une influence sur l’organisation et sur les<br />
propriétés d’inclusion.<br />
Pour pouvoir établir des relations entre la structure et les propriétés physico-chimiques des<br />
cyclodextrines amphiphiles, il est primordial de déterminer parfaitement la structure de ces<br />
composés. Il y a quelques années, les techniques de caractérisation ne permettaient pas<br />
d’élucider facilement la structure de ces macromolécules complexes (en particulier en ce qui<br />
concerne le nombre et la position des substituants greffés sur la CD). Aujourd’hui, des<br />
techniques puissantes telles que la Résonance Magnétique Nucléaire à haut champ et la<br />
Spectrométrie de Masse haute résolution sont des instruments indispensables à la<br />
caractérisation complète de cyclodextrines modifiées. Dans notre étude, nous nous appuierons<br />
grandement sur ces techniques pour caractériser nos molécules.<br />
Peu d’applications biologiques ont été décrites dans la littérature à partir des cyclodextrines<br />
amphiphiles. Les quelques exemples portent principalement sur leur capacité à transporter et<br />
faciliter le passage de principes actifs à travers les membranes cellulaires, sous forme de<br />
nanoparticules.<br />
47
1 ère PARTIE : LES PHOSPHOLIPIDYL-CYCLO<strong>DE</strong>XTRINES<br />
I. Introduction<br />
Comme il a été montré dans la partie bibliographique, une large variété de cyclodextrines<br />
modifiées a été préparée dans le but d’améliorer les propriétés de ces molécules hôtes pour la<br />
solubilisation et la vectorisation de principes actifs. Ainsi, la préparation de dérivés<br />
amphiphiles de cyclodextrines a été abordée depuis plusieurs années dans notre laboratoire.<br />
L’approche consiste à combiner les capacités de transport de systèmes organisés lipidiques<br />
(liposomes, vésicules, micelles…) à la sélectivité des CDs vis-à-vis de la taille de la molécule<br />
à transporter.<br />
Nous avons vu que de nombreuses études ont été entreprises en vue de mieux comprendre le<br />
comportement de telles molécules aussi bien au niveau de leur structure que de leur capacité à<br />
transporter des molécules invitées. Des CDs portant de multiples chaînes hydrophobes sur la<br />
face primaire, secondaire ou sur les deux faces ont été largement étudiées. Des travaux récents<br />
concernent les dérivés de cyclodextrines sur lesquelles est greffé un seul motif cholestérol<br />
avec ou sans bras espaceur 194 . En fonction de la structure du composé final, des résultats<br />
différents sont obtenus. Ainsi, seuls les composés comportant un bras espaceur s’incorporent<br />
remarquablement bien dans des structures phospholipidiques modèles. De plus, la<br />
modification des cyclodextrines par O-méthylation conduit à des structures moléculaires<br />
micellaires mono-disperses et stables qui ont pu être caractérisées au moyen de nombreuses<br />
techniques de diffusion et de RMN 196,197 .<br />
L’objectif de cette partie est l’obtention d’une série raisonnée de nouvelles cyclodextrines<br />
amphiphiles, où la partie cholestérol, de structure assez rigide, est remplacée par un<br />
phospholipide, afin d’essayer de reproduire de la façon la plus proche possible, les propriétés<br />
d’organisation des membranes naturelles. Ces nouveaux dérivés devraient permettre de mieux<br />
corréler structure chimique et propriétés physico-chimiques telles que la solubilité en milieu<br />
aqueux, et par là même de contrôler à priori leurs propriétés d’auto-organisation dans l’eau<br />
(formation de micelles avec une concentration micellaire critique la plus faible possible) ou<br />
leur incorporation dans des systèmes phospholipidiques modèles. Dans les deux cas, la<br />
présence des cavités de cyclodextrines, libres et accessibles, permettrait le transport de<br />
molécules hydrophobes par formation de complexes d’inclusion. On obtiendrait ainsi de<br />
nouvelles voies de vectorisation pour le transport de principes actifs.<br />
49
II. Synthèse des phospholipidyl-cyclodextrines<br />
II.1. Stratégie de synthèse<br />
Nous pouvons schématiser les cyclodextrines amphiphiles à élaborer de la façon suivante<br />
(figure 19) :<br />
cyclodextrine<br />
Bras espaceur<br />
groupements fonctionnels<br />
50<br />
groupement hydrophobe<br />
Figure 19 : Représentation schématique d’un modèle de cyclodextrine amphiphile.<br />
Pour obtenir une série raisonnée de ces nouveaux conjugués bifonctionnels de type CDespaceur-hydrophobe,<br />
il serait possible de jouer sur plusieurs paramètres :<br />
La nature de la cyclodextrine, ce qui induirait une modification de taille et de forme<br />
de la tête polaire. Des travaux antérieurs ont montré (sans toutefois pouvoir l’expliquer<br />
vraiment) que le type de cyclodextrine utilisé (-CD ou -CD) influençait de façon<br />
drastique le positionnement des têtes polaires les unes par rapport aux autres lors du<br />
processus d’incorporation dans des bicouches lipidiques 199 .<br />
La modification chimique des groupes hydroxyles libres de la cyclodextrine, dans<br />
le but de modifier de façon contrôlée la polarité de la CD (par exemple par<br />
O-méthylation partielle ou totale).<br />
La présence ou l’absence de bras espaceur qui semble influencer de façon<br />
extrêmement importante les propriétés d’auto-organisation ou d’incorporation des<br />
cyclodextrines amphiphiles. La nature et la longueur du bras espaceur pourront<br />
également jouer un rôle important sur les propriétés physico-chimiques des composés<br />
obtenus.
La nature du groupement hydrophobe, qui est une donnée essentielle. En effet, on<br />
peut penser que le greffage de phospholipides devrait conduire à des cyclodextrines<br />
amphiphiles solubles en milieu aqueux par formation de micelles ou de vésicules et/ou<br />
en s’incorporant dans des modèles membranaires.<br />
La stratégie que nous avons employée pour synthétiser une série de phospholipidylcyclodextrines<br />
est la suivante :<br />
Pour greffer la partie hydrophobe sur la cyclodextrine, la modification chimique des<br />
macrocycles est effectuée sur la face primaire. Ceci s’explique par le fait que la modification<br />
sélective d’un des hydroxyles primaires de la CD est chimiquement plus abordable que la<br />
modification d’un hydroxyle secondaire, notamment grâce aux propriétés nucléophiles des<br />
hydroxyles primaires. De plus, la majorité des molécules “invitées” s’incluent par le grand<br />
côté (plus favorable thermodynamiquement) du macrocycle. En fonctionnalisant le petit côté,<br />
les capacités d’accueil de la partie macrocyclique des conjugués pour des molécules invitées<br />
devraient être préservées. La jonction entre la CD et le bras espaceur d’une part et entre le<br />
bras espaceur et le phospholipide d’autre part est réalisée par la création d’une fonction amide<br />
obtenue par un couplage dérivé des méthodes utilisées en synthèse peptidique. La liaison<br />
amide présente les avantages d’être simple à former, résistante chimiquement et<br />
biocompatible.<br />
Le bras espaceur choisi est un diacide symétrique comme l’acide succinique, capable de se<br />
coupler à la cyclodextrine d’un côté et à la partie hydrophobe de l’autre par des couplages de<br />
type peptidique. Il s’agit du type d’espaceur classiquement utilisé dans notre laboratoire pour<br />
la synthèse des cyclodextrines amphiphiles monosubstituées 110,194 .<br />
Le groupement hydrophobe est un phospholipide possédant une fonction amine pour<br />
permettre le couplage. Il s’agit de la 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidyléthanolamine<br />
(DMPE), constituée de deux chaînes hydrocarbonées à 14 carbones (chaînes myristates).<br />
Cette longueur de chaîne est la plus fréquemment rencontrée dans les systèmes organisés<br />
phospholipidiques (liposomes). De plus, la fonction éthanolamine va avoir pour effet de<br />
rallonger le bras espaceur et donc, d’augmenter le degré de liberté de la molécule. Ce<br />
phénomène peut jouer un rôle important dans les propriétés d’organisation des futurs<br />
conjugués.<br />
51
En ce qui concerne la partie cyclodextrine, nous ne travaillerons que sur la famille des -CD.<br />
Nous avons voulu étudier l’influence de la modification chimique des groupements<br />
hydroxyles en préparant les conjugués phospholipidyl-cyclodextrines à partir des dérivés<br />
mono-aminés de la -CD et de ses analogues diméthylés (DIMEB) et perméthylés<br />
(TRIMEB).<br />
Le schéma rétrosynthétique suivant illustre la stratégie utilisée pour préparer les<br />
phospholipidyl-cyclodextrines (figure 20) :<br />
R 3O<br />
R 3O<br />
HN<br />
"CD-espaceur"<br />
R 3O<br />
O<br />
NH<br />
NH 2<br />
O<br />
OR2 O<br />
R3O O<br />
OH<br />
O<br />
OR2 O<br />
R3O O<br />
O<br />
O<br />
NH<br />
OR2 O<br />
R3O OR 6<br />
OR 6<br />
O<br />
OR 2<br />
O<br />
O<br />
OR 2<br />
O<br />
6<br />
6<br />
O P<br />
OR 6<br />
O-<br />
O<br />
O<br />
O H<br />
OR 2<br />
O<br />
+<br />
O<br />
O<br />
6<br />
O<br />
+H 3N<br />
O<br />
R2 = R3 = R6 = H -CD-Succ-DMPE<br />
R2 = R6 = CH3, R3 = H DIMEB-Succ-DMPE<br />
R2 = R3 = R6 = CH3 TRIMEB-Succ-DMPE<br />
R2 = R3 = R6 = H -CD-NH2 R2 = R6 = CH3 , R3 = H DIMEB-NH2 R2 = R3 = R6 = CH3 TRIMEB-NH2 52<br />
O P O-<br />
O O H<br />
Figure 20 : Schéma rétrosynthétique des phospholipidyl-cyclodextrines.<br />
O<br />
O<br />
O<br />
O
Les dérivés 6 I -amino-6 I -désoxy-cyclomaltoheptaose (-CD-NH2), 6 I -amino-6 I -désoxy-2 I -O-<br />
méthyl-hexakis(2 II-VII ,6 II-VII -di-O-méthyl)cyclomaltoheptaose (DIMEB-NH2) et 6 I -amino-6 I -<br />
désoxy-2 I ,3 I -di-O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,3 II-VII ,6 II-VII -tri-O-méthyl)cyclomaltoheptaose<br />
(TRIMEB-NH2) sont décrits dans la littérature 109,122,196 et ont déjà été synthétisés dans notre<br />
laboratoire.<br />
L’introduction du bras espaceur se fait très facilement par l’addition d’anhydride succinique<br />
sur les dérivés aminés 110 . On obtiendra alors les composés 6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxy-<br />
cyclomaltoheptaose (-CD-Succ), 6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxy-2 I -O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,6 II-<br />
VII I I I I<br />
-di-O-méthyl) cyclomaltoheptaose (DIMEB-Succ) et 6 -amidosuccinyl-6 -désoxy-2 ,3 -di-<br />
O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,3 II-VII ,6 II-VII -tri-O-méthyl) cyclomaltoheptaose (TRIMEB-Succ).<br />
Pour la préparation de ces précurseurs “CD-espaceur”, le principal challenge consistera à<br />
obtenir tous ces produits avec des rendements, une pureté et des quantités suffisantes,<br />
conditions difficiles à réaliser en chimie des cyclodextrines. Ceci impliquera d’optimiser les<br />
conditions de synthèse et de purification.<br />
L’étape finale consistera à greffer la DMPE, un phospholipide naturel, sur les macrocycles<br />
fonctionnalisés, grâce à une réaction de type peptidique. Cette dernière synthèse aboutira à<br />
une série de phospholipidyl-CDs composée de trois produits dont la nature de la partie CD<br />
varie : la 6 I -(1,2-ditétradecanoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamido)succinylamido-6 I -<br />
désoxy-cyclomaltoheptaose (-CD-Succ-DMPE), constituée d’une cyclodextrine totalement<br />
hydroxylée, et ses analogues sélectivement O-méthylés sur les positions 6 et 2, la 6 I -(1,2ditétradecanoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamido)succinylamido-6<br />
I -désoxy-2 I -O-méthylhexakis(2<br />
II-VII ,6 II-VII -di-O-méthyl)cyclomaltoheptaose (DIMEB-Succ-DMPE), et perméthylés<br />
sur toutes les positions hydroxyles, la 6 I -(1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3phosphoethalomamido)succinylamido-6<br />
I -deoxy-2 I ,3 I -di-O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,3 II-VII ,6 II-VII -<br />
tri-O-méthyl)cyclomaltoheptaose (TRIMEB-Succ-DMPE).<br />
Cette étape demandera la mise au point des conditions opératoires de couplage pour chacun<br />
des conjugués. Les solubilités des réactifs étant radicalement différentes (les CDs étant des<br />
composés polaires et le phospholipide étant apolaire), il faudra trouver un mélange réactionnel<br />
compatible. D’autre part, le couplage peptidique se faisant le plus souvent dans des conditions<br />
basiques, nous devrons tenir compte simultanément de la réactivité du couplage et de la<br />
stabilité chimique toute relative de la DMPE en milieu basique. Enfin, les conditions de<br />
purification et de caractérisation de tels composés seront à optimiser.<br />
53
II.2. Synthèse des dérivés CD-espaceur<br />
HO<br />
1<br />
4<br />
OH<br />
5<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
87 %<br />
HO<br />
OH<br />
1) PPh 3<br />
NH 4 OH 20%<br />
DMF, TA, 18 h<br />
2) Lewatit SP1080<br />
HO<br />
HO<br />
NH2<br />
O<br />
NH<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
1) TsCl<br />
H 2 O, NaOH<br />
0°C, pH = 12, 5 min.<br />
2) HCl 6N, pH = 1-2<br />
30 %<br />
Anhydride succinique 1,5 éq.<br />
DMF anhydre, TA, 5 h<br />
quantitatif<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
HO<br />
OH<br />
O<br />
HO<br />
OH<br />
OH<br />
O<br />
6<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
6<br />
6<br />
HO<br />
3<br />
HO<br />
7<br />
9<br />
HO<br />
8<br />
HO<br />
N 3<br />
2<br />
O<br />
70 %<br />
N 3<br />
75 %<br />
NH 2<br />
O<br />
HO<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
54<br />
S<br />
O<br />
HO<br />
LiN3 H2O reflux<br />
18 h<br />
60 %<br />
Me 2 SO 4<br />
Ba(OH) 2 , BaO<br />
DMF / DMSO<br />
8°C, 3 j<br />
Anh. succ. 0,9 éq.<br />
DMF anhydre, TA, 5 h<br />
quantitatif<br />
O<br />
NH<br />
O<br />
OCH3 O<br />
O<br />
OCH3 O<br />
O<br />
OCH3 O<br />
HO<br />
HO<br />
HO<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
OH<br />
OCH 3<br />
OCH3<br />
OCH 3<br />
O<br />
HO<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
OCH 3<br />
O<br />
O<br />
OCH 3<br />
O<br />
O<br />
6<br />
6<br />
OCH 3<br />
O<br />
OH<br />
6<br />
6<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
1) PPh 3<br />
NH 4 OH 20%<br />
DMF, TA, 18 h<br />
2) Lewatit SP1080<br />
OH<br />
O<br />
6<br />
H 3CO<br />
11<br />
86 %<br />
H 3CO<br />
12<br />
H 3CO<br />
13<br />
N 3<br />
NH 2<br />
MeI, NaH<br />
DMF anhydre<br />
TA, 24 h<br />
O<br />
OCH3 O<br />
H3CO O<br />
OCH3 O<br />
H3CO 90 %<br />
OCH 3<br />
OCH 3<br />
O<br />
OCH 3<br />
O<br />
O<br />
OCH 3<br />
O<br />
Anh. Succ. 1,5 éq.<br />
DMF anh., TA, 5 h<br />
quantitatif<br />
O<br />
OCH3 O<br />
H3CO 6 10 14<br />
O<br />
NH<br />
1) PPh 3<br />
NH 4 OH 20%<br />
DMF, TA, 18 h<br />
2) Lewatit SP1080<br />
Figure 21 : Schéma réactionnel pour la synthèse des dérivés “CD-espaceur” en série -CD, DIMEB,<br />
TRIMEB.<br />
OH<br />
O<br />
OCH 3<br />
O<br />
OCH 3<br />
O<br />
6<br />
6<br />
6
La première étape d’activation de la -CD 1 conduit à la modification d’un seul hydroxyle de<br />
la face primaire du macrocycle. La 6 I -(O-p-tolylsulphonyl)-6 I -désoxy-cyclomaltoheptaose 2<br />
(-CD-OTs) est obtenue avec un rendement d’environ 30 % après une recristallisation dans<br />
l’eau bouillante pour éliminer la -CD native régénérée lors de la réaction de tosylation. La<br />
pureté finale du produit est contrôlée par une analyse HPLC (µBondapak C18 ; gradient<br />
linéaire de 10 à 100 % de CH3CN dans H2O en 30 min.).<br />
La substitution nucléophile d’un anion azoture sur la -CD monotosylée 2, en milieu aqueux<br />
et à reflux, conduit au dérivé 6 I -azido-6 I -désoxy-cyclomaltoheptaose (-CD-N3) 3. Toutefois,<br />
une réaction d’hydrolyse est observée de façon concomitante à la réaction de substitution<br />
nucléophile, conduisant à la régénération d’un pourcentage non négligeable de la -CD-OTs 2<br />
en -CD naturelle. Le produit 3 n’est pas isolé à l’état pur mais sous forme d’un mélange<br />
constitué d’environ 65 % de -CD-N3 3 et de 35 % de -CD 1, selon une analyse réalisée par<br />
HPLC (figure 22). Le rendement de substitution est estimé à 60 %. L’azoture de lithium est<br />
préféré à l’azoture de sodium, car le sel de lithium généré et l’azoture de lithium en excès sont<br />
plus solubles dans l’éthanol que leurs homologues sodiques. Ils sont donc facilement éliminés<br />
lors de la précipitation du produit 3 dans l’éthanol.<br />
-CD 1<br />
-CD-N 3 3<br />
Figure 22 : Chromatogramme du produit 3 obtenu par HPLC (colonne µBondapak C18 ; élution en mode<br />
isocratique H2O / CH3CN 85 / 15 (v/v) en 15 min, débit : 1 ml.min -1 , détection : <strong>DE</strong>DL SE<strong>DE</strong>X 55<br />
(T° = 40 °C, gain = 6, pN2 = 2,1 bars)).<br />
55
La méthylation des groupements hydroxyles de la cyclodextrine se fait sur le dérivé<br />
-CD-N3 3. En fonction des conditions opératoires utilisées, la cyclodextrine peut être soit<br />
totalement méthylée sur tous ses groupements hydroxyles libres (série TRIMEB), soit<br />
sélectivement méthylée, sur tous les hydroxyles situés en position 6 et 2, sans toucher à la<br />
position 3 (série DIMEB). Ainsi, l’emploi d’une base forte (NaH) et d’un agent de<br />
méthylation puissant (MeI) en grand excès sur la -CD-N3 3 permet d’obtenir la 6 I -azido-6 I -<br />
désoxy-2 I ,3 I -di-O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,3 II-VII ,6 II-VII -tri-O-méthyl)cyclomaltoheptaose<br />
(TRIMEB-N3) 11 avec un rendement de 90 %. Par contre, dans des conditions contrôlées,<br />
c'est-à-dire en utilisant une base plus faible (Ba(OH)2, BaO) et un agent de méthylation plus<br />
doux (Me2SO4) en quantité stoechiométrique, et à température contrôlée (8°C), on obtient la<br />
6 I -azido-6 I -désoxy-2 I -O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,6 II-VII -di-O-méthyl)cyclomaltoheptaose<br />
(DIMEB-N3) 7 avec un rendement de 70 %. Les réactions de O-méthylation se font en fait à<br />
partir du mélange précédemment obtenu, c'est-à-dire en présence de la -CD-N3 3, mais aussi<br />
de -CD. En conséquence, nous obtenons à chaque fois un mélange de DIMEB-N3 7 et de<br />
DIMEB d’une part et un mélange de TRIMEB-N3 11 et de TRIMEB d’autre part (figure 23).<br />
sm015 (0.052) Cu (0.10); Is (1.00,1.00) C62H107N3O34Na2 TOF MS ES+<br />
100<br />
742.8<br />
743.3<br />
4.52e12<br />
%<br />
0<br />
sm015 (0.052) Cu (0.10); Is (1.00,1.00) C63H110O35Na2 TOF MS ES+<br />
100<br />
737.3<br />
737.8<br />
4.51e12<br />
%<br />
0<br />
sm015 9 (0.466) Cm (5:25) TOF MS ES+<br />
100<br />
737.4<br />
742.9<br />
1.86e3<br />
%<br />
737.9<br />
738.3<br />
738.8<br />
738.4<br />
738.9<br />
744.4<br />
0<br />
m/z<br />
735 736 737 738 739 740 741 742 743 744 745 746 747<br />
56<br />
743.4<br />
743.8<br />
744.3<br />
Figure 23 : Comparaison (c) du spectre de masse ESI avec détection en mode positif du produit 11 (région<br />
des ions [M+2Na] 2+ ) avec les amas isotopiques théoriques des ions [M+2Na] 2+ de (a) la TRIMEB-N3 11<br />
(m/z = 742,9) et de (b) la TRIMEB (m/z = 737,4).<br />
L’étape suivante consiste en une amination nucléophile 202 des dérivés azoturés 3, 7 et 11, en<br />
présence de triphénylphosphine et d’ammoniaque (Réaction de Staudinger). On obtient<br />
respectivement la -CD-NH2 4, la DIMEB-NH2 8 et la TRIMEB-NH2 12 avec des<br />
743.9<br />
a<br />
b<br />
c
endements moyens de 80 à 90 %. Ces produits sont isolés à l’état pur grâce à une résine<br />
échangeuse de cations (LEWATIT SP 1080, résine anionique forte) permettant d’éliminer les<br />
produits non fonctionnalisés (-CD, DIMEB et TRIMEB).<br />
Les dérivés aminés 4, 8 et 12 réagissent avec l’anhydride succinique dans le DMF pour<br />
former quantitativement les dérivés mono-amidosuccinyl correspondants (-CD-Succ 5,<br />
DIMEB-Succ 9 et TRIMEB-Succ 13).<br />
Dans le cas des dérivés de la -CD 5 et de la TRIMEB 13, on travaille avec un excès<br />
d’anhydride succinique. 5 est isolé par précipitation dans l’acétone. 13 est dissout dans le<br />
chloroforme, et l’acide succinique insoluble (généré par l’hydrolyse de l’anhydride succinique<br />
en excès) est filtré sur un filtre en téflon (PTFE 0,22 µm). Dans le cas de la DIMEB-Succ 9,<br />
on utilise un léger excès de DIMEB-NH2 8. 9 est alors purifié sur une colonne échangeuse<br />
d’ions (LEWATIT SP 1080, résine anionique forte) pour éliminer l’excès de 8, retenu par la<br />
colonne sous forme d’ion ammonium.<br />
Les dérivés “CD-espaceur” 5, 9 et 13 sont caractérisés par RMN haut champ et par<br />
spectrométrie de masse basse résolution (ESI-MS)<br />
II.3. Etape de couplage entre CD-espaceur et DMPE<br />
II.3.1. Optimisation des conditions opératoires du couplage<br />
Les dérivés 5, 9 et 13 possèdent une fonction acide carboxylique adéquate pour effectuer un<br />
couplage de type peptidique sur la fonction amine portée par la DMPE.<br />
Afin d’améliorer les rendements de couplage entre les deux protagonistes, nous avons choisi<br />
d’activer l’acide carboxylique des précurseurs CD-espaceur en formant un ester de<br />
N-hydroxysuccinimide, beaucoup plus réactif. Cette réaction est conduite dans le DMF<br />
anhydre en présence d’un agent de couplage, le diisopropylcarbodiimide (DIC) et du Nhydroxysuccinimide<br />
(NHS). Le phospholipide est mis en solution dans du CHCl3 anhydre, en<br />
présence d’une base, la triéthylamine (Et3N), avant d’être ajouté à la cyclodextrine activée. La<br />
présence de cette base a pour but de transformer le groupement ammonium tertiaire de la<br />
DMPE, initialement sous forme d’un zwitterion, en une fonction amine primaire, beaucoup<br />
plus réactive. La réaction se fait donc dans un milieu DMF / CHCl3.<br />
57
Les conditions opératoires de couplage (stoechiométrie, temps, température, nature et quantité<br />
de base, solvants) ont été optimisées pour chacun des trois conjugués synthétisés. Les<br />
tableaux 1, 2 et 3 représentent les différents essais de couplage réalisés pour synthétiser la -<br />
CD-Succ-DMPE 6 (tableau 2), la DIMEB-Succ-DMPE 10 (tableau 3) et la TRIMEB-Succ-<br />
DMPE 14 (tableau 4).<br />
Pour chaque essai de couplage, les réactions ont été suivies par CCM et les produits<br />
finalement obtenus contrôlés par spectrométrie de masse (ESI-MS). A partir des résultats<br />
obtenus, nous avons pu étudier l’influence de plusieurs paramètres.<br />
58
Tableau 2 : Optimisation de la synthèse de la -CD-Succ-DMPE 6.<br />
Identification<br />
du produit<br />
Réactifs : stoechiométrie<br />
Rdt<br />
Méthode de<br />
purification<br />
Solvant T° tps<br />
Base<br />
(Base/DMPE<br />
n/n)<br />
DMPE DIC NHS<br />
CD-Succ<br />
5<br />
1,2 1 1,2 1,2 iPr2NEt (10/1) DMF / CHCl3 2/1 v/v 50 °C 72 h HPLC 26 % dégradé<br />
1 1,2 1,2 1,2 iPr2NEt (1/1) DMF / CHCl3 1/2 v/v TA 72 h HPLC 7 % non<br />
1 1,2 1,5 1,5 Et3N (1,5/1) DMF / CHCl3 1/1 v/v 45 °C 24 h HPLC 15 % oui<br />
Tableau 3 : Optimisation de la synthèse de la DIMEB-Succ-DMPE 10.<br />
Réactifs : stoechiométrie<br />
Identification<br />
du produit<br />
Rdt<br />
Méthode de<br />
purification<br />
Solvant T° tps<br />
Base<br />
(Base/DMPE<br />
n/n)<br />
DIC /<br />
NHS<br />
DMPE<br />
CD-Succ<br />
9<br />
Anh.<br />
Succ.<br />
CD-NH2<br />
8<br />
1,2 1 1,5 / 1,5 iPr2NEt (10/1) DMF / CHCl3 1/1 v/v 50 °C 72 h HPLC dégradé<br />
1,2 1 1,5 / 1,5 iPr2NEt (1/1) DMF / CHCl3 1/2 v/v 40 °C 72 h HPLC 40 % oui<br />
1,2 1,5 / 1,5 iPr2NEt (1/1) DMF / CHCl3 1/2 v/v 35 °C 72 h HPLC 60 % oui<br />
1 1 1<br />
“in situ”<br />
57 % ii oui<br />
colonne de<br />
silice<br />
1 1 1<br />
“in situ” i 1,2 1,5 / 1,5 Et3N (1,1/1) DMF / CHCl3 1/4 v/v 35 °C 24 h<br />
i : Un équivalent du réactif 9 est obtenu “in situ” par réaction d’un équivalent de DIMEB-NH2 8 avec un équivalent d’anhydride succinique sans<br />
purification intermédiaire.<br />
ii : Rendement obtenu sur deux étapes à partir de la DIMEB-NH2 8<br />
59
Tableau 4 : Optimisation de la synthèse de la TRIMEB-Succ-DMPE 14.<br />
Identification<br />
du produit<br />
Réactifs : stoechiométrie<br />
Rdt<br />
Méthode de<br />
purification<br />
Solvant T° tps<br />
Base<br />
(Base/DMPE<br />
n/n)<br />
DMPE DIC NHS<br />
CD-Succ<br />
13<br />
1 1 1,5 1,5 non DMF / CHCl3 1/2 v/v TA 24 h 0 % non<br />
1 1 1,5 1,5 non DMF / CHCl3 1/2 v/v 50 °C 72 h 0 % non<br />
1,2 1 1,5 1,5 iPr2NEt (10/1) DMF / CHCl3 1/2 v/v TA 72 h HPLC 70 % dégradé<br />
1,2 1 1,5 1,5 iPr2NEt (1/1) DMF / CHCl3 1/2 v/v TA 72 h HPLC 50 % oui<br />
72 % oui<br />
colonne de<br />
silice<br />
1 1,2 1,5 1,5 Et3N (1,1/1) DMF / CHCl3 1/4 v/v 35 °C 24 h<br />
60
II.3.1.1. Importance du rôle de la base<br />
En l’absence d’une base, la réaction de couplage ne s’amorce pas. Le groupement ammonium<br />
tertiaire du phospholipide n’est pas assez réactif pour réagir sur l’ester activé de la partie<br />
cyclodextrine.<br />
En présence d’un grand excès de base (environ 10 équivalents de DMPE), le couplage a lieu<br />
avec, en général, de bons rendements mais les produits résultants sont dégradés. Le spectre de<br />
masse de la DIMEB-Succ-DMPE 10, obtenue dans ces conditions de couplage<br />
(DMPE / iPr2NEt 1/10 (n/n)), est représenté figure 24.<br />
sm23_qend1 18 (1.006) TOF MS ES-<br />
100<br />
2032.1<br />
751<br />
%<br />
0<br />
363.2 1611.7<br />
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800<br />
m/z<br />
3000<br />
Figure 24 : Spectre de masse ESI de la DIMEB-Succ-DMPE 10 avec détection en mode négatif (ion [M] - ),<br />
obtenu dans des conditions de couplage avec un excès de base.<br />
La coexistence de trois composés différents est observée : le composé 10 attendu à<br />
m/z = 2032,1 [M] - , et deux composés secondaires à m/z = 1821,9 correspondant au dérivé<br />
avec une seule chaîne myristate (-C14H26O), et à m/z = 1611,7 correspondant au dérivé<br />
dépourvu de ses deux chaînes grasses (-2 C14H26O). Ce phénomène est également observé<br />
pour la -CD-Succ-DMPE 6 et la TRIMEB-Succ-DMPE 14 (dans des conditions analogues<br />
de couplage, données non montrées). Il correspond à la saponification des esters d’acide gras<br />
des phospholipidyl-cyclodextrines.<br />
61<br />
1821.9
Cette observation nous a conduit à utiliser un milieu réactionnel moins basique pour éviter<br />
cette hydrolyse. Nous avons finalement choisi de mettre un peu plus d’un équivalent de base<br />
pour un équivalent de DMPE (1,1 éq. pour 10 et 14, 1,5 éq. pour 6).<br />
Notons que nous avons tout d’abord utilisé la diisopropyléthylamine qui est une base moins<br />
réactive que la triéthylamine en raison de ses groupements plus encombrés pour réduire au<br />
maximum les risques d’hydrolyse. Toutefois, le type de base utilisé ne s’est pas avéré<br />
déterminant et nous avons finalement décidé d’employer Et3N.<br />
II.3.1.2. Influence de la nature de la cyclodextrine<br />
La nature de la cyclodextrine (hydroxylée ou méthylée) a une influence considérable sur les<br />
conditions opératoires et sur l’efficacité de la réaction de couplage.<br />
Comme nous l’avons vu dans la partie bibliographique, la méthylation des cyclodextrines<br />
améliore fortement leur solubilité dans des solvants organiques variés. Ainsi, les dérivés<br />
méthylés sont solubles dans les solvants chlorés, contrairement aux CDs naturelles.<br />
Dans notre cas, le couplage a lieu dans un mélange DMF / CHCl3. En effet, les<br />
mono-amidosuccinyl-CD 5, 9 et 13 sont d’abord activés efficacement dans le DMF. Quand à<br />
la DMPE, elle est soluble dans très peu de solvants. En général, les phospholipides sont<br />
dissous dans un mélange CHCl3 / MeOH 9/1 ou 4/1 (v/v). Or, le méthanol est un solvant<br />
protique susceptible de réagir avec l’ester activé des dérivés CD-espaceur pour former un<br />
ester méthylé comme produit secondaire lors du couplage peptidique. La DMPE est donc<br />
solubilisée dans le chloroforme seul, bien que la solubilité soit médiocre.<br />
Dans le cas de la synthèse de la DIMEB-Succ-DMPE 10 et de la TRIMEB-Succ-DMPE 14, le<br />
couplage s’effectue facilement avec un excès de chloroforme (milieu réactionnel :<br />
CHCl3 / DMF 4/1 (v/v)), tous les réactifs ainsi que les produits de couplage étant solubles<br />
dans ce solvant.<br />
Il est beaucoup plus difficile de coupler la -CD-Succ 5 avec la DMPE. En effet, la CD<br />
naturelle n’est pas soluble dans le CHCl3 alors que la DMPE est insoluble dans le DMF. De<br />
plus, nous n’avons pas trouvé de solvant compatible pour les deux protagonistes. Nous avons<br />
donc décidé de nous placer dans un milieu CHCl3 / DMF 1/1 (v/v), en forçant les conditions<br />
de température (45 °C au lieu de 35 °C pour la synthèse des dérivés méthylés 10 et 14), sans<br />
62
altérer le phospholipide. Cette méthode permet d’obtenir la -CD-Succ-DMPE 6 avec<br />
toutefois un rendement beaucoup plus faible que celui des homologues méthylés.<br />
Enfin, notons que la purification de la DIMEB-Succ 9 est plus difficile que celle des<br />
analogues -CD 5 et TRIMEB 13, et conduit à des rendements légèrement moins élevés<br />
(80 % pour 9 au lieu de 95 à 99 % pour 5 et 13). Pour augmenter le rendement final de la<br />
synthèse de la DIMEB-Succ-DMPE 10, le réactif 9 a donc été généré “in situ” à partir du<br />
dérivé amino 8.<br />
Le schéma réactionnel de l’étape de couplage entre les adduits CD-espaceur et la DMPE dans<br />
les conditions opératoires optimisées est représenté figure 25 :<br />
-CD-Succ-DMPE 6<br />
HO<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
HO<br />
5<br />
DIMEB-Succ-DMPE 10<br />
HO<br />
O<br />
NH<br />
OH<br />
O<br />
9<br />
OCH 3<br />
TRIMEB-Succ-DMPE 14<br />
H 3CO<br />
NH 2<br />
O<br />
NH<br />
O<br />
OCH3 O<br />
HO<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
OCH3 O<br />
H3CO OCH 3<br />
OCH3<br />
O<br />
OH<br />
O 6<br />
O<br />
OCH 3<br />
O<br />
O<br />
OCH 3<br />
O<br />
6<br />
6<br />
1- DIC 1,5 éq., NHS 1,5 éq.<br />
DMF anhydre, TA, 2 h<br />
2- DMPE 1,2 éq., Et 3N (1,6 éq.)<br />
CHCl 3 anhydre<br />
45 °C, 24 h<br />
15 %<br />
1- anhydride succinique 1 éq.<br />
DMF anhydre, TA, 5 h<br />
2- DIC 1,5 éq., NHS 1,5 éq.<br />
DMF anhydre, TA, 2 h<br />
3- DMPE 1,2 éq., Et 3N (1,3 éq)<br />
CHCl 3 anhydre<br />
35 °C, 24 h<br />
57 %<br />
1- DIC 1,5 éq., NHS 1,5 éq.<br />
DMF anhydre, TA, 2 h<br />
2- DMPE 1,2 éq., Et 3 N (1,3 éq.)<br />
CHCl 3 anhydre<br />
35 °C, 24 h<br />
72 %<br />
13 14<br />
63<br />
HO<br />
HO<br />
H 3CO<br />
NH<br />
O<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
HO<br />
NH<br />
O<br />
O<br />
O<br />
6<br />
NH<br />
NH<br />
OCH3 O<br />
HO<br />
NH<br />
O<br />
O<br />
10<br />
O<br />
NH<br />
OCH3<br />
O<br />
H3CO O P O H<br />
OH<br />
O<br />
O-<br />
O<br />
OH<br />
O 6<br />
O P O H<br />
OCH 3<br />
O<br />
O-<br />
O<br />
OCH 3<br />
O<br />
O<br />
6<br />
O<br />
O<br />
O<br />
O<br />
O P O H<br />
Figure 25 : Schéma réactionnel pour la synthèse des phospholipidyl-cyclodextrines 6, 10 et 14.<br />
OCH 3<br />
O-<br />
O<br />
OCH 3<br />
O<br />
6<br />
O<br />
O<br />
O<br />
O<br />
O<br />
O<br />
O<br />
O
II.3.2. Purification des conjugués phospholipidyl-cyclodextrines<br />
La -CD-Succ-DMPE 6 est purifiée par HPLC sur une colonne semi-préparative à polarité de<br />
phase normale (colonne µPorasil WATERS 10µm 125 Å, cartouche Radial-Pak<br />
2 × 25 mm × 100 mm précédée d’une cartouche de garde) en utilisant comme éluant le<br />
mélange suivant : A = CH3OH, B = CHCl3 / CH3OH / NH3 20 % 80/19,5/0,5 (v/v/v), A / B<br />
10/90 (v/v), en mode isocratique. Le détecteur est un <strong>DE</strong>DL (Détecteur Evaporatif à Diffusion<br />
de Lumière) 203 . Ce mode de détection est approprié dans le cas de produits non volatils qui ne<br />
présentent pas de bande d’absorption dans le domaine de l’UV ou du visible tels que les<br />
oligosaccharides par exemple.<br />
Les analogues méthylés DIMEB-Succ-DMPE 10 et TRIMEB-Succ-DMPE 14 sont purifiés<br />
grâce à une colonne chromatographique sur silice (gel de silice 60 FLUKA, 220 - 440 mesh<br />
ASTM). Les produits sont élués dans un mélange CHCl3 / MeOH.<br />
64
III. Caractérisation structurale des phospholipidyl-CDs<br />
Afin de caractériser la structure de chacun des dérivés phospholipidyl-cyclodextrines<br />
synthétisés, nous avons eu recours à des expériences de RMN proton et carbone, mono et<br />
bidimensionnelles. Une étude par spectrométrie de masse à basse et haute résolution a<br />
également été réalisée pour compléter l’analyse de ces conjugués.<br />
III.1. Analyse structurale des composés par RMN haut champ<br />
Dans un premier temps, les spectres proton et carbone à une dimension de la -CD-Succ-<br />
DMPE 6, de la DIMEB-Succ-DMPE 10 et de la TRIMEB-Succ-DMPE 14 ont été réalisés<br />
respectivement dans la pyridine (pyr-D5) pour 6 et dans le chloroforme (CDCl3) pour 10 et<br />
14. Mais, les seules expériences RMN 1D ne suffisent pas pour effectuer l’attribution<br />
complète de la centaine de protons (respectivement 138, 164 et 178 pour 6, 10 et 14) et des<br />
nombreux signaux 13 C des phospholipidyl-cyclodextrines. De plus, il faut souligner que les<br />
protons des unités glucoses de la partie cyclodextrine sont inéquivalents en raison de la perte<br />
de symétrie de la CD provoquée par la monosubstitution. Ils ont donc tous un déplacement<br />
chimique différent, ce qui explique l’étalement des signaux de la partie saccharidique sur les<br />
spectres 1 H (figure 27).<br />
Pour réaliser l’attribution des spectres RMN 1 H et 13 C des phospholipidyl-cyclodextrines,<br />
nous avons donc eu recours à la RMN bidimensionnelle. La stratégie générale employée est la<br />
suivante (figure 26) :<br />
Attribution des signaux protons et carbones : COSY, COSY relayés, <strong>DE</strong>PT, HMQC,<br />
Séquençage de la molécule : HMBC, NOESY / ROESY.<br />
Il va être possible de relier tous les déplacements chimiques des signaux 1 H et 13 C des<br />
molécules étudiées à partir de ces expériences RMN. Celles-ci nous fournissent de précieuses<br />
informations sur les couplages scalaires entre les protons (COSY, COSY relayés) et entre les<br />
protons et les carbones (HMQC, HMBC), ainsi que des informations sur les proximités<br />
spatiales entre les protons via les couplages dipolaires (NOESY / ROESY).<br />
65
RO<br />
NH<br />
O<br />
O<br />
O<br />
OR<br />
O<br />
NH<br />
RO<br />
OR<br />
O P<br />
O<br />
O-<br />
O<br />
OR<br />
O<br />
O H<br />
6<br />
O<br />
O<br />
66<br />
O<br />
O<br />
COSY<br />
NOESY / ROESY<br />
HMBC<br />
Figure 26 : stratégie générale pour l’analyse structurale par RMN.<br />
Cette stratégie a permis la caractérisation RMN 1 H et 13 C des trois molécules 6, 10 et 14<br />
(cf. partie expérimentale). L’illustration sera faite sur l’exemple de la -CD-Succ-DMPE 6.<br />
III.1.1. Attribution du spectre proton de la -CD-Succ-DMPE 6<br />
Sur le spectre RMN 1 H monodimensionnel du composé 6, enregistré à 298 K dans la pyridine<br />
deutériée, en présence de 20 µL de D2O pour échanger les protons labiles des groupements<br />
hydroxyles, certains signaux peuvent être facilement repérés (figure 27) :<br />
Les signaux des protons anomères H-1 des unités glucoses de la CD. Ils sont plus<br />
déblindés que les autres protons de la structure saccharidique, en raison de<br />
l’électronégativité des atomes d’oxygène en position qui réduisent très sensiblement<br />
la densité électronique au niveau du proton acétalique ;<br />
les deux protons amides issus des couplages entre la CD et l’espaceur (NHCD) et entre<br />
l’espaceur et le phospholipide (NHDMPE) qui se situent vers les champs faibles<br />
(8,5 - 9 ppm) ;<br />
les groupements méthyle terminaux des chaînes grasses myristates du phospholipide<br />
(H-14 et H-14) qui forment un triplet caractéristique dans les champs forts ;<br />
le CH du motif glycérol du phospholipide (H-), situé dans la même zone que les<br />
protons anomères de la CD.
O<br />
1<br />
O<br />
H O<br />
NH<br />
<br />
<br />
O<br />
P<br />
O<br />
O- <br />
<br />
<br />
O<br />
1<br />
O c d<br />
O<br />
a b O<br />
NH<br />
4<br />
6<br />
5<br />
O<br />
OH<br />
HO<br />
3<br />
2<br />
OH 1<br />
O 4<br />
HO<br />
6<br />
5<br />
3<br />
O<br />
2<br />
OH<br />
1<br />
O<br />
6<br />
NH amides<br />
H-<br />
8.8 ppm 5.6 5.4 ppm ppm<br />
9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 ppm<br />
67<br />
H-1<br />
14<br />
14<br />
Me H-14 / H-14<br />
Figure 27 : Spectre RMN 1 H de la -CD-Succ-DMPE 6 (500,13 MHz, 25 mM, pyr-d5, 298 K).<br />
Ces repères vont servir de point de départ pour attribuer plus en détail le spectre. Pour cela,<br />
plusieurs types d’expériences RMN bidimensionnelles complémentaires sont utilisées.<br />
L’expérience COSY 204,205 (COrrelation SpectroscopY) homonucléaire 1 H- 1 H exprime les<br />
couplages scalaires entre deux protons voisins (couplages géminaux et viscinaux) grâce à un<br />
transfert d’aimantation entre les spins. Les séquences COSY relayés 206 permettent de pousser<br />
plus loin l’aimantation en poursuivant les transferts de polarisation via les couplages scalaires.<br />
Elles permettent d’exprimer les couplages scalaires à plus longue distance.<br />
Ces expériences vont permettre d’attribuer les signaux des protons H-1 à H-6 portés par les<br />
unités glucose de la CD selon la stratégie schématisée en figure 28 :<br />
HO<br />
H<br />
4<br />
3<br />
H<br />
6<br />
OH<br />
5<br />
H<br />
H<br />
2<br />
O<br />
OH<br />
1<br />
O<br />
H<br />
n<br />
COSY<br />
COSY simple relais<br />
COSY double relais<br />
COSY triple relais<br />
Figure 28 : Stratégie générale pour l’attribution RMN des signaux des protons des unités glucose de la<br />
partie cyclodextrine.
Ainsi, en considérant la zone de déplacement chimique des protons anomères, la carte du<br />
COSY fait apparaître des tâches de corrélation scalaire entre les protons H-1 et les protons<br />
H-2 de la CD (figure 29 a).<br />
La carte du COSY simple relais offre une information supplémentaire. L’aimantation est<br />
transférée du proton H-1 vers le proton H-2, puis de H-2 vers H-3. Nous observons donc des<br />
tâches de corrélation scalaire entre les protons H-1, H-2 et H-3 de la CD (figure 29 b).<br />
De même, la carte du COSY double relais fait apparaître les corrélations scalaires entre les<br />
protons H-1, H-2, H-3 et H-4 de la CD (figure 29 c). Une tâche correspondant au déplacement<br />
chimique de H-5 apparaît en plus sur la carte du COSY triple relais (figure 29 d).<br />
(a)<br />
(b)<br />
(c)<br />
(d)<br />
ppm<br />
5.5<br />
ppm<br />
5.5<br />
ppm<br />
5.5<br />
ppm<br />
5.5<br />
H- H-’ H-<br />
4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 ppm<br />
H-3<br />
4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 ppm<br />
H-3 H-4<br />
4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 ppm<br />
H-3 H-5 H-4<br />
4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 ppm<br />
68<br />
H-2<br />
H-2<br />
H-2<br />
H-2<br />
H-1<br />
H-<br />
Figure 29 : Contours partiels des cartes (a) COSY, (b) COSY simple relais, (c) COSY double relais et<br />
(d) COSY triple relais du composé 6 (500,13 MHz, 25 mM, pyr-d5, 298 K).<br />
H-1<br />
H-1<br />
H-1
La séquence COSY quadruple relais n’est pas utilisée pour l’attribution des signaux des<br />
protons H-6 et H-6’. En effet, on observe une baisse de sensibilité quand on augmente le<br />
nombre de transferts, car d’une part, toute l’aimantation issue de H-1 est diluée<br />
progressivement sur l’ensemble des spins, et d’autre part, les temps de transfert deviennent de<br />
plus en plus longs et non négligeables devant le temps de relaxation transversale, conduisant à<br />
des pertes importantes de signal par relaxation en T2. Toutefois, la plupart du temps, les<br />
signaux des protons H-6 et H-6’ peuvent être attribués à partir de la carte COSY grâce à<br />
déplacement chimique de H-5 (figure 30).<br />
ppm<br />
4.0<br />
4.1<br />
4.2<br />
4.3<br />
4.4<br />
4.5<br />
4.6<br />
4.7<br />
4.8<br />
H-5 / H-6<br />
4.7 4.6 4.5 4.4 4.3 4.2 4.1 ppm<br />
69<br />
H-5<br />
H-5 / H-6’<br />
H-4 / H-5<br />
Figure 30 : Contours partiels de la carte COSY du composé 6 (500,13 MHz, 25 mM, pyr-d5, 298 K).<br />
De la même manière, les signaux des protons de la partie phospholipide sont attribués grâce<br />
aux cartes COSY et COSY relayés (figures 31 et 29 a).
(a)<br />
(b)<br />
ppm<br />
ppm<br />
3<br />
4<br />
4<br />
NH DMPE NHCD<br />
H-<br />
H-<br />
H-<br />
H-6’ <br />
H-6 <br />
H-6’ <br />
H-6 <br />
H-5 I<br />
ppm<br />
1.0<br />
1.5<br />
2.0<br />
O<br />
1<br />
O<br />
H O<br />
NH<br />
<br />
<br />
O<br />
P<br />
O<br />
O- <br />
<br />
<br />
O<br />
1<br />
O c d<br />
O<br />
a b O<br />
NH<br />
4<br />
HO<br />
6<br />
5<br />
3<br />
O<br />
2<br />
OH 1<br />
O<br />
OH<br />
6<br />
4<br />
5<br />
O<br />
HO<br />
3<br />
2<br />
OH<br />
1<br />
O<br />
H-2 / H-3<br />
H-2 / H-3<br />
H-2, H-2<br />
2.5<br />
2.6 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 ppm<br />
70<br />
6<br />
H-3 / H-4<br />
H-3 / H-4<br />
H-4 à H-13,<br />
H-4 à H-13<br />
H-3, H-3<br />
H-13 / H-14<br />
H-13 / H-14<br />
14<br />
14<br />
H-14, H-14<br />
Figure 31 : Contours partiels des cartes (a) et (c) COSY et (b) COSY simple relais du composé 6<br />
(500,13 MHz, 25 mM, pyr-d5, 298 K).<br />
Il est possible de différencier les protons de l’unité glucosidique substituée des protons portés<br />
par les six autres unités. En partant du proton amide porté par la cyclodextrine (NHCD), les<br />
cartes COSY et COSY relayés permettent d’attribuer H-6 I et H-6’ I (COSY), H-5 I (COSY<br />
simple relais) et ainsi de suite jusqu’à H-1 I (figure 30). Nous verrons un exemple de<br />
l’attribution complète de l’unité saccharidique substituée ultérieurement.<br />
III.1.2. Attribution du spectre carbone de la -CD-Succ-DMPE 6<br />
Le spectre RMN 13 C découplé proton du composé 6, enregistré dans la pyridine deutériée<br />
(+ 20 µL de D2O) à 298 K est présenté figure 32.<br />
(c)
160 140 120 100 80 60 40 20 ppm<br />
Figure 32 : Spectre RMN 13 C de la -CD-Succ-DMPE 6 (125,77 MHz, 25 mM, pyr-d5, 298 K).<br />
De la même manière que pour le spectre 1 H, l’attribution du spectre 13 C nécessite l’utilisation<br />
de la RMN 2D.<br />
Le 13 C possède une faible abondance naturelle (1 %) et un rapport gyromagnétique quatre fois<br />
plus faible que celui du proton. Par conséquent, la sensibilité d’observation du 13 C est<br />
beaucoup plus faible et un bon rapport signal sur bruit nécessite de long temps d’acquisition.<br />
Pour augmenter la sensibilité d’observation, on utilise souvent des méthodes basées sur le<br />
principe du transfert de polarisation. Il permet de transférer les propriétés magnétiques des<br />
protons au carbone qui leur est couplé ( 1 JC-H), ce qui permet en première approximation<br />
d’augmenter la sensibilité d’observation du 13 C d’un facteur 4.<br />
La séquence HMQC 207 (Heteronuclear Multiple Quantum Correlation) a été utilisée pour<br />
l’attribution complète des signaux 13 C. Celle-ci est effectuée à partir des tâches de corrélation<br />
hétéronucléaire via les couplages 1 JC-H. Cette séquence va permettre d’attribuer sans<br />
ambiguïté les carbones, à partir des protons qui leurs sont liés scalairement et qui ont été<br />
précédemment attribués.<br />
Le grand intérêt de cette séquence est que le mode de détection est inversé par rapport à une<br />
séquence classique de corrélation 13 C- 1 H (HETCOR). Avec la séquence HETCOR, le<br />
71
transfert d’aimantation s’effectue entre les protons et les carbones et la détection se fait sur le<br />
carbone. Le transfert de polarisation rend observable l’aimantation des carbones détectés avec<br />
la sensibilité des protons. Le gain d’intensité en 13 C est d’un facteur 4 (soit le rapport<br />
gyromagnétique H / C). En détection inverse (HMQC), on utilise le proton à la fois comme<br />
initiateur du transfert d’aimantation hétéronucléaire et comme noyau observé. La sensibilité<br />
de détection est nettement améliorée et les temps d’acquisition beaucoup plus courts qu’avec<br />
une séquence classique.<br />
ppm<br />
60<br />
80<br />
100<br />
H-1/C-1<br />
ppm<br />
60<br />
70<br />
80<br />
90<br />
5.5 5.0 4.5 4.0 ppm<br />
H-6 / C-6<br />
H-3 / C-3<br />
4.7 4.6 4.5 4.4 4.3 4.2 4.1 4.0 3.9 3.8 ppm<br />
72<br />
H-6’ / C-6<br />
H-5 / C-5<br />
H- / C-<br />
H-4 / C-4<br />
H-2 / C-2<br />
H-4 I / C-4 I<br />
Figure 33 : Contours partiels de la carte HMQC du composé 6 (500,13 MHz, 25 mM, pyr-d5, 298 K).<br />
Par exemple, les signaux carbones C-1 à C-6 des unités glucose de la cyclodextrine sont<br />
facilement caractérisés à partir des signaux protons H-1 à H-6, dont les déplacements<br />
chimiques sont connus (cf. attribution du spectre proton), via les taches de corrélations<br />
hétéronucléaires (figure 33).
