UNIVERSITE DE PICARDIE JULES VERNE THESE ... - iramis - CEA

UNIVERSITE DE PICARDIE JULES VERNE
Faculté des Sciences d’Amiens
Laboratoire des Glucides
THESE DE DOCTORAT
Présentée par
Stéphane MOUTARD
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR
De l’Université de Picardie Jules Verne
RELATION ENTRE LA STRUCTURE
ET LES PROPRIÉTÉS D’ORGANISATION
DE NOUVELLES CYCLODEXTRINES AMPHIPHILES.
Commission d’examen :
P r . A. MARSURA Rapporteur Université Nancy 1
P r . D. PLUSQUELLEC Rapporteur ENSCR
D r . W. LUTEN Technologie SERVIER
P r . G. DEMAILLY UPJV
D r . P. GOD UPJV
P r . E. MONFLIER Membre invité Université D’Artois
P r . F. DJEDAÏNI-PILARD Directeur de Thèse UPJV
D r . B. PERLY Responsable CEA CEA Saclay

A mes parents
Amasÿur
ALaure

REMERCIEMENTS
Ce travail a été effectué au Commissariat à l’Energie Atomique, dans le cadre d’un contrat
CFR. Je remercie Monsieur Jean-Claude PETIT, Chef du Service de Chimie Moléculaire
(DRECAM / DSM, CEA Saclay) de m’avoir accueilli au sein de ce service et de m’avoir
permis de profiter d’excellentes conditions de travail.
Cette thèse a été réalisée sous la direction de Madame Florence DJEDAÏNI-PILARD,
Directrice du Laboratoire des Glucides à l’Université de Picardie Jules Verne (UPJV). Je
tiens à lui exprimer ma profonde reconnaissance pour la confiance et l’amitié qu’elle m’a
toujours témoignées. Ce travail n’aurait pas pu être ce qu’il est sans sa compétence, son
soutien scientifique et sa disponibilité. Qu’elle soit ici assurée de ma profonde amitié.
Je suis également infiniment reconnaissant à Monsieur Bruno PERLY, responsable du
Laboratoire de Chimie Bio-Organique des Molécules Cages, de m’avoir accueilli dans son
laboratoire et de m’avoir encadré tout au long de ce travail auquel je tiens à l’associer. A
travers nos nombreuses discussions scientifiques, il m’a fait partager ses grandes
connaissances et son enthousiasme pour la recherche. Je le remercie pour son amitié, son
aide et sa disponibilité. Qu’il soit également assuré de ma profonde amitié.
Monsieur Alain MARSURA, Professeur à l’Université Henry Poincaré (Nancy I) et Monsieur
Daniel PLUSQUELLEC, Directeur de l’Ecole Nationale Supérieure de Chimie de Rennes,
ont accepté d’être les rapporteurs scientifiques de ce travail. Qu’ils en soient vivement
remerciés.
Je remercie sincèrement Monsieur Gilles DEMAILLY, Président de l’UPJV pour l’honneur
qu’il m’a fait en acceptant de présider le jury de cette thèse.
Je remercie également Messieurs Wim LUIJTEN, Responsable du Département d’Analyse
Structurale à Technologie SERVIER, Eric MONFLIER, Professeur à l’Université d’Artois, et
Paul GODE, Maître de Conférence à l’UPJV, pour avoir accepté de faire partie de la
Commission d’Examen.
Je tiens à remercier tout particulièrement mes deux compagnons de route, Monsieur Jean-
Pierre DALBIEZ et Mademoiselle Sandrine WEISSE. Leur amitié, leur soutien
inconditionnel, et leur bonne humeur permanente ont été pour moi une source de motivation
permanente. Chaque jour passé en leur compagnie fut un réel plaisir. Merci Jean-Pierre, Ô
grand Purificateur, d’avoir mis tes compétences chromatographiques à mon service.

Merci à Madame Cécile BAUDIN, Monsieur Christophe FAJOLLES et Monsieur Laurent
MAUCLAIRE qui m’ont accompagnés durant toutes ces années et ont rendu mon séjour
agréable au sein du laboratoire.
Ce travail est le fruit d’une collaboration interdisciplinaire entre de nombreuses équipes qui
ont contribuées de manière importante aux résultats obtenus. Un grand merci à :
Madame Sophie MEUDAL et Monsieur Serge PILARD pour la spectrométrie de masse.
Monsieur Paul GODE pour les mesures de tension de surface.
Monsieur Sylvain DESERT pour la diffusion de la lumière.
Mademoiselle Caroline SULTANEM et Monsieur Jean-Jacques BENATTAR pour les études
de films noirs par rayons X.
Monsieur Sébastien TILLOY et Monsieur Eric MONFLIER pour les études de passage à
travers la Barrière Hémato-Encéphalique.
Madame Marie-Claire NEVERS et Monsieur Christophe CREMINON pour les dosages
immuno-enzymatiques.
Monsieur Michel ROUX, alias “Aldo”, pour les études par RMN du deutérium.
La RMN a été réalisée au Laboratoire Commun de RMN. Je remercie sincèrement Messieurs
Patrick BERTHAULT, Hervé DESVAUX, Gaspar HUBERT et Dominique LE PARC pour
leurs nombreux conseils techniques toujours judicieux, leur disponibilité et leur gentillesse.
Merci à Hélène MOREL, Stéphanie PEDINIELLI et Nathalie THROMAT pour leur
gentillesse et pour leur efficacité à régler tous mes problèmes administratifs.
Merci à Christophe, Rachel, Frédéric, Muriel, Florie, Paco, Séverine, Quitterie, Dorothée,
Philippe, Sophie, Alexandre, Delphine O., Delphine F., Souleymane, Lauriane, Fabienne,
Gwénaëlle et tous les autres stagiaires que j’ai eu la chance de côtoyer plus ou moins
longtemps. Leur sympathie et leur bonne humeur ont apporté un rayon de soleil dans le
Laboratoire. Mention spéciale à Christophe et Sandrine pour nos soirées inoubliables.
Enfin, un très grand merci à ma famille et à mes amis pour m’avoir apporté un soutien sans
faille. Merci à Laure d’avoir toujours été à mes côtés, même dans les moments difficiles, et
d’avoir supporté ma mauvaise humeur.

TABLE DES MATIERES
Liste des abréviations V
INTRODUCTION GENERALE 1
PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE 5
1 ère Partie : PRESENTATION GENERALE DES CYCLODEXTRINES 6
I. Historique 6
II. Caractéristiques structurales et physico-chimiques 7
III. Complexes d’inclusion 10
IV. Applications actuelles et futures 12
2 ème Partie : MODIFICATION SELECTIVE DES CYCLODEXTRINES 14
I. Introduction 14
I.1. Les facteurs qui influencent la sélectivité 15
I.2. Les problèmes liés à la structure de la CD 16
I.3. Les CDs modifiées : présentation générale 18
II. Les persubstitutions 19
II.1. Persubstitution par voie directe 19
II.2. Méthode longue : utilisation de groupements de protection 24
III. Les monosubstitutions 27
III.1. Monosubstitution d’un des hydroxyles en position 6 27
III.2. Monosubstitution de la face secondaire 30
IV. Polysubstitutions 33
IV.1. Disubstitution 33
IV.2. Polysubstitution d’ordre supérieure à 2 34
V. Conclusion 35
I

3 ème Partie : LES CYCLODEXTRINES AMPHIPHILES 36
I. Présentation des cyclodextrines amphiphiles 36
II. Relation entre structure et propriétés physico-chimiques des
cyclodextrines amphiphiles 46
II.1. Influence du degré de substitution 46
II.2. Influence de la nature du substituant 46
II.3. Influence de la nature de la CD 47
II.4. Conclusion 47
RESULTATS ET DISCUSSION 48
1 ère Partie : LES PHOSPHOLIPIDYL-CYCLODEXTRINES 49
I. Introduction 49
II. Synthèse des phospholipidyl-cyclodextrines 50
II.1. Stratégie de synthèse 50
II.2. Synthèse des dérivés CD-espaceur 54
II.3. Etape de couplage entre CD-espaceur et DMPE 57
III. Caractérisation structurale des phospholipidyl-cyclodextrines 65
III.1. Analyse structurale des composés par RMN haut champ 65
III.2. Identification exacte des produits grâce à la spectrométrie de masse
basse et haute résolution 77
III.3. Conclusion 81
IV. Propriétés d’organisation en milieu aqueux des phospholipidylcyclodextrines
méthylées 82
IV.1. Etude RMN 1 H dans l’eau 82
IV.2. Détermination de la CMC par mesures de tension de surface 84
IV.3. Caractérisation des systèmes organisés par diffusion de la lumière 88
IV.4. Conclusion 97
V. Propriétés d’inclusion des phospholipidyl-CDs 98
V.1. Etude par RMN des complexes d’inclusion dans les cyclodextrines 98
V.2. Résultats et discussion 106
V.3. Conclusion 115
II

VI. Comportement des phospholipidyl-cyclodextrines méthylées
dans des systèmes de type membranaire 116
VI.1. Les films noirs : modèle de membrane inversée de phospholipidylcyclodextrines
116
VI.2. Systèmes mixtes DMPC / TRIMEB-Succ-DMPE 14 : mise en évidence
des propriétés détergentes des phospholipidyl-CDs 128
VI.3. Conclusion 136
VII. Etude in vitro des propriétés de passage des phospholipidylcyclodextrines
à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE) 137
VII.1. Introduction 137
VII.2. Etude du passage à travers la BHE 139
VII.3. Résultats et discussion 140
VII.4. Conclusion 145
VIII. Conclusion de la 1 ère partie 147
2 ème PARTIE : LES PEPTIDOLIPIDYL-CYCLODEXTRINES 148
I. Introduction 148
II. Synthèse et caractérisation structurale des peptidolipidylcyclodextrines
149
II.1. Stratégie de synthèse 149
II.2. Préparation des synthons 155
II.3. Couplage avec les cyclodextrines 159
II.4. Caractérisation des peptidolipidyl-cyclodextrines 161
II.5. Conclusion 165
III. Propriétés d’organisation des peptidolipidyl-cyclodextrines 166
III.1. Propriétés d’auto-organisation dans l’eau : mesures de CMC 166
III.2. Insertion des peptidolipidyl-CDs dans des membranes lipidiques
modèles de DMPC : étude par RMN 2 H 167
IV. Conclusion de la 2 ème partie 173
CONCLUSION GENERALE 174
III

PARTIE EXPERIMENTALE 179
I. Matériels et méthodes 180
II. Synthèses 187
ANNEXES 229
Annexe 1 : Liste de spécialités pharmaceutiques commercialisées
contenant des cyclodextrines 230
Annexe 2 : Détermination de la stoechiométrie d’un complexe soluble
CD / “molécule invitée” par la méthode des variations
continues ou méthode de JOB 233
Annexe 3 : Détermination de la constante d’association d’un complexe
1:1 par la méthode de BENESI-HILDEBRAND 235
Annexe 4 : Dosages immunoenzymatiques 237
Annexe 5 : Principe de la RMN du deutérium 250
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 254
IV

LISTE DES ABREVIATIONS
ADC : Anisotropie de Déplacement Chimique
BAM : Brewster Angle Microscopy
BHL : Balance Hydrophile - Lipophile
CCM : Chromatographie sur Couche Mince
CD(s) : Cyclodextrine(s)
CID : Collision Induced Dissociation
CMC : Concentration Micellaire Critique
CPG : Chromatographie en Phase Gazeuse
COSY : COrrelation SpectroscopY
DEDL : Détecteur Evaporatif à Diffusion de Lumière
DEPT : Distorsionless Enhancement by Polarisation Transfert
DIBAL : Diisobutylaluminium (hydrure de)
DIC : N,N’-diisopropylcarbodiimide
DIMEB : 2,6-di-O-méthyl--cyclodextrine
DLS : Dynamic Light Scattering
DMAP : 4-(diméthylamino)pyridine
DMF : N,N’-diméthylformamide
DMPC : 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine
(ou 1,2-ditétradecanoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine)
DMPE : 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidyléthanolamine
(ou 1,2-ditétradecanoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine)
DMSO : Dimétylsulfoxyde
dp : degré de polymérisation
ESI : Electrospray Ionisation
FAB : Fast Atom Bombardment
FMOC: 9-fluorenylméthoxycarbonyle
HMBC : Heteronuclear Multiple Bound Correlation
HMQC : Heteronuclear Multiple Quantum Correlation
HOBT : N-hydroxybenzotriazole
HPLC : High Performance Liquid Chromatography
HRMS : High Resolution Mass Spectrometry
IRTF : Infra-Rouge à Transformée de Fourrier
LB : Langmuir-Blodgett
MALDI : Mass spectrometry with laser desorption and ionisation
MLV : Mutilamellar Large Vesicle (liposome)
MS / MS : Spectrométrie de masse en tandem
NHS : N-hydroxysuccinimide
POPC: 1-palmitoléyl-2-oléoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine
NOESY : Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY
QELS : Quasi-Elastic Light Scattering
RMN : Résonance Magnétique Nucléaire
ROESY : Rotating frame Overhauser Effect SpectroscopY
RX : Rayons X
SE : Substitution Electrophile
SLS : Static Light Scattering
SUV : Small Unilamellar Vesicle
TA : Température Ambiante
TBDMS : tert-butyldiméthylsilyle
TEM : Transmission Electronic Microscopy
TMS : Triméthylsilyle
TOCSY: TOtal Correlation SpectroscopY
TOF : Time Of Flight
TRIMEB : 2,3,6-tri-O-méthyl--cyclodextrine
TsCl : Chlorure de p-toluènesulfonyle
UV : Ultraviolet
V

L’administration des médicaments dans l’organisme est effectuée le plus souvent soit par voie
orale, soit par voie parentérale.
Dans le cas d’une administration par voie orale, une perte plus ou moins significative de
l’activité du principe actif est fréquemment observée. En fait, ceci est dû soit à une destruction
partielle du principe actif à travers l’appareil gastro-intestinal, soit à une absorption partielle
car la fenêtre d’absorption est trop étroite.
Dans le cas d’une administration par voie parentérale, le médicament est directement ou
indirectement délivré dans le système sanguin, d’où il peut atteindre son site d’activité.
L’inconvénient de cette méthode réside dans le fait que le principe actif va également
imprégner d’autres organes ou tissus, et provoquer des effets secondaires indésirables,
particulièrement toxiques dans le cas de médicaments tels que des produits antimitotiques. De
tels effets peuvent également être observés par voie orale.
Depuis ces vingt ou trente dernières années, une nouvelle technologie est apparue, qui
consiste à vectoriser les médicaments vers leur site d’absorption, ou encore mieux, vers leur
site d’activité. Dans cette optique, de nouveaux systèmes destinés à la délivrance des
principes actifs ont été mis au point : les liposomes, les nano et microparticules,…
Un des problèmes principaux rencontré avec ces systèmes vésiculaires apparaît durant leur
préparation, et résulte de la faible solubilité dans l’eau des principes actifs, conduisant soit à
un mauvais rendement de chargement, soit à un relargage faible et incomplet du principe actif
dans ces systèmes.
Pour surmonter ces inconvénients, plusieurs auteurs ont proposé l’utilisation des
cyclodextrines (CDs). En effet, les CDs naturelles et modifiées ont la très grande propriété de
solubiliser les principes actifs hydrophobes. Toutefois, au contraire des systèmes vésiculaires,
leur surface externe hydrophile ne leur permet pas d’entrer intimement en contact avec les
membranes biologiques.
Depuis plusieurs années, une attention spéciale a donc été portée sur la synthèse de
cyclodextrines amphiphiles dans le but de les utiliser comme de nouveaux composés pour la
préparation de nouveaux matériaux supramoléculaires (nanoparticules par exemple) ou pour
les insérer dans des membranes phospholipidiques préformées telles que des liposomes. Dans
les deux cas, le principal objectif est de combiner la spécificité de taille de la cavité des CDs
pour des molécules invitées hydrophobes aux propriétés de transport de structures lipidiques
organisées.
2

La littérature traitant de la synthèse de dérivés amphiphiles de cyclodextrines met en lumière
les propriétés de tels composés. Des CDs amphiphiles portant de multiples chaînes
hydrophobes sur la face primaire, sur la face secondaire ou sur les deux faces ont été
largement étudiées. Une autre classe de CDs amphiphiles a été préparée en greffant un seul
groupement hydrophobe (chaîne aliphatique ou stéroïde) sur la face primaire des macrocycles.
Les dérivés polysubstitués forment des systèmes organisés insolubles dans l’eau tels que des
couches de Langmuir-Blodgett. Certains sont utilisés dans la préparation de nanoparticules ou
insérés dans des matrices phospholipidiques préformées. Généralement, les cavités des CDs
ne sont pas accessibles à cause du grand nombre de substituants greffés sur la CD. Les
propriétés des dérivés monosubstitués dépendent fortement de la nature de l’adduit, et de
l’effet de méthylation de la partie CD. Ainsi, les propriétés des cholestéryl-CDs ont été
étudiées en détail, en l’absence et en présence d’une matrice phospholipidique modèle, par
RMN ( 1 H, 2 H, 31 P) et par des techniques de diffusion (diffusion de la lumière, de rayons X, de
neutrons). Il a été montré que ces molécules pouvaient soit s’auto-organiser en micelles, soit
former des films en bicouches mixtes avec les phospholipides, ou bien encore s’insérer dans
les membranes pour former des liposomes mixtes, en fonction des modulations structurales de
la molécule. Il a également été prouvé que la cavité des CDs conservait sa capacité
d’inclusion dans les systèmes organisés. De petites modifications de la structure (présence ou
absence de bras espaceur, taille de la CD, méthylation ou non des groupements hydroxyles)
influencent énormément les propriétés d’organisation. Cet aspect sera développé dans la
partie bibliographique.
La première partie de nos travaux portera sur la synthèse d’une nouvelle famille de
cyclodextrines amphiphiles. Dans cette approche, le stéroïde sera remplacé par un
phospholipide (la 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidyléthanolamine, DMPE) afin de
mimer au plus près les membranes naturelles. Le premier objectif de cette étude consistera à
synthétiser une série raisonnée de glycolipides, nommés phospholipidyl-cyclodextrines, en
greffant la DMPE sur une cyclodextrine dont nous ferons varier le degré de méthylation. La
structure de ces molécules sera entièrement caractérisée par RMN haut champ et par
spectrométrie de masse haute résolution.
Le comportement de ces composés en milieu aqueux sera étudié par différentes techniques
physico-chimiques complémentaires. Les phénomènes d’auto-association des phospholipidyl-
CDs dans l’eau seront mis en évidence par RMN 1 H et par des mesures de tension de surface.
3

Des expériences de diffusion dynamique et statique de la lumière nous renseigneront sur la
forme et la taille de ces assemblages supramoléculaires.
La capacité des cavités macrocycliques des phospholipidyl-CDs à inclure une molécule
invitée modèle (le 4-tertbutylbenzoate de sodium) dans les systèmes organisés dans l’eau,
sera démontrée par des expériences de RMN 1 H.
Nous regarderons par la suite les remarquables propriétés des phospholipidyl-cyclodextrines à
former des bicouches lipidiques grâce à la formation de films noirs, en collaboration avec le
D r J.-J. Benattar du Service de Physique de l’Etat Condensé (DSM / DRECAM, CEA Saclay).
La structure de ces films sera étudiée par réflectivité de rayons X aux incidences rasantes.
Leurs propriétés détergentes vis-à-vis de membranes phospholipidiques modèles (liposomes
de DMPC) seront évaluées par RMN du phosphore-31.
Pour mettre en application les propriétés des phospholipidyl-CDs, nous testerons leur capacité
à traverser la barrière hémato-encéphalique à partir d’un modèle in-vitro. Le suivi du passage
sera réalisé grâce à des méthodes de dosages immuno-enzymatiques. Cette étude sera réalisée
en collaboration avec le Laboratoire Mixte Institut Pasteur-Université d’Artois (Faculté Jean
Perrin, LENS) dirigé par le P r E. Monflier et le Laboratoire du D r Créminon, du Service de
Pharmacologie et d’Immunologie (DRM / DSV, CEA Saclay).
Dans une deuxième partie, nous traiterons de la synthèse d’une nouvelle famille de CDs
amphiphiles, conçues de façon à mimer les principales caractéristiques structurales des
phospholipidyl-CDs, tout en s’affranchissant des problèmes de stabilité chimique de ces
dernières. Ces glycopeptidolipides, nommés peptidolipidyl-cyclodextrines, seront
caractérisés par RMN et spectrométrie de masse. Leurs propriétés d’auto-organisation dans
l’eau seront évaluées par des mesures de tension de surface. Enfin, leur aptitude à former des
phases mixtes de bicouches lipidiques sera mise en évidence par RMN du deutérium en
collaboration avec le D r M. Roux, Chargé de Recherches CNRS, URA CNRS 2096, Section
de Biophysique des Protéines et des Membranes (DBCM / DSV, CEA Saclay).
4

PREMIERE PARTIE
PRESENTATION GENERALE DES CYCLODEXTRINES 1
I. Historique
L’histoire des cyclodextrines (CDs) commence il y a un peu plus de 100 ans, en 1891.
Villiers 2 isole 3 g d’une substance cristalline à partir de la digestion bactériologique de 1000 g
d’amidon. Il détermine la composition de cette substance comme étant (C6H10O5)2,3H2O et la
nomme “cellulosine” car ses propriétés se rapprochent de celles de la cellulose (résistance à
l’hydrolyse acide, propriétés non réductrices). Il observe également l’existence de deux
formes cristallines distinctes correspondant probablement à l’-CD et à la -CD.
Ce n’est que 20 ans plus tard que Shardinger isole la souche microbienne Bacillus
macerans 3,4 , responsable de la formation de ces dextrines cristallisées (les dextrines désignent
l’ensemble des produits de dégradation). Il distingue deux produits cristallins différents, la
“dextrine cristallisée” et la “dextrine cristallisée”, par leurs capacités à former avec les
molécules de diiode des adduits particuliers, de couleurs respectives différentes 5 .
Au début des années 30, l’équipe de Pringsheim, bien que se basant sur des études pouvant
être discutées, découvre la capacité de ces dextrines à former des complexes avec divers
composés organiques 6,7 .
Ce n’est qu’en 1936, que Freudenberg et coll. arrivent à la conclusion que les “dextrines de
Shardinger” sont des oligosaccharides constitués d’un enchaînement d’unités maltoses liées
par des liaisons (14) glycosidiques, et postulent que ces produits sont cycliques 8 . La
structure et la masse moléculaire de l’-CD et de la -CD sont déterminées par French et
Rundle en 1942 alors que la -CD est découverte et sa structure élucidée à la fin des
années 40 9 .
Au début des années 50, les propriétés d’inclusion des CDs sont étudiées de manière intensive
par Cramer et coll. 10 . En 1953, un premier brevet sur l’application des CDs dans la
formulation de composés à visée biologique est déposé par Freudenberg, Cramer et
Plieninger 11 .
A partir des années 70, et après plusieurs études prouvant qu’il n’y a pas de toxicité inhérente
à la CD empêchant son utilisation, les CDs sont produites et utilisées dans l’industrie.
6

Aujourd’hui, la production de -CD est supérieure à 1000 T/an et son prix continue de baisser
(quelques $ par kilogramme). D’autres CDs naturelles ou modifiées sont produites
industriellement. Enfin, le nombre de publications n’a cessé d’augmenter de façon
exponentielle au cours du XX ème siècle. CD-NEWS a recensé plus de 20000 publications
parues entre 1985 et fin 2002 12 .
II. Caractéristiques structurales et physico-chimiques
n = 1 -cyclodextrine
n = 2 -cyclodextrine
n = 3 -cyclodextrine
Figure 1 : Formule développée générale des cyclodextrines et représentation schématique de leur
structure tridimensionnelle.
Les cyclodextrines sont des oligosaccharides cycliques non réducteurs, obtenues
industriellement par la dégradation enzymatique de l’amylose (forme linéaire de l’amidon) à
l’aide d’une enzyme, la cyclodextrine glucosyltransférase (CGTase), d’origine bactérienne
(Bacillus macerans, Alkalophylic bacillus,…). Les trois CDs les plus fréquemment
rencontrées sont l’-, la - et la -CD constituées respectivement de 6, 7 et 8 sous unités
D-glucopyranosiques, liées entre elles par des liaisons glycosidiques (14) (figure 1). Il
existe des CDs de plus grandes tailles (-CD, -CD… respectivement constituées de 9, 10…
unités) et de taille plus petite (la cyclo-(14)-glucopentaoside) qui ont été isolées ou
totalement synthétisées. Différentes nomenclatures sont utilisées dans la littérature pour
7

l’appellation des CDs (la -cyclodextrine se trouve par exemple sous le nom de -dextrin de
Shardinger, cyclomaltoheptaose, cycloheptaglucan, cycloheptaamylose, -CD, BCD ou C7A).
Nous utiliserons le terme de -CD.
Les CDs ont une structure tridimensionnelle en forme de cylindre conique (ou en forme de
donuts pour les gourmands) dont la paroi est constituée par les unités glucoses, en
conformation chaise 4 C1 13,14 (figure 2).
Figure 2 : Structures tridimensionnelles des cyclodextrines naturelles (-, -, et -CD de gauche à droite),
avec de haut en bas : une vue de la face des hydroxyles secondaires (“grand côté”), une vue latérale, et une
vue de la face des hydroxyles primaires (“petit côté”). En bas, les dimensions respectives des CD’s
obtenues d’après les données cristallographiques.
Tous les hydroxyles secondaires (OH-2, OH-3) sont situés sur le côté le plus grand du tronc
conique alors que les hydroxyles primaires (OH-6) sont localisés sur le petit côté. La présence
de ces groupements hydroxyles sur les deux bords de la couronne confère à la partie
extérieure de la CD un caractère hydrophile (surface en contact avec le solvant), alors que
l’intérieur de la cavité, tapissée d’atomes d’hydrogène (H-3, H-5, H-6) et de l’oxygène
8

inter-glycosidique (O-4), est hydrophobe (surface en contact avec la molécule invitée). De
plus, les paires d’électrons non liantes des oxygènes inter-glycosidiques sont dirigées vers
l’intérieur de la cavité, y produisant une densité électronique élevée et conférant à la cavité un
caractère de Base de Lewis.
La structure des CDs est stabilisée par une véritable ceinture de liaisons hydrogène inter-
résidus entre les OH-2 d’une unité glucose et les OH-3 de l’unité voisine. Dans le cas de la -
CD, cette ceinture de liaisons hydrogène rend sa structure très rigide et peut justifier de sa
faible solubilité dans l’eau par rapport aux autres CDs. Par contre, elle n’empêche pas la
déformation de la cavité de la -CD. Cette déformation va en s’accentuant avec les CDs dont
le nombre d’unités glucose est supérieur à 8 et agit de façon défavorable sur leur propriétés
d’inclusion.
Les principales caractéristiques structurales et physico-chimiques de l’-, la - et la -CD
sont reportées dans le tableau ci-dessous (tableau 1) :
Tableau 1 : Caractéristiques physico-chimiques des principales CDs
-CD -CD -CD
Nombre d’unités glucoses 6 7 8
Formule brute C36H60O30 C42H70O35 C48H80O40
MM (g.mol -1 ) 972 1135 1297
Solubilité dans l’eau (g.L -1 ) 145 18,5 232
[]D 25 °C (H20, c 1) + 150° 0,5 + 162,5° 0,5 + 177,4° 0,5
Ø cavité (Å)
(petit côté – grand côté)
4,3 – 5,3 6,0 – 6,5 7,5 – 8,3
Hauteur du tore (Å) 7,9 0,1 7,9 0,1 7,9 0,1
Volume approx. cavité (Å 3 ) 174 262 427
Nombre moyen de molécules
d’eau
6 - 8 12 13
9

Les cyclodextrines sont entourées de molécules d’eau d’hydratation qui sont relativement
labiles et peuvent être éliminées par séchage, et de molécules d’eau d’inclusion dans la cavité
qui ne peuvent être que remplacées, mais non éliminées.
Le caractère amphiphile des CDs, lié à leur structure spatiale, leur confère leur propriété
majeure : celle de former des complexes supramoléculaires en solution aqueuse avec une ou
des molécules invitées hydrophobes.
III. Complexes d’inclusion
La cavité apolaire de la CD est occupée par des molécules d’eau, énergétiquement
défavorables (interactions polaire – apolaire). Ces molécules d’eau pourront donc être
facilement substituées par une “molécule invitée” appropriée, moins polaire que l’eau.
Les complexes formés entre la (les) cyclodextrine(s) “hôte(s)” et la (les) molécule(s)
“invitée(s)” peuvent être de plusieurs types 15 (figure 3) : on distingue les complexes
d’inclusion (a-f) et les complexes d’association (g).
Figure 3 : Diverses structures en solution aqueuse de complexes cyclodextrines-invités décrits dans la
littérature (d’après Wenz, 1994) ; a) inclusion complète ; b) inclusion "axiale" ; c) inclusion partielle ;
d) complexe 2:1; e) complexe 1:2; f) complexe 2:2; g) complexe "non-spécifique".
Le plus fréquemment, il s’agit de complexes d’inclusion de type 1:1. En solution, le complexe
étant régi par des forces d’interactions faibles, un équilibre s’établit entre les formes
dissociées et associées. Cet équilibre thermodynamique s’exprime par une constante
10

d’association Ka. Dans le cas d’une CD et d’une molécule invitée A, on peut écrire les
relations suivantes :
CD + A CD.A
Ka : 1)
(1
11
[CD.A]
[CD] [A]
Les complexes d’inclusion peuvent parfois être isolés comme des substances cristallines
stables.
De nombreuses techniques d’analyses physico-chimiques, telles que la spectroscopie
UV-visible, la spectroscopie de fluorescence, l’analyse cristallographique, la spectroscopie
RMN, la spectrométrie de masse ou bien encore des méthodes d’analyses électrochimiques,
permettent de mettre en évidence, de caractériser et de déterminer les constantes d’association
de ces complexes 16,17,18,19,20 .
La formation d’un complexe d’inclusion entre une CD et une molécule invitée confère à ce
complexe des propriétés physico-chimiques et biologiques différentes de celles de la CD et de
la molécule incluse prises séparément :
Modification de la solubilité dans l’eau ;
Modification des propriétés spectrales ;
Modification de la réactivité chimique due à la molécule hôte (protection à
l’oxydation, réduction chirale, Diels-Alder,…) et à la molécule invitée (orientation de
la régiosélectivité) ;
Diminution de la diffusion et de la volatilité (dans le cas de substances volatiles) ;
Modification des propriétés chirales ;
Modification des propriétés biologiques (par exemple, le caractère hémolytique).
L’exploitation des capacités d’inclusion et la biocompatibilité des CDs ont entraîné un
accroissement du nombre et de la diversité des applications scientifiques et industrielles.

IV. Applications actuelles et futures
C’est cette propriété remarquable qu’ont les CDs de complexer en milieu aqueux un panel
impressionnant de molécules hôtes qui fait que l’on trouve dans la littérature de nombreux
domaines d’application dans la formulation de composés actifs 21,22,23 .
Dans l’industrie, les propriétés des CDs sont largement exploitées dans le milieu
pharmaceutique 24,25 . Une liste des spécialités pharmaceutiques commercialisées est reportée
dans un tableau en annexe (Annexe I, M. Skiba, 2003).
Les principales CDs utilisées à l’heure actuelle par l’industrie pharmaceutique sont des -CD
normales ou modifiées. On trouve quelques exemples avec l’-CD et la -CD. La plupart des
médicaments à base de CDs sont administrés par voie orale (tablettes, dragées, sirops,…).
Cependant, on remarque que toutes les spécialités administrées par voie nasale ou oculaire
utilisent des CDs modifiées (Me--CD, HP--CD). Ces systèmes d’absorption font appel à
des mécanismes de passage transmembranaire. Ces mécanismes sont sans doute facilités par
le caractère amphiphile que confèrent les groupements alkyles greffés sur les CDs employées.
Beaucoup de ces médicaments sont utilisés comme anti-inflammatoires (Piroxicam), mais on
trouve d’autres applications. Le marché des CDs est un marché mondial : les entreprises
pharmaceutiques qui commercialisent ces produits sont européennes (Servier, Novartis, Fabre
(France), Betafarm (Allemagne), Pfizer (Suède),…), américaines (CTD, NCI,…), japonaises
(Takeda, Ono,…) et sud-américaines (Aché (Brésil), Gador (Argentine)).
Il existe également beaucoup d’applications dans les domaines de l’agroalimentaire, de la
cosmétique, des détergents et aussi du textile 26 . Actuellement, les applications des CDs dans
la formulation des pesticides restent encore modestes car l’industrie des pesticides est très
sensible au coût des matières premières. Toutefois, une baisse rapide des coûts de production
de la -CD pourrait rapidement changer la donne dans ce secteur d’activité.
Les applications industrielles faisant appel aux CDs représentent un marché en plein essor. Il
suffit de voir le très grand nombre de brevets nationaux et internationaux déposés ces
dernières années, couvrant l’exploitation de ces applications. Dans ce domaine, le Japon est
un exemple significatif 27 .
Dans les domaines plus fondamentaux et technologiques, les CDs trouvent aussi de
nombreuses applications. En chimie analytique, les CDs ont un potentiel incroyable pour la
12

séparation chirale (HPLC, Electrophorèse capillaire) 28,29 . Elles sont aussi des catalyseurs
chimiques efficaces 30,31,32 et sont utilisées dans la conception d’enzymes artificielles 33,34,35 .
Enfin, les applications des CDs dans les industries chimiques et biotechnologiques sont
également en expansion 36,37 .
13

DEUXIEME PARTIE
MODIFICATION SELECTIVE DES CYCLODEXTRINES 38
I. Introduction
La modification chimique des cyclodextrines offre à la fois d’énormes opportunités et de réels
défis pour les chimistes. La modification des CDs peut en effet permettre d’améliorer leurs
propriétés physico-chimiques (e.g. augmenter leur solubilité dans un solvant donné) et/ou le
pouvoir de complexation de leur cavité avec une molécule hôte. C’est également un moyen de
créer des molécules originales avec des fonctions spécifiques, trouvant des applications
variées au-delà des frontières de la chimie classique (e.g. une activité catalytique de type
enzymatique, des propriétés de vectorisation). Le défi qui est posé aux chimistes est celui de
développer des méthodes efficaces pour modifier de manière sélective les nombreuses
fonctions hydroxyles portées par les CDs (figure 4).
n = 1 -cyclodextrine
n = 2 -cyclodextrine
n = 3 -cyclodextrine
1
2
3
4
5
14
SE + , en présence
d’une base faible,
sans inclusion
Réaction anionique
avec une base forte
en présence d’un E + ,
sans inclusion
formation d’un complexe
d’inclusion entre l’E + et
la CD
Position 2 protégée,
puis 1
Position 6 protégée
Puis 1
CD modifiées en -6
CD modifiées en -2
CD modifiées en -2, -3 ou -6
(ou un mélange des 3)
CD modifiées en -6
CD modifiées en -3 ou en -2
Figure 4 : Présentation générale des méthodes de modification chimiques des CDs

I.1. Les facteurs qui influencent la sélectivité
Des facteurs, propres à la nature structurale des CDs, sont susceptibles d’influencer la
sélectivité de ces modifications, les principaux étant la différence de nucléophilie des
groupements hydroxyles et la capacité des CDs à former des complexes avec les réactifs et
solvants utilisés :
Réactivité des hydroxyles :
Les cyclodextrines possèdent trois types de fonctions hydroxyles situées sur les positions 2, 3
et 6 des unités glucoses (figure 5). Seules ces trois positions peuvent être modifiées car les
positions 1 et 4 des glucoses forment les liaisons inter-glycosidiques de la molécule cyclique.
La méthodologie développée sur les monosaccharides est difficilement transposable aux CDs,
car il n’y a pas de chimie d’anomère dans notre cas.
Position 6
HO
4
Position 3
6
O HO
5
3
O
15
O
H
1
O
O
H
4
3
6
5
OH
2
Position 2
Figure 5 : Localisation des hydroxyles sur une des unité -D-glucopyranose de la cyclodextrine
Les hydroxyles en 6 sont des hydroxyles primaires, plus réactifs que les hydroxyles
secondaires en position 2 et 3. De plus, ceux de la position 6 sont aussi les plus basiques, les
plus accessibles et souvent les plus nucléophiles. Ceux de la position 2 sont les plus acides et
ceux de la position 3 les plus inaccessibles et de loin les moins réactifs, d’autant plus que la
couronne d’hydroxyles secondaires est encombrée, moins flexible et rigidifiée par la ceinture
de liaisons hydrogène 39,40 . De plus, la réactivité est souvent modifiée lors de persubstitutions,
en raison de problèmes d’encombrement stérique dus à la structure tridimensionnelle cyclique
de la CD.
O
OH
1
O