Par ailleurs, Bengsch et coll. 208 ont mis en évidence que l’ordre de déplacement chimique des<br />
signaux 13 C des acides gras saturés suivent une règle empirique générale qui est schématisée<br />
par la représentation pyramidale ci-dessous (figure 34).<br />
Figure 34 : Pyramide de l’ordre de déplacement chimique des signaux RMN 13 C d’acides gras saturés.<br />
De manière surprenante, on s’aperçoit que le déplacement chimique des signaux RMN 13 C<br />
des acides gras aliphatiques suit un ordre systématique, qui ne correspond pas à l’ordre<br />
d’enchaînement des carbones sur la chaîne.<br />
Les expériences d’attribution ont permis de vérifier que cette règle s’applique aux signaux 13 C<br />
des esters d’acide gras de la partie phospholipidique des conjugués phospholipidylcyclodextrines<br />
(figure 35).<br />
73
(a)<br />
C-2<br />
35<br />
C-12<br />
C-4 C-11<br />
30<br />
C-3<br />
25<br />
C-13<br />
ppm<br />
15<br />
20<br />
25<br />
30<br />
35<br />
20<br />
HMQC<br />
C-2 / H-2<br />
2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 ppm<br />
74<br />
C-14<br />
15<br />
C-3 / H-3<br />
10<br />
C-14 / H-14<br />
C-13 / H-13<br />
C-12 / H-12<br />
Figure 35 : (a) spectre RMN 13 C partiel du composé 6 (125,77 MHz, 25 mM, pyr-d5, 298 K) et (b) contours<br />
partiels de la carte HMQC (500,13 MHz, 25 mM, pyr-d5, 298 K). Région des signaux carbones et protons<br />
des chaines hydrocarbonées.<br />
III.1.3. Séquençage de la molécule<br />
La séquence RMN bidimensionnelle NOESY 209 (Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY),<br />
permet d'étudier la relaxation spin-réseau longitudinale simultanément pour tous les protons<br />
présents dans une molécule. On peut, en utilisant cette séquence, mettre en évidence des<br />
proximités spatiales inter-nucléaires (< 5 Å). Ces noyaux peuvent être portés par la même<br />
molécule, ou bien, par deux molécules différentes.<br />
En fonction du champ de fréquence de l’appareil RMN (0, Fréquence de Larmor) et du<br />
temps de corrélation de la molécule observée (C), l’effet Overhauser (effet NOE) peut-être<br />
positif, négatif ou nul (figure 36). Lorsque 0C 1, alors, l’effet NOE est proche de zéro et<br />
aucun signal dipolaire n’est observé sur la carte NOESY, même si la distance entre deux<br />
protons est inférieure à 5 Å.<br />
(b)
Figure 36 : Intensité de l'effet NOE maximal en fonction de log (c).<br />
Cet inconvénient de la séquence NOESY peut néanmoins être contourné en utilisant la<br />
séquence ROESY 210 (Rotating frame Overhauser Effect SpectroscopY). Cette expérience<br />
présente l’avantage d’avoir un effet Overhauser (effet ROE) toujours positif quelque soit la<br />
valeur de 0C (figure 37).<br />
Figure 37 : Effet Overhauser nucléaire maximal dans le cas du ROESY en fonction de log (0c).<br />
Malheureusement, l’expérience ROESY possède un défaut lié à sa séquence d’impulsions. En<br />
effet, l'application d'un champ radiofréquence durant la période de mélange rend cette<br />
séquence très similaire à la séquence TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY), bien que les<br />
puissances de champ mises en jeu ne soient pas du même ordre de grandeur, et que le cycle de<br />
phase soit différent. Aussi, observe-t-on, en plus des signaux ROE, des signaux de corrélation<br />
scalaire dus à l’effet de transfert Hartmann-Hahn (HOHAHA) 211,212 . Ce phénomène (dit ROErelais<br />
ou relais-ROE) est plus particulièrement observé pour les dérivés glucidiques.<br />
Des séquences plus récentes, nommées ROESY hors résonance 213,214 et T-ROESY 215,216<br />
(Tranverse ROESY) sont deux approches destinées à améliorer la séquence ROESY de base.<br />
75
Elles diffèrent dans leurs approches conceptuelles, mais visent toutes les deux à diminuer les<br />
contributions TOCSY inhérentes à la séquence de base du ROESY.<br />
Pour étudier les proximités spatiales entre les différents protons des phospholipidylcyclodextrines,<br />
nous avons choisi d’utiliser l’expérience T-ROESY. Cette expérience va nous<br />
permettre de relier les différentes parties de la molécule les unes aux autres : la CD au bras<br />
espaceur et le bras espaceur au phospholipide via les couplages dipolaires (figure 38).<br />
ppm<br />
8.65<br />
8.70<br />
8.75<br />
8.80<br />
5 I<br />
6 I 6’ I<br />
4 I<br />
H- H-<br />
4.4 4.2 4.0 3.8 3.6 3.4 3.2 3.0 2.8 2.6 ppm<br />
76<br />
H-Succ<br />
H-Succ<br />
Couplages dipolaires<br />
H<br />
NH<br />
4<br />
HO<br />
6<br />
H O<br />
5<br />
2<br />
3 H OH 1<br />
H<br />
H O<br />
CD<br />
NH CD<br />
O<br />
NH DMPE<br />
O<br />
NH<br />
bras<br />
espaceur<br />
<br />
O O<br />
P<br />
O<br />
O<br />
Figure 38 : Contours partiels de la carte T-ROESY du composé 6 (500,13 MHz, 25 mM, pyr-d5, 298 K,<br />
tm = 300 ms).<br />
<br />
DMPE<br />
La séquence HMBC (Heteronuclear Multiple Bound Correlation) exprime les couplages<br />
scalaires à longue distance entre les carbones et les protons portés par un atome voisin. Cette<br />
expérience est très pratique pour détecter indirectement les carbones quaternaires couplés à un<br />
proton. Elle permet dans notre cas d’effectuer l’attribution des carbones quaternaires des<br />
groupes carbonyles des fonctions amides des phospholipidyl-CDs. C’est également un moyen
de séquencer les différentes parties de la molécule (CD-NH-CO-espaceur-NH-COphospholipide).<br />
Les spectres RMN du proton et du carbone de la -CD-Succ-DMPE 6 ont été entièrement<br />
caractérisés par le recoupement de toutes les informations obtenues à partir des expériences<br />
RMN bidimensionnelles. Les séquences COSY et COSY relayées nous ont permis de relier<br />
entre eux les protons couplés scalairement. Les déplacements chimiques des signaux du<br />
carbone ont été attribués grâce aux expériences <strong>DE</strong>PT, HMQC et HMBC qui expriment les<br />
couplages scalaires hétéronucléaires entre les protons et les carbones. Enfin, le séquençage<br />
des différentes parties de la phospholipidyl-cyclodextrine est effectué grâce à l’expérience<br />
T-ROESY, qui permet de relier entre eux les protons proches dans l’espace via les couplages<br />
dipolaires, et à la séquence HMBC. La même stratégie a été appliquée pour attribuer les<br />
spectres proton et carbone de la DIMEB-Succ-DMPE 10 et de la TRIMEB-Succ-DMPE 14<br />
(Cf partie expérimentale).<br />
III.2. Identification exacte des produits grâce à la spectrométrie de<br />
masse basse et haute résolution<br />
Pour caractériser la structure de molécules telles que les phospholipidyl-cyclodextrines dont<br />
l’architecture est complexe, la RMN bidimensionnelle à haute résolution est une technique<br />
très puissante. Toutefois, pour valider rapidement la structure des produits et évaluer leur<br />
pureté, des techniques d’analyses physico-chimiques complémentaires sont nécessaires.<br />
Nous avons vu dans la partie bibliographique que l’analyse élémentaire n’est pas la technique<br />
de contrôle la mieux appropriée pour les dérivés de cyclodextrines. Nous avons donc choisi<br />
de ne pas utiliser cette méthode, et avons eu recours à la spectrométrie de masse à basse et<br />
haute résolution.<br />
Les spectres de masse de la -CD-DMPE 6, de la DIMEB-Succ-DMPE 10 et de la<br />
TRIMEB-Succ-DMPE 14 purifiées ont été acquis à l’aide d’une source électrospray (Q-TOF),<br />
en utilisant un mode de détection positif et négatif. Les cations et les anions formés dans la<br />
source d’ionisation sont détectés grâce à un détecteur à temps de vol. Ces spectres sont<br />
présentés figure 39 et indiquent un haut degré de pureté des trois composés.<br />
77
NSTR023D_R3_L1 6 (0.623) Cm (4:8) 1: TOF MS ES+<br />
100<br />
959.9<br />
4.61e3<br />
%<br />
1896.8<br />
[MNa]<br />
a<br />
+<br />
[MNa + 2Na] 2+<br />
0<br />
854.3<br />
1278.4<br />
NSTR023D_R3_L2 14 (1.450) Cm (9:14) 1: TOF MS ES-<br />
100<br />
1849.9<br />
7.69e3<br />
b<br />
%<br />
819.3<br />
973.9 1232.4<br />
1639.7<br />
0<br />
NSTR023E_R3_L1 11 (1.141) Cm (9:12) 1: TOF MS ES+<br />
100<br />
1051.1<br />
6.74e3<br />
c<br />
%<br />
0<br />
NSTR023E_R3_L2 13 (1.349) Cm (10:13) 1: TOF MS ES-<br />
100<br />
2033.1<br />
2.36e3<br />
d<br />
%<br />
1058.6<br />
1414.7<br />
0<br />
NSTR049A_R3_L1 4 (0.417) Cm (4:7) 1: TOF MS ES+<br />
100<br />
1096.6<br />
2.02e4<br />
e<br />
%<br />
0<br />
NSTR049A_R3_L4 4 (0.417) Cm (3:6) 1: TOF MS ES-<br />
100<br />
2131.2<br />
[M]<br />
1.68e3<br />
f<br />
-<br />
%<br />
0<br />
[MNa + 2Na] 2+<br />
[MNa + 2Na] 2+<br />
1107.6 1512.8<br />
800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 m/z<br />
78<br />
[M] -<br />
2079.2<br />
[MNa] +<br />
[M] -<br />
2177.2<br />
[MNa] +<br />
Figure 39 : Spectres de masse ESI des phospholipidyl-cyclodextrines avec détection en mode positif et<br />
négatif : CD-Succ-DMPE 6 (a, b), DIMEB-Succ-DMPE 10 (c, d) and TRIMEB-Succ-DMPE 14 (e, f).<br />
Les amas isotopiques expérimentaux des ions [M] - et [MNa+2Na] 2+ des dérivés 6, 10 et 14<br />
sont en accord avec les amas isotopiques théoriques, calculés à partir des formules brutes,<br />
comme le montre la figure 40 pour le cation doublement chargé de la<br />
TRIMEB-Succ-DMPE 14.
sm022 (0.053) Cu (0.10); Is (1.00,1.00) C99H176N2O44PNa3 TOF MS ES+<br />
100<br />
1100.06<br />
3.35e12<br />
1099.56<br />
%<br />
0<br />
sm022 22 (1.177) Cm (5:25) TOF MS ES+<br />
100<br />
1100.04<br />
1.02e3<br />
1099.56<br />
%<br />
0<br />
m/z<br />
1098 1099 1100 1101 1102 1103<br />
79<br />
1100.56<br />
1100.54<br />
1101.07<br />
1101.07<br />
1101.57<br />
1101.56<br />
Figure 40 : Amas isotopique théorique (a) et experimental (b) de l’ion [MNa+2Na] 2+ de la<br />
TRIMEB-Succ-DMPE 14.<br />
Une observation attentive de la région de l’ion [M] - du spectre de masse de la<br />
DIMEB-Succ-DMPE 10 (figure 41) révèle la présence de deux ions supplémentaires à<br />
m/z = 2046,1 (+14 u) et 2060,1 (+28). Ces impuretés, qui ne sont pas observées sur les<br />
spectres de 6 et de 14, peuvent être certainement attribuées à la méthylation partielle des<br />
hydroxyles en position 3 pendant la réaction contrôlée de 2,6-diméthylation. Pour confirmer<br />
cette hypothèse et pour éliminer toute possibilité de modification située sur la partie Succ-<br />
DMPE, des expériences de spectrométrie de masse en tandem (MS / MS) ont été mises en<br />
œuvre. Les spectres issus du processus de dissociation CID (Collision Induced Dissociation)<br />
des ions précurseurs à m/z = 2046,1 et 2032,1 sont présentés figure 41. Ces spectres sont<br />
identiques, et montrent des ions fragments de basse masse à m/z = 153,1 (C3H6O5P), 227,3<br />
(C14H27O2) et 363,2 (C17H32O6P), caractéristiques d’un bloc Succ-DMPE inchangé. Ces<br />
observations confirment la sur-méthylation de la cyclodextrine et sont en accord avec les<br />
données bibliographiques 217 .<br />
a<br />
b
sm23_qend1 17 (0.951) Cm (10:30) TOF MS ES-<br />
100<br />
%<br />
2032.1<br />
2046.1<br />
a<br />
1.35e4<br />
2060.1<br />
0<br />
m/z<br />
2010 2015 2020 2025 2030 2035 2040 2045 2050 2055 2060 2065 2070 2075 2080<br />
sm23_qmnd2 15 (0.783) Cm (10:30) 1: TOF MSMS 2046.09ES-<br />
100<br />
%<br />
227.3<br />
363.2<br />
b<br />
3.08e3<br />
153.1<br />
2047.2<br />
0<br />
m/z<br />
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200<br />
sm23_qmnd1 29 (1.516) Cm (10:30) 1: TOF MSMS 2032.05ES-<br />
100<br />
227.3<br />
4.19e3<br />
%<br />
0<br />
363.2<br />
153.1<br />
2032.2<br />
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000<br />
m/z<br />
2200<br />
Figure 41 : (a) spectre de masse ESI de la DIMEB-Succ-DMPE 10 avec détection en mode négatif (région<br />
de l’ion [M] - ) et MS/MS (b) de m/z = 2046,1 et (c) de m/z = 2032,1.<br />
Finalement, des mesures de masse exacte de 6, 10 et 14 ont été réalisées en mode négatif, sur<br />
les ions [M ] - et en mode positif, sur les ions [MNa +Na] + avec une résolution de masse de<br />
5000, en utilisant NaI comme étalon interne, introduit de manière continue par un second<br />
nébuliseur (Lockspray). Les résultats de ces mesures sont présentés dans le tableau 5.<br />
Tableau 5 : Mesures de masse exacte des phospholipidyl-cyclodextrines 6, 10 et 14.<br />
Composé Ion<br />
6<br />
10<br />
14<br />
M <br />
Masse<br />
mesurée<br />
80<br />
Masse<br />
calculée<br />
c<br />
ppm Formule<br />
1849,8464 1849,8360 5,6 C79H138N2O44P<br />
[MNa+Na] + 1895,8080 1895,8156 4,0 C79H138N2O44PNa2<br />
M <br />
2032,0479 2032,0395 4,1 C92H164N2O44P<br />
[MNa+Na] + 2078,0178 2078,0190 0,6 C92H164N2O44PNa2<br />
M <br />
2130,1614 2130,1490 5,8 C99H178N2O44P<br />
[MNa+Na] + 2176,1230 2176,1286 2,5 C99H178N2O44PNa2<br />
On constate que la déviation observée entre la masse exacte calculée et la masse mesurée est<br />
de l’ordre de grandeur de l’erreur de mesure due à l’appareillage (5 ppm). Ces résultats<br />
valident sans aucun doute la formule brute des composés 6, 10 et 14.
III.3. Conclusion<br />
Nous avons donc synthétisé trois conjugués phospholipidyl-cyclodextrines à base de<br />
cyclodextrines de natures variées (méthylation ou non des hydroxyles libres). La préparation<br />
de ces produits a été réalisée à l’échelle de plusieurs centaines de milligrammes, en cinq ou<br />
six étapes de synthèse, suivies d’une étape de purification par HPLC, dans le cas de la<br />
-CD-Succ-DMPE 6, ou sur colonne chromatographique de silice, dans le cas des dérivés<br />
DIMEB-Succ-DMPE 10 et TRIMEB-Succ-DMPE 14. Chacun de ces produits a fait l’objet<br />
d’une caractérisation structurale par spectroscopie RMN 1 H et 13 C mono et bidimensionnelle.<br />
Une analyse complémentaire par spectrométrie de masse a permis de confirmer la formule<br />
brute de ces conjugués et de contrôler leur pureté. D’autres analyses physico-chimiques ont<br />
été réalisées (CCM, HPLC, Infra-Rouge, pouvoir rotatoire, point de fusion) et sont exposés<br />
dans la partie expérimentale.<br />
Il va maintenant être intéressant d’étudier le comportement de ces molécules amphiphiles en<br />
milieu aqueux. Il s’agira en fait de répondre aux questions suivantes : ces nouveaux dérivés<br />
ont-ils des propriétés d’organisation dans l’eau ? Si oui, quel est la structure des objets<br />
organisés en solution ? Quelle influence la méthylation de la partie cyclodextrine a-t-elle sur<br />
les propriétés physico-chimiques des phospholipidyl-cyclodextrines dans l’eau ? Enfin, les<br />
phospholipidyl-cyclodextrines conservent-elles les propriétés d’inclusion de la partie CD ?<br />
81
IV. Propriétés d’organisation en milieu aqueux des<br />
phospholipidyl-cyclodextrines méthylées<br />
Ces nouvelles cyclodextrines amphiphiles ont été préparées dans le but de les utiliser comme<br />
de nouveaux matériels capables de s’auto-assembler dans l’eau ou de s’insérer dans des<br />
assemblages supramoléculaires tels que des liposomes ou des micelles, à l’image des<br />
cholestéryl-cyclodextrines 196 .<br />
Dans un premier temps, le comportement des phospholipidyl-cyclodextrines a été testé en<br />
milieu aqueux. Alors que la -CD-Succ-DMPE 6 présente une solubilité nulle ou quasi-nulle<br />
dans l’eau, les dérivés méthylés 10 et 14 se solubilisent spontanément dans l’eau jusqu’à des<br />
concentrations supérieures à 100 mM, formant une solution colloïdale de plus en plus<br />
opalescente lorsque la concentration augmente. L’hypothèse d’un processus d’agrégation<br />
pourrait expliquer ce phénomène.<br />
Nous mettrons tout d’abord en évidence l’existence de ce phénomène d’auto-organisation par<br />
une étude RMN du proton dans l’eau et par des mesures de tension de surface. Des<br />
expériences de diffusion de la lumière nous permettrons ensuite d’avoir des indications<br />
supplémentaires sur la forme et la taille de ces objets. A partir de ces données, nous essaierons<br />
d’établir une hypothèse sur le type de structure organisée qui se forme en solution.<br />
L’évolution de ces structures en fonction de certains paramètres (pH, tampon, temps) sera<br />
également abordée en utilisant les mêmes méthodes.<br />
IV.1. Etude RMN 1 H dans l’eau<br />
En première approximation, les spectres RMN 1 H des conjugués DIMEB-Succ-DMPE 10 et<br />
TRIMEB-Succ-DMPE 14 ont été réalisés dans l’eau. Nous avons alors comparé l’allure de<br />
ces spectres à ceux effectués dans le chloroforme dans les mêmes conditions de concentration<br />
(5 mM) et de température (25 °C) (figure 42).<br />
82
(a)<br />
5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5<br />
ppm<br />
(b)<br />
(c)<br />
5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5<br />
ppm<br />
(d)<br />
7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 ppm<br />
7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 ppm<br />
Figure 42 : Spectres RMN 1 H (500,13 MHz) partiels de (a), (b) la DIMEB-Succ-DMPE 10 et (c), (d) de la<br />
TRIMEB-Succ-DMPE 14, réalisés respectivement dans (a), (c) le CDCl3 et dans (b), (d) D2O à 25 °C et à la<br />
même concentration, égale à 5 mM.<br />
Il apparaît de manière flagrante que les raies des spectres RMN de 10 et 14 sont beaucoup<br />
plus larges dans l’eau que dans le chloroforme. Or, on sait que la largeur à mi-hauteur des<br />
signaux RMN 1 H est directement liée au temps de relaxation transversale T2, et donc au temps<br />
de corrélation C (en première approximation, on considère C comme étant le temps<br />
nécessaire à une molécule ou un objet pour faire une rotation d’un radian sur lui-même). Ce<br />
temps dépend lui-même du coefficient de diffusion des particules en solution, et varie en<br />
fonction du rayon hydrodynamique des objets observés, de la viscosité du solvant et de la<br />
température (loi de Stokes-Einstein).<br />
83
Dans notre cas, la largeur des raies RMN dans l’eau est significative de la présence d’objets<br />
de grosse taille, issus de la formation de systèmes supramoléculaires de phospholipidylcyclodextrines.<br />
Si, effectivement, les conjugués 10 et 14 s’auto-organisent en milieu aqueux, ce phénomène<br />
doit être caractérisé par l’existence d’une concentration micellaire critique (CMC), c'est-à-dire<br />
une concentration à laquelle ces composés passent de l’échelle moléculaire à l’échelle<br />
supramoléculaire. Des mesures de tension de surface vont permettre de déterminer cette<br />
CMC, si celle-ci existe.<br />
IV.2. Détermination de la CMC par mesures de tension de surface<br />
IV.2.1. Principe de la méthode<br />
IV.2.1.1. Définition de la tension superficielle<br />
Les surfaces liquides ont la propriété de se contracter spontanément de façon à acquérir une<br />
aire minimale pour diminuer leur énergie superficielle. Cela se traduit notamment par une<br />
tension superficielle qui peut-être modifiée par la présence de molécules étrangères<br />
(tensio-actifs).<br />
A l’intérieur d’un liquide, les forces d’attraction ou forces de Van der Waals entre les<br />
molécules sont égales dans toutes les directions. Par contre, à la surface, en l’absence<br />
d’attraction compensatrice vers l’extérieur, ces molécules sont soumises à une force résultante<br />
non nulle, dirigée vers l’intérieur. Ainsi, la surface paraît se contracter.<br />
La “force” attirant les molécules vers l’intérieur du liquide se traduit mécaniquement par un<br />
travail dW correspondant à la portion de surface dS. La tension superficielle, notée S, est<br />
définie par le rapport :<br />
dW<br />
S (1)<br />
dS<br />
où S s’exprime habituellement en millinewton par mètre (mN.m -1 )<br />
84
La thermodynamique définit la tension superficielle S comme l’énergie superficielle libre par<br />
unité de surface, qui se manifeste par le travail à fournir pour augmenter la surface d’un<br />
liquide de façon isotherme et réversible.<br />
IV.2.1.2. Mesure de la tension de surface par la méthode de Wilhelmy 218<br />
L’appareillage utilisé pour mesurer les tensions de surface par la méthode de la plaque de<br />
Wilhelmy 219 est assez simple : un récipient contenant le liquide à analyser et une plaque reliée<br />
par un fil à un appareil de mesure de force. Ce dispositif permet de mesurer les tensions de<br />
surface.<br />
La plaque est placée juste en contact avec le liquide à analyser (figure 43). Une certaine<br />
quantité de liquide monte alors par capillarité sur la plaque. Cette quantité est fonction de la<br />
tension de surface et de la densité du liquide. Le poids du liquide qui monte est compensé par<br />
la tension de surface, et peut être mesuré.<br />
Figure 43 : Représentation schématique du dispositif de la plaque de Wilhelmy. L : longueur de la plaque,<br />
l : épaisseur de la plaque, : angle entre la plaque et l’interface.<br />
La relation entre la force et la tension de surface prend en compte les dimensions de la plaque<br />
(longueur et épaisseur) et l’angle de contact, comme le montre l’équation suivante :<br />
F<br />
(2)<br />
( 2L<br />
2l)<br />
cos<br />
où L et l représentent respectivement la longueur et l’épaisseur de la plaque, et l’angle de<br />
contact. La masse de la plaque est tarée avant les mesures. Les matériels sont choisis pour<br />
85
donner un angle de mesure le plus proche de zéro. Ainsi, la plaque est généralement en<br />
platine, dont la surface émérisée, permet un meilleur mouillage.<br />
La méthode de la plaque de Wilhelmy présente un avantage important : le détachement de la<br />
plaque du liquide n’est pas nécessaire. Pour cette raison, la cinétique d’adsorption des<br />
surfactants n’est pas une cause d’erreur importante dans la mesure.<br />
Cette méthode convient bien à l’étude de cinétique d’adsorption de surfactants qui adsorbent<br />
lentement, tels que les polymères (protéines…).<br />
IV.2.1.3. Détermination de la CMC<br />
La concentration micellaire critique est déterminée à partir des courbes de variation de la<br />
tension superficielle, s, en fonction de la concentration en tensioactif. La CMC correspond à<br />
la discontinuité des courbes s = f(Log C).<br />
IV.2.2. Résultats<br />
Les tensions de surface ont été mesurées sur une série de solutions de concentrations<br />
croissantes de DIMEB-Succ-DMPE 10 et de TRIMEB-Succ-DMPE 14, dans l’eau pure à<br />
20 °C. Les courbes de tension de surface en fonction de la concentration (s = f(Log C)) sont<br />
représentées figure 44 :<br />
Tension de surface (mN.m -1 )<br />
55<br />
50<br />
45<br />
40<br />
35<br />
30<br />
25<br />
-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1<br />
86<br />
Log C<br />
DIMEB-Succ-DMPE 10<br />
TRIMEB-Succ-DMPE 14<br />
Figure 44 : Courbes de tension de surface des solutions de DIMEB-Succ-DMPE 10 (pointillés) et de<br />
TRIMEB-Succ-DMPE 14 (trait plein) dans l’eau à 25 °C en fonction de la concentration
Une concentration micellaire critique est mise en évidence pour les deux composés 10 et 14<br />
par le changement de pente, ici à la tension de surface de 38 mN.m -1 à des concentrations très<br />
faibles. En effet, la CMC est estimée à 2 × 10 -4 mol.L -1 pour la DIMEB-Succ-DMPE 10 et<br />
10 -5 mol.L -1 pour son analogue perméthylée 14. Ces résultats indiquent une grande faculté<br />
d’association des phospholipidyl-cyclodextrines méthylées, qu’on retrouve chez d’autres<br />
dérivés de CDs amphiphiles monosubstituées comme la cholestéryl-DIMEB<br />
(CMC = 5 × 10 -6 mol.L -1 ) 196 .<br />
Les phospholipides seuls sont caractérisés par une CMC beaucoup plus basse (de l’ordre de<br />
10 -10 à 10 -12 mol.L -1 ) mais leur solubilité est également extrêmement faible.<br />
Par ailleurs, il est intéressant de constater que les composés 10 et 14 sont solubles (solubilité<br />
apparente) à des concentrations nettement supérieures à leur valeur de CMC respective (entre<br />
1000 et 10000 fois la valeur de la CMC) (Tableau 6). Cette caractéristique est propre aux<br />
composés qui possèdent d’excellentes propriétés de surfactant.<br />
Tableau 6 : CMC et solubilités des phospholipidyl-CDs 6, 10 et 14.<br />
CMC Solubilité apparente<br />
-CD-Succ-DMPE 6 / Nulle ou quasi-nulle<br />
DIMEB-Succ-DMPE 10 2 × 10 -4 mol.L -1<br />
TRIMEB-Succ-DMPE 14 1 × 10 -5 mol.L -1<br />
87<br />
> 10 -1 mol.L -1<br />
> 10 -1 mol.L -1<br />
Pour étudier l’influence du pH et de la force ionique sur la CMC des phospholipidylcyclodextrines,<br />
la CMC de la TRIMEB-Succ-DMPE 14 a été mesurée en milieu tamponné<br />
(tampon phosphate 0,1 M, pH = 7,4). La valeur de la CMC est identique à celle trouvée dans<br />
l’eau pure.<br />
La détermination des CMC de 10 et de 14 permet d’affirmer que les phospholipidylcyclodextrines<br />
forment des systèmes supramoléculaires dans l’eau à faible concentration. La<br />
diffusion de lumière va permettre d’obtenir des informations sur les tailles et la structure de<br />
ces objets organisés.
IV.3. Caractérisation des systèmes organisés par diffusion de la<br />
lumière<br />
La diffusion de radiations est utilisée depuis déjà plusieurs années comme technique non<br />
invasive pour la détermination de la taille des particules en suspension ou en aérosols 220 .<br />
Deux approches expérimentales fondamentalement différentes sont utilisées. Dans la première<br />
approche, les fluctuations de l’intensité de lumière diffusée résultant du mouvement diffusif<br />
des particules sont enregistrées et analysées par auto-corrélation. Cette approche étudiant les<br />
fluctuations de l’intensité, quand elle est appliquée à la diffusion de lumière, est connue sous<br />
une large variété de noms : Diffusion quasi-élastique de la lumière (QELS), Spectroscopie de<br />
Fluctuation de l’Intensité (IFS), Spectroscopie de Corrélation de photons (PCS), Diffusion<br />
Dynamique de la Lumière (DLS). La seconde approche implique la mesure de l’intensité<br />
moyenne de la lumière, de rayons X ou de neutrons diffusés par les particules en fonction de<br />
l’angle de diffusion (). En fonction de la source de radiation, ces techniques sont nommées<br />
Diffusion Statique de la Lumière (SLS), Diffusion des Rayons X aux Petits Angles (SAXS) et<br />
Diffusion de Neutons aux Petits Angles (SANS).<br />
Dans cette partie, nous utiliserons exclusivement la diffusion de lumière pour obtenir des<br />
informations sur la taille, la distribution de taille et la forme des objets organisés, formés par<br />
les phospholipidyl-cyclodextrines dans l’eau.<br />
IV.3.1. Le vecteur de diffusion : q<br />
En diffusion de lumière, un échantillon de particules en suspension est soumis à un faisceau<br />
incident monochromatique ( = 514,5 nm). Lorsque la lumière rencontre ces particules, elle<br />
est rediffusées dans toutes les directions. Grâce à l’utilisation de fentes, la lumière diffusée à<br />
un angle , mesuré à partir du faisceau principal, peut être détectée et analysée (figure 45).<br />
88
I 0<br />
Lumière incidente<br />
Volume de diffusion<br />
89<br />
<br />
Angle de diffusion<br />
I<br />
Lumière<br />
diffusée<br />
Figure 45 : Géométrie du montage optique de l’appareil de diffusion de lumière<br />
k s<br />
k 0<br />
Détecteur<br />
Le transfert d’impulsion résultant d’un tel processus est défini comme la différence vectorielle<br />
entre le vecteur d’onde incident k0 et le vecteur d’onde diffusé ks. Cette différence vectorielle,<br />
appelée le vecteur de diffusion (q), a une valeur qui peut être obtenue à partir de la formule<br />
suivante :<br />
4n0 <br />
q sin( ) (3)<br />
2<br />
où n0 est l’indice de réflexion du milieu dans lequel sont dispersées les particules et est la<br />
longueur d’onde (dans le vide) du rayon incident. L’unité de la valeur q est l’inverse d’une<br />
longueur. q -1 donne donc l’échelle de longueur qui sera sondée par la lumière diffusée à<br />
l’angle . Aux petits angles, q -1 est large et la lumière diffusée dans cette direction contiendra<br />
seulement des informations grossières sur les propriétés dynamiques et structurales des<br />
particules. Au contraire, la lumière diffusée à un grand angle contient des informations plus<br />
fines et peut, par exemple, apporter des renseignements sur la structure interne des particules.
IV.3.2. Diffusion Dynamique de la Lumière (ou quasi-élastique) : DLS ou QELS<br />
IV.3.2.1. Principe<br />
La diffusion dynamique de la lumière est une technique très utilisée pour déterminer la taille<br />
moyenne et la distribution de taille de particules en suspension, mesurant de quelques<br />
nanomètres à quelques micromètres.<br />
En DLS, nous nous intéressons aux fluctuations de l’intensité au cours du temps, sur quelques<br />
microsecondes, dues au mouvement brownien des particules dans la solution. Le rayon<br />
hydrodynamique et la densité des particules peuvent alors être déterminés de la façon<br />
suivante : un facteur de structure dynamique S(q, ) est définit comme la fonction d’auto-<br />
corrélation (“fac”) du champ électrique diffusé. Pour les solutions idéales monodisperses,<br />
c’est une exponentielle décroissante :<br />
D<br />
. q <br />
S(<br />
q,<br />
) e e<br />
<br />
t ²<br />
Dt est le coefficient de diffusion translationnel de la particules (en m².s -1 ). Pour des sphères, il<br />
est relié au rayon hydrodynamique de la particule par la formule de Stokes-Einstein :<br />
kT<br />
Dt<br />
(5)<br />
6RH<br />
avec RH : Rayon hydrodynamique des particules,<br />
k : Constante de Boltzman<br />
T : Température<br />
: Viscosité<br />
Dt : Coefficient de diffusion translationnelle<br />
Expérimentalement, on mesure la fonction d’auto-corrélation de l’intensité diffusée<br />
(figure 46) G() = t = A e -2 t + B où = Dt × q² dans la cas d’un système de<br />
particules rigides, monodisperses et compactes. Dans ce cas, la pente des courbes<br />
Log () = f (Log (q)) sera égale à 2.<br />
90<br />
(4)
IV.3.2.2. Résultats<br />
Figure 46 : Fonction d’auto-corrélation de l’intensité diffusée<br />
Les courbes Log () = f (Log (q)) ont été tracées pour des solutions de TRIMEB-Succ-DMPE<br />
14 et de DIMEB-Succ-DMPE 10, à une concentration de 10 -3 mol.L -1 dans l’eau à 25 °C<br />
(figure 47). Elles sont obtenues en mesurant pour chaque échantillon les valeurs de à partir<br />
des fonctions d’auto-corrélation de l’intensité diffusée à différents angles (30°, 45°, 60°, 90°,<br />
120° et 150°). Dans les deux cas, la pente de la droite est égale à 3.<br />
Log ()<br />
4,50<br />
4,00<br />
3,50<br />
3,00<br />
2,50<br />
2,00<br />
1,50<br />
1,00<br />
DIMEB-Succ-DMPE 10<br />
TRIMEB-Succ-DMPE 14<br />
y = 3,0568x + 11,396<br />
R 2 = 0,9945<br />
91<br />
y = 2,9961x + 11,298<br />
R 2 = 0,9936<br />
-3,20 -3,10 -3,00 -2,90 -2,80 -2,70 -2,60 -2,50 -2,40<br />
Log (q)<br />
Figure 47 : Courbes de diffusion dynamique Log () = f (Log (q)) tracées pour des solutions de<br />
DIMEB-Succ-DMPE 10 (trait plein) et de TRIMEB-Succ-DMPE 14 (pointillés) à 10 -3 mol.L -1 dans l’eau,<br />
à 25 °C
IV.3.3. Diffusion Statique de la Lumière (ou élastique) : SLS<br />
IV.3.3.1. Principe<br />
La diffusion statique de la lumière est utilisée dans la détermination des masses moléculaires,<br />
du rayon et de la structure des particules. Elle permet également d’étudier les interactions<br />
entre les particules.<br />
En SLS, on considère la valeur moyenne de l’intensité diffusée. Celle-ci est donc constante au<br />
cours du temps, mais varie en fonction de l’angle entre les faisceaux incident et diffusé.<br />
L’intensité diffusée, ou facteur de Rayleigh, peut se mettre sous la forme générale :<br />
I<br />
q dn / dc<br />
4<br />
² n²<br />
<br />
4<br />
N <br />
A<br />
²<br />
CMP<br />
qSq, C<br />
KCMPqSq,<br />
C<br />
avec q : vecteur de diffusion<br />
n : indice de réfraction de la solution<br />
C : concentration massique en particules diffusantes<br />
: longueur d’onde<br />
P : facteur de forme des particules<br />
S : facteur de structure<br />
M : masse molaire des particules<br />
S(q,C) est le facteur de structure et caractérise les interactions au sein de l’échantillon. En<br />
milieu dilué :<br />
0, C<br />
S C O<br />
1<br />
<br />
(7)<br />
1<br />
2MA<br />
C<br />
où A2 représente le second coefficient de viriel. S tend vers 1 lorsque la concentration tend<br />
vers 0 (milieu très dilué).<br />
92<br />
2<br />
(6)
P(q) est le facteur de forme, il dépend de la taille et de la structure des particules.<br />
Pour qRg > 1 :<br />
MP<br />
où D représente la dimension fractale.<br />
q En milieu très dilué, l’équation (6) devient :<br />
q I<br />
C<br />
1<br />
~ (9)<br />
D qRg<br />
93<br />
q KMP (10)<br />
En première approximation, les courbes Log (I(q)/C) = f (Log (q)) apporteront des<br />
informations sur la taille et la structure des particules. En effet, d’après l’équation (10), la<br />
valeur de la pente de ces courbes sera directement liée à la valeur du rayon de giration (Rg²) et<br />
donc à la géométrie des particules.
Ainsi, si les particules observées sont des bâtonnets, la pente des courbes tend vers -1. Dans le<br />
cas où les objets en solution sont des pelotes gaussiennes, alors la pente sera plus proche<br />
de -2.<br />
IV.3.3.2. Résultats<br />
Dans un premier temps, l’évolution des courbes Log (I(q)/C) = f (Log (q)) en fonction du<br />
temps a été étudiée pour une solution de DIMEB-Succ-DMPE 10 dans l’eau à 25 °C, à une<br />
concentration de 10 -3 mol.L -1 (figure 48).<br />
Log (I(q)/C)<br />
6,30<br />
6,10<br />
5,90<br />
5,70<br />
5,50<br />
5,30<br />
5,10<br />
4,90<br />
4,70<br />
4,50<br />
94<br />
y<br />
x<br />
1,5<br />
-3,40 -3,30 -3,20 -3,10 -3,00 -2,90 -2,80 -2,70 -2,60 -2,50<br />
Log (q)<br />
Figure 48 : Evolution des courbes de diffusion statique Log (I(q)/C) = f (Log (q)) en fonction du temps (j 0,<br />
j + 1, j + 5 et j + 8), tracées pour une solution de DIMEB-Succ-DMPE 10 à 10 -3 mol.L -1 dans l’eau, à 25 °C.<br />
La valeur de la pente des droites est environ égale à -1,5. Elle n’évolue pas de manière<br />
significative avec le temps.<br />
Une étude identique a été réalisée avec une solution de TRIMEB-Succ-DMPE 14 dans l’eau à<br />
25 °C, à une concentration de 10 -3 mol.L -1 (figure 49).<br />
j0<br />
j + 1<br />
j + 5<br />
j + 8
Log (I(q)/C)<br />
6,20<br />
6,00<br />
5,80<br />
5,60<br />
5,40<br />
5,20<br />
5,00<br />
4,80<br />
4,60<br />
y<br />
x<br />
1,5<br />
y<br />
x<br />
1<br />
-3,50 -3,40 -3,30 -3,20 -3,10 -3,00 -2,90 -2,80 -2,70 -2,60 -2,50<br />
95<br />
Log (q)<br />
Figure 49 : Evolution des courbes de diffusion statique Log (I(q)/C) = f (Log (q)) en fonction du temps (j 0,<br />
j + 1, j + 2, j + 6 et j + 8), tracées pour une solution de TRIMEB-Succ-DMPE 14 à 10 -3 mol.L -1 dans l’eau,<br />
à 25 °C.<br />
Les résultats sont similaires à ceux observés avec la DIMEB-Succ-DMPE 10. Toutefois, on<br />
constate que les valeurs des pentes fluctuent légèrement plus au cours du temps. Notons qu’au<br />
jour j = 0, la pente est plus faible qu’aux jours suivants et tend vers -1.<br />
L’influence de la concentration a également été étudiée. Des solutions de<br />
DIMEB-Succ-DMPE 10 ont été préparées à deux concentrations différentes et supérieures à<br />
la CMC (2 × 10 -4 et 10 -3 mol.L -1 dans l’eau à 25 °C). Les courbes Log (I(q)/C) = f (Log (q))<br />
obtenues sont représentées figure 50 . Les pentes des deux droites sont identiques et tendent<br />
vers -1,5.<br />
j0<br />
j + 1<br />
j + 2<br />
j + 6<br />
j + 8
Log (I(q)/C)<br />
7,50<br />
7,00<br />
6,50<br />
6,00<br />
5,50<br />
5,00<br />
4,50<br />
y<br />
x<br />
-3,3 -3,2 -3,1 -3 -2,9 -2,8 -2,7 -2,6 -2,5<br />
96<br />
1,5<br />
Log (q)<br />
2e-4 mol/L<br />
1e-3 mol/L<br />
Figure 50 : Evolution des courbes de diffusion statique Log (I(q)/C) = f (Log (q)) en fonction de la<br />
concentration, tracées pour des solutions de DIMEB-Succ-DMPE 10 à 10 -3 et 2 ×10 -4 mol.L -1 dans l’eau, à<br />
25 °C et à j + 8.<br />
IV.3.4. Discussion<br />
Des expériences de diffusion de lumière ont été réalisées sur des solutions de<br />
DIMEB-Succ-DMPE 10 et de TRIMEB-Succ-DMPE 14 dans l’eau à 25 °C, à une<br />
concentration supérieure à la concentration micellaire critique. Pour les deux espèces étudiées,<br />
les résultats obtenus à partir des courbes de diffusion sont identiques.<br />
En diffusion dynamique, la pente des droites Log () = f (Log (q)) tend vers 3. Or, dans le cas<br />
d’un système constitué de particules monodisperses, rigides et compactes la pente est égale à<br />
2. Il semble donc que les phospholipidyl-cyclodextrines 10 et 14 ne s’organisent pas sous<br />
forme de micelles sphériques ou de vésicules monodisperses. Une pente proche de 3 est<br />
caractéristique d’objets fluctuants et polydisperses.<br />
En diffusion statique, les pentes des courbes Log (I(q)/C) = f (Log (q)) tendent vers une<br />
valeur de -1,5 et ne varient pas en fonction du temps. De plus, il a été montré dans le cas de la<br />
DIMEB-Succ-DMPE 10 que pour deux concentrations différentes supérieures à la CMC, les<br />
pentes étaient identiques et égales à -1,5. A partir de ces résultats, on peut émettre l’hypothèse
que ces objets sont de long tubes fluctuants et polydisperses dont la forme générale varie entre<br />
le bâtonnet rigide (caractérisé par une pente de -1) et la pelote statistique (caractérisée par une<br />
pente de -2).<br />
Dans le cas de la TRIMEB-Succ-DMPE 14, la pente est proche de -1 au jour j = 0 et tend vers<br />
-1,5 à partir de j + 1. La cinétique de l’auto-organisation pourrait donc être plus lente qu’avec<br />
la DIMEB-Succ-DMPE 10. De plus, les valeurs des pentes qui fluctuent de manière plus<br />
importante autour de -1,5 pourraient signifier que les systèmes organisés sont un peu moins<br />
stables avec le dérivé 14. Toutefois, ces remarques ne restent que des suppositions et n’ont<br />
pas été vérifiées.<br />
Enfin, on n’observe pas aux petits angles l’amorce d’un plateau sur les courbes de diffusion<br />
statique, ce qui signifie que la taille des particules observées est au moins supérieure à<br />
l’inverse du vecteur de diffusion à min = 20°, c'est-à-dire supérieure à 200 nm.<br />
IV.4. Conclusion<br />
L’utilisation de plusieurs techniques physico-chimiques différentes et complémentaires<br />
(RMN 1 H, mesure de tensions de surface, diffusion dynamique et statique de la lumière) a<br />
permis de montrer sans ambiguïté que contrairement à la -CD-Succ-DMPE 6, les dérivés<br />
méthylés sur la partie cyclodextrine 10 et 14 formaient spontanément des systèmes<br />
supramoléculaires à de très faibles concentrations. Ce phénomène d’auto-organisation a été<br />
mis en évidence par la détermination de leur CMC (2 × 10 -4 mol.L -1 pour 10 et 10 -5 mol.L -1<br />
pour 14). Enfin, des informations sur la structure et la taille des objets observés en solution<br />
ont été apportées grâce à la diffusion de lumière. Les phospholipidyl-cyclodextrines semblent<br />
s’organiser sous forment de fibres micellaires (micelles allongées) fluctuantes et<br />
polydisperses de taille supérieure à 200 nm.<br />
L’intérêt de ces composés, rappelons-le, repose sur leur capacité à combiner les propriétés de<br />
transport de systèmes organisés avec les capacités des cyclodextrines à encapsuler des<br />
principes actifs. Il s’agit donc maintenant de prouver que la partie macrocyclique des<br />
phospholipidyl-CDs conserve ses propriétés d’inclusion au sein de ces nouveaux objets<br />
supramoléculaires.<br />
97
V. Propriétés d’inclusion des phospholipidyl-CDs<br />
Les cyclodextrines sont des molécules très intéressantes à cause principalement de leurs<br />
remarquables propriétés à former des complexes d’inclusion avec de petites molécules<br />
hydrophobes dans l’eau pour les rendre hydrosolubles et améliorer leur biodisponibilité quand<br />
il s’agit de principes actifs par exemple. Il est donc très important de prouver que la cavité de<br />
la partie cyclodextrine conserve son pouvoir d’encapsulation moléculaire au sein des<br />
systèmes organisés formés par ces nouveaux dérivés amphiphiles.<br />
De nombreuses méthodes d’investigations électrochimiques et spectroscopiques permettent de<br />
mettre en évidence les phénomènes de complexation entre les cyclodextrines et une (ou des)<br />
molécule(s) invitée(s). Cependant, l’une des méthodes de choix pour étudier les complexes<br />
d’inclusion moléculaire reste la RMN 221 .<br />
V.1. Etude par RMN des complexes d’inclusion dans les<br />
cyclodextrines<br />
La formation d’un complexe d’inclusion impliquant une cyclodextrine “hôte” et une molécule<br />
organique “invitée” peut-être décrite par la réaction générale :<br />
nC + mI<br />
98<br />
k 1<br />
k -1<br />
C nI m<br />
où C, I et CnIm représentent respectivement la cyclodextrine, la molécule “invitée” et le<br />
complexe d’inclusion pour une stoechiométrie n:m. La constante d’équilibre ou constante<br />
d’association apparente, Ka, du complexe est donnée par la relation :<br />
K<br />
a<br />
<br />
<br />
m n<br />
Cn<br />
Im<br />
C I<br />
où [CnIm], [C] et [I] sont les concentrations respectives des espèces présentes en solution à<br />
l’équilibre thermodynamique.<br />
(11)
V.1.1. Incidence du phénomène d’échange sur l’observation en RMN<br />
L’interaction entre deux molécules en solution met en jeu un phénomène important en RMN,<br />
l’échange, essentiellement l’échange chimique mais aussi l’échange conformationnel. De<br />
nombreux paramètres RMN (le déplacement chimique, les constantes de couplages, les temps<br />
de relaxation) sont représentatifs des différents aspects de ce type d’interaction.<br />
Dans le cas de la formation d’un complexe entre deux molécules, un équilibre entre les<br />
formes libres et associées implique un échange caractérisé par une constante de vitesse<br />
globale k = k1 + k-1. A l’échelle de la RMN, pour une fréquence d’observation donnée, trois<br />
cas sont à envisager (figure 51) :<br />
l’échange lent (k > | liée - libre | ) : un seul déplacement chimique est observé au<br />
barycentre de libre et de liée ;<br />
l’échange intermédiaire (coalescence) (k | liée - libre | ) : une seule raie large est<br />
visible au barycentre de libre et de liée.<br />
Echange<br />
Lent<br />
Coalescence<br />
Echange<br />
Rapide<br />
l<br />
Figure 51 : Illustration de l’influence de la vitesse d’échange sur la forme des raies et sur les valeurs de<br />
déplacements chimiques des signaux obtenus en RMN<br />
99<br />
<br />
obs<br />
c
La majorité des complexes d’inclusion des petites molécules organiques dans les<br />
cyclodextrines donnent lieu, quand ils sont étudiés à haut champ ( 400 MHz) à température<br />
ambiante et en milieu aqueux, à un échange rapide en RMN du proton et du carbone. Dans ce<br />
cas, un seul signal est observé pour les formes libres et associées, et sa fréquence de<br />
résonance dépend des concentrations respectives en cyclodextrine et en molécule “invitée”, et<br />
de la valeur de la constante d’association apparente.<br />
V.1.2. Mise en évidence directe de la complexation par les déplacements<br />
chimiques en RMN 1 H<br />
En présence d’un champ magnétique B0, les fréquences de résonance des noyaux d’une<br />
molécule étant liées à leur environnement, tout phénomène induisant une modification du<br />
champ magnétique effectif B ’ 0 ressenti par un noyau donné provoquera le déplacement de son<br />
signal dans le spectre RMN. L’encapsulation d’une molécule organique par une cyclodextrine<br />
induit des modifications de la densité électronique locale à l’intérieur de la cavité entraînant<br />
des variations de déplacements chimiques de certains protons des molécules “hôte” et<br />
“invitée”.<br />
L’inclusion d’un cycle benzénique induit des effets d’anisotropie importants qui sont mis en<br />
évidence par les variations des fréquences de résonance des protons situés à l’intérieur de la<br />
cavité de la CD, H-3 et H-5, alors que les fréquences de résonance des protons H-2, H-4 et<br />
H-1, situés à l’extérieur de la cavité, sont peu affectés par la complexation (figure 52).<br />
_<br />
+ +<br />
_<br />
C<br />
Figure 52 : Représentation du cône d’anisotropie créé par la délocalisation des électrons d’un cycle<br />
aromatique et influence de ce cône sur les protons H-3 et H-5 de la cyclodextrine<br />
Les déplacements des protons H-3 et H-5, observés vers les champs forts, proviennent des<br />
effets de courants de cycles générés par les électrons de la molécule aromatique invitée. Ils<br />
sont relativement faibles puisqu’ils sont moyennés par les mouvements de la molécule<br />
100<br />
H 4<br />
H 2<br />
H 3<br />
H 5<br />
H 5<br />
H3<br />
H 4<br />
H 2
incluse. Comme les effets d’anisotropie diminuent rapidement avec la distance, les protons les<br />
plus proches du cycle insaturé sont les plus touchés. Les effets importants d’anisotropie<br />
magnétique subis par les protons à l’intérieur de la cavité, prouvent sans ambiguïté l’existence<br />
du phénomène d’inclusion des composés aromatiques. Les liaisons C-C insaturées, les<br />
groupements nitro et les carbonyles sont également capables d’induire de tels effets sur les<br />
protons H-3 et H-5 de la CD.<br />
En général, pour la molécule invitée, les variations de déplacement chimique des protons<br />
induites par le cycle de la cyclodextrine se produisent vers les champs forts. Ces<br />
modifications sont relativement faibles n’excédant pas 1 ppm.<br />
V.1.3. Détermination de la stoechiométrie du complexe cyclodextrine /<br />
molécule “invitée”<br />
Deux cas de figure peuvent se présenter :<br />
le complexe formé n’est pas ou peu soluble dans l’eau et précipite sous forme d’un<br />
solide ;<br />
le complexe est soluble dans l’eau.<br />
Dans ce dernier cas, et en présence d’un échange lent à l’échelle de temps RMN, la<br />
stœchiométrie du complexe formé est déterminée directement à partir du spectre RMN du<br />
proton. En effet, les molécules hôte et invitée donnent chacune des signaux discernables pour<br />
les formes libres et complexées. L’intégration des signaux du complexe permet la<br />
détermination de r = n/m.<br />
Dans la situation d’échange rapide, la stœchiométrie du complexe n’est pas directement<br />
accessible. On a alors recours à des expériences de titration, appelées “méthode des variations<br />
continues” ou “méthode de Job” 222,223 (les équations sont développées en annexe II). Cette<br />
technique permet de déterminer le coefficient stœchiométrique d’un complexe de<br />
cyclodextrine, en absence de tout autre phénomène compétitif d’association, en observant<br />
l’évolution d’une variable physico-chimique au cours d’une titration. En maintenant constante<br />
la somme des concentrations totales en cyclodextrine [C]t et en molécule “invitée” [I]t tout au<br />
long de la titration, la concentration en complexe [CnIm] est maximale lorsque la fraction<br />
[C]<br />
molaire en cyclodextrine t<br />
y<br />
y satisfait à la relation <br />
[C] t [I]<br />
t<br />
1 y<br />
101<br />
n<br />
m<br />
223 .
En général, en RMN, la variable observée est le déplacement chimique des protons, obs de la<br />
molécule invitée I (les constantes de couplage ou les vitesses de relaxation pouvant en théorie<br />
être aussi utilisées). Compte tenu de l’échange rapide :<br />
ou encore<br />
<br />
obs<br />
[I] m [C<br />
I ] <br />
m [C<br />
<br />
l<br />
(12)<br />
nI<br />
m ] Ic<br />
t<br />
[I] t<br />
n m I<br />
I<br />
( ) [C I ] m (<br />
) [C I ] cte (13)<br />
c<br />
[I] t obs I l n m<br />
I l n m<br />
où Il et Ic sont respectivement les déplacements chimiques correspondant à la molécule<br />
“invitée” libre et au complexe pur.<br />
Le produit ( -<br />
) étant directement proportionnel à [CnIm], est donc fonction<br />
[I] obs I l<br />
t<br />
de y. La courbe ( -<br />
) f(y) passera par un maximum lorsque la composition du<br />
[I] obs I l<br />
mélange répondra à la condition :<br />
t<br />
y<br />
<br />
1 y<br />
n<br />
m<br />
.<br />
La même démarche peut être effectuée pour la cyclodextrine et confirmer ainsi la<br />
stœchiométrie du complexe.<br />
V.1.4. Détermination de la constante d’association d’un complexe 1:1<br />
Pour un complexe de stœchiométrie 1:1, l’équation de réaction s’écrit : C + I CI<br />
V.1.4.1. Cas d’un échange lent<br />
Dans le cas d’un échange lent, les concentrations totales en molécule “invitée” et en<br />
cyclodextrine étant connues, l’intégration des signaux des protons de chacune des espèces<br />
libre et complexée permet d’accéder très simplement aux concentrations de C, I et CI et donc<br />
à la valeur de la constante d’association Ka.<br />
102
V.1.4.2. Cas d’un échange rapide<br />
Méthode de Benesi-Hildebrand<br />
Dans le cas d’un échange rapide, la constante d’association n’est pas directement accessible.<br />
Une des approches possibles est la méthode développée par Benesi-Hildebrand (Hanna-<br />
Ashbaugh) 224,225 dans laquelle la concentration de la molécule organique hydrophobe est<br />
généralement maintenue constante, alors que celle de la cyclodextrine varie dans une gamme<br />
donnée de concentrations. Au cours de la titration, la variable observable est, en général, le<br />
déplacement chimique des protons de la molécule “invitée” quand elle est hydrophobe. Cette<br />
approche permet de déterminer graphiquement Ka à condition que l’espèce non observée soit<br />
en large excès (d’au moins un facteur 10) par rapport à l’espèce observée.<br />
Dans ces conditions, on établit la relation 225,226 qui correspond à l’équation d’une droite de<br />
type y = ax + b (où<br />
a <br />
K a<br />
1<br />
<br />
I c<br />
et b <br />
<br />
1 ).<br />
I c<br />
I c<br />
1 1 1<br />
(14)<br />
<br />
K <br />
[C]<br />
<br />
a<br />
où = obs - Il est le déplacement chimique induit, Ka la constante d’équilibre et [C] t la<br />
concentration totale en cyclodextrine (les équations qui aboutissent à cette relation sont<br />
développées en annexe III).<br />
La pente et l’ordonnée à l’origine des droites obtenues en portant 1/ en ordonnée en<br />
fonction de 1/[C]t en abscisse permettent d’atteindre les deux paramètres recherchés Ic et<br />
Ka. Toutefois cette méthode reste restrictive quant aux conditions expérimentales. Seule<br />
l’exploitation de protons présentant de larges variations lors du processus d’inclusion est<br />
reportée, la méthode devenant très imprécise pour de faibles variations de déplacement<br />
chimique. De plus la méthode de Benesi-Hildebrand (Hanna-Ashbaugh) n’est valable que<br />
pour des constantes d’association faibles et pour une gamme de concentrations en<br />
cyclodextrine très restreinte. En effet, lorsque la valeur de la constante d’association devient<br />
importante, la pente de la droite diminue fortement et par voie de conséquence la précision de<br />
la détermination de la constante d’association 227 . Enfin cette procédure implique que les<br />
valeurs des déplacements chimiques de la molécule invitée soient connues à l’état libre (ceci<br />
103<br />
t<br />
I c
nécessite que la molécule sous sa forme libre soit suffisamment soluble dans l’eau pour<br />
permettre l’enregistrement d’un spectre RMN).<br />
Méthode itérative pour la détermination de Ka et des paramètres dans le<br />
complexe pur : la procédure COMPLEX<br />
Une autre approche plus générale, permettant de s’affranchir de toutes les conditions<br />
restrictives, consiste à utiliser les données expérimentales (obs) acquises pour déterminer la<br />
stoechiométrie avec la méthode des variations continues, et à les traiter mathématiquement.<br />
Dans le cas d’un complexe 1:1, la constante d’équilibre (11) devient :<br />
Ka<br />
CI <br />
CI (15)<br />
où [C], [I] et [CI] sont les concentrations respectives des espèces présentes en solution à<br />
l’équilibre thermodynamique. Soient [I]t et [C]t les concentrations totales de molécule<br />
“invitée” et de cyclodextrine dans l’échantillon, on peut écrire les relations suivantes :<br />
I I t CI <br />
(16)<br />
C CtCI <br />
(17)<br />
En échange rapide, nous pouvons de plus appliquer la relation suivante :<br />
Iobs [I]t = Ic [CI] + Il [I] (18)<br />
où Iobs, Il, Ic représentent la valeur du déplacement chimique observé pour un proton<br />
de la molécule “invitée” et ses valeurs à l’état libre et dans le complexe pur, respectivement.<br />
La combinaison des équations (15), (16), (17) et (18) aboutit à l’équation suivante pour<br />
l’espèce I :<br />
C t<br />
<br />
I obs<br />
<br />
1<br />
<br />
I obs<br />
<br />
I ( I t ( K a ( )) 1)<br />
c<br />
<br />
104<br />
I c<br />
(19)
La condition Ic non nul est toujours remplie si un complexe est formé et si le paramètre<br />
observé a des valeurs différentes dans les états libre et complexé.<br />
On peut obtenir une équation similaire pour l’espèce C :<br />
I<br />
t<br />
<br />
<br />
C c<br />
( t<br />
<br />
C obs<br />
1<br />
<br />
a<br />
<br />
<br />
C obs<br />
C ( K ( )) 1)<br />
Les équations (19) et (20) sont donc constituées de trois variables expérimentales (obs, [I]t<br />
et [C]t) et de deux inconnues (Ka et c). Les données expérimentales sont traitées<br />
mathématiquement à l’aide d’une procédure de régression des moindres carrés<br />
multiparamétriques afin d’accéder aux valeurs calculées des deux inconnues Ka et c. Un<br />
programme réalisé au laboratoire (programme COMPLEX 228 ) permet d’effectuer cette<br />
opération dans le cas de complexes de stoechiométrie 1:1. Cet algorithme peut-être appliqué à<br />
chacun des protons des deux molécules formant le complexe et utilisé sans aucune restriction<br />
concernant les concentrations des deux espèces. La fiabilité de la méthode est confirmée par<br />
l’homogénéité des résultats obtenus pour différents protons. En revanche, si les valeurs de Ka<br />
calculées pour plusieurs protons diffèrent entre elles de plus de 10 %, alors l’hypothèse d’un<br />
complexe unique de stoechiométrie 1:1 est remise en cause, d’autres types d’association ou<br />
l’existence d’interactions compétitives (aggrégation, micellisation,…) doivent être envisagés.<br />
V.1.5. Détermination de la structure tridimensionnelle des complexes de<br />
cyclodextrines<br />
L’observation des variations des déplacements chimiques donne un nombre d’informations<br />
limité sur la structure d’un complexe d’inclusion de cyclodextrine. En effet, lorsque la taille<br />
de la molécule “invitée” est importante par rapport à la cavité de la CD, ce ne sont pas<br />
forcément les protons de la partie incluse qui présentent les variations de déplacement<br />
chimique les plus importantes. Des expériences RMN 2D (ou 1D sélectif) permettant de<br />
mettre en évidence les interactions dipolaires entre les deux protagonistes sont indispensables<br />
pour appréhender la structure tridimensionnelle des complexes.<br />
105<br />
C c<br />
(20)
On relève dans la littérature quelques exemples d’études de complexes d’inclusion de<br />
cyclodextrines mis en évidence par la séquence NOESY. Toutefois, la majorité des complexes<br />
supramoléculaires formés avec les cyclodextrines en solution aqueuse à température proche<br />
de l’ambiante présente un effet NOE pratiquement nul à haut champ (~ 500 MHz).<br />
Généralement, on ne peut donc pas observer de signal de relaxation croisée entre les protons<br />
de la CD et ceux de la molécule “invitée” avec la séquence NOESY. Pour l’étude<br />
tridimensionnelle des complexes, nous préférerons alors utiliser la séquence T-ROESY (pour<br />
des raisons que nous avons expliquées précédemment dans le chapitre III.1.3).<br />
V.2. Résultats et discussion<br />
La -CD forme généralement de très bons complexes d’inclusion avec les dérivés du benzène,<br />
qui s’insèrent dans la cavité par le grand côté du macrocycle. Höfler et coll. 229 ont montré que<br />
la force du complexe dépend fortement de la taille et de la position des substituants portés par<br />
le cycle benzénique.<br />
Nous avons choisi d’utiliser le sel de 4-tert-butylbenzoate de sodium (4-tBuPhCOO - Na + )<br />
comme molécule “invitée” modèle pour étudier les propriétés d’inclusion des phospholipidylcyclodextrines<br />
en raison de ses excellentes aptitudes à former des complexes forts avec les<br />
dérivés de la -CD. De plus, cette molécule est soluble dans l’eau sous forme de sel et les<br />
signaux 1 H du spectre RMN sont facilement caractérisables (figure 53).<br />
H-B/H-B’<br />
H-C/H-C’<br />
7.8 ppm<br />
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 ppm<br />
106<br />
H-tBu<br />
H D' H<br />
C C'<br />
H<br />
H 3C<br />
B<br />
O<br />
CH3 CH3 C<br />
A<br />
B'<br />
O - Na +<br />
H<br />
H-tBu<br />
Figure 53 : Spectre RMN 1 H du 4-tert-butylbenzoate de sodium (500,13 MHz, 5 mM, D2O, 298 K)
Toutefois, mettre en évidence les propriétés de complexation de la DIMEB-Succ-DMPE 10 et<br />
de la TRIMEB-Succ-DMPE 14 n’est pas aisé. En effet, ces CDs amphiphiles forment, à très<br />
faible concentration, des systèmes organisés qui rendent impossible une étude<br />
thermodynamique des complexes en raison des phénomènes d’interactions compétitives.<br />
Il sera préférable, dans un premier temps, de déterminer les paramètres thermodynamiques et<br />
structuraux des complexes formés entre les CDs seules (DIMEB et TRIMEB) et le<br />
4-tBuPhCOO - Na + . Nous pourrons ensuite extrapoler ces résultats pour l’étude de<br />
complexation des phospholipidyl-cyclodextrines 10 et 14. Notons que l’insolubilité de la<br />
molécule 6 ne permet pas une étude de ces propriétés d’inclusion par RMN en milieu aqueux.<br />
V.2.1. Etude par RMN du complexe TRIMEB / 4-tBuPhCOO - Na +<br />
La première étape de cette étude consiste à mettre en évidence le phénomène d’inclusion entre<br />
la TRIMEB et le 4-tBuPhCOO - Na + . En comparant les spectres RMN 1 H de la TRIMEB seule<br />
dans l’eau, et en présence du 4-tBuPhCOO - Na + dans des proportions équimolaires, on observe<br />
des variations de déplacement chimique des protons H-3 et H-5, situés à l’intérieur de la<br />
cavité de la CD (figure 54 a et b). De la même manière, l’enregistrement des spectres<br />
RMN 1 H du 4-tBuPhCOO - Na + seul dans l’eau, et en présence de TRIMEB, montre les<br />
variations de déplacement chimique que subissent les protons aromatiques de la molécule<br />
invitée (figure 54 c et d).<br />
107
(a)<br />
(b)<br />
(c)<br />
(d)<br />
H-5/H-6<br />
4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4 3.3 ppm<br />
4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4 3.3 ppm<br />
H-B/H-B’<br />
H-4<br />
H-3<br />
H-C/H-C’<br />
8.0 7.9<br />
7.8<br />
7.7<br />
7.6<br />
7.5<br />
7.4 ppm<br />
H-B/H-B’<br />
H-4/H-6<br />
H-6’<br />
H-5<br />
8.0 7.9<br />
7.8<br />
7.7<br />
7.6<br />
7.5<br />
7.4 ppm<br />
H-3<br />
H-6’<br />
108<br />
H-2<br />
H-2<br />
H-C/H-C’<br />
H 3CO<br />
H 3C<br />
H D' H<br />
C C'<br />
H<br />
4<br />
B<br />
O<br />
3<br />
OCH3<br />
5<br />
CH3 CH3 C<br />
A<br />
2<br />
B'<br />
O<br />
TRIMEB<br />
1<br />
OCH 3<br />
O<br />
O - Na +<br />
H<br />
7<br />
4-tBuPhCOO - Na +<br />
Figure 54 Spectres RMN 1 H partiels (500,13 MHz, 5 mM, D2O, 298 K) de la TRIMEB (a), (c) seule et<br />
(b), (d) en présence de 4-tert-butylbenzoate de sodium (5mM).<br />
La stoechiométrie du complexe est alors déterminée par la méthode des variations continues.<br />
Pratiquement, nous avons réalisé, dans l’eau, une série de mélanges<br />
TRIMEB / 4-tBuPhCOO - Na + de composition variable (la fraction molaire de cyclodextrine, r,<br />
variant de 0 à 1, avec [TRIMEB] + [4-tBuPhCOO - Na + ] = constante = 10 mM). Les spectres<br />
RMN 1 H ont été enregistrés dans D2O à 298 K pour chacun de ces mélanges. Les courbes de<br />
Job (figure 55) ont été tracées pour certains protons de la TRIMEB (H-3) et du<br />
4-tBuPhCOO - Na + (H-tBu, H-B/H-B’ et H-C/H-C’) à partir des expériences de titration des<br />
déplacements chimiques des protons qui participent à la complexation.
H [TRIMEB]<br />
9,00E-04<br />
8,00E-04<br />
7,00E-04<br />
6,00E-04<br />
5,00E-04<br />
4,00E-04<br />
3,00E-04<br />
2,00E-04<br />
1,00E-04<br />
H-3 TRIMEB<br />
0,00E+00<br />
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0<br />
Fraction molaire de TRIMEB (r)<br />
109<br />
H [4-tBuPhCOO - Na + ]<br />
9,00E-04<br />
8,00E-04<br />
7,00E-04<br />
6,00E-04<br />
5,00E-04<br />
4,00E-04<br />
3,00E-04<br />
2,00E-04<br />
1,00E-04<br />
H-tBu<br />
H-b / H-b'<br />
H-c / H-c'<br />
0,00E+00<br />
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0<br />
Fraction molaire de 4-tBuPhCOO - Na + (r)<br />
Figure 55 : Tracés de Job pour certains protons de la TRIMEB et du 4-tBuPhCOO - Na + .<br />
Les courbes passent toutes par un maximum pour r = 0,5. La TRIMEB forme donc un<br />
complexe 1:1 avec le 4-tBuPhCOO - Na + dans l’eau.<br />
Il reste maintenant à déterminer la constante d’association de ce complexe pour compléter<br />
l’étude thermodynamique. La méthode itérative de calcul COMPLEX a été appliquée aux<br />
protons à partir desquels ont été tracées les courbes de Job. Les résultats obtenus sont<br />
consignés dans le tableau suivant (tableau 7) :<br />
Tableau 7 : Calcul de Ka par un algorithme de régression multiparamétrique sur différents protons de la<br />
TRIMEB et du 4-tBuPhCOO - Na + .<br />
Molécule TRIMEB 4-tBuPhCOO - Na +<br />
Proton H-3 H-C/H-C’ H-tBu<br />
Ka (M -1 ) 1700 1800 2000<br />
Ka moyen (M -1 ) 1830 ± 380<br />
Les constantes d’association calculées pour les protons H-3, H-tBu et H-C/H-C’ sont très<br />
voisines. Ces résultats semblent donc cohérents. La valeur moyenne de la constante<br />
d’association du complexe a été calculée à partir des valeurs de Ka trouvées pour H-3, H-tBu<br />
et H-C/H-C’. L’intervalle de confiance donné est calculé avec une probabilité de 95 % (Loi de<br />
Student) sur la valeur de la moyenne.<br />
Enfin, la structure tridimensionnelle du complexe a été appréhendée à partir d’une expérience<br />
T-ROESY effectuée sur le mélange TRIMEB / 4-tBuPhCOO - Na + 5 mM / 5 mM dans l’eau
(D2O, 298 K, pH = 7, tm = 100 ms). Le modèle proposé se base sur l’observation des<br />
interactions dipolaires intermoléculaires qui traduisent les proximités spatiales entre les<br />
protons des deux espèces (figure 56).<br />
ppm<br />
2<br />
4<br />
6<br />
8<br />
ppm<br />
1.5<br />
H-6 H-5 H-3 H-6’<br />
3.8 3.6 3.4 3.2 ppm<br />
8 7 6 5 4 3 2 ppm<br />
ppm<br />
7.5<br />
8.0<br />
110<br />
H-tBu<br />
H-6<br />
H-5<br />
H-3 H-6’<br />
3.8 3.6 3.4 3.2 ppm<br />
Figure 56 : Carte T-ROESY du mélange TRIMEB / 4-tert-butylbenzoate de sodium (500,13 MHz, 5 mM<br />
pour chacune des espèces, D2O, 298 K, tm = 300 ms) et représentation tridimensionnelle de complexe 1:1<br />
TRIMEB / 4-tert-butylbenzoate de sodium.<br />
H-C/H-C’<br />
H-B/H-B’<br />
En résumé, le complexe d’inclusion formé entre la TRIMEB et le 4-tert-butylbenzoate de<br />
sodium est un complexe de type 1:1, dont la constante d’association est estimée à environ<br />
1800 M -1 . Ces résultats sont tout à fait en accord avec ceux déjà publiés.<br />
En effet, Höfler et coll. 229 ont utilisé une technique différente, la microcalorimétrie, pour<br />
réaliser l’étude thermodynamique de complexes d’inclusion entre la -CD et ses dérivés<br />
méthylés et l’acide 4-tert-butylbenzoïque dans un tampon phosphate (0,1 M, pH = 7,2). Ils en<br />
tirent les conclusions suivantes (tableau 8) :
Tableau 8 : Paramètres thermodynamiques (stoechiométrie et constante d’association) des complexes<br />
formés entre le 4-tert-butylbenzoate de sodium et les dérivés -CD, DIMEB et TRIMEB (Höfler et coll.)<br />
Type de CD Stoechiométrie Constante d’association Ka<br />
-CD 1:1 18000 M -1<br />
DIMEB 1:1 28000 M -1<br />
TRIMEB 1:1 1500 M -1<br />
On constate que les valeurs trouvées par RMN et par microcalorimétrie pour la constante<br />
d’association du complexe formé entre la TRIMEB et le sel de l’acide 4-tertbutylbenzoïque<br />
sont du même ordre de grandeur. Ceci prouve la fiabilité des résultats obtenus par les deux<br />
méthodes.<br />
Aux vues de ces conclusions, nous avons choisi de ne pas faire l’étude thermodynamique du<br />
complexe DIMEB / 4-tBuPhCOO - Na + par RMN et de nous appuyer sur les données<br />
bibliographiques (Tableau 8).<br />
V.2.2. Mise en évidence du pouvoir d’inclusion des phospholipidylcyclodextrines<br />
V.2.2.1. Etude des variations de déplacement chimique<br />
La conservation des propriétés d’inclusion de la partie cyclodextrine de la<br />
TRIMEB-Succ-DMPE 14 peut être mise en évidence par l’étude de la variation des<br />
déplacements chimiques des signaux protons de la molécule “invitée”.<br />
1 - +<br />
Les spectres RMN H du 4-tBuPhCOO Na seul (5 mM), du mélange<br />
TRIMEB / 4-tBuPhCOO - Na + (5 mM / 5 mM) et du mélange TRIMEB-Succ-DMPE /<br />
4-tBuPhCOO - Na + (5 mM / 5 mM) ont été effectués dans D2O à 298 K et sont représentés<br />
figure 57.<br />
111
(a)<br />
(b)<br />
(c)<br />
8.0 7.8 7.6 7.4 ppm<br />
= 0,02<br />
= 0,15<br />
8.0 7.8 7.6 7.4 ppm<br />
= 0,02<br />
H-B/H-B’ H-C/H-C’<br />
= 0,10<br />
8.0 7.8 7.6 7.4 ppm<br />
112<br />
1.5 1.4 1.3 ppm<br />
= 0,12<br />
1.5 1.4 1.3 ppm<br />
= 0,08<br />
H-tBu<br />
1.5 1.4 1.3 ppm<br />
Figure 57 : Spectres RMN 1 H partiels (500,13 MHz, 5 mM, D2O, 298 K) du 4-tert-butylbenzoate de sodium<br />
(a) seul (pH = 6,9), (b) en présence de TRIMEB (5 mM, pH = 6,9) et (c) en présence de<br />
TRIMEB-Succ-DMPE 14 (5 mM, pH = 7,3).<br />
On observe une variation de déplacement chimique importante des protons H-C/H-C’ vers les<br />
champs forts et des protons H-tBu vers les champs faibles lorsque le 4-tBuPhCOO - Na + se<br />
trouve en présence de TRIMEB. Les protons H-B/H-B’ varient quant à eux très légèrement<br />
vers les champs faibles (figure 57 b). Ce phénomène est dû à la formation du complexe<br />
d’inclusion entre la TRIMEB et le 4-tBuPhCOO - Na + , comme nous l’avons vu précédemment.<br />
Les mêmes variations de déplacement chimique sont observées en présence de TRIMEB-<br />
Succ-DMPE 14 (figure 57 c). Elles semblent mettre en évidence un phénomène de<br />
complexation entre la CD amphiphile et le 4-tBuPhCOO - Na + .<br />
Toutefois, les variations de déplacement chimique étant moins importantes pour le système<br />
14 / 4-tBuPhCOO - Na + que pour le système TRIMEB / 4-tBuPhCOO - Na + , on peut penser que<br />
les complexes d’inclusion formés avec les phospholipidyl-CDs ont une constante<br />
d’association un peu plus faible que ceux formés avec la CD correspondante seule.<br />
On notera un élargissement significatif des signaux des protons du 4-tBuPhCOO - Na + en<br />
présence de 14, correspondant à une diminution de T2 et donc, à une augmentation du C<br />
apparent. Ceci est bien en adéquation avec un échange rapide du 4-tBuPhCOO - Na + avec un<br />
système organisé.
V.2.2.2. Structure 3D des complexes Phospholipidyl-CDs / 4-tBuPhCOO - Na +<br />
Une expérience T-ROESY a été réalisée sur le mélange TRIMEB-Succ-DMPE 14 /<br />
4-tBuPhCOO - Na + 5 mM / 5 mM dans D2O à 298 K (figure 58).<br />
ppm<br />
1.0<br />
1.5<br />
ppm<br />
2<br />
4<br />
6<br />
8<br />
Protons de la cavité de la CD<br />
4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4 3.3 3.2 3.1 ppm<br />
H-tBu<br />
8 7 6 5 4 3 2 1 ppm<br />
Protons des<br />
chaînes myristates<br />
113<br />
ppm<br />
0.8<br />
1.0<br />
1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 ppm<br />
ppm<br />
7.5<br />
8.0<br />
H-tBu<br />
Protons des<br />
chaînes myristates<br />
Protons de la cavité de la CD<br />
4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4 3.3 3.2 ppm<br />
CH 3 (chaînes<br />
myristates)<br />
Figure 58 : Carte T-ROESY du mélange TRIMEB-Succ-DMPE 14 / 4-tert-butylbenzoate de sodium<br />
(500,13 MHz, 5 mM pour chacune des espèces, D2O, 298 K, tm = 100 ms, pH = 7,3).<br />
H-C/H-C’<br />
H-B/H-B’<br />
Les proximités spatiales observées entre les protons de la cavité de la partie cyclodextrine de<br />
la TRIMEB-Succ-DMPE 14 et les protons de la molécule “invitée” indiquent clairement que<br />
le 4-tBuPhCOO - Na + s’inclut dans le macrocycle.<br />
Par ailleurs, des interactions dipolaires sont aussi observées entre les protons de la cavité de la<br />
CD et ceux situés en fin de chaînes phospholipidiques. Un processus d’auto-inclusion apparaît<br />
comme peu probable, car il empêcherait les phénomènes d’auto-organisation des<br />
phospholipidyl-CDs précédemment mis en évidence. De plus, Lin et coll. 230 ont montré que la<br />
dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC) ne s’incluait pas dans la -CD.
Il semblerait plutôt que les chaînes aliphatiques des phospholipidyl-CDs soient interdigitées<br />
entre elles et forment un cœur hydrophobe à l’intérieur des fibres micellaires. L’extrémité<br />
d’une chaîne peut alors se trouver en contact avec la partie macrocyclique d’une autre<br />
molécule qui lui fait face dans le système organisé (figure 59).<br />
L’hypothèse d’un phénomène de compétition entre l’inclusion du 4-tBuPhCOO - Na + par le<br />
grand côté de la CD et une légère inclusion des chaînes par le côté opposé est confirmée par<br />
l’observation d’interactions dipolaires entre les protons du groupe tert-butyle de la molécule<br />
“invitée” et les protons des méthyles de l’extrémité des chaînes myristates. Les constantes<br />
d’association, plus faibles pour les complexes phospholipidyl-CD / 4-tBuPhCOO - Na + que<br />
pour les complexes CD / 4-tBuPhCOO - Na + pourraient en partie être expliquées par ce<br />
phénomène de compétition.<br />
Par contre, on n’observe pas d’interaction dipolaire entre les protons des chaînes myristates et<br />
les protons aromatiques du 4-tBuPhCOO - Na + , ce qui laisse à supposer que la petite molécule<br />
hydrophobe est uniquement incluse dans les cavités des cyclodextrines et non dans le cœur<br />
hydrophobe des systèmes micellaires.<br />
Figure 59 : Représentation tridimensionnelle du complexe 1:1 TRIMEB-Succ-DMPE 14 /<br />
4-tert-butylbenzoate de sodium dans les systèmes organisés.<br />
L’étude effectuée sur le complexe DIMEB-Succ-DMPE 10 / 4-tBuPhCOO - Na + a été réalisée<br />
dans les mêmes conditions que pour son analogue perméthylé 14 (T-ROESY, mélange<br />
DIMEB-Succ-DMPE 10 / 4-tBuPhCOO - Na + 5 mM / 5 mM dans D2O, pH = 6,5,<br />
298 K, tm = 100 ms). Les résultats obtenus sont similaires à ceux de la TRIMEB-Succ-<br />
DMPE 14, à savoir la conservation de la capacité d’inclusion de la partie cyclodextrine.<br />
114
V.3. Conclusion<br />
Dans ce chapitre, il s’agissait de prouver que les phospholipidyl-cyclodextrines solubles dans<br />
l’eau, c'est-à-dire la DIMEB-succ-DMPE 10 et la TRIMEB-Succ-DMPE 14, conservaient les<br />
propriétés d’inclusion de la CD. Le 4-tert-butylbenzoate de sodium (4-tBuPhCOO - Na + ) a été<br />
choisi comme molécule “invitée” modèle. Cette molécule est connue pour former de bons<br />
complexes d’inclusion avec les dérivés de la -CD.<br />
Le processus d’agrégation des cyclodextrines amphiphiles dans l’eau ne permet pas de<br />
déterminer directement les paramètres thermodynamiques d’éventuels complexes d’inclusion<br />
formés entre les phospholipidyl-CDs et le 4-tBuPhCOO - Na + en raison des interactions<br />
compétitives. L’étude thermodynamique par RMN a donc d’abord été réalisée sur le<br />
complexe formé entre la molécule “invitée” et la TRIMEB, afin d’extrapoler les résultats à<br />
l’étude de la complexation de la TRIMEB-Succ-DMPE 14. Le complexe<br />
TRIMEB / 4-tBuPhCOO - Na + est de stoechiométrie 1:1 avec une constante d’association<br />
estimée à environ 1800 M -1 . La structure tridimensionnelle de ce complexe a également été<br />
déterminée.<br />
La comparaison des variations de déplacements chimiques des spectres RMN 1 H et des<br />
spectres T-ROESY effectués sur les mélanges TRIMEB / 4-tBuPhCOO - Na + et<br />
14 / 4-tBuPhCOO - Na + a mis en évidence l’existence d’un complexe d’inclusion entre 14 et la<br />
molécule “invitée” modèle du même type que celui formé avec la TRIMEB, mais avec une<br />
constante d’inclusion qui semble plus faible. Ceci pourrait s’expliquer par un phénomène de<br />
compétition entre l’inclusion de la molécule invitée par le grand côté d’une part, et une légère<br />
inclusion par le côté opposé des chaînes lipidiques des phospholipidyl-CDs qui se font face<br />
dans le système organisé d’autre part.<br />
Le complexe DIMEB-Succ-DMPE 10 / 4-tBuPhCOO - Na + présente les mêmes caractéristiques<br />
structurales que le complexe 14 / 4-tBuPhCOO - Na + . Toutefois, on peut supposer que la valeur<br />
de la constante d’association est plus élevée, étant donné les valeurs de constantes<br />
d’association trouvées pour la DIMEB et pour la TRIMEB (28000 M -1 vs 1500 M -1 ).<br />
115
VI. Comportement des phospholipidyl-cyclodextrines<br />
méthylées dans des systèmes de type membranaire<br />
Les phospholipidyl-cyclodextrines ont été mises au point dans le but d’étudier de nouvelles<br />
voies de vectorisation pour le transport de principes actifs. Les dérivés méthylés 10 et 14<br />
s’auto-organisent sous forme d’objets de grosse taille, solubles en milieu aqueux. Au sein de<br />
ces systèmes, il a été démontré que les parties cyclodextrine forment des complexes<br />
d’inclusion avec des molécules “invitées” hydrophobes. Ces molécules ont de bonnes<br />
caractéristiques de transporteur.<br />
Il reste à savoir si ces composés ont des propriétés de vectorisation vers les cellules<br />
membranaires. Cela impose d’étudier finement les interactions entre les phospholipidyl-CDs<br />
et les systèmes membranaires naturels. Dans un premier temps, nous verrons comment il est<br />
possible de former et de caractériser la structure d’une bicouche lipidique formée uniquement<br />
à partir de phospholipidyl-cyclodextrines par la technique des films noirs. Nous étudierons<br />
ensuite les interactions entre les CDs amphiphiles et un système de bicouche<br />
phospholipidique préformé (liposomes de DMPC) grâce à la RMN du phosphore.<br />
VI.1. Les films noirs : modèle de membrane inversée de<br />
phospholipidyl-cyclodextrines<br />
Cette étude a été menée en étroite collaboration avec le Laboratoire d’optique X<br />
(SPEC / DRECAM / DSM, <strong>CEA</strong> Saclay) dirigé par le D r Jean-Jacques BENATTAR. Les<br />
expériences de réflectivité par rayons X ont été réalisées par Caroline SULTANEM.<br />
VI.1.1. Qu’est-ce qu’un film noir ?<br />
Les films noirs de surfactants sont des bicouches amphiphiles dont l’architecture moléculaire<br />
est bien définie aujourd’hui 231,232 . Ils présentent un intérêt scientifique majeur dans la mesure<br />
où les interactions physiques qui déterminent leur structure sont très proches de celles mises<br />
en jeu dans les membranes biologiques. On distingue deux types de films noirs : les films<br />
116
noirs communs et les films noirs de Newton. Dans les films noirs communs, les deux parois<br />
de surfactants sont séparées par une couche d’eau liquide, tandis que dans les films noirs de<br />
Newton, le coeur aqueux se limite à une fine couche d’hydratation. Ces derniers sont<br />
particulièrement intéressants car ils possèdent une structure très compacte et un haut degré<br />
d’organisation.<br />
Expérimentalement, on forme des films verticaux en plongeant un cadre métallique dans une<br />
cuve contenant une solution de tensio-actifs à une concentration supérieure à la CMC. Avant<br />
toute chose, on attend que l’équilibre entre les tensio-actifs présents en solution sous forme de<br />
micelles et ceux qui tapissent l’interface s’établisse. La surface entourant le cadre est alors<br />
saturée. Le film est progressivement étiré en hissant le cadre hors de la solution. Les queues<br />
hydrophobes des surfactants pointent vers l’extérieur, tandis que les têtes polaires se font face<br />
à l’intérieur du film (figure 60). L’état noir correspond au stade ultime du drainage des films<br />
de tensio-actifs, lorsque ceux-ci ont atteint leur épaisseur minimale.<br />
Écoulement<br />
de l’eau<br />
Figure 60 : Principe de la formation d’un film noir de Newton<br />
Un film noir ne réfléchit plus la lumière car il est beaucoup plus mince que les longueurs<br />
d’onde du spectre visible. En effet, la différence de marche géométrique entre les faisceaux<br />
réfléchis par chacune des interfaces air / film est très faible devant ces longueurs d’onde. Les<br />
faisceaux réfléchis sont déphasés, ils ne conduisent qu’à des interférences destructives.<br />
Cependant, les films ne sont pas noirs pour les rayons X, dont les longueurs d’onde sont de<br />
l’ordre de l’angström. Les faisceaux réfléchis sur chacune des faces du film interfèrent de<br />
manière constructive. On obtient alors des franges qui permettent de remonter à la structure<br />
moléculaire de ces bicouches de tensio-actifs.<br />
117
VI.1.2. Méthode de caractérisation des films noirs : la réflectivité de rayons X<br />
aux incidences rasantes<br />
Une expérience de réflectivité consiste à éclairer un échantillon avec un faisceau de rayons X<br />
faisant un angle avec sa surface et à mesurer ainsi le rapport R() = I() / I0, I0 étant<br />
l’intensité du faisceau incident et I() l’intensité du faisceau spéculaire réfléchi par le film à<br />
l’angle dans le plan d’incidence 233 . Par conséquent, le vecteur de diffusion q (q = 4 / <br />
sin) est perpendiculaire à la surface du film (figure 61).<br />
z<br />
air (n=1)<br />
faisceau<br />
incident<br />
faisceau<br />
réfléchi<br />
q<br />
k i<br />
k r<br />
<br />
<br />
118<br />
t<br />
milieu<br />
d’indice n<br />
faisceau<br />
transmis<br />
Figure 61 : Echantillon éclairé par un faisceau de rayons X<br />
Connaissant le rapport de réflectivité R(), on peut remonter au profil de densité électronique<br />
le long de la normale à la surface du film. Les films sont ensuite décrits comme un ensemble<br />
de strates de densité électronique homogène. Il faut souligner que la technique de réflectivité<br />
X n’est sensible qu’aux gradients de densité électronique perpendiculaires à la surface du<br />
film. Ainsi, lorsque le faisceau incident frappe la surface du film avec un angle , une partie<br />
est réfléchie, une autre transmise. Ce faisceau transmis se propage à l’intérieur du film jusqu’à<br />
atteindre une interface délimitant deux zones de densité électronique différente. Une partie du<br />
rayon est de nouveau réfléchie, une autre transmise, et ainsi de suite. Les faisceaux réfléchis<br />
par chacune des interfaces interfèrent et produisent des franges dites de Kiessig (figure 62).<br />
La largeur de ces franges est inversement proportionnelle à l’épaisseur du film dont la valeur<br />
sera déterminée grâce à un programme d’ajustement.
La technique de réflectivité de rayons X est particulièrement adaptée à l’étude des films<br />
verticaux car ils présentent un gradient de densité électronique important à chacune des deux<br />
interfaces film / air. Ils permettent ainsi d’obtenir des franges d’interférence très contrastées.<br />
REFLECTIVITE<br />
VECTEUR <strong>DE</strong> DIFFUSION Q<br />
119<br />
Franges de Kiessig<br />
Figure 62 : Spectre de réflectivité d’un film de Newton d’un surfactant : le C12E6<br />
Grâce à un traitement mathématique des courbes expérimentales de réflectivité, on accède<br />
finalement aux informations suivantes :<br />
l’épaisseur totale du film,<br />
l’épaisseur des différentes couches électroniques qui le constitue (dans le cas le plus<br />
simple, il s’agit des épaisseurs des couches hydrophiles, hydrophobes, et de<br />
l’éventuelle couche d’eau séparant les deux parois du film),<br />
les densités de chacune de ses couches,<br />
les rugosités de chacune des interfaces.
VI.1.3. Résultats antérieurs<br />
VI.1.3.1. Films noirs de phospholipides purs<br />
La dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC) est capable de former des films noirs stables<br />
pendant plusieurs jours. L’analyse de la courbe de réflectivité a permis de caractériser la<br />
structure moléculaire de ce film comme étant une bicouche naturelle inversée, d’épaisseur<br />
totale égale à 59 Å 234 .<br />
VI.1.3.2. Film noirs de cyclodextrines amphiphiles<br />
La 6-(cholest-5-en-3-ylamido)succinylamido-6 I -désoxy-per(2,6-di-O-methyl)--CD, plus<br />
communément appelée Chol-DIMEB (figure 63), est une cyclodextrine amphiphile qui a été<br />
synthétisée dans notre laboratoire par Auzély-Velty et coll. 196<br />
HO<br />
O<br />
NH<br />
O<br />
OMe<br />
O<br />
HN<br />
HO<br />
O<br />
120<br />
OMe<br />
Me<br />
O<br />
OMe O<br />
6<br />
Me<br />
CHMe2<br />
Figure 63 : Structure de la Chol-DIMEB<br />
Javierre et coll. 235 ont montré qu’il est possible de former un film noir de Chol-DIMEB pur.<br />
Quelle que soit la concentration de la solution, sa stabilité est faible (environ 15 mn) mais<br />
permet néanmoins de faire une mesure de réflectivité afin de déterminer son épaisseur qui est<br />
de 54 Å.<br />
Par contre, elles forment des films mixtes très stables en présence de phospholipides<br />
classiques comme la DMPC. La stabilité optimale est obtenue pour un rapport 3:1 entre le<br />
lipide et le dérivé de la cyclodextrine. La figure suivante montre la structure d’un tel film<br />
obtenu par réflectivité des RX (figure 64).
Reflectivité I / I O<br />
10 -2<br />
10 -3<br />
10 -4<br />
10 -5<br />
10 -6<br />
10 -7<br />
10 -8<br />
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5<br />
Scattering wave vector Q (Å<br />
z -1 )<br />
densité électronique<br />
121<br />
13.3Å 11.4Å 25.6Å 11.4Å 13.3Å<br />
Epaisseur : 75 Å<br />
Figure 64 : Courbe de réflectivité, profil de densité électronique et représentation schématique de la<br />
structure d’un film noir mixte DMPC / Chol-DIMEB.<br />
Enfin, les auteurs ont mis en évidence que les cavités des cyclodextrines conservent leur<br />
capacité d’inclusion dans les films mixtes DMPC / Chol-DIMEB. Pour cela, ils ont utilisé la<br />
Dosulépine, un composé biologiquement actif bien connu pour s’inclure dans les<br />
cyclodextrines.<br />
VI.1.4. Résultats et discussion<br />
Avec la Chol-DIMEB, nous avons vu qu’il n’était pas possible d’obtenir des films noirs<br />
stables sans la présence de phospholipides. L’objectif de ce travail consistera à former des<br />
films noirs de Newton stables, composés uniquement de phospholipidyl-cyclodextrines, afin<br />
d’étudier leur structure moléculaire.<br />
Comme indiqué précédemment, les films noirs de Newton sont des structures très ordonnées,<br />
caractérisées par un empilement moléculaire dense. Il est bien établi que la formation de films
stables dépend étroitement de la compacité des couches adsorbées à l’interface air / eau de la<br />
solution à partir desquelles les films noirs sont obtenus. C’est pourquoi nous travaillerons<br />
avec des solutions de phospholipidyl-cyclodextrines à des concentrations (c = 0,5 mg.mL -1 )<br />
nettement supérieures à la CMC pour assurer une couverture moléculaire maximale à<br />
l’interface air / eau. Pour toutes les solutions utilisées dans cette étude, les valeurs de tension<br />
de surface à l’équilibre sont comprises entre 36 et 38 mN.m -1 .<br />
VI.1.4.1. Effet de la concentration de sel en solution et du degré de méthylation des<br />
cyclodextrines sur la structure des films<br />
Les films obtenus à partir de solutions de DIMEB-Succ-DMPE 10 et de TRIMEB-Succ-<br />
DMPE 14 dans l’eau, sans addition de sels, sont “gris”, c'est-à-dire trop épais pour être<br />
étudiés par réflectivité de rayons X. En fait, les molécules 10 et 14 sont toutes les deux<br />
chargées négativement (-1) au niveau du groupement phosphate porté par la partie<br />
phospholipidique des CDs amphiphiles. Les parois du film, constituées d’un empilement de<br />
phospholipidyl-cyclodextrines sont donc chargées négativement. A l’image de deux aimants,<br />
dont on veut mettre en contact les extrémités de même polarité, il se crée des forces de<br />
répulsion électrostatique entre les parois du film qui s’opposent à leur rapprochement et<br />
expliquent l’épaisseur importante de ces films.<br />
Pour atteindre l’état de film noir de Newton, il est nécessaire d’écranter partiellement les<br />
charges pour diminuer les forces de répulsion électrostatique agissant entre les parois des<br />
films, en ajoutant un sel dans la solution. Ainsi, en présence de 0,07 mol.L -1 de chlorure de<br />
sodium (NaCl) en solution, des films noirs très stables (durée de vie de plusieurs heures) sont<br />
obtenus. Dans les deux cas, le drainage est très rapide et les films de 10 et de 14 atteignent<br />
respectivement une épaisseur minimum de 125 Å et de 104 Å en 15 minutes. Les courbes de<br />
réflectivité de rayons X des deux films à l’équilibre sont représentées figure 65 a. Ces courbes<br />
montrent une série de franges de Kiessig bien définies dans l’espace réciproque. Les franges<br />
observées sur la courbe de réflectivité du film de DIMEB-Succ-DMPE 10 sont plus étroites<br />
que celles de la courbe du dérivé TRIMEB 14. Les films noirs de 10 sont donc plus épais que<br />
ceux de 14. Les profils de densité électronique et les paramètres dérivés de la procédure<br />
d’ajustement sont également représentés figure 65 b et c.<br />
122
Réflectivité<br />
0,001<br />
0,0001<br />
10 -5<br />
10 -6<br />
10 -7<br />
DIMEB avec 0.07 M NaCl TRIMEB avec 0.07 M NaCl<br />
0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3<br />
vecteur de diffusion (Å -1 )<br />
(a)<br />
123<br />
(b)<br />
(c)<br />
profil de densité électronique<br />
profil de densité électronique<br />
3.5 10 -6<br />
3 10 -6<br />
2.5 10 -6<br />
2 10 -6<br />
1.5 10 -6<br />
1 10 -6<br />
5 10 -7<br />
4 10 -6<br />
3.5 10 -6<br />
3 10 -6<br />
2.5 10 -6<br />
2 10 -6<br />
1.5 10 -6<br />
1 10 -6<br />
5 10 -7<br />
0<br />
-20 0 20 40 60 80 100 120 140<br />
épaisseur (Å)<br />
0<br />
-20 0 20 40 60 80 100 120<br />
épaisseur (Å)<br />
Figure 65 : (a) Courbes de réflectivité de rayons X des films de DIMEB-Succ-DMPE 10 (trait plein) et de<br />
TRIMEB-Succ-DMPE 14 (pointillés) obtenus à partir de solutions de 10 et de 14 dans 0,07 M de NaCl.<br />
Profils de densité électronique des films de (b) DIMEB-Succ-DMPE 10 et (c) TRIMEB-Succ-DMPE 14<br />
obtenus à partir des courbes de réflectivité.<br />
La structure globale des films de 10 et de 14 semble très similaire. Ils sont composés tous<br />
deux d’une partie centrale hydrophile moins dense que les couches extérieures qui sont en<br />
contact avec l’air. L’épaisseur des couches extérieures est identique pour les films de 10 et de<br />
14, égale à 13 Å. Par contre, la partie centrale du film de 10 est plus épaisse de 21 Å que celle<br />
du film 14. De plus, au vu des valeurs de densité électronique, il apparaît que les molécules de<br />
TRIMEB-Succ-DMPE 14 sont empilées de manière plus dense dans les films que leurs<br />
homologues diméthylés 10.<br />
Une augmentation de la concentration en sel jusqu’à 0,1 mol.L -1 de NaCl en solution entraîne<br />
la formation de films plus fins mais dont la durée de vie est réduite de manière significative.<br />
Dans ces conditions de stabilité (durée de vie comprise entre 20 et 60 minutes), le temps<br />
d’acquisition des courbes de réflectivité est trop court pour obtenir des informations précises<br />
sur la structure interne des films. Seule leur épaisseur totale est déterminée précisément. Il est<br />
Å 1
intéressant de remarquer que les films de DIMEB-Succ-DMPE 10 sont toujours plus épais de<br />
16 Å que ceux de TRIMEB-Succ-DMPE 14 en présence de 0,1 mol.L -1 de NaCl.<br />
VI.1.4.2. Description de la structure des films<br />
Dans le cas où l’extension d’une molécule de DIMEB-Succ-DMPE 10 et de TRIMEB-Succ-<br />
DMPE 14 est maximale, leur longueur peut être grossièrement estimée à 38 Å (8 Å pour la<br />
hauteur du cône de la CD et 30 Å pour la partie DMPE + bras espaceur). Or, l’épaisseur totale<br />
des films de 10 et 14 déterminée par réflectivité de rayons X, varie de 94 à 130 Å en fonction<br />
de la concentration en NaCl, soit plus de deux fois la longueur maximale des CDs<br />
amphiphiles. Les deux parois du film, constituées de phospholipidyl-cyclodextrines, ne se<br />
font donc pas directement face mais doivent être séparées par une couche centrale. D’après les<br />
expériences de diffusion, la taille des agrégats de phospholipidyl-cyclodextrines présents en<br />
solution est supérieure à 200 nm. Il paraît donc évident que les films étudiés sont trop fins<br />
pour piéger de tels agrégats. Par conséquent, les deux parois du film sont probablement<br />
séparées par une couche d’eau, dont l’épaisseur dépend de la concentration de sel dans la<br />
solution et du degré de méthylation sur les hydroxyles de la cyclodextrine.<br />
On se propose de décrire les films de TRIMEB-Succ-DMPE 14 et de DIMEB-Succ-DMPE 10<br />
selon le modèle suivant (figure 66) :<br />
DIMEB-Succ-DMPE 10<br />
ou<br />
TRIMEB-Succ-DMPE 14<br />
124<br />
couches<br />
extérieures<br />
couche<br />
centrale<br />
eau liée<br />
couches<br />
extérieures<br />
Figure 66 : Représentation schématique de la structure d’un film noir de phospholipidyl-CDs
Les couches extérieures contiennent les queues hydrophobes, c'est-à-dire le phospholipide et<br />
le bras espaceur (+ 3 molécules d’eau autour du groupement phosphate). Le cœur du film est<br />
constitué des cyclodextrines et d’une couche d’eau. Dans le cadre de ces hypothèses, il va être<br />
possible de calculer l’angle d’inclinaison de la partie phospholipidique par rapport à la<br />
normale du film et l’aire moyenne par molécule.<br />
Angle d’inclinaison des queues hydrophobes ()<br />
Si l’on considère que les couches extérieures de 13 Å d’épaisseur contiennent les queues<br />
hydrophobes, dont on estime la longueur égale à 30 Å, alors ces queues réalisent un angle<br />
d’inclinaison d’environ 65° par rapport à la normale du film. Un tel angle d’inclinaison a déjà<br />
été observé pour des films noirs de Newton de dodécylsulfate de sodium (SDS) 233 et permet<br />
aux chaînes alkyles de s’empiler de manière plus compacte.<br />
Aire moyenne par molécule (A)<br />
L’aire moyenne par molécule dans le film peut-être déterminée à partir de l’équation<br />
suivante :<br />
ext<br />
ext ne<br />
<br />
(21)<br />
ext<br />
A<br />
t<br />
où ext et t ext représentent respectivement la densité électronique et l’épaisseur de la couche<br />
extérieure déduites des procédures d’ajustement. ne ext est la somme des électrons des queues<br />
hydrophobes et des molécules d’eau d’hydratation (trois molécules d’eau autour du groupe<br />
phosphate).<br />
Les aires moyennes par molécules calculées à partir de cette expression sont estimées<br />
respectivement à 280 Ų et 240 Ų, pour la DIMEB-Succ-DMPE 10 et pour la TRIMEB-<br />
Succ-DMPE 14 (avec 0,07 mol.L -1 de NaCl).<br />
125
VI.1.4.3. Influence de l’hydratation des cyclodextrines sur la structure des films<br />
Nous avons vu que la différence d’épaisseur entre les films de 10 et de 14 est directement liée<br />
à l’épaisseur de la partie centrale. Comme nous l’avons déjà expliqué, cette partie est<br />
constituée de la tête cyclodextrine et des molécules d’eau emprisonnées dans le coeur du film.<br />
Il est possible de calculer précisément le nombre moyen de molécules d’eau associées à<br />
chaque molécule de phospholipidyl-cyclodextrines dans le film à partir de l’équation<br />
suivante :<br />
cd<br />
cen ne<br />
10neau<br />
<br />
(22)<br />
cen<br />
A<br />
t<br />
où cen et t cen représentent respectivement la densité électronique et l’épaisseur de la couche<br />
centrale déduites des procédures d’ajustement. ne cd est le nombre d’électrons contenus dans<br />
une cyclodextrine et A, l’aire moyenne par molécule (280 Ų pour les films de 10, 240 Ų<br />
pour les films de 14). Dans ces calculs est pris en compte la présence des contre-ions Na + qui<br />
écrantent les charges négatives portées par les phospholipidyl-cyclodextrines. Les résultats<br />
sont reportés dans le tableau 9 :<br />
Tableau 9 : Caractéristiques structurales (Aire moyenne par molécule de CD amphiphile, angle<br />
d’inclinaison des queues hydrophobes et nombre moyen de molécules d’eau de la couche centrale par CD<br />
amphiphile) des films noirs de phospholipidyl-CDs 10 et 14.<br />
Type de film noir A (en Ų) (en degré) nH20 / molécule<br />
DIMEB-Succ-DMPE 10<br />
(NaCl 0,07 M)<br />
TRIMEB-Succ-DMPE 14<br />
(NaCl 0,07 M)<br />
279 64 56<br />
241 64 41<br />
A concentration égale de sel en solution, les films de 10 sont plus riches en eau dans la<br />
couche centrale que les films de 14. Contrairement au dérivé perméthylé, la DIMEB possède<br />
sept groupements hydroxyles libres capables de former des liaisons hydrogène avec des<br />
molécules d’eau et il ne semble pas surprenant que le taux d’hydratation soit plus élevé dans<br />
les films de 10. Cette différence d’hydratation pourrait agir de manière importante sur les<br />
interactions entre les molécules constituant le film, et ainsi expliquer les différences<br />
126
d’empilement entre les films de 14 et les films de 10, ainsi que la différence d’aire moyenne<br />
par molécule.<br />
Quoiqu’il en soit, pour les films de 10 comme pour ceux de 14, l’épaisseur de la couche d’eau<br />
séparant les parois de CDs amphiphiles est très importante. De plus, la densité électronique de<br />
cette partie centrale est environ trois fois plus faible que celle de l’eau libre. Cette dernière<br />
observation suggère que l’organisation des molécules d’eau contenues dans la partie centrale<br />
du film est fortement influencée par la présence des deux murs de cyclodextrines qui<br />
l’entourent. Les cyclodextrines seraient donc capables de former des interactions à longue<br />
distance avec les molécules d’eau environnantes. L’eau de la couche centrale pourrait alors<br />
être considérée comme une couche d’eau liée. Ces résultats sont en accord avec les études qui<br />
traitent de l’hydratation des DIMEB 236,237 dans la littérature. Ces études rapportent l’existence<br />
d’un réseau de molécules d’eau qui s’ordonnent de manière à encapsuler la cage de la<br />
cyclodextrine. L’abondante hydratation de la partie DIMEB pourrait être à l’origine de cette<br />
importante couche d’eau qui occupe le centre des films de phosphotidyl-cyclodextrines.<br />
Des films noirs formés à partir de solution de complexes DIMEB-Succ-DMPE 10 / acide<br />
citrique ont été étudiés. L’acide citrique (figure 67 a) forme avec la CD un complexe de<br />
stoechiométrie 1:1 en interagissant avec les groupements hydroxyle du macrocycle sans pour<br />
autant entrer dans la cavité. Leur structure est similaire à un film de DIMEB-Succ-DMPE 10<br />
pur. Cependant, la couche centrale des films de complexes est plus dense et légèrement plus<br />
épaisse. Une analyse plus fine des paramètres structuraux montre qu’en présence d’acide<br />
citrique, les macrocycles sont 20 % plus hydratés. Ces résultats sont accord avec de récentes<br />
études qui montrent que l’acide citrique améliore l’interface entre la CD et l’eau 238 . Mieux<br />
hydratées, les CD sont également plus solubles.<br />
Par contre, la présence d’une molécule invitée dans la cavité semble perturber la stabilité des<br />
films. La durée de vie des films obtenus entre 10 et plusieurs molécules d’inclusion modèles<br />
(le 4-tert-butylbenzoate de sodium, le chlorure de 1-adamantylammonium et le<br />
chloramphénicol (figure 67 b-d)) n’excède pas 20 minutes. Les interactions entre la CD et son<br />
environnement (CD-CD et CD-eau) sont probablement affectées par le phénomène<br />
d’inclusion. L’organisation du film est bouleversée, ce qui pourrait expliquer leur faible<br />
stabilité.<br />
127
HO<br />
HO<br />
O OH<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
O O Na<br />
128<br />
NH 3 Cl<br />
(a) (b)<br />
(c) (d)<br />
Figure 67 : Structure chimique (a) de l’acide citrique, (b) du 4-tert-butylbenzoate de sodium,<br />
(c) du chlorure de 1-adamantylammonium, (d) du chloramphénicol<br />
VI.2. Systèmes mixtes DMPC / TRIMEB-Succ-DMPE 14 : mise en<br />
évidence des propriétés détergentes des phospholipidyl-CDs<br />
VI.2.1. Utilisation de la RMN 31 P dans l’étude des systèmes organisés<br />
phospholipidiques<br />
La résonance magnétique du phosphore-31 239 (RMN 31 P) est une technique relativement<br />
facile à mettre en œuvre pour l’étude des milieux organisés phospholipidiques car elle ne<br />
nécessite pas de marquage isotopique préalable. En effet, l’isotope 31 du phosphore possède<br />
une abondance naturelle de 100 %. La RMN 31 P permet d’accéder directement à la dynamique<br />
de la tête polaire des phospholipides et apporte des informations qualitatives sur<br />
l’organisation des systèmes phospholipidiques.<br />
Dans le cas des atomes de phosphore des groupes phosphates des phospholipides, deux types<br />
d’interactions coexistent :<br />
les interactions nucléaires : anisotropie de déplacement chimique,<br />
les interactions dipolaires phosphore-proton.<br />
Seul l’anisotropie de déplacement chimique du phosphore intervient dans la description des<br />
propriétés structurales et dynamiques des milieux organisés phospholipidiques. Une<br />
expérience RMN du phosphore avec un découplage large bande des protons permettra de<br />
s’affranchir des problèmes liés aux interactions dipolaires.<br />
O<br />
Cl<br />
OH<br />
NH<br />
Cl<br />
OH<br />
N<br />
O 2
VI.2.1.1. Anisotropie de déplacement chimique<br />
Le nuage électronique d’un noyau de spin I = ½ peut varier en fonction de son environnement<br />
immédiat. Ce nuage sert d’écran au noyau, ce qui a pour conséquence de modifier la valeur du<br />
champ magnétique B0 au site nucléaire. Cet effet correspond au déplacement chimique. En<br />
raison d’une distribution asymétrique de la densité électronique au site nucléaire des atomes<br />
de phosphore, ces derniers présentent un phénomène particulier qui correspond à l’anisotropie<br />
de déplacement chimique (ADC).<br />
La densité du nuage électronique entourant le phosphore n’est pas isotrope mais dépend du<br />
mode de liaison de ce noyau avec ses voisins. L’écran électronique, donc le champ effectif au<br />
site nucléaire, ne sera pas le même dans toutes les directions ; l’effet d’écran sera minimal le<br />
long de l’axe ayant la plus faible densité électronique et maximal le long de l’axe possédant la<br />
plus forte densité électronique.<br />
Il est donc possible de déterminer les axes principaux du tenseur d’ADC en plaçant un<br />
monocristal dans toutes les positions possibles par rapport au champ magnétique B0. De telles<br />
expériences ont en effet été réalisées 240,241 . D’une manière générale et d’après les résultats<br />
expérimentaux rapportés par Seelig 242 , il a été trouvé que les éléments principaux du tenseur<br />
d’ADC sont quasiment identiques pour toutes les classes de phosphocholines étudiées et<br />
approximativement égaux à 11 = + 80 ppm, 22 = + 25 ppm et 33 = - 110 ppm (figure 68)<br />
Figure 68 : Orientation des axes principaux du tenseur ADC du groupe phosphate (Phosphorus-31 NMR,<br />
principles and application, Ed. D. Gorenstein, Academic Press: New York, 1984)<br />
129
Dans le cas d’un échantillon polycristallin, qui peut être assimilé à une multitude de grains<br />
monocristallins, orientés de façon aléatoire par rapport au champ magnétique B0, on obtient<br />
un spectre dit de “poudre”. Le spectre RMN 31 P de cette poudre consiste en une superposition<br />
des fréquences de résonances provenant des diverses orientations des microcristaux par<br />
rapport à B0. L’intensité de chaque raie individuelle est pondérée par la fonction de<br />
distribution des orientations 243 . Sur le spectre de poudre représenté figure 69, on remarque<br />
qu’il est très facile d’extraire les valeurs des composantes principales du tenseur d’ADC à<br />
partir de l’écart en fréquence entre les épaules et la discontinuité centrale du spectre.<br />
Figure 69 : Spectre RMN du phosphore d’un échantillon polycristallin de phospholipide (Phosphorus-31<br />
NMR, principles and application, Ed. D. Gorenstein, Academic Press: New York, 1984)<br />
VI.2.1.2. Influence des mouvements moléculaires sur le spectre de RMN 31 P<br />
Dans des systèmes de type bicouche phospholipidique, la présence de mouvements<br />
moléculaires anisotropes va entraîner des modifications de la forme du spectre de poudre.<br />
Selon l’hypothèse où les mouvements de réorientation du groupement phosphate ont un<br />
caractère anisotrope marqué et le mouvement de rotation autour de l’un des axes est beaucoup<br />
plus rapide que les rotations autour des autres axes, le mouvement de rotation peut ainsi être<br />
considéré à symétrie axiale. Par conséquent, le mouvement d’un phospholipide peut être<br />
décrit à l’aide de deux coefficients de diffusion : R// (mouvement axial rapide) et R<br />
(mouvements lents, perpendiculaires à l’axe principal du mouvement).<br />
130
axe 2<br />
axe 1<br />
axe 3<br />
(a) (b)<br />
Figure 70 : Forme des spectres de poudre du 31 P et oscillation de l’axe de rotation (Phosphorus-31 NMR,<br />
principles and application, Ed. D. Gorenstein, Academic Press: New York, 1984)<br />
En phase lamellaire, les mouvements moléculaires sont caractérisés par la rotation rapide des<br />
phospholipides autour d’un axe qui correspond à la normale à la bicouche, n. Pour des raisons<br />
de simplifications, supposons que l’axe de rotation n est parallèle à l’axe 1 (figure 68). Cette<br />
rotation rapide a pour effet de moyenner deux éléments principaux du tenseur d’ADC, 22 et<br />
33, qui sont perpendiculaires à l’axe de rotation. Autrement dit, dans le plan perpendiculaire<br />
définit par les axes 2 et 3, on doit avoir une valeur unique de déplacement chimique désignée<br />
par , alors que le déplacement chimique le long de l’axe 1 désigné par // est différent. La<br />
différence entre // et est notée = // - (figure 70 a).<br />
Toutefois, le mouvement des molécules dans les bicouches phospholipidiques ne se limite pas<br />
toujours à la simple rotation autour de l’axe 1. Cet axe de rotation peut également adopter des<br />
mouvements d’oscillation d’amplitude limitée en décrivant un cône (figure 70 b). Ce<br />
mouvement supplémentaire a pour conséquence de moyenner partiellement les valeurs<br />
précédentes de // et pour engendrer les nouvelles valeurs effectives ’// et ’, plus petites<br />
que les valeurs initiales. Soit ’ la différence entre ’// et ’, ’ sera plus faible que .<br />
Le mouvement d’oscillation a donc pour conséquence le “rétrécissement” du spectre de<br />
poudre caractéristique d’une phase lamellaire.<br />
131
L’importance de cette diminution de la largeur du signal dépend de l’amplitude du<br />
mouvement d’oscillation de l’axe de rotation. Dans le cas limite où le mouvement de l’axe 1<br />
est totalement non restreint, le mouvement de la molécule de phospholipide devient alors un<br />
mouvement isotrope, et le signal obtenu en RMN correspond par conséquent à un seul pic<br />
dont le déplacement chimique iso est identique à celui observé en solution non visqueuse :<br />
iso = (11 + 22 + 33) / 3 = (// + 2 ) / 3 = (’// + 2 ’) / 3<br />
VI.2.1.3. Forme des spectres de poudre en RMN 31 P selon les phases lipidiques<br />
Les phospholipidyl-cyclodextrines sont des molécules amphiphiles capables de former<br />
différents types de structures organisées en fonction de leur nature, du degré d’hydratation, de<br />
la température,… On parle de polymorphisme lipidique.<br />
Les principales phases lipidiques rencontrées sont les suivantes :<br />
bicouches en phase fluide L (membranes biologiques),<br />
bicouches en phase gel L,<br />
phase hexagonale inverse HII,<br />
vésicules (MLV, SUV, LUV).<br />
Les phospholipides, dans les différents types de phases lipidiques, possèdent des mouvements<br />
moléculaires différents, ce qui conduit à l’obtention des spectres RMN 31 P, de formes<br />
différentes et significatives, qui sont représentés sur la figure suivante (figure 71) :<br />
132
Figure 71 : Forme des spectres de poudre d’un groupe phosphate selon les différentes phases<br />
phospholipidiques en RMN 31 P<br />
L’analyse de la forme des spectres RMN 31 P donnera une indication précieuse sur le type de<br />
phase lipidique présente et ce, en fonction de différents paramètres tels que la température, la<br />
concentration,…<br />
133
VI.2.2. Pouvoir de solubilisation de la TRIMEB-Succ-DMPE 14 vis-à-vis des<br />
liposomes de DMPC : étude par RMN 31 P et par diffusion de lumière<br />
VI.2.2.1. Préparation d’un liposome de DMPC<br />
La méthode la plus simple de préparation des liposomes consiste à évaporer le solvant<br />
organique dans lequel sont dissous les lipides, puis à les remettre en suspension dans un<br />
solvant aqueux par simple agitation. La température de l’eau doit être supérieure à la<br />
température de transition de phase (23 °C pour la DMPC).<br />
Il se forme des liposomes multilamellaires (MLV pour Multi Lamellar Vesicle). Ce sont des<br />
structures en bicouches lipidiques, closes, concentriques, séparées les unes des autres par des<br />
couches d’eau. Ces liposomes ont des tailles très hétérogènes (plusieurs centaines de<br />
nanomètres) et possèdent un volume aqueux interne relativement faible par rapport à la<br />
quantité de lipides.<br />
VI.2.2.2. Mise en évidence du phénomène<br />
Une solution aqueuse de liposomes de DMPC est préparée à une concentration de<br />
15 mmol.L -1 dans un tampon Tris à 0,1 mol.L -1 et à pH = 7. Visuellement, on observe une<br />
solution laiteuse (figure 72 a). Lorsqu’on ajoute 1 mmol.L -1 de TRIMEB-Succ-DMPE 14<br />
dans cette solution, celle-ci devient translucide après une simple agitation (figure 72 b). Enfin,<br />
en augmentant encore légèrement la concentration de TRIMEB-Succ-DMPE 14<br />
(2,5 mmol.L -1 ), la solution devient très rapidement limpide (figure 72 c).<br />
(a) (b) (c)<br />
Figure 72 : Echantillons de DMPC à 15 mM dans l’eau (tampon Tris 0,1 mM, pH = 7,2) (a) seule sous<br />
forme d’un liposome, (b) en présence de 1 mM de TRIMEB-Succ-DMPE 14 et (c) en présence de<br />
2,5 mM de 14<br />
134
Les spectres RMN 31 P de ces trois échantillons sont effectués à 298 K (figure 55) :<br />
Figure 73 : Spectres RMN 31 P (81,0 MHz, tampon Tris 0,1 mol.L -1 , 298 K, pH = 7,2) de DMPC 15 mM (a)<br />
seule sous forme d’un liposome, (b) en présence de 1 mM de TRIMEB-Succ-DMPE 14 et (c) en présence<br />
de 2,5 mM de 14<br />
En raison de leur grosse taille, le rayon de courbure de la paroi sphérique des liposomes est<br />
très faible, et l’organisation des phospholipides dans la bicouche est très proche de celle<br />
rencontrée dans les membranes biologiques planes. Ceci explique que le spectre RMN 31 P de<br />
la solution de liposomes de DMPC est caractéristique d’une structure de type bicouche<br />
lipidique en phase fluide (L) (figure 73 a).<br />
En présence de 1 mmol.L -1 de TRIMEB-Succ-DMPE 14, la largeur du signal RMN diminue<br />
(figure 73 b), et donc l’amplitude du mouvement d’oscillation des phospholipides dans le<br />
système organisé augmente. Ce phénomène est la conséquence de l’ajout de la<br />
phospholipidyl-cyclodextrine qui désorganise la membrane des liposomes et rend sa structure<br />
moins compacte. De plus on observe sur ce spectre l’apparition d’un nouveau signal isotrope<br />
à ~ 0 ppm.<br />
135
En présence de 2,5 mmol.L -1 de TRIMEB-Succ-DMPE 14, la raie large a disparu et a laissé<br />
place à deux raies fines isotropes à ~ 0 ppm, qui correspondent respectivement aux signaux<br />
du phosphore de la DMPC et de la TRIMEB-Succ-DMPE 14 dans un système où le<br />
mouvement des molécules observées est totalement non restreint (figure 73 c). Il peut s’agir<br />
de petites vésicules ou de micelles. Les résultats de diffusion de lumière nous laissent à penser<br />
qu’il s’agit en fait de micelles mixtes DMPC / TRIMEB-Succ-DMPE 14 en raison de la taille<br />
très petites des objets (16 nm de moyenne) et de leur très grande monodispersité.<br />
L’addition de faibles concentrations de TRIMEB-Succ-DMPE 14 entraîne rapidement une<br />
solubilisation totale des liposomes de DMPC pour donner des micelles mixtes DMPC / 14.<br />
Nous avons donc clairement mis en évidence les propriétés détergentes de la phospholipidylcyclodextrine.<br />
VI.3. Conclusion<br />
Les phospholipidyl-cyclodextrines 10 et 14 sont capables de former des films noirs de<br />
Newton stables pendant plusieurs heures. L’épaisseur des films dépend de la concentration en<br />
sel dans la solution à partir de laquelle ils sont obtenus et du degré de méthylation des<br />
cyclodextrines. Les films sont constitués de deux parois de phospholipidyl-CDs séparés par<br />
une couche d’eau centrale plus épaisse que celle habituellement observée dans les films noirs<br />
de Newton 233,234 . Les queues hydrophobes sont tournées vers l’extérieur (air) et inclinées à un<br />
angle de 64° par rapport à la normale du film, ce qui semble favoriser l’empilement des<br />
chaînes. Les têtes cyclodextrines sont dirigées vers le cœur aqueux du film. Les fortes<br />
interactions existantes entre la CD et les molécules d’eau avoisinantes créent un réseau<br />
d’ordre à longue distance qui est responsable de l’épaisseur importante et de la faible densité<br />
de la couche d’hydratation qui est en fait une couche d’eau liée.<br />
D’autre part, les propriétés détergentes des phospholipidyl-cyclodextrines ont été mises en<br />
évidence par leur fort pouvoir solubilisant vis à vis de membranes modèles de DMPC.<br />
136
VII. Etude préliminaire in vitro des propriétés de passage<br />
des phospholipidyl-cyclodextrines à travers la Barrière<br />
Hémato-Encéphalique (BHE)<br />
Cette étude a été menée en étroite collaboration avec le Laboratoire Mixte Institut Pasteur -<br />
Université d’Artois (Faculté Jean Perrin, LENS) du P r Eric MONFLIER pour les études<br />
in vitro du passage à travers la BHE, qui ont été réalisées par le D r Sébastien TILLOY et M lle<br />
Véronique MONNAERT. Les dosages immunoenzymatiques ont été effectués dans le<br />
Laboratoire du D r Christophe CREMINON, au sein du Service de Pharmacologie et<br />
d’Immunologie dirigé par Jacques GRASSI (<strong>CEA</strong> Saclay, GIF sur YVETTE).<br />
Il est à noter que cette étude est très préliminaire et si les premiers résultats sont<br />
encourageants, ils restent à confirmer par une étude beaucoup plus approndie.<br />
VII.1. Introduction<br />
Les cellules des capillaires cérébraux restreignent les échanges entre le sang et le cerveau.<br />
Elles forment une barrière appelée Barrière Hémato-Encéphalique (BHE).<br />
La BHE présente une barrière physique (jonctions serrées, absence de fenestration) et une<br />
barrière métabolique (expression de protéines telles que la P-glycoprotéine (P-gp),<br />
responsable des phénomènes de “Drug Resistance”, c'est-à-dire qu’elle empêche le passage<br />
des médicaments de façon active) qui entraînent la restriction du transport de molécules du<br />
sang vers le cerveau (figure 74). Quelques molécules peuvent cependant traverser la BHE par<br />
diffusion passive ou par l’utilisation de récepteurs ou de transporteurs. Bien que cette barrière<br />
soit nécessaire et même vitale pour le maintient de l’homéostasie cérébrale, elles représentent<br />
un véritable problème pour le traitement des maladies neurologiques et des troubles<br />
psychiatriques.<br />
137
Principes<br />
actifs<br />
Principes<br />
actifs<br />
Sang Cerveau<br />
P-gp<br />
138<br />
Jonctions<br />
serrées<br />
Cellules<br />
endothéliales<br />
Figure 74 : Représentation schématique de la monocouche de cellules endothéliales constituant la BHE<br />
Pour parvenir à augmenter la délivrance de principes actifs vers le cerveau, différentes<br />
approches ont été envisagées : l’injection intracérébrale directe de médicaments ou encore la<br />
perméabilisation temporaire de la BHE par des solutions hyperosmotiques. Toutefois, ces<br />
méthodes sont invasives et non spécifiques. Les recherches se tournent alors vers la synthèse<br />
de vecteurs spécifiques permettant de traverser cette barrière.<br />
Dans le chapitre précédent, nous avons vu que les phospholipidyl-cyclodextrines interagissent<br />
fortement avec les lipides membranaires. Ils sont capables de solubiliser les membranes des<br />
liposomes phospholipidiques à des concentrations relativement faibles grâce à leurs propriétés<br />
détergentes. Il serait intéressant de tester leur capacité à pénétrer et traverser les membranes<br />
des cellules de la BHE sans les détruire. Nous avons choisi de tester la<br />
DIMEB-Succ-DMPE 10, qui présente de meilleures propriétés d’inclusion pour les principes<br />
actifs que le dérivé TRIMEB 14 et fait de cette molécule un meilleur candidat pour la<br />
vectorisation des médicaments.<br />
Dans un premier temps, une étude de toxicité de la DIMEB-Succ-DMPE 10 sera réalisée à<br />
différentes concentrations de 10 en solution (500 µmol.L -1 , 100 µmol.L -1 et 10 µmol.L -1 ) sur<br />
un modèle in vitro de la BHE. Le seuil de non-toxicité sera définit par la concentration de<br />
phospholipidyl-CD à laquelle la BHE n’est pas détruite.<br />
Aux concentrations non cytotoxiques, il faudra prouver le passage ou non de la molécule à<br />
travers la BHE. Pour cela, nous utiliserons une méthode de dosage spécifique à la<br />
DIMEB-Succ-DMPE et très sensible : le dosage immunoenzymatique (Cf annexe IV).