Influence de la nature des réactifs :
Un réactif électrophile privilégiera les positions primaires en 6 41 . Toutefois, il est important
de noter qu’un réactif “trop efficace” ne réagira pas seulement avec les hydroxyles en 6 mais
aussi avec ceux de la position 2 42 . Pour être très sélectif, il vaut mieux choisir un réactif avec
une réactivité modérée.
Les hydroxyles situés sur la position 2 sont les plus acides et donc les premiers à être
déprotonés. Les alcoolates formés sont alors plus nucléophiles que les hydroxyles primaires
en 6. Une base forte permettra donc une meilleure sélectivité en 2 43 sans toutefois éliminer
totalement une substitution en 2 et 6, conduisant à des mélanges complexes.
Influence de la cavité et du solvant :
La capacité des cyclodextrines à former des complexes peut jouer un rôle important dans la
sélectivité et affecter la chimie classique des groupes hydroxyles. Si un réactif électrophile
forme avec la CD un complexe fort, alors le produit prédominant formé sera dicté par
l’orientation de ce réactif dans le complexe 44 . La nature du solvant et la taille de la cavité de la
CD ont une influence importante sur la force et l’orientation du complexe entre le réactif et la
cyclodextrine, et affectent le produit de réaction. Par exemple, la réaction du chlorure de
p-toluène sulfonyle en milieu aqueux basique avec l’-CD et la -CD donne respectivement
les dérivés 2- et 6-tosylés. Dans la pyridine, le dérivé 6-tosylé est obtenu avec l’-CD 45,46 .
Pour éviter les complications dues à l’orientation inattendue de l’attaque d’un réactif, soumis
à l’influence de la cavité de la CD, la stratégie la plus souvent employée consiste à protéger
temporairement certaines positions hydroxyles 41,47 .
I.2. Les problèmes liés à la structure de la CD
L’ensemble des critères influençant la sélectivité des CDs décrits précédemment ainsi que le
très grand nombre de groupes hydroxyles portés par la CD (18 pour l’-CD, 21 pour la -CD,
24 pour la -CD) rendent compliquée l’obtention de CDs sélectivement modifiées avec un
haut degré de pureté et de bons rendements, en particulier dans le cas de polysubstitutions.
16

Des facteurs statistiques et stériques 48 conduisent à l’obtention d’un mélange de composés
souvent difficile à purifier, même en utilisant des techniques séparatives puissantes telles que
la Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC). La polysubstitution des CDs (di-,
tri-modifications) donne, de manière statistique, de nombreux isomères de position. Le
nombre possible d’isomères pour un substituant est donné par le nombre de positions
possibles sur une unité glucose (i.e. les hydroxyles en position 2, 3 et 6) multiplié par le
nombre d’unités glucoses dans la CD. Le nombre de combinaisons s’accroît rapidement avec
le nombre de substituants (figure 6). Par exemple, pour une -CD disubstituée, il existe 27
isomères de position théoriques !
De plus, la géométrie de la molécule est telle que les interactions stériques provoquées par la
polysubstitution peuvent tendre à inverser la sélectivité initiale des hydroxyles 48 .
Figure 6 : Nombre d’isomères de position, Ni, en fonction du nombre de substituants identiques, Ns, pour
la -CD
La purification des produits issus de la modification chimique des cyclodextrines pose de
nombreux problèmes. En effet, l’élimination des réactifs et des produits secondaires inclus
dans la cavité de la CD (ex : PPh3, OPPh3, I2, Br2,…) est très difficile. Il en va de même pour
les solvants couramment utilisés dans les réactions (pyridine, DMF, DMSO, DMAP), qui
sont, par définition, ceux ayant une grande affinité pour la cavité (condition sine qua non à la
solubilisation des CDs). Par ailleurs, les CDs non protégées sont beaucoup trop polaires pour
être purifiées sur silice. Seules les techniques de précipitations sélectives, l’HPLC et la
chromatographie échangeuse d’ions sont efficaces
Enfin, la caractérisation structurale de ces dérivés devient très délicate dès que la CD est
mono ou polysubstituée, en raison de la perte de symétrie de l’architecture. Par exemple, pour
17

une monosubstitution de la -CD, 35 protons inéquivalents auront un signal de résonance
compris entre 3 et 4 ppm en moyenne. Ceci nécessite l’utilisation de techniques physicochimiques
élaborées, comme la RMN haut champ mono et bidimensionnelle, homo et
hétéronucléaire.
L’analyse élémentaire n’est pas la technique de contrôle la mieux appropriée pour ce genre de
dérivés, notamment à cause du problème de la formation des isomères. Par exemple, si on
compare l’analyse élémentaire théorique d’une -CD monoamine (C 44,40 %, H 6,26 %, O
47,93 %, N 1,23%) et celle d’un mélange contenant 2 % de -CD, 95 % de -CD-NH2 et 3 %
de -CD-(NH2)2 (C 44,3999 %, H 6,2605 %, O 47,9155 %, N 1,2423 %), on constate qu’il
n’y a pas de différence significative entre l’analyse élémentaire du produit pur et celle du
mélange. De plus, la présence de molécules d’eau non labiles dans la cavité peut augmenter
l’erreur de mesure.
Dans ces conditions, la stratégie de caractérisation des cyclodextrines modifiées par RMN et
par couplage LC / HRMS parait être la plus judicieuse.
I.3. Les CDs modifiées : présentation générale
Dans la littérature, les principaux types recensés de fonctionnalisations chimiques effectuées
sur les CDs, peuvent être classés de la façon suivante :
Ethérification (dérivés alkylés et silylés) ;
Estérification (dérivés acylés et sulfonylés) ;
Halogénation ;
Substitution nucléophile de groupes partants (tosylates, halogénures) pour donner des
dérivés azotures, amines, thioalkyles,…
Pour obtenir ces dérivés, les méthodes utilisées peuvent être divisées en trois catégories 38 :
1. La méthode dite “intelligente” exploite la chimie de la CD pour obtenir le produit
désiré à partir d’un schéma réactionnel le plus court possible.
2. La méthode dite “longue” consiste à réaliser une série d’étapes de protection et de
déprotection afin de modifier sélectivement des positions qui n’auraient pas pu être
atteintes autrement.
18

3. La méthode du “rouleau compresseur” où la CD est soumise à un réactif non
discriminatoire, conduisant à un mélange de composés. Le produit désiré est alors
isolé de ses isomères et homologues, de façon souvent laborieuse, par des méthodes
chromatographiques. Cette méthode ne peut pas être exploitée en chimie préparative,
elle sert plutôt à établir des banques de produits ou à obtenir des CDs commerciales 25
(RAMEB, HPCD, SECD,…), la reproductibilité et la répétabilité des produits
devenant un problème majeur.
En fait, malgré le nombre impressionnant de publications traitant de la modification chimique
des CDs, il en ressort que seules quelques réactions de base conduisent à des composés
parfaitement caractérisés, facilement accessibles et avec des rendements acceptables.
Le but de ce chapitre n’est pas de recenser de manière exhaustive tous les dérivés substitués
décrits jusqu’à ce jour. Il existe de nombreuses revues traitant de ce sujet 38,49,50 . Il s’agira
plutôt de présenter de manière synthétique et analytique les différentes méthodes de
substitution possibles sur les CDs et les principaux types de modification chimique des
groupes hydroxyles.
II. Les persubstitutions
II.1. Persubstitution par voie directe
II.1.1. Modification de toutes les positions hydroxyles en 2, 3 et 6
Tous les groupes hydroxyles de la CD peuvent être convertis directement et de façon non
discriminatoire en fonctions esters (acétylation) ou éthers (alkylation, benzoylation, silylation)
en employant des réactifs adaptés, dans des conditions appropriées.
Les esters de cyclodextrines sont obtenus de manière générale par l’attaque d’un chlorure
d’acide organique dans la pyridine ou dans un autre solvant approprié, en présence d’une
amine tertiaire jouant le rôle de base. La taille des groupements alkyles ou aromatiques portés
par les réactifs n’a que très peu d’effet sur la substitution et les produits permodifiés sont
homogènes (pas de produits secondaires sous-substitués).
19

L’acétylation 42,51,52 et la benzoylation 42,48,53 complète des CDs sont respectivement obtenues à
partir de l’anhydride acétique et du chlorure de benzyle, dans la pyridine, avec des temps de
réaction suffisamment longs (plusieurs jours) pour une substitution totale.
Les halogénures d’alkyle réagissent avec les ions alkoxydes des CDs pour produire les éthers
de cyclodextrines correspondants avec de bons rendements 42,54 . Ici non plus, la taille des
substituants n’a pas d’effet sur la sélectivité 55,56,57,58 . La peralkylation des CDs améliore leur
solubilité dans les solvants organiques. De plus, les CDs perméthylées sont beaucoup plus
solubles dans l’eau que leurs homologues naturels 54 .
La silylation complète de toutes les positions est possible avec le chlorure de triméthylsilyle
mais ne présente que peu d’intérêt si ce n’est d’améliorer fortement la solubilité des CDs dans
des solvants organiques variés 48,59 .
II.1.2. Permodification des hydroxyles en 2 et 6
Les cyclodextrines peuvent être sélectivement modifiées sur toutes les positions 2 et 6 sans
affecter les positions 3, du fait de la plus grande réactivité de ces groupements hydroxyles.
Des conditions rigoureuses sont pour cela employées. En général, des sulfates de dialkyle
réagissent avec la cyclodextrine dans un mélange DMF / DMSO en présence d’oxyde de
baryum (BaO) et d’hydroxyde de baryum (Ba(OH)2) pour donner les dérivés
2,6-dialkylcyclodextrines. La taille des groupements alkyles a peu d’effet sur la sélectivité. La
littérature rapporte la préparation d’un grand nombre de dialkylcyclodextrines allant de la
diméthyl-CD jusqu’à la n-dodécyl-CD 60,61,62,63,64,65 . La réaction de dialkylation conduit
toutefois à un mélange de dérivés sous- et sur-alkylés (12 < dp < 16), avec une majorité du
produit désiré (dp = 14). Les conditions de purification doivent donc être drastiques. Par
exemple, la DIMEB est purifiée par une recristallisation dans l’eau à 95 °C (sa solubilité dans
l’eau étant strictement inversement proportionnelle à la température).
II.1.3. Permodification des hydroxyles primaires en 6
Les hydroxyles primaires, situés en position 6, sont plus nucléophiles et réactifs que leurs
homologues secondaires en 2 et 3. Il est donc facile de modifier directement et de manière
sélective ces positions en employant des électrophiles tels que les halogénures d’alkyle, de
silyle, de sulfonyle, ou d’acide carboxylique pour donner des dérivés alkylés, silylés,
20

sulfonatés ou acylés. L’utilisation d’une base faible ou d’un solvant basique permet de
neutraliser l’acide formé lors de la réaction et ainsi, d’éviter la décomposition de la CD, non
stable en milieu acide.
L’introduction de dérivés sulfonylés ou halogénés comme groupes partants est une méthode
très utilisée pour obtenir des perfonctionnalisations variées sur la face primaire des CDs, par
substitution nucléophile de type SN2 (figure 7).
R = N3 48,66,67
R = NHR 68
R = H 69
R n
R = SR’ 70 , SAr 71 , SOR’ 72 , SCnF2n+1 73
R = Thioglycosyl 74 , acide aminé 75 …
R
L
L = Groupe partant
21
n
Base Forte
O
O
OH
3,6-anhydro-CD
n
n = 6, 7 ou 8
Figure 7 : Présentation générale des perfonctionnalisations possibles à partir des CDs persulfonylées et
perhalogénées sur la face primaire.
II.1.3.1. Les cyclodextrines per-6-tosylées
La synthèse des per(6-O-ptoluènesulfonyle)-CD et -CD est reportée pour la première fois
dans la littérature en 1954 par Lehmann et coll. 76 Le chlorure de para-toluènesulfonyle réagit
en présence de pyridine sur la cyclodextrine pendant 24 h à température ambiante.
Des modifications ont ensuite été apportées à cette procédure par Umezawa et coll. 77 , Cramer
et coll. 78 , Breslow et coll. 79 Cependant, les données analytiques fournies par les auteurs
(pouvoir rotatoire, point de fusion, analyses élémentaires) sont rares et en désaccord. Seul
Umezawa apporte des précisions sur une procédure de purification par colonne de silice
(Benzène / EtOH 4/1 v/v), les autres utilisant des méthodes de recristallisation comme moyen
de purification.

En 1991, Ashton et coll. 80,81 ont synthétisé des dérivés per-3,6-anhydro d’-CD et de -CD à
partir de dérivés per-6-tosylés. Ils ont mis en évidence le manque de sélectivité de la réaction
de tosylation, qui conduit à un mélange de dérivés sous-tosylés et sur-tosylés. Ils n’ont pu
obtenir des composés purs qu’après des étapes répétées de purification par HPLC en polarité
de phase inversée, la purification sur colonne de Umezawa et les recristallisations se révélant
infructueuses selon eux.
Des -CD per-6-tosylées ont également été synthétisées et purifiées sur gel de silice greffée
aminopropyle par Yamamura et coll. 82,83 La littérature relate aussi la synthèse de CDs
per-6-mésylées 84 .
Le manque de sélectivité de la pertosylation en position 6 conduit à des mélanges de
composés, nécessitant une purification difficile avec des rendements non acceptables. C’est
pourquoi les dérivés per-6-tosylés ont été abandonnés au profit des dérivés per-6-halogénés.
II.1.3.2. Les cyclodextrines per-6-halogénées
L’introduction de groupes halogènes sur la face primaire de la CD est une alternative aux
groupes tosylés qui s’avère très intéressante pour la modification sélective des CDs.
En 1974, des -CD et -CD per-6-bromées ont été réalisées par Takeo et coll. 85 de manière
originale par réaction du bromure de méthanesulfonyle sur la CD dans le DMF, à température
élevée. Les auteurs observent malheureusement un degré de bromation très inférieur à 100 %.
Des produits secondaires sulfonatés sont également formés durant la réaction.
En 1991, Gadelle et coll. 86 montrent que des cyclodextrines non protégées peuvent être
directement halogénées en position 6, avec de hauts rendements, par un réactif de type
Vilsmeier-Haack généré in-situ, à partir de brome ou d’iode en présence de
triphénylphosphine dans le DMF, en chauffant à 80°C pendant 15 h (figure 8). La réaction est
ensuite traitée avec du méthanolate de sodium pour détruire les esters de formiate formés lors
de la réaction. Ces dérivés per-6-halogénés sont utilisés comme intermédiaires pour la
synthèse de per-3,6-anhydro-CD et per-6-désoxy-CD.
22

HO
OH
OH
PPh 3
Br 2
DMF
PPh3 + Br2 Br-+ PPh3Br Br-+ PPh3Br + Me2N-CHO [Me2N-CHBr] + Br- +Ph3PO Figure 8 : Perhalogénation des cyclodextrines par la méthode de Gadelle et coll. et mécanisme de
formation du réactif de Vilsmeier-Haack généré in-situ.
Pour éviter les réactions secondaires de sulfonylation et de formylation, Kahn et coll. 87
forment un complexe de type Vilsmeier-Haack avec des chlorures d’alkylsulfonyle dans le
DMF, en passant par un complexe imidazole-sulfonyle. Cette réaction fonctionne très bien
avec les dérivés chlorés, donnant de très bons rendements (~ 90 %), mais ne conduit pas aux
dérivés bromés et iodés.
Le réactif de type Vilsmeier-Haack a encore été isolé sous forme d’un sel de bromure
([CH3)2NCHBr] + Br - ) 88 . L’avantage de cette méthode est d’éliminer les produits secondaires
apparaissant lors de la formation du réactif, en particulier l’oxyde de triphénylphosphine,
avant de le faire réagir avec la CD.
Une autre méthode de synthèse a été proposée par Chmurski et coll. 89 , utilisant comme réactif
de type Vilsmeier-Haack un chlorure ou un bromure d’halométhylènemorpholinium avec la
CD dans le DMF. Cette réaction est réalisable dans d’autres solvants aprotiques dipolaires
(N-méthyl-2-pyrolidinone, N-N’-diméthylpropylèneurée, N-diméthylacétamide et pyridine)
mais avec des rendements plus modestes.
Les per(6-halogéno-6-désoxy)-CD ont récemment été obtenues avec d’excellents rendements
et une très bonne sélectivité par le traitement d’une CD native avec du N-halosuccinimide et
de la triphénylphosphine dans le DMF 90 (figure 9).
23
HO
OH
Br

HO
OH
OH
O
O
N
X
2 éq.
PPh 3 / DMF
HO
24
OH
X
-CD -CD -CD
X = Cl 85 % 96 % 88 %
X = Br 76 % 93 % 93 %
X = I 81 % 89 % 81 %
Figure 9 : Perhalogénation des cyclodextrines par la méthode de Chmurski et coll. Le tableau indique les
rendements obtenus pour chaque produit final.
II.1.4. Permodification des hydroxyles en 2
Une base forte produit sélectivement un ion 2-alcoolate qui peut réagir avec un chlorure
d’alkyle ou de sulfonyle 43 . Mais le caractère discriminatoire de la base est de moins en moins
significatif au fur et à mesure que le degré de substitution augmente, à cause de
l’encombrement stérique. L’électrophilie privilégiera alors de plus en plus les hydroxyles
primaires, plus attractifs, conduisant à des mélanges de dérivés 2- et 6-substitués. Ce
problème est souvent résolu en utilisant une étape préalable de protection.
II.2. Méthode longue : utilisation de groupements de protection
II.2.1. Permodification des hydroxyles en 2 et 3
De nombreuses publications traitent de la permodification complète de la face secondaire des
cyclodextrines.
Parrot-Lopez et coll. 91 ont synthétisé des CDs totalement estérifiées sur la face secondaire.
Les hydroxyles primaires en 6 sont d’abord protégés par des groupements
tert-butyldiméthylsilyles (TBDMS), puis les hydroxyles secondaires sont estérifiés avec des
chlorures d’acyle, dans la pyridine, en présence de DMAP. Enfin, les positions 6 sont
déprotégées grâce à du trifluorure de bore-diéthyl éther (figure 10)

HO
OH
OH
HO
OH
OSi
25
ROCO
OSi
OCOR
ROCO
OH
OCOR
Figure 10 : Peracylation des hydroxyles secondaires en passant par une étape de protection des hydroxyles
primaires (Parrot-Lopez et coll.)
Boger et coll. 48 obtiennent également des CDs peracylées sur les positions 2 et 3 par une étape
de perbenzoylation de tous les hydroxyles, suivi d’une déprotection sélective des benzoates
situés sur la face primaire (figure 11). Ils jouent pour cela sur la différence de réactivité, due à
l’encombrement stérique de la face secondaire, entre les hydroxyles du petit côté et ceux du
grand côté.
HO
OH
OH
PhCOCl
Pyridine
PhOCO
OCOPh
OCOPh
K
O
CH 3
CH 3
2-propanol,
benzène
PhOCO
OH
OCOPh
Figure 11 : Peracylation des hydroxyles secondaires par déprotection sélective des hydroxyles primaires
(Boger et coll.)
II.2.2. Permodification des hydroxyles en 3
La permodification des positions 3 reste un challenge à relever. Ainsi, la protection des
hydroxyles en 6 entraîne la modification privilégiée des hydroxyles en 2 92 . La protection des
positions 2 et 6 par des groupements TBDMS ne permet pas non plus l’attaque des chlorures
de sulfonyle sur les positions 3, probablement à cause de l’encombrement stérique des
fonctions silylées, très volumineuses 93 . De plus, les groupements TBDMS ont tendance à
migrer des hydroxyles en 2 vers ceux en 3 dans des conditions fortement basiques 94 . Enfin,
bien que l’utilisation de groupes triméthylsilyles (TMS) pour la protection des hydroxyles en
2 et 6 diminue l’encombrement stérique, ces fonctions sont facilement hydrolysées dans des
conditions neutres ou acides, ce qui interdit l’obtention de dérivés per-3-tosylés 93 .
Les per-2-sulfonyl-CD donnent, dans des conditions basiques, des per-2,3-époxy-CD qui
servent d’intermédiaires dans la synthèse des altro-CD (cycloaltrine). Dans ce cas, l’attaque

nucléophile des positions 3 sur ces époxydes donnera des cycloaltrines substituées en
position 3 95 .
II.2.3. Amélioration de la sélectivité
Nous avons vu précédemment que les positions 6 et même les positions 2 pouvaient être
directement substituées dans des conditions adaptées. Mais le manque de sélectivité, dû à
l’encombrement stérique causé par l’augmentation du degré de substitution, a contraint les
chercheurs à se servir de groupements protecteurs, temporaires ou définitifs pour obtenir des
dérivés per-6-substitués et per-2-substitués.
Takeo et coll. 47 utilisent ainsi une “méthode longue” pour obtenir des dérivés per-6-tosylés
(figure 12) avec un haut degré de pureté et pour éviter le risque de formation de 3,6-anhydrocyclodextrine.
HO
OH
OH
HO
OH
OSi
AcO
Figure 12 : Pertosylation des hydroxyles primaires par une méthode longue (Takeo et coll.)
Alker et coll. 96 ont réalisé la synthèse de la per(2,3-diméthyl-6-bromo-6-désoxy)-CD, une
version plus soluble dans l’eau de la per(6-bromo-6-désoxy)-CD. Le dérivé per-6-silylé est
méthylé par du iodure de méthyle dans des conditions anhydres pour obtenir la per(2,3diméthyl-6-silyl)-CD.
Le produit final est obtenu après désylilation et bromation des
positions 6 avec du dibromure de triphénylphosphine dans le DMF.
Le recours à la protection des hydroxyles primaires en 6 par des groupes silyles pour persubstituer
les positions 2 est très courant pour éviter les mélanges de produits résultant de la
compétition entre les hydroxyles en 6 et en 2. Cette méthode est employée pour la pertosylation
en 2 par exemple 95,97 .
Une procédure originale consiste également à tirer profit des propriétés de migration des
silyles encombrés. La per(2,6-di-O-TBDMS)-CD réagit avec des halogénures de benzyle ou
26
OSi
OAc
AcO
OH
OAc
AcO
OTs
OAc

d’alkyle dans des conditions basiques fortes pour produire le dérivé per-2-alkyl-3,6-silyle qui,
après désylilation, donne le dérivé per-2-alkylé 94 .
III. Les monosubstitutions
III.1. Monosubstitution d’un des hydroxyles en position 6
L’étape clef pour attacher un groupement fonctionnel sur un des hydroxyles de la face
primaire des CDs est une sulfonylation sélective permettant d’obtenir un dérivé monotosylé.
Ce précurseur important mène à une grande variété de CDs monomodifiées (figure 13).
Le déplacement nucléophile du tosylate par des groupements nucléophiles bien adaptés tels
que des ions halogénures, azotures, des thiolates, des hydroxylamines, des alkyl- ou
poly(alkylamines) donnent 98 des monohalogéno- 99,100 , azido- 99,101 , thio- 102,103 ,
(hydroxylamino)- 104 ou (alkylamino)cyclodextrines 105,106 .
Les monoazido-CD sont synthétisées classiquement à partir des dérivés monotosylés en
présence d’azoture de lithium ou de sodium dans le DMF à reflux 99 . Elles peuvent également
être préparées directement à partir de la CD naturelle en passant par une réaction de type
Vilsmeier-Haack, dans laquelle les CDs réagissent avec de l’azoture de lithium, en présence
de triphénylphosphine, dans le DMF et avec chauffage 107 (cette réaction conduit aussi à la
formation de dérivés polysubstitués). Les dérivés monoamino-CD sont obtenus à partir de
dérivés monoazides par réduction avec de la triphénylphosphine en présence
d’ammoniaque 107 . Le dérivé aminé sert de synthon pour la préparation de nombreuses CDs
modifiées sur la face primaire, grâce notamment au greffage de molécules variées (sucres 108 ,
peptides 109,110 , chaînes alkyles 111 ,...) par un couplage de type peptidique.
27

HO
OH
OTs) 1
OH HO) n OH) n
n-1 N3 ) 1
R) 1
(HO n-1 (HO n-1 (HO
n-1 (HO
n-1 (HO
HO) n
HO) n
HO) n
OH) n
NH 2 ) 1
OH) n
NHR’) 1
OH) n
n-1 (HO
HO) n
OH) n
n-1 (HO
28
HO) n
O
n = 6 : -CD
n = 7 : -CD
n = 8 : -CD
OH) n
HO) n
OH
1
O
H
1
OH) n
n-1 (HO
HO) n
R''
OH) n
R : X, N3, aminoalkyle, thioalkyle, thiosucre…
R’: dérivés de sucres…
R’’: OH, NH-Ph
Figure 13 : Présentation générale des méthodes pour monosubstituer la position 6 des CDs
Des dérivés monothio-CD (groupements thiol, thioalkyle) ont été obtenus à partir du dérivé
monotosylé pour former des films immobilisés sur une surface d’or, et étudier l’orientation
des CDs dans ce film 112 . La synthèse directe de dérivés monothio--CD à partir d’une
cyclodextrine native et de thiols aromatiques a été réalisée par la réaction de Mitsunobu
(triphénylphosphine, diisopropyl azodicarboxylate, pyridine ou DMF). Cette réaction donne
des mélanges de produits mono-, di- et tri-substitués qui sont ensuite purifiés par HPLC 113 .
La -CD monoaldéhyde a été préparée par Czarnik et coll. 114 , par oxydation de la -CD
monotosyle en utilisant la réaction de Nace (DMSO / collidine). Ce monoaldéhyde a ensuite
été employé comme matériel de départ pour donner les dérivés monoacide carboxylique,
1

monooxime et monohydrazone 115 . Bienarz et coll. 116 ont obtenu directement le dérivé
monoaldéhyde en faisant réagir la -CD native avec le réactif de Dess-Martin (DMP).
Par contre, il n’est pas possible d’obtenir directement le monoéther d’alkyle à partir du dérivé
monotosylate. L’ion alkoxyde correspondant, qui sert de nucléophile, est produit en présence
d’une base forte qui va arracher également les protons de la position 3 de la CD et former le
produit secondaire mono-3,6-anhydrocyclodextrine. Les éthers d’alkyle de -CD sont
synthétisés par une méthode “longue” 117 .
Deux méthodes ont été décrites dans la littérature pour préparer la très employée mono-6-Otosyl-cyclodextrine
:
La méthode “classique” consiste à préparer ces monosulfonates en faisant réagir un équivalent
de chlorure de p-toluènesulfonyle avec la CD dans la pyridine, et repose sur un contrôle
rigoureux de l’avancement de la réaction (contrôle de la température, du pH, du temps de
réaction) 99,118 . Ce procédé présente le grand inconvénient de ne pas être sélectif et conduit à
un mélange de produits secondaires correspondant à des dérivés di- et tri-tosylés sur la face
primaire. Il faut passer par de pénibles étapes de purification pour isoler le mono-6-O-tosyl-
CD pur. De plus, des réactions secondaires (attaque des contre-ions chlorures sur les tosylates,
réaction d’élimination conduisant à la formation du dérivé mono-3,6-anhydro) réduisent
d’autant plus le rendement final.
La méthode de choix pour la synthèse des dérivés monotosylés est de faire réagir la CD avec
un chlorure de sulfonyle dans une solution aqueuse alcaline. En série -CD, la monotosylation
est réalisée de manière exclusive sur une seule fonction hydroxyle primaire en utilisant le
chlorure de p-toluènesulfonyle comme réactif 105,119,120 . Cette réaction met en jeu la formation
d’un complexe de type 1:1 -CD / TsCl, suivie d’une réaction “intra-complexe” entre l’une
des fonctions hydroxyles en 6 et le TsCl. Une fois le groupement tosylate greffé sur le
macrocycle, il se forme un complexe intramoléculaire entre le cycle aromatique du groupe
tosyle et la cavité de la CD, empêchant tout risque de formation d’un nouveau complexe
-CD-OTs / TsCl. Le problème de cette méthode reste les faibles rendements obtenus
(~30 %), principalement à cause de l’hydrolyse du tosylate qui conduit à une régénération
partielle de la -CD lors de la réaction. Darcy et coll. 121 ont remplacé le chlorure de
29

p-toluènesulfonyle par du p-toluènesulfonylimidazole, moins sensible à l’hydrolyse
(figure 14). Une monotosylation à partir de l’anhydride de l’acide p-toluènesulfonyle a été
mis en œuvre. En série -CD, le principe est identique mais le réactif utilisé pour former un
complexe 1:1 est le chlorure de 2-naphtalènesulfonyle, et la réaction se fait dans la
pyridine 122 . Récemment, des auteurs 123 ont montré que le chlorure de
2,4,6-triisopropylbenzènesulfonyle donnait de manière efficace le dérivé monotosylé sans
traces de di- ou tri-substitution, avec de bons rendements.
Figure 14 : Mécanisme de monofonctionnalisation de la -CD par le tosylimidazole en milieu aqueux
Une méthode de synthèse inédite, faisant intervenir un complexe du cuivre comme
intermédiaire, est décrite par Defaye et coll 124 avec des rendements satisfaisants (~ 40 %).
III.2. Monosubstitution de la face secondaire
La modification sélective d’un hydroxyle de la couronne secondaire est beaucoup plus
délicate qu’une monosubstitution en face primaire, en particulier quand il s’agit de la
position 3. La bibliographie concernant cette partie est beaucoup plus restreinte.
30

III.2.1. Modification de la position 2
Différentes stratégies ont été élaborées pour tosyler sélectivement un des hydroxyles situés
sur la position 2 des unités glucoses du macrocycle :
Stratégie de transfert 100 : La réaction se fait via la formation d’un complexe. Le groupement
réactionnel est transféré préférentiellement sur la position 2 en raison de l’orientation du
réactif inclus dans la CD.
Substitution directe 43 : Les protons des hydroxyles en 2 sont plus acides que ceux en 6. On
exploite cette caractéristique pour attaquer préférentiellement une des positions 2 en présence
d’une base forte et d’un réactif électrophile dans des conditions anhydres.
Méthode “longue” 125 : La substitution électrophile est précédée d’une étape de protection des
hydroxyles primaires par des groupes silyles en général. Un avantage de cette stratégie est que
les réactions et les purifications peuvent être effectuées dans un grand nombre de solvants
organiques et la déprotection des silyles se fait très aisément.
Le groupement tosyle des dérivés mono-2-tosyl-CD est généralement éliminé en présence
d’une base par le groupe hydroxyle adjacent en C3, pour donner le mono-manno-2,3-époxy-
CD. Ce dernier est ouvert en présence d’un réactif nucléophile ou d’une base pour conduire
au dérivé monosubstitué en 2 correspondant. Dans d’autres cas, certaines bases agissent
directement par une réaction de type SN2 sur la position 2 tosylée (figure 15).
Très récemment, Ueno et coll. 126 ont réalisé une étude sur la monosilylation régiosélective en
position 2 des -, - et -CD non protégées par réaction du TBDMS Imidazole dans le DMF,
avec du tamis moléculaire 4 Å, à 140 °C. Ils montrent que la température de la réaction
influence la régiosélectivité. Ainsi, à 0 °C, l’attaque se fait préférentiellement sur un
hydroxyle primaire.
31

Base
forte
Nu 2
Nu 1
manno-2,3-époxy-CD
III.2.2. Modification de la position 3
32
minoritaire majoritaire
Nu 1 : Imidazole
Le composé minoritaire n’est pas formé
avec la plupart des nucléophiles
Nu 2 : CH 3 NH 2 , imidazole
Figure 15 : Réactions sur la mono-2-tosyl-CD
Des modifications en 3 sont souvent réalisées par réaction d’un nucléophile sur le monomanno-2,3-époxy-CD.
Les mélanges de dérivés mono-2- et mono-3-substitués sont ensuite
séparés par chromatographie.
Les stratégies employées pour accéder à la position 3 des CDs sont résumées figure 16 :
allo-2,3-epoxy-CD
Chromatographie
Nu : NH 3 , imidazole
Sf : sulfonate
Figure 16 : Stratégies pour accéder à des cyclodextines modifiées sélectivement sur une position 3.
L’orientation du groupement sulfonate dans le complexe d’inclusion 1:1 entre la -CD et le chlorure de
dansyle (I) donne préférentiellement le dérivé 3-sulfonaté(II).

La monosubstitution en position 2 ou 3 reste difficile d’accès, les rendements obtenus étant
généralement trop faibles pour une première étape de synthèse (< 10 %).
IV. Polysubstitutions
IV.1. Disubstitution
La disubstitution des cyclodextrines peut être obtenue en utilisant plus d’un équivalent de
réactif avec la CD, dans des conditions appropriées, pour donner un mélange de produits qui
sont ensuite séparés par HPLC 127 . Ce procédé est évidemment extrêmement lourd et
complexe et d’autres méthodes plus pertinentes ont été élaborées.
Une stratégie, initialement proposée par Tabushi 128 , permet de synthétiser des dérivés bifonctionnalisés
par la méthode dite de “capping”. Il s’agit d’agrafer deux hydroxyles de la
cyclodextrine par un réactif présentant deux sites de liaisons, pour conduire en général à la
formation d’une cyclodextrine disulfonatée (figure 17). Le déplacement de cette attache
temporaire par un nucléophile 129 ou la conversion en dérivé diiodé 130 permet d’obtenir une
double fonctionnalisation avec rétention de l’isomérie de position. En jouant sur la taille et sur
le site réactif de l’agrafe, des isomères AB 131 , AC et AD 132 ont été préparés sur les positions
6 131 , 2 132 et 3 des CDs. Cependant, les rendements ne dépassent jamais 10 %.
Figure 17 : Utilisation de la géométrie des réactifs pour disubstituer régiospéciquement les cyclodextrines
33

La déprotection sélective des cyclodextrines perbenzylées et perméthylées conduit également
à l’obtention de CDs bifonctionnalisées. Pearce et coll. 133 ont effectué la bis-dé-O-benzylation
de la face primaire d’une -CD et d’une -CD perbenzylées avec d’excellents rendements en
utilisant l’hydrure de diisobutylaluminium (DIBAL) dans des conditions optimisées
(figure 18). L’unique diol AD obtenu parmi les très nombreux régioisomères statistiquement
possibles sur les macrocycles prouve la très grande régiosélectivité de la réaction. Cette
déprotection sélective est un moyen de disubstituer facilement les CDs. De plus, la grande
solubilité dans les solvants organiques de ces composés, grâce aux groupements benzyles,
simplifie les étapes réactionnelles et la purification.
(OBn) 18
34
OH HO
DIBAL (0.5 M, 120 éq.)
A
Toluène, 50°C, 2h
82 %
(OBn) 21
OH HO
DIBAL (0.5 M, 140 éq.)
A
Toluène, 30°C, 2h
83 %
D
(OBn) 16
D
(OBn) 19
Figure 18 : Déprotection sélective des CDs perbenzylées (Pearce et coll.)
Wang et coll. 134 ont utilisé le DIBAL sur une cyclodextrine “mixte” (perméthylée sur le bord
primaire et perbenzylée sur le bord secondaire). Ils obtiennent une bis-dé-O-méthylation sur
la face primaire. De Roizel et coll. 135 ont étudié l’action du DIBAL sur une CD perméthylée.
Ils ont mis en évidence la formation de deux produits : un composé majoritaire bis-dé-Ométhylé
sur la face secondaire en position 2A et 3B, et un composé minoritaire dé-O-méthylé
sur la face secondaire.
IV.2. Polysubstitution d’ordre supérieur à 2
Au-delà d’une disubstitution, les CDs polysubstituées sont obtenues par des méthodes de
criblage 136 . Le nombre important d’isomères de position possibles ne permet pas actuellement
de faire des modifications sélectives avec des méthodes simples.