VII.2. Etude du passage à travers la BHE<br />
VII.2.1. Description du modèle in vitro de la BHE<br />
Le Laboratoire du P r Monflier a développé un modèle in vitro de la BHE en 1992. Ce modèle<br />
consiste en une coculture, de part et d’autre d’un filtre, de cellules endothéliales de capillaires<br />
cérébraux de bœuf et d’astrocytes de rats nouveaux nés. Ce modèle présente toutes les<br />
caractéristiques de la BHE in vivo, à savoir la présence de jonctions serrées, la rareté de<br />
vésicules et l’expression de la P-glycoprotéine. Ceci en fait un modèle intéressant pour la<br />
prédiction de la délivrance des médicaments vers le cerveau<br />
VII.2.2. Protocole d’étude<br />
Cellules<br />
endothéliales<br />
Filtres PC<br />
Astrocytes<br />
Tampon<br />
Ringer-Hepes<br />
(RH)<br />
A t = 0 min<br />
Tampon RH +<br />
DIMEB-Succ-DMPE 10<br />
1 er puits<br />
t = 0 30 min<br />
139<br />
2 ème puits<br />
t = 30 60 min<br />
3 ème puits<br />
t = 60 90 min<br />
Figure 75 : Schéma du protocole d’étude du passage de 10 à travers la BHE<br />
4 ème puits<br />
t = 90 120 min<br />
Les expériences sont menées après 12 jours de coculture. Le jour de l’expérience, une<br />
solution tamponée de Ringer (Ringer-Hepes (RH) est un milieu physiologique) est ajoutée<br />
dans le compartiment inférieur d’une boite six puits.<br />
Puis un filtre (filtre PC) recouvert d’une monocouche de cellules endothéliales est transféré<br />
dans le premier puits de la boite six puits. Au temps zéro, une solution tamponnée de Ringer<br />
contenant du saccharose marqué au carbone 14 (marqueur paracellulaire) et la
DIMEB-Succ-DMPE 10 est placée dans le compartiment supérieur. Aux temps 30, 60, 90,<br />
120, 180 et 240 minutes après addition de la molécule 10, le filtre est transféré dans un autre<br />
puits afin de minimiser l’éventuel passage de substances du compartiment inférieur vers le<br />
compartiment supérieur. L’incubation s’effectue à 37 °C sur agitateur (figure 75).<br />
Pour cette première étude, tous les résultats seront exprimés sur 120 minutes (4 puits).<br />
VII.3. Résultats et discussion<br />
L’étude du passage de la DIMEB-Succ-DMPE 10 à travers la BHE est réalisée à trois<br />
concentrations initiales différentes de 500 µmol.L -1 , 100 µmol.L -1 et 10 µmol.L -1 de 10 dans<br />
une solution tamponnée RH. Ces trois séries d’expériences sont effectuées selon le protocole<br />
décrit précédemment sur une durée de deux heures. A t = 0 min, la solution de 10 est placée<br />
dans le compartiment supérieur. Toutes les 30 minutes, le compartiment supérieur est<br />
transféré d’un compartiment inférieur à un autre (figure 75). Chaque expérience est triplée<br />
pour contrôler la répétabilité des résultats.<br />
Lorsque l’intégrité de la monocouche des cellules endothéliales est conservée (i.e. jonctions<br />
serrées), le saccharose, molécule modèle, diffuse très faiblement à travers la BHE. Par contre,<br />
dans des conditions toxiques pour la monocouche de cellules endothéliales (i.e. jonctions<br />
ouvertes), ce même saccharose diffusera beaucoup plus facilement. Le dosage de la diffusion<br />
de cette molécule à travers la BHE se fait à l’aide de saccharose marquée au carbone 14.<br />
L’intégrité de la monocouche de cellules endothéliales est vérifiée lorsque le coefficient de<br />
perméabilité (Pe) du saccharose est inférieur à 0,2 × 10 -3 cm.min -1 dans des conditions non<br />
toxiques.<br />
Les dosages immunoenzymatiques de la DIMEB-Succ-DMPE 10 sont effectués sur la<br />
solution du compartiment supérieur au début (t = 0 min) et à la fin (t = 120 min) de<br />
l’expérience, et sur les solutions des quatre compartiments inférieurs (t = 0 à 30 min,<br />
t = 30 à 60 min, t = 60 à 90 min, t = 90 à 120 min). Les résultats des dosages sont exprimés en<br />
concentration massique. Le volume connu du compartiment supérieur (V = 1,5 mL) et des<br />
compartiments inférieurs (V = 2,5 mL chacun) vont permettre de réaliser le bilan massique<br />
140
des expériences. Nos résultats seront exprimés en % massique de quantité totale (ou quantité<br />
initiale) de 10.<br />
VII.3.1. Limite de sensibilité du dosage immunoenzymatique<br />
Pour doser la DIMEB-Succ-DMPE 10 dans une matrice complexe (milieu physiologique) et à<br />
de très faibles concentrations (de l’ordre de la µmol.L -1 ), le dosage immunoenzymatique par<br />
compétition est une méthode idéale, à condition de posséder des anticorps capables de<br />
reconnaître spécifiquement les molécules de notre phospholipidyl-CD.<br />
Des anticorps anti-DIMEB, mis au point dans le Service de Phamacologie et d’Immunologie<br />
du <strong>CEA</strong> Saclay en utilisant la DIMEB-NH2 comme haptène 244 , sont capables à priori de<br />
reconnaître la DIMEB-Succ-DMPE 10, qui est une substance dont la structure est apparentée<br />
à la DIMEB. Pour contrôler la spécificité de ces anticorps pour notre molécule, nous avons<br />
tracé les courbes dose-réponse des dosages de la DIMEB et de la DIMEB-Succ-DMPE 10<br />
(figure 76).<br />
Les anticorps anti-DIMEB reconnaissent la DIMEB-Succ-DMPE 10, mais les courbes<br />
100 × B/B0 = f(C) indiquent que le dosage est dix fois moins sensible avec 10 qu’avec la<br />
DIMEB. Toutefois, la limite de détection est établie à 1 ng.L -1 , ce qui représente déjà une très<br />
bonne sensibilité de dosage.<br />
B/Bo (%)<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
0,1 1 10 100<br />
competitor (ng/mL)<br />
141<br />
DIMEB<br />
DIMEB-Succ-DMPE 10<br />
B/B 0 50 %<br />
Figure 76 : Courbes dose-réponse des dosages par compétition de la DIMEB et de la<br />
DIMEB-Succ-DMPE 10
VII.3.2. Etude préliminaire du passage de la DIMEB-Succ-DMPE 10 à travers le<br />
filtre sans cellules endothéliales<br />
Une étude préliminaire du passage de la DIMEB-Succ-DMPE 10 à travers le filtre seul, sans<br />
couche de cellules endothéliales, a été menée pour s’assurer que le filtre laisse passer<br />
librement 10 du compartiment supérieur au compartiment inférieur.<br />
Deux types de filtres différents ont été testés : les filtres PC et les filtres Transwell. Les<br />
résultats des dosages prouvent que dans les deux cas, les filtres laissent passer la<br />
DIMEB-Succ-DMPE 10. Les filtres PC ont été choisis pour réaliser toutes les études avec la<br />
BHE.<br />
VII.3.3. Etude à 500 µmol.L -1 et 100 µmol.L -1<br />
A des concentrations initiales en DIMEB-Succ-DMPE 10 de 500 µmol.L -1 et 100 µmol.L -1 , la<br />
BHE est détruite. Ces concentrations sont cytotoxiques.<br />
VII.3.4. Etude à 10 µmol.L -1<br />
A une concentration initiale de 10 µmol.L -1 , l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique est<br />
préservée. La DIMEB-Succ-DMPE n’est pas toxique à cette concentration.<br />
Des dosages immunoenzymatiques de 10 sont alors effectués sur le compartiment supérieur et<br />
les compartiments inférieurs à t = 0 min. et à t = 120 min. Le bilan matière de 10 est<br />
représenté graphiquement en début et en fin d’expérience sur la figure 77 :<br />
142
%<br />
100<br />
90<br />
80<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0<br />
compartiments inférieurs compartiment supérieur<br />
t = 0 min t = 120 min, Essai n°1 t = 120 min, Essai n°2 t = 120 min, Essai n°3<br />
t = 0 min<br />
143<br />
t = 120 min,<br />
Essai n°1<br />
t = 120 min,<br />
Essai n°2<br />
t = 120 min,<br />
Essai n°3<br />
Compartiment supérieur 100 % 69,6 % 79,0 % 73,6 %<br />
Compartiments inférieurs 0 % 10,2 % 9,7 % 11,6 %<br />
Figure 77 : Représentation graphique de l’étude du passage de la DIMEB-Succ-DMPE 10 à travers la<br />
Barrière Hémato-Encéphalique.<br />
A t = 0 min, la concentration initiale de la solution de 10 est mesurée à 10,9 µmol.L -1 . Cette<br />
solution est placée dans le compartiment supérieur, qui contient alors 100 % de la quantité<br />
totale de 10.<br />
A t = 120 min, environ 10 % de la quantité totale de la DIMEB-Succ-DMPE 10 est retrouvée<br />
dans les compartiments inférieurs. Cette molécule a donc l’étonnante propriété de passer à<br />
travers la BHE sans la détruire pour autant. Par contre, 70 à 80 % de la quantité totale de 10<br />
demeure dans le compartiment supérieur. Les résultats obtenus pour les trois essais sont<br />
similaires et peuvent donc être considérer comme fiables.
D’après ce bilan, 10 à 20 % de la quantité initiale de DIMEB-Succ-DMPE 10 n’a pas été<br />
dosée en fin d’expérience. Il est probable que cette partie soit restée fixé dans les membranes<br />
des cellules endothéliales.<br />
Les résultats des dosages immunoenzymatiques prouvent que la DIMEB-Succ-DMPE 10<br />
passe à travers la BHE.<br />
Etude de la cinétique de passage de la DIMEB-Succ-DMPE 10 à travers la BHE<br />
Chaque compartiment inférieur représente 30 minutes de passage de la DIMEB-Succ-DMPE<br />
10 à travers la BHE. Leur dosage nous a donc permis de tracer un profil cinétique du passage<br />
(figure 78).<br />
Essai n°3<br />
Essai n°2<br />
Essai n°1<br />
t + 0min<br />
t + 30min<br />
144<br />
t + 60 min<br />
t + 120 min<br />
t + 90 min<br />
temps<br />
t + 0 min t + 30 min t + 60 min t + 90 min t + 120 min<br />
Essai n°1 0,0 % 30,1 % 58,4 % 79,9 % 100 %<br />
Essai n°2 0,0 % 34,3 % 61,5 % 81,1 % 100 %<br />
Essai n°3 0,0 % 32,1 % 61,1 % 82,3 % 100 %<br />
Figure 78 : Représentation graphique de l’étude de la cinétique de passage de la DIMEB-Succ-DMPE 10 à<br />
travers la BHE.<br />
70,0<br />
60,0<br />
50,0<br />
40,0<br />
30,0<br />
20,0<br />
10,0<br />
0,0<br />
100,0<br />
90,0<br />
80,0<br />
%
La cinétique de passage de la DIMEB-Succ-DMPE 10 à travers la BHE ne varie pas d’un<br />
essai à un autre. Sur la quantité totale de 10 trouvée dans les compartiments inférieurs après<br />
120 minutes de passage, 30 à 35 % passent pendant la première demi-heure, 30 % pendant la<br />
deuxième demi-heure, 20 % pendant la troisième et 20 % pendant la dernière. La vitesse de<br />
diffusion de 10 est donc uniforme.<br />
De plus, on constate que 10 diffuse plus rapidement la première heure (60 % du total) que la<br />
deuxième heure (40 %). La vitesse de diffusion est liée à la concentration de 10 dans le<br />
compartiment supérieur.<br />
Toutes ces observations sont caractéristiques d’un processus de diffusion passive de 10 à<br />
travers la BHE. On peut supposer que la vitesse de diffusion continuera à décroître avec le<br />
temps et que la quantité de 10 traversant la BHE n’évoluera quasiment plus après quelques<br />
heures.<br />
VII.4. Conclusion<br />
Nous avons étudié la propriété de la DIMEB-Succ-DMPE 10 à traverser la barrière hématoencéphalique<br />
à partir d’un modèle in vitro dans le but de développer une application<br />
biologique pour les phospholipidyl-cyclodextrines. L’étude a été menée sur plusieurs<br />
concentrations de 10 en solution dans un milieu physiologique (tampon Ringer-Hépes). A<br />
500 µmol.L -1 et à 100 µmol.L -1 , la DIMEB-Succ-DMPE 10 détruit la BHE. Par contre, à<br />
10 µmol.L -1 , une concentration vingt fois inférieure à la CMC de 10, la molécule traverse la<br />
BHE par diffusion passive sans la détruire.<br />
C’est la première fois que ce passage est démontré avec une cyclodextrine à de telles<br />
concentrations. Deux hypothèses peuvent être avancées pour expliquer ces résultats<br />
particulièrement intéressants :<br />
la DIMEB-Succ-DMPE 10 est un bon candidat pour traverser la BHE ;<br />
les dosages immunoenzymatiques sont beaucoup plus performants que les dosages par<br />
HPLC car leur grande sélectivité vis-à-vis de la molécule à doser et leur grande<br />
sensibilité nous ont permis de travailler dans des matrices complexes à des<br />
concentrations beaucoup plus basses pour lesquelles le risque de cytotoxicité est<br />
beaucoup plus limité.<br />
145
Des anticorps spécifiques aux -CD 245 , -CD 246 , DIMEB 244 et TRIMEB existent déjà. Il<br />
faudra donc compléter notre étude en testant, à de faibles concentrations, le passage de la<br />
BHE des CDs commerciales et des autres CDs amphiphiles substituées en position 6 (e.g. les<br />
cholestéryl-cyclodextrines) par les méthodes de dosages immunoenzymatiques. De même, il<br />
existe des anticorps spécifiques de molécules invitées potentielles qui ne passent pas seules la<br />
BHE. Il faudra tester leur passage par cette méthode sans et avec les différentes CDs.<br />
146
VIII. Conclusion de la Partie 1<br />
Une nouvelle famille de cyclodextrines amphiphiles monosubstituées a été synthétisée en<br />
greffant un phospholipide naturel : la 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidyléthanolamine<br />
(DMPE) sur une -cyclodextrine méthylée ou non. Les trois phospholipidyl-cyclodextrines<br />
obtenues (-CD-Succ-DMPE 5, DIMEB-Succ-DMPE 10 et TRIMEB-Succ-DMPE 14) ont été<br />
entièrement caractérisées par Résonance Magnétique Nucléaire à haut champ et par<br />
Spectrométrie de Masse à basse et haute résolution. Le comportement de ces molécules en<br />
milieu aqueux a ensuite été étudié. Il apparaît que les dérivés méthylés DIMEB-Succ-<br />
DMPE 10 et TRIMEB-Succ-DMPE 14 s’auto-organisent dans l’eau avec une CMC<br />
relativement faible. Des expériences de diffusion dynamique et statique de la lumière ont<br />
permis de caractériser ces assemblages supramoléculaires comme étant de longues fibres<br />
micellaires fluctuantes et polydisperses de grande taille (> 200 nm). La conservation des<br />
propriétés d’inclusion de la partie CD des phospholipidyl-cyclodextrines 10 et 14 au sein des<br />
systèmes organisés dans l’eau a été mise en évidence par RMN 1 H.<br />
Afin d’étudier les interactions entre les phospholipidyl-CDs dans des systèmes de type<br />
membranaire, des bicouches lipidiques ont été formées sous forme de films noirs de Newton<br />
et leur structure a été caractérisée par réflectivité de rayons X à incidence rasante. Ces films<br />
sont stables et mettent en évidence un important réseau d’hydratation constitué de molécules<br />
d’eau liées dans l’environnement des têtes cyclodextrines et un empilement compact des<br />
queues phospholipidiques. De plus, ces CDs amphiphiles présentent des propriétés<br />
détergentes vis-à-vis des membranes modèles de DMPC.<br />
Cette aptitude à interagir très facilement avec les membranes biologiques et les propriétés de<br />
transport des phospholipidyl-CDs nous ont conduit à tester les capacités de ces molécules à<br />
traverser la barrière hémato-encéphalique en vue d’une application biologique potentielle. Il a<br />
été prouvé que la DIMEB-Succ-DMPE 10 traverse effectivement la BHE sans la détruire à<br />
des concentrations bien inférieures à la CMC. Cette première étude a permis de développer<br />
une méthode efficace d’évaluation de ces molécules en combinant d’une part un modèle<br />
biologique et d’autre part une méthode de dosage sensible et spécifique comme le dosage<br />
immunoenzymatique. Ces résultats préliminaires ouvrent une voie extrêmement intéressante<br />
dans le développement de nouveaux systèmes de vectorisation pour le transport de<br />
médicaments, notamment vers le cerveau.<br />
147
2 ème PARTIE : LES PEPTIDOLIPIDYL-CYCLO<strong>DE</strong>XTRINES<br />
I. Introduction<br />
Nous avons vu dans la partie précédente que les phospholipidyl-cyclodextrines combinent les<br />
propriétés d’inclusion des cyclodextrines aux propriétés d’organisation des phospholipides et<br />
ouvrent une voie extrêmement intéressante dans le développement de nouveaux systèmes de<br />
transports transmembranaires de principes actifs. Toutefois, la synthèse de tels composés est<br />
longue et très délicate, et le phospholipide greffé est un produit de départ coûteux et fragile.<br />
La fragilité des produits obtenus est donc inhérente à celle du phospholipide (dégradation au<br />
bout de quelques jours à température ambiante, conservation à -20°C). Enfin, leur structure<br />
chimique n’est pas facilement modifiable car assujettie à la structure du phospholipide greffé.<br />
Pour ces raisons, l’obtention d’une série de CDs amphiphiles entièrement synthétique, mimant<br />
les caractéristiques structurales des phospholipidyl-cyclodextrines en s’affranchissant des<br />
problèmes de stabilité chimique est une alternative possible. La mise au point de synthons<br />
versatiles, jouant le rôle de la partie lipidique, nous permettra, contrairement aux<br />
phospholipides, de modifier facilement les différents éléments de structure de ces molécules.<br />
Le but est d’aboutir facilement et rapidement à l’obtention d’une série raisonnée d’une<br />
nouvelle classe de CDs amphiphiles : les peptidolipidyl-CDs.<br />
Nous traiterons dans un premier temps de la conception, de la synthèse et de la caractérisation<br />
de ces nouveaux produits. Une première évaluation de leurs propriétés d’organisation sera<br />
effectuée par des mesures de tension de surface, ainsi que par une étude par RMN du<br />
deutérium.<br />
148
II. Synthèse et caractérisation structurale des<br />
peptidolipidyl-cyclodextrines<br />
II.1. Stratégie de synthèse<br />
II.1.1. Structure générale<br />
La structure générale des peptidolipidyl-cyclodextrines a été mise au point à partir de l’étude<br />
des principales caractéristiques structurales des phospholipidyl-cyclodextrines (figure 79).<br />
CD-espaceur<br />
Base chirale<br />
HO<br />
CD<br />
HN<br />
O<br />
O<br />
O<br />
NH<br />
OH<br />
O<br />
HO<br />
Phospholipidyl-cyclodextrine<br />
O-<br />
O P O H<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
espaceur<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
O<br />
6<br />
149<br />
O<br />
Base<br />
chirale<br />
Peptidolipidyl-cyclodextrine<br />
antenne lipophile<br />
antenne lipophile<br />
Figure 79 : Conception des peptidolipidyl-cyclodextrines à partir des principales caractéristiques<br />
structurales des phospholipidyl-cyclodextrines<br />
Antennes<br />
lipophiles
Les éléments de structure qui ont été conservés sont les suivants :<br />
Le bras espaceur qui relie la CD au groupement hydrophobe. Il introduit un degré<br />
de liberté dans la molécule et son rôle dans les propriétés d’organisation des<br />
cyclodextrines amphiphiles a été démontré 194 .<br />
Le nombre de chaînes portées par le phospholipide, c'est-à-dire deux.<br />
Le carbone asymétrique porté par le groupement glycéro du phospholipide. Il<br />
introduit une contrainte sur l’orientation des deux chaînes lipidiques.<br />
La longueur des chaînes lipidiques.<br />
Par contre, le groupement phosphate n’a pas été conservé, pour simplifier au maximum dans<br />
un premier temps la synthèse de ces nouvelles molécules.<br />
La structure des peptidolipidyl-cyclodextrines peut être décrite en trois parties :<br />
La partie CD-ESPACEUR<br />
Cette partie est commune aux phospholipidyl-CDs et aux peptidolipidyl-CDs. Un bras<br />
espaceur de type acide succinique est “branché” sur un des hydroxyles primaires de la -CD.<br />
La nature de la cyclodextrine peut varier en fonctionnalisant ou non les hydroxyles (dérivés<br />
-CD, DIMEB et TRIMEB).<br />
La BASE CHIRALE<br />
La base chirale doit comporter au moins un carbone asymétrique pour introduire une<br />
contrainte sur l’orientation des chaînes lipidiques dans l’espace et de nombreuses fonctions<br />
chimiques permettant de la coupler avec la partie CD-espaceur d’une part, et d’y greffer les<br />
antennes lipophiles d’autre part. Nous avons choisi d’utiliser des acides aminés naturels<br />
optiquement actifs (de configuration L) avec une chaîne latérale comportant une fonction<br />
acide, c’est-à-dire l’acide L-aspartique (L-Asp) et l’acide L-glutamique (L-Glu).<br />
Les ANTENNES LIPOPHILES<br />
Il peut s’agir de deux chaînes hydrocarbonées saturées ou insaturées de même longueur ou de<br />
longueurs différentes, possédant une fonction amine primaire terminale permettant leur<br />
greffage sur les acides aminés par un couplage de type peptidique. La liaison amide présente<br />
l’avantage d’être moins sensible à l’hydrolyse que les fonctions esters d’un phospholipide,<br />
donc plus stable chimiquement. Les amides gras obtenus se rencontrent dans certains<br />
150
constituants de la membranes tels que les sphingolipides et sont donc tout à fait acceptables<br />
biologiquement.<br />
Nous limiterons notre étude à l’introduction de deux chaînes saturées de même longueur (12<br />
carbones), et deux chaînes saturées de longueurs différentes, l’une à 12 carbones, l’autre à 16<br />
carbones. Toutefois, beaucoup d’autres dérivés peuvent être envisagés.<br />
La structure plus détaillée des peptidolipidyl-cyclodextrines que nous synthétiserons dans<br />
cette partie est représentée ci-dessous (figure 80).<br />
R 3O<br />
O<br />
NH<br />
O<br />
H<br />
HN<br />
O<br />
OR2<br />
O<br />
R3O<br />
O<br />
OR6<br />
NHC n'H 2n'+1<br />
n<br />
O<br />
O<br />
OR 2O<br />
NHC n''H 2n''+1<br />
6<br />
151<br />
n = 1 ou 2<br />
n’ = 12<br />
n’’ = 12 ou 16<br />
R 2 = R 3 = R 6 = H<br />
R 2 = R 6 = CH 3 , R 3 = H<br />
R 2 = R 3 = R 6 = CH 3<br />
Figure 80 : Structure générale des peptidolipidyl-cyclodextrines<br />
II.1.2. Peptidolipidyl-cyclodextrines avec deux chaînes identiques<br />
Le schéma rétrosynthétique représenté figure 81 illustre la stratégie utilisée pour préparer la<br />
série de peptidolipidyl-cyclodextrines composées de deux chaînes hydrocarbonées de même<br />
longueur.<br />
Les synthons N’,N’’-didodecyl-L-aspartamide (H-L-Asp(C12)-C12) et N’,N’’-didodecyl-Lglutamide<br />
(H-L-Glu(C12)-C12) seront préparés en trois étapes de synthèse, respectivement à<br />
partir de l’acide L-aspartique (H-L-Asp(OH)-OH) et de l’acide L-glutamique<br />
(H-L-Glu(OH)-OH) qui sont des produits commerciaux.
H2N<br />
O<br />
H<br />
n<br />
NH<br />
O<br />
NH<br />
R 3O<br />
"CD-espaceur"<br />
R 3O<br />
n = 1 H-L-Asp(C 12 )-C 12<br />
n = 2 H-L-Glu(C 12)-C 12<br />
O<br />
NH<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
OR2 O<br />
R3O OR6 O<br />
R2 = R3 = R6 = H -CD-Succ<br />
R2 = R6 = CH3 , R3 = H DIMEB-Succ<br />
R2 = R3 = R6 = CH3 TRIMEB-Succ<br />
O<br />
NH<br />
OR2O 6<br />
O<br />
O<br />
H<br />
NH<br />
O<br />
n<br />
NH<br />
O<br />
NH<br />
O<br />
OR6 OR2 O<br />
O<br />
R3O OR2O 6<br />
O<br />
HN H<br />
O<br />
NH<br />
O<br />
n<br />
NH<br />
+<br />
n = 1 Fmoc-L-Asp(C 12 )-C 12<br />
n = 2 Fmoc-L-Glu(C 12)-C 12<br />
152<br />
H 2N<br />
O<br />
H<br />
n<br />
NH<br />
O<br />
NH<br />
n = 1 : série L-Asp<br />
R2 = R3 = R6 = H -CD-Succ-L-Asp(C12)-C12 R2 = R6 = CH3, R3 = H DIMEB-Succ-L-Asp(C12)-C12 R2 = R3 = R6 = CH3 TRIMEB-Succ-L-Asp(C12)-C12 n = 2 : série L-Glu<br />
R 2 = R 3 = R 6 = H -CD-Succ-L-Glu(C 12 )-C 12<br />
R 2 = R 6 = CH 3, R 3 = H DIMEB-Succ-L-Glu(C 12)-C 12<br />
n = 1 H-L-Asp(C 12)-C 12<br />
n = 2 H-L-Glu(C 12)-C 12<br />
O<br />
HN H<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
n = 1 Fmoc-L-Asp(OH)-OH<br />
n = 2 Fmoc-L-Glu(OH)-OH<br />
O<br />
n<br />
OH<br />
HO<br />
O<br />
NH2 O<br />
n<br />
OH<br />
n = 1 H-L-Asp(OH)-OH<br />
n = 2 H-L-Glu(OH)-OH<br />
Figure 81 : Schéma rétrosynthétique des peptidolipidyl-CDs avec deux chaînes de même longueur<br />
La première étape consistera à protéger la fonction amine primaire des acides aminés de<br />
départ. L’action du N-(9-Fluorenylmethoxycarbonyloxy)succinimide (Fmoc-OSu) sur les<br />
acides L-aspartique et L-glutamique permettra d’obtenir, selon une procédure décrite dans la<br />
littérature 247 , l’acide N-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-L-aspartique (Fmoc-L-Asp(OH)-<br />
OH) et l’acide N-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-L-glutamique (Fmoc-L-Glu(OH)-OH).<br />
Le greffage des chaînes hydrocarbonées sera alors réalisé en une seule étape par l’action de la<br />
dodécylamine sur les fonctions acides carboxyliques des acides aminés protégés, par une<br />
réaction de type peptidique. Les produits obtenus, le N’,N’’-didodecyl-N-<br />
(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-L-aspartamide (Fmoc-L-Asp(C12)-C12) et le N’,N’’-<br />
didodecyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-L-glutamide (Fmoc-L-Glu(C12)-C12), seront<br />
alors déprotégés en présence de pipéridine pour donner les dérivés H-L-Asp(C12)-C12 et<br />
H-L-Glu(C12)-C12.
La littérature traite de la synthèse de N’,N’’-didodecyl-L-aspartamide 248 , mais les auteurs<br />
utilisent une stratégie de protection-déprotection différente de la nôtre (protection avec le<br />
chlorure de benzyloxycarbonyle (Z-Cl), déprotection avec H2/Pd).<br />
L’étape finale consistera à coupler les synthons précédemment décrits aux dérivés<br />
“CD-espaceur” (-CD-Succ 5, DIMEB-Succ 9, TRIMEB-Succ 13) par une réaction de type<br />
peptidique. La synthèse de 5, 9 et 13 a été décrite dans la partie précédente. Nous obtiendrons<br />
une série raisonnée de cinq peptidolipidyl-cyclodextrines en faisant varier la nature de la<br />
partie cyclodextrine et la nature de l’acide aminé (tableau 10) :<br />
Tableau 10 : Noms et abréviations des peptidolipidyl-cyclodextrines<br />
Nom abréviation<br />
N’,N’’-Didodecyl-N-(6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxycyclomaltoheptaose)-<br />
L-aspartamide<br />
N’,N’’-Didodecyl-N-(6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxy-2 I -O-méthyl-hexakis(2 II-<br />
VII II-VII<br />
,6 -di-O-méthyl)cyclomaltoheptaose)-L-aspartamide<br />
N’,N’’-Didodecyl-N-(6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxy-2 I ,3 I -di-O-méthylhexakis(2<br />
II-VII ,3 II-VII ,6 II-VII -tri-O-méthyl)cyclomaltoheptaose)-L-aspartamide<br />
N’,N’’-Didodecyl-N-(6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxycyclomaltoheptaose)-<br />
L-glutamide<br />
N’,N’’-Didodecyl-N-(6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxy-2 I -O-méthyl-hexakis(2 II-<br />
VII II-VII<br />
,6 -di-O-méthyl)cyclomaltoheptaose)-L-glutamide<br />
II.1.3. Peptidolipidyl-cyclodextrines avec deux chaînes différentes<br />
153<br />
-CD-Succ-L-Asp(C12)-C12<br />
DIMEB-Succ-L-Asp(C12)-C12<br />
TRIMEB-Succ-L-Asp(C12)-C12<br />
-CD-Succ-L-Glu(C12)-C12<br />
DIMEB-Succ-L-Glu(C12)-C12<br />
Le schéma rétrosynthétique représenté figure 82 illustre la stratégie utilisée pour préparer la<br />
série de peptidolipidyl-cyclodextrines composées de deux chaînes hydrocarbonées de<br />
longueurs différentes.
HO<br />
O<br />
H<br />
H2N O<br />
NH<br />
O<br />
H<br />
NH<br />
O<br />
NH<br />
O<br />
NH<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
HO<br />
OH<br />
O 6<br />
NH<br />
-CD-Succ-L-Asp(C16)-C12<br />
O<br />
NH<br />
H-L-Asp(C 16)-C 12<br />
O<br />
O<br />
HN H<br />
"CD-espaceur"<br />
HO<br />
O<br />
NH<br />
O<br />
NH<br />
NH<br />
154<br />
-CD-Succ<br />
Fmoc-L-Asp(C 16)-C 12<br />
O<br />
O<br />
Fmoc-L-Asp(O-tBu)-OH<br />
O<br />
HN H<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
HO<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
OH<br />
O 6<br />
+<br />
O<br />
H 2N<br />
O<br />
H<br />
HN H<br />
O<br />
O<br />
O<br />
NH<br />
O<br />
NH<br />
H-L-Asp(C 16)-C 12<br />
O<br />
NH<br />
O<br />
OH<br />
Fmoc-L-Asp(OH)-C 12<br />
HN H<br />
O<br />
NH<br />
O<br />
O<br />
Fmoc-L-Asp(O-tBu)-C 12<br />
Figure 82 : Schéma rétrosynthétique des peptidolipidyl-CDs avec deux chaînes de longueurs différentes<br />
Le synthon N’-dodecyl-N’’-hexadécyl-L-aspartamide (H-L-Asp(C16)-C12) sera préparé à<br />
partir de l’acide N’’-(tert-butyloxycarbonyl)-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-L-aspartique<br />
commercial (Fmoc-L-Asp(O-tBu)-OH) en quatre étapes. Ce produit de départ peut être<br />
synthétisé en une seule étape à partir de l’acide L-aspartique selon une procédure décrite par<br />
Lajoie et coll 249 .<br />
Une réaction de type peptidique entre le Fmoc-L-Asp(O-tBu)-OH et la dodécylamine<br />
permettra de greffer une seule chaîne hydrocarbonée sur l’acide aminé pour donner le<br />
N’-dodécyl-N’’-(tert-butyloxycarbonyl)-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-L-aspartamide<br />
(Fmoc-L-Asp(O-tBu)-C12), l’acide carboxylique de la chaîne latérale étant sélectivement<br />
protégé.<br />
Le groupement protecteur BOC (butyloxycarbonyl) sera facilement clivé sous l’action de<br />
l’acide trifluoroacétique, et l’acide carboxylique déprotégé pourra réagir avec<br />
l’hexadécylamine, grâce à une réaction de type peptidique, pour donner un produit dibranché<br />
avec deux chaînes de longueurs différentes, le N’-dodécyl-N’’-hexadécyl-N-<br />
(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-L-aspartamide (Fmoc-L-Asp(C16)-C12).
Le synthon H-L-Asp(C16)-C12 sera finalement obtenu par clivage du groupement protecteur<br />
de l’amine primaire (Fmoc) avec de la pipéridine.<br />
Le couplage entre la -CD-Succ 5 et le H-L-Asp(C16)-C12 donnera un nouveau composé de la<br />
famille des peptidolipidyl-cyclodextrines, le N’-dodécyl-N’’-hexadecyl-N-(6 I -<br />
amidosuccinyl-6 I -désoxycyclomaltoheptaose)-L-aspartamide (-CD-Succ-L-Asp(C16)-C12).<br />
II.2. Préparation des synthons<br />
II.2.1. H-L-Asp(C12)-C12 21 et H-L-Glu(C12)-C12 22<br />
HO<br />
H 2N<br />
H<br />
O<br />
H<br />
NH 2<br />
n = 1 15<br />
n = 2 16<br />
O<br />
n<br />
n<br />
n = 1 21<br />
n = 2 22<br />
O<br />
NHC 12H 25<br />
O<br />
OH<br />
NHC 12H 25<br />
Fmoc-OSu 0.83 éq.<br />
Na 2 CO 3 aq.<br />
H 2 O, DMF, TA, 1 h 30<br />
n = 1 92 %<br />
n = 2 83 %<br />
Pipéridine 20% (v/v)<br />
n = 1 90 %<br />
n = 2 94 %<br />
155<br />
O<br />
HO<br />
O<br />
O<br />
n = 1 17<br />
n = 2 18<br />
DIC 3 éq.<br />
HOBt 3 éq.<br />
C 12 H 25 NH 2 3 éq.<br />
DMF anh. / CHCl 3 anh. 1/3<br />
TA, 18 h<br />
CHCl3 , TA, 1 h O NH<br />
O<br />
n = 1 19<br />
n = 2 20<br />
NH O<br />
H<br />
H<br />
n<br />
OH<br />
n = 1 72 %<br />
n = 2 69 %<br />
O<br />
n<br />
NHC 12H 25<br />
O<br />
NHC 12H 25<br />
Figure 83 : Schéma réactionnel pour la synthèse de H-L-Asp(C12)-C12 21 et de H-L-Glu(C12)-C12 22<br />
L’étape de protection de la fonction amine de l’acide L-aspartique 15 et de l’acide<br />
L-glutamique 16 est réalisée en utilisant le groupement Fmoc. Le Fmoc-L-Asp(OH)-OH 17 et<br />
le Fmoc-L-Glu(OH)-OH 18 sont obtenus facilement dans de grandes quantités avec un haut<br />
degré de pureté et de très bons rendements (92 % et 83 % pour 17 et 18, respectivement). Le
groupement protecteur Fmoc a été choisi car il peut être éliminé dans des conditions très<br />
douces.<br />
La réaction de type peptidique entre les acides aminés protégés 17 et 18 et la dodécylamine<br />
est réalisée par la diisopropylcarbodiimide (DIC) en présence d’hydroxybenzotriazole<br />
(HOBT). Le mécanisme de ce couplage est représenté ci-dessous (figure 84) :<br />
O<br />
O<br />
O<br />
R 2<br />
O<br />
HN H<br />
H<br />
N H<br />
HN H<br />
O<br />
R 1<br />
O<br />
R 1<br />
O<br />
O<br />
H<br />
N<br />
NH<br />
N<br />
C<br />
N<br />
DIC<br />
156<br />
O<br />
O<br />
HN H<br />
O<br />
R 1<br />
O<br />
NH<br />
O<br />
R 2<br />
O<br />
HN H<br />
O<br />
HN H<br />
R1<br />
O<br />
R1<br />
O-acyl-urée<br />
+<br />
NH<br />
O<br />
N<br />
H N<br />
O<br />
O NH<br />
R2<br />
H H<br />
N N<br />
Figure 84 mécanisme réactionnel du couplage peptidique en présence de DIC<br />
L’attaque nucléophile de l’acide carboxylique sur la DIC conduit à une O-acyl-urée<br />
intermédiaire. L’attaque de l’amine primaire sur le carbonyle activé et un réarrangement<br />
conduisent à la formation de la liaison peptidique et à la libération de N,N’-diisopropylurée<br />
(DIU). Ce mode de couplage est extrêmement efficace mais il peut conduire à une<br />
racémisation partielle de l’acide aminé. Ce phénomène indésirable se produit au niveau de la<br />
O-acyl-urée intermédiaire par abstraction intramoléculaire d’un proton selon le mécanisme<br />
suivant (figure 85) :<br />
O<br />
DIU<br />
NH
O<br />
O<br />
N<br />
H<br />
R 1 O<br />
H<br />
N<br />
O<br />
C<br />
N<br />
H<br />
Figure 85 : mécanisme de racémisation de la O-acyl-urée<br />
157<br />
O<br />
O<br />
N<br />
H<br />
R 1 O<br />
L’utilisation de l’HOBT a pour but de réduire considérablement la probabilité de cette<br />
racémisation. Ce composé intervient d’une part par son caractère acide faible mais surtout en<br />
tant que puissant nucléophile capable d’attaquer la O-acyl-urée pour donner un ester actif<br />
(figure 86).<br />
O<br />
O<br />
HN H<br />
O<br />
R 1<br />
O<br />
N<br />
H<br />
NH +<br />
O<br />
N<br />
N<br />
N<br />
O<br />
O<br />
HN H<br />
+ DIU<br />
Figure 86 : Formation d’un ester actif par l’emploi d’HOBt sur la O-acyl-urée<br />
Cette réaction réduit la durée d’existence de la O-acyl-urée qui représente l’intermédiaire le<br />
plus apte à conduire à la racémisation. L’ester formé avec le HOBT présente au contraire une<br />
très bonne stabilité chirale. Son aminolyse conduit à la formation de la liaison peptidique et<br />
régénère l’HOBT.<br />
Le réaction est effectuée dans un mélange DMF anhydre / CHCl3 anhydre 1 / 3 (v/v). Les<br />
composés Fmoc-L-Asp(C12)-C12 19 et Fmoc-L-Glu(C12)-C12 20 sont isolés avec des<br />
rendements satisfaisants (72 % et 69 % pour 19 et 20, respectivement) après plusieurs lavages<br />
au DMF et à l’éther du précipité formé pendant la réaction, pour éliminer les produits de<br />
départ en excès ou régénérés et l’urée formée.<br />
L’élimination du groupement Fmoc est réalisée dans une solution à 20 % (v/v) de pipéridine<br />
dans le chloroforme. Les dérivés H-L-Asp(C12)-C12 21 et H-L-Glu(C12)-C12 22 sont isolés par<br />
précipitation dans l’hexane, puis par recristallisation dans le méthanol avec des rendements<br />
supérieurs à 90 %.<br />
HN<br />
O<br />
R 1<br />
O<br />
C<br />
N<br />
H<br />
O<br />
N<br />
N<br />
N
Les dérivés 21 et 22 sont obtenus en trois étapes à partir des acides L-Aspartique 15 et<br />
L-Glutamique 16 avec un rendement global de 60 % et de 54 %, respectivement. Ces<br />
rendements sont supérieurs à ceux indiqués dans la littérature pour la synthèse de 21 248 .<br />
II.2.2. H-L-Asp(C16)-C12 32<br />
O<br />
O<br />
O<br />
O<br />
28<br />
NH<br />
NH<br />
H<br />
H<br />
31<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
Pipéridine 20% (v/v)<br />
CHCl 3 , TA, 1 h<br />
84 %<br />
O<br />
O<br />
NHC12H25 O<br />
NHC 16H 33<br />
DIC 1,5 éq.<br />
HOBt 1,5 éq.<br />
C 12 H 25 NH 2 1,5 éq.<br />
DMF anh. / CHCl 3 anh. 1/3<br />
TA, 18 h<br />
87 %<br />
DIC 1,5 éq.<br />
HOBt 1,5 éq.<br />
C 16 H 33 NH 2 1,5 éq.<br />
DMF anh. / CHCl 3 anh. 1/3<br />
TA, 18 h<br />
H 2N<br />
H<br />
158<br />
61 %<br />
O<br />
NHC12H25 O<br />
32<br />
NHC 16H 33<br />
Figure 87 : Schéma réactionnel pour la synthèse de H-L-Asp(C16)-C12 32<br />
O<br />
O<br />
29<br />
O<br />
NH<br />
TFA 20% (v/v)<br />
CH 2 Cl 2 ,5h, TA<br />
O<br />
30<br />
H<br />
O<br />
94 %<br />
NH<br />
H<br />
O<br />
NHC 12H 25<br />
O<br />
O<br />
NHC 12H 25<br />
La dodécylamine est greffée au Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH 28 par la méthode de couplage<br />
peptidique classique (DIC, HOBT), dans un mélange DMF anhydre / CHCl3 anhydre 1/3<br />
(v/v). Le Fmoc-L-Asp-(OtBu)-C12 29 est purifié grâce à une colonne chromatographique sur<br />
silice (gel de silice 60 FLUKA, 220 - 440 mesh ASTM) avec une élution au chloroforme. Il<br />
est isolé avec un très bon rendement (87 %).<br />
Le groupement protecteur BOC de la fonction acide carboxylique du composé 29 est très<br />
facilement éliminé dans une solution à 20 % d’acide trifluoroacétique (TFA) dans le<br />
dichlorométhane. Le Fmoc-L-Asp(OH)-C12 30 est isolé par précipitation dans l’éther de<br />
pétrole avec des rendements quasi-quantitatifs.<br />
O<br />
OH
L’hexadécylamine est alors greffée au composé 30 par la méthode de couplage peptidique<br />
classique (DIC, HOBT). Le Fmoc-L-Asp(C16)-C12 31 est isolé de façon identique aux<br />
composés 19 et 20 avec un rendement de 61%. La dernière étape consiste à déprotéger<br />
l’amine primaire du composé 31. Le H-L-Asp(C16)-C12 32 est obtenu de la même manière que<br />
les composés 21 et 22 avec un rendement de 84 %.<br />
Le dérivé 32 est obtenu en quatre étapes à partir du Fmoc-L-Asp(O-tBu)-OH avec un<br />
rendement global de 42 %.<br />
II.3. Couplage avec les cyclodextrines<br />
Le couplage des synthons 21, 22 et 32 aux dérivés “CD-espaceur” 5, 9 et 13 conduit aux<br />
peptidolipidyl-cyclodextrines selon le schéma suivant (figure 88) :<br />
R 3O<br />
O<br />
NH<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
OR2 O<br />
R3O OR 6<br />
O<br />
OR 2<br />
O<br />
6<br />
+<br />
O<br />
H<br />
H2N Cn'H2n'+1<br />
N<br />
H<br />
O<br />
n<br />
NH<br />
Cn''H2n''+1 DIC 4 éq.<br />
HOBt 4 éq.<br />
DMF anh. / CHCl3 anh. 1/1<br />
TA, 24 h<br />
CD-espaceur Synthon Peptidolipidyl-CD<br />
CD-espaceur Synthon<br />
Type n éq. Type n éq.<br />
159<br />
R 3O<br />
O<br />
NH<br />
O<br />
O<br />
OR2 O<br />
R3O H<br />
HN<br />
O<br />
OR 6<br />
Cn'H2n'+1 N<br />
H<br />
O<br />
n<br />
NH<br />
Cn''H2n''+1 O<br />
OR 2<br />
O<br />
Peptidolipidyl-CD Rdt<br />
-CD-Succ 5 1 H-L-Asp(C12)-C12 21 1,2 -CD-Succ-L-Asp(C12)-C12 23 85 %<br />
-CD-Succ 5 1 H-L-Glu(C12)-C12 22 1,2 -CD-Succ -L-Glu(C12)-C12 24 77 %<br />
DIMEB-Succ 9 1 H-L-Asp(C12)-C12 21 1,2 DIMEB-Succ-L-Asp(C12)-C12 25 60 %<br />
DIMEB-Succ 9 1 H-L-Glu(C12)-C12 22 1,2 DIMEB-Succ -L-Glu(C12)-C12 26 63 %<br />
TRIMEB-Succ 13 1 H-L-Asp(C12)-C12 21 1,2 TRIMEB-Succ-L-Asp(C12)-C12 27 46 %<br />
-CD-Succ 5 1 H-L-Asp(C16)-C12 32 1,2 -CD-Succ-L-Asp(C16)-C12 33 66 %<br />
Figure 88 : Schéma réactionnel pour la synthèse des peptidolipidyl-CDs 23, 24, 25, 26, 27 et 33
Ce couplage est réalisé par la diisopropylcarbodiimide (DIC) en présence<br />
d’hydroxybenzotriazole (HOBT). Les réactifs de départ n’étant pas solubles dans un même<br />
solvant, la réaction est effectuée dans un mélange DMF anhydre / CHCl3 anhydre 1/1 (v/v).<br />
Les peptidolipidyl-cyclodextrines 23, 26 et 33, dérivées de la -CD, sont obtenues<br />
pratiquement pures après une simple précipitation dans l’éther. Leur degré de pureté est en<br />
général supérieur à 95 % d’après les profils analytiques réalisés par HPLC (figure 89). Les<br />
quelques impuretés qui subsistent (< 5 %) sont probablement des traces d’urée non solubilisée<br />
dans l’éther. Toutefois, pour obtenir des produits avec une pureté proche de 100 %, les<br />
composés 23, 24 et 33 ont été purifiés par HPLC sur une colonne semi-préparative à polarité<br />
de phase normale (colonne µPorasil WATERS 10µm 125 Å, cartouche Radial-Pak 2 × 25 mm<br />
× 100 mm précédée d’une cartouche de garde) en utilisant comme éluant le mélange<br />
suivant : A = CH3OH, B = CHCl3 / CH3OH / NH3 20 % 80/19,5/0,5 (v/v/v), A/B 20/80 (v/v),<br />
en mode isocratique. La détection est effectuée à partir d’un <strong>DE</strong>DL.<br />
-CD-Succ-L-Glu(C 12 )-C 12 24<br />
Figure 89 : Chromatogramme du produit 3 obtenu par HPLC (colonne µPorasil WATERS 10µm ; élution<br />
en mode isocratique A / B 20/80 (v/v) avec A = CH3OH et B = CHCl3 / CH3OH / NH3 20 % 80/19,5/0,5 (v/v)<br />
en 12 min, débit : 1 ml.min -1 , détection : <strong>DE</strong>DL SE<strong>DE</strong>X 55 (T° = 40 °C, gain = 7, pN2 = 2,1 bars)).<br />
Les produits finaux 25, 26 et 27 sont purifiés grâce à une colonne chromatographique sur<br />
silice (gel de silice 60 FLUKA, 220 - 440 mesh ASTM). Les produits sont élués dans un<br />
mélange CHCl3 / MeOH.<br />
Les rendements des produits 23 à 27 et 33, compris entre 46 et 85 %, sont encore<br />
optimisables.<br />
160
II.4. Caractérisation des peptidolipidyl-cyclodextrines<br />
La structure des peptidolipidyl-cyclodextrines a été entièrement caractérisée par RMN du<br />
proton et du carbone et par spectrométrie de masse à haute résolution.<br />
II.4.1. Caractérisation par RMN<br />
L’attribution des spectres RMN 1 H et 13 C des peptidolipidyl-cyclodextrines 23, 24, 25, 26, 27<br />
et 33 a été réalisée grâce à des expériences bidimensionnelles homonucléaires ( 1 H- 1 H) et<br />
hétéronucléaires ( 1 H- 13 C). La stratégie d’attribution est la même que celle employée pour<br />
l’attribution des phospholipidyl-CDs.<br />
La figure 90 représente le spectre RMN 1 H attribué de la -CD-Succ-L-Glu(C12)-C12 24.<br />
HO<br />
NH<br />
O<br />
OH<br />
H<br />
O<br />
NH <br />
O c d <br />
a b O<br />
NH<br />
O<br />
OH<br />
NH CD<br />
1<br />
N'H<br />
N''H<br />
6<br />
O<br />
4 O<br />
5<br />
HO 2<br />
3 1<br />
OH<br />
O 6<br />
N’H<br />
N’’H<br />
9.2 9.0 8.8 8.6 ppm<br />
1<br />
12<br />
12<br />
H-1<br />
9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 ppm<br />
161<br />
H-<br />
H-3<br />
H-5/H-6’<br />
H-6<br />
H-4<br />
H-2<br />
H-2 I<br />
H-4 I<br />
H-1/<br />
H-1<br />
H-b/H-c<br />
H-3 àH-11 / H-3 àH-11<br />
H-, H-/H-’<br />
Figure 90 : Spectre RMN 1 H de la -CD-Succ-L-Glu(C12)-C12 24 (500,13 MHz, 20 mM, pyr-d5, 298 K).<br />
H-’<br />
H-2/<br />
H-2<br />
H-12/<br />
H-12
Le séquençage des différentes parties du peptidolipidyl-CD 24 est réalisé grâce aux spectres<br />
COSY, COSY simple relais et T-ROESY, via les interactions scalaires et dipolaires<br />
(figure 91).<br />
(a)<br />
(b)<br />
(c)<br />
ppm<br />
ppm<br />
ppm<br />
2<br />
4<br />
2<br />
4<br />
3<br />
4<br />
5<br />
NH N’H N’’H<br />
H-<br />
H-’<br />
H-<br />
H-<br />
H-’<br />
H-, H-, H-’<br />
NH CD<br />
H-6’ I<br />
H-6 I<br />
H-6’ I<br />
H-6 I<br />
H-5 I<br />
H-1 H-1<br />
H-2<br />
H-1<br />
H-1<br />
H- H-<br />
H-2<br />
H-1<br />
H-1<br />
H-/H-’<br />
9.4 9.2 9.0 8.8 8.6 8.4 8.2 ppm<br />
162<br />
HO<br />
O<br />
NH<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
HO<br />
H<br />
NH<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
NH<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
COSY (a)<br />
COSY simple relais (b)<br />
T-ROESY (c)<br />
Figure 91 : contours partiels des cartes (a) COSY, (b) COSY simple relais et (c) T-ROESY (tm = 300 ms)<br />
du composé 24 (500,13 MHz, 20 mM, pyr-d5, 298 K).<br />
Par ailleurs, tous les protons de l’unité glucosidique substituée de la cyclodextrine sont<br />
attribués via les interactions scalaires, à partir du proton amide (NHCD) porté par la CD<br />
(figure 92).<br />
NH<br />
6
ppm<br />
3.8<br />
4.0<br />
4.2<br />
4.4<br />
4.6<br />
4.8<br />
NH CD<br />
4<br />
HO<br />
H-6’ I<br />
H-6 I<br />
H-5 I<br />
6<br />
3<br />
9.0 ppm<br />
NH<br />
5<br />
R<br />
Unité I<br />
CD<br />
2<br />
O<br />
OH<br />
1<br />
O<br />
H-3 I /H-4 I<br />
H-2 I /H-3 I<br />
H-3 I<br />
H-4 I /H-5 I<br />
4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 ppm<br />
(a) (b)<br />
4<br />
HO<br />
Unités II - VII<br />
6<br />
3<br />
OH<br />
5<br />
2<br />
163<br />
O<br />
1<br />
OH<br />
O<br />
6<br />
H-6 I /H-6’ I<br />
COSY (a)<br />
COSY simple relais (b)<br />
Figure 92 : Contours partiels des cartes (a) COSY simple relais et (b) COSY du composé 24 (500,13 MHz,<br />
20 mM, pyr-d5, 298 K).<br />
Enfin, les proximités spatiales entre les protons H-1 d’une unité glucosidique et les protons<br />
H-4 de l’unité voisine permettent de relier l’unité substituée à ses unités adjacentes via les<br />
interactions dipolaires (figure 93).<br />
H-2 I<br />
H-4 I
ppm<br />
3.8<br />
4.0<br />
4.2<br />
H-1 VII / H-4 I<br />
H-1I H-1VII<br />
H1 I / H-2 I<br />
H4 I / H-1 II<br />
5.7 5.6 5.5 5.4 5.3 ppm<br />
H-4 I<br />
H-2 I<br />
164<br />
H-1 VII<br />
4<br />
HO<br />
6<br />
3<br />
NH<br />
5<br />
R<br />
Unité I<br />
CD<br />
2<br />
O<br />
OH<br />
1<br />
6<br />
O<br />
4<br />
5<br />
O<br />
HO 3<br />
2<br />
OH<br />
1<br />
O 6<br />
T-ROESY<br />
Unités II - VII<br />
Figure 93 : Contours partiels de la carte T-ROESY du composé 24 (500,13 MHz, 20 mM, pyr-d5, 298 K,<br />
tm = 300 ms).<br />
Le spectre RMN 13 C de 24 attribué grâce aux expériences hétéronucléaires bidimensionnelles<br />
(HMQC, HMBC) est représenté figure 94 :<br />
O<br />
H N'H<br />
1<br />
NH <br />
O c d <br />
a<br />
NH<br />
b<br />
O<br />
O<br />
O<br />
N''H<br />
1<br />
HO<br />
OH<br />
O<br />
OH<br />
6<br />
4 O<br />
5<br />
HO 2<br />
3 1<br />
OH<br />
O 6<br />
C-a<br />
C-d<br />
N’’H-C=O<br />
N’H-C=O<br />
ppm<br />
12<br />
12<br />
C-1<br />
C-4 I<br />
C-10/<br />
C-10<br />
C-b/C-c<br />
34 32 30 ppm<br />
C-11/<br />
C-11<br />
C-12/<br />
C-12<br />
160 140 120 100 80 60 40<br />
ppm<br />
C-4<br />
C-<br />
C-3/C-5/C-2<br />
C-5 I<br />
C-6<br />
C-<br />
C-<br />
C-3/<br />
C-3<br />
C-4 àC-9/C-4 àC-9,<br />
C-2/C-2<br />
C-1/C-1<br />
Figure 94 : Spectre RMN 13 C de la -CD-Succ-L-Glu(C12)-C12 24 (125,77 MHz, 20 mM, pyr-d5, 298 K).<br />
C-6 I
II.4.2. Spectrométrie de Masse Haute Résolution<br />
Des mesures de masse exacte des six peptidolipidyl-cyclodextrines synthétisées ont été<br />
réalisées en mode positif, sur les ions [MH] + et [MNa] + avec une résolution de masse de 5000,<br />
en utilisant NaI comme étalon interne, introduit de manière continue par un second nébuliseur<br />
(Lockspray). Les résultats de ces mesures sont présentés dans le tableau 11 :<br />
Tableau 11 : Mesures de masse exacte des peptidolipidyl-cyclodextrines 23, 24, 25, 26, 27, 33<br />
Composé Ion<br />
23<br />
MH +<br />
24 MH +<br />
25<br />
26 MNa +<br />
Masse<br />
mesurée<br />
165<br />
Masse<br />
calculée<br />
ppm Formule<br />
1683,8441 1683,8441 0,0 C74H131N4O38<br />
MNa + 1705,8169 1705,8261 5,4 C74H130N4O38Na<br />
1697,8624 1697,8598 1,6 C75H133N4O38<br />
MH + 1866,0394 1866,0476 4,4 C87H157N4O38<br />
MNa + 1888,0214 1888,0295 4,3 C87H156N4O38Na<br />
1902,0529 1902,0452 4,0 C88H158N4O38Na<br />
27 MNa + 1986,1432 1986,1391 2,1 C94H170N4O38Na<br />
33<br />
MH +<br />
MNa +<br />
II.5. Conclusion<br />
1739,8983 1739,9670 4,8 C78H139N4O38<br />
1761,8866 1761,8887 1,2 C78H138N4O38Na<br />
Nous avons réalisé la synthèse de six conjugués peptidolipidyl-cyclodextrines en faisant<br />
varier la nature de la CD, de l’acide aminé et la longueur des chaînes lipidiques.<br />
Il va maintenant falloir tester les aptitudes de cette série raisonnée de CDs amphiphiles à<br />
s’auto-organiser dans l’eau ou bien à s’insérer dans des membranes phospholipidiques modèle<br />
pour former de nouvelles structures lipidiques supramoléculaires potentielles capables de<br />
vectoriser des principe actifs.
III. Propriétés d’organisation des peptidolipidyl-CDs<br />
Les propriétés d’organisation des peptidolipidyl-cyclodextrines seront étudiées sous deux<br />
aspects différents. Dans un premier temps, des mesures de concentration micellaire critique et<br />
de solubilité permettront d’évaluer les capacités de ces nouveaux dérivés à s’auto-organiser<br />
dans l’eau. Nous pourrons alors établir un point de comparaison avec les phospholipidylcyclodextrines.<br />
Les propriétés d’insertion de certaines peptidolipidyl-CDs dans des bicouches<br />
phospholipidiques préformées (liposomes de DMPC) seront ensuite largement étudiées par<br />
RMN du deutérium.<br />
III.1. Propriétés d’auto-organisation dans l’eau : mesures de CMC<br />
Les concentrations micellaires critiques des composés 23, 24, 25, 26 et 27 sont déterminées à<br />
partir des courbes de variation de la tension superficielle en fonction de la concentration<br />
(s = f(Log(C)). Les mesures de tensions de surface sont réalisées par la méthode de la plaque<br />
de Wilhelmy à 20°C. Les résultats sont indiqués dans le tableau 12 :<br />
Tableau 12 : CMC et solubilités des peptidolipidyl-CDs 23, 24, 25, 26 et 27<br />
Composé CMC (mol.L -1 ) Solubilité (mol.L -1 )<br />
-CD-Succ-L-Asp(C12)-C12 23 Pas de CMC ou non détectée
(< 10 -5 mol.L -1 ). Les dérivés de la DIMEB 25 et 26, et de la TRIMEB 27, possèdent une CMC<br />
très faible (de l’ordre de 10 -5 -10 -6 mol.L -1 ), et sont également faiblement solubles dans l’eau<br />
(de l’ordre de 10 -3 mol.L -1 ).<br />
Les peptidolipidyl-CDs dont la partie macrocyclique est partiellement ou complètement<br />
méthylée sur les hydroxyles possèdent une CMC, et leur solubilité est plus importante que<br />
celle du dérivé de la -CD. On retrouve cette caractéristique pour les phospholipidyl-<br />
cyclodextrines et les cholestéryl-CD 194,196 . Il semble donc acquis que la nature de la CD joue<br />
un rôle prépondérant dans les propriétés surfactantes des cyclodextrines amphiphiles<br />
monosubstituées. On suppose que le caractère hydrophile de la DIMEB et de la TRIMEB est<br />
plus important que celui de la -CD, en raison du réseau d’hydratation qui se forme autour<br />
des dérivés méthylés de la cyclodextrine et améliore leur solubilité.<br />
Toutefois, les solubilités des peptidolipidyl-DIMEB 25 et 26, et de la peptidolipidyl-<br />
TRIMEB 27 sont très inférieures à leurs analogues phospholipidyl-cyclodextrines et les<br />
caractéristiques de ces molécules (faible CMC, faible solubilité) sont plus proches de<br />
surfactants tels que les phospholipides.<br />
Aussi nous n’étudierons pas les propriétés d’auto-organisation de ces composés en milieu<br />
aqueux mais leur capacité à s’insérer dans des systèmes déjà organisés comme des bicouches<br />
de phospholipides. Une telle approche pourrait conduire à des système mixtes.<br />
III.2. Insertion des peptidolipidyl-CDs dans des membranes<br />
lipidiques modèles de DMPC : Etude par RMN 2 H<br />
Cette étude a été menée en collaboration avec le D r Michel ROUX (SBPM / DBCM / DSV,<br />
<strong>CEA</strong> Saclay) qui a réalisé les expériences de RMN du deutérium.<br />
La RMN du deutérium est très différente de celle du proton ou du carbone-13. Ces principes<br />
fondamentaux sont brièvement décrits en annexe V. Pour notre compréhension, nous allons<br />
nous limiter à expliquer de façon très succincte quelles sont les informations essentielles qui<br />
peuvent être extraites d’un spectre RMN 2 H.<br />
Le spectre RMN du deutérium de la POPC-d31, une phosphatidylcholine deutériée sur la<br />
chaîne sn-1 est représenté figure 95 :<br />
167
POPC-d31<br />
Fréquence (KHz)<br />
Figure 95 : Spectre RMN du deutérium (a) brut et (b) déconvolué de la POPC-d31<br />
A chaque groupement CD2 de la chaîne, correspond un doublet ou écart quadrupolaire q. La<br />
superposition de l’ensemble des doublets conduit au spectre composite représenté figure 17 a.<br />
Par déconvolution de ce spectre, on obtient le spectre représenté figure 17 b, qui permet une<br />
mesure précise de chaque écart quadrupolaire, notamment ceux des groupements CD2 et CD3<br />
localisés en bout de chaîne (positions 9 à 16) qui apparaissent au centre du spectre. Les<br />
groupements CD2 proches du glycérol (2 à 8) sont superposés et apparaissent aux bornes du<br />
spectres.<br />
Pour chaque liaison CD, l’écart quadrupolaire est de la forme :<br />
q <br />
Q SCD<br />
où Q est la constante du couplage quadrupolaire statique ( 125 KHz pour les groupes CD<br />
aliphatiques) et SCD, le paramètre d’ordre orientationnel. Dans le cas de liposomes<br />
multilamellaires, SCD contient deux composantes, une d’ordre géométrique, soit l’angle<br />
moyen que fait cette liaison CD avec la normale de la bicouche, et une autre d’ordre<br />
168
dynamique, qui rend compte de l’amplitude des fluctuations angulaires du vecteur CD. Ce<br />
paramètre d’ordre SCD peut fournir des informations d’ordre macroscopique sur l’organisation<br />
globale de la membrane (phase lamellaires, hexagonales ou cubique, micelles, vésicules…) et<br />
microscopique au niveau de perturbations plus spécifiques du groupement considéré et de son<br />
environnement local. Le travail présenté ici a été effectué au moyen de la<br />
dimyristoylphosphatidylcholine deutériée sur les deux chaînes hydrophobes (DMPC-d54),<br />
dont la structure est représentée figure 96.<br />
N<br />
O P<br />
O-<br />
O H<br />
O<br />
O<br />
O<br />
O<br />
O<br />
D<br />
D<br />
D D<br />
D D DDDD DD DD D D D<br />
DD<br />
D<br />
D<br />
D D<br />
169<br />
DD<br />
D<br />
D<br />
D D<br />
DD<br />
D<br />
D<br />
D D<br />
D<br />
D<br />
D D<br />
Figure 96 : Structure de la DMPC-d54<br />
La figure 97 représente les spectres du deutérium déconvolués de la DMPC-d54 seule<br />
(figure 97 a), sous forme de liposome hydraté, et en présence de quantités croissantes de<br />
-CD-Succ-L-Asp(C12)-C12 23 non marquée (figure 97 b-f).<br />
DD<br />
D<br />
D<br />
D D<br />
DD<br />
D<br />
D D<br />
DD<br />
D D
(a)<br />
(b)<br />
(c)<br />
(d)<br />
(e)<br />
(f)<br />
Phase L<br />
DMPC seule<br />
Fréquence (KHz)<br />
170<br />
Phase mixte L<br />
DMPC / 23<br />
Figure 97 : Spectres RMN 2 H déconvolués de membranes de DMPC d-54 à 21 °C, préparées (a) en<br />
absence ou (b-f) en présence de (b) 2,5 %, (c) 5 %, (d) 7,5 %, (e) 10 % et (f) 20 % de<br />
-CD-Succ-L-Asp(C12)-C12 23.<br />
Le spectre RMN 2 H de la DMPC seule sous forme de bicouche en phase fluide (L) a une<br />
forme spécifique correspondant au spectre représenté figure 17 (a). On peut considérer deux<br />
signaux caractéristiques, l’un à -32 KHz (groupements CD2 proches du glycérol), et l’autre à<br />
-5 KHz (CD3 terminaux) représentés par des pointillés.<br />
L’addition de quantités croissantes de 23 fait apparaître deux nouveaux pics à -26 KHz et<br />
-3 KHz (traits pleins), correspondant à une nouvelle phase mixte DMPC / 23. Entre 2,5 % et<br />
10 % de 23, la persistance des signaux à -33 KHz et -5 KHz laisse supposer la coexistence de<br />
deux phases, une pure de DMPC d’une part, l’autre mixte DMPC / 23 d’autre part.<br />
Avec 20 % de 23 et plus, les signaux à -33 KHz et -5KHz disparaissent indiquant l’absence de<br />
phase pure de DMPC et donc la présence d’une phase mixte DMPC / 23 unique.
Par simulation des raies de résonances des groupements méthyle de la DMPC en phase fluide<br />
L avec une fonction gaussienne, on peut déterminer les quantités relatives de DMPC<br />
présentes dans la phase pure de DMPC et dans la phase mixte DMPC /<br />
-CD-Succ-L-Asp(C12)-C12 23 (tableau 13) :<br />
Tableau 13 : Répartition des phospholipides à divers taux -CD-Succ-L-Asp(C12)-C12 23,<br />
Proportion de<br />
-CD-Succ-L-Asp(C12)-C12 23<br />
Phase L DMPC Phase mixte L DMPC / 23<br />
0,0 % 100 % 0 %<br />
5,0 % 76 % 24 %<br />
7,5 % 57 % 43 %<br />
10,0 % 49 % 51 %<br />
20,0 % 0 % 100 %<br />
30,0 % 0 % 100 %<br />
Quelque soit le pourcentage de CDs amphiphiles 23, la phase mixte est constante, c'est-à-dire<br />
constituée de 4 à 5 molécules de DMPC pour une molécule de 23. Au fur et à mesure que l’on<br />
augmente le pourcentage de 23, la phase pure de DMPC est consommée, jusqu’à disparaître<br />
pour un pourcentage de 20 % de 23.<br />
Cependant, lorsque la phase mixte contient au moins 30 % de 23, on constate une diminution<br />
de sa stabilité sans doute due à un déficit de phospholipides.<br />
La température de transition fluide-gel de la phase mixte DMPC / 23 peut-être facilement<br />
déterminée à l’aide des spectres RMN 2 H effectués sur l’échantillon à 20 % de 23 à des<br />
températures différentes (figure 98).<br />
171
°C<br />
Fréquence (KHz)<br />
Figure 98 : Spectre RMN 2 H déconvolués de membranes de DMPC-d54 préparées en présence de 20 % de<br />
-CD-Succ-L-Asp(C12)-C12 23 et enregistré à différentes températures.<br />
On peut constater un brutal changement de l’allure générale des spectres pour des<br />
températures inférieures ou égale à 12 °C. Ce brusque effondrement des signaux est<br />
caractéristique d’une transition de phase fluide-gel de la bicouche de la phase mixte<br />
DMPC / 23.<br />
Des résultats similaires ont été obtenus pour les composés -CD-Succ-L-Glu(C12)-C12 24.<br />
En conclusion, lorsque les membranes de DMPC sont préparées en présence de<br />
peptidolipidyl-cyclodextrines, on observe une ségrégation de phase avec formation d’une<br />
phase mixte parfaitement organisée, constituée de 4 à 5 molécules de phospholipides pour une<br />
molécule de peptidolipidyl-CD, et avec une transition de phase fluide-gel très bien définie et<br />
très basse (T° fluide-gel : 12°C).<br />
Ces résultats sont à comparer avec ceux obtenus précédemment sur le dérivé Chol--CD, pour<br />
lequel une ségrégation de phase a également été observée 199 . Une phase mixte<br />
172
Chol--CD / DMPC constituée de 3 phospholipides pour 2 CDs amphiphiles est formée et<br />
coexiste avec la phase pure de DMPC. Contrairement aux peptidolipidyl-CDs, il a été montré<br />
que la partie cholestéryle induisait une désorganisation locale de la membrane<br />
phospholipidique et aucune transition fluide-gel franche n’a été observée pour la phase mixte<br />
Chol--CD / DMPC.<br />
IV. Conclusion de la deuxième partie<br />
Nous avons réalisé la synthèse de six conjugués peptidolipidyl-cyclodextrines en faisant<br />
varier la nature de la CD, de l’acide aminé et la longueur des chaînes lipidiques. Ces produits<br />
ont été obtenus à l’échelle de plusieurs centaines de milligrammes par un couplage de type<br />
peptidique entre les dérivés “CD-espaceur” et des synthons à base d’un acide aminé chiral sur<br />
lequel sont greffées deux chaînes lipidiques, qui ont été préparés en trois ou quatre étapes de<br />
synthèse. Les produits finaux ont été purifiés par HPLC ou sur colonne chromatographique<br />
selon la nature de la partie CD. Chacun des composés a fait l’objet d’une caractérisation<br />
structurale par RMN 1 H et 13 C mono et bidimensionnelle et d’une analyse de spectrométrie de<br />
masse à haute résolution. Des analyses physico-chimiques complémentaires ont permis de<br />
compléter la caractérisation.<br />
Les propriétés d’auto-organisation des peptidolipidyl-CDs dans l’eau ont été étudiées par des<br />
mesures de tensions de surface. Les dérivés DIMEB et TRIMEB possèdent une très faible<br />
CMC et une faible solubilité dans l’eau , alors que les dérivés -CD ne s’auto-organisent pas.<br />
Par contre, ces nouvelles CDs amphiphiles conduisent à l’obtention de systèmes organisés de<br />
type bicouches lipidiques mixtes DMPC / peptidolipidyl--CD. Ces phases sont stables et<br />
bien organisées, avec une température de transition fluide-gel très bien caractérisée et<br />
particulièrement basse. Ces derniers résultats laissent espérer l’obtention de vésicules mixtes<br />
phospholipides / peptidolipidyl-CD.<br />
173
L’objectif de ce travail de thèse était de synthétiser, de caractériser et d’évaluer les propriétés<br />
physico-chimiques et biologiques de nouvelles cyclodextrines amphiphiles monosubstituées.<br />
La préparation de composés hybrides comportant une cyclodextrine normale ou modifiée,<br />
greffée à une molécule très hydrophobe, a pour but de combiner les propriétés d’organisation<br />
de structures lipidiques (micelles, vésicules, liposomes,…) à la spécificité de taille de la cavité<br />
des cyclodextrines pour y inclure de petites molécules organiques hydrophobes. La finalité de<br />
cette étude est de concevoir de nouveaux vecteurs pour le transport de principes actifs.<br />
Dans une première partie, nous avons utilisé un phospholipide comme ancre hydrophobe, en<br />
raison des propriétés de polymorphisme lipidique des ces molécules (bicouches lipidiques des<br />
membranes biologiques, liposomes). Nous avons donc préparé une série de trois<br />
phospholipidyl-CDs, en greffant la 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidyléthanolamine<br />
(DMPE) sur une -CD native, partiellement méthylée (DIMEB) ou complètement méthylée<br />
(TRIMEB). Ce couplage est effectué par l’intermédiaire d’une fonction de type succinique<br />
jouant le rôle de bras espaceur. Les produits obtenus sont respectivement nommés<br />
-CD-Succ-DMPE, DIMEB-Succ-DMPE et TRIMEB-Succ-DMPE. Nous avons caractérisé<br />
la structure de chacun des dérivés préparés, de façon rigoureuse et détaillée, par RMN du<br />
proton et du carbone-13, à partir d’expériences bidimensionnelles, ainsi que par spectrométrie<br />
de masse à basse et haute résolution.<br />
Le comportement de ces composés en milieu aqueux a été étudié par plusieurs techniques<br />
physico-chimiques complémentaires. L’existence d’un phénomène d’auto-organisation dans<br />
l’eau des dérivés DIMEB-Succ-DMPE et TRIMEB-Succ-DMPE a été mis en évidence par<br />
RMN 1 H. Des mesures de tension de surface ont permis de déterminer une concentration<br />
micellaire critique (CMC) faible pour ces deux composés. Enfin, des expériences de<br />
diffusions dynamique et statique de la lumière ont été employées pour caractériser la forme et<br />
la taille de ces assemblages supramoléculaires qui semblent être de longues fibres micellaires<br />
fluctuantes et polydisperses de grosse taille (> 200 nm).<br />
Nous avons par ailleurs démontré, toujours à partir d’expériences RMN 1 H, que les cavités<br />
des parties CDs des phospholipidyl-cyclodextrines méthylées conservaient leurs propriétés de<br />
complexation dans l’eau vis-à-vis du 4-tertbutylbenzoate de sodium, connu pour s’inclure<br />
dans la cavité de la -CD naturelle et de ses dérivés méthylés.<br />
175
Afin de comprendre les interactions mises en jeu entre les phospholipidyl-CDs et les<br />
membranes biologiques, nous avons tout d’abord étudié, en collaboration avec le D r J.-J.<br />
Benattar du Service de Physique de l’Etat Condensé (DSM / DRECAM, <strong>CEA</strong> Saclay), la<br />
structure d’une bicouche constituée uniquement de DIMEB-Succ-DMPE et de<br />
TRIMEB-Succ-DMPE, par la méthode des films noirs de Newton. La structure de ces films,<br />
caractérisée par réflectivité de rayons X, indique un empilement compact des chaînes<br />
lipidiques, et de fortes interactions des CDs entre elles et avec les molécules d’eau<br />
environnantes. Ces interactions créent un réseau d’ordre à longue distance des molécules<br />
d’eau.<br />
Les interactions entre les phospholipidyl-CDs et des matrices phospholipidiques préformées<br />
ont été étudiées par RMN du phosphore-31. Les CDs amphiphiles ont des propriétés<br />
détergentes vis-à-vis des membranes modèles de DMPC.<br />
Enfin, nous avons voulu mettre en œuvre une application biologique en étudiant les capacités<br />
de la DIMEB-Succ-DMPE à passer à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE). Il a été<br />
prouvé que ces molécules traversent effectivement les membranes hermétiques des cellules<br />
endothéliales de la BHE sans les détruire (pour une concentration de 10 µmol.L -1 ).<br />
Toutefois, les inconvénients liés à la difficulté de synthèse des phospholipidyl-CDs et à la<br />
fragilité de ces produits, nous ont conduits à préparer une nouvelle famille de CDs<br />
amphiphiles : les peptidolipidyl-CDs, dont la structure mime les caractéristiques structurales<br />
des phospholipidyl-CDs tout en s’affranchissant des problèmes de réactivité de couplage et de<br />
stabilité chimique des phospholipides.<br />
Les peptidolipidyl-CDs ont été synthétisées en greffant sur une cyclodextrine munie d’un bras<br />
espaceur, un acide aminé naturel bifonctionnalisé par deux chaînes lipidiques. Six composés<br />
différents ont été obtenus en faisant varier la nature de la cyclodextrine (-CD, DIMEB,<br />
TRIMEB), la nature de l’acide aminé (acide aspartique, acide glutamique) et la longueur des<br />
chaînes lipidiques (deux chaînes de même longueur en C12, deux chaînes de longueurs<br />
différentes, l’une en C12, l’autre en C16). Nous leur avons attribués les codifications suivantes :<br />
-CD-Succ-L-Asp(C12)-C12, -CD-Succ-L-Glu(C12)-C12, DIMEB-Succ-L-Asp(C12)-C12,<br />
DIMEB-Succ-L-Glu(C12)-C12, TRIMEB-Succ-L-Asp(C12)-C12 et -CD-Succ-L-Asp(C16)-C12.<br />
Ces molécules ne sont pratiquement pas solubles dans l’eau, mais les dérivés méthylés<br />
possèdent une CMC très faible.<br />
176
Par contre, les peptidolipidyl-CDs ont des propriétés d’organisation étonnantes dans les<br />
matrices phospholipidiques de DMPC. La -CD-Succ-L-Asp(C12)-C12 et la -CD-Succ-L-<br />
Glu(C12)-C12 s’insèrent dans les membranes modèles de DMPC et forment dans des<br />
proportions peptidolipidyl-CD / DMPC 20/80 (m/m), une phase mixte unique de type<br />
bicouche lipidique. Cette phase a été parfaitement caractérisée par RMN du deutérium pour le<br />
système -CD-Succ-L-Asp(C12)-C12 / DMPC, en collaboration avec le D r M. Roux, Chargé de<br />
Recherches CNRS, URA CNRS 2096, Section de Biophysique des Protéines et des<br />
Membranes (DBCM / DSV, <strong>CEA</strong> Saclay). Celle-ci est constituée de quatre à cinq molécules<br />
de DMPC pour une molécule de -CD-Succ-L-Asp(C12)-C12 et possède une température de<br />
transition gel-fluide franche à 12 °C. Les chaînes lipidiques ne désorganisent pas du tout la<br />
membrane de la phase, à la différence des systèmes Chol--CD / DMPC. Elles interagissent<br />
au contraire parfaitement avec les chaînes de DMPC.<br />
La structure générale des cyclodextrines amphiphiles que nous avons synthétisées peut-être<br />
schématisée de la manière suivante (figure 99) :<br />
CD espaceur<br />
-CD<br />
DIMEB<br />
TRIMEB<br />
connecteur<br />
succinique<br />
177<br />
Ancre<br />
hydrophobe<br />
DMPE<br />
peptidolipidyls<br />
Figure 99 : Structure générale des cyclodextrines amphiphiles<br />
En faisant varier tous les critères, beaucoup de composés peuvent être synthétisés (taille de la<br />
CD, fonctionnalisation ou non des hydroxyles libres de la CD, longueur du bras espaceur,<br />
longueur des chaînes lipidiques, une chaîne ou deux, saturées ou insaturées…). A ce stade,<br />
neuf composés ont été obtenus et entièrement caractérisés. Ceci est certes insuffisant pour<br />
effectuer une approche rationnelle de la relation entre la structure et les propriétés<br />
d’organisation. Toutefois, certaines hypothèses peuvent être avancées :<br />
La présence de la -CD comme tête polaire conduit à des composés insolubles en<br />
milieu aqueux mais qui s’incorporent dans des systèmes organisés de type bicouche
phospholipidique. Les propriétés de la phase mixte obtenue semblent dépendre de la<br />
nature de l’ancre hydrophobe (par exemple, la phase mixte<br />
peptidolipidyl--CD / DMPC a des proportions différentes et un degré d’organisation<br />
plus important que la phase mixte cholestéryl-CD / DMPC).<br />
La méthylation partielle ou totale de la CD conduit à des composés amphiphiles<br />
solubles en milieu aqueux, présentant une CMC relativement basse. La solubilité, la<br />
valeur de la CMC et la forme des objets obtenus semble dépendre de l’ancre<br />
hydrophobe (les dérivés cholestéryl forment des micelles, les dérivés phospholipidyl<br />
des fibres micellaires et les dérivés peptidolipidyl des agrégats non caractérisés). Les<br />
capacités d’inclusion sont conservées, et comme pour les CDs seules, les dérivés<br />
DIMEB forment les complexes les plus forts.<br />
A partir des composés obtenus, deux applications potentielles se sont dégagées :<br />
Grâce à une collaboration entre le Laboratoire Mixte Institut Pasteur-Université<br />
d’Artois (Faculté Jean Perrin, LENS) dirigé par le P r Monflier, le laboratoire du<br />
D r Créminon, du Service de Pharmacologie et d’Immunologie (DRM / DSV, <strong>CEA</strong><br />
Saclay) dirigé par le D r Jacques Grassi et nos laboratoires, une méthode d’évaluation<br />
du passage de la BHE “in vitro” suivi par dosage immunoenzymatique de nos CDs<br />
amphiphiles a pu être mise au point. Les premiers résultats montrent qu’un passage<br />
passif et sans cytotoxicité de la DIMEB-Succ-DMPE est possible. Ceci est un premier<br />
résultat certes encourageant mais qui doit être confirmé par des études beaucoup plus<br />
approfondies impliquant l’étude des CDs commerciales (et en particulier de la DIMEB<br />
seule), d’autres CDs amphiphiles et enfin de complexes d’inclusion dont la molécule<br />
invitée ne franchit pas seule la BHE.<br />
La formation de liposomes mixtes phospholipides / peptidolipidyl-CDs stables avec<br />
les dérivés de la -CD permet d’envisager par la suite de former des vésicules mixtes<br />
stables. Les propriétés d’inclusion de ces nouveaux objets supramoléculaires<br />
pourraient être testés par des techniques de diffusion par RMN. Nous obtiendrions<br />
alors de nouveaux systèmes de vectorisation très performants pour le transport de<br />
principes actifs.<br />
178
I. Matériels et méthodes<br />
I.1. Produits chimiques et solvants<br />
La majorité des réactifs et des solvants proviennent de chez SIGMA-ALDRICH SARL (Saint<br />
Quentin Fallavier, France) et FLUKA (division de SIGMA-ALDRICH SARL, Saint Quentin<br />
Fallavier, France), et ont été utilisés sans traitements spécifiques. La -cyclodextrine provient<br />
de chez Roquette frères SA (Lestrem, France). Toutes les cyclodextrines naturelles ou<br />
modifiées sont lyophilisées avant chaque réaction, lorsque celles-ci sont hydrosolubles. Le<br />
chlorure de toluène para-sulfonyle (TsCl) est recristallisé dans l’éther de pétrole. L’azoture de<br />
lithium provient de chez ACROS ORGANICS (Noisy-le-Grand, France) et est vendu sous<br />
forme d’une solution aqueuse à 20 % (m/v). Les phospholipides (DMPE et DMPC)<br />
proviennent de chez AVENTI POLAR LIPIDS (Alabaster, AL, USA) et de chez FLUKA. Les<br />
acides aminés utilisés pour la synthèse des peptidolipidyl-cyclodextrines proviennent<br />
respectivement de chez FLUKA pour l’acide L-aspartique, de chez MERCK Eurolab<br />
(Fontenay-sous-Bois, France) pour l’acide L-Glutamique et de chez BACHEM Biochimie<br />
SARL (Voisins-le-Bretonneux, France) dans le cas du FMOC-L-Asp(OtBu)-OH.<br />
Tous les solvants anhydres sont achetés chez SIGMA-ALDRICH et FLUKA et utilisés tels<br />
quels, excepté pour le chloroforme, qui est séché sur pentoxyde de di-phosphore avant d’être<br />
distillé.<br />
I.2. Chromatographie<br />
La Chromatographie sur Couche Mince (CCM) est réalisée sur des plaques d’aluminium<br />
5 7,5 cm recouvertes de gel de silice 60 F254 (MERCK). Les composés sont révélés sous<br />
lumière UV ( = 254 nm), puis par pulvérisation d’une solution aqueuse d’acide sulfurique à<br />
10 % suivie d’une étape de chauffage à 150 °C pour tous les dérivés de cyclodextrines, ou par<br />
aspersion d’une solution à 0,2 % de ninhydrine dans l’éthanol suivi d’une étape de chauffage<br />
à 150°C pour les composés possédant une fonction amine primaire.<br />
Les séparations chromatographiques flash sont effectuées sur gel de silice 60 FLUKA (220 -<br />
440 mesh ASTM). Les chromatographies sur colonne échangeuse d’ions sont réalisées avec<br />
180
une résine échangeuse de cations fortement acide MERCK (Lewatit ® SP1080, 60 – 150 mesh<br />
ASTM), en utilisant 140 cm 3 de résine pour 1,5 g de produit à purifier.<br />
L’analyse et la purification de certaines cyclodextrines modifiées sont effectuées par<br />
Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP) sur un appareil Waters <strong>DE</strong>LTA PREP<br />
3000, en utilisant un détecteur évaporatif à diffusion de lumière SE<strong>DE</strong>X 55 203 . Les colonnes<br />
CLHP employées sont une colonne µPorasil WATERS (10µm, 125 Å) en phase normale et<br />
une colonne µBondapak C18 WATERS (10µm, 125 Å) en polarité de phase inversée.<br />
I.3. Infra-Rouge, pouvoir rotatoire, point de fusion<br />
Les spectres Infra-Rouge sont réalisés sur un spectromètre THERMO NICOLET Avatar 320<br />
ESP (ATR) et sont traités grâce au logiciel EZ OMNIC.<br />
Les pouvoirs rotatoires optiques sont déterminés à 20-25 °C au moyen d’un polarimètre<br />
digital JASCO DIP-370, utilisant une lampe de sodium ( = 589 nm).<br />
Les points de fusion sont réalisés sur un banc chauffant de KOFLER. Les substances<br />
d’étalonnages proviennent de chez MERCK Eurolab.<br />
I.4. Spectrométrie de Masse<br />
Préparation des échantillons<br />
Les produits à analyser sont dissous (0,01 mg.mL -1 ) dans un mélange méthanol/eau<br />
50/50 (v/v) ou acétonitrile/eau 50/50 (v/v) et les solutions sont directement introduites<br />
(5µL.mn -1 ) dans la source électrospray par l’intermédiaire d’une pompe à seringue (Harvard<br />
Apparatus, Les Ulis, France).<br />
Appareillage<br />
Les spectres de masse sont réalisés sur un appareil Waters-Micromass (Manchester, U.K.)<br />
Q-TOF équipé d’une source d’ion électrospray assistée pneumatiquement (Z-Spray). L’azote<br />
est utilisé comme gaz de désolvatation et de nébulisation avec un débit de 250 et 50 L/h,<br />
respectivement. Les températures de la source et du gaz de désolvatation sont respectivement<br />
fixées à 80 et 150 °C. La tension du capillaire est de ± 3,5 kV et la tension du cône de<br />
± 180 V (± ESI). Pour les expériences de dissociation induite par collision (CID : Collision<br />
181
Induced Dissociation), l’argon est utilisé comme de gaz de collision, à une pression de<br />
l’analyseur indiqué à 5 × 10 -5 Torr et une énergie de collision réglée à 90 V.<br />
Les mesures de masse exacte sont effectuées sur un appareil Waters-Micromass (Manchester,<br />
U.K.) LCT, équipé d’une source d’ion électrospray assistée pneumatiquement (Z-spray), et<br />