V. Conclusion
De nombreuses méthodes sont décrites dans la littérature pour modifier sélectivement une ou
plusieurs positions spécifiques sur les cyclodextrines. Malgré cela, il reste beaucoup de travail
à accomplir au niveau de la méthodologie de synthèse pour améliorer l’efficacité des réactions
(meilleure sélectivité, meilleurs rendements). De plus, la structure tridimensionnelle et la
capacité d’inclusion des cyclodextrines leur confèrent une réactivité particulière qui peut être
exploitée pour réaliser des modifications chimiques par des voies de synthèse qui sortent de la
chimie classique, comme par exemple l’inclusion des réactifs pour orienter la
fonctionnalisation, la déprotection sélective, ou encore l’utilisation du capping. Ces méthodes,
encore balbutiantes, sont peut-être appelées à se développer, aidées par des instruments de
prédiction tels que la modélisation moléculaire.
La recherche de méthodologies de synthèse toujours plus performantes est importante. Elle
fournit de nouveaux outils, mieux adaptés, pour construire plus facilement et avec une plus
grande efficacité des molécules cibles avec des propriétés bien définies (amélioration de la
solubilité dans l’eau, activité enzymatique, catalyseur chimique, propriétés de
vectorisation…), qui peuvent aboutir à de nombreuses applications.
Depuis plusieurs années, une attention particulière a été portée sur l’utilisation de
cyclodextrines modifiées pour le ciblage des médicaments. Le principe consiste à greffer sur
la cyclodextrine une ou plusieurs antennes destinées à assurer une fonction de vectorisation
vers un site d’action privilégié, la CD jouant le rôle de véhicule moléculaire pour le principe
actif. Différentes approches ont été envisagées dans le choix du vecteur. Celui-ci peut avoir
un mode de reconnaissance spécifique pour des récepteurs membranaires (antennes
polysaccharidiques ou peptidiques) ou non spécifique, privilégiant le passage
transmembranaire et destiné à des applications topiques (antennes de type lipidique). Le
chapitre suivant traitera de cette dernière classe de composés : les cyclodextrines amphiphiles.
35

TROISIEME PARTIE
LES CYCLODEXTRINES AMPHIPHILES
I. Présentation des cyclodextrines amphiphiles
Les cyclodextrines amphiphiles sont obtenues par greffage de un ou plusieurs groupements
lipophiles sur la CD. De tels composés peuvent être utilisés en tant que nouveaux matériaux
(nanoparticules par exemple), ou peuvent s’insérer dans des matrices lipidiques préformées
telles que des liposomes. Dans les deux cas, l’objectif principal de cette approche est de
combiner la spécificité de taille de la CD pour inclure de petites molécules hydrophobes et les
propriétés de transport des structures lipidiques (liposomes ou analogues).
Il existe plusieurs grandes familles de cyclodextrines amphiphiles selon la position et le
nombre de groupements hydrophobes portés par la CD :
Persubstitution sur la face primaire (en 6) : Les “médusa-like”
Persubstitution sur la face secondaire (en 2 et 3) : Les “skirt-shaped”
Persubstitution en 2 et en 6 : Les “molécules bouquets”
Persubstitution sur toutes les positions (2, 3 et 6)
Monosubstitution sur un des hydroxyles de la face primaire
Ces composés sont obtenus à partir de cyclodextrines sélectivement fonctionnalisées selon les
méthodes de synthèse qui ont été décrites dans le chapitre précédent. Le but de cette partie
bibliographique est d’établir une relation entre la structure de ces dérivés et leurs propriétés
physico-chimiques et biologiques. Afin d’éviter une description exhaustive de toutes les
cyclodextrines amphiphiles recensées dans la littérature, le tableau suivant récapitule les
principales caractéristiques de ces composés (structure, méthodes de caractérisation
structurale, degré de substitution, types de systèmes organisés obtenus et techniques utilisées
pour les caractériser, solubilité dans l’eau, mise en évidence de complexes d’inclusion dans
les systèmes organisés, applications biologiques potentielles).
36

Appl.
Bio.
Mise en évidence de
l’inclusion dans les
systèmes organisés
Solubilité
dans l’eau
(CMC)
Systèmes organisés
Techniques de
caractérisation
d° subst.
(dp) Type
Réf. Structure Caractérisation
structurale
O
R
S
Subst.
partielle
O
n.c.
(non
communiqué)
HO
OH
137,
non non non
Mesures des
isothermes de pression
de surface – Aire
( - A)
Films de LB i,ii
7
O
138
dp < 7
R = -C12H25 R = -C8H17 R = -C4H9 O
R
S
Subst.
partielle
O
137,
AcO
138,
non
2-aminonaphtalène /
dérivé C12H25 139
non
• Mesures des
isothermes – A
• Spectroscopie IR
polarisé (orientation
moléculaire dans le
film)
Films de LB i,ii
Aire par molécule à la
pression d’effondrement
(A0) régie par la partie CD
(A0 augmente quand CD
peracétylée en 2 et 3)
n.c.
7
OAc
O
139,
dp < 7
140
R = -C12H25 R = -C8H17 R = -C4H9 SR
Subst.
partielle
O
AcO
137,
non non non
Mesures des
isothermes – A
Films de LB i,ii
Remplacement du groupe
sulfonyle par un groupe
sulfure : pas d’influence
sur les isothermes – A
n.c.
7
OAc
O
138
dp < 7
R = -C12H25 R = -C8H17 R = -C4H9 137,138 : n.c.
SR
O
Subst.
partielle
HO
OH
137,
n
O
non non non
• Mesures des
isothermes – A
• BAM(Brewster
Angle Microscopy)
Films de LB i,ii
monocouches
multicouches 141
141 :
• HR-MS
• RMN 1 H et
13
C
• Analyse
élémentaire
138,
141
dp < 7
n = 7
R = -C 12H 25
n = 6
n = 7
R = -C 18H 37
n=8
i : monocouches à l’interface air/eau, stables pour des chaînes à 8 C ou plus, instables pour des chaînes inférieures à 8 C.
ii : Le cône cylindrique de la CD est orienté parallèlement au plan du film et les chaînes hydrocarbonées verticalement.
37

Appl.
Bio.
Mise en évidence de
l’inclusion dans les
systèmes organisés
Solubilité
dans l’eau
(CMC)
Systèmes organisés
Techniques de
caractérisation
d° subst.
(dp) Type
Réf. Structure Caractérisation
structurale
• Azobenzènes iii,iv :
139,
Y
NHR
140,
N N
X
139,140,142
-148 : n.c.
O
141,
Y = COOH
Y = COOH ou COONa
X = H
X = NMe2 • Films de LB :
Monocouches i,ii
Multicouches 141
Subst.
partielle
HO
142,
• Mesures des
isothermes – A
• BAM
141 :
• HR-MS
• RMN 1 H et
13
C
• Analyse
élémentaire
OH
n
O
143,
non
Y = SO 3Na
X = NMe 2
• 2-naphtalènesulfonate
iv, 139
de Na
• Inclusion du cholestérol
dans les films mixtes
avec le dérivé de -CD 147
non
144,
• Films de LB mixtes :
CD / Cholestérol 147
CD / Phospholipides 148
dp < 7
n = 6
n = 7
R = -C 12H 25
145,
R = -C 16H 33
146,
n = 6
n = 7
n=8
147,
148
(CH 2)9 CH3
Subst.
partielle
(CH 2) 8
O
non non non
• Mesures des
isothermes – A
• Spectr. UV-Visible
• CPG
Films de LB ii
Photopolymérisation
intermoléculaire sous
irradiation UV du film
n.c.
NH
149
O
dp < 7
HO
OH
7
O
Diace-CD
(CH 2) 20
O
Subst.
partielle
NH
non non non
• Mesures des
isothermes – A
• Spectr. IR
• Films de LB ii
• Films de LB mixtes :
Vinyl-CD / TA
(TA : HOOC(CH2) 20CH CH2) Photopolymérisation
intermoléculaire sous
irradiation UV des
n.c.
O
150
HO
OH
dp < 7
7
O
films v
Vinyl-CD
iii : Stabilisation de l’isomère cis des azobenzènes (isomérisation thermique cis-trans rapide) dans la cavité de la CD. Excellent comportement photochromique dans les films
de LB.
iv : Influence des interactions coulombiennes (entre la jonction amino- et les motifs –COOH et -SO3Na des dérivés azobenzènes et naphtalènes) et de l’isomérie de position
des groupes substitués sur les aromatiques dans les phénomènes de complexation et de stabilisation.
v : La polymérisation dans les films mixtes de composition vinyl-CD / TA 1:1 et 1:5 (80 – 90 % de conversion, rapide) est meilleure que celle dans des films de vinyl-CD
seule (50 – 60 % de conversion, lent). Les molécules de TA s’intercalent entre les interstices formés dans les films de CD, accélérant le processus par un phénomène de
copolymérisation.
38

Appl.
Bio.
Mise en évidence de
l’inclusion dans les
systèmes organisés
Solubilité dans
l’eau (CMC)
Systèmes organisés
Techniques de
caractérisation
d° subst.
(dp) Type
Réf. Structure Caractérisation
structurale
• Films de LB :
monocouches stables 1- 5,
(1 : tendance à former des
multicouches pendant la
compression)
SR
• Mesures des
isothermes – A
• Calorimétrie
différentielle (DSC)
• Microscopie optique
O
HO
• RMN 1 H et
13
C
• Analyse
élémentaire
OH
Nulle ou
quasi-nulle
7
O
non non
dp = 7
151
• Cristal liquide
thermotropique
R = -C2H5 1
R = -C4H9 2
R = -C10H21 3
R = -C16H33 4
R = -C18H37 5
Vésicules (SUV) vi :
50 < Ø < 300 nm (2 h de
sonication à 50°C)
(pour le dérivé -C12H25,
Ø ~ 60 nm après 9h de
sonication)
SR
• Diffusion de lumière
(DLS)
• Microscopie à
transmission
électronique (TEM)
Face I aire :
dp = 7
• RMN 1 H et
13
C
• ES-MS
• Analyse
élémentaire
O
O
152,
oui non non
O
7
O
153
Face II aire :
partielle
OH
OH
R = -C12H25 R = -C16H33 • 2 : Nanoparticules
polydisperses (30-60
min. de sonication à
TA) : 50 < Ø < 150 nm
SR
oui (1 et 3)
En 6 :
dp = 7
• RMN 1 H et
13
C, 2D
• ES-MS
• Analyse
élémentaire
O
• Mesures de tension
de surface
• DLS
• TEM
HO
O
153,
CMC :
1 : 3,4.10 -6 M -1
2 : pas de cmc
3 : 1,3.10 -6 M -1
7
O
non non
154,
• 1 et 3 : micelles
allongées (dissolution
spontanée)
• 1 : nanoparticules très
polydisperses vii ,
(120 < Ø < 1000 nm).
Hétéroaggrégats avec
porphyrines.
En 2 :
dp = 7
O
n
H
n ~ 2 1
n ~ 3 2
n ~ 4 3
155
R = -C2H5 R = -C6H13 R = -C6H13 SR
En 6 :
dp = 7
O
• RMN 1 H et
13
C, 2D
• ES-MS
• Analyse
élémentaire
HO
153,
O
7
O
156,
non non oui vii
• DLS
• TEM
En 2 :
dp = 7
O
157,
n
• 2 : Vésicules (SUV)
monodisperses, Ø ~ 30-
35 nm
158
ClH.H2N
R = -C6H13 n ~ 2 1
R = -C16H33 n ~ 1 2
vi : Mise en évidence de l’encapsulation d’un colorant fluorescent (CF) et de dextranes marquées par fluorescence dans les SUVs (petites vésicules unilamellaires). Meilleure
encapsulation des vésicules obtenues à partir du dérivé –C16H33.
vii : Effets inhibiteurs des nanoparticules de SC6CDNH2 sur la réaction photochimique qui conduit à la dégradation du diflunisal (DF, un médicament photosensible) en un
produit secondaire toxique.
39

Réf. Structure
159
160,
161
162,
163,
164
165
HO
Br
O
n = 6, 7 ou 8
HO
N 3
OH
O
O
n = 6, 7 ou 8
R
HO
S
OH
O
O
OH
O
R = H
R = Br
R = O-n-C 4H 9
R = n-C 5H 11
R = NO 2
n = 6,7 ou 8
AcO
SCF 3
O
OAc
O
n
n
n
7
Caractérisation
structurale
• RMN 1 H et
13 C
• ES-MS
• Analyse
élémentaire
• RMN 1 H,
1D et 2D
• IR
• RMN 1 H et
13 C
• ES-MS
• Analyse
élémentaire
• RMN 1 H,
13 C et 19 F
• ES-MS
d° subst.
(dp) Type
dp = 7
dp = 7
dp =7
dp = 7
Films de LB :
monocouche à
l’interface air-eau de
faible stabilité
Films de LB :
• CD-N3 et CD-N3 :
triple couche, non
structuré, peu stable
• CD-N3 : Triple couche,
grande rigidité, structure
hexagonale
Films de LB
• Séries et -CD :
La stabilité des films
varie avec la nature des
substituants viii
• Série -CD :
Monocouches très
stables et indépendant de
la nature du
substituant viii
Films de LB
monocouche stable
Systèmes organisés
Techniques de
caractérisation
40
Mesures des
isothermes – A
• Mesures des
isothermes – A
• Scanning Force
Microscopy (SFM)
Solubilité
dans l’eau
(CMC)
Mesures des
isothermes – A non
Mise en évidence de
l’inclusion dans les
systèmes organisés
Appl.
Bio.
non non non
non non non
Auto- inclusion du cycle
aromatique des dérivés
thiophényl-, et CD
dans le DMF
non
Mesures des
isothermes – A non non non
viii : Pour les séries - et -CD, l’ordre croissant du degré d’organisation et de stabilité des films en fonction de la nature des substituants est le suivant : S-Ph < S-Br

Appl.
Bio.
Mise en évidence de
l’inclusion dans les
systèmes organisés
Solubilité
dans l’eau
(CMC)
Systèmes organisés
Techniques de
caractérisation
d° subst.
(dp) Type
Réf. Structure Caractérisation
structurale
Mise en évidence d’une
inclusion partielle de la
progestérone, du
bifonazole et du
clotrimazole dans la
cavité des 6-N-CAPRO -
CD formant les
nanosphères chargées
R
O
• Spectroscopie à
corrélation de photons
(taille des particules)
• Potentiel zeta
• TEM
Nanosphères obtenues par
nanoprécipitation
(solubilisation dans un
solvant organique puis
précipitation dans l’eau) ix
• RMN 1 H
• FAB-MS
• IRTF
• DSC
• Analyse
élémentaire
X
O
166,
HO
167,
oui
non
dp = 7
OH
7
O
168,
169
X = O, R = C5H9 : 6-O-CAPRO-CD
X = NH, R = C5H9 : 6-N-CAPRO-CD
X = NH, R = C13H27 : 6-N-MYRISTO-CD
X = NH, R = CH2-CH(CH3)3 : ramified-CD
170,
OH
171,
O
172,
O
O
O
O
173,
O n
R
• CCM
R
174,
• Pouvoir
175,
rotatoire
R = -CH3 n = 7 : -CD-C2
176, R = -C5H11 n = 7 :-CD-C6 • RMN
R = -C7H15 n = 7 :-CD-C8
177, R = -C9H19 n = 7 : -CD-C10
R = -C
178,
11H23 n = 7 : -CD-C12
R = -C13H27 n = 7 :-CD-C14
179 R = -C13H27 n = 6 : -CD-C14
R = -C13H27 n = 8 :-CD-C14
41
1 • Vésicules mixtes -CD-
C6 / DMPC instables
• formation de structure
lamellaire en milieu
organique (THF, pyridine)
• Films LB
dp ~ 14
(mélange
de sous-
H et de sur-
(caract. faible) acylation)
x , LB mixtes 179
• Dépôts de monocouches
d’-, de - et de -CD-C14
sur une surface en silicone,
étude de l’empilement des
CDs dans le film
• Nanoparticules xi
• DLS
• Mesures des
isothermes – A
• Mesures de tension
de surface
• RMN
(nanosphères ou
nanocapsules) avec
-CD-C6, -C12, -C14 et
CD-C6
1 Dans le cas des
nanosphères, une partie
H
des molécules de
• Diffusion de rayons
non principes actifs
X
encapsulées
• Spectroscopie à
corrélation de photons
• potentiel zeta
• Microscopie
électronique à
cryofracture
xi oui
peuvent se
trouver incluses dans la
cavité.
xi
ix : La formation et les caractéristiques physico-chimiques des nanoparticules dépendent fortement des propriétés structurales de la CD modifiée (comportement à l’interface
huile-eau, viscosité et miscibilité du solvant organique avec l’eau). Le dérivé 6-N-CAPRO-CD donne les nanoparticules les plus homogènes et de plus petites tailles
(diamètre moyen ~ 300 nm).
x : De manière surprenante, la valeur de pression de surface ne corrèle pas avec la longueur des chaînes hydrocarbonées et le dérivé -CD-C6 possède la pression de surface
d’effondrement la plus élevée (plus grande stabilité).
xi : Plusieurs principes actifs, hydrophiles ou lipophiles, ont été encapsulés dans les nanosphères (la doxorubicine sous forme de sel de chlorhydrate et la progestérone) ainsi
que dans les nanoparticules (l’indométhacine, la progestérone et l’amphotéricine B).

Appl.
Bio.
Mise en évidence de
l’inclusion dans les
systèmes organisés
Solubilité
dans l’eau
(CMC)
Systèmes organisés
Techniques de
caractérisation
d° subst.
(dp) Type
Réf. Structure Caractérisat°
structurale
• Films de LB (série -CD)
• Films de LB mixtes :
2 / Phospholipides 182,183
mélange de CDs
amphiphiles xii,179
NH3 + Cl -
O
179,
O
O
R
180,
n
O
R
non
Complexe entre 2 et le
N-acétylphénylalanine
dans le CHCl3 180
non
• Mesures des
isothermes – A
• DLS
• Electrochimie
• IRTF
• BAM
• 4 : Agrégats
monodisperses dans le
THF (Ø ~ 350 nm) 180
• Auto-association des
dérivés -, -, et -CD-C6
(1, 2 et 3) en multicouches
sur une surface d’or
modifiée 181
n.c. n.c.
181,
182,
R = -C6H13 n = 6 1
R = -C6H13 n = 7 2
R = -C6H13 n = 8 3
R = -C12H25 n = 7 4
183
oui
Face I aire :
1,3 dp = 7
2 dp = 4
- +
OSO3 Na
O
O
non non
CMC :
1 : 10 -4 M -1
2 : 10 -4 M -1
3 : 10 -6 M -1
• Mesures de tension
de surface
Auto-organisation en
agrégats micellaires
• RMN 1 H
et 13 C
• ES-MS
• CCM
• Pouvoir
rotatoire
O
7
O
O
C5H11
O
184
Face II aire :
1,2 dp = 14
3 dp > 14
C 5H 11
peracylé, persulfaté 1
peracylé, sous-sulfaté 2
sur-acylé, persulfaté 3
- N + H(CH3) 3
OSO3 O
O
non non non
• Mesures des
isothermes – A
• TEM
• Films de LB :
monocouche stable
• vésicules mixtes
phospholipide (DMPC) /
Cholestérol / dérivé -CD
Face II aire :
dp = 14
• RMN
• MALDI-
TOF-MS
• Analyse
élémentaire
• DLS
O
n
O
O
185
O
R
R
R = CO(CH2) 14CH3 n = 6
n = 7
n= 8
xii : Observation (isothermes de compression, microscopie à angle de Brewster) de films de Langmuir-Blodgett mixtes entre les per-6-ammonium-6-désoxy-per-2,3-di-Ohexyl--CD
(ci-dessus) et les per-2,3-di-O-hexanoyl--CD (-CD-C6, Tableau page précédente) 179 .
42

Appl.
Bio.
Mise en évidence de
l’inclusion dans les
systèmes organisés
Solubilité
dans l’eau
(CMC)
Systèmes organisés
Techniques de
caractérisation
d° subst.
(dp) Type
Réf. Structure Caractérisation
structurale
• Spectroscopie à
corrélation de photons
• Potentiel zeta
• TEM
Nanocapsules sphériques
et homogènes (Ø moyen =
335 nm) : PFC-NC
Stables 35 j, à 4 et 25°C
• CCM
• IRTF
• DSC
• Analyse
élémentaire
• TOF-MS
OH
dp = 14
(> 95 %)
O
non non oui xiii
186
O
O
n
O
O
C7F15 O
C 7F 15
ROOC
X
X
X
O
O
O
187,
O
O
O 7
O
HO
188,
non non oui xiv
• Spectroscopie UV
• RMN 23 Na
• RMN 7 Li
Incorporation dans des
bicouches
phospholipidiques xiv :
vésicules mixtes (LUV)
dp ~ 14
• CCM
• pouvoir
rotatoire
• RMN 1 H et
13
C
• ES-MS
• Analyse
élémentaire
O
189,
X
190
X
X
ROOC
X = CH2 R = H, Et ou Bn 1
X = O R = H, Et ou Bn 2
OR 6
O
R 3O
non non non
• Mesures des
isothermes – A
• IRTF (réflexion)
• Microscopie à Force
Atomique
Films de LB :
Monocouches
Multicouches
dp = 14
ou 21
n.c.
OR 2
191
n
O
R2 = C8H17ou C12H25 R3 = H, CH3, C2H5 ou C8H17 R 6 = C 8H 17 ou C 12H 25
xiii : Etude in vitro de la cinétique de délivrance de l’oxygène encapsulés dans les PFC-NC.
xiv : Ces composés ont été conçus dans le but d’obtenir des canaux transmembranaires artificiels pour améliorer le transport des ions à travers les membranes cellulaires.
Malgré un taux d’insertion relativement élevé dans les modèles de membranes, ces molécules n’améliorent pas de façon significative le passage des ions métalliques
(Na + , Li + ).
43

Appl.
Bio.
Mise en évidence de
l’inclusion dans les
systèmes organisés
Solubilité dans
l’eau (CMC)
Systèmes organisés
Techniques de
Type
caractérisation
d°
subst.
(dp)
Réf. Structure Caractérisation
structurale
oui
(à pH

Appl.
Bio.
Mise en évidence de
l’inclusion dans les
systèmes organisés
Solubilité dans
l’eau (CMC)
Systèmes organisés
Techniques de
caractérisation
d° subst.
(dp) Type
Réf. Structure Caractérisat°
structurale
Pour DIMEB-Chol :
• Mise en évidence de
l’inclusion de
molécules invitées
(ex : dosulépine) à
l’intérieur des cavités
des CDs, dans les
micelles 197
• Inclusion de la
dosulépine dans les
films noirs mixtes 198
-CD-Chol :
Incorporation dans une
membrane modèle de
DMPC xvii,194,199
-CD-Chol :
insoluble
• DSC
• RMN 31 P
• Diffusion de lumière
dynamique (DLS) et
statique (SLS)
• SAXS (Diffusion de
rayons X aux petits
angles)
• SANS (Diffusion de
neutrons aux petits
angles)
•RMN 1 H (techniques
de diffusion)
• RMN 2 H
• Réflectivité de
rayons X (films noirs)
DIMEB-Chol :
Formation spontanée de
micelles sphériques
monodisperses constituées
de 24 monomères 196,197
• HPLC
• ESI-
HRMS
• RMN 1 H
et 13 C, 2D
• Analyse
élémentaire
194,
HN
195,
O
O
DIMEB-Chol
soluble
(800 g.L -1 )
CMC :
5 × 10 -6 M
NH
196,
non
dp = 1
OR
O
O HO
O
OR
O
HO
OR O
197,
6
Cholestéryl-CD
R = H CD-Chol
R = CH3 DIMEB-Chol
198,
Solubilisation de vésicules
de DMPC pour donner des
micelles mixtes
199
Films noirs mixtes
DIMEB-Chol/DMPC 198
• HPLC
HN
200 • ES-MS
O
OAc
O
AcO
OAc
O
O • RMN AcO
OAc
O
Chol-CD-Ac
1 H
et 13 dp = 1
Acétylation
C partielle xviii
• Spectroscopie à
Nanocapsules rigides et
corrélation de photon
Propionate de
monodisperses
non
oui
• Potentiel zeta
Vitamine A (PVA)
(Ø ~ 100 nm)
• HPLC
xix
xvii : Coexistence de deux phases lamellaires stables : une phase de DMPC pure (L) et une autre riche en -CD-Chol (LCD)
xix : Le degré d’acétylation de la Chol-CD-Ac varie en fonction du temps de réaction : à t = 8 h, dp ~ 14, 15 et 16, à t = 24 h, dp ~ 16, 17 et 18, à t = 72 h, dp ~ 18, 19 et 20
(dp = 20 correspondant au dérivé peracétylé). Le dérivé acétylé sur 14, 15 et 16 positions est celui qui permet d’obtenir les nanoparticules les plus stables.
xx : Encapsulation de la vitamine A dans les nanocapsules de Chol-CD-Ac et étude de pénétration dans la peau.
45

II. Relation entre structure et propriétés
physico-chimiques des cyclodextrines amphiphiles
II.1. Influence du degré de substitution
Les cyclodextrines persubstituées par des groupements hydrophobes sur la face primaire,
secondaire, ou bien sur les deux côtés ne sont en général pas solubles dans l’eau. Elles ne
s’organisent pas de manière spontanée. Les deux types de systèmes organisés obtenus à partir
de ces composés sont des films de Langmuir-Blodgett (monocouches ou multicouches)
insolubles à l’interface air/eau et des nanoparticules. Ces systèmes sont hétérogènes. De plus,
l’effondrement des chaînes sur elles-mêmes rend la cavité de ces CDs inaccessible à toute
molécule invitée.
Contrairement aux dérivés persubstitués, les CDs monosubstituées sont souvent solubles en
milieu aqueux, dans lequel elles peuvent s’organiser spontanément (formation de micelles
avec la DIMEB-Chol). Le faible degré de substitution et la solubilité dans l’eau permettent à
la cavité de ces molécules d’être très accessible aux molécules organiques pour former des
complexes d’inclusion.
Le Rapport Hydrophilie-Lipophilie (HLB) des CDs modifiées joue un rôle très important dans
leur caractère amphiphile et influence de manière considérable leurs propriétés physicochimiques
(solubilité dans l’eau, type d’organisation).
II.2. Influence de la nature du substituant
Des substituants de nature différente ont été greffés sur les CDs. Leur caractère plus ou moins
hydrophobe et leur structure influencent les propriétés d’organisation. Par exemple, dans le
cas des CDs persubstituées, l’introduction de groupements dioxyde d’éthyle à la place des
chaînes aliphatiques augmente le caractère amphiphile. Ainsi, Darcy et coll. arrivent à former
des vésicules et même des micelles allongées à partir de dérivés persubstitués. Encore une
fois, on joue sur le HLB des CDs amphiphiles pour influer sur le type d’organisation.
Récemment, des auteurs ont remplacé les chaînes hydrocarbonées par des chaînes
fluorocarbonées 165,201 , afin de diminuer l’hydrophobie des chaînes.
46

II.3. Influence de la nature de la CD
Les travaux d’Auzély et coll. illustrent très bien l’influence de la nature de la tête polaire sur
les propriétés d’organisation des cyclodextrines amphiphiles. Selon que la partie
cyclodextrine soit méthylée ou non, les dérivés cholestéryl-cyclodextrines ont des propriétés
physico-chimiques totalement différentes. Alors que la CD-Chol est totalement insoluble
dans l’eau et s’insère dans des membranes modèles de DMPC, la DIMEB-Chol se dissout
spontanément pour former à très faible concentration des micelles monodisperses. Elle
possède en outre de bonne propriétés détergentes vis-à-vis des vésicules de DMPC.
II.4. Conclusion
Il existe une étroite relation entre la structure des cyclodextrines amphiphiles et leur propriétés
physico-chimiques, dépendant du degré de substitution, de la nature du substituant et de la
nature de la CD. On peut noter également que la nature et la longueur de la jonction entre la
CD et le substituant hydrophobe peuvent avoir une influence sur l’organisation et sur les
propriétés d’inclusion.
Pour pouvoir établir des relations entre la structure et les propriétés physico-chimiques des
cyclodextrines amphiphiles, il est primordial de déterminer parfaitement la structure de ces
composés. Il y a quelques années, les techniques de caractérisation ne permettaient pas
d’élucider facilement la structure de ces macromolécules complexes (en particulier en ce qui
concerne le nombre et la position des substituants greffés sur la CD). Aujourd’hui, des
techniques puissantes telles que la Résonance Magnétique Nucléaire à haut champ et la
Spectrométrie de Masse haute résolution sont des instruments indispensables à la
caractérisation complète de cyclodextrines modifiées. Dans notre étude, nous nous appuierons
grandement sur ces techniques pour caractériser nos molécules.
Peu d’applications biologiques ont été décrites dans la littérature à partir des cyclodextrines
amphiphiles. Les quelques exemples portent principalement sur leur capacité à transporter et
faciliter le passage de principes actifs à travers les membranes cellulaires, sous forme de
nanoparticules.
47

1 ère PARTIE : LES PHOSPHOLIPIDYL-CYCLODEXTRINES
I. Introduction
Comme il a été montré dans la partie bibliographique, une large variété de cyclodextrines
modifiées a été préparée dans le but d’améliorer les propriétés de ces molécules hôtes pour la
solubilisation et la vectorisation de principes actifs. Ainsi, la préparation de dérivés
amphiphiles de cyclodextrines a été abordée depuis plusieurs années dans notre laboratoire.
L’approche consiste à combiner les capacités de transport de systèmes organisés lipidiques
(liposomes, vésicules, micelles…) à la sélectivité des CDs vis-à-vis de la taille de la molécule
à transporter.
Nous avons vu que de nombreuses études ont été entreprises en vue de mieux comprendre le
comportement de telles molécules aussi bien au niveau de leur structure que de leur capacité à
transporter des molécules invitées. Des CDs portant de multiples chaînes hydrophobes sur la
face primaire, secondaire ou sur les deux faces ont été largement étudiées. Des travaux récents
concernent les dérivés de cyclodextrines sur lesquelles est greffé un seul motif cholestérol
avec ou sans bras espaceur 194 . En fonction de la structure du composé final, des résultats
différents sont obtenus. Ainsi, seuls les composés comportant un bras espaceur s’incorporent
remarquablement bien dans des structures phospholipidiques modèles. De plus, la
modification des cyclodextrines par O-méthylation conduit à des structures moléculaires
micellaires mono-disperses et stables qui ont pu être caractérisées au moyen de nombreuses
techniques de diffusion et de RMN 196,197 .
L’objectif de cette partie est l’obtention d’une série raisonnée de nouvelles cyclodextrines
amphiphiles, où la partie cholestérol, de structure assez rigide, est remplacée par un
phospholipide, afin d’essayer de reproduire de la façon la plus proche possible, les propriétés
d’organisation des membranes naturelles. Ces nouveaux dérivés devraient permettre de mieux
corréler structure chimique et propriétés physico-chimiques telles que la solubilité en milieu
aqueux, et par là même de contrôler à priori leurs propriétés d’auto-organisation dans l’eau
(formation de micelles avec une concentration micellaire critique la plus faible possible) ou
leur incorporation dans des systèmes phospholipidiques modèles. Dans les deux cas, la
présence des cavités de cyclodextrines, libres et accessibles, permettrait le transport de
molécules hydrophobes par formation de complexes d’inclusion. On obtiendrait ainsi de
nouvelles voies de vectorisation pour le transport de principes actifs.
49

II. Synthèse des phospholipidyl-cyclodextrines
II.1. Stratégie de synthèse
Nous pouvons schématiser les cyclodextrines amphiphiles à élaborer de la façon suivante
(figure 19) :
cyclodextrine
Bras espaceur
groupements fonctionnels
50
groupement hydrophobe
Figure 19 : Représentation schématique d’un modèle de cyclodextrine amphiphile.
Pour obtenir une série raisonnée de ces nouveaux conjugués bifonctionnels de type CDespaceur-hydrophobe,
il serait possible de jouer sur plusieurs paramètres :
La nature de la cyclodextrine, ce qui induirait une modification de taille et de forme
de la tête polaire. Des travaux antérieurs ont montré (sans toutefois pouvoir l’expliquer
vraiment) que le type de cyclodextrine utilisé (-CD ou -CD) influençait de façon
drastique le positionnement des têtes polaires les unes par rapport aux autres lors du
processus d’incorporation dans des bicouches lipidiques 199 .
La modification chimique des groupes hydroxyles libres de la cyclodextrine, dans
le but de modifier de façon contrôlée la polarité de la CD (par exemple par
O-méthylation partielle ou totale).
La présence ou l’absence de bras espaceur qui semble influencer de façon
extrêmement importante les propriétés d’auto-organisation ou d’incorporation des
cyclodextrines amphiphiles. La nature et la longueur du bras espaceur pourront
également jouer un rôle important sur les propriétés physico-chimiques des composés
obtenus.

La nature du groupement hydrophobe, qui est une donnée essentielle. En effet, on
peut penser que le greffage de phospholipides devrait conduire à des cyclodextrines
amphiphiles solubles en milieu aqueux par formation de micelles ou de vésicules et/ou
en s’incorporant dans des modèles membranaires.
La stratégie que nous avons employée pour synthétiser une série de phospholipidylcyclodextrines
est la suivante :
Pour greffer la partie hydrophobe sur la cyclodextrine, la modification chimique des
macrocycles est effectuée sur la face primaire. Ceci s’explique par le fait que la modification
sélective d’un des hydroxyles primaires de la CD est chimiquement plus abordable que la
modification d’un hydroxyle secondaire, notamment grâce aux propriétés nucléophiles des
hydroxyles primaires. De plus, la majorité des molécules “invitées” s’incluent par le grand
côté (plus favorable thermodynamiquement) du macrocycle. En fonctionnalisant le petit côté,
les capacités d’accueil de la partie macrocyclique des conjugués pour des molécules invitées
devraient être préservées. La jonction entre la CD et le bras espaceur d’une part et entre le
bras espaceur et le phospholipide d’autre part est réalisée par la création d’une fonction amide
obtenue par un couplage dérivé des méthodes utilisées en synthèse peptidique. La liaison
amide présente les avantages d’être simple à former, résistante chimiquement et
biocompatible.
Le bras espaceur choisi est un diacide symétrique comme l’acide succinique, capable de se
coupler à la cyclodextrine d’un côté et à la partie hydrophobe de l’autre par des couplages de
type peptidique. Il s’agit du type d’espaceur classiquement utilisé dans notre laboratoire pour
la synthèse des cyclodextrines amphiphiles monosubstituées 110,194 .
Le groupement hydrophobe est un phospholipide possédant une fonction amine pour
permettre le couplage. Il s’agit de la 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidyléthanolamine
(DMPE), constituée de deux chaînes hydrocarbonées à 14 carbones (chaînes myristates).
Cette longueur de chaîne est la plus fréquemment rencontrée dans les systèmes organisés
phospholipidiques (liposomes). De plus, la fonction éthanolamine va avoir pour effet de
rallonger le bras espaceur et donc, d’augmenter le degré de liberté de la molécule. Ce
phénomène peut jouer un rôle important dans les propriétés d’organisation des futurs
conjugués.
51

En ce qui concerne la partie cyclodextrine, nous ne travaillerons que sur la famille des -CD.
Nous avons voulu étudier l’influence de la modification chimique des groupements
hydroxyles en préparant les conjugués phospholipidyl-cyclodextrines à partir des dérivés
mono-aminés de la -CD et de ses analogues diméthylés (DIMEB) et perméthylés
(TRIMEB).
Le schéma rétrosynthétique suivant illustre la stratégie utilisée pour préparer les
phospholipidyl-cyclodextrines (figure 20) :
R 3O
R 3O
HN
"CD-espaceur"
R 3O
O
NH
NH 2
O
OR2 O
R3O O
OH
O
OR2 O
R3O O
O
O
NH
OR2 O
R3O OR 6
OR 6
O
OR 2
O
O
OR 2
O
6
6
O P
OR 6
O-
O
O
O H
OR 2
O
+
O
O
6
O
+H 3N
O
R2 = R3 = R6 = H -CD-Succ-DMPE
R2 = R6 = CH3, R3 = H DIMEB-Succ-DMPE
R2 = R3 = R6 = CH3 TRIMEB-Succ-DMPE
R2 = R3 = R6 = H -CD-NH2 R2 = R6 = CH3 , R3 = H DIMEB-NH2 R2 = R3 = R6 = CH3 TRIMEB-NH2 52
O P O-
O O H
Figure 20 : Schéma rétrosynthétique des phospholipidyl-cyclodextrines.
O
O
O
O

Les dérivés 6 I -amino-6 I -désoxy-cyclomaltoheptaose (-CD-NH2), 6 I -amino-6 I -désoxy-2 I -O-
méthyl-hexakis(2 II-VII ,6 II-VII -di-O-méthyl)cyclomaltoheptaose (DIMEB-NH2) et 6 I -amino-6 I -
désoxy-2 I ,3 I -di-O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,3 II-VII ,6 II-VII -tri-O-méthyl)cyclomaltoheptaose
(TRIMEB-NH2) sont décrits dans la littérature 109,122,196 et ont déjà été synthétisés dans notre
laboratoire.
L’introduction du bras espaceur se fait très facilement par l’addition d’anhydride succinique
sur les dérivés aminés 110 . On obtiendra alors les composés 6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxy-
cyclomaltoheptaose (-CD-Succ), 6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxy-2 I -O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,6 II-
VII I I I I
-di-O-méthyl) cyclomaltoheptaose (DIMEB-Succ) et 6 -amidosuccinyl-6 -désoxy-2 ,3 -di-
O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,3 II-VII ,6 II-VII -tri-O-méthyl) cyclomaltoheptaose (TRIMEB-Succ).
Pour la préparation de ces précurseurs “CD-espaceur”, le principal challenge consistera à
obtenir tous ces produits avec des rendements, une pureté et des quantités suffisantes,
conditions difficiles à réaliser en chimie des cyclodextrines. Ceci impliquera d’optimiser les
conditions de synthèse et de purification.
L’étape finale consistera à greffer la DMPE, un phospholipide naturel, sur les macrocycles
fonctionnalisés, grâce à une réaction de type peptidique. Cette dernière synthèse aboutira à
une série de phospholipidyl-CDs composée de trois produits dont la nature de la partie CD
varie : la 6 I -(1,2-ditétradecanoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamido)succinylamido-6 I -
désoxy-cyclomaltoheptaose (-CD-Succ-DMPE), constituée d’une cyclodextrine totalement
hydroxylée, et ses analogues sélectivement O-méthylés sur les positions 6 et 2, la 6 I -(1,2ditétradecanoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamido)succinylamido-6
I -désoxy-2 I -O-méthylhexakis(2
II-VII ,6 II-VII -di-O-méthyl)cyclomaltoheptaose (DIMEB-Succ-DMPE), et perméthylés
sur toutes les positions hydroxyles, la 6 I -(1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3phosphoethalomamido)succinylamido-6
I -deoxy-2 I ,3 I -di-O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,3 II-VII ,6 II-VII -
tri-O-méthyl)cyclomaltoheptaose (TRIMEB-Succ-DMPE).
Cette étape demandera la mise au point des conditions opératoires de couplage pour chacun
des conjugués. Les solubilités des réactifs étant radicalement différentes (les CDs étant des
composés polaires et le phospholipide étant apolaire), il faudra trouver un mélange réactionnel
compatible. D’autre part, le couplage peptidique se faisant le plus souvent dans des conditions
basiques, nous devrons tenir compte simultanément de la réactivité du couplage et de la
stabilité chimique toute relative de la DMPE en milieu basique. Enfin, les conditions de
purification et de caractérisation de tels composés seront à optimiser.
53

II.2. Synthèse des dérivés CD-espaceur
HO
1
4
OH
5
O
OH
O
87 %
HO
OH
1) PPh 3
NH 4 OH 20%
DMF, TA, 18 h
2) Lewatit SP1080
HO
HO
NH2
O
NH
O
OH
O
O
OH
O
1) TsCl
H 2 O, NaOH
0°C, pH = 12, 5 min.
2) HCl 6N, pH = 1-2
30 %
Anhydride succinique 1,5 éq.
DMF anhydre, TA, 5 h
quantitatif
O
OH
O
HO
OH
O
HO
OH
OH
O
6
OH
O
O
OH
O
6
6
HO
3
HO
7
9
HO
8
HO
N 3
2
O
70 %
N 3
75 %
NH 2
O
HO
OH
O
O
54
S
O
HO
LiN3 H2O reflux
18 h
60 %
Me 2 SO 4
Ba(OH) 2 , BaO
DMF / DMSO
8°C, 3 j
Anh. succ. 0,9 éq.
DMF anhydre, TA, 5 h
quantitatif
O
NH
O
OCH3 O
O
OCH3 O
O
OCH3 O
HO
HO
HO
O
OH
O
OH
OCH 3
OCH3
OCH 3
O
HO
OH
O
O
OCH 3
O
O
OCH 3
O
O
6
6
OCH 3
O
OH
6
6
O
OH
O
1) PPh 3
NH 4 OH 20%
DMF, TA, 18 h
2) Lewatit SP1080
OH
O
6
H 3CO
11
86 %
H 3CO
12
H 3CO
13
N 3
NH 2
MeI, NaH
DMF anhydre
TA, 24 h
O
OCH3 O
H3CO O
OCH3 O
H3CO 90 %
OCH 3
OCH 3
O
OCH 3
O
O
OCH 3
O
Anh. Succ. 1,5 éq.
DMF anh., TA, 5 h
quantitatif
O
OCH3 O
H3CO 6 10 14
O
NH
1) PPh 3
NH 4 OH 20%
DMF, TA, 18 h
2) Lewatit SP1080
Figure 21 : Schéma réactionnel pour la synthèse des dérivés “CD-espaceur” en série -CD, DIMEB,
TRIMEB.
OH
O
OCH 3
O
OCH 3
O
6
6
6

La première étape d’activation de la -CD 1 conduit à la modification d’un seul hydroxyle de
la face primaire du macrocycle. La 6 I -(O-p-tolylsulphonyl)-6 I -désoxy-cyclomaltoheptaose 2
(-CD-OTs) est obtenue avec un rendement d’environ 30 % après une recristallisation dans
l’eau bouillante pour éliminer la -CD native régénérée lors de la réaction de tosylation. La
pureté finale du produit est contrôlée par une analyse HPLC (µBondapak C18 ; gradient
linéaire de 10 à 100 % de CH3CN dans H2O en 30 min.).
La substitution nucléophile d’un anion azoture sur la -CD monotosylée 2, en milieu aqueux
et à reflux, conduit au dérivé 6 I -azido-6 I -désoxy-cyclomaltoheptaose (-CD-N3) 3. Toutefois,
une réaction d’hydrolyse est observée de façon concomitante à la réaction de substitution
nucléophile, conduisant à la régénération d’un pourcentage non négligeable de la -CD-OTs 2
en -CD naturelle. Le produit 3 n’est pas isolé à l’état pur mais sous forme d’un mélange
constitué d’environ 65 % de -CD-N3 3 et de 35 % de -CD 1, selon une analyse réalisée par
HPLC (figure 22). Le rendement de substitution est estimé à 60 %. L’azoture de lithium est
préféré à l’azoture de sodium, car le sel de lithium généré et l’azoture de lithium en excès sont
plus solubles dans l’éthanol que leurs homologues sodiques. Ils sont donc facilement éliminés
lors de la précipitation du produit 3 dans l’éthanol.
-CD 1
-CD-N 3 3
Figure 22 : Chromatogramme du produit 3 obtenu par HPLC (colonne µBondapak C18 ; élution en mode
isocratique H2O / CH3CN 85 / 15 (v/v) en 15 min, débit : 1 ml.min -1 , détection : DEDL SEDEX 55
(T° = 40 °C, gain = 6, pN2 = 2,1 bars)).
55

La méthylation des groupements hydroxyles de la cyclodextrine se fait sur le dérivé
-CD-N3 3. En fonction des conditions opératoires utilisées, la cyclodextrine peut être soit
totalement méthylée sur tous ses groupements hydroxyles libres (série TRIMEB), soit
sélectivement méthylée, sur tous les hydroxyles situés en position 6 et 2, sans toucher à la
position 3 (série DIMEB). Ainsi, l’emploi d’une base forte (NaH) et d’un agent de
méthylation puissant (MeI) en grand excès sur la -CD-N3 3 permet d’obtenir la 6 I -azido-6 I -
désoxy-2 I ,3 I -di-O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,3 II-VII ,6 II-VII -tri-O-méthyl)cyclomaltoheptaose
(TRIMEB-N3) 11 avec un rendement de 90 %. Par contre, dans des conditions contrôlées,
c'est-à-dire en utilisant une base plus faible (Ba(OH)2, BaO) et un agent de méthylation plus
doux (Me2SO4) en quantité stoechiométrique, et à température contrôlée (8°C), on obtient la
6 I -azido-6 I -désoxy-2 I -O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,6 II-VII -di-O-méthyl)cyclomaltoheptaose
(DIMEB-N3) 7 avec un rendement de 70 %. Les réactions de O-méthylation se font en fait à
partir du mélange précédemment obtenu, c'est-à-dire en présence de la -CD-N3 3, mais aussi
de -CD. En conséquence, nous obtenons à chaque fois un mélange de DIMEB-N3 7 et de
DIMEB d’une part et un mélange de TRIMEB-N3 11 et de TRIMEB d’autre part (figure 23).
sm015 (0.052) Cu (0.10); Is (1.00,1.00) C62H107N3O34Na2 TOF MS ES+
100
742.8
743.3
4.52e12
%
0
sm015 (0.052) Cu (0.10); Is (1.00,1.00) C63H110O35Na2 TOF MS ES+
100
737.3
737.8
4.51e12
%
0
sm015 9 (0.466) Cm (5:25) TOF MS ES+
100
737.4
742.9
1.86e3
%
737.9
738.3
738.8
738.4
738.9
744.4
0
m/z
735 736 737 738 739 740 741 742 743 744 745 746 747
56
743.4
743.8
744.3
Figure 23 : Comparaison (c) du spectre de masse ESI avec détection en mode positif du produit 11 (région
des ions [M+2Na] 2+ ) avec les amas isotopiques théoriques des ions [M+2Na] 2+ de (a) la TRIMEB-N3 11
(m/z = 742,9) et de (b) la TRIMEB (m/z = 737,4).
L’étape suivante consiste en une amination nucléophile 202 des dérivés azoturés 3, 7 et 11, en
présence de triphénylphosphine et d’ammoniaque (Réaction de Staudinger). On obtient
respectivement la -CD-NH2 4, la DIMEB-NH2 8 et la TRIMEB-NH2 12 avec des
743.9
a
b
c

endements moyens de 80 à 90 %. Ces produits sont isolés à l’état pur grâce à une résine
échangeuse de cations (LEWATIT SP 1080, résine anionique forte) permettant d’éliminer les
produits non fonctionnalisés (-CD, DIMEB et TRIMEB).
Les dérivés aminés 4, 8 et 12 réagissent avec l’anhydride succinique dans le DMF pour
former quantitativement les dérivés mono-amidosuccinyl correspondants (-CD-Succ 5,
DIMEB-Succ 9 et TRIMEB-Succ 13).
Dans le cas des dérivés de la -CD 5 et de la TRIMEB 13, on travaille avec un excès
d’anhydride succinique. 5 est isolé par précipitation dans l’acétone. 13 est dissout dans le
chloroforme, et l’acide succinique insoluble (généré par l’hydrolyse de l’anhydride succinique
en excès) est filtré sur un filtre en téflon (PTFE 0,22 µm). Dans le cas de la DIMEB-Succ 9,
on utilise un léger excès de DIMEB-NH2 8. 9 est alors purifié sur une colonne échangeuse
d’ions (LEWATIT SP 1080, résine anionique forte) pour éliminer l’excès de 8, retenu par la
colonne sous forme d’ion ammonium.
Les dérivés “CD-espaceur” 5, 9 et 13 sont caractérisés par RMN haut champ et par
spectrométrie de masse basse résolution (ESI-MS)
II.3. Etape de couplage entre CD-espaceur et DMPE
II.3.1. Optimisation des conditions opératoires du couplage
Les dérivés 5, 9 et 13 possèdent une fonction acide carboxylique adéquate pour effectuer un
couplage de type peptidique sur la fonction amine portée par la DMPE.
Afin d’améliorer les rendements de couplage entre les deux protagonistes, nous avons choisi
d’activer l’acide carboxylique des précurseurs CD-espaceur en formant un ester de
N-hydroxysuccinimide, beaucoup plus réactif. Cette réaction est conduite dans le DMF
anhydre en présence d’un agent de couplage, le diisopropylcarbodiimide (DIC) et du Nhydroxysuccinimide
(NHS). Le phospholipide est mis en solution dans du CHCl3 anhydre, en
présence d’une base, la triéthylamine (Et3N), avant d’être ajouté à la cyclodextrine activée. La
présence de cette base a pour but de transformer le groupement ammonium tertiaire de la
DMPE, initialement sous forme d’un zwitterion, en une fonction amine primaire, beaucoup
plus réactive. La réaction se fait donc dans un milieu DMF / CHCl3.
57

Les conditions opératoires de couplage (stoechiométrie, temps, température, nature et quantité
de base, solvants) ont été optimisées pour chacun des trois conjugués synthétisés. Les
tableaux 1, 2 et 3 représentent les différents essais de couplage réalisés pour synthétiser la -
CD-Succ-DMPE 6 (tableau 2), la DIMEB-Succ-DMPE 10 (tableau 3) et la TRIMEB-Succ-
DMPE 14 (tableau 4).
Pour chaque essai de couplage, les réactions ont été suivies par CCM et les produits
finalement obtenus contrôlés par spectrométrie de masse (ESI-MS). A partir des résultats
obtenus, nous avons pu étudier l’influence de plusieurs paramètres.
58

Tableau 2 : Optimisation de la synthèse de la -CD-Succ-DMPE 6.
Identification
du produit
Réactifs : stoechiométrie
Rdt
Méthode de
purification
Solvant T° tps
Base
(Base/DMPE
n/n)
DMPE DIC NHS
CD-Succ
5
1,2 1 1,2 1,2 iPr2NEt (10/1) DMF / CHCl3 2/1 v/v 50 °C 72 h HPLC 26 % dégradé
1 1,2 1,2 1,2 iPr2NEt (1/1) DMF / CHCl3 1/2 v/v TA 72 h HPLC 7 % non
1 1,2 1,5 1,5 Et3N (1,5/1) DMF / CHCl3 1/1 v/v 45 °C 24 h HPLC 15 % oui
Tableau 3 : Optimisation de la synthèse de la DIMEB-Succ-DMPE 10.
Réactifs : stoechiométrie
Identification
du produit
Rdt
Méthode de
purification
Solvant T° tps
Base
(Base/DMPE
n/n)
DIC /
NHS
DMPE
CD-Succ
9
Anh.
Succ.
CD-NH2
8
1,2 1 1,5 / 1,5 iPr2NEt (10/1) DMF / CHCl3 1/1 v/v 50 °C 72 h HPLC dégradé
1,2 1 1,5 / 1,5 iPr2NEt (1/1) DMF / CHCl3 1/2 v/v 40 °C 72 h HPLC 40 % oui
1,2 1,5 / 1,5 iPr2NEt (1/1) DMF / CHCl3 1/2 v/v 35 °C 72 h HPLC 60 % oui
1 1 1
“in situ”
57 % ii oui
colonne de
silice
1 1 1
“in situ” i 1,2 1,5 / 1,5 Et3N (1,1/1) DMF / CHCl3 1/4 v/v 35 °C 24 h
i : Un équivalent du réactif 9 est obtenu “in situ” par réaction d’un équivalent de DIMEB-NH2 8 avec un équivalent d’anhydride succinique sans
purification intermédiaire.
ii : Rendement obtenu sur deux étapes à partir de la DIMEB-NH2 8
59

Tableau 4 : Optimisation de la synthèse de la TRIMEB-Succ-DMPE 14.
Identification
du produit
Réactifs : stoechiométrie
Rdt
Méthode de
purification
Solvant T° tps
Base
(Base/DMPE
n/n)
DMPE DIC NHS
CD-Succ
13
1 1 1,5 1,5 non DMF / CHCl3 1/2 v/v TA 24 h 0 % non
1 1 1,5 1,5 non DMF / CHCl3 1/2 v/v 50 °C 72 h 0 % non
1,2 1 1,5 1,5 iPr2NEt (10/1) DMF / CHCl3 1/2 v/v TA 72 h HPLC 70 % dégradé
1,2 1 1,5 1,5 iPr2NEt (1/1) DMF / CHCl3 1/2 v/v TA 72 h HPLC 50 % oui
72 % oui
colonne de
silice
1 1,2 1,5 1,5 Et3N (1,1/1) DMF / CHCl3 1/4 v/v 35 °C 24 h
60

II.3.1.1. Importance du rôle de la base
En l’absence d’une base, la réaction de couplage ne s’amorce pas. Le groupement ammonium
tertiaire du phospholipide n’est pas assez réactif pour réagir sur l’ester activé de la partie
cyclodextrine.
En présence d’un grand excès de base (environ 10 équivalents de DMPE), le couplage a lieu
avec, en général, de bons rendements mais les produits résultants sont dégradés. Le spectre de
masse de la DIMEB-Succ-DMPE 10, obtenue dans ces conditions de couplage
(DMPE / iPr2NEt 1/10 (n/n)), est représenté figure 24.
sm23_qend1 18 (1.006) TOF MS ES-
100
2032.1
751
%
0
363.2 1611.7
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800
m/z
3000
Figure 24 : Spectre de masse ESI de la DIMEB-Succ-DMPE 10 avec détection en mode négatif (ion [M] - ),
obtenu dans des conditions de couplage avec un excès de base.
La coexistence de trois composés différents est observée : le composé 10 attendu à
m/z = 2032,1 [M] - , et deux composés secondaires à m/z = 1821,9 correspondant au dérivé
avec une seule chaîne myristate (-C14H26O), et à m/z = 1611,7 correspondant au dérivé
dépourvu de ses deux chaînes grasses (-2 C14H26O). Ce phénomène est également observé
pour la -CD-Succ-DMPE 6 et la TRIMEB-Succ-DMPE 14 (dans des conditions analogues
de couplage, données non montrées). Il correspond à la saponification des esters d’acide gras
des phospholipidyl-cyclodextrines.
61
1821.9

Cette observation nous a conduit à utiliser un milieu réactionnel moins basique pour éviter
cette hydrolyse. Nous avons finalement choisi de mettre un peu plus d’un équivalent de base
pour un équivalent de DMPE (1,1 éq. pour 10 et 14, 1,5 éq. pour 6).
Notons que nous avons tout d’abord utilisé la diisopropyléthylamine qui est une base moins
réactive que la triéthylamine en raison de ses groupements plus encombrés pour réduire au
maximum les risques d’hydrolyse. Toutefois, le type de base utilisé ne s’est pas avéré
déterminant et nous avons finalement décidé d’employer Et3N.
II.3.1.2. Influence de la nature de la cyclodextrine
La nature de la cyclodextrine (hydroxylée ou méthylée) a une influence considérable sur les
conditions opératoires et sur l’efficacité de la réaction de couplage.
Comme nous l’avons vu dans la partie bibliographique, la méthylation des cyclodextrines
améliore fortement leur solubilité dans des solvants organiques variés. Ainsi, les dérivés
méthylés sont solubles dans les solvants chlorés, contrairement aux CDs naturelles.
Dans notre cas, le couplage a lieu dans un mélange DMF / CHCl3. En effet, les
mono-amidosuccinyl-CD 5, 9 et 13 sont d’abord activés efficacement dans le DMF. Quand à
la DMPE, elle est soluble dans très peu de solvants. En général, les phospholipides sont
dissous dans un mélange CHCl3 / MeOH 9/1 ou 4/1 (v/v). Or, le méthanol est un solvant
protique susceptible de réagir avec l’ester activé des dérivés CD-espaceur pour former un
ester méthylé comme produit secondaire lors du couplage peptidique. La DMPE est donc
solubilisée dans le chloroforme seul, bien que la solubilité soit médiocre.
Dans le cas de la synthèse de la DIMEB-Succ-DMPE 10 et de la TRIMEB-Succ-DMPE 14, le
couplage s’effectue facilement avec un excès de chloroforme (milieu réactionnel :
CHCl3 / DMF 4/1 (v/v)), tous les réactifs ainsi que les produits de couplage étant solubles
dans ce solvant.
Il est beaucoup plus difficile de coupler la -CD-Succ 5 avec la DMPE. En effet, la CD
naturelle n’est pas soluble dans le CHCl3 alors que la DMPE est insoluble dans le DMF. De
plus, nous n’avons pas trouvé de solvant compatible pour les deux protagonistes. Nous avons
donc décidé de nous placer dans un milieu CHCl3 / DMF 1/1 (v/v), en forçant les conditions
de température (45 °C au lieu de 35 °C pour la synthèse des dérivés méthylés 10 et 14), sans
62

altérer le phospholipide. Cette méthode permet d’obtenir la -CD-Succ-DMPE 6 avec
toutefois un rendement beaucoup plus faible que celui des homologues méthylés.
Enfin, notons que la purification de la DIMEB-Succ 9 est plus difficile que celle des
analogues -CD 5 et TRIMEB 13, et conduit à des rendements légèrement moins élevés
(80 % pour 9 au lieu de 95 à 99 % pour 5 et 13). Pour augmenter le rendement final de la
synthèse de la DIMEB-Succ-DMPE 10, le réactif 9 a donc été généré “in situ” à partir du
dérivé amino 8.
Le schéma réactionnel de l’étape de couplage entre les adduits CD-espaceur et la DMPE dans
les conditions opératoires optimisées est représenté figure 25 :
-CD-Succ-DMPE 6
HO
O
OH
O
HO
5
DIMEB-Succ-DMPE 10
HO
O
NH
OH
O
9
OCH 3
TRIMEB-Succ-DMPE 14
H 3CO
NH 2
O
NH
O
OCH3 O
HO
O
OH
O
OCH3 O
H3CO OCH 3
OCH3
O
OH
O 6
O
OCH 3
O
O
OCH 3
O
6
6
1- DIC 1,5 éq., NHS 1,5 éq.
DMF anhydre, TA, 2 h
2- DMPE 1,2 éq., Et 3N (1,6 éq.)
CHCl 3 anhydre
45 °C, 24 h
15 %
1- anhydride succinique 1 éq.
DMF anhydre, TA, 5 h
2- DIC 1,5 éq., NHS 1,5 éq.
DMF anhydre, TA, 2 h
3- DMPE 1,2 éq., Et 3N (1,3 éq)
CHCl 3 anhydre
35 °C, 24 h
57 %
1- DIC 1,5 éq., NHS 1,5 éq.
DMF anhydre, TA, 2 h
2- DMPE 1,2 éq., Et 3 N (1,3 éq.)
CHCl 3 anhydre
35 °C, 24 h
72 %
13 14
63
HO
HO
H 3CO
NH
O
O
O
OH
O
HO
NH
O
O
O
6
NH
NH
OCH3 O
HO
NH
O
O
10
O
NH
OCH3
O
H3CO O P O H
OH
O
O-
O
OH
O 6
O P O H
OCH 3
O
O-
O
OCH 3
O
O
6
O
O
O
O
O P O H
Figure 25 : Schéma réactionnel pour la synthèse des phospholipidyl-cyclodextrines 6, 10 et 14.
OCH 3
O-
O
OCH 3
O
6
O
O
O
O
O
O
O
O

II.3.2. Purification des conjugués phospholipidyl-cyclodextrines
La -CD-Succ-DMPE 6 est purifiée par HPLC sur une colonne semi-préparative à polarité de
phase normale (colonne µPorasil WATERS 10µm 125 Å, cartouche Radial-Pak
2 × 25 mm × 100 mm précédée d’une cartouche de garde) en utilisant comme éluant le
mélange suivant : A = CH3OH, B = CHCl3 / CH3OH / NH3 20 % 80/19,5/0,5 (v/v/v), A / B
10/90 (v/v), en mode isocratique. Le détecteur est un DEDL (Détecteur Evaporatif à Diffusion
de Lumière) 203 . Ce mode de détection est approprié dans le cas de produits non volatils qui ne
présentent pas de bande d’absorption dans le domaine de l’UV ou du visible tels que les
oligosaccharides par exemple.
Les analogues méthylés DIMEB-Succ-DMPE 10 et TRIMEB-Succ-DMPE 14 sont purifiés
grâce à une colonne chromatographique sur silice (gel de silice 60 FLUKA, 220 - 440 mesh
ASTM). Les produits sont élués dans un mélange CHCl3 / MeOH.
64

III. Caractérisation structurale des phospholipidyl-CDs
Afin de caractériser la structure de chacun des dérivés phospholipidyl-cyclodextrines
synthétisés, nous avons eu recours à des expériences de RMN proton et carbone, mono et
bidimensionnelles. Une étude par spectrométrie de masse à basse et haute résolution a
également été réalisée pour compléter l’analyse de ces conjugués.
III.1. Analyse structurale des composés par RMN haut champ
Dans un premier temps, les spectres proton et carbone à une dimension de la -CD-Succ-
DMPE 6, de la DIMEB-Succ-DMPE 10 et de la TRIMEB-Succ-DMPE 14 ont été réalisés
respectivement dans la pyridine (pyr-D5) pour 6 et dans le chloroforme (CDCl3) pour 10 et
14. Mais, les seules expériences RMN 1D ne suffisent pas pour effectuer l’attribution
complète de la centaine de protons (respectivement 138, 164 et 178 pour 6, 10 et 14) et des
nombreux signaux 13 C des phospholipidyl-cyclodextrines. De plus, il faut souligner que les
protons des unités glucoses de la partie cyclodextrine sont inéquivalents en raison de la perte
de symétrie de la CD provoquée par la monosubstitution. Ils ont donc tous un déplacement
chimique différent, ce qui explique l’étalement des signaux de la partie saccharidique sur les
spectres 1 H (figure 27).
Pour réaliser l’attribution des spectres RMN 1 H et 13 C des phospholipidyl-cyclodextrines,
nous avons donc eu recours à la RMN bidimensionnelle. La stratégie générale employée est la
suivante (figure 26) :
Attribution des signaux protons et carbones : COSY, COSY relayés, DEPT, HMQC,
Séquençage de la molécule : HMBC, NOESY / ROESY.
Il va être possible de relier tous les déplacements chimiques des signaux 1 H et 13 C des
molécules étudiées à partir de ces expériences RMN. Celles-ci nous fournissent de précieuses
informations sur les couplages scalaires entre les protons (COSY, COSY relayés) et entre les
protons et les carbones (HMQC, HMBC), ainsi que des informations sur les proximités
spatiales entre les protons via les couplages dipolaires (NOESY / ROESY).
65

RO
NH
O
O
O
OR
O
NH
RO
OR
O P
O
O-
O
OR
O
O H
6
O
O
66
O
O
COSY
NOESY / ROESY
HMBC
Figure 26 : stratégie générale pour l’analyse structurale par RMN.
Cette stratégie a permis la caractérisation RMN 1 H et 13 C des trois molécules 6, 10 et 14
(cf. partie expérimentale). L’illustration sera faite sur l’exemple de la -CD-Succ-DMPE 6.
III.1.1. Attribution du spectre proton de la -CD-Succ-DMPE 6
Sur le spectre RMN 1 H monodimensionnel du composé 6, enregistré à 298 K dans la pyridine
deutériée, en présence de 20 µL de D2O pour échanger les protons labiles des groupements
hydroxyles, certains signaux peuvent être facilement repérés (figure 27) :
Les signaux des protons anomères H-1 des unités glucoses de la CD. Ils sont plus
déblindés que les autres protons de la structure saccharidique, en raison de
l’électronégativité des atomes d’oxygène en position qui réduisent très sensiblement
la densité électronique au niveau du proton acétalique ;
les deux protons amides issus des couplages entre la CD et l’espaceur (NHCD) et entre
l’espaceur et le phospholipide (NHDMPE) qui se situent vers les champs faibles
(8,5 - 9 ppm) ;
les groupements méthyle terminaux des chaînes grasses myristates du phospholipide
(H-14 et H-14) qui forment un triplet caractéristique dans les champs forts ;
le CH du motif glycérol du phospholipide (H-), situé dans la même zone que les
protons anomères de la CD.

O
1
O
H O
NH
O
P
O
O-
O
1
O c d
O
a b O
NH
4
6
5
O
OH
HO
3
2
OH 1
O 4
HO
6
5
3
O
2
OH
1
O
6
NH amides
H-
8.8 ppm 5.6 5.4 ppm ppm
9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 ppm
67
H-1
14
14
Me H-14 / H-14
Figure 27 : Spectre RMN 1 H de la -CD-Succ-DMPE 6 (500,13 MHz, 25 mM, pyr-d5, 298 K).
Ces repères vont servir de point de départ pour attribuer plus en détail le spectre. Pour cela,
plusieurs types d’expériences RMN bidimensionnelles complémentaires sont utilisées.
L’expérience COSY 204,205 (COrrelation SpectroscopY) homonucléaire 1 H- 1 H exprime les
couplages scalaires entre deux protons voisins (couplages géminaux et viscinaux) grâce à un
transfert d’aimantation entre les spins. Les séquences COSY relayés 206 permettent de pousser
plus loin l’aimantation en poursuivant les transferts de polarisation via les couplages scalaires.
Elles permettent d’exprimer les couplages scalaires à plus longue distance.
Ces expériences vont permettre d’attribuer les signaux des protons H-1 à H-6 portés par les
unités glucose de la CD selon la stratégie schématisée en figure 28 :
HO
H
4
3
H
6
OH
5
H
H
2
O
OH
1
O
H
n
COSY
COSY simple relais
COSY double relais
COSY triple relais
Figure 28 : Stratégie générale pour l’attribution RMN des signaux des protons des unités glucose de la
partie cyclodextrine.

Ainsi, en considérant la zone de déplacement chimique des protons anomères, la carte du
COSY fait apparaître des tâches de corrélation scalaire entre les protons H-1 et les protons
H-2 de la CD (figure 29 a).
La carte du COSY simple relais offre une information supplémentaire. L’aimantation est
transférée du proton H-1 vers le proton H-2, puis de H-2 vers H-3. Nous observons donc des
tâches de corrélation scalaire entre les protons H-1, H-2 et H-3 de la CD (figure 29 b).
De même, la carte du COSY double relais fait apparaître les corrélations scalaires entre les
protons H-1, H-2, H-3 et H-4 de la CD (figure 29 c). Une tâche correspondant au déplacement
chimique de H-5 apparaît en plus sur la carte du COSY triple relais (figure 29 d).
(a)
(b)
(c)
(d)
ppm
5.5
ppm
5.5
ppm
5.5
ppm
5.5
H- H-’ H-
4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 ppm
H-3
4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 ppm
H-3 H-4
4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 ppm
H-3 H-5 H-4
4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 ppm
68
H-2
H-2
H-2
H-2
H-1
H-
Figure 29 : Contours partiels des cartes (a) COSY, (b) COSY simple relais, (c) COSY double relais et
(d) COSY triple relais du composé 6 (500,13 MHz, 25 mM, pyr-d5, 298 K).
H-1
H-1
H-1

La séquence COSY quadruple relais n’est pas utilisée pour l’attribution des signaux des
protons H-6 et H-6’. En effet, on observe une baisse de sensibilité quand on augmente le
nombre de transferts, car d’une part, toute l’aimantation issue de H-1 est diluée
progressivement sur l’ensemble des spins, et d’autre part, les temps de transfert deviennent de
plus en plus longs et non négligeables devant le temps de relaxation transversale, conduisant à
des pertes importantes de signal par relaxation en T2. Toutefois, la plupart du temps, les
signaux des protons H-6 et H-6’ peuvent être attribués à partir de la carte COSY grâce à
déplacement chimique de H-5 (figure 30).
ppm
4.0
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
4.7
4.8
H-5 / H-6
4.7 4.6 4.5 4.4 4.3 4.2 4.1 ppm
69
H-5
H-5 / H-6’
H-4 / H-5
Figure 30 : Contours partiels de la carte COSY du composé 6 (500,13 MHz, 25 mM, pyr-d5, 298 K).
De la même manière, les signaux des protons de la partie phospholipide sont attribués grâce
aux cartes COSY et COSY relayés (figures 31 et 29 a).

(a)
(b)
ppm
ppm
3
4
4
NH DMPE NHCD
H-
H-
H-
H-6’
H-6
H-6’
H-6
H-5 I
ppm
1.0
1.5
2.0
O
1
O
H O
NH
O
P
O
O-
O
1
O c d
O
a b O
NH
4
HO
6
5
3
O
2
OH 1
O
OH
6
4
5
O
HO
3
2
OH
1
O
H-2 / H-3
H-2 / H-3
H-2, H-2
2.5
2.6 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 ppm
70
6
H-3 / H-4
H-3 / H-4
H-4 à H-13,
H-4 à H-13
H-3, H-3
H-13 / H-14
H-13 / H-14
14
14
H-14, H-14
Figure 31 : Contours partiels des cartes (a) et (c) COSY et (b) COSY simple relais du composé 6
(500,13 MHz, 25 mM, pyr-d5, 298 K).
Il est possible de différencier les protons de l’unité glucosidique substituée des protons portés
par les six autres unités. En partant du proton amide porté par la cyclodextrine (NHCD), les
cartes COSY et COSY relayés permettent d’attribuer H-6 I et H-6’ I (COSY), H-5 I (COSY
simple relais) et ainsi de suite jusqu’à H-1 I (figure 30). Nous verrons un exemple de
l’attribution complète de l’unité saccharidique substituée ultérieurement.
III.1.2. Attribution du spectre carbone de la -CD-Succ-DMPE 6
Le spectre RMN 13 C découplé proton du composé 6, enregistré dans la pyridine deutériée
(+ 20 µL de D2O) à 298 K est présenté figure 32.
(c)

160 140 120 100 80 60 40 20 ppm
Figure 32 : Spectre RMN 13 C de la -CD-Succ-DMPE 6 (125,77 MHz, 25 mM, pyr-d5, 298 K).
De la même manière que pour le spectre 1 H, l’attribution du spectre 13 C nécessite l’utilisation
de la RMN 2D.
Le 13 C possède une faible abondance naturelle (1 %) et un rapport gyromagnétique quatre fois
plus faible que celui du proton. Par conséquent, la sensibilité d’observation du 13 C est
beaucoup plus faible et un bon rapport signal sur bruit nécessite de long temps d’acquisition.
Pour augmenter la sensibilité d’observation, on utilise souvent des méthodes basées sur le
principe du transfert de polarisation. Il permet de transférer les propriétés magnétiques des
protons au carbone qui leur est couplé ( 1 JC-H), ce qui permet en première approximation
d’augmenter la sensibilité d’observation du 13 C d’un facteur 4.
La séquence HMQC 207 (Heteronuclear Multiple Quantum Correlation) a été utilisée pour
l’attribution complète des signaux 13 C. Celle-ci est effectuée à partir des tâches de corrélation
hétéronucléaire via les couplages 1 JC-H. Cette séquence va permettre d’attribuer sans
ambiguïté les carbones, à partir des protons qui leurs sont liés scalairement et qui ont été
précédemment attribués.
Le grand intérêt de cette séquence est que le mode de détection est inversé par rapport à une
séquence classique de corrélation 13 C- 1 H (HETCOR). Avec la séquence HETCOR, le
71

transfert d’aimantation s’effectue entre les protons et les carbones et la détection se fait sur le
carbone. Le transfert de polarisation rend observable l’aimantation des carbones détectés avec
la sensibilité des protons. Le gain d’intensité en 13 C est d’un facteur 4 (soit le rapport
gyromagnétique H / C). En détection inverse (HMQC), on utilise le proton à la fois comme
initiateur du transfert d’aimantation hétéronucléaire et comme noyau observé. La sensibilité
de détection est nettement améliorée et les temps d’acquisition beaucoup plus courts qu’avec
une séquence classique.
ppm
60
80
100
H-1/C-1
ppm
60
70
80
90
5.5 5.0 4.5 4.0 ppm
H-6 / C-6
H-3 / C-3
4.7 4.6 4.5 4.4 4.3 4.2 4.1 4.0 3.9 3.8 ppm
72
H-6’ / C-6
H-5 / C-5
H- / C-
H-4 / C-4
H-2 / C-2
H-4 I / C-4 I
Figure 33 : Contours partiels de la carte HMQC du composé 6 (500,13 MHz, 25 mM, pyr-d5, 298 K).
Par exemple, les signaux carbones C-1 à C-6 des unités glucose de la cyclodextrine sont
facilement caractérisés à partir des signaux protons H-1 à H-6, dont les déplacements
chimiques sont connus (cf. attribution du spectre proton), via les taches de corrélations
hétéronucléaires (figure 33).