muni d’un nébuliseur additionnel (Lockspray) pour le composé de référence (NaI). L’azote est<br />
utilisé comme gaz de désolvatation et de nébulisation avec un débit de 500 et 20 L/h,<br />
respectivement. Les températures de la source et du gaz de désolvatation sont respectivement<br />
fixées à 80 et 120 °C. La tension du capillaire est de ± 3,0 kV et la tension du cône de<br />
± 100 V (± ESI).<br />
Les spectres sont accumulés à une vitesse de 3 secondes par scan pour une gamme de masse<br />
comprise entre 100 et 3500 uma. La résolution utilisée est de 9000 FWHM pour le Q-TOF et<br />
5000 FWHM pour le LCT. L’acquisition des données et leur traitement sont réalisés avec le<br />
programme MassLynx V3.5.<br />
I.5. Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)<br />
I.5.1. RMN 1 H et 13 C<br />
Les expériences RMN du proton et du carbone sont enregistrées respectivement à la fréquence<br />
de 500,13 MHz et 125,77 MHz sur un appareil BRUKER DRX 500 équipé d’une sonde<br />
Broad Bande Inverse (bbi) 3 axes 5 mm. Les déplacements chimiques sont donnés par rapport<br />
à une référence externe, le tetraméthylsilane ( = 0 ppm), et les calibrations internes sont<br />
effectuées à l'aide du signal résiduel de solvant, avec une éventuelle correction pour le signal<br />
de l’eau en fonction de la température. Les solvants deutériés employés (D2O, DMSO-d6,<br />
CDCl3, Pyr-d5) proviennent de chez Eurisotop (Gif sur Yvette, FRANCE). Les mesures sont<br />
effectuées à l’aide d’un contrôle rigoureux de la température (+/- 0.1 K) à 298 K sauf<br />
indication contraire. Les valeurs de pulses 90° sont d’environ 11 µs pour 1 H (atténuation<br />
0 dB), et d’environ 20 µs pour le 13 C (atténuation 2 dB).<br />
Les spectres monodimensionnels sont acquis sur 16 K points, et transformés sur 32 K points<br />
(zero-filling). Un éventuel traitement à l’aide d’une fonction exponentielle (1
Les spectres bidimensionnels sont acquis sur 2048 points en F2 avec 256 incréments de temps<br />
en F1, le temps de recyclage pour chaque scan étant d’environ 1,5 sec. Les expériences<br />
phasées sont acquises en mode TPPI, et transformées en matrice de 1K x 1K points (matrice<br />
réels-réels). Les spectres sont traités par une fonction d’apodisation en sinus décalé de /2<br />
dans les deux dimensions, avec une correction de la ligne de base.<br />
Tous les spectres sont traités à l’aide du logiciel UXNMR (Bruker Analytische Messtechnik)<br />
sur la station de travail INDY (Silicon Graphics) ou sur PC.<br />
I.5.2. RMN 31 P<br />
Les expériences RMN du phosphore sont enregistrées à la fréquence de 81,0 MHz sur un<br />
spectromètre AC200. Dans tous les cas, les échantillons sont préparés dans l’eau et les<br />
mesures sont effectuées à l’aide d’un contrôle rigoureux de la température à 298 K ou 303 K<br />
sauf indication contraire.<br />
I.5.3. RMN 2 H<br />
L’eau appauvrie en deutérium provient de chez Eurisotop (Gif sur Yvette, FRANCE). Les<br />
spectres RMN du deutérium sont enregistrées à la fréquence de 46,0 MHz sur un spectromètre<br />
BRUKER DMX 300 équipé d’une sonde conçue spécialement pour les expériences RMN 2 H<br />
à l’état solide (Morris Instrument Inc., Gloucester, Ontario, Canada). Les spectres sont acquis<br />
entre -12°C et 37°C, sur 4096 points (DW = 2µs), le temps de recyclage pour chaque scan<br />
étant d’environ 200 ms.<br />
Une séquence d’écho quadrupolaire est utilisée avec une longueur de pulse de 3 µs et un<br />
intervalle de temps de 40 µs entre les pulses. La phase est ajustée pour n’obtenir plus aucun<br />
signal dans le canal imaginaire, suivi de la transformation de Fourier de l’écho. Quand cela<br />
est nécessaire, la phase de l’écho est ajustée par une modification de la valeur de 2 par une<br />
fraction de la période d’échantillonage DW.<br />
Préparation des échantillons<br />
Les membranes de lipides purs ou de mélanges lipides / CDs amphiphiles sont obtenues en<br />
mélangeant des solutions chloroformiques de DMPC et méthanoliques des glycoconjugués<br />
dans les proportions requises. La solution mixte est alors concentrée à sec, séchée sous vide<br />
183
poussé pendant 12 h. Le film obtenu est dispersé dans 100 à 300 µL d’eau appauvrie en<br />
deutérium ajustés à pH = 8,0 et fortement agités pour obtenir des suspensions à la<br />
concentration en lipides d’environ 200 mM.<br />
I.6. Mesures de tensions de surface<br />
Les tensions de surface ( sont mesurées à 20°C pour chacune des solutions, obtenues par<br />
dilution d’une solution mère S0 dans la gamme S0/2, S0/4, S0/8, S0/16, S0/32, S0/64 et S0/128,<br />
et après avoir atteint les équilibres thermique et surfacique (plus de 12 h.). Les mesures sont<br />
réalisées avec un tensiomètre TD 2000 Prolabo, en utilisant la méthode de Wilhelmy. Les<br />
valeurs de CMC sont déterminées à partir des graphiques f(Log C), dans lesquels C<br />
représente la concentration molaire du composé étudié.<br />
I.7. Diffusion de lumière<br />
Les expériences de diffusions statique et dynamique de la lumière sont effectuées sur un<br />
goniomètre AMTEC 2000 pourvu d’un laser à argon ionisé comme source lumineuse (Spectra<br />
Physics 2016) dont on utilise la longueur d’onde 514,5 nm. Le domaine de vecteur de<br />
diffusion q (Å -1 ) = 4n/ sin(/2) (n étant l’indice de réfraction du milieu dans lequel les<br />
particules sont suspendues, la longueur d’onde du rayon incident et l’angle de diffusion)<br />
couvert est 5,6×10 -4 Å -1 < q < 2,7×10 -3 Å -1 . Les échantillons sont préparés dans l’eau<br />
(n = 1,33) et thermostatés à 25°C. La fonction de corrélation et les mesures d’intensité de<br />
lumière sont obtenues et traitées à partir d’un corrélateur BI30 et d’un logiciel Brookhaven<br />
Instrument.<br />
I.8. Expériences de réflectivité de rayons X<br />
Les films noirs verticaux macroscopiques (35 mm × 3 mm) sont obtenus en utilisant un cadre<br />
rectangulaire à l’intérieur d’une boite scellée pour maintenir la saturation en vapeur d’eau.<br />
Les mesures de réflectivité de rayons X sont effectuées sur un diffractomètre à haute<br />
résolution (Micro-Contrôle Optix), en utilisant une anticathode de cuivre comme source de<br />
rayons X ( = 1,5405 Å, (raie CuK1)).<br />
184
I.9. Dosages immuno-enzymatiques<br />
I.9.1. Dosages par compétition: protocoles opératoires standards<br />
Les plaques de microtitration (96 puits, plaque MAXISORB, 12x8 puits) ont été<br />
préalablement sensibilisées par un anticorps monoclonal de souris dirigé contre les<br />
immunoglobulines de lapin, puis saturées avec du tampon EIA. Avant utilisation, les plaques<br />
sont lavées avec une solution de Tween 20 (0.05 %) dans un tampon phosphate (0.01 M, pH<br />
7.4). Dans chaque puits, on distribue alors 50 µL de traceur enzymatique, 50 µL de sérum<br />
polyclonal de lapin, et 50 µL d’échantillon ou d’étalon cyclodextrine (toutes les dilutions sont<br />
réalisées en tampon EIA). Le traceur est utilisé à une concentration de 5 unités Ellman (pour<br />
définition, voir Grassi et coll 254 ). La dilution à laquelle est employé le sérum de lapin a été<br />
préalablement estimée en effectuant une série de dilution de l’anti-sérum.<br />
Après 18 h de réaction à 4 °C, les plaques sont lavées (5 lavages avec avec une solution de<br />
Tween 20 (0.05 %) dans un tampon phosphate (0.01 M, pH 7.4)). On distribue alors dans<br />
chaque puits 200 µL de réactif d'Ellman. Après une heure de réaction enzymatique (à l'abri de<br />
la lumière et sous agitation douce), l'absorbance de chaque puits est mesurée à 414 nm.<br />
Pour chaque plaque, 4 puits sont reservés à la mesure de l'absorbance maximale (B0, réalisé<br />
en remplaçant le volume destiné à l’échantillon ou à la solution étalon par 50 µL de tampon<br />
EIA), et 2 puits sont destinés à la mesure de la liaison non-spécifique du traceur sur la phase<br />
solide (le volume destiné à l’échantillon ou à la solution étalon et le volume de sérum<br />
polyclonal étant alors remplacées par 100 µL de tampon EIA).<br />
Chaque point de mesure est réalisé en double, et la mesure du B0 en quatre exemplaires.<br />
Les résultats sont exprimés en (B/B0)x100, en fonction de la dose de cyclodextrines<br />
introduites (échelle semi-logarithmique, voir courbe au chapitre des rappels d’immunologie).<br />
I.9.2. Tampons<br />
Tampon Ringer-HEPES :<br />
Pour 1L de tampon :<br />
NaCl : 8,8g ; KCl : 0,387g ; CaCl2 : 0,244 g ; MgCl2, 6 H2O : 0,0406 g ; NaHCO3 : 0,504 g ;<br />
HEPES : 1,19 g ; glucose : 0,504 g.<br />
Dissoudre dans EPPI, ajuster le pH à 7,4, ajuster le volume en fiole jaugée puis filtrer.<br />
185
Réactif d'Ellman pour le dosage par compétition:<br />
Tampon phosphate 10 -2 M (pH 7,4), iodure d'acétylthiocholine (76 mM), 5,5'-dithiobis-(2nitrobenzoique<br />
acide) (DTNB, 250 µM), NaCl (1,45 M).<br />
Tampon EIA (pH 7.4):<br />
[K2HPO4] = 0,08 M, [KH2PO4] = 0,02 M, [NaCl] = 0,15 M, [BSA] = 145 µM,<br />
[NaN3] = 1,5 mM.<br />
186
II. Synthèses<br />
6 I -(O-p-tolylsulphonyl)-cyclomaltoheptaose (2)<br />
S a<br />
O<br />
O b c'<br />
b<br />
c<br />
d<br />
e<br />
'<br />
HO<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
2<br />
4<br />
6<br />
5<br />
O<br />
HO<br />
3<br />
2<br />
OH<br />
1<br />
O<br />
Dans un erlenmeyer de 1 L, 70,16 g (61,8 mmol ; 1 éq.) de -CD 1, préalablement séchée<br />
sous vide, sont mis en suspension dans 525 mL d’eau sous forte agitation (Ultraturax,<br />
8000 tours/min). Le pH de la solution est amené à 11-12 par ajout de 24,5 mL de soude<br />
8 N (la -CD se solubilise). Le milieu réactionnel est ensuite refroidi à 0°C dans un bain de<br />
glace, puis 14,12 g (74,1 mmol ; 1,2 éq.) de chlorure de p-toluènesulfonyle (fraîchement<br />
recristallisé dans l’éther de pétrole), dissous dans 35 mL d’acétonitrile, sont additionnés<br />
goutte à goutte (durée d’addition : 10 min). La solution obtenue est immédiatement acidifiée<br />
en ajoutant 25 mL d’acide chlorhydrique 6 N (pH ~ 1-2) : il se forme un précipité abondant.<br />
L’erlenmeyer est laissé à 4°C durant 12 h. Le précipité est alors filtré puis solubilisé dans<br />
150 mL d’eau bouillante (recristallisation à 4°C pendant 24 h). Le précipité est filtré, lavé à<br />
l’eau, puis à l’acétone, et enfin séché 24 h à l’étuve à vide. On obtient 14,99 g du composé 2,<br />
sous forme d’une fine poudre blanche.<br />
Composé 2 :<br />
Formule brute : C49H76O37S, M = 1289,17 g.mol -1<br />
Rendement : 14,99 g (11,6 mmol ; 31 %)<br />
CCM : Rf 2 = 0,4 (NH4OH 6% / EtOH / BuOH 5 / 5 / 4 (v/v/v) ; Rf 1 = 0,2)<br />
HPLC : k’ 2 = 3,3 (µBondapak C18 ; Gradient linéaire de 10 à 100 % de CH3CN dans H2O<br />
en 30 min.)<br />
187<br />
OH<br />
6
p.f. 179 °C (lente déc.)<br />
ESI-MS +: m/z mesuré à 1290,2 pour [M+H] + , calculé à 1290,2 pour C49H77O37S<br />
RMN 1 H (dmso-d6, 500,13 MHz) (ppm) 7,75 (d, 2H, H-arom. b/b’) ; 7,42 (d, 2H, H-<br />
arom. c/c’) ; 5,6-5,9 (14 OH, OH-2, OH-3) ; 4,81 – 4,86 (m, 6H, H-1 II-VII CD) ; 4,76 (d, 1H, H-<br />
1 I CD) ; 4,33 (d, 1H, H-6 I CD) ; 4,18 (dd, 1H, H-6’ I CD) ; 3,4 – 3,7 (m, 18H, H-5 I-VII CD / H-6 II-VII CD<br />
/ H-6’ II-VII CD / H-3 I-VII CD) ; 3,2 – 3,4 (m, 14H, H-2 I-VII CD / H-4 I-VII CD) ; 2,42 (s, 3H, CeH3)<br />
Les données analytiques sont en accord avec la littérature 105 :<br />
6 I -azido-6 I -désoxy-cyclomaltoheptaose (3)<br />
HO<br />
N 3<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
3<br />
4<br />
6<br />
5<br />
O<br />
HO<br />
3<br />
2<br />
OH<br />
1<br />
O<br />
Dans un ballon de 1 L, 7,16 g (5,55 mmol ; 1 éq.) du composé 2 sont mis en suspension dans<br />
605 mL d’eau sous agitation. 13,6 mL (55,5 mmol ; 10 éq.) d’une solution aqueuse d’azoture<br />
de lithium à 20 % (m/v) sont ajoutés et le tout est porté à reflux, sous agitation, durant 4 h<br />
(Tbain = 110°C). Le milieu réactionnel est alors maintenu 15 h sous agitation douce et à<br />
température ambiante. Puis, après filtration des insolubles, la solution est concentrée à<br />
l’évaporateur rotatif (40°C), jusqu’à obtenir un volume d’environ 10 mL. Le résidu huileux<br />
est ensuite précipité dans 200 mL d’éthanol sous agitation. Le mélange est porté à ébullition<br />
puis filtré à chaud (élimination de l’azoture de lithium en excès). Le solide obtenu est lavé<br />
avec de l’éthanol bouillant propre, puis avec de l’acétone et séché à l’étuve à vide. On isole<br />
5,96 g d’une fine poudre blanche, correspondant au composé 3, et à de la -CD régénérée<br />
pendant la réaction (hydrolyse du tosylate 2). Une analyse par CLHP à polarité de phase<br />
inversée (H2O / CH3CN 85 / 15 (v/v)) permet d’estimer que ce mélange contient ~ 35 % de -<br />
CD, qui sera éliminée ultérieurement.<br />
188<br />
OH<br />
6
Composé 3 :<br />
Formule brute : C42H69N3O34, M = 1160,01 g.mol -1<br />
Rendement estimé : 5,96 g 65 % = 3,87 g (3,34 mmol ; 60 %)<br />
CCM : Rf 3 = 0,3 (NH4OH 6% / EtOH / BuOH 5 / 5 / 4 (v/v/v) ; Rf 2 = 0,4)<br />
HPLC : k’ 1 (-CD) = 0,2 ; k’ 3 = 0,9 (µBondapak C18 ; H2O / CH3CN 85 / 15 (v/v) en<br />
15 min.)<br />
p.f. 160°C (déc.)<br />
ESI-MS + : m/z mesuré à 1166,5 pour [M+Li] + , calculé à 1166,4 pour C42H69N3O34Li<br />
RMN 1 H (D2O, 500,13 MHz) (ppm) 5,10 (d, H-1CD) ; 3,99 (t, H-3CD) ; 3,86 – 3,97 (m, H-<br />
5CD / H-6CD / H-6’CD) ; 3,68 (dd, H-2CD) ; 3,61 (d, H-4CD)<br />
6 I -amino-6 I -désoxy-cyclomaltoheptaose (4)<br />
HO<br />
NH2<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
4<br />
6<br />
4 O<br />
5<br />
HO 2<br />
3<br />
OH<br />
1<br />
O<br />
Dans un ballon de 500 mL, 3,03 g (2,61 mmol ; 1 éq.) du composé 3 sont dissous dans<br />
200 mL de DMF sous agitation. Une solution de 2,74 g (10,4 mmol ; 4 éq.) de<br />
triphénylphosphine (fraîchement recristallisée dans l’éthanol bouillant) dissous dans 10 mL de<br />
DMF est ajoutée. Après 2 h sous agitation à température ambiante, le milieu réactionnel est<br />
refroidi à 0°C dans un bain de glace et 98,5 mL d’ammoniaque (solution à 20 % v/v) sont<br />
lentement additionnés. La réaction est maintenue 18 h sous agitation à température ambiante.<br />
La solution est ensuite concentrée à l’évaporateur rotatif (40°C) et le résidu huileux est repris<br />
dans 150 mL d’eau. Le précipité blanc formé (mélange de triphénylphosphine et d’oxyde de<br />
triphénylphosphine) est filtré et lavé (2 20 mL d’eau). Le filtrat est concentré sous vide à<br />
40°C, puis repris dans un minimun d’eau et ajusté à pH = 4,5 par ajout de quelques gouttes<br />
d’HCl 1 N. Cette solution est passée sur une colonne de résine échangeuse d'ions<br />
189<br />
OH<br />
6
(V = 140 cm 3 ), remplie de résine anionique LEWATIT 1080 (MERCK), préalablement<br />
régénérée par trois cycles de lavages successifs alternant ammoniaque 10 %, eau, et HCl<br />
0,1 M. La mono-amine 4 est fortement retenue sur la colonne, tandis que la -CD présente est<br />
éluée avec de l'eau (5 volumes de colonne). Le produit 4 est à son tour élué avec une solution<br />
d'ammoniaque à 10 % (3 volumes de colonne). L’éluat basique est évaporé à sec sous vide<br />
(40°C), repris dans un minimum d’eau puis lyophilisé. On isole ainsi 1,68 g du composé 4,<br />
sous forme d’une poudre blanche.<br />
composé 4 :<br />
Formule brute : C42H71NO34, M = 1134,01 g.mol -1<br />
Rendement estimé : 1,68 g (1,48 mmol ; 87 %)<br />
CCM : Rf 4 = 0,2 (NH4OH 6% / EtOH / BuOH 5 / 5 / 4 (v/v/v) ; Rf 3 = 0,3)<br />
p.f. 160°C (déc.)<br />
IR : absence de bande (N3)<br />
ESI-MS + : m/z mesuré à 1134,5 [M+H] + , calculé à 1134,4 pour C42H72NO34<br />
RMN 1 H (D2O, 500,13 MHz) (ppm) 5,09 – 5,13 (7H, H-1CD) ; 3,86 – 4,01 (H-3CD / H-6 II-<br />
VII<br />
CD / H-5CD / H-6’ II-VII CD) ; 3,68 (ddl, H-4CD) ; 3,62 (tl, H-2CD) ; 3,51 (t, 1H) ; 3,19 (d, 1H,<br />
H-6 I CD) ; 2,95 (dd, 1H, H-6’ I CD)<br />
6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxy-cyclomaltoheptaose (5)<br />
HO<br />
NH<br />
OH<br />
O c d<br />
a b O<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
5<br />
6<br />
4 O<br />
5<br />
HO 2<br />
3<br />
OH<br />
1<br />
O<br />
190<br />
OH<br />
6
Dans un ballon de 100 mL, 990,5 mg (0,87 mmol ; 1 éq.) du composé 4, préalablement<br />
lyophilisés, sont dissous dans 20 mL de DMF anhydre sous agitation et sous atmosphère<br />
inerte. 137,7 mg (1,31 mmol ; 1,5 éq.) d’anhydride succinique en solution dans 5 mL de DMF<br />
anhydre sont alors additionnés. Le milieu réactionnel est maintenu sous agitation et sous<br />
atmosphère inerte pendant 18 h à température ambiante. La réaction est stoppée par ajout de<br />
100 µL d’eau puis la solution est concentrée à l’évaporateur rotatif (40°C). Le résidu huileux<br />
est ensuite précipité dans 200 mL d’acétone sous agitation. Le solide obtenu est filtré, lavé<br />
avec de l’acétone puis séché. Le produit est repris dans un minimum d’eau et lyophilisé, après<br />
filtration des insolubles sur filtre Millex. On obtient 1,04 g du composé 5, sous forme d’une<br />
poudre blanche.<br />
Composé 5 :<br />
Formule brute : C46H75NO37, M = 1234,09 g.mol -1<br />
Rendement : 1,04 g (0,84 mmol, 97 %)<br />
CCM : Rf 5 = 0,6 (DMF / BuOH / H2O 1 / 2 / 1 (v/v/v) ; Rf 4 = 0,1)<br />
p.f. 160°C (déc.)<br />
ESI-MS + : m/z mesuré à 1234,5 [M+H] + , calculé à 1234,4 pour C46H76NO37<br />
RMN 1 H (Pyr-d5, 500,13 MHz) (ppm) 8,67 (t, 1H, NHCD, 3 JNH-6 I = 5,7 Hz) ; 7,4 – 7,9 (14<br />
OH) ; 5,51 – 5,61 (6H, H-1 II-VII CD) ; 5,45 (d, 1H, H-1 I CD, 3 J1 I -2 I = 3,5 Hz) ; 4,63 – 4,78 (H-3 II-<br />
VII<br />
CD) ; 4,64 (H-3 I CD) ; 4,62 – 4,69 (H-6 II-VII CD) ; 4,31 – 4,57 (H-5 II-VII CD / H-6’ II-VII CD) ; 4,46<br />
(H-5 I CD) ; 4,04 – 4,27 (H-4 II-VII CD) ; 4,19 (H-6 I CD) ; 4,12 (H-6’ I CD) ; 3,98 – 4,11 (H-2 II-VII CD) ;<br />
3,88 (H-2 I CD) ; 3,87 (H-4 I CD) ; 2,77 – 2,94 (4H, H-b / H-c, syst. AA’B)<br />
191
6 I -(1,2-ditétradecanoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamido)succinylamido-6 I -désoxy-<br />
cyclomaltoheptaose (-CD-Succ-DMPE) (6)<br />
HO<br />
NH<br />
NH<br />
O c d<br />
a b O<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
<br />
OH<br />
<br />
4<br />
6<br />
5<br />
O<br />
HO<br />
3<br />
2<br />
OH<br />
1<br />
O<br />
O<br />
H<br />
O<br />
1<br />
O<br />
O<br />
P<br />
O<br />
O- <br />
<br />
<br />
O<br />
1<br />
O<br />
6<br />
6<br />
Dans un ballon de 50 mL sec, 576 mg (0,47 mmol ; 1 éq.) du composé 5, préalablement<br />
lyophilisés, sont dissous dans 15 mL de DMF anhydre sous agitation et sous atmosphère<br />
inerte. 109 µL (0,70 mmol ; 1,5 éq.) de diisopropylcarbodiimide (DIC), puis 84,1 mg<br />
(0,73 mmol ; 1,5 éq.) de N-hydroxysuccinimide (NHS) dissous dans 5 mL de DMF anhydre<br />
sont successivement ajoutés. La réaction est laissée 2 h sous agitation et sous atmosphère<br />
inerte à température ambiante. Cette solution est alors versée dans un tricol de 500 mL<br />
surmonté d’un réfrigérant et d’un piège à CaCl2, dans lequel 358,3 mg (0,56 mmol ; 1,2 éq.)<br />
de DMPE sont préalablement mis en solution dans 200 mL de chloroforme anhydre<br />
(fraîchement distillé sur P2O5), en présence de 107 µL (0,76 mmol ; 1,6 éq.) de triéthylamine,<br />
le tout placé dans un bain marie à 45 °C sous agitation et sous atmosphère inerte. L’ajout de<br />
180 mL de DMF anhydre permet de se placer dans un milieu DMF / CHCl3 1/1 (v/v). Le<br />
milieu réactionnel est alors maintenu 24 h à 45°C, sous agitation, et dans des conditions<br />
anhydres. La réaction est enfin stoppée par ajout de 100 µL d’eau. La solution est alors<br />
concentrée à l’évaporateur rotatif (40°C) jusqu’à obtenir un résidu huileux, qui est ensuite<br />
précipité dans 200 mL d’éther sous agitation. Le précipité est récupéré par centrifugation<br />
(10000 tours/min ; 15 min), lavé avec de l’éther et séché une nuit sous hotte. 372,3 mg de<br />
produit brut sont ainsi isolés et sont purifiés sur CLHP à polarité de phase normale (µPorasil ;<br />
192<br />
14<br />
14
A/B 10 / 90 (v/v) avec A = CH3OH et B = CHCl3 / CH3OH / NH3 20 % (80/19,5/0,5) (v/v/v)<br />
en 15 min.). On isole 130,5 mg du composé 23 sous forme d’une poudre blanche.<br />
Composé 6 :<br />
Formule brute : C79H138N2O44P, M = 1850,93 g.mol -1<br />
Rendement : 130,5 mg (0,07 mmol, 15 %)<br />
CCM : Rf 6 = 0,2 (CHCl3 / MeOH / H2O 65 / 35 / 8 (v/v/v))<br />
p.f. 160°C (déc.)<br />
[]D 20 + 69 ° (c 0,26, pyridine)<br />
ES-HRMS (haute résolution avec détection en mode négatif) : m/z mesuré à 1849,8464 [M] - ,<br />
calculé à 1849,8360 pour C79H138N2O44P (déviation : 5,6 ppm)<br />
RMN 1 H (Pyr-d5, 500,13 MHz) (ppm) 8,80 (tl, 1H, NHDMPE) ; 8,71 (tl, 1H, NHCD) ; 5,57<br />
(m, 1H, H-) ; 5,47 – 5,54 (m), 5,43 (d) (6H, H-1 II-VII CD) ; 5,39 (d, 1H, H-1 I CD) ; 4,65 (H-) ;<br />
4,56 - 4,65 (H-3 II-VII CD) ; 4,51 - 4,58 (H-6 II-VII CD) ; 4,52 (H-3 I CD) ; 4,43 (H-’) ; 4,29 - 4,44 (H-<br />
5 II-VII CD) ; 4,36 (H-) ; 4,31 (H-5 I CD) ; 4,17 - 4,23 (H-6’ II-VII CD) ; 4,19 (H-) ; 4,16 (H-6 I CD) ;<br />
4,05 - 4,15 (H-4 II-VII CD) ; 3,89 - 4,10 (H-2 II-VII CD) ; 3,96 (dd, 1H, H-2 I CD) ; 3,84 (H-6’ I CD) ;<br />
3,77 (t, 1H, H-4 I CD) ; 3,57 (H-) ; 2,62 – 2,93 (ml, 4H, H-b / H-c) ; 2,27 (dt, 4H, H-2 / H-<br />
2) ; 1,52 (m, 4H, H-3 /H-3) ; 1,07 - 1,22 (ml, 40H, H-4 à H-13 / H-4 à H-13) ; 0,73<br />
(t, 6H, H-14 / H-14)<br />
RMN 13 C (CDCl3, 125,77 MHz) (ppm) 173,9, 173,7, 173,5, 173,4 (4s, CO-d, CO-a,<br />
CO-1, CO-1) ; 103,8 - 104,4 (C-1 I-VII CD) ; 85,4 (C-4 I CD) ; 83,4 – 84,0 (C-4 II-VII CD) ; 73,7 –<br />
75,1 (C-2 I-VII CD / C-5 II-VII CD / C-3 I-VII CD) ; 72,1 (C-5 I CD) ; 71,7 (C-) ; 64,8 (C-) ; 64,5 (C-) ;<br />
63,6 (C-) ; 61,5 - 62,1 (C-6 II-VII CD) ; 41,5 (C-) ; 41,1 (C-6 I CD) ; 34,6, 34,8 (2s, C-2, C-2) ;<br />
32,4 (C-12 / C-12) ; 29,6 - 30,4 (C-4 à C11 / C-4 à C-11) ; 25,5, 25,6 (2s, C-3 / C-<br />
3) ; 23,2 (C-13 / C-13) ; 14,6 (C-14 / C-14)<br />
193
6 I -azido-6 I -désoxy-2 I -O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,6 II-VII -di-O-méthyl)cyclomaltoheptaose (7)<br />
HO<br />
N 3<br />
O<br />
OCH 3<br />
O<br />
7<br />
4<br />
6<br />
5<br />
O<br />
HO<br />
3<br />
2<br />
OCH<br />
1<br />
3<br />
O<br />
Dans un bicol de 250 mL sec, 4,45 g (3,84 mmol ; 1 éq.) du composé 3, préalablement séchés<br />
à l’étuve à vide, sont dissous dans 55,7 mL de DMF anhydre sous agitation et sous<br />
atmosphère inerte. Après avoir placé le milieu réactionnel dans un bain à 8°C, 55,7 mL de<br />
DMSO anhydre sont introduits, puis 8,25 g (53,8 mmol ; 14 éq.) d’oxyde de baryum et 8,50 g<br />
(26,9 mmol ; 7 éq.) d’hydroxyde de baryum octahydraté sont successivement ajoutés. On<br />
additionne enfin 6 mL (63,0 mmol) de sulfate de méthyle, et le tout est maintenu pendant 72 h<br />
à 8°C, sous agitation et sous atmosphère inerte. A la suspension grisâtre obtenue, sont ensuite<br />
ajoutés lentement 27,5 mL d’ammoniaque (solution à 20 % v/v). Le mélange est alors<br />
maintenu 3 h sous agitation et à température ambiante. Après avoir laissé décanter la<br />
suspension 2 h à 4°C, le surnageant est isolé dans un ballon de 500 mL, concentré à<br />
l’évaporateur rotatif (50°C) jusqu’à obtenir un résidu huileux, puis repris dans 300 mL de<br />
dichlorométhane. Le solide résiduel de la décantation est repris avec du dichlorométhane<br />
(3 100 mL) puis filtré. Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution<br />
aqueuse saturée en chlorure de sodium (3 130 mL), puis à l’eau (3 130 mL), séchées sur<br />
sulfate de sodium et concentrées à l’évaporateur rotatif (40°C) jusqu’à l’obtention d’une huile<br />
résiduelle. Ce résidu est précipité dans 250 mL d’hexane sous agitation. Le précipité est filtré,<br />
lavé avec de l’hexane et séché à l’étuve à vide. On isole 3,59 g d’une fine poudre blanche,<br />
correspondant au composé 7, et à de la per(2,6-di-O-méthyl)cyclomaltoheptaose (DIMEB),<br />
formée à partir de la -CD régénérée lors de la synthèse du composé 3. Ce mélange sera<br />
194<br />
OCH 3<br />
purifié lors de l’étape suivante (synthèse du composé 8).<br />
composé 7 :<br />
Formule brute : C55H95N3O34, M = 1342,36 g.mol -1<br />
Rendement : 3,59 g (2,67 mmol ; 70 %)<br />
6
CCM : Rf 7 = 0,9 (CHCl3 / MeOH 9 / 1 (v/v) ; Rf 3 = 0)<br />
p.f. 160°C (déc.)<br />
IR : 2101 cm -1 (N3)<br />
ESI-MS + : m/z mesuré à 1364,5 [M+Na] + , calculé à 1364,6 pour C55H95N3O34Na<br />
RMN 1 H (CDCl3, 500,13 MHz) (ppm) 5,25 – 5,32 (H-1CD) ; 3,99 – 4,05 (H-3CD) ; 3,88 –<br />
3,98 (H-5CD) ; 3,70 – 3,85 (H-6CD / H-6’CD) ; 3,60 (OCH3-6CD) ; 3,53 – 3,68 (H-4CD) ; 3,43<br />
(OCH3-2CD) ; 3,40 – 3,46 (H-2CD)<br />
6 I -amino-6 I -désoxy-2 I -O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,6 II-VII -di-O-méthyl)cyclomaltoheptaose (8)<br />
HO<br />
NH 2<br />
O<br />
OCH 3<br />
O<br />
8<br />
4<br />
6<br />
5<br />
O<br />
HO<br />
3<br />
2<br />
OCH<br />
1<br />
3<br />
O<br />
Dans un ballon de 500 mL, 3,51 g (2,61 mmol ; 1 éq.) du composé 7 sont dissous dans<br />
200 mL de DMF sous agitation. Une solution de 2,74 g (10,46 mmol ; 4 éq.) de<br />
triphénylphosphine (fraîchement recristallisée dans l’éthanol bouillant) dissous dans 10 mL de<br />
DMF est ajoutée. Après 2 h sous agitation à température ambiante, le milieu réactionnel est<br />
refroidi à 0°C dans un bain de glace et 99 mL d’ammoniaque (solution à 20 % v/v) sont<br />
lentement additionnés. La réaction est maintenue 18 h sous agitation à température ambiante.<br />
La solution est ensuite concentrée à l’évaporateur rotatif (40°C) et le résidu huileux est repris<br />
dans 150 mL d’eau. Le précipité blanc formé (mélange de triphénylphosphine et d’oxyde de<br />
triphénylphosphine) est filtré et lavé (2 20 mL d’eau). Le filtrat est concentré sous vide à<br />
40°C, puis repris dans un minimun d’eau et ajusté à pH = 4,5 par ajout de quelques gouttes<br />
d’HCl 1 N. Cette solution est passée sur une colonne de résine échangeuse d'ions<br />
(V = 160 cm 3 ), remplie de résine anionique LEWATIT 1080 (MERCK), préalablement<br />
régénérée par trois cycles de lavages successifs alternant ammoniaque 10 %, eau, et HCl<br />
0,1 M. La mono-amine 8 est fortement retenue sur la colonne, tandis que la DIMEB présente<br />
est éluée avec de l'eau (5 volumes de colonne). Le produit 8 est à son tour élué avec une<br />
195<br />
OCH3<br />
6
solution d'ammoniaque à 10 % (3 volumes de colonne). L’éluat basique est évaporé à sec à<br />
l’évaporateur rotatif (40°C) ; le résidu est repris dans un minimum d’eau puis lyophilisé. On<br />
isole ainsi 1,68 g du composé 8, sous forme d’une poudre blanche.<br />
Composé 8 :<br />
Formule brute: C55H97NO34, M = 1316,36 g.mol -1<br />
Rendement estimé : 1,68 g (1,28 mmol ; 75 %)<br />
CCM : Rf 8 = 0,4 (CHCl3 / MeOH 9 / 1 (v/v) ; Rf 7 = 0,9)<br />
p.f. 160 °C (déc.)<br />
IR : absence de bande (N3)<br />
ESI-MS + : m/z mesuré à 1316,8 [M+H] + , calculé à 1316,6 pour C55H98NO34<br />
RMN 1 H (D2O, 500,13 MHz) (ppm) 5,24 – 5,30 (7H, H-1 I-VII CD) ; 3,92 – 3,98 (H-3 I-VII CD) ;<br />
3,80 – 3,90 (H-5 II-VII CD) ; 3,72 – 3,80 (H-6 II-VII CD, H-6’ II-VII CD) ; 3,71 (H-5 I CD) ; 3,61 (OCH3-<br />
6CD) ; 3,58 – 3,65 (H-4 II-VII CD) ; 3,55 (H-4 I CD) ; 3,43 (OCH3-2CD) ; 3,38 – 3,44 (H-2 I-VII CD) ;<br />
3,06 (dd, 1H, H-6 I CD) ; 2,92 (dd, 1H, H-6’ I CD)<br />
RMN 13 C (D2O, 125,77 MHz) (ppm) 99,3 – 99,9 (C-1 I-VII CD) ; 81,5 – 82,2 (C-4 I-VII CD / C-<br />
2 I-VII CD) ; 72,4 – 72,7 (C-3 I-VII CD) ; 70,4 – 72,7 (C-5 I-VII CD / C-6 II-VII CD) ; 59,6 – 59,8 (OCH3-<br />
6CD) ; 58,8 – 59,0 (OCH3-2CD) ; 41,5 (C-6 I CD)<br />
6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxy-2 I -O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,6 II-VII -di-O-méthyl)<br />
cyclomaltoheptaose (9)<br />
HO<br />
OH<br />
O c d<br />
a b O<br />
NH<br />
O<br />
OCH 3<br />
O<br />
9<br />
6<br />
4 O<br />
5<br />
HO 2<br />
3<br />
OCH<br />
1<br />
3<br />
O<br />
196<br />
OCH 3<br />
6
Dans un ballon de 100 mL, 1,093 g (0,83 mmol ; 1,1 éq.) du composé 8, préalablement<br />
lyophilisés, sont dissous dans 20 mL de DMF anhydre sous agitation et sous atmosphère<br />
inerte. 75,7 mg (0,76 mmol ; 1 éq.) d’anhydride succinique en solution dans 5 mL de DMF<br />
anhydre sont alors additionnés. Le milieu réactionnel est maintenu sous agitation et sous<br />
atmosphère inerte pendant 18 h à température ambiante. La réaction est stoppée par ajout de<br />
100 µL d’eau. Le solvant est évaporé à sec sous vide (40°C) puis le résidu est repris dans un<br />
minimum d’eau jusqu’à dissolution complète. Cette solution acide est passée sur une colonne<br />
de résine échangeuse d'ions (V = 10 cm 3 ), remplie de résine anionique LEWATIT 1080<br />
(MERCK), préalablement régénérée par trois cycles de lavages successifs alternant<br />
ammoniaque 10 %, eau, et HCl 0,1 M. Le composé 9 est élué avec de l’eau alors que la<br />
mono-amine 8 en excès (sous forme d’un ion ammonium) est fortement retenue dans la<br />
colonne. L’éluat est concentré à l’évaporateur rotatif (40°C) puis lyophilisé. On obtient<br />
821 mg du composé 9 sous forme d’une poudre blanche.<br />
Composé 9 :<br />
Formule brute : C59H101NO37, M = 1416,44 g.mol -1<br />
Rendement : 821 mg (0,58 mmol, 77 %)<br />
CCM : Rf 9 = 0,2 (CHCl3 / MeOH 9 / 1 (v/v) ; Rf 8 = 0,4)<br />
p.f. 160 °C (déc.)<br />
ESI-MS - : m/z mesuré à 1414,5 pour [M-H] - , calculé à 1414,6 pour C59H100NO37<br />
197
6 I -(1,2-ditétradecanoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamido)succinylamido-6 I -désoxy-2 I -<br />
O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,6 II-VII -di-O-méthyl)cyclomaltoheptaose (DIMEB-Succ-DMPE)<br />
(10)<br />
HO<br />
NH<br />
O c d<br />
a b O<br />
NH<br />
O<br />
OCH 3<br />
O<br />
<br />
<br />
OCH 3<br />
6<br />
4 O<br />
5<br />
HO 2<br />
3<br />
OCH<br />
1<br />
3<br />
O<br />
O<br />
H<br />
O<br />
1<br />
O<br />
O<br />
P<br />
O<br />
O- <br />
<br />
<br />
O<br />
1<br />
O<br />
6<br />
10<br />
Dans un ballon de 50 mL sec, 340 mg (0,26 mmol ; 1 éq.) du composé 8, préalablement<br />
lyophilisés, sont dissous dans 20 mL de DMF anhydre sous agitation et sous atmosphère<br />
inerte. 26 mg (0,26 mmol ; 1 éq.) d’anhydride succinique en solution dans 5 mL de DMF<br />
anhydre sont alors additionnés. Le milieu réactionnel est maintenu sous agitation et sous<br />
atmosphère inerte pendant 18 h à température ambiante. La réaction est ensuite traitée par<br />
ajout de 48 µL (0,31 mmol ; 1,2 éq.) de diisopropylcarbodiimide (DIC), puis de 36 mg<br />
(0,31 mmol ; 1,2 éq.) de N-hydroxysuccinimide (NHS) dissous dans 5 mL de DMF anhydre,<br />
et laissée 2 h sous agitation et sous atmosphère inerte à température ambiante. Cette solution<br />
est alors versée dans un tricol de 250 mL surmonté d’un réfrigérant et d’un piège à CaCl2,<br />
dans lequel 197 mg (0,31 mmol ; 1,2 éq.) de DMPE sont préalablement mis en solution dans<br />
120 mL de chloroforme anhydre (fraîchement distillé sur P2O5), en présence de 48 µL<br />
(0,34 mmol ; 1,3 éq.) de triéthylamine, le tout placé dans un bain marie à 35 °C sous agitation<br />
et sous atmosphère inerte. Le milieu réactionnel maintenu 24 h à 35°C, sous agitation, et dans<br />
des conditions anhydres. La réaction est enfin stoppée par ajout de 100 µL d’eau et les<br />
solvants sont évaporés à sec sous vide primaire (40°C). Le solide résiduel est repris dans du<br />
chloroforme et la diisopropylurée filtrée. Le filtrat est concentré à l’évaporateur rotatif (35°C)<br />
et purifié grâce à une colonne chromatographique sur gel de silice (élution avec<br />
198<br />
14<br />
14
CHCl3/CH3OH 95/5 puis 90/10 (v/v)). On isole ainsi 304 mg du composé 10 sous forme<br />
d’une poudre blanche après lyophilisation.<br />
Composé 10 :<br />
Formule brute : C92H164N2O44P, M = 2033,27 g.mol -1<br />
Rendement : 304 mg (0,15 mmol, 58 %)<br />
CCM : Rf 10 = 0,3 (CHCl3 / MeOH 8 / 2 (v/v))<br />
p.f. 160°C (déc.)<br />
[]D 20 + 76 ° (c 0,26, CHCl3)<br />
IR : 1738 cm -1 (C=O esters) ; 1651 cm -1 (C=O amides)<br />
ES-HRMS (haute résolution avec détection en mode négatif) : m/z mesuré à 2032,0479 [M] - ,<br />
calculé à 2032,0395 pour C92H164N2O44P (déviation : 4,1 ppm)<br />
RMN 1 H (CDCl3, 500,13 MHz) (ppm) 7,50 (1H, NHDMPE) ; 6,71 (1H, NHCD) ; 5,19 (m,<br />
1H, H-) ; 4,92 – 5,08 (m, H-1 I-VII CD) ; 4,38 (dd, 1H, H-) ; 4,13 (dd, 1H, H-’) ; 3,92 (H-) ;<br />
3,88 – 3,96 (m, H-3 I-VII CD) ; 3,64 (m, OCH3-6CD ) ; 3,55 – 3,77 (m, H-5 I-VII CD / H-6 I-VII CD / H-<br />
6’ I-VII CD) ; 3,4 – 3,5 (m, H-4 I-VII CD) ; 3,40 (m, OCH3-2CD) ; 3,23 – 3,32 (H-2 I-VII CD) ; 2,5 – 2,6<br />
(ml, H-b / H-c) ; 2,28 (dt, 4H, H-2 /H-2) ; 1,57 (ml, 4H, H-3 /H-3) ; 1,25 (ml, 40H, H-<br />
4 à H-13 / H-4 à H-13) ; 0,88 (t, 6H, H-14 / H-14)<br />
RMN 13 C (CDCl3, 125,77 MHz) (ppm) 173,4, 173,1 (2s, C-d, C-a) ; 172,5 (2s, CO-1,<br />
CO-1) ; 100,6 – 101,6 (C-1 I-VII CD) ; 82,6 – 84,2 (C-4 I-VII CD ) ; 81,4 – 82,6 (C-2 I-VII CD) ; 72,6 –<br />
73,4 (C-3 I-VII CD) ; 70,5 – 71,2 (C-6 II-VII CD) ; 70,0 – 70,5 (C-5 I-VII CD) ; 60,1 – 60,5 (OCH3-6CD) ;<br />
58,8 – 59,4 (OCH3-2CD) ; 34,1, 34,2 (2s, C-2, C-2) ; 31,9 (C-12 / C-12) ; 29,1 – 29,7 (C-<br />
4 à C11 / C-4 à C-11) ; 24,9 (2s, C-3 / C-3) ; 22,7 (C-13 / C-13) ; 14,1 (C-14 / C-<br />
14)<br />
199
6 I -azido-6 I -désoxy-2 I ,3 I -di-O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,3 II-VII ,6 II-VII -tri-O-méthyl)<br />
cyclomaltoheptaose (11)<br />
H 3CO<br />
N 3<br />
O<br />
OCH3 O 4<br />
6<br />
5<br />
O<br />
H3CO 3<br />
2<br />
OCH<br />
1<br />
3<br />
O<br />
11<br />
Dans un bicol de 500 mL sec, 6,2 g (0,26 mol ; ~ 100 éq.) d’hydrure de sodium (enrobé sous<br />
huile à 60 % m/m, soit 10 g d’enrobé) sont introduits. Le produit est placé sous atmosphère<br />
inerte, lavé avec de l’hexane anhydre (2 50 mL) pour éliminer l’enrobage puis séché sous<br />
un courant d’azote. L’hydrure de sodium est alors mis en suspension dans 130 mL de DMF<br />
anhydre sous agitation. 3,01 g (2,60 mmol ; 1 éq.) du composé 3, préalablement séchés à<br />
l’étuve à vide, sont dissous dans 200 mL de DMF anhydre sous agitation et sous atmosphère<br />
inerte, puis ajoutés au milieu réactionnel. Le mélange est refroidi à 0°C dans un bain de glace<br />
puis 30 mL (0,48 mol ; ~ 185 éq.) d’iodure de méthyle sont additionnés. La réaction est<br />
maintenue sous agitation pendant 24 h à température ambiante. Le milieu réactionnel est<br />
ensuite filtré et le filtrat est concentré à l’évaporateur rotatif (40°C). Le résidu huileux est<br />
repris dans un minimum d’eau puis extrait au chloroforme (4 40 mL). La phase organique<br />
est lavée à l’eau (2 50 mL), séchée sur sulfate de sodium, filtrée, et concentrée à<br />
l’évaporateur rotatif (40°C). Le résidu huileux est repris dans un minimum d’eau, les<br />
insolubles sont filtrés et la solution est lyophilisée. On isole 3,38 g d’une poudre blanche,<br />
correspondant au composé 11, et à de la per(2,3,6-tri-O-méthyl)cyclomaltoheptaose<br />
(TRIMEB), formée à partir de la -CD régénérée lors de la synthèse du composé 3. Ce<br />
200<br />
OCH 3<br />
mélange sera purifié lors de l’étape suivante (synthèse du composé 12).<br />
composé 11 :<br />
Formule brute : C62H109N3O34, M = 1440,55 g.mol -1<br />
Rendement : 3,38 g (2,35 mmol ; 90 %)<br />
CCM : Rf 11 = 0,9 (CHCl3 / MeOH 9 / 1 (v/v) ; Rf 3 = 0)<br />
p.f. 160°C (déc.)<br />
6
IR : 2096 cm -1 (N3)<br />
ES-MS + : m/z mesuré à 1462,8 [M+Na] + , calculé à 1462,7 pour C62H109N3O34Na<br />
RMN 1 H (CDCl3, 500,13 MHz) (ppm) 5,31 – 5,36 (H-1CD) ; 3,88 – 3,96 (H-5CD / H-6CD) ;<br />
3,69 – 3,84 (H-4CD / H-6’CD / H-3CD) ; 3,65 (OCH3-6CD) ; 3,56 (OCH3-3CD) ; 3,43 (OCH3-<br />
2CD) ; 3,38 – 3,42 (H-2CD)<br />
6 I -amino-6 I -désoxy-2 I ,3 I -di-O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,3 II-VII ,6 II-VII -tri-O-méthyl)<br />
cyclomaltoheptaose (12)<br />
H 3CO<br />
NH2<br />
O<br />
OCH3 O 4<br />
6<br />
5<br />
O<br />
H3CO 3<br />
2<br />
OCH<br />
1<br />
3<br />
O<br />
12<br />
Dans un ballon de 500 mL, 3,37 g (2,34 mmol ; 1 éq.) du composé 11 sont dissous dans<br />
180 mL de DMF sous agitation. Une solution de 2,46 g (9,38 mmol ; 4 éq.) de<br />
triphénylphosphine (fraîchement recristallisée dans l’éthanol bouillant) dissous dans 10 mL de<br />
DMF est ajoutée. Après 2 h sous agitation à température ambiante, le milieu réactionnel est<br />
refroidi à 0°C dans un bain de glace et 88,5 mL d’ammoniaque (solution à 20 % v/v) sont<br />
lentement additionnés. La réaction est maintenue 18 h sous agitation à température ambiante.<br />
La solution est ensuite concentrée à l’évaporateur rotatif (40°C) et le résidu huileux est repris<br />
dans 140 mL d’eau. Le précipité blanc formé (mélange de triphénylphosphine et d’oxyde de<br />
triphénylphosphine) est filtré et lavé (2 20 mL d’eau). Le filtrat est concentré sous vide à<br />
40°C, puis repris dans un minimun d’eau et ajusté à pH = 4,5 par ajout de quelques gouttes<br />
d’HCl 1 N. Cette solution est passée sur une colonne de résine échangeuse d'ions<br />
(V = 160 cm 3 ), remplie de résine anionique LEWATIT 1080 (MERCK), préalablement<br />
régénérée par trois cycles de lavages successifs alternant ammoniaque 10 %, eau, et HCl<br />
0,1 M. La mono-amine 12 est fortement retenue sur la colonne, tandis que la TRIMEB<br />
présente est éluée avec de l'eau (5 volumes de colonne). Le produit 12 est à son tour élué avec<br />
une solution d'ammoniaque à 10 % (3 volumes de colonne). L’éluat basique est évaporé à sec<br />
201<br />
OCH 3<br />
6
sous vide (40°C) ; le résidu est repris dans un minimum d’eau puis lyophilisé. On isole ainsi<br />
1,85 g du composé 12, sous forme d’une poudre blanche.<br />
composé 12 :<br />
Formule brute : C62H111NO34, M = 1414.55 g.mol -1<br />
Rendement estimé : 1,85 g (1,31 mmol ; 86 %)<br />
CCM : Rf 12 = 0,7 (CHCl3 / MeOH 8 / 2 (v/v) ; Rf 11 = 1)<br />
p.f. 160°C (déc.)<br />
IR : Absence de la bande (N3)<br />
ES-MS + : m/z mesuré à 1414,8 [M+H] + , calculé à 1414,7 pour C62H112NO34<br />
RMN 1 H (D2O, 500,13 MHz) (ppm) 5,36 (d, 1H, H-1 I CD, 3 J1 I -2 I = 3,6 Hz) ; 5,30 – 5,35 (m,<br />
6H, H-1 II-VII CD) ; 3,86 – 3,96 (m, H-5 II-VII CD) ; 3,87 – 3,92 (m, H-6 II-VII CD) ; 3,83 (H-5 I CD) ;<br />
3,75 – 3,83 (m, H-4 II-VII CD) ; 3,76 (H-3 I CD) ; 3,69 – 3,79 (m, H-3 II-VII CD) ; 3,71 (H-4 I CD) ; 3,65<br />
– 3,73 (m, H-6’ II-VII CD) ; 3,64 – 3,66 (m, OCH3-6CD) ; 3,55 – 3,57 (m, OCH3-3CD) ; 3,43 (H-<br />
2 I CD) ; 3,42 – 3,43 (m, OCH3-2CD) ; 3,36 – 3,44 (m, H-2 II-VII CD) ; 3,05 (dd, 1H, H-6 I CD, 3 J6 I -5 I =<br />
5,5 Hz, 3 J6 I -6’ I = 14,2 Hz) ; 2,96 (dd, 1H, H-6’ I CD, 3 J6’ I -5 I = 3,0 Hz, 3 J6’ I -6 I = 14,2 Hz)<br />
RMN 13 C (D2O, 125,77 MHz) (ppm) 97,1 – 97,8 (C-1 I-VII CD) ; 80,9 – 81,6 (C-3 I-VII CD) ;<br />
80,2 – 80,6 (C-2 I-VII CD) ; 76,7 – 78,6 (C-4 I-VII CD) ; 71,0 – 71,4 (C-6 II-VII CD) ; 70,7 – 71,7 (C-5 I-<br />
VII<br />
CD) ; 59,8 – 60,4 (OCH3-6CD) ; 58,3 – 59,0 (OCH3-3CD / OCH3-2CD) ; 41,6 (C-6 I CD)<br />
6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxy-2 I ,3 I -di-O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,3 II-VII ,6 II-VII -tri-O-méthyl)<br />
cyclomaltoheptaose (13)<br />
H 3CO<br />
OH<br />
O c d<br />
a b O<br />
NH<br />
O<br />
OCH3 O 4<br />
6<br />
5<br />
O<br />
H3CO 3<br />
2<br />
OCH<br />
1<br />
3<br />
O<br />
13<br />
202<br />
OCH 3<br />
6
Dans un ballon de 100 mL, 996,7 mg (0,70 mmol ; 1 éq.) du composé 12, préalablement<br />
lyophilisés, sont dissous dans 20 mL de DMF anhydre sous agitation et sous atmosphère<br />
inerte. 105,7 mg (1,06 mmol ; 1,5 éq.) d’anhydride succinique en solution dans 5 mL de DMF<br />
anhydre sont alors additionnés. Le milieu réactionnel est maintenu 18 h sous agitation, sous<br />
atmosphère inerte et à température ambiante. La réaction est stoppée par ajout de 100 µL<br />
d’eau. Le solvant est éliminé à l’évaporateur rotatif (40°C) puis le résidu est repris dans<br />
50 mL de chloroforme. Les insolubles (acide succinique) sont filtrés sur filtre Téflon (PTFE)<br />
0,22 µm et le chloroforme est évaporé à sec sous vide (40°C). Le résidu est repris dans un<br />
minimum d’eau et lyophilisé. On obtient 1,03 g du composé 13, sous forme d’une poudre<br />
blanche.<br />
Composé 13 :<br />
Formule brute: C66H115NO37, M = 1514,62 g.mol -1<br />
Rendement : 1,03 g (0,68 mmol, 96 %)<br />
CCM : Rf 13 = 0,6 (CH2Cl2 / MeOH 9 / 1 (v/v))<br />
p.f. 160°C (déc.)<br />
IR : 1733 cm -1 (C=O acide) ; 1676 cm -1 (C=O amide)<br />
ES-MS + : m/z mesuré à 1536,9 [M+Na] + , calculé à 1536,7 pour C66H115NO37Na<br />
RMN 1 H (CDCl3, 500,13 MHz) (ppm) 6,40 (t, 1H, NHCD, 3 JNH-6 I = 5,6 Hz) ; 5,24, 5,22,<br />
5,14, 5,11, 5,07, 5,07 (6d, H-1 II-VII CD, 3 J1-2 = 3,7 Hz) ; 5,08 (d, H-1 I CD, 3 J1 I -2 I = 3,7 Hz) ; 3,85 –<br />
3,95 (m, H-6 II-VII CD) ; 3,87 (H-5 I CD) ; 3,86, 3,73, 3,78, 3,87, 3,82, 3,79 (H-5 II-VII CD) ; 3,77 (H-<br />
6 I CD) ; 3,62 – 3,68 (m, OCH3-6CD) ; 3,63, 3,63, 3,63, 3,60, 3,62, 3,70 (H-4 II-VII CD) ; 3,55 – 3,65<br />
(H-6’ II-VII CD) ; 3,57 (H-3 I CD) ; 3,46, 3,57, 3,56, 3,50, 3,50, 3,44 (H-3 II-VII CD) ; 3,49 – 3,53 (m,<br />
OCH3-3CD) ; 3,38 – 3,42 (m, OCH3-2CD) ; 3,36 (H-4 I CD) ; 3,35 (H-6’ I CD) ; 3,20, 3,19, 3,18,<br />
3,18, 3,18, 3,18 (H-2 II-VII CD) ; 3,18 (H-2 I CD) ; 2,74, 2,65, 2,49 (4H, H-b / H-c, syst. AA’B)<br />
RMN 13 C (CDCl3, 125,77 MHz) (ppm) 174,5 (C-d) ; 172,7 (C-a) ; 98,7 – 99,9 (7s, C-1 I-<br />
VII<br />
CD) ; 82,0 – 82,9 (C-3 I-VII CD / C-2 I-VII CD) ; 79,6 – 81,4 (C-4 I-VII CD) ; 71,5 – 72,2 (C-6 II-VII CD) ;<br />
70,7 – 71,9 (C-5 I-VII CD) ; 61,7 – 62,3 (OCH3-6CD) ; 58,9 – 60,1 (OCH3-3CD / OCH3-2CD) ; 42,0<br />
(C-6 I CD) ; 31,5, 30,5 (C-b, C-c)<br />
203
6 I -(1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethalomamido)succinylamido-6 I -deoxy-<br />
2 I ,3 I -di-O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,3 II-VII ,6 II-VII -tri-O-méthyl)cyclomaltoheptaose<br />
(TRIMEB-Succ-DMPE) (14) :<br />
H 3CO<br />
NH<br />
O c d<br />
a b O<br />
NH<br />
O<br />
<br />
OCH3 6<br />
4 O<br />
O<br />
5<br />
H3CO 2<br />
3<br />
OCH<br />
1<br />
3<br />
O<br />
<br />
OCH 3<br />
O<br />
H<br />
O<br />
1<br />
O<br />
O<br />
P<br />
O<br />
O- <br />
<br />
<br />
O<br />
1<br />
6<br />
14<br />
Dans un ballon de 50 mL sec, 448,0 mg (0,30 mmol ; 1 éq.) du composé 13, préalablement<br />
lyophilisés, sont dissous dans 25 mL de DMF anhydre sous agitation et sous atmosphère<br />
inerte. 69 µL (0,45 mmol ; 1,5 éq.) de diisopropylcarbodiimide (DIC), puis 51,4 mg<br />
(0,45 mmol ; 1,5 éq.) de N-hydroxysuccinimide (NHS) dissous dans 5 mL de DMF anhydre<br />
sont successivement ajoutés. La réaction est laissée 2 h sous agitation et sous atmosphère<br />
inerte à température ambiante. Cette solution est alors versée dans un tricol de 250 mL<br />
surmonté d’un réfrigérant et d’un piège à CaCl2, dans lequel 226,3 mg (0,36 mmol ; 1,2 éq.)<br />
de DMPE sont préalablement mis en solution dans 120 mL de chloroforme anhydre<br />
(fraîchement distillé sur P2O5), en présence de 55 µL (0,40 mmol ; 1,3 éq.) de triéthylamine,<br />
le tout placé dans un bain marie à 35 °C sous agitation et sous atmosphère inerte. Le milieu<br />
réactionnel est maintenu 24 h à 35°C, sous agitation, et dans des conditions anhydres. La<br />
réaction est enfin stoppée par ajout de 100 µL d’eau et les solvants sont évaporés à sec sous<br />
vide primaire (40°C). Le solide résiduel est repris dans du chloroforme et la diisopropylurée<br />
filtrée. Le filtrat est concentré à l’évaporateur rotatif (35°C) et purifié grâce à une colonne<br />
chromatographique sur gel de silice (élution avec CHCl3/CH3OH 95/5 puis 90/10 puis 80/20<br />
(v/v)). On isole ainsi 452,5 mg du composé 14 sous forme d’une poudre blanche après<br />
lyophilisation.<br />
O<br />
204<br />
14<br />
14
Composé 14 :<br />
Formule brute : C99H178N2O44P, M = 2131.46 g.mol -1<br />
Rendement : 452,5 mg (0,21 mmol, 72 %)<br />
CCM : Rf 14 = 0,5 (CHCl3 / MeOH 8 / 2 (v/v))<br />
p.f. 160°C (déc.)<br />
[]D 24 + 89,4 ° (c 0,1, CHCl3)<br />
IR : 1738 cm -1 (C=O esters) ; 1662 cm -1 (C=O amides)<br />
ES-HRMS (haute résolution avec détection en mode négatif) : m/z mesuré à 2130,1614 [M] - ,<br />
calculé à 2130,1490 pour C99H178N2O44P (déviation : 5,8 ppm)<br />
RMN 1 H (CDCl3, 500,13 MHz) (ppm) 7,29 (1H, NHDMPE) ; 6,71 (1H, NHCD) ; 5,24 (m,<br />
1H, H-) ; 5,07 – 5,16 (m, H-1 I-VII CD, 3 J1-2 = 3,6 Hz) ; 4,36 (dd, 1H, H- 3 J- = 3,8 Hz, 3 J-’ =<br />
12,1 Hz) ; 4,17 (dd, 1H, H-’, 3 J’- = 6,3 Hz, 3 J’- = 12,1 Hz) ; 4,12 (H-) ; 4,10 (H-) ; 3,75 –<br />
3,90 (m, H-5 I-VII CD / H-6 I-VII CD) ; 3,5 – 3,7 (m, H-4 II-VII CD / H-6’ I-VII CD) ; 3,63 – 3,66 (m,<br />
OCH3-6CD) ; 3,45 – 3,57 (m, H-3 I-VII CD) ; 3,50 – 3,55 (m, OCH3-3CD) ; 3,50 (H-) ; 3,43 – 3,39<br />
(m, OCH3-2CD) ; 3,39 (1H, H-4 I CD) ; 3,17 – 3,22 (m, 7H, H-2 I-VII CD) ; 2.5 – 2.6 (m, H-b / H-<br />
c) ; 2,32 (dt, 4H, H-2H-2 3 J2-3 = 3 J2-3 = 7,7 Hz) ; 1,61 (ml, 4H, H-3/ H-3) ; 1,26<br />
(ml, 40H, H-4à H-13/ H-4 à H-13) ; 0,89 (t, 6H, H-14 / H-14 3 J13-14 = 3 J13-14 =<br />
6,9 Hz)<br />
RMN 13 C (CDCl3, 125,77 MHz) (ppm) 174.1 (C-d) ; 173,8 (CO-1, CO-1) ; 173.2 (C-<br />
a) ; 102,0 – 99,5 (7s, C-1 I-VII CD) ; 83,0 – 80,2 (C-3 I-VII CD / C-2 I-VII CD / C-4 I-VII CD) ; 73,9, 71,7 –<br />
70,6 (C-5 I-VII CD) ; 71,4 – 72,3 (C-6 II-VII CD) ; 70,5 (C-) ; 66,2 (C-) ; 64,9 (C-) ; 62,9 (C-) ;<br />
62,2 – 60,4 (OCH3-6CD) ; 59,0 – 59,7 (OCH3-3CD / OCH3-2CD) ; 40,9 (C-) ; 40,2 (C-6 I CD) ;<br />
34,7, 34,9 (2s, C-2, C-2) ; 32,6 (C-12 / C-12) ; 31,4, 31,0 (C-a, C-b) ; 30,4 – 29,8 (C-4<br />
à C-11 / C-4 à C-11) ; 25,5 (C-3 C-3) ; 23,4 (C-13 / C-13) ; 14,8 (C-14 C-14)<br />
205
Acide N-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-L-aspartique, Fmoc-L-Asp-OH (17) :<br />
2<br />
1<br />
3<br />
6<br />
4<br />
6'<br />
5<br />
1'<br />
2'<br />
7<br />
5'<br />
3'<br />
4'<br />
8<br />
O<br />
17<br />
Dans un ballon de 250 mL sec, 3,03 g (22,8 mmol ; 1,2 éq.) d’acide L-aspartique 15 sont<br />
dissous dans 54 mL (68,8 mmol ; 3,6 éq.) d’une solution aqueuse de carbonate de sodium à<br />
13,5 % (m/v). Le milieu est refroidit dans un bain de glace à 0°C, puis une solution de 6,41 g<br />
(19,0 mmol ;1 éq.) de N-(9-Fluorenylmethoxycarbonyloxy)succinimide (Fmoc-OSu) dissous<br />
dans 44 mL de DMF est additionnée sous forte agitation (un précipité se forme dans le milieu<br />
réactionnel). L’agitation est maintenue pendant 1 h à température ambiante. La mixture est<br />
alors diluée dans 665 mL d’eau, extraite à l’éther (1 80 mL) puis à l’acétate d’éthyle<br />
(2 60 mL). La phase aqueuse résultante est refroidie dans un bain de glace et acidifiée à<br />
pH = 2 avec de l’acide chlorhydrique concentré (HCl 6 N). La phase aqueuse contenant le<br />
produit précipité (sous forme d’huile) est extraite à l’acétate d’éthyle (6 60 mL). La phase<br />
organique issue de l’extraction est lavée avec une solution aqueuse saturée en chlorure de<br />
sodium (3 35 mL), puis à l’eau (2 35 mL), séchée sur sulfate de sodium et concentrée à<br />
l’évaporateur rotatif (35°C) jusqu’à l’obtention d’un petit volume résiduel. Le composé 17 est<br />
recristallisé par ajout d’éther de pétrole (environ 10 fois le volume résiduel) sous forte<br />
agitation. Après avoir laissé décanter 2 h à 4°C, le précipité est filtré puis séché 24 h à l’étuve<br />
à vide. On isole 6,22 g du composé 17 sous forme d’une fine poudre blanche.<br />
Composé 17 :<br />
Formule brute : C19H17NO6, M = 355,35 g.mol -1<br />
Rendement : 6,22 g (17,5 mmol ; 92 %)<br />
CCM : Rf 17 = 0,8 (AcOH 60 % / BuOH 4 / 6 (v/v) ; Rf 15 = 0,2)<br />
p.f. 181 °C<br />
ESI-MS + : m/z mesuré à 378,1 [M+Na] + , calculé à 378,1 pour C19H17NO6Na<br />
O<br />
9<br />
206<br />
HN<br />
H<br />
<br />
<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
O
RMN 1 H (dmso-d6, 500,13 MHz) (ppm) 12,60 (sl, 2H, COOH) ; 7,89 (d, 2H, H-4 / H-4’,<br />
3 J4-3 = 3 J4’-3’ = 7,5 Hz) ; 7,72 (d, 1H, NH) ; 7,70 (d, 2H, H-1 / H-1’, 3 J1-2 = 3 J1’-2’ = 7,5 Hz) ;<br />
7,42 (t, 2H, H-3 / H-3’, 3 J3-2 = 3 J3-4 = 3 J3’-2’ = 3 J3’-4’ = 7,5 Hz) ; 7,33 (t, 2H, H-2 / H-2’, 3 J2-1 =<br />
3 J2-3 = 3 J2’-1’ = 3 J2’-3’ = 7,5 Hz) ; 4,34 (m, 1H, H-) ; 4,29 (d, 2H, H-8) ; 4,22 (t, 1H, H-7) ; 2,73<br />
(dd, 1H, H- 3 J = 5,5 Hz, 3 J-’ = 16,4 Hz) ; 2,58 (dd, 1H, H-’, 3 J’ = 8,3 Hz, 3 J-’ = 16,4<br />
Hz)<br />
RMN 13 C (dmso-d6, 125,77 MHz) (ppm) 172,8, 171,8 (CH-COOH, CH2-COOH) ; 155,9<br />
(C-9) ; 143,9 (C-5 / C-5’) ; 140,8 (C-6 / C-6’) ; 127,7 (C-3 / C-3’) ; 127,2 (C-2 / C-2’) ; 125,4<br />
(C-1 / C-1’) ; 120,2 (C-4 / C-4’) ; 65,8 (C-8) ; 50,6 (C-) ; 46,7 (C-7) ; 36,1 (C-)<br />
Acide N-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-L-glutamique, Fmoc-L-Glu-OH (18) :<br />
2<br />
1<br />
3<br />
6<br />
4<br />
6'<br />
5<br />
1'<br />
2'<br />
Même protocole expérimental que pour la synthèse du composé 17.<br />
Bilan molaire :<br />
Acide L-glutamique 16 : 3,40 g (23,1 mmol ; 1,2 éq.)<br />
Na2CO3 aq. 13,5 % (m/v) : 54,5 mL (69,3 mmol ; 3,6 éq.)<br />
Fmoc-OSu : 6,50 g (19,3 mmol ; 1 éq.)<br />
composé 18 :<br />
Formule brute : C20H19NO6, M = 369,37 g.mol -1<br />
Rendement : 6,07 g (16,4 mmol ; 85 %)<br />
CCM : Rf 18 = 0,9 (AcOH 60 % / BuOH 4 / 6 (v/v) ; Rf 16 = 0,2)<br />
7<br />
5'<br />
3'<br />
4'<br />
8<br />
O<br />
18<br />
O<br />
9<br />
HN<br />
207<br />
H<br />
<br />
<br />
O<br />
O<br />
<br />
OH<br />
OH
p.f. 197 °C<br />
ESI-MS + : m/z mesuré à 392,2 [M+Na] + , calculé à 392,1 pour C20H19NO6Na ; m/z mesuré à<br />
408,2 [M+K] + , calculé à 408,1 pour C20H19NO6K<br />
RMN 1 H (dmso-d6, 500,13 MHz) (ppm) 12,42 (sl, 2H, COOH) ; 7,89 (d, 2H, H-4 / H-4’,<br />
3 J4-3 = 3 J4’-3’ = 7,5 Hz) ; 7,72 (d, 2H, H-1 / H-1’, 3 J1-2 = 3 J1’-2’ = 7,5 Hz) ; 7,67 (d, 1H, NH,<br />
3 J-H= 8,2 Hz) ; 7,42 (t, 2H, H-3 / H-3’, 3 J3-2 = 3 J3-4 = 3 J3’-2’ = 3 J3’-4’ = 7,5 Hz) ; 7,33 (t, 2H,<br />
H-2 / H-2’, 3 J2-1 = 3 J2-3 = 3 J2’-1’ = 3 J2’-3’ = 7,5 Hz) ; 4,28 (d, 2H, H-8) ; 4,23 (t, 1H, H-7) ; 4,00<br />
(ddd, 1H, H- 3 J- = 5,0 Hz , 3 J-’ = 1,6 Hz, 3 J-NH = 8,2 Hz) ; 2,32 (m, 1H, ) ; 1,99 (m,<br />
1H, H-) ; 1,79 (m, 1H, H-’)<br />
N’,N’’-Didodecyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-L-aspartamide,<br />
Fmoc-L-Asp(NHC12H25)-(NHC12H25) (19) :<br />
2<br />
1<br />
3<br />
6<br />
4<br />
6'<br />
5<br />
1'<br />
2'<br />
7<br />
5'<br />
3'<br />
4'<br />
8<br />
O<br />
O<br />
9<br />
H<br />
HN<br />
<br />
<br />
O<br />
N'H<br />
O<br />
N''H<br />
1<br />
1<br />
19<br />
Dans un ballon de 500 mL sec, 5,03 g (14,2 mmol ; 1 éq.) du composé 17 sont dissous dans<br />
30 mL de DMF anhydre sous agitation et sous atmosphère inerte. 6,6 mL (42,5 mmol ; 3 éq.)<br />
de N,N’-diisopropylcarbodiimide (DIC) puis 5,74 g (42,5 mmol ; 3 éq.)<br />
d’hydroxybenzotriazole (HOBT), en solution dans 20 mL de DMF anhydre, sont<br />
successivement additionnés. Le réaction est alors maintenue 2 h sous agitation et sous<br />
atmosphère inerte à température ambiante. 7,91 g (42,7 mmol ; 3 éq.) de dodécylamine, en<br />
solution dans 100 mL de chloroforme anhydre (fraîchement distillé sur P2O5), sont enfin<br />
ajoutés au milieu réactionnel et le tout est laissé 24 h sous agitation et sous atmosphère inerte<br />
à température ambiante (un précipité abondant se forme rapidement). La mixture est ensuite<br />
concentrée à l’évaporateur rotatif (40°C) et reprise dans du DMF. Le solide pâteux est filtré et<br />
lavé, d’abord avec du DMF, puis à l’éther. Après une nuit de séchage à l’étuve à vide, on isole<br />
6,95 g du composé 19, sous forme d’une poudre blanche fine.<br />
208<br />
12<br />
12
composé 19 :<br />
Formule brute : C43H67N3O4, M = 690,02 g.mol -1<br />
Rendement : 6,95 g (10,1 mmol ; 71 %)<br />
CCM : Rf 19 = 0,9 (CHCl3 / MeOH 9 / 1 (v/v) ; Rf 17 = 0)<br />
p.f. 174 °C<br />
RMN 1 H (CDCl3, 500,13 MHz) (ppm) 7,78 (d, 2H, H-4 / H-4’, 3 J4-3 = 3 J4’-3’ = 7,5 Hz) ;<br />
7,61 (d, 2H, H-1 / H-1’, 3 J1-2 = 3 J1’-2’ = 7,5 Hz) ; 7,41 (tt, 2H, H-3 / H-3’, 3 J3-2 = 3 J3-4 = 3 J3’-2’ =<br />
3<br />
J3’-4’ = 7,5 Hz) ; 7,32 (tt, 2H, H-2 / H-2’, 3 J2-1 = 3 J2-3 = 3 J2’-1’ = 3 J2’-3’ = 7,5 Hz) ; 7,00 (tl, 1H,<br />
N’H) ; 6,55 (d, 1H, NH) ; 5,85 (tl, 1H, N’’H) ; 4,48 (ml, 1H, H-) ; 4,42 (d, 2H, H-8, 3 J8-7 =<br />
7,2 Hz) ; 4,23 (t, 1H, H-7, 3 J7-8 = 7,2 Hz) ; 3,23 (m, 4H, H-1/ H-1) ; 2,87 (d, 1H, H- 3 J-’<br />
= 14,8 Hz) ; 2,52 (dd, 1H, H-’, 3 J’- = 6,8 Hz , 3 J-’ = 14,8 Hz) ; 1,49 (m, 4H, H-2/ H-2) ;<br />
1,25 – 1,32 (m, H-3 à H-11/ H-3 à H-11) ; 0,89 (t, 6H, H-12/ H-12)<br />
RMN 13 C (CDCl3, 125,77 MHz) (ppm) 170,9, 170,3 (-CO-N’H, -CO-N’’H) ; 156,1 (C-9) ;<br />
143,6 (C-5 / C-5’) ; 141,2 (C-6 / C-6’) ; 127,6 (C-3 / C-3’) ; 127,0 (C-2 / C-2’) ; 125,0 (C-1 /<br />
C-1’) ; 119,9 (C-4 / C-4’) ; 67,1 (C-8) ; 51,6 (C-) ; 47,0 (C-7) ; 39,6 (C-1/ C-1) ; 37,9 (C-<br />
) ; 31,8 (C-10/ C-10) ; 29,1 – 29,6 (C-2, C-4 à C-9/ C-2, C-4 à C-9) ; 26,8 (C-<br />
3/ C-3) ; 22,6 (C-11/ C-11) ; 14,0 (C-12/ C-12)<br />
N’,N’’-Didodecyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-L-glutamide, ,<br />
Fmoc-L-Glu(NHC12H25)-(NHC12H25) (20) :<br />
2<br />
1<br />
3<br />
6<br />
4<br />
6'<br />
1'<br />
5<br />
2'<br />
7<br />
5'<br />
3'<br />
4'<br />
8<br />
O<br />
O<br />
9<br />
H<br />
HN<br />
<br />
Même protocole expérimental que pour la synthèse du composé 19.<br />
<br />
O<br />
O<br />
<br />
N'H<br />
1<br />
N''H<br />
20<br />
1<br />
209<br />
12<br />
12
Bilan molaire :<br />
Fmoc-L-Glu-OH 18 : 5,89 g (16,0 mmol ; 1 éq.)<br />
DIC : 7,4 mL (47,8 mmol ; 3 éq.)<br />
HOBT : 6,47 g (47,9 mmol ; 3 éq.)<br />
Dodécylamine : 8,87 g (47,9 mmol ; 3 éq.)<br />
Composé 20 :<br />
Formule brute : C44H69N3O4, M = 704,05 g.mol -1<br />
Rendement : 9,29 g (13,2 mmol ; 83 %)<br />
CCM : Rf 20 = 0,9 (CHCl3 / MeOH 9 / 1 (v/v) ; Rf 18 = 0)<br />
p.f. 165 °C<br />
RMN 1 H (CDCl3, 500,13 MHz) (ppm) 7,77 (d, 2H, H-4 / H-4’, 3 J4-3 = 3 J4’-3’ = 7,5 Hz) ;<br />
7,61 (d, 2H, H-1 / H-1’, 3 J1-2 = 3 J1’-2’ = 7,5 Hz) ; 7,41 (t, 2H, H-3 / H-3’, 3 J3-2 = 3 J3-4 = 3 J3’-2’ =<br />
3<br />
J3’-4’ = 7,5 Hz) ; 7,32 (t, 2H, H-2 / H-2’, 3 J2-1 = 3 J2-3 = 3 J2’-1’ = 3 J2’-3’ = 7,5 Hz) ; 6,69 (tl, 1H,<br />
N’H) ; 6,24 (dl, 1H, NH, 3 J-H = 6,8 Hz) ; 5,81 (tl, 1H, N’’H) ; 4,37 (d, 2H, H-8, 3 J8-7 =<br />
7,2 Hz) ; 4,22 (t, 1H, H-7, 3 J7-8 = 7,2 Hz) ; 4,17 (m, 1H, H-) ; 3,26 (q, 4H, H-1/ H-1) ;<br />
2,40 (m, 1H, H-) ;2,31 (m, 1H, H-’) ;2,11 (m, 1H, H-) ; 2,00 (m, 1H, H-’) ; 1,51 (m, 4H,<br />
H-2/ H-2) ; 1,23 – 1,33 (m, H-3 à H-11/ H-3 à H-11) ; 0,89 (t, 6H, H-12/ H-12)<br />
N’,N’’-Didodecyl-L-aspartamide, H-L-Asp(NHC12H25)-(NHC12H25) (21) :<br />
H 2N<br />
H<br />
<br />
<br />
O<br />
N'H<br />
O<br />
N''H<br />
1<br />
1<br />
21<br />
210<br />
12<br />
12
Dans un ballon de 100 mL, 2,09 g (3,03 mmol ; 1 éq.) du composé 19 sont mis en solution<br />
dans 40 mL d’une solution à 20 % (v/v) de pipéridine dans le chloroforme. La solution est<br />
chauffée quelques minutes à 40°C. Le milieu réactionnel, d’abord hétérogène à cause de la<br />
faible solubilité du produit de départ dans le chloroforme, devient rapidement limpide. La<br />
solution est ensuite évaporée à sec, sous vide primaire (40°C), pour éliminer le maximum de<br />
pipéridine (bp 101-106°C). Le résidu solide est repris dans 10 mL de chloroforme pour être<br />
ensuite précipité dans 200 mL d’hexane sous agitation. Après avoir laissé décanter 2 h à 4°C,<br />
le précipité est filtré puis séché. Une ultime étape de recristallisation dans le méthanol<br />
(dissolution dans un minimum de méthanol bouillant, filtration des insolubles à chaud et<br />
recristallisation à 4°C) permet d’isoler par filtration, et après une nuit de séchage à l’étuve à<br />
vide, 1,20 g du composé 21 sous forme d’une poudre blanche pulvérulente.<br />
Composé 21 :<br />
Formule brute : C28H57N3O2, M = 467,78 g.mol -1<br />
Rendement : 1,20 g (2,57 mmol ; 85 %)<br />
CCM : Rf 21 = 0,4 (CHCl3 / MeOH 9 / 1 (v/v) ; Rf 19 = 0,9)<br />
p.f. 121 °C<br />
[]D 20 + 5 ° (c 0,27, CHCl3)<br />
IR : 3311 cm -1 (large) (NH2) ; 1630 cm -1 (C=O amides)<br />
ESI-MS + : m/z mesuré à 468,5 [M+H] + , calculé à 468,5 pour C28H58N3O2 ; m/z mesuré à<br />
490,5 [M+Na] + , calculé à 490,4 pour C28H57N3O2Na.<br />
RMN 1 H (CDCl3, 500,13 MHz) (ppm) 7,51 (t, 1H, N’H, 3 JN’H-1 = 5,7 Hz) ; 6,26 (t, 1H,<br />
N’’H, 3 JN’’H-1 = 5,5 Hz) ; 3,65 (dd, 1H, H- 3 J = 4,5 Hz, 3 J-’ = 7,1 Hz) ; 3,21 (m, 4H, H-<br />
1/ H-1) ; 2,61 (dd, 1H, H- 3 J = 4,5 Hz, 3 J-’ = 14,4 Hz) ; 2,54 (dd, 1H, H-’, 3 J’ =<br />
7,1 Hz, 3 J’- = 14,4 Hz) ; 1,48 (m, 4H, H-2/ H-2) ; 1,25 – 1,32 (m, H-3 à H-11/ H-<br />
3 à H-11) ; 0,88 (t, 6H, H-12/ H-12)<br />
RMN 13 C (CDCl3, 125,77 MHz) (ppm) 173,7 (-CO-N’H) ; 170,8 (-CO-N’’H) ; 52,7 (C-<br />
) ; 40,9 (C-) ; 39,4, 39,2 (C-1C-1) ; 31,8 (C-10/ C-10) ; 29,1 – 29,6 (C-2, C-<br />
4 à C-9/ C-2, C-4 à C-9) ; 26,8 (C-3/ C-3) ; 22,6 (C-11/ C-11) ; 14,0 (C-12/<br />
C-12)<br />
211
N’,N’’-Didodecyl-L-glutamide, H-L-Glu(NHC12H25)-(NHC12H25) (22) :<br />
H 2N<br />
H<br />
<br />
<br />
O<br />
O<br />
<br />
N'H<br />
1<br />
N''H<br />
Même protocole expérimental que pour la synthèse du composé 21.<br />
Bilan molaire :<br />
Fmoc-L-Glu(NHC12H25)-(NHC12H25) 20 : 9,29 g (13,2 mmol ; 1 éq.)<br />
composé 22 :<br />
1<br />
22<br />
Formule brute : C29H59N3O2, M = 481,81 g.mol -1<br />
Rendement : 5,01 g (10,4 mmol ; 79 %)<br />
CCM : Rf 22 = 0,4 (CHCl3 / MeOH 9 / 1 (v/v) ; Rf 20 = 0,9)<br />
p.f. 118 °C<br />
[]D 20 + 45 ° (c 0,25, CHCl3)<br />
IR : 3324 cm -1 (NH2) ; 1633 cm -1 (C=O amides)<br />
ESI-MS + : m/z mesuré à 504,6 [M+Na] + , calculé à 504,5 pour C29H59N3O2Na<br />
RMN 1 H (CDCl3, 500,13 MHz) (ppm) 7,37 (tl, 1H, N’H) ; 6,27 (tl, 1H, N’’H) ; 3,40 (t,<br />
1H, H- 3 J = 6,8 Hz) ; 3,21 (m, 4H, H-1/ H-1) ; 2,30 (m, 2H, H-) ; 1,93 (m, 2H, H-) ;<br />
1,48 (m, 4H, H-2/ H-2) ; 1,22 – 1,33 (m, H-3 à H-11/ H-3 à H-11) ; 0,87 (t, 6H, H-<br />
12/ H-12 3 J11 = 3 J11 = 7,0 Hz)<br />
RMN 13 C (CDCl3, 125,77 MHz) (ppm) 174,6 (-CO-N’H) ; 172,5 (-CO-N’’H) ; 54,1 (C-<br />
) ; 39,5, 38,9 (C-1C-1) ; 33,1 (C-) ; 31,8 (C-10/ C-10) ; 31,6 (C-) ; 29,1 – 29,6 (C-<br />
2, C-4 à C-9/ C-2, C-4 à C-9) ; 26,8 (C-3/ C-3) ; 22,5 (C-11/ C-11) ; 14,0 (C-<br />
12/ C-12)<br />
212<br />
12<br />
12
N’,N’’-Didodecyl-N-(6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxycyclomaltoheptaose)-L-aspartamide,<br />
-CD-Succ-L-Asp(NHC12H25)-NHC12H25 (23) :<br />
HO<br />
NH<br />
NH<br />
O c d<br />
a b O<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
HO<br />
O<br />
1<br />
H N'H<br />
12<br />
4<br />
<br />
<br />
OH<br />
O<br />
N''H<br />
6<br />
O<br />
5<br />
2<br />
3 1<br />
OH<br />
O<br />
23<br />
Dans un ballon de 100 mL sec, 407,7 mg (0,33 mmol ; 1 éq.) du composé 5, préalablement<br />
lyophilisés, sont dissous dans 10 mL de DMF anhydre sous agitation et sous atmosphère<br />
inerte. 205 µL (1,32 mmol ; 4 éq.) de DIC puis 179,3 mg (1,33 mmol ; 4 éq.) de HOBT, en<br />
solution dans 5 mL de DMF anhydre, sont successivement additionnés. Le réaction est alors<br />
maintenue 2 h sous agitation et sous atmosphère inerte à température ambiante. 185,3 mg<br />
(0,40 mmol ; 1,2 éq.) du composé 21, dissous dans 15 mL de chloroforme anhydre<br />
(fraîchement distillé sur P2O5), sont enfin ajoutés au milieu réactionnel. Après 24 h<br />
d’agitation à température ambiante et sous atmosphère inerte, la réaction est stoppée par ajout<br />
de 100 µL d’eau. La solution est concentrée à l’évaporateur rotatif (40°C) jusqu’à obtenir un<br />
résidu huileux, qui est ensuite précipité dans 100 mL d’acétone sous agitation. Le précipité est<br />
récupéré par centrifugation (10000 tours/min ; 15 min), lavé avec de l’acétone propre et séché<br />
une nuit sous hotte. 486,8 mg de produit brut sont ainsi isolés et sont purifiés sur CLHP à<br />
polarité de phase normale (µPorasil ; A/B 20/80 (v/v) avec A : CH3OH et<br />
B : CHCl3/CH3OH/NH3 20 % (80/19,5/0,5) (v/v/v) en 20 min.). On isole 465,9 mg du<br />
composé 23 sous forme d’une fine poudre blanche après lyophilisation.<br />
composé 23 :<br />
Formule brute : C74H130N4O38, M = 1683,85 g.mol -1<br />
Rendement : 465,9 g (0,28 mmol ; 85 %)<br />
CCM : Rf 23 = 0,2 (CHCl3 / MeOH / H2O 6 / 3 / 0,5 (v/v/v))<br />
1<br />
6<br />
213<br />
12
p.f. 160°C (déc.)<br />
[]D 20 + 83 ° (c 0,26, DMF)<br />
IR : 3000-3500 cm -1 (large) (OH) ; 1647 cm -1 (C=O amides)<br />
ESI-HRMS (haute résolution avec détection en mode positif) : m/z mesuré à 1683,8441<br />
[M+H] + , calculé à 1683,8441 pour C74H131N4O38 (déviation : 0 ppm) ; m/z mesuré à<br />
1705,8169 [M+Na] + , calculé à 1705,8261 pour C74H130N4O38Na (déviation : 5,4 ppm)<br />
RMN 1 H (pyridine-d5, 500,13 MHz) (ppm) : 9,14 (d, 1H, NH) ; 8,80 (t, 1H, NHCD) ; 8,68<br />
(t, 1H, N’’H) ; 8,51 (t, 1H, N’H ) ; 5,38 (m, 1H, H-) ; 5,42 – 5,61 (m, 6H, H-1 II-VII CD) ; 5,43<br />
(d, 1H, H-1 I CD) ; 4,62 – 4,75 (m, H-3 II-VII CD) ; 4,62 (H-3 I CD) ; 4,55 – 4,64 (m, H-6 II-VII CD) ;<br />
4,31 – 4,52 (m, H-5 II-VII CD / H-6’ II-VII CD) ; 4,42 (H-5 I CD) ; 4,15 – 4,29 (m, H-4 II-VII CD) ; 4,19<br />
(H-6 I CD) ; 4,06 (H-6’ I CD) ; 3,99 – 4,14 (m, H-2 II-VII CD) ; 3,91 (dd, 1H, H-2 I CD) ; 3,81 (t, 1H, H-<br />
4 I CD) ; 3,36, 3,31 (2m, 4H, H-1, H-1) ; 3,12 (d, 1H, H-) ; 3,07 (d, 1H, H-’) ; 2,5 – 3,0 (m,<br />
4H, H-b / H-c) ; 1,53, 1,46 (2m, 4H, H-2, H-2) ; 1,20, 1,18 (H-3, H-3) ; 1,13 (H-11/<br />
H-11) ; 1,05 – 1,25 (m, H-4 à H-10/ H-4 à H-10) ; 0,75 (t, 6H, H-12/ H-12)<br />
RMN 13 C (pyridine-d5, 125,77 MHz) (ppm) 173,6 (C-a) ; 173,4 (C-d) ; 172,3 (-CO-N’H) ;<br />
171,5 (-CO-N’’H-) ; 104,1 – 104,6 (C-1 I-VII CD) ; 85,8 (C-4 I CD) ; 83,7 – 84,3 (C-4 II-VII CD) ; 74,1<br />
– 75,4 (C-3 I-VII CD / C-5 II-VII CD / C-2 I-VII CD) ; 72,3 (C-5 I CD) ; 61,9 – 62,6 (C-6 II-VII CD) ; 52,0 (C-<br />
) ; 41,6 (C-6 I CD) ; 40,3, 40,5 (C-1, C-1) ; 39,1 (C-) ; 32,6 (C-10/ C-10) ; 32,1, 32,4<br />
(C-b, C-c) ; 30,5 (C-2/ C-2) ; 30,1 (C-4/ C-4) ; 30,1 – 30,6 (C-5 à C-9/ C-5 à C-<br />
9) ; 27,8, 27,9 (C-3, C-3) ; 23,4 (C-11 / C-11) ; 14,8 (C-12/ C-12)<br />
214
N’,N’’-Didodecyl-N-(6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxycyclomaltoheptaose)-L-glutamide,<br />
-CD-Succ-L-Glu(NHC12H25)-NHC12H25 (24) :<br />
HO<br />
NH<br />
NH<br />
O c d<br />
a b O<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
HO<br />
H<br />
4<br />
O<br />
<br />
<br />
N'H<br />
O<br />
1<br />
N''H<br />
6<br />
O<br />
5<br />
2<br />
3 1<br />
OH<br />
O<br />
Même protocole expérimental que pour la synthèse du composé 23.<br />
Bilan molaire :<br />
OH<br />
6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxy-cyclomaltoheptaose 5 : 1,04 g (0,84 mmol ; 1 éq.)<br />
DIC : 525 µL (3,39 mmol ; 4 éq.)<br />
HOBT : 456,5 mg (3,38 mmol ; 4 éq.)<br />
N’,N’’-Didodecyl-L-glutamide 22 : 610,2 mg (1,27 mmol ; 1,5 éq.)<br />
composé 24 :<br />
Formule brute : C75H132N4O38, M = 1697,88 g.mol -1<br />
Rendement : 1,10 g (0,65 mmol ; 77 %)<br />
CCM : Rf 24 = 0,2 (CHCl3 / MeOH / H2O 6 / 3 / 0,5 (v/v/v))<br />
p.f. 160°C (déc.)<br />
[]D 20 + 69 ° (c 0,27, DMF)<br />
IR : 3000-3500 cm -1 (large) (OH) ; 1647 cm -1 (C=O amides)<br />
24<br />
ES-HRMS (haute résolution avec détection en mode positif) : m/z mesuré à 1697,8624<br />
[M+H] + , calculé à 1697,8598 pour C75H133N4O38 (déviation : 1,6 ppm)<br />
6<br />
1<br />
215<br />
12<br />
12
RMN 1 H (pyridine-d5, 500,13 MHz) (ppm) : 9,17 (d, 1H, NH) ; 8,82 (t, 1H, NHCD) ; 8,56<br />
(t, 1H, N’H) ; 8,37 (t, 1H, N’’H ) ; 5,56 – 5,60 (m), 5,55 (d), 5,46(d) (6H, H-1 II-VII CD) ; 5,43<br />
(d, 1H, H-1 I CD) ; 4,94 (m, 1H, H-) ; 4,62 – 4,76 (m, H-3 II-VII CD) ; 4,62 (H-3 I CD) ; 4,56 – 4,64<br />
(m, H-6 II-VII CD) ; 4,28 – 4,53 (m, H-5 II-VII CD / H-6’ II-VII CD) ; 4,41 (H-5 I CD) ; 4,14 – 4,27<br />
(m, H-4 II-VII CD) ; 4,19 (H-6 I CD) ; 4,06 (H-6’ I CD) ; 3,98 – 4,13 (m, H-2 II-VII CD) ; 3,92 (dd, 1H,<br />
H-2 I CD) ; 3,80 (t, 1H, H-4 I CD) ; 3,35, 3,30 (m, 4H, H-1, H-1) ; 2,6 – 3,0 (m, H-b / H-c) ;<br />
2,61 (m, H-/ H-’) ; 2,61 (m, H-) ; 2,34 (m, 1H, H-’) ; 1,50, 1,47 (m, 4H, H-2, H-2) ;<br />
1,18 (H-3/ H-3) ; 1,05 – 1,25 (m, H-4 à H-11/ H-4 à H-11) ; 0,75 (t, 6H, H-12/<br />
H-12)<br />
RMN 13 C (pyridine-d5, 125,77 MHz) (ppm) 173,7 (C-a) ; 173,6 (C-d) ; 173,2<br />
(-CO-N’’H) ; 172,9 (-CO-N’H) ; 104,1 – 104,6 (C-1 I-VII CD) ; 85,8 (C-4 I CD) ; 83,8 – 84,2<br />
(C-4 II-VII CD) ; 74,1 – 75,4 (C-3 I-VII CD / C-5 II-VII CD / C-2 I-VII CD) ; 72,3 (C-5 I CD) ; 62,0 – 62,7<br />
(C-6 II-VII CD) ; 54,4 (C-) ; 41,6 (C-6 I CD) ; 40,3 (C-1/ C-1) ; 33,8 (C-) ; 32,6 (C-10/<br />
C-10) ; 32,1, 32,3 (C-b, C-c) ; 30,5 (C-2/ C-2) ; 30,1 (C-4/ C-4) ; 30,1 – 30,7<br />
(C-5 à C-9/ C-5 à C-9) ; 30,0 (C-) ; 27,8, 27,9 (C-3, C-3) ; 23,4 (C-11/ C-11) ;<br />
14,8 (C-12 / C-12)<br />
N’,N’’-Didodecyl-N-(6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxy-2 I -O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,6 II-VII -di-O-<br />
méthyl)cyclomaltoheptaose)-L-aspartamide, DIMEB-Succ-L-Asp(NHC12H25)-NHC12H25<br />
(25) :<br />
HO<br />
O<br />
H N'H<br />
1<br />
12<br />
NH O<br />
O c d <br />
a<br />
NH<br />
b O<br />
N''H<br />
1<br />
O<br />
OCH 3<br />
O<br />
OCH 3<br />
6<br />
4 O<br />
5<br />
HO 2<br />
3<br />
OCH<br />
1<br />
3<br />
O<br />
25<br />
6<br />
216<br />
12
Dans un ballon de 50 mL sec, 338,9 mg (0,24 mmol ; 1 éq.) du composé 9, préalablement<br />
lyophilisés, sont dissous dans 10 mL de DMF anhydre sous agitation et sous atmosphère<br />
inerte. 149 µL (0,96 mmol ; 4 éq.) de DIC puis 129,3 mg (0,96 mmol ; 4 éq.) de HOBT, en<br />
solution dans 5 mL de DMF anhydre, sont successivement additionnés. Le réaction est alors<br />
maintenue 2 h sous agitation et sous atmosphère inerte à température ambiante. 169,6 mg<br />
(0,36 mmol ; 1,5 éq.) du composé 21, dissous dans 15 mL de chloroforme anhydre<br />
(fraîchement distillé sur P2O5), sont enfin ajoutés au milieu réactionnel. Après 24 h<br />
d’agitation à température ambiante et sous atmosphère inerte, la réaction est stoppée par ajout<br />
de 100 µL d’eau. La solution est évaporée à sec sous vide primaire (40°C), le résidu est repris<br />
dans 20 mL de chloroforme et les insolubles sont filtrés. Le filtrat est concentré à<br />
l’évaporateur rotatif (30°C) et purifié grâce à une colonne chromatographique sur gel de silice<br />
(élution avec CHCl3/CH3OH 98/2 puis 95/5 (v/v)). On isole ainsi 267,0 mg du composé 25<br />
sous forme d’une poudre blanche après lyophilisation.<br />
composé 25 :<br />
Formule brute : C87H156N4O38, M = 1866,20 g.mol -1<br />
Rendement : 267 mg (0,14 mmol ; 60 %)<br />
p.f. 160°C (déc.)<br />
CCM : Rf 25 = 0,3 (CHCl3 / MeOH 8 / 2 (v/v))<br />
[]D 20 + 84 ° (c 0,25, CHCl3)<br />
IR : 3300-3500 cm -1 (large) (OH) ; 1655 cm -1 (C=O amides)<br />
ES-HRMS (haute résolution avec détection en mode positif) : m/z mesuré à 1866,0394<br />
[M+H] + , calculé à 1866,0476 pour C87H157N4O38 (déviation : 4,4 ppm) ; m/z mesuré à<br />
1888,0214 [M+Na] + , calculé à 1888,0295 pour C87H156N4O38Na (déviation : 4,3 ppm)<br />
RMN 1 H (CDCl3, 500,13 MHz) (ppm) : 7,50 (t, 1H, N’H ou N’’H) ; 7,44 (d, 1H, NH) ;<br />
6,27 (t, 1H, N’H ou N’’H) ; 6,11 (t, 1H, NHCD) ; 4,93 – 5,10 (m, H-1 I-VII CD / OH-3CD) ; 4,64<br />
(m, 1H, H-) ; 3,88 – 3,96 (m, H-3 I-VII CD) ; 3,63 (m, OCH3-6CD) ; 3,55 – 3,77 (m, H-5 I-VII CD /<br />
H-6 I-VII CD / H-6’ I-VII CD) ; 3,40 (m, OCH3-2CD) ; 3,38 – 3,50 (m, H-4 I-VII CD) ; 3,22 – 3,32 (m, H-<br />
2 I-VII CD) ; 3,19 (m, H-1/ H-1) ; 2,88 (dd, 1H, H-) ; 2,4 – 2,7 (m, 4H, H-b / H-c) ; 2,42<br />
217
(dd, 1H, H-’) ; 1,47 (m, H-2/ H-2) ; 1,24 – 1,31 (m, H-3 à H-11/ H-3 à H-11) ;<br />
0,87 (t, 6H, H-12/ H-12)<br />
RMN 13 C (CDCl3, 125,77 MHz) (ppm) 171,9, 171,8, 171,2, 170,2 (4s, -CO-NH) ; 100,8 –<br />
101,5 (C-1 I-VII CD) ; 83,0 – 83,7, 84,9 (C-4 I-VII CD) ; 81,7 – 82,3 (C-2 I-VII CD) ; 73,0 – 73,3 (C-3 I-<br />
VII<br />
CD) ; 69,6 – 71,6 (C-5 I-VII CD) ; 70,6 – 71,0 (C-6 I-VII CD) ; 60,2 – 60,5 (OCH3-6CD) ; 58,9 –<br />
59,1, 59,5 (OCH3-2CD) ; 50,0 (C-) ; 39,7 (C-1/ C-1) ; 37,4 (C-) ; 31,9 (C-10/ C-10) ;<br />
31,1, 31,4 (C-b, C-c) ; 29,6 (C-2/ C-2) ; 29,2 – 29,7 (C-4 àC-9/ C-4 à C-9) ; 26,9<br />
(C-3/ C-3) ; 22,6 (C-11/ C-11) ; 14,0 (C-12/ C-12)<br />
N’,N’’-Didodecyl-N-(6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxy-2 I -O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,6 II-VII -di-O-<br />
méthyl)cyclomaltoheptaose)-L-glutamide, DIMEB-Succ-L-Glu(NHC12H25)-NHC12H25<br />
(26) :<br />
HO<br />
O<br />
H N'H<br />
NH <br />
O c d <br />
a b O<br />
NH<br />
O<br />
O<br />
OCH 3<br />
O<br />
OCH 3<br />
1<br />
N''H<br />
6<br />
4 O<br />
5<br />
HO 2<br />
3<br />
OCH<br />
1<br />
3<br />
O<br />
Même protocole expérimental que pour la synthèse du composé 25.<br />
Bilan molaire :<br />
6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxy-per(2,6-di-O-méthyl)cyclomaltoheptaose 9 : 804 mg<br />
(0,57 mmol ; 1 éq.)<br />
DIC : 355 µL (2,29 mmol ; 4 éq.)<br />
HOBT : 313,4 mg (2,32 mmol ; 4 éq.)<br />
N’,N’’-Didodecyl-L-glutamide 22 : 411,8 mg (0,855 mmol ; 1,5 éq.)<br />
26<br />
6<br />
1<br />
218<br />
12<br />
12
composé 26 :<br />
Formule brute : C88H158N4O38, M = 1880,23 g.mol -1<br />
Rendement : 672,6 g (0,36 mmol ; 63 %)<br />
CCM : Rf 26 = 0,3 (CHCl3 / MeOH 8 / 2 (v/v))<br />
p.f. 160°C (déc.)<br />
[]D 20 + 98 ° (c 0,26, CHCl3)<br />
IR : 3300-3500 cm -1 (large) (OH) ; 1655 cm -1 (C=O amides)<br />
ES-HRMS (haute résolution avec détection en mode positif) : m/z mesuré à 1902,0529<br />
[M+Na] + , calculé à 1902,0452 pour C88H158N4O38Na (déviation : 4,0 ppm)<br />
RMN 1 H (CDCl3, 500,13 MHz) (ppm) : 7,29 (d, 1H, NH) ; 7,04 (tl, 1H, N’H ou N’’H) ;<br />
6,31 (tl, 1H, NHCD) ; 6,05 (t, 1H, N’H ou N’’H) ; 4,94 – 5,06 (m, 7H, H-1 I-VII CD) ; 4,31 (m,<br />
1H, H-) ; 3,82 – 4,01 (m, H-3 I-VII CD) ; 3,63 (m, OCH3-6CD) ; 3,55 – 3,80 (m, H-5 I-VII CD / H-6 I-<br />
VII<br />
CD / H-6’ I-VII CD) ; 3,39 – 3,52 (m, H-4 I-VII CD) ; 3,40 (m, OCH3-2CD) ; 3,15 – 3,33 (m, H-2 I-<br />
VII CD) ; 3,21 (m, H-1/ H-1) ; 2,5 – 2,6 (m, 4H, H-b / H-c) ; 2,46 (m, 1H, H-) ; 2,29 (m, 1H,<br />
H-’) ; 2,08 (m, 1H, H-) ; 1,99 (m, 1H, H-’) ; 1,49 (m, 4H, H-2/ H-2) ; 1,24 – 1,32 (m,<br />
H-3 à H-11/ H-3 à H-11) ; 0,88 (t, 6H, H-12/ H-12)<br />
RMN 13 C (CDCl3, 125,77 MHz) (ppm) 172,9, 172,1, 172,0, 170,9 (4s, -CO-NH) ; 100,8 –<br />
101,5 (C-1 I-VII CD) ; 83,0 – 83,7, 85,0 (C-4 I-VII CD) ; 81,7 – 82,4 (C-2 I-VII CD) ; 73,0 – 73,4 (C-3 I-<br />
VII<br />
CD) ; 69,7 – 71,7 (C-5 I-VII CD) ; 70,5 – 71,4 (C-6 I-VII CD) ; 60,1 – 60,5 (OCH3-6CD) ; 58,9 –<br />
59,2, 59,4 (OCH3-2CD) ; 52,8 (C-) ; 39,7, 39,8 (2s, C-1C-1) ; 32,9 (C-) ; 31,9 (C-10/<br />
C-10) ; 31,4 (C-b / C-c) ; 29,4 (C-2/ C-2) ; 29,2 – 29,7 (C-4 àC-9/ C-4 à C-9) ; 29,1<br />
(C-) ; 27,0, 26,9 (2s, C-3, C-3) ; 22,6 (C-11/ C-11) ; 14,0 (C-12/ C-12)<br />
219
N’,N’’-Didodecyl-N-(6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxy-2 I ,3 I -di-O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,3 II-<br />
VII II-VII<br />
,6 -tri-O-méthyl)cyclomaltoheptaose)-L-aspartamide,<br />
TRIMEB-Succ-L-Asp(NHC12H25)-NHC12H25 (27) :<br />
H 3CO<br />
O<br />
H N'H<br />
1<br />
12<br />
NH O<br />
O c d <br />
a b O<br />
N''H<br />
NH<br />
1<br />
O<br />
OCH 3<br />
OCH3 O 4<br />
6<br />
5<br />
O<br />
H3CO 3<br />
2<br />
OCH<br />
1<br />
3<br />
O<br />
27<br />
Dans un tricol de 100 mL sec, 1,01 g (0,67 mmol ; 1 éq.) du composé 13, préalablement<br />
lyophilisés, sont dissous dans 15 mL de DMF anhydre sous agitation et sous atmosphère<br />
inerte. 415 µL (2,68 mmol ; 4 éq.) de DIC puis 361,4 mg (2,68 mmol ; 4 éq.) de HOBT, en<br />
solution dans 5 mL de DMF anhydre, sont successivement additionnés. Le réaction est alors<br />
maintenue 2 h sous agitation et sous atmosphère inerte à température ambiante. 376,1 mg<br />
(0,80 mmol ; 1,2 éq.) du composé 21, dissous dans 20 mL de chloroforme anhydre<br />
(fraîchement distillé sur P2O5), sont enfin ajoutés au milieu réactionnel. Après 24 h<br />
d’agitation à température ambiante et sous atmosphère inerte, la réaction est stoppée par ajout<br />
de 100 µL d’eau. La solution est évaporée à sec sous vide primaire (40°C), le résidu est repris<br />
dans 20 mL de chloroforme et les insolubles sont filtrés. Le filtrat est concentré à<br />
l’évaporateur rotatif (30°C) et purifié grâce à une colonne chromatographique sur gel de silice<br />
(élution avec CHCl3/CH3OH 99/1 puis 98/2 puis 95/5 (v/v)). On isole ainsi 605 mg du<br />
composé 27 sous forme d’une poudre blanche après lyophilisation.<br />
composé 27 :<br />
Formule brute : C94H170N4O38, M = 1964,39 g.mol -1<br />
Rendement : 605 mg (0,31 mmol ; 46 %)<br />
CCM : Rf 27 = 0,4 (CHCl3 / MeOH 95 / 5 (v/v))<br />
p.f. 160°C (déc.)<br />
6<br />
220<br />
12
[]D 20 + 107 ° (c 0,27, CHCl3)<br />
IR : Absence de bande (OH) ; 1651 cm -1 (C=O amides)<br />
ES-HRMS (haute résolution avec détection en mode positif) : m/z mesuré à 1986,1432<br />
[M+Na] + , calculé à 1986,1391 pour C94H170N4O38Na (déviation : 2,1 ppm)<br />
RMN 1 H (CDCl3, 500,13 MHz) (ppm) : 7,56 (t, 1H, N’H ou N’’H) ; 7,45 (d, 1H, NH) ;<br />
6,37 (t, 1H, N’H ou N’’H) ; 6,16 (t, 1H, NHCD) ; 5,08 – 5,17 (m, H-1 I-VII CD) ; 4,65 (m, H-) ;<br />
3,70 - 3,90 (H-5 I-VII CD / H-6 I-VII CD) ; 3,4 - 3,7 (H-4 II-VII CD / H-6’ I-VII CD) ; 3,63 (m, OCH3-6CD) ;<br />
3,42 - 3,56 (H-3 I-VII CD) ; 3,50 (m, OCH3-3CD) ; 3,38 (m, OCH3-2CD) ; 3,36 (H-4 I CD) ; 3,12 -<br />
3,24 (H-2 I-VII CD) ; 3,18 (m, H-1/ H-1) ; 2,87 (dd, 1H, H-) ; 2,4 – 2,7 (m, 4H, H-b / H-c) ;<br />
2,43 (dd, 1H, H-’) ; 1,47 (m, H-2/ H-2) ; 1,23 – 1,31 (m, H-3 à H-11/ H-3 à H-<br />
11) ; 0,87 (t, 6H, H-12/ H-12)<br />
RMN 13 C (CDCl3, 125,77 MHz) (ppm) 170,3, 171,1, 171,8, 171,9 (4s, -CO-NH) ; 98,0 –<br />
99,2 (C-1 I-VII CD) ; 79,1 – 82,3 (C-3 I-VII CD / C-2 I-VII CD / C-4 I-VII CD) ; 70,5 – 71,5 (C-6 II-VII CD /<br />
C-5 II-VII CD) ; 70,0 (C-5 I CD) ; 61,0 – 61,6 (OCH3-6CD) ; 58,0 – 59,5 (OCH3-2CD / OCH3-3CD) ;<br />
49,9 (C-) ; 40,1 (C-6 I CD) ; 39,6 (C-1/ C-1) ; 37,3 (C-) ; 31,8 (C-10/ C-10) ; 31,0,<br />
31,4 (C-b, C-c) ; 29,0 – 29,7 (C-4 àC-9/ C-4 à C-9) ; 26,8 (C-3/ C-3) ; 22,5 (C-<br />
11/ C-11) ; 14,0 (C-12/ C-12)<br />
N’-dodécyl-N’’-(tert-butyloxycarbonyl)-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-<br />
L-aspartamide, Fmoc-L-Asp(O-tBu)-NHC12H25 (29) :<br />
2<br />
1<br />
3<br />
6<br />
4<br />
6'<br />
5<br />
1'<br />
2'<br />
7<br />
5'<br />
3'<br />
4'<br />
8<br />
O<br />
O<br />
9<br />
HN<br />
H<br />
<br />
<br />
O<br />
O<br />
N'H<br />
C<br />
O<br />
1<br />
29<br />
Dans un ballon de 100 mL sec, 504,7 mg (1,23 mmol ; 1 éq.) de Fmoc-L-Asp(O-tBu)-OH 28<br />
sont dissous dans 5 mL de DMF anhydre sous agitation et sous atmosphère inerte. 285 µL<br />
221<br />
12
(1,84 mmol ; 1,5 éq.) de N,N’-diisopropylcarbodiimide (DIC) puis 249,5 mg (1,85 mmol ;<br />
1,5 éq.) d’hydroxybenzotriazole (HOBT) dissous dans 1 mL de DMF anhydre, sont<br />
successivement additionnés. Le réaction est alors maintenue 2 h sous agitation et sous<br />
atmosphère inerte à température ambiante. 344,2 mg (1,86 mmol ; 1,5 éq.) de dodécylamine,<br />
en solution dans 20 mL de chloroforme anhydre, sont enfin ajoutés au milieu réactionnel.<br />
Après 18 h d’agitation à température ambiante et sous atmosphère inerte, la réaction est<br />
stoppée par ajout de 100 µL d’eau. La solution est évaporée à sec sous vide primaire (40°C),<br />
le résidu est repris dans 20 mL de chloroforme et les insolubles sont filtrés. Le filtrat est<br />
concentré à l’évaporateur rotatif (30°C) et purifié grâce à une colonne chromatographique sur<br />
gel de silice (élution avec CHCl3 + AcOH (0,2 %)). L’éluat est évaporé à sec et le résidu<br />
repris dans un minimum de MeOH. Le composé 29 est alors précipité par ajout de 50 mL<br />
d’eau. Le solide est filtré sur verre fritté et lavé avec de l’eau. Après une nuit de séchage à<br />
l’étuve à vide, on isole 619,4 mg du composé 29, sous forme d’une poudre blanche.<br />
composé 29 :<br />
Formule brute : C35H50N2O5, M = 578,79 g.mol -1<br />
Rendement : 619,4 mg (1,07 mmol, 87 %)<br />
CCM : Rf 29 = 0,9 (CHCl3 / MeOH 9 / 1 (v/v))<br />
p.f. 120 °C<br />
IR : 3349 cm -1 (large) (NH- amide) ; 1744 cm -1 (C=O ester) ; 1701 cm -1 (C=O<br />
carbamate) ; 1646 cm -1 (C=O amide)<br />
ESI-MS + : m/z mesuré à 601,5 [M+Na] + , calculé à 601,4 pour C35H50N2O5Na<br />
RMN 1 H (CDCl3, 500,13 MHz) (ppm) 7,77 (d, 2H, H-4 / H-4’, 3 J4-3 = 3 J4’-3’ = 7,5 Hz) ;<br />
7,62 (d, H-1, 3 J1-2 = 7,5 Hz) ; 7,61 (d, H-1’, 3 J1’-2’ = 7,5 Hz) ; 7,41 (t, 2H, H-3 / H-3’, 3 J3-2 =<br />
3<br />
J3-4 = 3 J3’-2’ = 3 J3’-4’ = 7,5 Hz) ; 7,32 (t, 2H, H-2 / H-2’, 3 J2-1 = 3 J2-3 = 3 J2’-1’ = 3 J2’-3’ = 7,5 Hz) ;<br />
6,09 (d, 1H, NH, 3 JN- = 8,3 Hz) ; 5,62 (tl, 1H, N’H) ; 4,48 (m, 1H, H-) ; 4,40 (dd, 1H,<br />
H-8) ; 4,32 (dd, 1H, H-8’) ; 4,23 (t, 1H, H-7) ; 3,24 (m, 2H, H-1) ; 2,87 (dd, 1H, H- 3 J-’ =<br />
15,5 Hz, 3 J= 5,1 Hz) ; 2,71 (dd, 1H, H-’, 3 J’- = 15,5 Hz, 3 J’- = 4,3 Hz) ; 1,49 (s,<br />
3×CH3 tBu) ; 1,47 (m, H-2) ; 1,24 – 1,32 (m, 18H, H-3 à H-11) ; 0,89 (t, 3H, H-12, 3 J12<br />
- 11 = 6,8 Hz)<br />
222
RMN 13 C (CHCl3, 125,77 MHz) (ppm) 170,7 (-CO-N’H) ; 170,3 (-CO-OtBu) ; 156,9<br />
(C-10) ; 144,6, 144,5 (C-5, C-5’) ; 141,9 (C-6 / C-6’) ; 128,4 (C-3 / C-3’) ; 127,7 (C-2 / C-<br />
2’) ; 125,9 (C-1 / C-1’) ; 120,6 (C-4 / C-4’) ; 83,0 (-C- tBu) ; 67,9 (C-8) ; 52,1 (C-) ; 47,8<br />
(C-7) ; 40,3 (C-1) ; 38,8 (C-) ; 32,6 (C-10) ; 29,9 – 30,4C-4 à C-9) ; 30,0 (C-2) ;<br />
28,6 (3×CH3 tBu) ; 27,6 (C-3) ; 23,4 (C-11) ; 14,8 (C-12)<br />
N’-dodécyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-L-aspartamide,<br />
Fmoc-L-Asp(OH)-NHC12H25 (30) :<br />
2<br />
1<br />
3<br />
6<br />
4<br />
6'<br />
1'<br />
5<br />
2'<br />
7<br />
5'<br />
3'<br />
4'<br />
8<br />
O<br />
O<br />
9<br />
H<br />
HN<br />
<br />
<br />
O<br />
N'H<br />
OH<br />
O<br />
1<br />
30<br />
Dans un ballon de 50 mL, 542,6 mg (0,94 mmol ; 1 éq.) du composé 29 sont dissous dans<br />
10 mL d’une solution à 20 % (v/v) d’acide trifluoroacétique dans le dichlorométhane. Le<br />
milieu réactionnel est maintenu 3 h sous agitation à température ambiante. La solution est<br />
alors évaporée à sec sous vide primaire (30°C). Le résidu est repris dans un minimum<br />
d’acétate d’éthyle et précipité par ajout de 40 mL d’éther de pétrole. Après avoir laissé<br />
décanter 2 h à 4°C, le précipité est filtré sur verre fritté puis séché une nuit à l’étuve à vide.<br />
On obtient 461,7 mg du composé 30 sous forme d’une poudre de couleur blanche.<br />
composé 30 :<br />
Formule brute : C31H42N2O5, M = 522,68 g.mol -1<br />
Rendement : 461,7 mg (0,88 mmol, 94 %)<br />
CCM : Rf 30 = 0,1 (CHCl3 / MeOH 9 / 1 (v/v) ; Rf 29 = 0,9)<br />
p.f. 155 °C<br />
223<br />
12
IR : 3306 cm -1 (large) (NH- amide) ; 1703 cm -1 (2s) (C=O acide) et (C=O carbamate) ;<br />
1645 cm -1 (C=O amide)<br />
ESI-MS + : m/z mesuré à 545,5 [M+Na] + , calculé à 545,3 pour C31H42N2O5Na<br />
RMN 1 H (DMSO-d6, 500,13 MHz) (ppm) 12,8 (sl, -COOH) ; 7,99 (d, 2H, H-4 / H-4’, 3 J4-3<br />
= 3 J4’-3’ = 7,5 Hz) ; 7,92 (tl, 1H, N’H) ; 7,80 (d, 2H, H-1 / H-1’, 3 J1-2 = 3 J1’-2’ = 7,5 Hz) ; 7,64<br />
(d, 1H, NH, 3 JN- = 8,3 Hz) ; 7,51 (t, 2H, H-3 / H-3’, 3 J3-2 = 3 J3-4 = 3 J3’-2’ = 3 J3’-4’ = 7,5 Hz) ;<br />
7,42 (t, 2H, H-2 / H-2’, 3 J2-1 = 3 J2-3 = 3 J2’-1’ = 3 J2’-3’ = 7,5 Hz) ; 4,46 (dt, 1H, H- 3 J-N=<br />
3 J’= 8,3 Hz, 3 J= 5,2 Hz) ; 4,34 (H-8) ; 4,31 (H-7) ; 3,12 (m, 2H, H-1) ; 2,67 (dd, 1H,<br />
H- 3 J-’ = 15 Hz, 3 J= 5,2 Hz) ; 2,57 (dd, 1H, H-’, 3 J’- = 15 Hz, 3 J’- = 8,3 Hz) ; 1,45<br />
(m, 2H, H-2) ; 1,28 – 1,36 (m, 18H, H-3 à H-11) ; 0,94 (t, 3H, H-12, 3 J12 - 11 = 6,8<br />
Hz)<br />
RMN 13 C (DMSO-d6, 125,77 MHz) (ppm) 173,1 (-COOH) ; 168,8 (-CO-N’H) ; 155,7<br />
(C-10) ; 143,7 (C-5 / C-5’) ; 140,7 (C-6 / C-6’) ; 127,6 (C-3 / C-3’) ; 127,0 (C-2 / C-2’) ;<br />
125,2 (C-1 / C-1’) ; 120,1 (C-4 / C-4’) ; 65,7 (C-8) ; 50,7 (C-) ; 46,6 (C-7) ; 38,6 (C-1) ;<br />
37,0 (C-) ; 31,3 (C-10) ; 28,6 – 29,1 (C-2C-4 à C-9) ; 26,3 (C-3) ; 22,1 (C-11) ;<br />
13,9 (C-12)<br />
N’-dodécyl-N’’-hexadécyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-L-aspartamide,<br />
Fmoc-L-Asp(NHC16H33)-NHC12H25 (31) :<br />
2<br />
1<br />
3<br />
6<br />
4<br />
6'<br />
5<br />
1'<br />
2'<br />
7<br />
5'<br />
3'<br />
4'<br />
8<br />
O<br />
O<br />
9<br />
H<br />
HN<br />
<br />
<br />
O<br />
N'H<br />
O<br />
N''H<br />
1<br />
1<br />
31<br />
Dans un ballon de 50 mL sec, 396,0 mg (0,76 mmol ; 1 éq.) du composé 30 sont dissous dans<br />
5 mL de DMF anhydre sous agitation et sous atmosphère inerte. 176 µL (1,14 mmol ; 1,5 éq.)<br />
de N,N’-diisopropylcarbodiimide (DIC) puis 155,2 mg (1,15 mmol ; 1,5 éq.)<br />
d’hydroxybenzotriazole (HOBT) dissous dans 1 mL de DMF anhydre, sont successivement<br />
additionnés. Le réaction est alors maintenue 2 h sous agitation et sous atmosphère inerte à<br />
224<br />
12<br />
16
température ambiante. 276,9 mg (1,15 mmol ; 1,5 éq.) d’hexadécylamine, en solution dans<br />
20 mL de chloroforme anhydre, sont enfin ajoutés au milieu réactionnel et le tout est laissé<br />
24 h sous agitation et sous atmosphère inerte à température ambiante (un précipité abondant<br />
se forme rapidement). La mixture est ensuite concentrée à l’évaporateur rotatif (40°C) et<br />
reprise dans du DMF. Le solide pâteux est filtré sur verre fritté et lavé, d’abord avec du DMF,<br />
puis à l’éther. Après une nuit de séchage à l’étuve à vide, on isole 335,7 mg du composé 31,<br />
sous forme d’une poudre blanche fine.<br />
composé 31 :<br />
Formule brute : C47H75N3O4, M = 746,13 g.mol -1<br />
Rendement : 341,7 mg (0,46 mmol, 61 %)<br />
CCM : Rf 31 = 0,85 (CHCl3 / MeOH 95 / 5 (v/v))<br />
N’-dodecyl-N’’-hexadécyl-L-aspartamide, H-L-Asp(NHC16H33)-NHC16H25 (32) :<br />
H 2N<br />
H<br />
<br />
<br />
O<br />
N'H<br />
O<br />
N''H<br />
1<br />
1<br />
32<br />
Dans un ballon de 50 mL, 330 mg (0,44 mmol ; 1 éq.) du composé 31 sont mis en solution<br />
dans 10 mL d’une solution à 20 % (v/v) de pipéridine dans le chloroforme. La solution est<br />
chauffée quelques minutes à 40°C. Le milieu réactionnel, d’abord hétérogène à cause de la<br />
faible solubilité du produit de départ dans le chloroforme, devient rapidement limpide. La<br />
solution est ensuite évaporée à sec, sous vide primaire (40°C), pour éliminer le maximum de<br />
pipéridine (bp 101-106°C). Le résidu solide est repris dans 1 mL de chloroforme pour être<br />
ensuite précipité dans 100 mL d’hexane sous agitation. Après avoir laissé décanter 2 h à 4°C,<br />
le précipité est récupéré par centrifugation (10000 tours/min, 20 min.). Le solide est séché,<br />
225<br />
12<br />
16
puis une ultime étape de recristallisation dans le méthanol (dissolution dans un minimum de<br />
méthanol bouillant, filtration des insolubles à chaud et recristallisation à 4°C) permet d’isoler<br />
par filtration, et après une nuit de séchage à l’étuve à vide, 196 mg du composé 32 sous forme<br />
d’une poudre blanche.<br />
composé 32 :<br />
Formule brute : C32H65N3O2, M = 523,89 g.mol -1<br />
Rendement : 196 mg (0,37 mmol, 84 %)<br />
CCM : Rf 32 = 0,5 (CHCl3 / MeOH 9 / 1 (v/v))<br />
p.f. 104 °C<br />
[]D 20 -7 ° (c 0,26, CHCl3)<br />
IR : 3315 cm -1 (large) (NH- amide) et (NH2) ; 1631 cm -1 (C=O amide)<br />
ESI-MS + : m/z mesuré à 524,6 [M+Na] + , calculé à 524,5 pour C32H66N3O2<br />
RMN 1 H (CDCl3, 500,13 MHz) (ppm) 7,50 (tl, 1H, N’H) ; 6,23 (tl, 1H, N’’H) ; 3,65 (m,<br />
1H, H-) ; 3,21 (m, 4H, H-1 /H-1) ; 2,61 (dd, 1H, H-2,55 (dd, 1H, H-’) ; 1,48 (m,<br />
4H, H-2 /H-2) ; 1,24 – 1,32 (m, 44 H, H-3 à H-11H-3 à H-15) ; 0,88 (t, 6H,<br />
H-12 / H-16)<br />
RMN 13 C (CDCl3, 125,77 MHz) (ppm) 174,4 (CO-N’H) ; 171,6 (CO-N’’H) ; 53,5 (C-) ;<br />
41,7 (C-) ; 40,2, 40,0 (C-1, C-1) ; 32,6 (C-10 / C-14) ; 30,2 – 30,4<br />
(C-4 à C-9C-4 à C-13) ; 30,0 (2s, C-2 / C-2) ; 27,6 (2s, C-3 / C-3) ; 23,4 (C-11 /<br />
C-15) ; 14,8 (C-12 / C-16)<br />
226
N’-dodécyl-N’’-hexadecyl-N-(6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxy-cyclomaltoheptaose)-<br />
L-aspartamide, -CD-Succ-L-Asp(NHC16H33)-NHC12H25 (33) :<br />
HO<br />
NH<br />
NH<br />
O c d<br />
a b O<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
1<br />
H N'H<br />
12<br />
<br />
<br />
O<br />
N''H<br />
6<br />
4 O<br />
5<br />
HO 2<br />
3<br />
OH<br />
1<br />
O<br />
Même protocole expérimental que pour la synthèse du composé 23.<br />
Bilan molaire :<br />
OH<br />
6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxy-cyclomaltoheptaose 5 : 191,6 mg (0,16 mmol ; 1 éq.)<br />
DIC : 96 µL (0,62 mmol ; 4 éq.)<br />
HOBT : 86,0 mg (0,64 mmol ; 4 éq.)<br />
N’-dodécyl-N’’-hexadecyl-L-aspartamide 32 : 122,9 mg (0,23 mmol ; 1,5 éq.)<br />
composé 33 :<br />
Formule brute : C78H138N4O38, M = 1739,96 g.mol -1<br />
Rendement : 178 mg (0,10 mmol ; 66 %)<br />
CCM : Rf 33 = 0,2 (CHCl3 / MeOH / H2O 6 / 3 / 0,5 (v/v/v))<br />
p.f. 160°C (déc.)<br />
[]D 20 + 80 ° (c 0,26, DMF)<br />
IR : 3000-3500 cm -1 (large) (OH) ; 1652 cm -1 (C=O amides)<br />
1<br />
6<br />
33<br />
ES-HRMS : ESI-HRMS (haute résolution avec détection en mode positif) : m/z mesuré à<br />
1739,8983 [M+H] + , calculé à 1739,9670 pour C78H139N4O38 (déviation : 4,8 ppm) ;<br />
227<br />
16
m/z mesuré à 1761,8866 [M+Na] + , calculé à 1761,8887 pour C78H138N4O38Na<br />
(déviation : 5,4 ppm)<br />
RMN 1 H (pyridine-d5, 500,13 MHz) (ppm) : 9,14 (d, 1H, NH) ; 8,79 (t, 1H, NHCD) ; 8,67<br />
(t, 1H, N’’H) ; 8,50 (t, 1H, N’H ) ; 7,3 - 8,0 (OH) ; 5,57 – 5,60 (m), 5,55 (d), 5,47 (d) (6H, H-<br />
1 II-VII CD) ; 5,44 (d, 1H, H-1 I CD) ; 5,38 (m, 1H, H-) ; 4,64 – 4,75 (m, H-3 II-VII CD) ; 4,62 (H-<br />
3 I CD) ; 4,57 – 4,64 (m, H-6 II-VII CD) ; 4,33 – 4,52 (m, H-5 II-VII CD / H-6’ II-VII CD) ; 4,41 (H-5 I CD) ;<br />
4,03 – 4,26 (m, H-4 II-VII CD) ; 4,19 (H-6 I CD) ; 4,06 (H-6’ I CD) ; 3,99 – 4,09 (m, H-2 II-VII CD) ; 3,92<br />
(dd, 1H, H-2 I CD) ; 3,80 (t, 1H, H-4 I CD) ; 3,37, 3,32 (m, 4H, H-1, H-1) ; 3,07 (1H, H-) ;<br />
2,98 (1H, H-’) ; 2,52 – 2,75 (m, 4H, H-b / H-c) ; 1,54, 1,46 (2m, 4H, H-2, H-2) ; 1,07 –<br />
1,26 (m, H-3 à H-11/ H-3 à H-11) ; 0,76 (t, 6H, H-12/ H-12)<br />
RMN 13 C (pyridine-d5, 125,77 MHz) (ppm) 173,2 (C-a) ; 173,1 (C-d) ; 172,0 (-CO-N’H) ;<br />
171,2 (-CO-N’’H) ; 103,7 – 104,3 (C-1 I-VII CD) ; 85,5 (C-4 I CD) ; 83,4 – 83,9 (C-4 II-VII CD) ; 73,8<br />
– 75,0 (C-3 I-VII CD / C-5 II-VII CD / C-2 I-VII CD) ; 72,0 (C-5 I CD) ; 61,7 – 62,3 (C-6 II-VII CD) ; 51,6<br />
(C-) ; 41,2 (C-6 I CD) ; 40,1, 40,0 (C-1, C-1) ; 38,8 (C-) ; 32,3 (C-10/ C-10) ; 32,1,<br />
31,7 (C-b, C-c) ; 29,7 – 30,3 (C-2 C-5 à C-9/ C-2C-5 à C-9) ; 27,5 (2s, C-3, C-<br />
3) ; 23,1 (C-11 / C-11) ; 14,4 (C-12/ C-12)<br />
228
ANNEXE I :<br />
LISTE <strong>DE</strong> SPECIALITES PHARMACEUTIQUES COMMERCIALISEES CONTENANT <strong>DE</strong>S<br />
CYCLO<strong>DE</strong>XTRINES (M. SKIBA, 2003)<br />
Company<br />
Type of cyclodextrin Drug molecule trade name Pharmaceutical forme Indication<br />
country<br />
Cefotiam-hexetil<br />
Takeda<br />
CD<br />
Pansporin T Tablet Antibiotics<br />
hydrochloride<br />
Japan<br />
Cefotiam-hexetil<br />
Cassenne<br />
CD<br />
Taketiam Tablet Antibiotics<br />
hydrochloride<br />
France<br />
Cefotiam-hexetil<br />
CD<br />
Texodil Tablet Antibiotics<br />
hydrochloride<br />
Takeda<br />
Japan<br />
Limaprost<br />
Peripheral vascular<br />
Ono<br />
CD<br />
Opalmon Tablet<br />
disorders<br />
Japan<br />
PGE1<br />
Chronic arterial<br />
Ono<br />
-CD<br />
Prostandin Intra arterial<br />
20g/amp.<br />
occlusive disease<br />
Japan<br />
PGE1<br />
Ono<br />
-CD<br />
Prostandin 500 Infusion Vasodilatator<br />
500g/amp.<br />
Japan<br />
PGE1<br />
Viridal<br />
Intra arterial<br />
Chronic arterial<br />
Schwartz Pharma<br />
-CD<br />
20g/amp.<br />
20g/646g<br />
IV<br />
occlusive disease<br />
Germany, Italy<br />
Shionogi<br />
-CD Benexate Lonmiel Capsule Antiulcerant<br />
Japan<br />
-CD Benexate Ulgut Capsule Antiulcerant Teikoku<br />
Japan<br />
Tranxllium<br />
Gador<br />
-CD Chlordiazepoxide<br />
Tablet Tranquilizer<br />
5mg/25mg<br />
Argentina<br />
Analgesic,<br />
Fujinaga<br />
-CD Dexamethasone, glyteer Glymesason Ointment<br />
Antiinflammatory<br />
Japan<br />
Diphenylhydramine HCl,<br />
Stada<br />
-CD<br />
Stada-Travel Chewing tablet Travel sickness<br />
chlortheophylline<br />
Germany<br />
Meiji Seika<br />
-CD Cephalosporin Meiact Tablet Antibiotics<br />
Japan<br />
Xund<br />
Bipharm<br />
-CD Garlic oil<br />
Dragees Anti-artherosclerotic<br />
5mg/36mg<br />
Germany<br />
Tegra<br />
-CD Garlic oil<br />
5mg/36mg Dragees Anti-artherosclerotic Hermes<br />
Germany<br />
230
Company<br />
country<br />
Pharmafontana<br />
Hungary<br />
CTD<br />
USA<br />
Type of cyclodextrin Drug molecule trade name Pharmaceutical forme Indication<br />
-CD Garlic oil Allidex Dragees Anti-artherosclerotic<br />
-CD Garlic oil Garlessence Dragees Anti-artherosclerotic<br />
Island<br />
Mouth wash against aphta,<br />
gingivitis, etc<br />
HPCD Hydrocortisone Dexacort Liquid<br />
Kyushin<br />
Japan<br />
Janssen<br />
Europe/USA<br />
Nippon Kayaku<br />
Japan<br />