Par ailleurs, Bengsch et coll. 208 ont mis en évidence que l’ordre de déplacement chimique des
signaux 13 C des acides gras saturés suivent une règle empirique générale qui est schématisée
par la représentation pyramidale ci-dessous (figure 34).
Figure 34 : Pyramide de l’ordre de déplacement chimique des signaux RMN 13 C d’acides gras saturés.
De manière surprenante, on s’aperçoit que le déplacement chimique des signaux RMN 13 C
des acides gras aliphatiques suit un ordre systématique, qui ne correspond pas à l’ordre
d’enchaînement des carbones sur la chaîne.
Les expériences d’attribution ont permis de vérifier que cette règle s’applique aux signaux 13 C
des esters d’acide gras de la partie phospholipidique des conjugués phospholipidylcyclodextrines
(figure 35).
73

(a)
C-2
35
C-12
C-4 C-11
30
C-3
25
C-13
ppm
15
20
25
30
35
20
HMQC
C-2 / H-2
2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 ppm
74
C-14
15
C-3 / H-3
10
C-14 / H-14
C-13 / H-13
C-12 / H-12
Figure 35 : (a) spectre RMN 13 C partiel du composé 6 (125,77 MHz, 25 mM, pyr-d5, 298 K) et (b) contours
partiels de la carte HMQC (500,13 MHz, 25 mM, pyr-d5, 298 K). Région des signaux carbones et protons
des chaines hydrocarbonées.
III.1.3. Séquençage de la molécule
La séquence RMN bidimensionnelle NOESY 209 (Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY),
permet d'étudier la relaxation spin-réseau longitudinale simultanément pour tous les protons
présents dans une molécule. On peut, en utilisant cette séquence, mettre en évidence des
proximités spatiales inter-nucléaires (< 5 Å). Ces noyaux peuvent être portés par la même
molécule, ou bien, par deux molécules différentes.
En fonction du champ de fréquence de l’appareil RMN (0, Fréquence de Larmor) et du
temps de corrélation de la molécule observée (C), l’effet Overhauser (effet NOE) peut-être
positif, négatif ou nul (figure 36). Lorsque 0C 1, alors, l’effet NOE est proche de zéro et
aucun signal dipolaire n’est observé sur la carte NOESY, même si la distance entre deux
protons est inférieure à 5 Å.
(b)

Figure 36 : Intensité de l'effet NOE maximal en fonction de log (c).
Cet inconvénient de la séquence NOESY peut néanmoins être contourné en utilisant la
séquence ROESY 210 (Rotating frame Overhauser Effect SpectroscopY). Cette expérience
présente l’avantage d’avoir un effet Overhauser (effet ROE) toujours positif quelque soit la
valeur de 0C (figure 37).
Figure 37 : Effet Overhauser nucléaire maximal dans le cas du ROESY en fonction de log (0c).
Malheureusement, l’expérience ROESY possède un défaut lié à sa séquence d’impulsions. En
effet, l'application d'un champ radiofréquence durant la période de mélange rend cette
séquence très similaire à la séquence TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY), bien que les
puissances de champ mises en jeu ne soient pas du même ordre de grandeur, et que le cycle de
phase soit différent. Aussi, observe-t-on, en plus des signaux ROE, des signaux de corrélation
scalaire dus à l’effet de transfert Hartmann-Hahn (HOHAHA) 211,212 . Ce phénomène (dit ROErelais
ou relais-ROE) est plus particulièrement observé pour les dérivés glucidiques.
Des séquences plus récentes, nommées ROESY hors résonance 213,214 et T-ROESY 215,216
(Tranverse ROESY) sont deux approches destinées à améliorer la séquence ROESY de base.
75

Elles diffèrent dans leurs approches conceptuelles, mais visent toutes les deux à diminuer les
contributions TOCSY inhérentes à la séquence de base du ROESY.
Pour étudier les proximités spatiales entre les différents protons des phospholipidylcyclodextrines,
nous avons choisi d’utiliser l’expérience T-ROESY. Cette expérience va nous
permettre de relier les différentes parties de la molécule les unes aux autres : la CD au bras
espaceur et le bras espaceur au phospholipide via les couplages dipolaires (figure 38).
ppm
8.65
8.70
8.75
8.80
5 I
6 I 6’ I
4 I
H- H-
4.4 4.2 4.0 3.8 3.6 3.4 3.2 3.0 2.8 2.6 ppm
76
H-Succ
H-Succ
Couplages dipolaires
H
NH
4
HO
6
H O
5
2
3 H OH 1
H
H O
CD
NH CD
O
NH DMPE
O
NH
bras
espaceur
O O
P
O
O
Figure 38 : Contours partiels de la carte T-ROESY du composé 6 (500,13 MHz, 25 mM, pyr-d5, 298 K,
tm = 300 ms).
DMPE
La séquence HMBC (Heteronuclear Multiple Bound Correlation) exprime les couplages
scalaires à longue distance entre les carbones et les protons portés par un atome voisin. Cette
expérience est très pratique pour détecter indirectement les carbones quaternaires couplés à un
proton. Elle permet dans notre cas d’effectuer l’attribution des carbones quaternaires des
groupes carbonyles des fonctions amides des phospholipidyl-CDs. C’est également un moyen

de séquencer les différentes parties de la molécule (CD-NH-CO-espaceur-NH-COphospholipide).
Les spectres RMN du proton et du carbone de la -CD-Succ-DMPE 6 ont été entièrement
caractérisés par le recoupement de toutes les informations obtenues à partir des expériences
RMN bidimensionnelles. Les séquences COSY et COSY relayées nous ont permis de relier
entre eux les protons couplés scalairement. Les déplacements chimiques des signaux du
carbone ont été attribués grâce aux expériences DEPT, HMQC et HMBC qui expriment les
couplages scalaires hétéronucléaires entre les protons et les carbones. Enfin, le séquençage
des différentes parties de la phospholipidyl-cyclodextrine est effectué grâce à l’expérience
T-ROESY, qui permet de relier entre eux les protons proches dans l’espace via les couplages
dipolaires, et à la séquence HMBC. La même stratégie a été appliquée pour attribuer les
spectres proton et carbone de la DIMEB-Succ-DMPE 10 et de la TRIMEB-Succ-DMPE 14
(Cf partie expérimentale).
III.2. Identification exacte des produits grâce à la spectrométrie de
masse basse et haute résolution
Pour caractériser la structure de molécules telles que les phospholipidyl-cyclodextrines dont
l’architecture est complexe, la RMN bidimensionnelle à haute résolution est une technique
très puissante. Toutefois, pour valider rapidement la structure des produits et évaluer leur
pureté, des techniques d’analyses physico-chimiques complémentaires sont nécessaires.
Nous avons vu dans la partie bibliographique que l’analyse élémentaire n’est pas la technique
de contrôle la mieux appropriée pour les dérivés de cyclodextrines. Nous avons donc choisi
de ne pas utiliser cette méthode, et avons eu recours à la spectrométrie de masse à basse et
haute résolution.
Les spectres de masse de la -CD-DMPE 6, de la DIMEB-Succ-DMPE 10 et de la
TRIMEB-Succ-DMPE 14 purifiées ont été acquis à l’aide d’une source électrospray (Q-TOF),
en utilisant un mode de détection positif et négatif. Les cations et les anions formés dans la
source d’ionisation sont détectés grâce à un détecteur à temps de vol. Ces spectres sont
présentés figure 39 et indiquent un haut degré de pureté des trois composés.
77

NSTR023D_R3_L1 6 (0.623) Cm (4:8) 1: TOF MS ES+
100
959.9
4.61e3
%
1896.8
[MNa]
a
+
[MNa + 2Na] 2+
0
854.3
1278.4
NSTR023D_R3_L2 14 (1.450) Cm (9:14) 1: TOF MS ES-
100
1849.9
7.69e3
b
%
819.3
973.9 1232.4
1639.7
0
NSTR023E_R3_L1 11 (1.141) Cm (9:12) 1: TOF MS ES+
100
1051.1
6.74e3
c
%
0
NSTR023E_R3_L2 13 (1.349) Cm (10:13) 1: TOF MS ES-
100
2033.1
2.36e3
d
%
1058.6
1414.7
0
NSTR049A_R3_L1 4 (0.417) Cm (4:7) 1: TOF MS ES+
100
1096.6
2.02e4
e
%
0
NSTR049A_R3_L4 4 (0.417) Cm (3:6) 1: TOF MS ES-
100
2131.2
[M]
1.68e3
f
-
%
0
[MNa + 2Na] 2+
[MNa + 2Na] 2+
1107.6 1512.8
800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 m/z
78
[M] -
2079.2
[MNa] +
[M] -
2177.2
[MNa] +
Figure 39 : Spectres de masse ESI des phospholipidyl-cyclodextrines avec détection en mode positif et
négatif : CD-Succ-DMPE 6 (a, b), DIMEB-Succ-DMPE 10 (c, d) and TRIMEB-Succ-DMPE 14 (e, f).
Les amas isotopiques expérimentaux des ions [M] - et [MNa+2Na] 2+ des dérivés 6, 10 et 14
sont en accord avec les amas isotopiques théoriques, calculés à partir des formules brutes,
comme le montre la figure 40 pour le cation doublement chargé de la
TRIMEB-Succ-DMPE 14.

sm022 (0.053) Cu (0.10); Is (1.00,1.00) C99H176N2O44PNa3 TOF MS ES+
100
1100.06
3.35e12
1099.56
%
0
sm022 22 (1.177) Cm (5:25) TOF MS ES+
100
1100.04
1.02e3
1099.56
%
0
m/z
1098 1099 1100 1101 1102 1103
79
1100.56
1100.54
1101.07
1101.07
1101.57
1101.56
Figure 40 : Amas isotopique théorique (a) et experimental (b) de l’ion [MNa+2Na] 2+ de la
TRIMEB-Succ-DMPE 14.
Une observation attentive de la région de l’ion [M] - du spectre de masse de la
DIMEB-Succ-DMPE 10 (figure 41) révèle la présence de deux ions supplémentaires à
m/z = 2046,1 (+14 u) et 2060,1 (+28). Ces impuretés, qui ne sont pas observées sur les
spectres de 6 et de 14, peuvent être certainement attribuées à la méthylation partielle des
hydroxyles en position 3 pendant la réaction contrôlée de 2,6-diméthylation. Pour confirmer
cette hypothèse et pour éliminer toute possibilité de modification située sur la partie Succ-
DMPE, des expériences de spectrométrie de masse en tandem (MS / MS) ont été mises en
œuvre. Les spectres issus du processus de dissociation CID (Collision Induced Dissociation)
des ions précurseurs à m/z = 2046,1 et 2032,1 sont présentés figure 41. Ces spectres sont
identiques, et montrent des ions fragments de basse masse à m/z = 153,1 (C3H6O5P), 227,3
(C14H27O2) et 363,2 (C17H32O6P), caractéristiques d’un bloc Succ-DMPE inchangé. Ces
observations confirment la sur-méthylation de la cyclodextrine et sont en accord avec les
données bibliographiques 217 .
a
b

sm23_qend1 17 (0.951) Cm (10:30) TOF MS ES-
100
%
2032.1
2046.1
a
1.35e4
2060.1
0
m/z
2010 2015 2020 2025 2030 2035 2040 2045 2050 2055 2060 2065 2070 2075 2080
sm23_qmnd2 15 (0.783) Cm (10:30) 1: TOF MSMS 2046.09ES-
100
%
227.3
363.2
b
3.08e3
153.1
2047.2
0
m/z
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200
sm23_qmnd1 29 (1.516) Cm (10:30) 1: TOF MSMS 2032.05ES-
100
227.3
4.19e3
%
0
363.2
153.1
2032.2
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
m/z
2200
Figure 41 : (a) spectre de masse ESI de la DIMEB-Succ-DMPE 10 avec détection en mode négatif (région
de l’ion [M] - ) et MS/MS (b) de m/z = 2046,1 et (c) de m/z = 2032,1.
Finalement, des mesures de masse exacte de 6, 10 et 14 ont été réalisées en mode négatif, sur
les ions [M ] - et en mode positif, sur les ions [MNa +Na] + avec une résolution de masse de
5000, en utilisant NaI comme étalon interne, introduit de manière continue par un second
nébuliseur (Lockspray). Les résultats de ces mesures sont présentés dans le tableau 5.
Tableau 5 : Mesures de masse exacte des phospholipidyl-cyclodextrines 6, 10 et 14.
Composé Ion
6
10
14
M
Masse
mesurée
80
Masse
calculée
c
ppm Formule
1849,8464 1849,8360 5,6 C79H138N2O44P
[MNa+Na] + 1895,8080 1895,8156 4,0 C79H138N2O44PNa2
M
2032,0479 2032,0395 4,1 C92H164N2O44P
[MNa+Na] + 2078,0178 2078,0190 0,6 C92H164N2O44PNa2
M
2130,1614 2130,1490 5,8 C99H178N2O44P
[MNa+Na] + 2176,1230 2176,1286 2,5 C99H178N2O44PNa2
On constate que la déviation observée entre la masse exacte calculée et la masse mesurée est
de l’ordre de grandeur de l’erreur de mesure due à l’appareillage (5 ppm). Ces résultats
valident sans aucun doute la formule brute des composés 6, 10 et 14.

III.3. Conclusion
Nous avons donc synthétisé trois conjugués phospholipidyl-cyclodextrines à base de
cyclodextrines de natures variées (méthylation ou non des hydroxyles libres). La préparation
de ces produits a été réalisée à l’échelle de plusieurs centaines de milligrammes, en cinq ou
six étapes de synthèse, suivies d’une étape de purification par HPLC, dans le cas de la
-CD-Succ-DMPE 6, ou sur colonne chromatographique de silice, dans le cas des dérivés
DIMEB-Succ-DMPE 10 et TRIMEB-Succ-DMPE 14. Chacun de ces produits a fait l’objet
d’une caractérisation structurale par spectroscopie RMN 1 H et 13 C mono et bidimensionnelle.
Une analyse complémentaire par spectrométrie de masse a permis de confirmer la formule
brute de ces conjugués et de contrôler leur pureté. D’autres analyses physico-chimiques ont
été réalisées (CCM, HPLC, Infra-Rouge, pouvoir rotatoire, point de fusion) et sont exposés
dans la partie expérimentale.
Il va maintenant être intéressant d’étudier le comportement de ces molécules amphiphiles en
milieu aqueux. Il s’agira en fait de répondre aux questions suivantes : ces nouveaux dérivés
ont-ils des propriétés d’organisation dans l’eau ? Si oui, quel est la structure des objets
organisés en solution ? Quelle influence la méthylation de la partie cyclodextrine a-t-elle sur
les propriétés physico-chimiques des phospholipidyl-cyclodextrines dans l’eau ? Enfin, les
phospholipidyl-cyclodextrines conservent-elles les propriétés d’inclusion de la partie CD ?
81

IV. Propriétés d’organisation en milieu aqueux des
phospholipidyl-cyclodextrines méthylées
Ces nouvelles cyclodextrines amphiphiles ont été préparées dans le but de les utiliser comme
de nouveaux matériels capables de s’auto-assembler dans l’eau ou de s’insérer dans des
assemblages supramoléculaires tels que des liposomes ou des micelles, à l’image des
cholestéryl-cyclodextrines 196 .
Dans un premier temps, le comportement des phospholipidyl-cyclodextrines a été testé en
milieu aqueux. Alors que la -CD-Succ-DMPE 6 présente une solubilité nulle ou quasi-nulle
dans l’eau, les dérivés méthylés 10 et 14 se solubilisent spontanément dans l’eau jusqu’à des
concentrations supérieures à 100 mM, formant une solution colloïdale de plus en plus
opalescente lorsque la concentration augmente. L’hypothèse d’un processus d’agrégation
pourrait expliquer ce phénomène.
Nous mettrons tout d’abord en évidence l’existence de ce phénomène d’auto-organisation par
une étude RMN du proton dans l’eau et par des mesures de tension de surface. Des
expériences de diffusion de la lumière nous permettrons ensuite d’avoir des indications
supplémentaires sur la forme et la taille de ces objets. A partir de ces données, nous essaierons
d’établir une hypothèse sur le type de structure organisée qui se forme en solution.
L’évolution de ces structures en fonction de certains paramètres (pH, tampon, temps) sera
également abordée en utilisant les mêmes méthodes.
IV.1. Etude RMN 1 H dans l’eau
En première approximation, les spectres RMN 1 H des conjugués DIMEB-Succ-DMPE 10 et
TRIMEB-Succ-DMPE 14 ont été réalisés dans l’eau. Nous avons alors comparé l’allure de
ces spectres à ceux effectués dans le chloroforme dans les mêmes conditions de concentration
(5 mM) et de température (25 °C) (figure 42).
82

(a)
5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5
ppm
(b)
(c)
5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5
ppm
(d)
7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 ppm
7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 ppm
Figure 42 : Spectres RMN 1 H (500,13 MHz) partiels de (a), (b) la DIMEB-Succ-DMPE 10 et (c), (d) de la
TRIMEB-Succ-DMPE 14, réalisés respectivement dans (a), (c) le CDCl3 et dans (b), (d) D2O à 25 °C et à la
même concentration, égale à 5 mM.
Il apparaît de manière flagrante que les raies des spectres RMN de 10 et 14 sont beaucoup
plus larges dans l’eau que dans le chloroforme. Or, on sait que la largeur à mi-hauteur des
signaux RMN 1 H est directement liée au temps de relaxation transversale T2, et donc au temps
de corrélation C (en première approximation, on considère C comme étant le temps
nécessaire à une molécule ou un objet pour faire une rotation d’un radian sur lui-même). Ce
temps dépend lui-même du coefficient de diffusion des particules en solution, et varie en
fonction du rayon hydrodynamique des objets observés, de la viscosité du solvant et de la
température (loi de Stokes-Einstein).
83

Dans notre cas, la largeur des raies RMN dans l’eau est significative de la présence d’objets
de grosse taille, issus de la formation de systèmes supramoléculaires de phospholipidylcyclodextrines.
Si, effectivement, les conjugués 10 et 14 s’auto-organisent en milieu aqueux, ce phénomène
doit être caractérisé par l’existence d’une concentration micellaire critique (CMC), c'est-à-dire
une concentration à laquelle ces composés passent de l’échelle moléculaire à l’échelle
supramoléculaire. Des mesures de tension de surface vont permettre de déterminer cette
CMC, si celle-ci existe.
IV.2. Détermination de la CMC par mesures de tension de surface
IV.2.1. Principe de la méthode
IV.2.1.1. Définition de la tension superficielle
Les surfaces liquides ont la propriété de se contracter spontanément de façon à acquérir une
aire minimale pour diminuer leur énergie superficielle. Cela se traduit notamment par une
tension superficielle qui peut-être modifiée par la présence de molécules étrangères
(tensio-actifs).
A l’intérieur d’un liquide, les forces d’attraction ou forces de Van der Waals entre les
molécules sont égales dans toutes les directions. Par contre, à la surface, en l’absence
d’attraction compensatrice vers l’extérieur, ces molécules sont soumises à une force résultante
non nulle, dirigée vers l’intérieur. Ainsi, la surface paraît se contracter.
La “force” attirant les molécules vers l’intérieur du liquide se traduit mécaniquement par un
travail dW correspondant à la portion de surface dS. La tension superficielle, notée S, est
définie par le rapport :
dW
S (1)
dS
où S s’exprime habituellement en millinewton par mètre (mN.m -1 )
84

La thermodynamique définit la tension superficielle S comme l’énergie superficielle libre par
unité de surface, qui se manifeste par le travail à fournir pour augmenter la surface d’un
liquide de façon isotherme et réversible.
IV.2.1.2. Mesure de la tension de surface par la méthode de Wilhelmy 218
L’appareillage utilisé pour mesurer les tensions de surface par la méthode de la plaque de
Wilhelmy 219 est assez simple : un récipient contenant le liquide à analyser et une plaque reliée
par un fil à un appareil de mesure de force. Ce dispositif permet de mesurer les tensions de
surface.
La plaque est placée juste en contact avec le liquide à analyser (figure 43). Une certaine
quantité de liquide monte alors par capillarité sur la plaque. Cette quantité est fonction de la
tension de surface et de la densité du liquide. Le poids du liquide qui monte est compensé par
la tension de surface, et peut être mesuré.
Figure 43 : Représentation schématique du dispositif de la plaque de Wilhelmy. L : longueur de la plaque,
l : épaisseur de la plaque, : angle entre la plaque et l’interface.
La relation entre la force et la tension de surface prend en compte les dimensions de la plaque
(longueur et épaisseur) et l’angle de contact, comme le montre l’équation suivante :
F
(2)
( 2L
2l)
cos
où L et l représentent respectivement la longueur et l’épaisseur de la plaque, et l’angle de
contact. La masse de la plaque est tarée avant les mesures. Les matériels sont choisis pour
85

donner un angle de mesure le plus proche de zéro. Ainsi, la plaque est généralement en
platine, dont la surface émérisée, permet un meilleur mouillage.
La méthode de la plaque de Wilhelmy présente un avantage important : le détachement de la
plaque du liquide n’est pas nécessaire. Pour cette raison, la cinétique d’adsorption des
surfactants n’est pas une cause d’erreur importante dans la mesure.
Cette méthode convient bien à l’étude de cinétique d’adsorption de surfactants qui adsorbent
lentement, tels que les polymères (protéines…).
IV.2.1.3. Détermination de la CMC
La concentration micellaire critique est déterminée à partir des courbes de variation de la
tension superficielle, s, en fonction de la concentration en tensioactif. La CMC correspond à
la discontinuité des courbes s = f(Log C).
IV.2.2. Résultats
Les tensions de surface ont été mesurées sur une série de solutions de concentrations
croissantes de DIMEB-Succ-DMPE 10 et de TRIMEB-Succ-DMPE 14, dans l’eau pure à
20 °C. Les courbes de tension de surface en fonction de la concentration (s = f(Log C)) sont
représentées figure 44 :
Tension de surface (mN.m -1 )
55
50
45
40
35
30
25
-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1
86
Log C
DIMEB-Succ-DMPE 10
TRIMEB-Succ-DMPE 14
Figure 44 : Courbes de tension de surface des solutions de DIMEB-Succ-DMPE 10 (pointillés) et de
TRIMEB-Succ-DMPE 14 (trait plein) dans l’eau à 25 °C en fonction de la concentration

Une concentration micellaire critique est mise en évidence pour les deux composés 10 et 14
par le changement de pente, ici à la tension de surface de 38 mN.m -1 à des concentrations très
faibles. En effet, la CMC est estimée à 2 × 10 -4 mol.L -1 pour la DIMEB-Succ-DMPE 10 et
10 -5 mol.L -1 pour son analogue perméthylée 14. Ces résultats indiquent une grande faculté
d’association des phospholipidyl-cyclodextrines méthylées, qu’on retrouve chez d’autres
dérivés de CDs amphiphiles monosubstituées comme la cholestéryl-DIMEB
(CMC = 5 × 10 -6 mol.L -1 ) 196 .
Les phospholipides seuls sont caractérisés par une CMC beaucoup plus basse (de l’ordre de
10 -10 à 10 -12 mol.L -1 ) mais leur solubilité est également extrêmement faible.
Par ailleurs, il est intéressant de constater que les composés 10 et 14 sont solubles (solubilité
apparente) à des concentrations nettement supérieures à leur valeur de CMC respective (entre
1000 et 10000 fois la valeur de la CMC) (Tableau 6). Cette caractéristique est propre aux
composés qui possèdent d’excellentes propriétés de surfactant.
Tableau 6 : CMC et solubilités des phospholipidyl-CDs 6, 10 et 14.
CMC Solubilité apparente
-CD-Succ-DMPE 6 / Nulle ou quasi-nulle
DIMEB-Succ-DMPE 10 2 × 10 -4 mol.L -1
TRIMEB-Succ-DMPE 14 1 × 10 -5 mol.L -1
87
> 10 -1 mol.L -1
> 10 -1 mol.L -1
Pour étudier l’influence du pH et de la force ionique sur la CMC des phospholipidylcyclodextrines,
la CMC de la TRIMEB-Succ-DMPE 14 a été mesurée en milieu tamponné
(tampon phosphate 0,1 M, pH = 7,4). La valeur de la CMC est identique à celle trouvée dans
l’eau pure.
La détermination des CMC de 10 et de 14 permet d’affirmer que les phospholipidylcyclodextrines
forment des systèmes supramoléculaires dans l’eau à faible concentration. La
diffusion de lumière va permettre d’obtenir des informations sur les tailles et la structure de
ces objets organisés.

IV.3. Caractérisation des systèmes organisés par diffusion de la
lumière
La diffusion de radiations est utilisée depuis déjà plusieurs années comme technique non
invasive pour la détermination de la taille des particules en suspension ou en aérosols 220 .
Deux approches expérimentales fondamentalement différentes sont utilisées. Dans la première
approche, les fluctuations de l’intensité de lumière diffusée résultant du mouvement diffusif
des particules sont enregistrées et analysées par auto-corrélation. Cette approche étudiant les
fluctuations de l’intensité, quand elle est appliquée à la diffusion de lumière, est connue sous
une large variété de noms : Diffusion quasi-élastique de la lumière (QELS), Spectroscopie de
Fluctuation de l’Intensité (IFS), Spectroscopie de Corrélation de photons (PCS), Diffusion
Dynamique de la Lumière (DLS). La seconde approche implique la mesure de l’intensité
moyenne de la lumière, de rayons X ou de neutrons diffusés par les particules en fonction de
l’angle de diffusion (). En fonction de la source de radiation, ces techniques sont nommées
Diffusion Statique de la Lumière (SLS), Diffusion des Rayons X aux Petits Angles (SAXS) et
Diffusion de Neutons aux Petits Angles (SANS).
Dans cette partie, nous utiliserons exclusivement la diffusion de lumière pour obtenir des
informations sur la taille, la distribution de taille et la forme des objets organisés, formés par
les phospholipidyl-cyclodextrines dans l’eau.
IV.3.1. Le vecteur de diffusion : q
En diffusion de lumière, un échantillon de particules en suspension est soumis à un faisceau
incident monochromatique ( = 514,5 nm). Lorsque la lumière rencontre ces particules, elle
est rediffusées dans toutes les directions. Grâce à l’utilisation de fentes, la lumière diffusée à
un angle , mesuré à partir du faisceau principal, peut être détectée et analysée (figure 45).
88

I 0
Lumière incidente
Volume de diffusion
89
Angle de diffusion
I
Lumière
diffusée
Figure 45 : Géométrie du montage optique de l’appareil de diffusion de lumière
k s
k 0
Détecteur
Le transfert d’impulsion résultant d’un tel processus est défini comme la différence vectorielle
entre le vecteur d’onde incident k0 et le vecteur d’onde diffusé ks. Cette différence vectorielle,
appelée le vecteur de diffusion (q), a une valeur qui peut être obtenue à partir de la formule
suivante :
4n0
q sin( ) (3)
2
où n0 est l’indice de réflexion du milieu dans lequel sont dispersées les particules et est la
longueur d’onde (dans le vide) du rayon incident. L’unité de la valeur q est l’inverse d’une
longueur. q -1 donne donc l’échelle de longueur qui sera sondée par la lumière diffusée à
l’angle . Aux petits angles, q -1 est large et la lumière diffusée dans cette direction contiendra
seulement des informations grossières sur les propriétés dynamiques et structurales des
particules. Au contraire, la lumière diffusée à un grand angle contient des informations plus
fines et peut, par exemple, apporter des renseignements sur la structure interne des particules.

IV.3.2. Diffusion Dynamique de la Lumière (ou quasi-élastique) : DLS ou QELS
IV.3.2.1. Principe
La diffusion dynamique de la lumière est une technique très utilisée pour déterminer la taille
moyenne et la distribution de taille de particules en suspension, mesurant de quelques
nanomètres à quelques micromètres.
En DLS, nous nous intéressons aux fluctuations de l’intensité au cours du temps, sur quelques
microsecondes, dues au mouvement brownien des particules dans la solution. Le rayon
hydrodynamique et la densité des particules peuvent alors être déterminés de la façon
suivante : un facteur de structure dynamique S(q, ) est définit comme la fonction d’auto-
corrélation (“fac”) du champ électrique diffusé. Pour les solutions idéales monodisperses,
c’est une exponentielle décroissante :
D
. q
S(
q,
) e e
t ²
Dt est le coefficient de diffusion translationnel de la particules (en m².s -1 ). Pour des sphères, il
est relié au rayon hydrodynamique de la particule par la formule de Stokes-Einstein :
kT
Dt
(5)
6RH
avec RH : Rayon hydrodynamique des particules,
k : Constante de Boltzman
T : Température
: Viscosité
Dt : Coefficient de diffusion translationnelle
Expérimentalement, on mesure la fonction d’auto-corrélation de l’intensité diffusée
(figure 46) G() = t = A e -2 t + B où = Dt × q² dans la cas d’un système de
particules rigides, monodisperses et compactes. Dans ce cas, la pente des courbes
Log () = f (Log (q)) sera égale à 2.
90
(4)

IV.3.2.2. Résultats
Figure 46 : Fonction d’auto-corrélation de l’intensité diffusée
Les courbes Log () = f (Log (q)) ont été tracées pour des solutions de TRIMEB-Succ-DMPE
14 et de DIMEB-Succ-DMPE 10, à une concentration de 10 -3 mol.L -1 dans l’eau à 25 °C
(figure 47). Elles sont obtenues en mesurant pour chaque échantillon les valeurs de à partir
des fonctions d’auto-corrélation de l’intensité diffusée à différents angles (30°, 45°, 60°, 90°,
120° et 150°). Dans les deux cas, la pente de la droite est égale à 3.
Log ()
4,50
4,00
3,50
3,00
2,50
2,00
1,50
1,00
DIMEB-Succ-DMPE 10
TRIMEB-Succ-DMPE 14
y = 3,0568x + 11,396
R 2 = 0,9945
91
y = 2,9961x + 11,298
R 2 = 0,9936
-3,20 -3,10 -3,00 -2,90 -2,80 -2,70 -2,60 -2,50 -2,40
Log (q)
Figure 47 : Courbes de diffusion dynamique Log () = f (Log (q)) tracées pour des solutions de
DIMEB-Succ-DMPE 10 (trait plein) et de TRIMEB-Succ-DMPE 14 (pointillés) à 10 -3 mol.L -1 dans l’eau,
à 25 °C

IV.3.3. Diffusion Statique de la Lumière (ou élastique) : SLS
IV.3.3.1. Principe
La diffusion statique de la lumière est utilisée dans la détermination des masses moléculaires,
du rayon et de la structure des particules. Elle permet également d’étudier les interactions
entre les particules.
En SLS, on considère la valeur moyenne de l’intensité diffusée. Celle-ci est donc constante au
cours du temps, mais varie en fonction de l’angle entre les faisceaux incident et diffusé.
L’intensité diffusée, ou facteur de Rayleigh, peut se mettre sous la forme générale :
I
q dn / dc
4
² n²
4
N
A
²
CMP
qSq, C
KCMPqSq,
C
avec q : vecteur de diffusion
n : indice de réfraction de la solution
C : concentration massique en particules diffusantes
: longueur d’onde
P : facteur de forme des particules
S : facteur de structure
M : masse molaire des particules
S(q,C) est le facteur de structure et caractérise les interactions au sein de l’échantillon. En
milieu dilué :
0, C
S C O
1
(7)
1
2MA
C
où A2 représente le second coefficient de viriel. S tend vers 1 lorsque la concentration tend
vers 0 (milieu très dilué).
92
2
(6)

P(q) est le facteur de forme, il dépend de la taille et de la structure des particules.
Pour qRg > 1 :
MP
où D représente la dimension fractale.
q En milieu très dilué, l’équation (6) devient :
q I
C
1
~ (9)
D qRg
93
q KMP (10)
En première approximation, les courbes Log (I(q)/C) = f (Log (q)) apporteront des
informations sur la taille et la structure des particules. En effet, d’après l’équation (10), la
valeur de la pente de ces courbes sera directement liée à la valeur du rayon de giration (Rg²) et
donc à la géométrie des particules.

Ainsi, si les particules observées sont des bâtonnets, la pente des courbes tend vers -1. Dans le
cas où les objets en solution sont des pelotes gaussiennes, alors la pente sera plus proche
de -2.
IV.3.3.2. Résultats
Dans un premier temps, l’évolution des courbes Log (I(q)/C) = f (Log (q)) en fonction du
temps a été étudiée pour une solution de DIMEB-Succ-DMPE 10 dans l’eau à 25 °C, à une
concentration de 10 -3 mol.L -1 (figure 48).
Log (I(q)/C)
6,30
6,10
5,90
5,70
5,50
5,30
5,10
4,90
4,70
4,50
94
y
x
1,5
-3,40 -3,30 -3,20 -3,10 -3,00 -2,90 -2,80 -2,70 -2,60 -2,50
Log (q)
Figure 48 : Evolution des courbes de diffusion statique Log (I(q)/C) = f (Log (q)) en fonction du temps (j 0,
j + 1, j + 5 et j + 8), tracées pour une solution de DIMEB-Succ-DMPE 10 à 10 -3 mol.L -1 dans l’eau, à 25 °C.
La valeur de la pente des droites est environ égale à -1,5. Elle n’évolue pas de manière
significative avec le temps.
Une étude identique a été réalisée avec une solution de TRIMEB-Succ-DMPE 14 dans l’eau à
25 °C, à une concentration de 10 -3 mol.L -1 (figure 49).
j0
j + 1
j + 5
j + 8

Log (I(q)/C)
6,20
6,00
5,80
5,60
5,40
5,20
5,00
4,80
4,60
y
x
1,5
y
x
1
-3,50 -3,40 -3,30 -3,20 -3,10 -3,00 -2,90 -2,80 -2,70 -2,60 -2,50
95
Log (q)
Figure 49 : Evolution des courbes de diffusion statique Log (I(q)/C) = f (Log (q)) en fonction du temps (j 0,
j + 1, j + 2, j + 6 et j + 8), tracées pour une solution de TRIMEB-Succ-DMPE 14 à 10 -3 mol.L -1 dans l’eau,
à 25 °C.
Les résultats sont similaires à ceux observés avec la DIMEB-Succ-DMPE 10. Toutefois, on
constate que les valeurs des pentes fluctuent légèrement plus au cours du temps. Notons qu’au
jour j = 0, la pente est plus faible qu’aux jours suivants et tend vers -1.
L’influence de la concentration a également été étudiée. Des solutions de
DIMEB-Succ-DMPE 10 ont été préparées à deux concentrations différentes et supérieures à
la CMC (2 × 10 -4 et 10 -3 mol.L -1 dans l’eau à 25 °C). Les courbes Log (I(q)/C) = f (Log (q))
obtenues sont représentées figure 50 . Les pentes des deux droites sont identiques et tendent
vers -1,5.
j0
j + 1
j + 2
j + 6
j + 8

Log (I(q)/C)
7,50
7,00
6,50
6,00
5,50
5,00
4,50
y
x
-3,3 -3,2 -3,1 -3 -2,9 -2,8 -2,7 -2,6 -2,5
96
1,5
Log (q)
2e-4 mol/L
1e-3 mol/L
Figure 50 : Evolution des courbes de diffusion statique Log (I(q)/C) = f (Log (q)) en fonction de la
concentration, tracées pour des solutions de DIMEB-Succ-DMPE 10 à 10 -3 et 2 ×10 -4 mol.L -1 dans l’eau, à
25 °C et à j + 8.
IV.3.4. Discussion
Des expériences de diffusion de lumière ont été réalisées sur des solutions de
DIMEB-Succ-DMPE 10 et de TRIMEB-Succ-DMPE 14 dans l’eau à 25 °C, à une
concentration supérieure à la concentration micellaire critique. Pour les deux espèces étudiées,
les résultats obtenus à partir des courbes de diffusion sont identiques.
En diffusion dynamique, la pente des droites Log () = f (Log (q)) tend vers 3. Or, dans le cas
d’un système constitué de particules monodisperses, rigides et compactes la pente est égale à
2. Il semble donc que les phospholipidyl-cyclodextrines 10 et 14 ne s’organisent pas sous
forme de micelles sphériques ou de vésicules monodisperses. Une pente proche de 3 est
caractéristique d’objets fluctuants et polydisperses.
En diffusion statique, les pentes des courbes Log (I(q)/C) = f (Log (q)) tendent vers une
valeur de -1,5 et ne varient pas en fonction du temps. De plus, il a été montré dans le cas de la
DIMEB-Succ-DMPE 10 que pour deux concentrations différentes supérieures à la CMC, les
pentes étaient identiques et égales à -1,5. A partir de ces résultats, on peut émettre l’hypothèse

que ces objets sont de long tubes fluctuants et polydisperses dont la forme générale varie entre
le bâtonnet rigide (caractérisé par une pente de -1) et la pelote statistique (caractérisée par une
pente de -2).
Dans le cas de la TRIMEB-Succ-DMPE 14, la pente est proche de -1 au jour j = 0 et tend vers
-1,5 à partir de j + 1. La cinétique de l’auto-organisation pourrait donc être plus lente qu’avec
la DIMEB-Succ-DMPE 10. De plus, les valeurs des pentes qui fluctuent de manière plus
importante autour de -1,5 pourraient signifier que les systèmes organisés sont un peu moins
stables avec le dérivé 14. Toutefois, ces remarques ne restent que des suppositions et n’ont
pas été vérifiées.
Enfin, on n’observe pas aux petits angles l’amorce d’un plateau sur les courbes de diffusion
statique, ce qui signifie que la taille des particules observées est au moins supérieure à
l’inverse du vecteur de diffusion à min = 20°, c'est-à-dire supérieure à 200 nm.
IV.4. Conclusion
L’utilisation de plusieurs techniques physico-chimiques différentes et complémentaires
(RMN 1 H, mesure de tensions de surface, diffusion dynamique et statique de la lumière) a
permis de montrer sans ambiguïté que contrairement à la -CD-Succ-DMPE 6, les dérivés
méthylés sur la partie cyclodextrine 10 et 14 formaient spontanément des systèmes
supramoléculaires à de très faibles concentrations. Ce phénomène d’auto-organisation a été
mis en évidence par la détermination de leur CMC (2 × 10 -4 mol.L -1 pour 10 et 10 -5 mol.L -1
pour 14). Enfin, des informations sur la structure et la taille des objets observés en solution
ont été apportées grâce à la diffusion de lumière. Les phospholipidyl-cyclodextrines semblent
s’organiser sous forment de fibres micellaires (micelles allongées) fluctuantes et
polydisperses de taille supérieure à 200 nm.
L’intérêt de ces composés, rappelons-le, repose sur leur capacité à combiner les propriétés de
transport de systèmes organisés avec les capacités des cyclodextrines à encapsuler des
principes actifs. Il s’agit donc maintenant de prouver que la partie macrocyclique des
phospholipidyl-CDs conserve ses propriétés d’inclusion au sein de ces nouveaux objets
supramoléculaires.
97

V. Propriétés d’inclusion des phospholipidyl-CDs
Les cyclodextrines sont des molécules très intéressantes à cause principalement de leurs
remarquables propriétés à former des complexes d’inclusion avec de petites molécules
hydrophobes dans l’eau pour les rendre hydrosolubles et améliorer leur biodisponibilité quand
il s’agit de principes actifs par exemple. Il est donc très important de prouver que la cavité de
la partie cyclodextrine conserve son pouvoir d’encapsulation moléculaire au sein des
systèmes organisés formés par ces nouveaux dérivés amphiphiles.
De nombreuses méthodes d’investigations électrochimiques et spectroscopiques permettent de
mettre en évidence les phénomènes de complexation entre les cyclodextrines et une (ou des)
molécule(s) invitée(s). Cependant, l’une des méthodes de choix pour étudier les complexes
d’inclusion moléculaire reste la RMN 221 .
V.1. Etude par RMN des complexes d’inclusion dans les
cyclodextrines
La formation d’un complexe d’inclusion impliquant une cyclodextrine “hôte” et une molécule
organique “invitée” peut-être décrite par la réaction générale :
nC + mI
98
k 1
k -1
C nI m
où C, I et CnIm représentent respectivement la cyclodextrine, la molécule “invitée” et le
complexe d’inclusion pour une stoechiométrie n:m. La constante d’équilibre ou constante
d’association apparente, Ka, du complexe est donnée par la relation :
K
a
m n
Cn
Im
C I
où [CnIm], [C] et [I] sont les concentrations respectives des espèces présentes en solution à
l’équilibre thermodynamique.
(11)

V.1.1. Incidence du phénomène d’échange sur l’observation en RMN
L’interaction entre deux molécules en solution met en jeu un phénomène important en RMN,
l’échange, essentiellement l’échange chimique mais aussi l’échange conformationnel. De
nombreux paramètres RMN (le déplacement chimique, les constantes de couplages, les temps
de relaxation) sont représentatifs des différents aspects de ce type d’interaction.
Dans le cas de la formation d’un complexe entre deux molécules, un équilibre entre les
formes libres et associées implique un échange caractérisé par une constante de vitesse
globale k = k1 + k-1. A l’échelle de la RMN, pour une fréquence d’observation donnée, trois
cas sont à envisager (figure 51) :
l’échange lent (k > | liée - libre | ) : un seul déplacement chimique est observé au
barycentre de libre et de liée ;
l’échange intermédiaire (coalescence) (k | liée - libre | ) : une seule raie large est
visible au barycentre de libre et de liée.
Echange
Lent
Coalescence
Echange
Rapide
l
Figure 51 : Illustration de l’influence de la vitesse d’échange sur la forme des raies et sur les valeurs de
déplacements chimiques des signaux obtenus en RMN
99
obs
c

La majorité des complexes d’inclusion des petites molécules organiques dans les
cyclodextrines donnent lieu, quand ils sont étudiés à haut champ ( 400 MHz) à température
ambiante et en milieu aqueux, à un échange rapide en RMN du proton et du carbone. Dans ce
cas, un seul signal est observé pour les formes libres et associées, et sa fréquence de
résonance dépend des concentrations respectives en cyclodextrine et en molécule “invitée”, et
de la valeur de la constante d’association apparente.
V.1.2. Mise en évidence directe de la complexation par les déplacements
chimiques en RMN 1 H
En présence d’un champ magnétique B0, les fréquences de résonance des noyaux d’une
molécule étant liées à leur environnement, tout phénomène induisant une modification du
champ magnétique effectif B ’ 0 ressenti par un noyau donné provoquera le déplacement de son
signal dans le spectre RMN. L’encapsulation d’une molécule organique par une cyclodextrine
induit des modifications de la densité électronique locale à l’intérieur de la cavité entraînant
des variations de déplacements chimiques de certains protons des molécules “hôte” et
“invitée”.
L’inclusion d’un cycle benzénique induit des effets d’anisotropie importants qui sont mis en
évidence par les variations des fréquences de résonance des protons situés à l’intérieur de la
cavité de la CD, H-3 et H-5, alors que les fréquences de résonance des protons H-2, H-4 et
H-1, situés à l’extérieur de la cavité, sont peu affectés par la complexation (figure 52).
_
+ +
_
C
Figure 52 : Représentation du cône d’anisotropie créé par la délocalisation des électrons d’un cycle
aromatique et influence de ce cône sur les protons H-3 et H-5 de la cyclodextrine
Les déplacements des protons H-3 et H-5, observés vers les champs forts, proviennent des
effets de courants de cycles générés par les électrons de la molécule aromatique invitée. Ils
sont relativement faibles puisqu’ils sont moyennés par les mouvements de la molécule
100
H 4
H 2
H 3
H 5
H 5
H3
H 4
H 2

incluse. Comme les effets d’anisotropie diminuent rapidement avec la distance, les protons les
plus proches du cycle insaturé sont les plus touchés. Les effets importants d’anisotropie
magnétique subis par les protons à l’intérieur de la cavité, prouvent sans ambiguïté l’existence
du phénomène d’inclusion des composés aromatiques. Les liaisons C-C insaturées, les
groupements nitro et les carbonyles sont également capables d’induire de tels effets sur les
protons H-3 et H-5 de la CD.
En général, pour la molécule invitée, les variations de déplacement chimique des protons
induites par le cycle de la cyclodextrine se produisent vers les champs forts. Ces
modifications sont relativement faibles n’excédant pas 1 ppm.
V.1.3. Détermination de la stoechiométrie du complexe cyclodextrine /
molécule “invitée”
Deux cas de figure peuvent se présenter :
le complexe formé n’est pas ou peu soluble dans l’eau et précipite sous forme d’un
solide ;
le complexe est soluble dans l’eau.
Dans ce dernier cas, et en présence d’un échange lent à l’échelle de temps RMN, la
stœchiométrie du complexe formé est déterminée directement à partir du spectre RMN du
proton. En effet, les molécules hôte et invitée donnent chacune des signaux discernables pour
les formes libres et complexées. L’intégration des signaux du complexe permet la
détermination de r = n/m.
Dans la situation d’échange rapide, la stœchiométrie du complexe n’est pas directement
accessible. On a alors recours à des expériences de titration, appelées “méthode des variations
continues” ou “méthode de Job” 222,223 (les équations sont développées en annexe II). Cette
technique permet de déterminer le coefficient stœchiométrique d’un complexe de
cyclodextrine, en absence de tout autre phénomène compétitif d’association, en observant
l’évolution d’une variable physico-chimique au cours d’une titration. En maintenant constante
la somme des concentrations totales en cyclodextrine [C]t et en molécule “invitée” [I]t tout au
long de la titration, la concentration en complexe [CnIm] est maximale lorsque la fraction
[C]
molaire en cyclodextrine t
y
y satisfait à la relation
[C] t [I]
t
1 y
101
n
m
223 .