Ono<br />
Japan<br />
Chiesi<br />
Italy<br />
Robapharm (P.Fabre),<br />
France<br />
Masterpharm<br />
Italy,Belgium,Netherlands<br />
and Switzeland<br />
Promedica<br />
France<br />
Nycomed<br />
Scandanavia<br />
FarmiTalia<br />
Germany<br />
Aché<br />
Brasil<br />
Roussel Maestrett<br />
Italy<br />
Ono<br />
Japon<br />
-CD Iodine Mena-Gargle Gargling solution Throat disinfectant<br />
Esophageal candidiosis<br />
Oral Liquid<br />
I.V. solution<br />
HPCD Itraconazole Sporanox<br />
-CD Nitroglycerin Nitropen Sublingual tablet Coronary dilator<br />
PGE2<br />
-CD<br />
Prostarmon E Sublingual tablet Induction of labour<br />
.<br />
Anti inflammatory,<br />
-CD Piroxicam Brexin Tablet, Sachet<br />
analgesic<br />
Anti inflammatory,<br />
-CD Piroxicam Brexin Tablet, Sachet<br />
analgesic<br />
Anti inflammatory,<br />
-CD Piroxicam Cycladol Suppository<br />
analgesic<br />
Anti inflammatory,<br />
-CD Piroxicam Cycladol Tablet, Sachet<br />
analgesic<br />
Anti inflammatory,<br />
-CD Piroxicam Brexidol Tablet, Sachet<br />
analgesic<br />
Anti inflammatory,<br />
-CD Piroxicam Brexidol Tablet, Sachet<br />
analgesic<br />
Anti inflammatory<br />
-CD Piroxicam Flogene Liquid<br />
analgesic for pediatric use<br />
Surgamyl<br />
Anti inflammatory<br />
-CD Tiaprofenic acide<br />
Tablet<br />
300mg/1400mg<br />
analgesic for pediatric use<br />
CD OP-1206 Opalmon Tablet Buerger's diease<br />
231
Company<br />
Type of cyclodextrin Drug molecule trade name Pharmaceutical forme Indication<br />
country<br />
Rectal pessary<br />
Core Technologies<br />
CD Morphine Moraxen Analgesic<br />
Hydrgel<br />
UK<br />
HPCD Indomethacin Indocid Eye drop Chauvin<br />
France<br />
HPCD Flavopiridol IV Breast cancer NCI<br />
USA<br />
HP-CD Cisapride Prepulsid Rectal suppository Gastrointestinal<br />
Janssen<br />
Mobility stimulant<br />
Belgium<br />
Methyl--CD Cloramphenicol Clorocil Eye drop Antibiotic Oftalder<br />
Portugal<br />
Methyl--CD estradiol Aerodiol Voie nasale Servier<br />
France<br />
Betafarm<br />
-CD Omeprazol comprimé Pompe à proton<br />
Germany<br />
-CD Cefotiam Pansporin-T comprimé Takeda<br />
Japon<br />
S-CD Ziprazidone Zeldox I.M. olution Pfizer<br />
Sweden<br />
HP-CD Diclofenac Voltaren ophtha Eye drop Anti-inflammatoire Novartis<br />
France<br />
Chiesi et Novartis<br />
-CD Nimesulide Nimedex comprimé Anti-inflammatoire<br />
Europe<br />
232
ANNEXE II<br />
<strong>DE</strong>TERMINATION <strong>DE</strong> LA STŒCHIOMETRIE D’UN COMPLEXE<br />
SOLUBLE CYCLO<strong>DE</strong>XTRINE / “MOLECULE INVITEE” PAR LA<br />
METHO<strong>DE</strong> <strong>DE</strong>S VARIATIONS CONTINUES OU METHO<strong>DE</strong> <strong>DE</strong> JOB<br />
L’équation stoechiométrique est<br />
n C + m I Cn I m<br />
L’évolution d’une variable physico-chimique est observée au cours d’une<br />
titration au cours de laquelle la somme des concentrations totales en<br />
cyclodextrine [C] t et en molécule « invitée » [I] t doit être maintenue constante.<br />
[C] t<br />
[I] t<br />
c<br />
Au cours de la titration la fraction molaire en cyclodextrine y varie en fonction des concentrations<br />
totales en cyclodextrine et molécule « invitée » :<br />
[C]<br />
y t d’où [C] t cy et [I] t<br />
c(1<br />
y)<br />
[C] t<br />
[I] t<br />
On exprime la concentration en complexe I ]<br />
[Cn m en fonction des différents paramètres Ka, concentrations totales et concentrations à l’équilibre, [C] et [I], en cyclodextrine et molécule<br />
invitée :<br />
[Cn Im<br />
] =<br />
[Cn Im<br />
] =<br />
K<br />
n m<br />
a [C] [I]<br />
(1)<br />
[C] [<br />
t<br />
[ C] c y C]<br />
<br />
n n<br />
[I] c(1 y) ]<br />
[Cn Im<br />
] = t<br />
[I]<br />
[I<br />
<br />
(3)<br />
m m<br />
La concentration en complexe I ] varie en fonction de y et passe par un maximum pour<br />
d[C m<br />
[Cn m<br />
nI ]<br />
0 . On calcule les dérivées à partir des trois équations précédentes et on les égale à<br />
dy<br />
zéro ce qui conduit aux trois relations :<br />
d[C] d[I]<br />
n [I] m [C]<br />
0<br />
dy<br />
dy<br />
(1’)<br />
d[C]<br />
c<br />
(2’)<br />
dy<br />
d[I]<br />
c<br />
(3’)<br />
dy<br />
La combinaison de ces trois équations conduit à l’égalité suivante :<br />
233<br />
(2)
n [I] m [C]<br />
(4)<br />
La loi de conservation des masses appliquée au composé I s’écrit :<br />
[I] m[C I ] c(1<br />
y) (5)<br />
[I] t<br />
n m<br />
d’où en remplaçant I ] par sa valeur tirée de (2) :<br />
[Cn m<br />
cy [ C]<br />
c(1 y) [I]+ m<br />
(6)<br />
n<br />
L’élimination de [C]et [I] entre (4) et (6) donne finalement la relation :<br />
qui permet de préciser la composition du mélange optimal<br />
y n<br />
<br />
(7)<br />
1 y m<br />
Autrement dit si une variable physique directement liée à la concentration en complexe est<br />
n<br />
mesurée en fonction de y, sa valeur maximale est observée pour y . Cette relation est<br />
m n<br />
indépendante de la constante d’association Ka et de la valeur de c.<br />
Lorsque la RMN du proton est utilisée comme méthode analytique dans le cas d’un<br />
échange rapide à l’échelle de temps de la RMN, la valeur observée pour le déplacement chimique<br />
d’un noyau i de la molécule « invitée » I, obs, est donnée par :<br />
[I] m [C<br />
I ] <br />
m [CnIm<br />
] I<br />
<br />
c t n m Il<br />
obs <br />
(8)<br />
[I]<br />
t<br />
Ic étant la valeur pour le noyau i dans le complexe pur C nI m et Il la valeur pour le noyau i dans<br />
la molécule « invitée » à l’état libre. D’où la relation :<br />
( ) [C I ] m (<br />
) [C I ] cte (9)<br />
[I] t obs Il n m Ic Il n m<br />
Le produit ( ) directement proportionnel à [CnIm], est donc fonction de y. La<br />
[I] t obs Il<br />
[C]<br />
courbe [I]<br />
t<br />
t ( obs<br />
Il<br />
) f(y) f passera par un maximum lorsque la composition du<br />
[C] t<br />
[I] t<br />
mélange répondra à la condition :<br />
y n<br />
<br />
1 y m<br />
Dans le cas d’un phénomène de complexation pur (en absence de tout phénomène<br />
d’association) le coefficient stœchiométrique du complexe est déterminé à l’aide du tracé de la<br />
fonction ( ) f(y) pour un proton donné de la molécule « invitée ».<br />
[I] t obs If<br />
Les constantes de couplage ou les vitesses de relaxation peuvent être aussi utilisées, en théorie.<br />
234
ANNEXE III<br />
<strong>DE</strong>TERMINATION <strong>DE</strong> LA CONSTANTE D’ASSOCIATION D’UN<br />
COMPLEXE 1:1 PAR LA METHO<strong>DE</strong> <strong>DE</strong> BENESI-HIL<strong>DE</strong>BRAND<br />
Pour un complexe de stœchiométrie 1 :1, l’équation de réaction s’écrit :<br />
C + I <br />
CI<br />
En supposant que l’échange de la molécule « invitée » entre forme associée et forme libre<br />
soit rapide à l’échelle de temps de la RMN le déplacement chimique induit , est donné par:<br />
[I] [CI]<br />
<br />
[CI] Ic<br />
t <br />
<br />
Il<br />
obs <br />
<br />
Il<br />
Il<br />
(1)<br />
[I]<br />
où If et Ic sont respectivement les déplacements chimiques correspondant à la molécule<br />
« invitée » et au complexe pur, obs le déplacement chimique observé à l’équilibre en présence de<br />
cyclodextrine, [CI] et [I] t respectivement la concentration en complexe et la concentration totale<br />
en espèce invitée.<br />
On en déduit<br />
<br />
[CI] Ic<br />
[CI]<br />
Il<br />
soit<br />
[I]<br />
[CI]<br />
Ic<br />
(2)<br />
[I]<br />
La constante d’équilibre s’écrit :<br />
K<br />
a<br />
t<br />
avec Ic Ic<br />
Il<br />
t<br />
[CI]<br />
[CI]<br />
<br />
(4)<br />
[C] [I]<br />
[C] [CI]<br />
[I] [CI]<br />
<br />
t<br />
Sous réserve que la concentration en molécule « invitée » soit faible devant la concentration en<br />
cyclodextrine, il est possible de négliger le terme [CI] 2 dans l’expression précédente ce qui conduit<br />
à :<br />
K<br />
a<br />
[CI]<br />
(5)<br />
[C] [I] [I]<br />
[CI] [C]<br />
[CI]<br />
t<br />
t<br />
t<br />
De l’équation (2), on tire la valeur de [CI] que l’on reporte dans l’expression simplifiée (5) de la<br />
constante K a :<br />
<br />
K a <br />
(6)<br />
[C] <br />
[I]<br />
<br />
[C]<br />
<br />
t<br />
Ic<br />
t<br />
A partir de cette équation en négligeant [I] t devant [C] t ( [I] t
1<br />
<br />
<br />
K<br />
a<br />
1<br />
<br />
Ic<br />
[C]<br />
t<br />
<br />
1<br />
<br />
La pente et l’ordonnée à l’origine des droites obtenues en portant 1/ en ordonnée en<br />
fonction de 1/[C]t en abscisse et permettent d’atteindre les deux paramètres recherchés Ic et<br />
Ka.<br />
236<br />
Ic<br />
(7)
ANNEXE IV :<br />
DOSAGES IMMUNOENZYMATIQUES<br />
1. Le système immunitaire : présentation des anticorps<br />
Les anticorps sont des protéines produites par le système immunitaire pour protéger un<br />
organisme des agressions extérieures comme l’intrusion d’organismes pathogènes par<br />
exemple. Ces molécules sont produites par les lymphocytes B en réponse à l’intrusion d’une<br />
molécule étrangère à l’organisme hôte. Ces substances étrangères capables de déclencher une<br />
réponse immunitaire sont dénommées antigènes, et ce sont en générale des composés<br />
possédant des molécules de masse supérieure à 5000 Da. Les molécules plus petites (M
Figure 1. Représentation schématique d'un anticorps (ici, une molécule d’immunoglobuline G,<br />
encore notée IgG)<br />
Du point de vue structural, les anticorps sont des glycoprotéines constituées d’un arrangement<br />
quaternaire de plusieurs sous-unités peptidiques. On distingue quatre chaînes protéiques :<br />
deux chaînes dites lourdes (nommées VH, H pour Heavy, et dont la masse est proche de<br />
50 kDa), et deux chaînes légères (nommées VL, L pour Light, de masse moléculaire environ<br />
25 kDa). Ces quatre polypeptides sont arrangés de manière symétrique, chacune des chaînes<br />
légères étant associée à une chaîne lourde, et l’assemblage global étant assuré par plusieurs<br />
ponts disulfures intra- et inter-catennaires (figure 1).<br />
On distingue dans les immunoglobulines deux grandes régions : une partie est dite constante,<br />
et l’autre variable. Ce sont les parties constantes, constituées par les parties C-terminales des<br />
polypeptides qui permettent de distinguer les différentes classes d’immunoglobulines. Ainsi,<br />
il existe 5 classes d’immunoglobulines chez les mammifères, dénommées IgA, IgD, IgE, IgG<br />
et IgM, qui se distinguent chacune par la partie constante de leurs chaînes lourdes, , , , ,<br />
et µ, respectivement. Ce sont les IgG les plus fréquentes, et ce sont elles que nous avons<br />
utilisées pour les expériences de reconnaissance immunologique.<br />
238
Les parties variables sont, elles, responsables de la reconnaissance pour un antigène donné.<br />
Elles sont constituées d’une partie des chaînes lourdes, et d’une partie des chaînes légères (les<br />
extrémités N-terminales) qui créent ainsi 2 sites de liaisons par anticorps (voir schéma de<br />
l’IgG). On distingue dans ces parties variables un sous-motif qualifié «d’hypervariable», et<br />
qui est directement impliqué dans l’interaction avec l’antigène. Ces régions hypervariables<br />
sont constituées d’un arrangement conformationel et fonctionnel (le paratope) spécifique à la<br />
liaison avec une partie de l’antigène (l’épitope). Le phénomène pur de reconnaissance ne met<br />
cependant en jeu que quelques uns des acides aminés de ces régions hypervariables.<br />
2. Obtention des anticorps.<br />
Nous décrirons ici une méthode générale d’obtention d’anticorps dirigés contre des haptènes,<br />
en étudiant plus particulièrement la production d’anticorps anti-cyclodextrines.<br />
Les haptènes sont de petites molécules (M < 5000Da) qui ne suffisent pas à elles seules à<br />
induire une réponse immunitaire chez un mammifère. On fabrique donc un immunogène en<br />
greffant de façon covalente l’haptène sur une protéine étrangère à l’hôte auquel on veut faire<br />
produire des anticorps (typiquement, un lapin). Le système immunitaire va produire des<br />
anticorps dirigés contre l’ensemble des épitopes portés par cette protéine étrangère (KLH +<br />
haptène ou BSA + haptène), et dans cet ensemble d’anticorps, certains seront dirigés contre<br />
l’haptène préalablement greffé.<br />
Pour les cyclodextrines, on utilise les dérivés mono-6-désoxy-6-amino-cyclodextrines (CD-<br />
NH2). Cet haptène est couplé de façon covalente à la Sérum Albumine Bovine (BSA),<br />
protéine étrangère à l’organisme du lapin, en utilisant le glutaraldéhyde comme bras espaceur<br />
(la façon dont le glutaraldéhyde lie les deux molécules n’est pas bien connue, mais le<br />
glutaraldéhyde réagit probablement sous sa forme polymérique). L'agent de couplage réagit<br />
en créant des fonctions imines à partir des fonctions amines primaires de la CD et de la BSA<br />
(figure 2).<br />
239
NH2<br />
CD +<br />
BSA<br />
OHC CHO<br />
240<br />
CD<br />
Figure 2: Préparation de l'immunogène.<br />
H2 N CH N 3<br />
IMMUNOGENE<br />
Pour réaliser ceci, 900 nmol d'haptène et 30 mg de BSA sont dissouts dans 2 ml de tampon<br />
phosphate (0.1 M, pH 7.4). On ajoute à cette solution 8 µL de solution aqueuse de<br />
glutaraldéhyde (25 % (v/v)). La solution est agitée durant 16 H à Tamb, puis dialysée contre<br />
deux litres de tampon phosphate 10 -1 M. L'immunogène est stocké à -30 °C jusqu'à utilisation.<br />
Les lapins sont immunisés par injection intradermique de l’immunogène. Afin d’accroître la<br />
réponse immunitaire du lapin, l’immunogène est émulsionné dans de l’adjuvant de Freund<br />
complet 251 . 1 mg d’immunogène est injecté au lapin. Six semaines après la première injection,<br />
les animaux reçoivent une injection de rappel. Cette opération est ensuite répétée tous les<br />
mois, tandis que l’on vérifie la présence et le titre des anticorps spécifiques dans les saignées<br />
effectuées avant et après chaque rappel.<br />
Ce sont ces protéines générées par le système immunitaire qui sont la base des dosages<br />
immunologiques.<br />
3. Les dosages immunologiques<br />
3.1 Principe<br />
Sous le terme de dosages immunologiques sont regroupées différentes méthodes d’analyse<br />
qui on toutes en commun d’utiliser à la fois des anticorps (Ac) et des molécules marquées.<br />
Les anticorps ont la propriété de former des complexes spécifiques de haute affinité avec les<br />
antigènes (Ag) contre lesquels ils ont été produits. Les dosages immunologiques exploitent les<br />
propriétés de base de l’interaction Ag-Ac. Dans sa forme la plus simple, celle-ci peut être<br />
décrite par l’équilibre suivant :<br />
BSA
Ag + Ac AgAc<br />
Il est admis que cet équilibre obéit à la loi d’action de masse et donc que les concentrations de<br />
ces constituants sont reliées entre elles par la relation :<br />
Kd [Ag] [Ac] [AgAc] –1<br />
où Kd est la constante de dissociation du complexe Ag-Ac<br />
De cet équilibre on peut déduire que la concentration des complexes AgAc formés dépend des<br />
concentrations en Ag et en Ac introduites dans la réaction. Si l’on suppose constante la<br />
concentration totale en Ac, on peut montrer qu’il existe une relation mathématique simple<br />
reliant [Ag] à [Ag-Ac]. Cette relation va permettre de mesurer la concentration en Ag si l’on<br />
est capable de mesurer la concentration du complexe formé.<br />
On pourrait alors penser qu’il est possible de mesurer la concentration d’un Ag au moyen<br />
d’un seul équilibre réalisé avec une quantité connue d‘Ac. Ceci serait possible si on pouvait<br />
connaître avec précision la concentration totale en Ac, le Kd et la concentration du complexe<br />
formé. En pratique, ces trois conditions ne sont jamais réalisées en même temps et tous les<br />
dosages immunologiques sont, en fait, des méthodes d’analyses relatives faisant appel à des<br />
courbes d’étalonnage. Celles-ci sont établies en réalisant plusieurs équilibres avec des<br />
concentrations connues et variables d’Ag. En mesurant pour chaque équilibre la quantité de<br />
complexe formé, on va établir une relation expérimentale entre la concentration de l’Ag et<br />
celle du complexe AgAc. C’est à partir de cette relation que l’on va mesurer la concentration<br />
de l’Ag dans un échantillon inconnu traité dans les mêmes conditions expérimentales que les<br />
solutions étalons. Dans ces conditions, il n’est pas nécessaire de travailler dans des conditions<br />
d’équilibre.<br />
Pour effectuer un dosage immunologique, il faut donc pouvoir mesurer la concentration du<br />
complexe AgAc formé. C’est pour rendre plus facile cette mesure que l’on a recours à<br />
l’utilisation de molécules marquées. Il s’agit d’Ag ou d’Ac auxquels on associe un signal les<br />
rendant facilement mesurables au moyen d’une méthode physico-chimique quelconque. De<br />
très nombreux marqueurs ont été décrits mais les plus utilisés sont les marqueurs radioactifs<br />
(dosage radioimmunologiques), les marqueurs fluorescents (dosages fluoroimmunologiques)<br />
241
et les enzymes (dosages immunoenzymatiques). Nous nous concentrerons sur ce dernier cas<br />
qui est la méthode que nous avons utilisée.<br />
Pour permettre des dosages sensibles, un bon traceur doit pouvoir être détecté à des<br />
concentrations très faibles, c’est à dira posséder une activité spécifique la plus élevée possible.<br />
Il faut aussi que l’opération de marquage respecte les structures essentielles de l’Ac afin que<br />
la stabilité du complexe ne soit pas affectée.<br />
Les enzymes les plus utilisées restent la phosphatase alcaline et la peroxydase de Raifort. Au<br />
laboratoire, nous utilisons plutôt l’acétylcholinesterase ou AchE en raison de sa très grande<br />
activité catalytique qui confère aux traceurs synthétisés à partir de cette enzyme des activités<br />
spécifiques très élevées souvent comparables à celles des traceurs radioactifs. La fonction<br />
principale de cette enzyme est l’hydrolyse de l’acétylcholine dans la synapse cholinergique.<br />
Pour détecter cette enzyme on utilise le réactif d’Ellman 252 (Figure 3) qui est un mélange<br />
d’acétylthiocholine, un pseudo-substrat de l’AchE, et le DTNB. L’hydrolyse de<br />
l’acétylthiocholine aboutit à la production de thiocholine qui réagit avec le DTNB ox., réactif<br />
classiquement utilisé pour mesurer les groupements thiols, et entraîne la formation de DTNB<br />
réduit. Ce dernier est un chromophore (max 414 nm, M 13600cm -1 .M -1 ) qui absorbe fortement<br />
dans le visible en produisant une couleur jaune.<br />
AChE<br />
CH3COO<br />
Acétylthiocholine Thiocholine<br />
- + - S-CH2CH2N(CH3)3 + + 2H +<br />
CH3COS-CH2CH2N(CH3)3 + + H2O<br />
- S-CH2 -CH 2 -N + (CH 3 ) 3 +<br />
O 2 N<br />
-OOC<br />
DTNB<br />
S<br />
S NO2 242<br />
COO-<br />
COO- HSNO2 C<br />
H 3<br />
C<br />
H 3<br />
N +<br />
CH3 Figure 3. Principe de la méthode colorimétrique d’Ellman.<br />
+<br />
S<br />
DTNB<br />
Réduit (coloré)<br />
COO-<br />
S NO 2
Il est courant d’exprimer les concentrations d’AchE en fonction des mesures effectuées avec<br />
la méthode d’Ellman. Une unité Ellman correspond à la quantité d’enzyme produisant un<br />
accroissement d’absorbance d’une unité à 414 nm pendant une minute, dans un volume de<br />
1 mL de milieu Ellman, pour 1 cm de trajet optique à 25°C.<br />
Dans certains cas, la formation de complexe s’accompagne d’une modification du signal porté<br />
par le traceur. Les dosages de ce type sont appelés homogène car la mesure est effectuée<br />
directement sur l’ensemble des constituants de l’équilibre immunologique. A l’opposé on<br />
distingue les dosages hétérogènes, pour lesquels la formation des complexes Ag-Ac ne<br />
modifie pas le signal porté par le traceur. Dans ce cas, pour accéder à la mesure des complexe<br />
Ag-Ac, il faut procéder à une séparation des différents constituants de l’équilibre et<br />
notamment séparer le traceur non complexé de celui engagé dans les complexes Ag-Ac. Cette<br />
séparation, qui doit être effectuée avant la mesure finale, fait presque toujours appel à une<br />
séparation de phase (liquide/solide). Dans la suite de cet exposé nous envisagerons seulement<br />
le cas des dosages hétérogènes que nous avons utilisé.<br />
Nous venons d’examiner les principes de base sur lesquels reposent les dosages<br />
immunologiques et nous avons vu comment la formation de complexes Ag-Ac et l’utilisation<br />
de molécules marquées permettait de mesurer des concentrations d’Ag ou d’Ac. Ces principes<br />
ne sont pas propres aux dosages immunologiques et on pourrait les appliquer, par exemple,<br />
aux dosages faisant intervenir des récepteurs. Si les dosages immunologiques ont connu un<br />
développement si spectaculaire ces trente dernières années, c’est parce qu’ils sont dotés<br />
d’autres propriétés remarquables. Ce sont d’abord des méthodes très générales dans la mesure<br />
où il est possible d’obtenir des Ac contre à peu près n’importe quelle molécule. Le succès des<br />
dosages immunologiques est aussi dû à deux propriétés essentielles de l’interaction Ag-Ac :<br />
spécificité et affinité. C’est grâce à la spécificité des Ac, c’est à dire à leur aptitude à ne<br />
former des complexes qu’avec le seul Ag contre lequel ils ont été produit, que les dosages<br />
immunologiques pourront être effectués dans des milieux biologiques complexes (plasma,<br />
urines, extraits de tissus) sans purification préalable. Et c’est grâce à la grande stabilité des<br />
complexes que les dosages immunologiques pourront être très sensibles. Or ces complexes ne<br />
se formeront de façon mesurable, à de très faibles concentrations, que si la constante de<br />
dissociation de ces complexes le permet. Avec des Kd de l’ordre de 10 -9 M et pouvant aller<br />
jusqu’à 10 -12 M, les Ac permettent de mesurer de très faibles concentrations d’Ag. Ainsi, que<br />
243
ce soit en termes de spécificité ou d’affinité, les Ac sont les réactifs les plus performants<br />
actuellement accessibles aux biologistes avec les sondes nucléotides.<br />
Il ne saurait être question ici de décrire les très nombreuses méthodes faisant intervenir la<br />
relation Ag-Ac. Nous nous bornerons à décrire succinctement le type de dosage hétérogène<br />
que nous avons utilisé : le dosage par compétition.<br />
3.2 Dosage par compétition<br />
Les dosages par compétition mettent en jeu 3 composants: un anticorps (poly ou monoclonal),<br />
un antigène marqué (le traceur) et le même antigène non marqué. Le fait d’utiliser comme<br />
traceur l’antigène marqué est l’une des caractéristiques essentielles des dosages par<br />
compétition. Le traceur (Ag * ) et l’antigène (Ag) non marqué sont aptes à se lier tous les deux<br />
aux mêmes anticorps (Ac), et de ce fait, à établir une compétition si la concentration des sites<br />
anticorps est limitante. Le principe de compétition met donc en œuvre deux équilibres :<br />
Ag * + Ac Ag * Ac Kd * = [Ac][Ag * ]/[Ag * Ac]<br />
Ag + Ac AgAc Kd= [Ac][Ag]/[AgAc]<br />
On peut montrer que si la concentration en anticorps et en traceurs est constante, la<br />
concentration en complexe Ag * Ac diminue quand la concentration d’antigènes non marqués<br />
introduite dans l’équilibre augmente, et ceci pour toutes valeurs de Kd et Kd * .<br />
3.2.1 Préparation du traceur pour le dosage par compétition<br />
Comme indiqué précédemment, un traceur pour dosage par compétition est obtenu en<br />
couplant de façon covalente l’haptène étudié à l’acétylcholinestérase. Il existe de nombreuses<br />
façons de coupler l’haptène sur l’enzyme. La méthode employée dépend uniquement des<br />
fonctions chimiques réactives disponibles sur l’haptène. Dans le cas des cyclodextrines, le<br />
traceur est préparé en exploitant la fonction amine du dérivé mono-6-désoxy-6-aminocyclodextrines<br />
(CD-NH2), en utilisant le protocole précédemment décrit pour les haptènes 253<br />
ou pour les protéines 254 .<br />
244
CD<br />
A C<br />
h E<br />
NH 2<br />
NH 2<br />
SMCC<br />
SATA<br />
NH2OH A C<br />
h E<br />
O<br />
NH<br />
CD<br />
AChE-G4-SMCC<br />
NHCOCH 2 SH<br />
N<br />
O<br />
O<br />
245<br />
A C<br />
h E<br />
O<br />
NH<br />
Traceur CD-G4<br />
Figure 4. Synthèse du traceur enzymatique CD-AChE-G4.<br />
Le dérivé mono-6-désoxy-6-amino-cyclodextrine (CD-NH2) est d’abord thiolé en faisant<br />
réagir le groupe amine de la CD-NH2 avec le N-succinimidyl-S-acétylthioacétate (SATA) en<br />
milieu alcalin. A une solution de CD-NH2 (1µmol) en tampon borate (1 ml de tampon borate<br />
0.1 M, pH 8.5) on ajoute 50 µl d'une solution de SATA dans le DMF anhydre (2.13 mg, 9.2<br />
µmol). La réaction a lieu à température ambiante durant 30 mn avant purification de la CD-<br />
SATA sur cartouche de SEP-PAK C18. Le dérivé thiolé est élué avec du méthanol, lyophilisé<br />
et repris dans 1.6 ml de tampon phosphate préalablement dégazé (tampon phosphate 0.1 M,<br />
pH 6). On ajoute alors 400 µL d'une solution de chlorure d'hydroxylamine (pH 7). Après 30<br />
mn de réaction, le nombre de fonctions thiols est estimé par colorimétrie, en faisant réagir le<br />
milieu réactionnel avec 0.5 mM de 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoique acide) (DTNB) selon la<br />
procédure décrite par Ellman 255 .<br />
L'acétylcholinestérase (sous sa forme globulaire G4, préalablement extraite à partir des<br />
organes électriques de Gymnote et purifiée par chromatographie d'affinité 256 ) est de son côté<br />
fonctionnalisée par réaction avec le N-succinimidyl-4-(N-maléimidométhyl) cyclohexane-1carboxylate<br />
(SMCC, un agent bifonctionnel), puis purifiée comme précédement décrit 254 . Le<br />
couplage de la cyclodextrine thiolée (3 nmol) avec l'AChE fonctionnalisée (0.3 nmol AChE-<br />
G4-SMCC) est réalisé en milieu tampon phosphate (0.1 M, pH 6, 275 µL) durant 3 h à 30°C.<br />
Le traceur CD-AChE est alors purifié par filtration sur gel de sépharose (Biogel A, colonne de<br />
90 x 1.5 cm, éluant tampon EIA).<br />
N<br />
O<br />
O<br />
S<br />
O<br />
NH<br />
CD
3.2.2 Mise en œuvre ; interprétations<br />
La mise en œuvre d’un dosage immunoenzymatique par compétition nécessite la préparation<br />
d'un traceur (antigène étudié lié de façon covalente à l’acétylcholinestérase), et d’avoir à notre<br />
disposition un anticorps spécifique de l’antigène étudié (voir le chapitre concernant la<br />
préparation de l’immunogène à partir d’un haptène).<br />
Les dosages immunologiques sont réalisés dans des plaques de microtitration comprenant 96<br />
puits. Un prétraitement nécessaire à la bonne réalisation du dosage (schéma 1, fig 5), consiste<br />
à recouvrir les puits avec un anticorps monoclonal de souris dirigé contre la partie constante<br />
des immunoglobulines de lapin. La première étape du dosage consiste à mélanger dans un<br />
même puits, une quantité constante de ces anticorps spécifiques de lapin avec une quantité<br />
constante de traceur (antigène-AChE), et une quantité variable de l’antigène étudié (schéma 2,<br />
fig 5). Après l’étape de réaction immunologique (typiquement 18 h à 4 °C) et après une étape<br />
de lavage soigné, on se retrouve dans la situation du schéma 3, où certains sites sont occupés<br />
par une molécule de traceur, ou bien, par une molécule d’antigène, l’excédant ayant été<br />
éliminé par l’étape de lavage.<br />
Figure 5. Principe du dosage immunoenzymatique par compétition.<br />
La quantité d’AChE fixée sur la phase solide est alors détectée par la méthode colorimétrique<br />
d’Ellman en ajoutant dans chacun des puits un mélange d’acétylthiocholine et de DTNB<br />
(schéma 4, fig 5). Après une à deux heures de réaction enzymatique, l’absorbance<br />
( = 414 nm) de chaque puits est mesurée à l’aide d’un lecteur approprié.<br />
246
La réalisation de ces mesures sur une gamme de concentration de l’antigène étudié conduit à<br />
l’obtention de courbe de type B = f([concentration]), B étant l’absorbance du milieu à 414<br />
nm, pour une concentration donnée d’antigène. Il est cependant plus pratique de représenter<br />
ces courbes sous une forme semi-logarithmique, en traçant 100*B/B0 = f([concentration]), B0<br />
étant l’absorbance mesurée en absence d’antigène non marqué (figure 6).<br />
Figure 6. Courbe dose-réponse obtenue lors d'un dosage immunologique par compétition.<br />
Il est à noter que des mesures de liaison non spécifique (absorbance mesurée en absence<br />
d’anticorps spécifiques) sont effectuées à chaque dosage.<br />
On peut estimer grossièrement la sensibilité d’un dosage par la valeur de la concentration en<br />
antigène qui correspond à une valeur de B*100/B0 de 50 % de B0. Cette valeur caractérise la<br />
zone de concentration dans laquelle le dosage présente la précision maximale. Lors du dosage,<br />
on doit donc trouver les dilutions de l’échantillons permettant d’obtenir des valeurs de<br />
concentration compris dans cette zone. (La sensibilité d’un dosage par compétition est définie<br />
de façon plus rigoureuse par la « concentration minimale détectable », c’est à dire la plus<br />
petite concentration d’antigène capable d’induire une diminution statistiquement significative<br />
de la valeur de B0. Expérimentalement, elle est déterminée en calculant la concentration<br />
d’antigène correspondant à B0-3, étant l’écart type estimé sur la mesure de B0).<br />
247
La spécificité d’un dosage peut être évaluée en réalisant des courbes d’étalonnage avec des<br />
substances structuralement et fonctionnellement apparentées. On définit alors le pourcentage<br />
de réaction croisée RC (%) (critère d’Abraham 257 ):<br />
RC (%) =<br />
[Ag]50%<br />
[analogue]<br />
248<br />
50%<br />
x 100<br />
Figure 7. Formule du critère d'Abraham (Abraham, 1974).<br />
[Ag]50% et [analogue]50% représentant respectivement les concentrations d’antigène et<br />
d’analogue qui engendrent un signal de 50 % de B0. La comparaison des valeurs de B/B0 à<br />
50% mesurées pour une série de produits testés dans les mêmes conditions permet d’estimer<br />
l’affinité relative de chacun de ces produits pour les anticorps étudiés.<br />
Dans le cas du dosage de la Rameb, notre limite de détection est de 0.1 ng/mL et le B/B0 50%<br />
correspond à environ 1.5 ng/mL.<br />
La sensibilité d’un dosage dépend de nombreux paramètres et notamment de la concentration<br />
du traceur et de l’Ac. La règle générale est que le dosage sera d’autant plus sensible que<br />
l’anticorps et le traceur sont plus dilués. Cette règle découle du principe de la compétition,<br />
celle-ci s’exerçant plus facilement à l’avantage de l’antigène non marqué, si le traceur est peu<br />
concentré et si la concentration en Ac est limitante. En conséquence, si l’on veut utiliser un<br />
traceur à de très faibles concentrations, il faut que celui-ci possède une activité spécifique telle<br />
qu’à ces concentrations il fournisse encore un signal mesurable. C’est le cas de l’AchE dont la<br />
limite théorique de détection, dans les conditions d’utilisation habituelles (200µL d’Ellman,<br />
trajet optique de 0.44 cm, 1 heure de réaction) est de 1.85 10 -18 mole.<br />
Avec des traceurs aussi performants, c’est presque toujours la stabilité du complexe qui limite<br />
les dilutions que l’on peut faire subir à l’Ac. Même s’il est possible dans certains cas<br />
d’influencer la réponse immunitaire, il faut considérer que l’affinité des Ac produits par un<br />
animal échappe en grande partie à l’expérimentateur. Bien entendu, il n’est pas possible de<br />
diluer indéfiniment traceurs et anticorps et il existe, en théorie pour chaque dosage (un traceur<br />
et un Ac donné) une combinaison idéale qu’il conviendrait de déterminer à chaque fois. En<br />
pratique, on opère souvent de façon plus empirique en fixant arbitrairement la concentration
du traceur et en déterminant ensuite par dilutions successives, la concentration minimale<br />
d’anticorps utilisable. C’est la technique que nous avons utilisée.<br />
Pour chaque échantillon, nous avons évalué la qualité du dosage grâce au critère de<br />
répétabilité ou précision intra-essai, qui exprime la variation des résultats au cours d’une<br />
même analyse et est évaluée en dosant systématiquement sur une même plaque chaque<br />
échantillon à 4 concentrations différentes. Pour être pris en compte les résultats doivent bien<br />
sur se situer dans la zone proche du B/B0 50% (généralement 30% B/B0 70%).<br />
249
ANNEXE V<br />
PRINCIPE <strong>DE</strong> LA RMN DU <strong>DE</strong>UTERIUM<br />
Le deutérium possède un spin égal à 1, c’est donc un noyau quadrupolaire. Son rapport<br />
gyromagnétique est 6 fois plus faible que celui du proton. Ces paramètres vont fortement<br />
affecter les données que l’on peut en déduire et la méthode d’acquisition et de traitement des<br />
spectres.<br />
-Le faible rapport gyromagnétique et la faible abondance naturelle du deutérium<br />
(0,0156 %) rendent impossible l’observation directe des signaux et impose donc de travailler<br />
sur des composés marqués ce qui constitue une première limitation d’un point de vue<br />
économique.<br />
- Le couplage quadrupolaire important (de l’ordre de la centaine de KHz) n’est pas<br />
moyenné à zéro par le mouvement et sera donc présent sur les spectres qui seront répartis sur<br />
de très grandes largeurs spectrales. Nous verrons ultérieurement que l’accès à ce couplage<br />
résiduel est néanmoins très utile pour les systèmes organisés.<br />
- la faiblesse du rapport gyromagnétique implique également que les différences de<br />
déplacements chimiques exprimés en Hertz seront 6 fois plus faibles que les équivalents en<br />
RMN du proton. Ceci peut conduire à des difficultés pour l’attribution des différents<br />
deutérons. Ces difficultés seront contournées par l’utilisation des couplages quadrupolaires.<br />
- En ce qui concerne les processus de relaxation, la situation est très différente de celle<br />
rencontrée pour les noyaux non quadrupolaires. Dans le cas du deutérium, la relaxation par les<br />
processus quadrupolaires sera dominante (en comparaison de celle induite par des voies<br />
dipolaires ou par anisotropie de déplacement chimique) et extrêmement efficace, conduisant à<br />
des valeurs de T1 et surtout de T2 très faibles (inférieures à la milliseconde). Des T2 aussi<br />
faibles conduiront à un signal de très courte durée de vie et à des largeurs de raie importantes<br />
(plusieurs KHz), imposant des conditions d’acquisition et de traitement très particulières afin<br />
de récupérer la totalité du signal.<br />
- La très grande largeur spectrale et la très courte durée de vie du signal requièrent<br />
d’une part des impulsions radio-fréquences très courtes (donc des émetteurs de très forte<br />
puissance) pour exciter totalement et de manière homogène tout le spectre et, d’autre part, des<br />
délais très courts pour réduire les pertes par relaxation. Dans le cas présent les spectres ont été<br />
obtenus par la séquence d’écho quadrupolaire 258 que l’on peut exprimer comme suit<br />
(figure 1) :<br />
250
90° 90°<br />
1<br />
2<br />
251<br />
×<br />
×<br />
×<br />
×<br />
×<br />
×<br />
×<br />
×<br />
Figure 1 : Séquence de l’écho quadrupolaire (ou écho solide)<br />
Les temps 1et 2sont de l'ordre de 40 microsecondes et si on se place dans les conditions<br />
pour lesquelles 2 est inférieur à 1, on peut observer la formation de l’écho. Les points<br />
antérieurs au maximum de l’écho sont éliminés. Le positionnement fin d'un point au sommet<br />
de l'écho s'effectue en variant 2 par de petites fractions de la période d'échantillonage DW.<br />
Avant transformée de Fourier, la partie imaginaire de l’interférogramme est mise à zéro pour<br />
augmenter le rapport signal sur bruit. En raison du caractère non orienté des échantillons, les<br />
spectres obtenus sont des spectres de poudre issus de la somme des spectres individuels<br />
correspondants à toutes les orientations que peut prendre chaque vecteur C-D par rapport au<br />
champ magnétique externe. Le spectre correspondant à celui qui serait obtenu avec un<br />
monocristal ou un échantillon orienté peut être obtenu par déconvolution (de-Paking) selon<br />
les algorithmes décrits dans la littérature 259 .<br />
Paramètres accessibles grâce à la RMN 2 H<br />
L’analyse est en général réalisée sur les spectres déconvolués. Le rapport entre l’écart<br />
quadrupolaire mesuré pour un deutéron donné à celui d’un système rigide (environ 125 KHz)<br />
fournit directement le paramètre d’ordre du segment considéré lié à la mobilité locale. Dans la<br />
suite de cette étude les données seront essentiellement déduites des signaux des méthyles des<br />
DW
chaînes aliphatiques qui présentent le plus grand désordre et sont donc au centre du spectre.<br />
Par simulation des signaux et intégration il est alors possible de déduire les proportions des<br />
différentes phases coexistantes 199 . Le traitement et l'attribution de spectres deutérium sera<br />
illustré sur un exemple particulièrement pédagogique concernant des liposomes<br />
multilamellaires de POPC-d31 ou 1-palmitoléyl-d31,2-oleoyl-glycero-3-phosphatidylcholine<br />
pour laquelle seule la chaîne palmitoyl est totalement deutériée. (figure 2)<br />
POPC-d31<br />
écart quadrupolaire<br />
Fréquence (KHz)<br />
Figure 2 : Spectre RMN du deutérium (a) brut et (b) déconvolué de la POPC-d31<br />
A chaque deutéron de la chaîne, correspond un doublet caractérisé par un écart quadrupolaire<br />
q et centré par rapport à la fréquence porteuse située au centre du spectre. En ce point se<br />
trouve un singulet fin correspondant au signal du deutérium résiduel de l'eau. La superposition<br />
de l’ensemble des doublets conduit au spectre composite représenté figure 17 a. Par<br />
déconvolution de ce spectre, on obtient le spectre représenté figure 17 b, qui permet une<br />
mesure précise de chaque écart quadrupolaire, notamment ceux des groupements CD2 et CD3<br />
localisés en bout de chaîne (positions 9 à 16) qui apparaissent au centre du spectre. Les<br />
252
groupements CD2 proches du glycérol (2 à 8) sont superposés et apparaissent aux bornes du<br />
spectre. Les signaux les plus proches du centre correspondent aux deutérons présentant la plus<br />
grande mobilité donc les écarts quadrupolaires les plus faibles. Ce principe général permet<br />
d'attribuer chaque groupe méthylène ou méthyle de la chaîne deutériée et d'extraire les<br />
paramètres d'ordre.<br />
Pour chaque liaison CD, l’écart quadrupolaire est de la forme :<br />
q <br />
Q SCD<br />
où Q est la constante du couplage quadrupolaire statique (=125 KHz pour les groupes<br />
CD aliphatiques) et SCD, le paramètre d’ordre orientationnel. Dans le cas de liposomes<br />
multilamellaires, SCD contient deux composantes, une d’ordre géométrique, soit l’angle<br />
moyen que fait cette liaison CD avec la normale de la bicouche, et une autre d’ordre<br />
dynamique, qui rend compte de l’amplitude des fluctuations angulaires du vecteur CD. Ce<br />
paramètre d’ordre SCD peut fournir des informations d’ordre macroscopique sur l’organisation<br />
globale de la membrane (phase lamellaires, hexagonales ou cubique, micelles, vésicules…) et<br />
microscopique au niveau de perturbations plus spécifiques du groupement considéré et de son<br />
environnement local.<br />
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271
Résumé :<br />
Depuis plusieurs années, une attention spéciale a été portée sur la synthèse de cyclodextrines<br />
amphiphiles afin de les utiliser comme de nouveaux matériaux supramoléculaires ou pour les insérer<br />
dans des matrices phospholipidiques préformées telles que des liposomes. Dans les deux cas, le but est<br />
de combiner la spécificité de taille de la cavité des CDs pour l’inclusion et la solubilisation de petites<br />
molécules hydrophobes, et les propriétés de transport de structures organisées lipidiques (vésicules,<br />
liposomes, micelles,…). L’objectif est d’obtenir des composés pour le transport et/ou la vectorisation<br />
de composés biologiquement actifs.<br />
Dans un premier temps, une nouvelle famille de CDs amphiphiles a été préparée en greffant un<br />
phospholipide : le 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DMPE) sur une cyclodextrine<br />
méthylée ou non par l’intermédiaire d’un bras espaceur. Les composés obtenus (les phospholipidylcyclodextrines)<br />
ont été entièrement caractérisés par RMN et spectrométrie de masse haute résolution.<br />
Les dérivés méthylés s’auto-organisent spontanément dans l’eau à de faibles CMC pour former des<br />
fibres micellaires fluctuantes. Le pouvoir d’inclusion de la cavité des CDs est préservé au sein de ces<br />
objets supramoléculaires. Les interactions de ces molécules avec les systèmes membranaires ont été<br />
étudiées sous forme de films noirs, par réflectivité de rayons X et par l’évaluation de leur pouvoir<br />
détergent vis-à-vis des membranes modèles de DMPC. La capacité de ces composés à passer la<br />
barrière hémato-encéphalique a été mise en évidence par une nouvelle approche utilisant les dosages<br />
immunoenzymatiques.<br />
Dans un second temps, nous avons synthétisé une autre catégorie de CDs amphiphiles, les<br />
peptidolipidyl-cyclodextrines, mimant les caractéristiques structurales des phospholipidylcyclodextrines<br />
tout en s’affranchissant des contraintes liées à la synthèse et à la stabilité des<br />
phospholipides. Ces composés ont été entièrement caractérisés et leurs propriétés d’organisation ont<br />
été évaluées par des mesures de CMC d’une part, et par l’étude par RMN du deutérium d’une phase<br />
lamellaire mixte peptidolipidyl--CD / DMPC unique et homogène d’autre part. Cette dernière famille<br />
de composés apparaît comme très prometteuse pour la préparation de formulations galéniques à base<br />
de CDs.<br />
Mots clés : cyclodextrines, phospholipides, glycoconjugués, amphiphiles, chimie supramoléculaire,<br />
RMN, applications biologiques.<br />
Abstract :<br />
Since a number of years, special attention and efforts have been made to prepare amphiphilic<br />
cyclodextrins (CDs) with the objective to use them to obtain supramolecular assemblies as such or in<br />
the presence of preformed lipidic structures. The aim of these investigation is in both cases to combine<br />
the size specificity of cyclodextrins for guests and the transport properties of phospholipidic structures.<br />
The final objects could be of importance to transport or target biologically relevant molecules such as<br />
drugs using new galenic formulations. In a first step, a new family of amphiphilic CDs was prepared<br />
from a pure phospholipids (DMPE) onto cyclodextrins or methylated derivatives through a spacing<br />
arm. The afforded compounds (phospholipidyl-cyclodextrins) were fully characterized by high field<br />
NMR and high resolution mass spectrometry. The methylated derivatives were shown to self-organize<br />
in water with low CMC to form fluctuating micellar fibers retaining the inclusion capacity of the<br />
cyclodextrin cavities. The interactions of these compounds with membrane systems were investigated<br />
as black films using X-ray reflectivity and by evaluation of their detergent power towards model<br />
DMPC liposomes. Their ability to cross over the Blood Brain Barrier was evidenced by a new<br />
approach making use of novel immuno-enzymatic assays. In a second step, a new class of amphiphilic<br />
cyclodextrins was considered (peptidolipidyl-cyclodextrins). Although they are structurally similar to<br />
phospholipidyl-CDs, their preparation overcomes the tedious steps of the later and lead to a<br />
considerable versatility in terms of the number of possible molecules to be prepared. Moreover, the<br />
stability problems encountered with phospholipids are avoided. Several examples have been prepared,<br />
fully characterized and their organization properties investigated by the determination of CMC and by<br />
deuterium NMR on a pure and homogeneous mixed peptidolipidyl-CD / DMPC lamellar phase. This<br />
novel class of amphiphilic CDs appears as very promising candidates to develop new galenic<br />
formulations.<br />
Key-words : cyclodextrins, phospholipids, glycoconjugate, amphiphilic, supramolecular chemistry,<br />
NMR, biological applications.