En général, en RMN, la variable observée est le déplacement chimique des protons, obs de la
molécule invitée I (les constantes de couplage ou les vitesses de relaxation pouvant en théorie
être aussi utilisées). Compte tenu de l’échange rapide :
ou encore
obs
[I] m [C
I ]
m [C
l
(12)
nI
m ] Ic
t
[I] t
n m I
I
( ) [C I ] m (
) [C I ] cte (13)
c
[I] t obs I l n m
I l n m
où Il et Ic sont respectivement les déplacements chimiques correspondant à la molécule
“invitée” libre et au complexe pur.
Le produit ( -
) étant directement proportionnel à [CnIm], est donc fonction
[I] obs I l
t
de y. La courbe ( -
) f(y) passera par un maximum lorsque la composition du
[I] obs I l
mélange répondra à la condition :
t
y
1 y
n
m
.
La même démarche peut être effectuée pour la cyclodextrine et confirmer ainsi la
stœchiométrie du complexe.
V.1.4. Détermination de la constante d’association d’un complexe 1:1
Pour un complexe de stœchiométrie 1:1, l’équation de réaction s’écrit : C + I CI
V.1.4.1. Cas d’un échange lent
Dans le cas d’un échange lent, les concentrations totales en molécule “invitée” et en
cyclodextrine étant connues, l’intégration des signaux des protons de chacune des espèces
libre et complexée permet d’accéder très simplement aux concentrations de C, I et CI et donc
à la valeur de la constante d’association Ka.
102

V.1.4.2. Cas d’un échange rapide
Méthode de Benesi-Hildebrand
Dans le cas d’un échange rapide, la constante d’association n’est pas directement accessible.
Une des approches possibles est la méthode développée par Benesi-Hildebrand (Hanna-
Ashbaugh) 224,225 dans laquelle la concentration de la molécule organique hydrophobe est
généralement maintenue constante, alors que celle de la cyclodextrine varie dans une gamme
donnée de concentrations. Au cours de la titration, la variable observable est, en général, le
déplacement chimique des protons de la molécule “invitée” quand elle est hydrophobe. Cette
approche permet de déterminer graphiquement Ka à condition que l’espèce non observée soit
en large excès (d’au moins un facteur 10) par rapport à l’espèce observée.
Dans ces conditions, on établit la relation 225,226 qui correspond à l’équation d’une droite de
type y = ax + b (où
a
K a
1
I c
et b
1 ).
I c
I c
1 1 1
(14)
K
[C]
a
où = obs - Il est le déplacement chimique induit, Ka la constante d’équilibre et [C] t la
concentration totale en cyclodextrine (les équations qui aboutissent à cette relation sont
développées en annexe III).
La pente et l’ordonnée à l’origine des droites obtenues en portant 1/ en ordonnée en
fonction de 1/[C]t en abscisse permettent d’atteindre les deux paramètres recherchés Ic et
Ka. Toutefois cette méthode reste restrictive quant aux conditions expérimentales. Seule
l’exploitation de protons présentant de larges variations lors du processus d’inclusion est
reportée, la méthode devenant très imprécise pour de faibles variations de déplacement
chimique. De plus la méthode de Benesi-Hildebrand (Hanna-Ashbaugh) n’est valable que
pour des constantes d’association faibles et pour une gamme de concentrations en
cyclodextrine très restreinte. En effet, lorsque la valeur de la constante d’association devient
importante, la pente de la droite diminue fortement et par voie de conséquence la précision de
la détermination de la constante d’association 227 . Enfin cette procédure implique que les
valeurs des déplacements chimiques de la molécule invitée soient connues à l’état libre (ceci
103
t
I c

nécessite que la molécule sous sa forme libre soit suffisamment soluble dans l’eau pour
permettre l’enregistrement d’un spectre RMN).
Méthode itérative pour la détermination de Ka et des paramètres dans le
complexe pur : la procédure COMPLEX
Une autre approche plus générale, permettant de s’affranchir de toutes les conditions
restrictives, consiste à utiliser les données expérimentales (obs) acquises pour déterminer la
stoechiométrie avec la méthode des variations continues, et à les traiter mathématiquement.
Dans le cas d’un complexe 1:1, la constante d’équilibre (11) devient :
Ka
CI
CI (15)
où [C], [I] et [CI] sont les concentrations respectives des espèces présentes en solution à
l’équilibre thermodynamique. Soient [I]t et [C]t les concentrations totales de molécule
“invitée” et de cyclodextrine dans l’échantillon, on peut écrire les relations suivantes :
I I t CI
(16)
C CtCI
(17)
En échange rapide, nous pouvons de plus appliquer la relation suivante :
Iobs [I]t = Ic [CI] + Il [I] (18)
où Iobs, Il, Ic représentent la valeur du déplacement chimique observé pour un proton
de la molécule “invitée” et ses valeurs à l’état libre et dans le complexe pur, respectivement.
La combinaison des équations (15), (16), (17) et (18) aboutit à l’équation suivante pour
l’espèce I :
C t
I obs
1
I obs
I ( I t ( K a ( )) 1)
c
104
I c
(19)

La condition Ic non nul est toujours remplie si un complexe est formé et si le paramètre
observé a des valeurs différentes dans les états libre et complexé.
On peut obtenir une équation similaire pour l’espèce C :
I
t
C c
( t
C obs
1
a
C obs
C ( K ( )) 1)
Les équations (19) et (20) sont donc constituées de trois variables expérimentales (obs, [I]t
et [C]t) et de deux inconnues (Ka et c). Les données expérimentales sont traitées
mathématiquement à l’aide d’une procédure de régression des moindres carrés
multiparamétriques afin d’accéder aux valeurs calculées des deux inconnues Ka et c. Un
programme réalisé au laboratoire (programme COMPLEX 228 ) permet d’effectuer cette
opération dans le cas de complexes de stoechiométrie 1:1. Cet algorithme peut-être appliqué à
chacun des protons des deux molécules formant le complexe et utilisé sans aucune restriction
concernant les concentrations des deux espèces. La fiabilité de la méthode est confirmée par
l’homogénéité des résultats obtenus pour différents protons. En revanche, si les valeurs de Ka
calculées pour plusieurs protons diffèrent entre elles de plus de 10 %, alors l’hypothèse d’un
complexe unique de stoechiométrie 1:1 est remise en cause, d’autres types d’association ou
l’existence d’interactions compétitives (aggrégation, micellisation,…) doivent être envisagés.
V.1.5. Détermination de la structure tridimensionnelle des complexes de
cyclodextrines
L’observation des variations des déplacements chimiques donne un nombre d’informations
limité sur la structure d’un complexe d’inclusion de cyclodextrine. En effet, lorsque la taille
de la molécule “invitée” est importante par rapport à la cavité de la CD, ce ne sont pas
forcément les protons de la partie incluse qui présentent les variations de déplacement
chimique les plus importantes. Des expériences RMN 2D (ou 1D sélectif) permettant de
mettre en évidence les interactions dipolaires entre les deux protagonistes sont indispensables
pour appréhender la structure tridimensionnelle des complexes.
105
C c
(20)

On relève dans la littérature quelques exemples d’études de complexes d’inclusion de
cyclodextrines mis en évidence par la séquence NOESY. Toutefois, la majorité des complexes
supramoléculaires formés avec les cyclodextrines en solution aqueuse à température proche
de l’ambiante présente un effet NOE pratiquement nul à haut champ (~ 500 MHz).
Généralement, on ne peut donc pas observer de signal de relaxation croisée entre les protons
de la CD et ceux de la molécule “invitée” avec la séquence NOESY. Pour l’étude
tridimensionnelle des complexes, nous préférerons alors utiliser la séquence T-ROESY (pour
des raisons que nous avons expliquées précédemment dans le chapitre III.1.3).
V.2. Résultats et discussion
La -CD forme généralement de très bons complexes d’inclusion avec les dérivés du benzène,
qui s’insèrent dans la cavité par le grand côté du macrocycle. Höfler et coll. 229 ont montré que
la force du complexe dépend fortement de la taille et de la position des substituants portés par
le cycle benzénique.
Nous avons choisi d’utiliser le sel de 4-tert-butylbenzoate de sodium (4-tBuPhCOO - Na + )
comme molécule “invitée” modèle pour étudier les propriétés d’inclusion des phospholipidylcyclodextrines
en raison de ses excellentes aptitudes à former des complexes forts avec les
dérivés de la -CD. De plus, cette molécule est soluble dans l’eau sous forme de sel et les
signaux 1 H du spectre RMN sont facilement caractérisables (figure 53).
H-B/H-B’
H-C/H-C’
7.8 ppm
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 ppm
106
H-tBu
H D' H
C C'
H
H 3C
B
O
CH3 CH3 C
A
B'
O - Na +
H
H-tBu
Figure 53 : Spectre RMN 1 H du 4-tert-butylbenzoate de sodium (500,13 MHz, 5 mM, D2O, 298 K)

Toutefois, mettre en évidence les propriétés de complexation de la DIMEB-Succ-DMPE 10 et
de la TRIMEB-Succ-DMPE 14 n’est pas aisé. En effet, ces CDs amphiphiles forment, à très
faible concentration, des systèmes organisés qui rendent impossible une étude
thermodynamique des complexes en raison des phénomènes d’interactions compétitives.
Il sera préférable, dans un premier temps, de déterminer les paramètres thermodynamiques et
structuraux des complexes formés entre les CDs seules (DIMEB et TRIMEB) et le
4-tBuPhCOO - Na + . Nous pourrons ensuite extrapoler ces résultats pour l’étude de
complexation des phospholipidyl-cyclodextrines 10 et 14. Notons que l’insolubilité de la
molécule 6 ne permet pas une étude de ces propriétés d’inclusion par RMN en milieu aqueux.
V.2.1. Etude par RMN du complexe TRIMEB / 4-tBuPhCOO - Na +
La première étape de cette étude consiste à mettre en évidence le phénomène d’inclusion entre
la TRIMEB et le 4-tBuPhCOO - Na + . En comparant les spectres RMN 1 H de la TRIMEB seule
dans l’eau, et en présence du 4-tBuPhCOO - Na + dans des proportions équimolaires, on observe
des variations de déplacement chimique des protons H-3 et H-5, situés à l’intérieur de la
cavité de la CD (figure 54 a et b). De la même manière, l’enregistrement des spectres
RMN 1 H du 4-tBuPhCOO - Na + seul dans l’eau, et en présence de TRIMEB, montre les
variations de déplacement chimique que subissent les protons aromatiques de la molécule
invitée (figure 54 c et d).
107

(a)
(b)
(c)
(d)
H-5/H-6
4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4 3.3 ppm
4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4 3.3 ppm
H-B/H-B’
H-4
H-3
H-C/H-C’
8.0 7.9
7.8
7.7
7.6
7.5
7.4 ppm
H-B/H-B’
H-4/H-6
H-6’
H-5
8.0 7.9
7.8
7.7
7.6
7.5
7.4 ppm
H-3
H-6’
108
H-2
H-2
H-C/H-C’
H 3CO
H 3C
H D' H
C C'
H
4
B
O
3
OCH3
5
CH3 CH3 C
A
2
B'
O
TRIMEB
1
OCH 3
O
O - Na +
H
7
4-tBuPhCOO - Na +
Figure 54 Spectres RMN 1 H partiels (500,13 MHz, 5 mM, D2O, 298 K) de la TRIMEB (a), (c) seule et
(b), (d) en présence de 4-tert-butylbenzoate de sodium (5mM).
La stoechiométrie du complexe est alors déterminée par la méthode des variations continues.
Pratiquement, nous avons réalisé, dans l’eau, une série de mélanges
TRIMEB / 4-tBuPhCOO - Na + de composition variable (la fraction molaire de cyclodextrine, r,
variant de 0 à 1, avec [TRIMEB] + [4-tBuPhCOO - Na + ] = constante = 10 mM). Les spectres
RMN 1 H ont été enregistrés dans D2O à 298 K pour chacun de ces mélanges. Les courbes de
Job (figure 55) ont été tracées pour certains protons de la TRIMEB (H-3) et du
4-tBuPhCOO - Na + (H-tBu, H-B/H-B’ et H-C/H-C’) à partir des expériences de titration des
déplacements chimiques des protons qui participent à la complexation.

H [TRIMEB]
9,00E-04
8,00E-04
7,00E-04
6,00E-04
5,00E-04
4,00E-04
3,00E-04
2,00E-04
1,00E-04
H-3 TRIMEB
0,00E+00
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
Fraction molaire de TRIMEB (r)
109
H [4-tBuPhCOO - Na + ]
9,00E-04
8,00E-04
7,00E-04
6,00E-04
5,00E-04
4,00E-04
3,00E-04
2,00E-04
1,00E-04
H-tBu
H-b / H-b'
H-c / H-c'
0,00E+00
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
Fraction molaire de 4-tBuPhCOO - Na + (r)
Figure 55 : Tracés de Job pour certains protons de la TRIMEB et du 4-tBuPhCOO - Na + .
Les courbes passent toutes par un maximum pour r = 0,5. La TRIMEB forme donc un
complexe 1:1 avec le 4-tBuPhCOO - Na + dans l’eau.
Il reste maintenant à déterminer la constante d’association de ce complexe pour compléter
l’étude thermodynamique. La méthode itérative de calcul COMPLEX a été appliquée aux
protons à partir desquels ont été tracées les courbes de Job. Les résultats obtenus sont
consignés dans le tableau suivant (tableau 7) :
Tableau 7 : Calcul de Ka par un algorithme de régression multiparamétrique sur différents protons de la
TRIMEB et du 4-tBuPhCOO - Na + .
Molécule TRIMEB 4-tBuPhCOO - Na +
Proton H-3 H-C/H-C’ H-tBu
Ka (M -1 ) 1700 1800 2000
Ka moyen (M -1 ) 1830 ± 380
Les constantes d’association calculées pour les protons H-3, H-tBu et H-C/H-C’ sont très
voisines. Ces résultats semblent donc cohérents. La valeur moyenne de la constante
d’association du complexe a été calculée à partir des valeurs de Ka trouvées pour H-3, H-tBu
et H-C/H-C’. L’intervalle de confiance donné est calculé avec une probabilité de 95 % (Loi de
Student) sur la valeur de la moyenne.
Enfin, la structure tridimensionnelle du complexe a été appréhendée à partir d’une expérience
T-ROESY effectuée sur le mélange TRIMEB / 4-tBuPhCOO - Na + 5 mM / 5 mM dans l’eau

(D2O, 298 K, pH = 7, tm = 100 ms). Le modèle proposé se base sur l’observation des
interactions dipolaires intermoléculaires qui traduisent les proximités spatiales entre les
protons des deux espèces (figure 56).
ppm
2
4
6
8
ppm
1.5
H-6 H-5 H-3 H-6’
3.8 3.6 3.4 3.2 ppm
8 7 6 5 4 3 2 ppm
ppm
7.5
8.0
110
H-tBu
H-6
H-5
H-3 H-6’
3.8 3.6 3.4 3.2 ppm
Figure 56 : Carte T-ROESY du mélange TRIMEB / 4-tert-butylbenzoate de sodium (500,13 MHz, 5 mM
pour chacune des espèces, D2O, 298 K, tm = 300 ms) et représentation tridimensionnelle de complexe 1:1
TRIMEB / 4-tert-butylbenzoate de sodium.
H-C/H-C’
H-B/H-B’
En résumé, le complexe d’inclusion formé entre la TRIMEB et le 4-tert-butylbenzoate de
sodium est un complexe de type 1:1, dont la constante d’association est estimée à environ
1800 M -1 . Ces résultats sont tout à fait en accord avec ceux déjà publiés.
En effet, Höfler et coll. 229 ont utilisé une technique différente, la microcalorimétrie, pour
réaliser l’étude thermodynamique de complexes d’inclusion entre la -CD et ses dérivés
méthylés et l’acide 4-tert-butylbenzoïque dans un tampon phosphate (0,1 M, pH = 7,2). Ils en
tirent les conclusions suivantes (tableau 8) :

Tableau 8 : Paramètres thermodynamiques (stoechiométrie et constante d’association) des complexes
formés entre le 4-tert-butylbenzoate de sodium et les dérivés -CD, DIMEB et TRIMEB (Höfler et coll.)
Type de CD Stoechiométrie Constante d’association Ka
-CD 1:1 18000 M -1
DIMEB 1:1 28000 M -1
TRIMEB 1:1 1500 M -1
On constate que les valeurs trouvées par RMN et par microcalorimétrie pour la constante
d’association du complexe formé entre la TRIMEB et le sel de l’acide 4-tertbutylbenzoïque
sont du même ordre de grandeur. Ceci prouve la fiabilité des résultats obtenus par les deux
méthodes.
Aux vues de ces conclusions, nous avons choisi de ne pas faire l’étude thermodynamique du
complexe DIMEB / 4-tBuPhCOO - Na + par RMN et de nous appuyer sur les données
bibliographiques (Tableau 8).
V.2.2. Mise en évidence du pouvoir d’inclusion des phospholipidylcyclodextrines
V.2.2.1. Etude des variations de déplacement chimique
La conservation des propriétés d’inclusion de la partie cyclodextrine de la
TRIMEB-Succ-DMPE 14 peut être mise en évidence par l’étude de la variation des
déplacements chimiques des signaux protons de la molécule “invitée”.
1 - +
Les spectres RMN H du 4-tBuPhCOO Na seul (5 mM), du mélange
TRIMEB / 4-tBuPhCOO - Na + (5 mM / 5 mM) et du mélange TRIMEB-Succ-DMPE /
4-tBuPhCOO - Na + (5 mM / 5 mM) ont été effectués dans D2O à 298 K et sont représentés
figure 57.
111

(a)
(b)
(c)
8.0 7.8 7.6 7.4 ppm
= 0,02
= 0,15
8.0 7.8 7.6 7.4 ppm
= 0,02
H-B/H-B’ H-C/H-C’
= 0,10
8.0 7.8 7.6 7.4 ppm
112
1.5 1.4 1.3 ppm
= 0,12
1.5 1.4 1.3 ppm
= 0,08
H-tBu
1.5 1.4 1.3 ppm
Figure 57 : Spectres RMN 1 H partiels (500,13 MHz, 5 mM, D2O, 298 K) du 4-tert-butylbenzoate de sodium
(a) seul (pH = 6,9), (b) en présence de TRIMEB (5 mM, pH = 6,9) et (c) en présence de
TRIMEB-Succ-DMPE 14 (5 mM, pH = 7,3).
On observe une variation de déplacement chimique importante des protons H-C/H-C’ vers les
champs forts et des protons H-tBu vers les champs faibles lorsque le 4-tBuPhCOO - Na + se
trouve en présence de TRIMEB. Les protons H-B/H-B’ varient quant à eux très légèrement
vers les champs faibles (figure 57 b). Ce phénomène est dû à la formation du complexe
d’inclusion entre la TRIMEB et le 4-tBuPhCOO - Na + , comme nous l’avons vu précédemment.
Les mêmes variations de déplacement chimique sont observées en présence de TRIMEB-
Succ-DMPE 14 (figure 57 c). Elles semblent mettre en évidence un phénomène de
complexation entre la CD amphiphile et le 4-tBuPhCOO - Na + .
Toutefois, les variations de déplacement chimique étant moins importantes pour le système
14 / 4-tBuPhCOO - Na + que pour le système TRIMEB / 4-tBuPhCOO - Na + , on peut penser que
les complexes d’inclusion formés avec les phospholipidyl-CDs ont une constante
d’association un peu plus faible que ceux formés avec la CD correspondante seule.
On notera un élargissement significatif des signaux des protons du 4-tBuPhCOO - Na + en
présence de 14, correspondant à une diminution de T2 et donc, à une augmentation du C
apparent. Ceci est bien en adéquation avec un échange rapide du 4-tBuPhCOO - Na + avec un
système organisé.

V.2.2.2. Structure 3D des complexes Phospholipidyl-CDs / 4-tBuPhCOO - Na +
Une expérience T-ROESY a été réalisée sur le mélange TRIMEB-Succ-DMPE 14 /
4-tBuPhCOO - Na + 5 mM / 5 mM dans D2O à 298 K (figure 58).
ppm
1.0
1.5
ppm
2
4
6
8
Protons de la cavité de la CD
4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4 3.3 3.2 3.1 ppm
H-tBu
8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
Protons des
chaînes myristates
113
ppm
0.8
1.0
1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 ppm
ppm
7.5
8.0
H-tBu
Protons des
chaînes myristates
Protons de la cavité de la CD
4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4 3.3 3.2 ppm
CH 3 (chaînes
myristates)
Figure 58 : Carte T-ROESY du mélange TRIMEB-Succ-DMPE 14 / 4-tert-butylbenzoate de sodium
(500,13 MHz, 5 mM pour chacune des espèces, D2O, 298 K, tm = 100 ms, pH = 7,3).
H-C/H-C’
H-B/H-B’
Les proximités spatiales observées entre les protons de la cavité de la partie cyclodextrine de
la TRIMEB-Succ-DMPE 14 et les protons de la molécule “invitée” indiquent clairement que
le 4-tBuPhCOO - Na + s’inclut dans le macrocycle.
Par ailleurs, des interactions dipolaires sont aussi observées entre les protons de la cavité de la
CD et ceux situés en fin de chaînes phospholipidiques. Un processus d’auto-inclusion apparaît
comme peu probable, car il empêcherait les phénomènes d’auto-organisation des
phospholipidyl-CDs précédemment mis en évidence. De plus, Lin et coll. 230 ont montré que la
dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC) ne s’incluait pas dans la -CD.

Il semblerait plutôt que les chaînes aliphatiques des phospholipidyl-CDs soient interdigitées
entre elles et forment un cœur hydrophobe à l’intérieur des fibres micellaires. L’extrémité
d’une chaîne peut alors se trouver en contact avec la partie macrocyclique d’une autre
molécule qui lui fait face dans le système organisé (figure 59).
L’hypothèse d’un phénomène de compétition entre l’inclusion du 4-tBuPhCOO - Na + par le
grand côté de la CD et une légère inclusion des chaînes par le côté opposé est confirmée par
l’observation d’interactions dipolaires entre les protons du groupe tert-butyle de la molécule
“invitée” et les protons des méthyles de l’extrémité des chaînes myristates. Les constantes
d’association, plus faibles pour les complexes phospholipidyl-CD / 4-tBuPhCOO - Na + que
pour les complexes CD / 4-tBuPhCOO - Na + pourraient en partie être expliquées par ce
phénomène de compétition.
Par contre, on n’observe pas d’interaction dipolaire entre les protons des chaînes myristates et
les protons aromatiques du 4-tBuPhCOO - Na + , ce qui laisse à supposer que la petite molécule
hydrophobe est uniquement incluse dans les cavités des cyclodextrines et non dans le cœur
hydrophobe des systèmes micellaires.
Figure 59 : Représentation tridimensionnelle du complexe 1:1 TRIMEB-Succ-DMPE 14 /
4-tert-butylbenzoate de sodium dans les systèmes organisés.
L’étude effectuée sur le complexe DIMEB-Succ-DMPE 10 / 4-tBuPhCOO - Na + a été réalisée
dans les mêmes conditions que pour son analogue perméthylé 14 (T-ROESY, mélange
DIMEB-Succ-DMPE 10 / 4-tBuPhCOO - Na + 5 mM / 5 mM dans D2O, pH = 6,5,
298 K, tm = 100 ms). Les résultats obtenus sont similaires à ceux de la TRIMEB-Succ-
DMPE 14, à savoir la conservation de la capacité d’inclusion de la partie cyclodextrine.
114

V.3. Conclusion
Dans ce chapitre, il s’agissait de prouver que les phospholipidyl-cyclodextrines solubles dans
l’eau, c'est-à-dire la DIMEB-succ-DMPE 10 et la TRIMEB-Succ-DMPE 14, conservaient les
propriétés d’inclusion de la CD. Le 4-tert-butylbenzoate de sodium (4-tBuPhCOO - Na + ) a été
choisi comme molécule “invitée” modèle. Cette molécule est connue pour former de bons
complexes d’inclusion avec les dérivés de la -CD.
Le processus d’agrégation des cyclodextrines amphiphiles dans l’eau ne permet pas de
déterminer directement les paramètres thermodynamiques d’éventuels complexes d’inclusion
formés entre les phospholipidyl-CDs et le 4-tBuPhCOO - Na + en raison des interactions
compétitives. L’étude thermodynamique par RMN a donc d’abord été réalisée sur le
complexe formé entre la molécule “invitée” et la TRIMEB, afin d’extrapoler les résultats à
l’étude de la complexation de la TRIMEB-Succ-DMPE 14. Le complexe
TRIMEB / 4-tBuPhCOO - Na + est de stoechiométrie 1:1 avec une constante d’association
estimée à environ 1800 M -1 . La structure tridimensionnelle de ce complexe a également été
déterminée.
La comparaison des variations de déplacements chimiques des spectres RMN 1 H et des
spectres T-ROESY effectués sur les mélanges TRIMEB / 4-tBuPhCOO - Na + et
14 / 4-tBuPhCOO - Na + a mis en évidence l’existence d’un complexe d’inclusion entre 14 et la
molécule “invitée” modèle du même type que celui formé avec la TRIMEB, mais avec une
constante d’inclusion qui semble plus faible. Ceci pourrait s’expliquer par un phénomène de
compétition entre l’inclusion de la molécule invitée par le grand côté d’une part, et une légère
inclusion par le côté opposé des chaînes lipidiques des phospholipidyl-CDs qui se font face
dans le système organisé d’autre part.
Le complexe DIMEB-Succ-DMPE 10 / 4-tBuPhCOO - Na + présente les mêmes caractéristiques
structurales que le complexe 14 / 4-tBuPhCOO - Na + . Toutefois, on peut supposer que la valeur
de la constante d’association est plus élevée, étant donné les valeurs de constantes
d’association trouvées pour la DIMEB et pour la TRIMEB (28000 M -1 vs 1500 M -1 ).
115

VI. Comportement des phospholipidyl-cyclodextrines
méthylées dans des systèmes de type membranaire
Les phospholipidyl-cyclodextrines ont été mises au point dans le but d’étudier de nouvelles
voies de vectorisation pour le transport de principes actifs. Les dérivés méthylés 10 et 14
s’auto-organisent sous forme d’objets de grosse taille, solubles en milieu aqueux. Au sein de
ces systèmes, il a été démontré que les parties cyclodextrine forment des complexes
d’inclusion avec des molécules “invitées” hydrophobes. Ces molécules ont de bonnes
caractéristiques de transporteur.
Il reste à savoir si ces composés ont des propriétés de vectorisation vers les cellules
membranaires. Cela impose d’étudier finement les interactions entre les phospholipidyl-CDs
et les systèmes membranaires naturels. Dans un premier temps, nous verrons comment il est
possible de former et de caractériser la structure d’une bicouche lipidique formée uniquement
à partir de phospholipidyl-cyclodextrines par la technique des films noirs. Nous étudierons
ensuite les interactions entre les CDs amphiphiles et un système de bicouche
phospholipidique préformé (liposomes de DMPC) grâce à la RMN du phosphore.
VI.1. Les films noirs : modèle de membrane inversée de
phospholipidyl-cyclodextrines
Cette étude a été menée en étroite collaboration avec le Laboratoire d’optique X
(SPEC / DRECAM / DSM, CEA Saclay) dirigé par le D r Jean-Jacques BENATTAR. Les
expériences de réflectivité par rayons X ont été réalisées par Caroline SULTANEM.
VI.1.1. Qu’est-ce qu’un film noir ?
Les films noirs de surfactants sont des bicouches amphiphiles dont l’architecture moléculaire
est bien définie aujourd’hui 231,232 . Ils présentent un intérêt scientifique majeur dans la mesure
où les interactions physiques qui déterminent leur structure sont très proches de celles mises
en jeu dans les membranes biologiques. On distingue deux types de films noirs : les films
116

noirs communs et les films noirs de Newton. Dans les films noirs communs, les deux parois
de surfactants sont séparées par une couche d’eau liquide, tandis que dans les films noirs de
Newton, le coeur aqueux se limite à une fine couche d’hydratation. Ces derniers sont
particulièrement intéressants car ils possèdent une structure très compacte et un haut degré
d’organisation.
Expérimentalement, on forme des films verticaux en plongeant un cadre métallique dans une
cuve contenant une solution de tensio-actifs à une concentration supérieure à la CMC. Avant
toute chose, on attend que l’équilibre entre les tensio-actifs présents en solution sous forme de
micelles et ceux qui tapissent l’interface s’établisse. La surface entourant le cadre est alors
saturée. Le film est progressivement étiré en hissant le cadre hors de la solution. Les queues
hydrophobes des surfactants pointent vers l’extérieur, tandis que les têtes polaires se font face
à l’intérieur du film (figure 60). L’état noir correspond au stade ultime du drainage des films
de tensio-actifs, lorsque ceux-ci ont atteint leur épaisseur minimale.
Écoulement
de l’eau
Figure 60 : Principe de la formation d’un film noir de Newton
Un film noir ne réfléchit plus la lumière car il est beaucoup plus mince que les longueurs
d’onde du spectre visible. En effet, la différence de marche géométrique entre les faisceaux
réfléchis par chacune des interfaces air / film est très faible devant ces longueurs d’onde. Les
faisceaux réfléchis sont déphasés, ils ne conduisent qu’à des interférences destructives.
Cependant, les films ne sont pas noirs pour les rayons X, dont les longueurs d’onde sont de
l’ordre de l’angström. Les faisceaux réfléchis sur chacune des faces du film interfèrent de
manière constructive. On obtient alors des franges qui permettent de remonter à la structure
moléculaire de ces bicouches de tensio-actifs.
117

VI.1.2. Méthode de caractérisation des films noirs : la réflectivité de rayons X
aux incidences rasantes
Une expérience de réflectivité consiste à éclairer un échantillon avec un faisceau de rayons X
faisant un angle avec sa surface et à mesurer ainsi le rapport R() = I() / I0, I0 étant
l’intensité du faisceau incident et I() l’intensité du faisceau spéculaire réfléchi par le film à
l’angle dans le plan d’incidence 233 . Par conséquent, le vecteur de diffusion q (q = 4 /
sin) est perpendiculaire à la surface du film (figure 61).
z
air (n=1)
faisceau
incident
faisceau
réfléchi
q
k i
k r
118
t
milieu
d’indice n
faisceau
transmis
Figure 61 : Echantillon éclairé par un faisceau de rayons X
Connaissant le rapport de réflectivité R(), on peut remonter au profil de densité électronique
le long de la normale à la surface du film. Les films sont ensuite décrits comme un ensemble
de strates de densité électronique homogène. Il faut souligner que la technique de réflectivité
X n’est sensible qu’aux gradients de densité électronique perpendiculaires à la surface du
film. Ainsi, lorsque le faisceau incident frappe la surface du film avec un angle , une partie
est réfléchie, une autre transmise. Ce faisceau transmis se propage à l’intérieur du film jusqu’à
atteindre une interface délimitant deux zones de densité électronique différente. Une partie du
rayon est de nouveau réfléchie, une autre transmise, et ainsi de suite. Les faisceaux réfléchis
par chacune des interfaces interfèrent et produisent des franges dites de Kiessig (figure 62).
La largeur de ces franges est inversement proportionnelle à l’épaisseur du film dont la valeur
sera déterminée grâce à un programme d’ajustement.

La technique de réflectivité de rayons X est particulièrement adaptée à l’étude des films
verticaux car ils présentent un gradient de densité électronique important à chacune des deux
interfaces film / air. Ils permettent ainsi d’obtenir des franges d’interférence très contrastées.
REFLECTIVITE
VECTEUR DE DIFFUSION Q
119
Franges de Kiessig
Figure 62 : Spectre de réflectivité d’un film de Newton d’un surfactant : le C12E6
Grâce à un traitement mathématique des courbes expérimentales de réflectivité, on accède
finalement aux informations suivantes :
l’épaisseur totale du film,
l’épaisseur des différentes couches électroniques qui le constitue (dans le cas le plus
simple, il s’agit des épaisseurs des couches hydrophiles, hydrophobes, et de
l’éventuelle couche d’eau séparant les deux parois du film),
les densités de chacune de ses couches,
les rugosités de chacune des interfaces.

VI.1.3. Résultats antérieurs
VI.1.3.1. Films noirs de phospholipides purs
La dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC) est capable de former des films noirs stables
pendant plusieurs jours. L’analyse de la courbe de réflectivité a permis de caractériser la
structure moléculaire de ce film comme étant une bicouche naturelle inversée, d’épaisseur
totale égale à 59 Å 234 .
VI.1.3.2. Film noirs de cyclodextrines amphiphiles
La 6-(cholest-5-en-3-ylamido)succinylamido-6 I -désoxy-per(2,6-di-O-methyl)--CD, plus
communément appelée Chol-DIMEB (figure 63), est une cyclodextrine amphiphile qui a été
synthétisée dans notre laboratoire par Auzély-Velty et coll. 196
HO
O
NH
O
OMe
O
HN
HO
O
120
OMe
Me
O
OMe O
6
Me
CHMe2
Figure 63 : Structure de la Chol-DIMEB
Javierre et coll. 235 ont montré qu’il est possible de former un film noir de Chol-DIMEB pur.
Quelle que soit la concentration de la solution, sa stabilité est faible (environ 15 mn) mais
permet néanmoins de faire une mesure de réflectivité afin de déterminer son épaisseur qui est
de 54 Å.
Par contre, elles forment des films mixtes très stables en présence de phospholipides
classiques comme la DMPC. La stabilité optimale est obtenue pour un rapport 3:1 entre le
lipide et le dérivé de la cyclodextrine. La figure suivante montre la structure d’un tel film
obtenu par réflectivité des RX (figure 64).

Reflectivité I / I O
10 -2
10 -3
10 -4
10 -5
10 -6
10 -7
10 -8
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
Scattering wave vector Q (Å
z -1 )
densité électronique
121
13.3Å 11.4Å 25.6Å 11.4Å 13.3Å
Epaisseur : 75 Å
Figure 64 : Courbe de réflectivité, profil de densité électronique et représentation schématique de la
structure d’un film noir mixte DMPC / Chol-DIMEB.
Enfin, les auteurs ont mis en évidence que les cavités des cyclodextrines conservent leur
capacité d’inclusion dans les films mixtes DMPC / Chol-DIMEB. Pour cela, ils ont utilisé la
Dosulépine, un composé biologiquement actif bien connu pour s’inclure dans les
cyclodextrines.
VI.1.4. Résultats et discussion
Avec la Chol-DIMEB, nous avons vu qu’il n’était pas possible d’obtenir des films noirs
stables sans la présence de phospholipides. L’objectif de ce travail consistera à former des
films noirs de Newton stables, composés uniquement de phospholipidyl-cyclodextrines, afin
d’étudier leur structure moléculaire.
Comme indiqué précédemment, les films noirs de Newton sont des structures très ordonnées,
caractérisées par un empilement moléculaire dense. Il est bien établi que la formation de films

stables dépend étroitement de la compacité des couches adsorbées à l’interface air / eau de la
solution à partir desquelles les films noirs sont obtenus. C’est pourquoi nous travaillerons
avec des solutions de phospholipidyl-cyclodextrines à des concentrations (c = 0,5 mg.mL -1 )
nettement supérieures à la CMC pour assurer une couverture moléculaire maximale à
l’interface air / eau. Pour toutes les solutions utilisées dans cette étude, les valeurs de tension
de surface à l’équilibre sont comprises entre 36 et 38 mN.m -1 .
VI.1.4.1. Effet de la concentration de sel en solution et du degré de méthylation des
cyclodextrines sur la structure des films
Les films obtenus à partir de solutions de DIMEB-Succ-DMPE 10 et de TRIMEB-Succ-
DMPE 14 dans l’eau, sans addition de sels, sont “gris”, c'est-à-dire trop épais pour être
étudiés par réflectivité de rayons X. En fait, les molécules 10 et 14 sont toutes les deux
chargées négativement (-1) au niveau du groupement phosphate porté par la partie
phospholipidique des CDs amphiphiles. Les parois du film, constituées d’un empilement de
phospholipidyl-cyclodextrines sont donc chargées négativement. A l’image de deux aimants,
dont on veut mettre en contact les extrémités de même polarité, il se crée des forces de
répulsion électrostatique entre les parois du film qui s’opposent à leur rapprochement et
expliquent l’épaisseur importante de ces films.
Pour atteindre l’état de film noir de Newton, il est nécessaire d’écranter partiellement les
charges pour diminuer les forces de répulsion électrostatique agissant entre les parois des
films, en ajoutant un sel dans la solution. Ainsi, en présence de 0,07 mol.L -1 de chlorure de
sodium (NaCl) en solution, des films noirs très stables (durée de vie de plusieurs heures) sont
obtenus. Dans les deux cas, le drainage est très rapide et les films de 10 et de 14 atteignent
respectivement une épaisseur minimum de 125 Å et de 104 Å en 15 minutes. Les courbes de
réflectivité de rayons X des deux films à l’équilibre sont représentées figure 65 a. Ces courbes
montrent une série de franges de Kiessig bien définies dans l’espace réciproque. Les franges
observées sur la courbe de réflectivité du film de DIMEB-Succ-DMPE 10 sont plus étroites
que celles de la courbe du dérivé TRIMEB 14. Les films noirs de 10 sont donc plus épais que
ceux de 14. Les profils de densité électronique et les paramètres dérivés de la procédure
d’ajustement sont également représentés figure 65 b et c.
122

Réflectivité
0,001
0,0001
10 -5
10 -6
10 -7
DIMEB avec 0.07 M NaCl TRIMEB avec 0.07 M NaCl
0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3
vecteur de diffusion (Å -1 )
(a)
123
(b)
(c)
profil de densité électronique
profil de densité électronique
3.5 10 -6
3 10 -6
2.5 10 -6
2 10 -6
1.5 10 -6
1 10 -6
5 10 -7
4 10 -6
3.5 10 -6
3 10 -6
2.5 10 -6
2 10 -6
1.5 10 -6
1 10 -6
5 10 -7
0
-20 0 20 40 60 80 100 120 140
épaisseur (Å)
0
-20 0 20 40 60 80 100 120
épaisseur (Å)
Figure 65 : (a) Courbes de réflectivité de rayons X des films de DIMEB-Succ-DMPE 10 (trait plein) et de
TRIMEB-Succ-DMPE 14 (pointillés) obtenus à partir de solutions de 10 et de 14 dans 0,07 M de NaCl.
Profils de densité électronique des films de (b) DIMEB-Succ-DMPE 10 et (c) TRIMEB-Succ-DMPE 14
obtenus à partir des courbes de réflectivité.
La structure globale des films de 10 et de 14 semble très similaire. Ils sont composés tous
deux d’une partie centrale hydrophile moins dense que les couches extérieures qui sont en
contact avec l’air. L’épaisseur des couches extérieures est identique pour les films de 10 et de
14, égale à 13 Å. Par contre, la partie centrale du film de 10 est plus épaisse de 21 Å que celle
du film 14. De plus, au vu des valeurs de densité électronique, il apparaît que les molécules de
TRIMEB-Succ-DMPE 14 sont empilées de manière plus dense dans les films que leurs
homologues diméthylés 10.
Une augmentation de la concentration en sel jusqu’à 0,1 mol.L -1 de NaCl en solution entraîne
la formation de films plus fins mais dont la durée de vie est réduite de manière significative.
Dans ces conditions de stabilité (durée de vie comprise entre 20 et 60 minutes), le temps
d’acquisition des courbes de réflectivité est trop court pour obtenir des informations précises
sur la structure interne des films. Seule leur épaisseur totale est déterminée précisément. Il est
Å 1

intéressant de remarquer que les films de DIMEB-Succ-DMPE 10 sont toujours plus épais de
16 Å que ceux de TRIMEB-Succ-DMPE 14 en présence de 0,1 mol.L -1 de NaCl.
VI.1.4.2. Description de la structure des films
Dans le cas où l’extension d’une molécule de DIMEB-Succ-DMPE 10 et de TRIMEB-Succ-
DMPE 14 est maximale, leur longueur peut être grossièrement estimée à 38 Å (8 Å pour la
hauteur du cône de la CD et 30 Å pour la partie DMPE + bras espaceur). Or, l’épaisseur totale
des films de 10 et 14 déterminée par réflectivité de rayons X, varie de 94 à 130 Å en fonction
de la concentration en NaCl, soit plus de deux fois la longueur maximale des CDs
amphiphiles. Les deux parois du film, constituées de phospholipidyl-cyclodextrines, ne se
font donc pas directement face mais doivent être séparées par une couche centrale. D’après les
expériences de diffusion, la taille des agrégats de phospholipidyl-cyclodextrines présents en
solution est supérieure à 200 nm. Il paraît donc évident que les films étudiés sont trop fins
pour piéger de tels agrégats. Par conséquent, les deux parois du film sont probablement
séparées par une couche d’eau, dont l’épaisseur dépend de la concentration de sel dans la
solution et du degré de méthylation sur les hydroxyles de la cyclodextrine.
On se propose de décrire les films de TRIMEB-Succ-DMPE 14 et de DIMEB-Succ-DMPE 10
selon le modèle suivant (figure 66) :
DIMEB-Succ-DMPE 10
ou
TRIMEB-Succ-DMPE 14
124
couches
extérieures
couche
centrale
eau liée
couches
extérieures
Figure 66 : Représentation schématique de la structure d’un film noir de phospholipidyl-CDs

Les couches extérieures contiennent les queues hydrophobes, c'est-à-dire le phospholipide et
le bras espaceur (+ 3 molécules d’eau autour du groupement phosphate). Le cœur du film est
constitué des cyclodextrines et d’une couche d’eau. Dans le cadre de ces hypothèses, il va être
possible de calculer l’angle d’inclinaison de la partie phospholipidique par rapport à la
normale du film et l’aire moyenne par molécule.
Angle d’inclinaison des queues hydrophobes ()
Si l’on considère que les couches extérieures de 13 Å d’épaisseur contiennent les queues
hydrophobes, dont on estime la longueur égale à 30 Å, alors ces queues réalisent un angle
d’inclinaison d’environ 65° par rapport à la normale du film. Un tel angle d’inclinaison a déjà
été observé pour des films noirs de Newton de dodécylsulfate de sodium (SDS) 233 et permet
aux chaînes alkyles de s’empiler de manière plus compacte.
Aire moyenne par molécule (A)
L’aire moyenne par molécule dans le film peut-être déterminée à partir de l’équation
suivante :
ext
ext ne
(21)
ext
A
t
où ext et t ext représentent respectivement la densité électronique et l’épaisseur de la couche
extérieure déduites des procédures d’ajustement. ne ext est la somme des électrons des queues
hydrophobes et des molécules d’eau d’hydratation (trois molécules d’eau autour du groupe
phosphate).
Les aires moyennes par molécules calculées à partir de cette expression sont estimées
respectivement à 280 Ų et 240 Ų, pour la DIMEB-Succ-DMPE 10 et pour la TRIMEB-
Succ-DMPE 14 (avec 0,07 mol.L -1 de NaCl).
125

VI.1.4.3. Influence de l’hydratation des cyclodextrines sur la structure des films
Nous avons vu que la différence d’épaisseur entre les films de 10 et de 14 est directement liée
à l’épaisseur de la partie centrale. Comme nous l’avons déjà expliqué, cette partie est
constituée de la tête cyclodextrine et des molécules d’eau emprisonnées dans le coeur du film.
Il est possible de calculer précisément le nombre moyen de molécules d’eau associées à
chaque molécule de phospholipidyl-cyclodextrines dans le film à partir de l’équation
suivante :
cd
cen ne
10neau
(22)
cen
A
t
où cen et t cen représentent respectivement la densité électronique et l’épaisseur de la couche
centrale déduites des procédures d’ajustement. ne cd est le nombre d’électrons contenus dans
une cyclodextrine et A, l’aire moyenne par molécule (280 Ų pour les films de 10, 240 Ų
pour les films de 14). Dans ces calculs est pris en compte la présence des contre-ions Na + qui
écrantent les charges négatives portées par les phospholipidyl-cyclodextrines. Les résultats
sont reportés dans le tableau 9 :
Tableau 9 : Caractéristiques structurales (Aire moyenne par molécule de CD amphiphile, angle
d’inclinaison des queues hydrophobes et nombre moyen de molécules d’eau de la couche centrale par CD
amphiphile) des films noirs de phospholipidyl-CDs 10 et 14.
Type de film noir A (en Ų) (en degré) nH20 / molécule
DIMEB-Succ-DMPE 10
(NaCl 0,07 M)
TRIMEB-Succ-DMPE 14
(NaCl 0,07 M)
279 64 56
241 64 41
A concentration égale de sel en solution, les films de 10 sont plus riches en eau dans la
couche centrale que les films de 14. Contrairement au dérivé perméthylé, la DIMEB possède
sept groupements hydroxyles libres capables de former des liaisons hydrogène avec des
molécules d’eau et il ne semble pas surprenant que le taux d’hydratation soit plus élevé dans
les films de 10. Cette différence d’hydratation pourrait agir de manière importante sur les
interactions entre les molécules constituant le film, et ainsi expliquer les différences
126

d’empilement entre les films de 14 et les films de 10, ainsi que la différence d’aire moyenne
par molécule.
Quoiqu’il en soit, pour les films de 10 comme pour ceux de 14, l’épaisseur de la couche d’eau
séparant les parois de CDs amphiphiles est très importante. De plus, la densité électronique de
cette partie centrale est environ trois fois plus faible que celle de l’eau libre. Cette dernière
observation suggère que l’organisation des molécules d’eau contenues dans la partie centrale
du film est fortement influencée par la présence des deux murs de cyclodextrines qui
l’entourent. Les cyclodextrines seraient donc capables de former des interactions à longue
distance avec les molécules d’eau environnantes. L’eau de la couche centrale pourrait alors
être considérée comme une couche d’eau liée. Ces résultats sont en accord avec les études qui
traitent de l’hydratation des DIMEB 236,237 dans la littérature. Ces études rapportent l’existence
d’un réseau de molécules d’eau qui s’ordonnent de manière à encapsuler la cage de la
cyclodextrine. L’abondante hydratation de la partie DIMEB pourrait être à l’origine de cette
importante couche d’eau qui occupe le centre des films de phosphotidyl-cyclodextrines.
Des films noirs formés à partir de solution de complexes DIMEB-Succ-DMPE 10 / acide
citrique ont été étudiés. L’acide citrique (figure 67 a) forme avec la CD un complexe de
stoechiométrie 1:1 en interagissant avec les groupements hydroxyle du macrocycle sans pour
autant entrer dans la cavité. Leur structure est similaire à un film de DIMEB-Succ-DMPE 10
pur. Cependant, la couche centrale des films de complexes est plus dense et légèrement plus
épaisse. Une analyse plus fine des paramètres structuraux montre qu’en présence d’acide
citrique, les macrocycles sont 20 % plus hydratés. Ces résultats sont accord avec de récentes
études qui montrent que l’acide citrique améliore l’interface entre la CD et l’eau 238 . Mieux
hydratées, les CD sont également plus solubles.
Par contre, la présence d’une molécule invitée dans la cavité semble perturber la stabilité des
films. La durée de vie des films obtenus entre 10 et plusieurs molécules d’inclusion modèles
(le 4-tert-butylbenzoate de sodium, le chlorure de 1-adamantylammonium et le
chloramphénicol (figure 67 b-d)) n’excède pas 20 minutes. Les interactions entre la CD et son
environnement (CD-CD et CD-eau) sont probablement affectées par le phénomène
d’inclusion. L’organisation du film est bouleversée, ce qui pourrait expliquer leur faible
stabilité.
127

HO
HO
O OH
O
O
OH
O O Na
128
NH 3 Cl
(a) (b)
(c) (d)
Figure 67 : Structure chimique (a) de l’acide citrique, (b) du 4-tert-butylbenzoate de sodium,
(c) du chlorure de 1-adamantylammonium, (d) du chloramphénicol
VI.2. Systèmes mixtes DMPC / TRIMEB-Succ-DMPE 14 : mise en
évidence des propriétés détergentes des phospholipidyl-CDs
VI.2.1. Utilisation de la RMN 31 P dans l’étude des systèmes organisés
phospholipidiques
La résonance magnétique du phosphore-31 239 (RMN 31 P) est une technique relativement
facile à mettre en œuvre pour l’étude des milieux organisés phospholipidiques car elle ne
nécessite pas de marquage isotopique préalable. En effet, l’isotope 31 du phosphore possède
une abondance naturelle de 100 %. La RMN 31 P permet d’accéder directement à la dynamique
de la tête polaire des phospholipides et apporte des informations qualitatives sur
l’organisation des systèmes phospholipidiques.
Dans le cas des atomes de phosphore des groupes phosphates des phospholipides, deux types
d’interactions coexistent :
les interactions nucléaires : anisotropie de déplacement chimique,
les interactions dipolaires phosphore-proton.
Seul l’anisotropie de déplacement chimique du phosphore intervient dans la description des
propriétés structurales et dynamiques des milieux organisés phospholipidiques. Une
expérience RMN du phosphore avec un découplage large bande des protons permettra de
s’affranchir des problèmes liés aux interactions dipolaires.
O
Cl
OH
NH
Cl
OH
N
O 2

VI.2.1.1. Anisotropie de déplacement chimique
Le nuage électronique d’un noyau de spin I = ½ peut varier en fonction de son environnement
immédiat. Ce nuage sert d’écran au noyau, ce qui a pour conséquence de modifier la valeur du
champ magnétique B0 au site nucléaire. Cet effet correspond au déplacement chimique. En
raison d’une distribution asymétrique de la densité électronique au site nucléaire des atomes
de phosphore, ces derniers présentent un phénomène particulier qui correspond à l’anisotropie
de déplacement chimique (ADC).
La densité du nuage électronique entourant le phosphore n’est pas isotrope mais dépend du
mode de liaison de ce noyau avec ses voisins. L’écran électronique, donc le champ effectif au
site nucléaire, ne sera pas le même dans toutes les directions ; l’effet d’écran sera minimal le
long de l’axe ayant la plus faible densité électronique et maximal le long de l’axe possédant la
plus forte densité électronique.
Il est donc possible de déterminer les axes principaux du tenseur d’ADC en plaçant un
monocristal dans toutes les positions possibles par rapport au champ magnétique B0. De telles
expériences ont en effet été réalisées 240,241 . D’une manière générale et d’après les résultats
expérimentaux rapportés par Seelig 242 , il a été trouvé que les éléments principaux du tenseur
d’ADC sont quasiment identiques pour toutes les classes de phosphocholines étudiées et
approximativement égaux à 11 = + 80 ppm, 22 = + 25 ppm et 33 = - 110 ppm (figure 68)
Figure 68 : Orientation des axes principaux du tenseur ADC du groupe phosphate (Phosphorus-31 NMR,
principles and application, Ed. D. Gorenstein, Academic Press: New York, 1984)
129

Dans le cas d’un échantillon polycristallin, qui peut être assimilé à une multitude de grains
monocristallins, orientés de façon aléatoire par rapport au champ magnétique B0, on obtient
un spectre dit de “poudre”. Le spectre RMN 31 P de cette poudre consiste en une superposition
des fréquences de résonances provenant des diverses orientations des microcristaux par
rapport à B0. L’intensité de chaque raie individuelle est pondérée par la fonction de
distribution des orientations 243 . Sur le spectre de poudre représenté figure 69, on remarque
qu’il est très facile d’extraire les valeurs des composantes principales du tenseur d’ADC à
partir de l’écart en fréquence entre les épaules et la discontinuité centrale du spectre.
Figure 69 : Spectre RMN du phosphore d’un échantillon polycristallin de phospholipide (Phosphorus-31
NMR, principles and application, Ed. D. Gorenstein, Academic Press: New York, 1984)
VI.2.1.2. Influence des mouvements moléculaires sur le spectre de RMN 31 P
Dans des systèmes de type bicouche phospholipidique, la présence de mouvements
moléculaires anisotropes va entraîner des modifications de la forme du spectre de poudre.
Selon l’hypothèse où les mouvements de réorientation du groupement phosphate ont un
caractère anisotrope marqué et le mouvement de rotation autour de l’un des axes est beaucoup
plus rapide que les rotations autour des autres axes, le mouvement de rotation peut ainsi être
considéré à symétrie axiale. Par conséquent, le mouvement d’un phospholipide peut être
décrit à l’aide de deux coefficients de diffusion : R// (mouvement axial rapide) et R
(mouvements lents, perpendiculaires à l’axe principal du mouvement).
130

axe 2
axe 1
axe 3
(a) (b)
Figure 70 : Forme des spectres de poudre du 31 P et oscillation de l’axe de rotation (Phosphorus-31 NMR,
principles and application, Ed. D. Gorenstein, Academic Press: New York, 1984)
En phase lamellaire, les mouvements moléculaires sont caractérisés par la rotation rapide des
phospholipides autour d’un axe qui correspond à la normale à la bicouche, n. Pour des raisons
de simplifications, supposons que l’axe de rotation n est parallèle à l’axe 1 (figure 68). Cette
rotation rapide a pour effet de moyenner deux éléments principaux du tenseur d’ADC, 22 et
33, qui sont perpendiculaires à l’axe de rotation. Autrement dit, dans le plan perpendiculaire
définit par les axes 2 et 3, on doit avoir une valeur unique de déplacement chimique désignée
par , alors que le déplacement chimique le long de l’axe 1 désigné par // est différent. La
différence entre // et est notée = // - (figure 70 a).
Toutefois, le mouvement des molécules dans les bicouches phospholipidiques ne se limite pas
toujours à la simple rotation autour de l’axe 1. Cet axe de rotation peut également adopter des
mouvements d’oscillation d’amplitude limitée en décrivant un cône (figure 70 b). Ce
mouvement supplémentaire a pour conséquence de moyenner partiellement les valeurs
précédentes de // et pour engendrer les nouvelles valeurs effectives ’// et ’, plus petites
que les valeurs initiales. Soit ’ la différence entre ’// et ’, ’ sera plus faible que .
Le mouvement d’oscillation a donc pour conséquence le “rétrécissement” du spectre de
poudre caractéristique d’une phase lamellaire.
131

L’importance de cette diminution de la largeur du signal dépend de l’amplitude du
mouvement d’oscillation de l’axe de rotation. Dans le cas limite où le mouvement de l’axe 1
est totalement non restreint, le mouvement de la molécule de phospholipide devient alors un
mouvement isotrope, et le signal obtenu en RMN correspond par conséquent à un seul pic
dont le déplacement chimique iso est identique à celui observé en solution non visqueuse :
iso = (11 + 22 + 33) / 3 = (// + 2 ) / 3 = (’// + 2 ’) / 3
VI.2.1.3. Forme des spectres de poudre en RMN 31 P selon les phases lipidiques
Les phospholipidyl-cyclodextrines sont des molécules amphiphiles capables de former
différents types de structures organisées en fonction de leur nature, du degré d’hydratation, de
la température,… On parle de polymorphisme lipidique.
Les principales phases lipidiques rencontrées sont les suivantes :
bicouches en phase fluide L (membranes biologiques),
bicouches en phase gel L,
phase hexagonale inverse HII,
vésicules (MLV, SUV, LUV).
Les phospholipides, dans les différents types de phases lipidiques, possèdent des mouvements
moléculaires différents, ce qui conduit à l’obtention des spectres RMN 31 P, de formes
différentes et significatives, qui sont représentés sur la figure suivante (figure 71) :
132

Figure 71 : Forme des spectres de poudre d’un groupe phosphate selon les différentes phases
phospholipidiques en RMN 31 P
L’analyse de la forme des spectres RMN 31 P donnera une indication précieuse sur le type de
phase lipidique présente et ce, en fonction de différents paramètres tels que la température, la
concentration,…
133

VI.2.2. Pouvoir de solubilisation de la TRIMEB-Succ-DMPE 14 vis-à-vis des
liposomes de DMPC : étude par RMN 31 P et par diffusion de lumière
VI.2.2.1. Préparation d’un liposome de DMPC
La méthode la plus simple de préparation des liposomes consiste à évaporer le solvant
organique dans lequel sont dissous les lipides, puis à les remettre en suspension dans un
solvant aqueux par simple agitation. La température de l’eau doit être supérieure à la
température de transition de phase (23 °C pour la DMPC).
Il se forme des liposomes multilamellaires (MLV pour Multi Lamellar Vesicle). Ce sont des
structures en bicouches lipidiques, closes, concentriques, séparées les unes des autres par des
couches d’eau. Ces liposomes ont des tailles très hétérogènes (plusieurs centaines de
nanomètres) et possèdent un volume aqueux interne relativement faible par rapport à la
quantité de lipides.
VI.2.2.2. Mise en évidence du phénomène
Une solution aqueuse de liposomes de DMPC est préparée à une concentration de
15 mmol.L -1 dans un tampon Tris à 0,1 mol.L -1 et à pH = 7. Visuellement, on observe une
solution laiteuse (figure 72 a). Lorsqu’on ajoute 1 mmol.L -1 de TRIMEB-Succ-DMPE 14
dans cette solution, celle-ci devient translucide après une simple agitation (figure 72 b). Enfin,
en augmentant encore légèrement la concentration de TRIMEB-Succ-DMPE 14
(2,5 mmol.L -1 ), la solution devient très rapidement limpide (figure 72 c).
(a) (b) (c)
Figure 72 : Echantillons de DMPC à 15 mM dans l’eau (tampon Tris 0,1 mM, pH = 7,2) (a) seule sous
forme d’un liposome, (b) en présence de 1 mM de TRIMEB-Succ-DMPE 14 et (c) en présence de
2,5 mM de 14
134

Les spectres RMN 31 P de ces trois échantillons sont effectués à 298 K (figure 55) :
Figure 73 : Spectres RMN 31 P (81,0 MHz, tampon Tris 0,1 mol.L -1 , 298 K, pH = 7,2) de DMPC 15 mM (a)
seule sous forme d’un liposome, (b) en présence de 1 mM de TRIMEB-Succ-DMPE 14 et (c) en présence
de 2,5 mM de 14
En raison de leur grosse taille, le rayon de courbure de la paroi sphérique des liposomes est
très faible, et l’organisation des phospholipides dans la bicouche est très proche de celle
rencontrée dans les membranes biologiques planes. Ceci explique que le spectre RMN 31 P de
la solution de liposomes de DMPC est caractéristique d’une structure de type bicouche
lipidique en phase fluide (L) (figure 73 a).
En présence de 1 mmol.L -1 de TRIMEB-Succ-DMPE 14, la largeur du signal RMN diminue
(figure 73 b), et donc l’amplitude du mouvement d’oscillation des phospholipides dans le
système organisé augmente. Ce phénomène est la conséquence de l’ajout de la
phospholipidyl-cyclodextrine qui désorganise la membrane des liposomes et rend sa structure
moins compacte. De plus on observe sur ce spectre l’apparition d’un nouveau signal isotrope
à ~ 0 ppm.
135

En présence de 2,5 mmol.L -1 de TRIMEB-Succ-DMPE 14, la raie large a disparu et a laissé
place à deux raies fines isotropes à ~ 0 ppm, qui correspondent respectivement aux signaux
du phosphore de la DMPC et de la TRIMEB-Succ-DMPE 14 dans un système où le
mouvement des molécules observées est totalement non restreint (figure 73 c). Il peut s’agir
de petites vésicules ou de micelles. Les résultats de diffusion de lumière nous laissent à penser
qu’il s’agit en fait de micelles mixtes DMPC / TRIMEB-Succ-DMPE 14 en raison de la taille
très petites des objets (16 nm de moyenne) et de leur très grande monodispersité.
L’addition de faibles concentrations de TRIMEB-Succ-DMPE 14 entraîne rapidement une
solubilisation totale des liposomes de DMPC pour donner des micelles mixtes DMPC / 14.
Nous avons donc clairement mis en évidence les propriétés détergentes de la phospholipidylcyclodextrine.
VI.3. Conclusion
Les phospholipidyl-cyclodextrines 10 et 14 sont capables de former des films noirs de
Newton stables pendant plusieurs heures. L’épaisseur des films dépend de la concentration en
sel dans la solution à partir de laquelle ils sont obtenus et du degré de méthylation des
cyclodextrines. Les films sont constitués de deux parois de phospholipidyl-CDs séparés par
une couche d’eau centrale plus épaisse que celle habituellement observée dans les films noirs
de Newton 233,234 . Les queues hydrophobes sont tournées vers l’extérieur (air) et inclinées à un
angle de 64° par rapport à la normale du film, ce qui semble favoriser l’empilement des
chaînes. Les têtes cyclodextrines sont dirigées vers le cœur aqueux du film. Les fortes
interactions existantes entre la CD et les molécules d’eau avoisinantes créent un réseau
d’ordre à longue distance qui est responsable de l’épaisseur importante et de la faible densité
de la couche d’hydratation qui est en fait une couche d’eau liée.
D’autre part, les propriétés détergentes des phospholipidyl-cyclodextrines ont été mises en
évidence par leur fort pouvoir solubilisant vis à vis de membranes modèles de DMPC.
136

VII. Etude préliminaire in vitro des propriétés de passage
des phospholipidyl-cyclodextrines à travers la Barrière
Hémato-Encéphalique (BHE)
Cette étude a été menée en étroite collaboration avec le Laboratoire Mixte Institut Pasteur -
Université d’Artois (Faculté Jean Perrin, LENS) du P r Eric MONFLIER pour les études
in vitro du passage à travers la BHE, qui ont été réalisées par le D r Sébastien TILLOY et M lle
Véronique MONNAERT. Les dosages immunoenzymatiques ont été effectués dans le
Laboratoire du D r Christophe CREMINON, au sein du Service de Pharmacologie et
d’Immunologie dirigé par Jacques GRASSI (CEA Saclay, GIF sur YVETTE).
Il est à noter que cette étude est très préliminaire et si les premiers résultats sont
encourageants, ils restent à confirmer par une étude beaucoup plus approndie.
VII.1. Introduction
Les cellules des capillaires cérébraux restreignent les échanges entre le sang et le cerveau.
Elles forment une barrière appelée Barrière Hémato-Encéphalique (BHE).
La BHE présente une barrière physique (jonctions serrées, absence de fenestration) et une
barrière métabolique (expression de protéines telles que la P-glycoprotéine (P-gp),
responsable des phénomènes de “Drug Resistance”, c'est-à-dire qu’elle empêche le passage
des médicaments de façon active) qui entraînent la restriction du transport de molécules du
sang vers le cerveau (figure 74). Quelques molécules peuvent cependant traverser la BHE par
diffusion passive ou par l’utilisation de récepteurs ou de transporteurs. Bien que cette barrière
soit nécessaire et même vitale pour le maintient de l’homéostasie cérébrale, elles représentent
un véritable problème pour le traitement des maladies neurologiques et des troubles
psychiatriques.
137

Principes
actifs
Principes
actifs
Sang Cerveau
P-gp
138
Jonctions
serrées
Cellules
endothéliales
Figure 74 : Représentation schématique de la monocouche de cellules endothéliales constituant la BHE
Pour parvenir à augmenter la délivrance de principes actifs vers le cerveau, différentes
approches ont été envisagées : l’injection intracérébrale directe de médicaments ou encore la
perméabilisation temporaire de la BHE par des solutions hyperosmotiques. Toutefois, ces
méthodes sont invasives et non spécifiques. Les recherches se tournent alors vers la synthèse
de vecteurs spécifiques permettant de traverser cette barrière.
Dans le chapitre précédent, nous avons vu que les phospholipidyl-cyclodextrines interagissent
fortement avec les lipides membranaires. Ils sont capables de solubiliser les membranes des
liposomes phospholipidiques à des concentrations relativement faibles grâce à leurs propriétés
détergentes. Il serait intéressant de tester leur capacité à pénétrer et traverser les membranes
des cellules de la BHE sans les détruire. Nous avons choisi de tester la
DIMEB-Succ-DMPE 10, qui présente de meilleures propriétés d’inclusion pour les principes
actifs que le dérivé TRIMEB 14 et fait de cette molécule un meilleur candidat pour la
vectorisation des médicaments.
Dans un premier temps, une étude de toxicité de la DIMEB-Succ-DMPE 10 sera réalisée à
différentes concentrations de 10 en solution (500 µmol.L -1 , 100 µmol.L -1 et 10 µmol.L -1 ) sur
un modèle in vitro de la BHE. Le seuil de non-toxicité sera définit par la concentration de
phospholipidyl-CD à laquelle la BHE n’est pas détruite.
Aux concentrations non cytotoxiques, il faudra prouver le passage ou non de la molécule à
travers la BHE. Pour cela, nous utiliserons une méthode de dosage spécifique à la
DIMEB-Succ-DMPE et très sensible : le dosage immunoenzymatique (Cf annexe IV).

VII.2. Etude du passage à travers la BHE
VII.2.1. Description du modèle in vitro de la BHE
Le Laboratoire du P r Monflier a développé un modèle in vitro de la BHE en 1992. Ce modèle
consiste en une coculture, de part et d’autre d’un filtre, de cellules endothéliales de capillaires
cérébraux de bœuf et d’astrocytes de rats nouveaux nés. Ce modèle présente toutes les
caractéristiques de la BHE in vivo, à savoir la présence de jonctions serrées, la rareté de
vésicules et l’expression de la P-glycoprotéine. Ceci en fait un modèle intéressant pour la
prédiction de la délivrance des médicaments vers le cerveau
VII.2.2. Protocole d’étude
Cellules
endothéliales
Filtres PC
Astrocytes
Tampon
Ringer-Hepes
(RH)
A t = 0 min
Tampon RH +
DIMEB-Succ-DMPE 10
1 er puits
t = 0 30 min
139
2 ème puits
t = 30 60 min
3 ème puits
t = 60 90 min
Figure 75 : Schéma du protocole d’étude du passage de 10 à travers la BHE
4 ème puits
t = 90 120 min
Les expériences sont menées après 12 jours de coculture. Le jour de l’expérience, une
solution tamponée de Ringer (Ringer-Hepes (RH) est un milieu physiologique) est ajoutée
dans le compartiment inférieur d’une boite six puits.
Puis un filtre (filtre PC) recouvert d’une monocouche de cellules endothéliales est transféré
dans le premier puits de la boite six puits. Au temps zéro, une solution tamponnée de Ringer
contenant du saccharose marqué au carbone 14 (marqueur paracellulaire) et la

DIMEB-Succ-DMPE 10 est placée dans le compartiment supérieur. Aux temps 30, 60, 90,
120, 180 et 240 minutes après addition de la molécule 10, le filtre est transféré dans un autre
puits afin de minimiser l’éventuel passage de substances du compartiment inférieur vers le
compartiment supérieur. L’incubation s’effectue à 37 °C sur agitateur (figure 75).
Pour cette première étude, tous les résultats seront exprimés sur 120 minutes (4 puits).
VII.3. Résultats et discussion
L’étude du passage de la DIMEB-Succ-DMPE 10 à travers la BHE est réalisée à trois
concentrations initiales différentes de 500 µmol.L -1 , 100 µmol.L -1 et 10 µmol.L -1 de 10 dans
une solution tamponnée RH. Ces trois séries d’expériences sont effectuées selon le protocole
décrit précédemment sur une durée de deux heures. A t = 0 min, la solution de 10 est placée
dans le compartiment supérieur. Toutes les 30 minutes, le compartiment supérieur est
transféré d’un compartiment inférieur à un autre (figure 75). Chaque expérience est triplée
pour contrôler la répétabilité des résultats.
Lorsque l’intégrité de la monocouche des cellules endothéliales est conservée (i.e. jonctions
serrées), le saccharose, molécule modèle, diffuse très faiblement à travers la BHE. Par contre,
dans des conditions toxiques pour la monocouche de cellules endothéliales (i.e. jonctions
ouvertes), ce même saccharose diffusera beaucoup plus facilement. Le dosage de la diffusion
de cette molécule à travers la BHE se fait à l’aide de saccharose marquée au carbone 14.
L’intégrité de la monocouche de cellules endothéliales est vérifiée lorsque le coefficient de
perméabilité (Pe) du saccharose est inférieur à 0,2 × 10 -3 cm.min -1 dans des conditions non
toxiques.
Les dosages immunoenzymatiques de la DIMEB-Succ-DMPE 10 sont effectués sur la
solution du compartiment supérieur au début (t = 0 min) et à la fin (t = 120 min) de
l’expérience, et sur les solutions des quatre compartiments inférieurs (t = 0 à 30 min,
t = 30 à 60 min, t = 60 à 90 min, t = 90 à 120 min). Les résultats des dosages sont exprimés en
concentration massique. Le volume connu du compartiment supérieur (V = 1,5 mL) et des
compartiments inférieurs (V = 2,5 mL chacun) vont permettre de réaliser le bilan massique
140

des expériences. Nos résultats seront exprimés en % massique de quantité totale (ou quantité
initiale) de 10.
VII.3.1. Limite de sensibilité du dosage immunoenzymatique
Pour doser la DIMEB-Succ-DMPE 10 dans une matrice complexe (milieu physiologique) et à
de très faibles concentrations (de l’ordre de la µmol.L -1 ), le dosage immunoenzymatique par
compétition est une méthode idéale, à condition de posséder des anticorps capables de
reconnaître spécifiquement les molécules de notre phospholipidyl-CD.
Des anticorps anti-DIMEB, mis au point dans le Service de Phamacologie et d’Immunologie
du CEA Saclay en utilisant la DIMEB-NH2 comme haptène 244 , sont capables à priori de
reconnaître la DIMEB-Succ-DMPE 10, qui est une substance dont la structure est apparentée
à la DIMEB. Pour contrôler la spécificité de ces anticorps pour notre molécule, nous avons
tracé les courbes dose-réponse des dosages de la DIMEB et de la DIMEB-Succ-DMPE 10
(figure 76).
Les anticorps anti-DIMEB reconnaissent la DIMEB-Succ-DMPE 10, mais les courbes
100 × B/B0 = f(C) indiquent que le dosage est dix fois moins sensible avec 10 qu’avec la
DIMEB. Toutefois, la limite de détection est établie à 1 ng.L -1 , ce qui représente déjà une très
bonne sensibilité de dosage.
B/Bo (%)
100
80
60
40
20
0
0,1 1 10 100
competitor (ng/mL)
141
DIMEB
DIMEB-Succ-DMPE 10
B/B 0 50 %
Figure 76 : Courbes dose-réponse des dosages par compétition de la DIMEB et de la
DIMEB-Succ-DMPE 10

VII.3.2. Etude préliminaire du passage de la DIMEB-Succ-DMPE 10 à travers le
filtre sans cellules endothéliales
Une étude préliminaire du passage de la DIMEB-Succ-DMPE 10 à travers le filtre seul, sans
couche de cellules endothéliales, a été menée pour s’assurer que le filtre laisse passer
librement 10 du compartiment supérieur au compartiment inférieur.
Deux types de filtres différents ont été testés : les filtres PC et les filtres Transwell. Les
résultats des dosages prouvent que dans les deux cas, les filtres laissent passer la
DIMEB-Succ-DMPE 10. Les filtres PC ont été choisis pour réaliser toutes les études avec la
BHE.
VII.3.3. Etude à 500 µmol.L -1 et 100 µmol.L -1
A des concentrations initiales en DIMEB-Succ-DMPE 10 de 500 µmol.L -1 et 100 µmol.L -1 , la
BHE est détruite. Ces concentrations sont cytotoxiques.
VII.3.4. Etude à 10 µmol.L -1
A une concentration initiale de 10 µmol.L -1 , l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique est
préservée. La DIMEB-Succ-DMPE n’est pas toxique à cette concentration.
Des dosages immunoenzymatiques de 10 sont alors effectués sur le compartiment supérieur et
les compartiments inférieurs à t = 0 min. et à t = 120 min. Le bilan matière de 10 est
représenté graphiquement en début et en fin d’expérience sur la figure 77 :
142

%
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
compartiments inférieurs compartiment supérieur
t = 0 min t = 120 min, Essai n°1 t = 120 min, Essai n°2 t = 120 min, Essai n°3
t = 0 min
143
t = 120 min,
Essai n°1
t = 120 min,
Essai n°2
t = 120 min,
Essai n°3
Compartiment supérieur 100 % 69,6 % 79,0 % 73,6 %
Compartiments inférieurs 0 % 10,2 % 9,7 % 11,6 %
Figure 77 : Représentation graphique de l’étude du passage de la DIMEB-Succ-DMPE 10 à travers la
Barrière Hémato-Encéphalique.
A t = 0 min, la concentration initiale de la solution de 10 est mesurée à 10,9 µmol.L -1 . Cette
solution est placée dans le compartiment supérieur, qui contient alors 100 % de la quantité
totale de 10.
A t = 120 min, environ 10 % de la quantité totale de la DIMEB-Succ-DMPE 10 est retrouvée
dans les compartiments inférieurs. Cette molécule a donc l’étonnante propriété de passer à
travers la BHE sans la détruire pour autant. Par contre, 70 à 80 % de la quantité totale de 10
demeure dans le compartiment supérieur. Les résultats obtenus pour les trois essais sont
similaires et peuvent donc être considérer comme fiables.

D’après ce bilan, 10 à 20 % de la quantité initiale de DIMEB-Succ-DMPE 10 n’a pas été
dosée en fin d’expérience. Il est probable que cette partie soit restée fixé dans les membranes
des cellules endothéliales.
Les résultats des dosages immunoenzymatiques prouvent que la DIMEB-Succ-DMPE 10
passe à travers la BHE.
Etude de la cinétique de passage de la DIMEB-Succ-DMPE 10 à travers la BHE
Chaque compartiment inférieur représente 30 minutes de passage de la DIMEB-Succ-DMPE
10 à travers la BHE. Leur dosage nous a donc permis de tracer un profil cinétique du passage
(figure 78).
Essai n°3
Essai n°2
Essai n°1
t + 0min
t + 30min
144
t + 60 min
t + 120 min
t + 90 min
temps
t + 0 min t + 30 min t + 60 min t + 90 min t + 120 min
Essai n°1 0,0 % 30,1 % 58,4 % 79,9 % 100 %
Essai n°2 0,0 % 34,3 % 61,5 % 81,1 % 100 %
Essai n°3 0,0 % 32,1 % 61,1 % 82,3 % 100 %
Figure 78 : Représentation graphique de l’étude de la cinétique de passage de la DIMEB-Succ-DMPE 10 à
travers la BHE.
70,0
60,0
50,0
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
100,0
90,0
80,0
%

La cinétique de passage de la DIMEB-Succ-DMPE 10 à travers la BHE ne varie pas d’un
essai à un autre. Sur la quantité totale de 10 trouvée dans les compartiments inférieurs après
120 minutes de passage, 30 à 35 % passent pendant la première demi-heure, 30 % pendant la
deuxième demi-heure, 20 % pendant la troisième et 20 % pendant la dernière. La vitesse de
diffusion de 10 est donc uniforme.
De plus, on constate que 10 diffuse plus rapidement la première heure (60 % du total) que la
deuxième heure (40 %). La vitesse de diffusion est liée à la concentration de 10 dans le
compartiment supérieur.
Toutes ces observations sont caractéristiques d’un processus de diffusion passive de 10 à
travers la BHE. On peut supposer que la vitesse de diffusion continuera à décroître avec le
temps et que la quantité de 10 traversant la BHE n’évoluera quasiment plus après quelques
heures.
VII.4. Conclusion
Nous avons étudié la propriété de la DIMEB-Succ-DMPE 10 à traverser la barrière hématoencéphalique
à partir d’un modèle in vitro dans le but de développer une application
biologique pour les phospholipidyl-cyclodextrines. L’étude a été menée sur plusieurs
concentrations de 10 en solution dans un milieu physiologique (tampon Ringer-Hépes). A
500 µmol.L -1 et à 100 µmol.L -1 , la DIMEB-Succ-DMPE 10 détruit la BHE. Par contre, à
10 µmol.L -1 , une concentration vingt fois inférieure à la CMC de 10, la molécule traverse la
BHE par diffusion passive sans la détruire.
C’est la première fois que ce passage est démontré avec une cyclodextrine à de telles
concentrations. Deux hypothèses peuvent être avancées pour expliquer ces résultats
particulièrement intéressants :
la DIMEB-Succ-DMPE 10 est un bon candidat pour traverser la BHE ;
les dosages immunoenzymatiques sont beaucoup plus performants que les dosages par
HPLC car leur grande sélectivité vis-à-vis de la molécule à doser et leur grande
sensibilité nous ont permis de travailler dans des matrices complexes à des
concentrations beaucoup plus basses pour lesquelles le risque de cytotoxicité est
beaucoup plus limité.
145

Des anticorps spécifiques aux -CD 245 , -CD 246 , DIMEB 244 et TRIMEB existent déjà. Il
faudra donc compléter notre étude en testant, à de faibles concentrations, le passage de la
BHE des CDs commerciales et des autres CDs amphiphiles substituées en position 6 (e.g. les
cholestéryl-cyclodextrines) par les méthodes de dosages immunoenzymatiques. De même, il
existe des anticorps spécifiques de molécules invitées potentielles qui ne passent pas seules la
BHE. Il faudra tester leur passage par cette méthode sans et avec les différentes CDs.
146

VIII. Conclusion de la Partie 1
Une nouvelle famille de cyclodextrines amphiphiles monosubstituées a été synthétisée en
greffant un phospholipide naturel : la 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidyléthanolamine
(DMPE) sur une -cyclodextrine méthylée ou non. Les trois phospholipidyl-cyclodextrines
obtenues (-CD-Succ-DMPE 5, DIMEB-Succ-DMPE 10 et TRIMEB-Succ-DMPE 14) ont été
entièrement caractérisées par Résonance Magnétique Nucléaire à haut champ et par
Spectrométrie de Masse à basse et haute résolution. Le comportement de ces molécules en
milieu aqueux a ensuite été étudié. Il apparaît que les dérivés méthylés DIMEB-Succ-
DMPE 10 et TRIMEB-Succ-DMPE 14 s’auto-organisent dans l’eau avec une CMC
relativement faible. Des expériences de diffusion dynamique et statique de la lumière ont
permis de caractériser ces assemblages supramoléculaires comme étant de longues fibres
micellaires fluctuantes et polydisperses de grande taille (> 200 nm). La conservation des
propriétés d’inclusion de la partie CD des phospholipidyl-cyclodextrines 10 et 14 au sein des
systèmes organisés dans l’eau a été mise en évidence par RMN 1 H.
Afin d’étudier les interactions entre les phospholipidyl-CDs dans des systèmes de type
membranaire, des bicouches lipidiques ont été formées sous forme de films noirs de Newton
et leur structure a été caractérisée par réflectivité de rayons X à incidence rasante. Ces films
sont stables et mettent en évidence un important réseau d’hydratation constitué de molécules
d’eau liées dans l’environnement des têtes cyclodextrines et un empilement compact des
queues phospholipidiques. De plus, ces CDs amphiphiles présentent des propriétés
détergentes vis-à-vis des membranes modèles de DMPC.
Cette aptitude à interagir très facilement avec les membranes biologiques et les propriétés de
transport des phospholipidyl-CDs nous ont conduit à tester les capacités de ces molécules à
traverser la barrière hémato-encéphalique en vue d’une application biologique potentielle. Il a
été prouvé que la DIMEB-Succ-DMPE 10 traverse effectivement la BHE sans la détruire à
des concentrations bien inférieures à la CMC. Cette première étude a permis de développer
une méthode efficace d’évaluation de ces molécules en combinant d’une part un modèle
biologique et d’autre part une méthode de dosage sensible et spécifique comme le dosage
immunoenzymatique. Ces résultats préliminaires ouvrent une voie extrêmement intéressante
dans le développement de nouveaux systèmes de vectorisation pour le transport de
médicaments, notamment vers le cerveau.
147

2 ème PARTIE : LES PEPTIDOLIPIDYL-CYCLODEXTRINES
I. Introduction
Nous avons vu dans la partie précédente que les phospholipidyl-cyclodextrines combinent les
propriétés d’inclusion des cyclodextrines aux propriétés d’organisation des phospholipides et
ouvrent une voie extrêmement intéressante dans le développement de nouveaux systèmes de
transports transmembranaires de principes actifs. Toutefois, la synthèse de tels composés est
longue et très délicate, et le phospholipide greffé est un produit de départ coûteux et fragile.
La fragilité des produits obtenus est donc inhérente à celle du phospholipide (dégradation au
bout de quelques jours à température ambiante, conservation à -20°C). Enfin, leur structure
chimique n’est pas facilement modifiable car assujettie à la structure du phospholipide greffé.
Pour ces raisons, l’obtention d’une série de CDs amphiphiles entièrement synthétique, mimant
les caractéristiques structurales des phospholipidyl-cyclodextrines en s’affranchissant des
problèmes de stabilité chimique est une alternative possible. La mise au point de synthons
versatiles, jouant le rôle de la partie lipidique, nous permettra, contrairement aux
phospholipides, de modifier facilement les différents éléments de structure de ces molécules.
Le but est d’aboutir facilement et rapidement à l’obtention d’une série raisonnée d’une
nouvelle classe de CDs amphiphiles : les peptidolipidyl-CDs.
Nous traiterons dans un premier temps de la conception, de la synthèse et de la caractérisation
de ces nouveaux produits. Une première évaluation de leurs propriétés d’organisation sera
effectuée par des mesures de tension de surface, ainsi que par une étude par RMN du
deutérium.
148

II. Synthèse et caractérisation structurale des
peptidolipidyl-cyclodextrines
II.1. Stratégie de synthèse
II.1.1. Structure générale
La structure générale des peptidolipidyl-cyclodextrines a été mise au point à partir de l’étude
des principales caractéristiques structurales des phospholipidyl-cyclodextrines (figure 79).
CD-espaceur
Base chirale
HO
CD
HN
O
O
O
NH
OH
O
HO
Phospholipidyl-cyclodextrine
O-
O P O H
O
O
OH
espaceur
O
OH
O
O
O
6
149
O
Base
chirale
Peptidolipidyl-cyclodextrine
antenne lipophile
antenne lipophile
Figure 79 : Conception des peptidolipidyl-cyclodextrines à partir des principales caractéristiques
structurales des phospholipidyl-cyclodextrines
Antennes
lipophiles

Les éléments de structure qui ont été conservés sont les suivants :
Le bras espaceur qui relie la CD au groupement hydrophobe. Il introduit un degré
de liberté dans la molécule et son rôle dans les propriétés d’organisation des
cyclodextrines amphiphiles a été démontré 194 .
Le nombre de chaînes portées par le phospholipide, c'est-à-dire deux.
Le carbone asymétrique porté par le groupement glycéro du phospholipide. Il
introduit une contrainte sur l’orientation des deux chaînes lipidiques.
La longueur des chaînes lipidiques.
Par contre, le groupement phosphate n’a pas été conservé, pour simplifier au maximum dans
un premier temps la synthèse de ces nouvelles molécules.
La structure des peptidolipidyl-cyclodextrines peut être décrite en trois parties :
La partie CD-ESPACEUR
Cette partie est commune aux phospholipidyl-CDs et aux peptidolipidyl-CDs. Un bras
espaceur de type acide succinique est “branché” sur un des hydroxyles primaires de la -CD.
La nature de la cyclodextrine peut varier en fonctionnalisant ou non les hydroxyles (dérivés
-CD, DIMEB et TRIMEB).
La BASE CHIRALE
La base chirale doit comporter au moins un carbone asymétrique pour introduire une
contrainte sur l’orientation des chaînes lipidiques dans l’espace et de nombreuses fonctions
chimiques permettant de la coupler avec la partie CD-espaceur d’une part, et d’y greffer les
antennes lipophiles d’autre part. Nous avons choisi d’utiliser des acides aminés naturels
optiquement actifs (de configuration L) avec une chaîne latérale comportant une fonction
acide, c’est-à-dire l’acide L-aspartique (L-Asp) et l’acide L-glutamique (L-Glu).
Les ANTENNES LIPOPHILES
Il peut s’agir de deux chaînes hydrocarbonées saturées ou insaturées de même longueur ou de
longueurs différentes, possédant une fonction amine primaire terminale permettant leur
greffage sur les acides aminés par un couplage de type peptidique. La liaison amide présente
l’avantage d’être moins sensible à l’hydrolyse que les fonctions esters d’un phospholipide,
donc plus stable chimiquement. Les amides gras obtenus se rencontrent dans certains
150

constituants de la membranes tels que les sphingolipides et sont donc tout à fait acceptables
biologiquement.
Nous limiterons notre étude à l’introduction de deux chaînes saturées de même longueur (12
carbones), et deux chaînes saturées de longueurs différentes, l’une à 12 carbones, l’autre à 16
carbones. Toutefois, beaucoup d’autres dérivés peuvent être envisagés.
La structure plus détaillée des peptidolipidyl-cyclodextrines que nous synthétiserons dans
cette partie est représentée ci-dessous (figure 80).
R 3O
O
NH
O
H
HN
O
OR2
O
R3O
O
OR6
NHC n'H 2n'+1
n
O
O
OR 2O
NHC n''H 2n''+1
6
151
n = 1 ou 2
n’ = 12
n’’ = 12 ou 16
R 2 = R 3 = R 6 = H
R 2 = R 6 = CH 3 , R 3 = H
R 2 = R 3 = R 6 = CH 3
Figure 80 : Structure générale des peptidolipidyl-cyclodextrines
II.1.2. Peptidolipidyl-cyclodextrines avec deux chaînes identiques
Le schéma rétrosynthétique représenté figure 81 illustre la stratégie utilisée pour préparer la
série de peptidolipidyl-cyclodextrines composées de deux chaînes hydrocarbonées de même
longueur.
Les synthons N’,N’’-didodecyl-L-aspartamide (H-L-Asp(C12)-C12) et N’,N’’-didodecyl-Lglutamide
(H-L-Glu(C12)-C12) seront préparés en trois étapes de synthèse, respectivement à
partir de l’acide L-aspartique (H-L-Asp(OH)-OH) et de l’acide L-glutamique
(H-L-Glu(OH)-OH) qui sont des produits commerciaux.

H2N
O
H
n
NH
O
NH
R 3O
"CD-espaceur"
R 3O
n = 1 H-L-Asp(C 12 )-C 12
n = 2 H-L-Glu(C 12)-C 12
O
NH
O
OH
O
OR2 O
R3O OR6 O
R2 = R3 = R6 = H -CD-Succ
R2 = R6 = CH3 , R3 = H DIMEB-Succ
R2 = R3 = R6 = CH3 TRIMEB-Succ
O
NH
OR2O 6
O
O
H
NH
O
n
NH
O
NH
O
OR6 OR2 O
O
R3O OR2O 6
O
HN H
O
NH
O
n
NH
+
n = 1 Fmoc-L-Asp(C 12 )-C 12
n = 2 Fmoc-L-Glu(C 12)-C 12
152
H 2N
O
H
n
NH
O
NH
n = 1 : série L-Asp
R2 = R3 = R6 = H -CD-Succ-L-Asp(C12)-C12 R2 = R6 = CH3, R3 = H DIMEB-Succ-L-Asp(C12)-C12 R2 = R3 = R6 = CH3 TRIMEB-Succ-L-Asp(C12)-C12 n = 2 : série L-Glu
R 2 = R 3 = R 6 = H -CD-Succ-L-Glu(C 12 )-C 12
R 2 = R 6 = CH 3, R 3 = H DIMEB-Succ-L-Glu(C 12)-C 12
n = 1 H-L-Asp(C 12)-C 12
n = 2 H-L-Glu(C 12)-C 12
O
HN H
O
OH
O
n = 1 Fmoc-L-Asp(OH)-OH
n = 2 Fmoc-L-Glu(OH)-OH
O
n
OH
HO
O
NH2 O
n
OH
n = 1 H-L-Asp(OH)-OH
n = 2 H-L-Glu(OH)-OH
Figure 81 : Schéma rétrosynthétique des peptidolipidyl-CDs avec deux chaînes de même longueur
La première étape consistera à protéger la fonction amine primaire des acides aminés de
départ. L’action du N-(9-Fluorenylmethoxycarbonyloxy)succinimide (Fmoc-OSu) sur les
acides L-aspartique et L-glutamique permettra d’obtenir, selon une procédure décrite dans la
littérature 247 , l’acide N-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-L-aspartique (Fmoc-L-Asp(OH)-
OH) et l’acide N-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-L-glutamique (Fmoc-L-Glu(OH)-OH).
Le greffage des chaînes hydrocarbonées sera alors réalisé en une seule étape par l’action de la
dodécylamine sur les fonctions acides carboxyliques des acides aminés protégés, par une
réaction de type peptidique. Les produits obtenus, le N’,N’’-didodecyl-N-
(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-L-aspartamide (Fmoc-L-Asp(C12)-C12) et le N’,N’’-
didodecyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-L-glutamide (Fmoc-L-Glu(C12)-C12), seront
alors déprotégés en présence de pipéridine pour donner les dérivés H-L-Asp(C12)-C12 et
H-L-Glu(C12)-C12.

La littérature traite de la synthèse de N’,N’’-didodecyl-L-aspartamide 248 , mais les auteurs
utilisent une stratégie de protection-déprotection différente de la nôtre (protection avec le
chlorure de benzyloxycarbonyle (Z-Cl), déprotection avec H2/Pd).
L’étape finale consistera à coupler les synthons précédemment décrits aux dérivés
“CD-espaceur” (-CD-Succ 5, DIMEB-Succ 9, TRIMEB-Succ 13) par une réaction de type
peptidique. La synthèse de 5, 9 et 13 a été décrite dans la partie précédente. Nous obtiendrons
une série raisonnée de cinq peptidolipidyl-cyclodextrines en faisant varier la nature de la
partie cyclodextrine et la nature de l’acide aminé (tableau 10) :
Tableau 10 : Noms et abréviations des peptidolipidyl-cyclodextrines
Nom abréviation
N’,N’’-Didodecyl-N-(6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxycyclomaltoheptaose)-
L-aspartamide
N’,N’’-Didodecyl-N-(6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxy-2 I -O-méthyl-hexakis(2 II-
VII II-VII
,6 -di-O-méthyl)cyclomaltoheptaose)-L-aspartamide
N’,N’’-Didodecyl-N-(6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxy-2 I ,3 I -di-O-méthylhexakis(2
II-VII ,3 II-VII ,6 II-VII -tri-O-méthyl)cyclomaltoheptaose)-L-aspartamide
N’,N’’-Didodecyl-N-(6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxycyclomaltoheptaose)-
L-glutamide
N’,N’’-Didodecyl-N-(6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxy-2 I -O-méthyl-hexakis(2 II-
VII II-VII
,6 -di-O-méthyl)cyclomaltoheptaose)-L-glutamide
II.1.3. Peptidolipidyl-cyclodextrines avec deux chaînes différentes
153
-CD-Succ-L-Asp(C12)-C12
DIMEB-Succ-L-Asp(C12)-C12
TRIMEB-Succ-L-Asp(C12)-C12
-CD-Succ-L-Glu(C12)-C12
DIMEB-Succ-L-Glu(C12)-C12
Le schéma rétrosynthétique représenté figure 82 illustre la stratégie utilisée pour préparer la
série de peptidolipidyl-cyclodextrines composées de deux chaînes hydrocarbonées de
longueurs différentes.

HO
O
H
H2N O
NH
O
H
NH
O
NH
O
NH
O
OH
OH
O
O
HO
OH
O 6
NH
-CD-Succ-L-Asp(C16)-C12
O
NH
H-L-Asp(C 16)-C 12
O
O
HN H
"CD-espaceur"
HO
O
NH
O
NH
NH
154
-CD-Succ
Fmoc-L-Asp(C 16)-C 12
O
O
Fmoc-L-Asp(O-tBu)-OH
O
HN H
O
OH
O
OH
O
HO
O
OH
O
O
OH
O
OH
O 6
+
O
H 2N
O
H
HN H
O
O
O
NH
O
NH
H-L-Asp(C 16)-C 12
O
NH
O
OH
Fmoc-L-Asp(OH)-C 12
HN H
O
NH
O
O
Fmoc-L-Asp(O-tBu)-C 12
Figure 82 : Schéma rétrosynthétique des peptidolipidyl-CDs avec deux chaînes de longueurs différentes
Le synthon N’-dodecyl-N’’-hexadécyl-L-aspartamide (H-L-Asp(C16)-C12) sera préparé à
partir de l’acide N’’-(tert-butyloxycarbonyl)-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-L-aspartique
commercial (Fmoc-L-Asp(O-tBu)-OH) en quatre étapes. Ce produit de départ peut être
synthétisé en une seule étape à partir de l’acide L-aspartique selon une procédure décrite par
Lajoie et coll 249 .
Une réaction de type peptidique entre le Fmoc-L-Asp(O-tBu)-OH et la dodécylamine
permettra de greffer une seule chaîne hydrocarbonée sur l’acide aminé pour donner le
N’-dodécyl-N’’-(tert-butyloxycarbonyl)-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-L-aspartamide
(Fmoc-L-Asp(O-tBu)-C12), l’acide carboxylique de la chaîne latérale étant sélectivement
protégé.
Le groupement protecteur BOC (butyloxycarbonyl) sera facilement clivé sous l’action de
l’acide trifluoroacétique, et l’acide carboxylique déprotégé pourra réagir avec
l’hexadécylamine, grâce à une réaction de type peptidique, pour donner un produit dibranché
avec deux chaînes de longueurs différentes, le N’-dodécyl-N’’-hexadécyl-N-
(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-L-aspartamide (Fmoc-L-Asp(C16)-C12).

Le synthon H-L-Asp(C16)-C12 sera finalement obtenu par clivage du groupement protecteur
de l’amine primaire (Fmoc) avec de la pipéridine.
Le couplage entre la -CD-Succ 5 et le H-L-Asp(C16)-C12 donnera un nouveau composé de la
famille des peptidolipidyl-cyclodextrines, le N’-dodécyl-N’’-hexadecyl-N-(6 I -
amidosuccinyl-6 I -désoxycyclomaltoheptaose)-L-aspartamide (-CD-Succ-L-Asp(C16)-C12).
II.2. Préparation des synthons
II.2.1. H-L-Asp(C12)-C12 21 et H-L-Glu(C12)-C12 22
HO
H 2N
H
O
H
NH 2
n = 1 15
n = 2 16
O
n
n
n = 1 21
n = 2 22
O
NHC 12H 25
O
OH
NHC 12H 25
Fmoc-OSu 0.83 éq.
Na 2 CO 3 aq.
H 2 O, DMF, TA, 1 h 30
n = 1 92 %
n = 2 83 %
Pipéridine 20% (v/v)
n = 1 90 %
n = 2 94 %
155
O
HO
O
O
n = 1 17
n = 2 18
DIC 3 éq.
HOBt 3 éq.
C 12 H 25 NH 2 3 éq.
DMF anh. / CHCl 3 anh. 1/3
TA, 18 h
CHCl3 , TA, 1 h O NH
O
n = 1 19
n = 2 20
NH O
H
H
n
OH
n = 1 72 %
n = 2 69 %
O
n
NHC 12H 25
O
NHC 12H 25
Figure 83 : Schéma réactionnel pour la synthèse de H-L-Asp(C12)-C12 21 et de H-L-Glu(C12)-C12 22
L’étape de protection de la fonction amine de l’acide L-aspartique 15 et de l’acide
L-glutamique 16 est réalisée en utilisant le groupement Fmoc. Le Fmoc-L-Asp(OH)-OH 17 et
le Fmoc-L-Glu(OH)-OH 18 sont obtenus facilement dans de grandes quantités avec un haut
degré de pureté et de très bons rendements (92 % et 83 % pour 17 et 18, respectivement). Le

groupement protecteur Fmoc a été choisi car il peut être éliminé dans des conditions très
douces.
La réaction de type peptidique entre les acides aminés protégés 17 et 18 et la dodécylamine
est réalisée par la diisopropylcarbodiimide (DIC) en présence d’hydroxybenzotriazole
(HOBT). Le mécanisme de ce couplage est représenté ci-dessous (figure 84) :
O
O
O
R 2
O
HN H
H
N H
HN H
O
R 1
O
R 1
O
O
H
N
NH
N
C
N
DIC
156
O
O
HN H
O
R 1
O
NH
O
R 2
O
HN H
O
HN H
R1
O
R1
O-acyl-urée
+
NH
O
N
H N
O
O NH
R2
H H
N N
Figure 84 mécanisme réactionnel du couplage peptidique en présence de DIC
L’attaque nucléophile de l’acide carboxylique sur la DIC conduit à une O-acyl-urée
intermédiaire. L’attaque de l’amine primaire sur le carbonyle activé et un réarrangement
conduisent à la formation de la liaison peptidique et à la libération de N,N’-diisopropylurée
(DIU). Ce mode de couplage est extrêmement efficace mais il peut conduire à une
racémisation partielle de l’acide aminé. Ce phénomène indésirable se produit au niveau de la
O-acyl-urée intermédiaire par abstraction intramoléculaire d’un proton selon le mécanisme
suivant (figure 85) :
O
DIU
NH

O
O
N
H
R 1 O
H
N
O
C
N
H
Figure 85 : mécanisme de racémisation de la O-acyl-urée
157
O
O
N
H
R 1 O
L’utilisation de l’HOBT a pour but de réduire considérablement la probabilité de cette
racémisation. Ce composé intervient d’une part par son caractère acide faible mais surtout en
tant que puissant nucléophile capable d’attaquer la O-acyl-urée pour donner un ester actif
(figure 86).
O
O
HN H
O
R 1
O
N
H
NH +
O
N
N
N
O
O
HN H
+ DIU
Figure 86 : Formation d’un ester actif par l’emploi d’HOBt sur la O-acyl-urée
Cette réaction réduit la durée d’existence de la O-acyl-urée qui représente l’intermédiaire le
plus apte à conduire à la racémisation. L’ester formé avec le HOBT présente au contraire une
très bonne stabilité chirale. Son aminolyse conduit à la formation de la liaison peptidique et
régénère l’HOBT.
Le réaction est effectuée dans un mélange DMF anhydre / CHCl3 anhydre 1 / 3 (v/v). Les
composés Fmoc-L-Asp(C12)-C12 19 et Fmoc-L-Glu(C12)-C12 20 sont isolés avec des
rendements satisfaisants (72 % et 69 % pour 19 et 20, respectivement) après plusieurs lavages
au DMF et à l’éther du précipité formé pendant la réaction, pour éliminer les produits de
départ en excès ou régénérés et l’urée formée.
L’élimination du groupement Fmoc est réalisée dans une solution à 20 % (v/v) de pipéridine
dans le chloroforme. Les dérivés H-L-Asp(C12)-C12 21 et H-L-Glu(C12)-C12 22 sont isolés par
précipitation dans l’hexane, puis par recristallisation dans le méthanol avec des rendements
supérieurs à 90 %.
HN
O
R 1
O
C
N
H
O
N
N
N

Les dérivés 21 et 22 sont obtenus en trois étapes à partir des acides L-Aspartique 15 et
L-Glutamique 16 avec un rendement global de 60 % et de 54 %, respectivement. Ces
rendements sont supérieurs à ceux indiqués dans la littérature pour la synthèse de 21 248 .
II.2.2. H-L-Asp(C16)-C12 32
O
O
O
O
28
NH
NH
H
H
31
O
O
OH
Pipéridine 20% (v/v)
CHCl 3 , TA, 1 h
84 %
O
O
NHC12H25 O
NHC 16H 33
DIC 1,5 éq.
HOBt 1,5 éq.
C 12 H 25 NH 2 1,5 éq.
DMF anh. / CHCl 3 anh. 1/3
TA, 18 h
87 %
DIC 1,5 éq.
HOBt 1,5 éq.
C 16 H 33 NH 2 1,5 éq.
DMF anh. / CHCl 3 anh. 1/3
TA, 18 h
H 2N
H
158
61 %
O
NHC12H25 O
32
NHC 16H 33
Figure 87 : Schéma réactionnel pour la synthèse de H-L-Asp(C16)-C12 32
O
O
29
O
NH
TFA 20% (v/v)
CH 2 Cl 2 ,5h, TA
O
30
H
O
94 %
NH
H
O
NHC 12H 25
O
O
NHC 12H 25
La dodécylamine est greffée au Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH 28 par la méthode de couplage
peptidique classique (DIC, HOBT), dans un mélange DMF anhydre / CHCl3 anhydre 1/3
(v/v). Le Fmoc-L-Asp-(OtBu)-C12 29 est purifié grâce à une colonne chromatographique sur
silice (gel de silice 60 FLUKA, 220 - 440 mesh ASTM) avec une élution au chloroforme. Il
est isolé avec un très bon rendement (87 %).
Le groupement protecteur BOC de la fonction acide carboxylique du composé 29 est très
facilement éliminé dans une solution à 20 % d’acide trifluoroacétique (TFA) dans le
dichlorométhane. Le Fmoc-L-Asp(OH)-C12 30 est isolé par précipitation dans l’éther de
pétrole avec des rendements quasi-quantitatifs.
O
OH

L’hexadécylamine est alors greffée au composé 30 par la méthode de couplage peptidique
classique (DIC, HOBT). Le Fmoc-L-Asp(C16)-C12 31 est isolé de façon identique aux
composés 19 et 20 avec un rendement de 61%. La dernière étape consiste à déprotéger
l’amine primaire du composé 31. Le H-L-Asp(C16)-C12 32 est obtenu de la même manière que
les composés 21 et 22 avec un rendement de 84 %.
Le dérivé 32 est obtenu en quatre étapes à partir du Fmoc-L-Asp(O-tBu)-OH avec un
rendement global de 42 %.
II.3. Couplage avec les cyclodextrines
Le couplage des synthons 21, 22 et 32 aux dérivés “CD-espaceur” 5, 9 et 13 conduit aux
peptidolipidyl-cyclodextrines selon le schéma suivant (figure 88) :
R 3O
O
NH
O
OH
O
OR2 O
R3O OR 6
O
OR 2
O
6
+
O
H
H2N Cn'H2n'+1
N
H
O
n
NH
Cn''H2n''+1 DIC 4 éq.
HOBt 4 éq.
DMF anh. / CHCl3 anh. 1/1
TA, 24 h
CD-espaceur Synthon Peptidolipidyl-CD
CD-espaceur Synthon
Type n éq. Type n éq.
159
R 3O
O
NH
O
O
OR2 O
R3O H
HN
O
OR 6
Cn'H2n'+1 N
H
O
n
NH
Cn''H2n''+1 O
OR 2
O
Peptidolipidyl-CD Rdt
-CD-Succ 5 1 H-L-Asp(C12)-C12 21 1,2 -CD-Succ-L-Asp(C12)-C12 23 85 %
-CD-Succ 5 1 H-L-Glu(C12)-C12 22 1,2 -CD-Succ -L-Glu(C12)-C12 24 77 %
DIMEB-Succ 9 1 H-L-Asp(C12)-C12 21 1,2 DIMEB-Succ-L-Asp(C12)-C12 25 60 %
DIMEB-Succ 9 1 H-L-Glu(C12)-C12 22 1,2 DIMEB-Succ -L-Glu(C12)-C12 26 63 %
TRIMEB-Succ 13 1 H-L-Asp(C12)-C12 21 1,2 TRIMEB-Succ-L-Asp(C12)-C12 27 46 %
-CD-Succ 5 1 H-L-Asp(C16)-C12 32 1,2 -CD-Succ-L-Asp(C16)-C12 33 66 %
Figure 88 : Schéma réactionnel pour la synthèse des peptidolipidyl-CDs 23, 24, 25, 26, 27 et 33

Ce couplage est réalisé par la diisopropylcarbodiimide (DIC) en présence
d’hydroxybenzotriazole (HOBT). Les réactifs de départ n’étant pas solubles dans un même
solvant, la réaction est effectuée dans un mélange DMF anhydre / CHCl3 anhydre 1/1 (v/v).
Les peptidolipidyl-cyclodextrines 23, 26 et 33, dérivées de la -CD, sont obtenues
pratiquement pures après une simple précipitation dans l’éther. Leur degré de pureté est en
général supérieur à 95 % d’après les profils analytiques réalisés par HPLC (figure 89). Les
quelques impuretés qui subsistent (< 5 %) sont probablement des traces d’urée non solubilisée
dans l’éther. Toutefois, pour obtenir des produits avec une pureté proche de 100 %, les
composés 23, 24 et 33 ont été purifiés par HPLC sur une colonne semi-préparative à polarité
de phase normale (colonne µPorasil WATERS 10µm 125 Å, cartouche Radial-Pak 2 × 25 mm
× 100 mm précédée d’une cartouche de garde) en utilisant comme éluant le mélange
suivant : A = CH3OH, B = CHCl3 / CH3OH / NH3 20 % 80/19,5/0,5 (v/v/v), A/B 20/80 (v/v),
en mode isocratique. La détection est effectuée à partir d’un DEDL.
-CD-Succ-L-Glu(C 12 )-C 12 24
Figure 89 : Chromatogramme du produit 3 obtenu par HPLC (colonne µPorasil WATERS 10µm ; élution
en mode isocratique A / B 20/80 (v/v) avec A = CH3OH et B = CHCl3 / CH3OH / NH3 20 % 80/19,5/0,5 (v/v)
en 12 min, débit : 1 ml.min -1 , détection : DEDL SEDEX 55 (T° = 40 °C, gain = 7, pN2 = 2,1 bars)).
Les produits finaux 25, 26 et 27 sont purifiés grâce à une colonne chromatographique sur
silice (gel de silice 60 FLUKA, 220 - 440 mesh ASTM). Les produits sont élués dans un
mélange CHCl3 / MeOH.
Les rendements des produits 23 à 27 et 33, compris entre 46 et 85 %, sont encore
optimisables.
160

II.4. Caractérisation des peptidolipidyl-cyclodextrines
La structure des peptidolipidyl-cyclodextrines a été entièrement caractérisée par RMN du
proton et du carbone et par spectrométrie de masse à haute résolution.
II.4.1. Caractérisation par RMN
L’attribution des spectres RMN 1 H et 13 C des peptidolipidyl-cyclodextrines 23, 24, 25, 26, 27
et 33 a été réalisée grâce à des expériences bidimensionnelles homonucléaires ( 1 H- 1 H) et
hétéronucléaires ( 1 H- 13 C). La stratégie d’attribution est la même que celle employée pour
l’attribution des phospholipidyl-CDs.
La figure 90 représente le spectre RMN 1 H attribué de la -CD-Succ-L-Glu(C12)-C12 24.
HO
NH
O
OH
H
O
NH
O c d
a b O
NH
O
OH
NH CD
1
N'H
N''H
6
O
4 O
5
HO 2
3 1
OH
O 6
N’H
N’’H
9.2 9.0 8.8 8.6 ppm
1
12
12
H-1
9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 ppm
161
H-
H-3
H-5/H-6’
H-6
H-4
H-2
H-2 I
H-4 I
H-1/
H-1
H-b/H-c
H-3 àH-11 / H-3 àH-11
H-, H-/H-’
Figure 90 : Spectre RMN 1 H de la -CD-Succ-L-Glu(C12)-C12 24 (500,13 MHz, 20 mM, pyr-d5, 298 K).
H-’
H-2/
H-2
H-12/
H-12

Le séquençage des différentes parties du peptidolipidyl-CD 24 est réalisé grâce aux spectres
COSY, COSY simple relais et T-ROESY, via les interactions scalaires et dipolaires
(figure 91).
(a)
(b)
(c)
ppm
ppm
ppm
2
4
2
4
3
4
5
NH N’H N’’H
H-
H-’
H-
H-
H-’
H-, H-, H-’
NH CD
H-6’ I
H-6 I
H-6’ I
H-6 I
H-5 I
H-1 H-1
H-2
H-1
H-1
H- H-
H-2
H-1
H-1
H-/H-’
9.4 9.2 9.0 8.8 8.6 8.4 8.2 ppm
162
HO
O
NH
O
OH
O
HO
H
NH
O
O
OH
NH
O
O
OH
O
COSY (a)
COSY simple relais (b)
T-ROESY (c)
Figure 91 : contours partiels des cartes (a) COSY, (b) COSY simple relais et (c) T-ROESY (tm = 300 ms)
du composé 24 (500,13 MHz, 20 mM, pyr-d5, 298 K).
Par ailleurs, tous les protons de l’unité glucosidique substituée de la cyclodextrine sont
attribués via les interactions scalaires, à partir du proton amide (NHCD) porté par la CD
(figure 92).
NH
6

ppm
3.8
4.0
4.2
4.4
4.6
4.8
NH CD
4
HO
H-6’ I
H-6 I
H-5 I
6
3
9.0 ppm
NH
5
R
Unité I
CD
2
O
OH
1
O
H-3 I /H-4 I
H-2 I /H-3 I
H-3 I
H-4 I /H-5 I
4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 ppm
(a) (b)
4
HO
Unités II - VII
6
3
OH
5
2
163
O
1
OH
O
6
H-6 I /H-6’ I
COSY (a)
COSY simple relais (b)
Figure 92 : Contours partiels des cartes (a) COSY simple relais et (b) COSY du composé 24 (500,13 MHz,
20 mM, pyr-d5, 298 K).
Enfin, les proximités spatiales entre les protons H-1 d’une unité glucosidique et les protons
H-4 de l’unité voisine permettent de relier l’unité substituée à ses unités adjacentes via les
interactions dipolaires (figure 93).
H-2 I
H-4 I

ppm
3.8
4.0
4.2
H-1 VII / H-4 I
H-1I H-1VII
H1 I / H-2 I
H4 I / H-1 II
5.7 5.6 5.5 5.4 5.3 ppm
H-4 I
H-2 I
164
H-1 VII
4
HO
6
3
NH
5
R
Unité I
CD
2
O
OH
1
6
O
4
5
O
HO 3
2
OH
1
O 6
T-ROESY
Unités II - VII
Figure 93 : Contours partiels de la carte T-ROESY du composé 24 (500,13 MHz, 20 mM, pyr-d5, 298 K,
tm = 300 ms).
Le spectre RMN 13 C de 24 attribué grâce aux expériences hétéronucléaires bidimensionnelles
(HMQC, HMBC) est représenté figure 94 :
O
H N'H
1
NH
O c d
a
NH
b
O
O
O
N''H
1
HO
OH
O
OH
6
4 O
5
HO 2
3 1
OH
O 6
C-a
C-d
N’’H-C=O
N’H-C=O
ppm
12
12
C-1
C-4 I
C-10/
C-10
C-b/C-c
34 32 30 ppm
C-11/
C-11
C-12/
C-12
160 140 120 100 80 60 40
ppm
C-4
C-
C-3/C-5/C-2
C-5 I
C-6
C-
C-
C-3/
C-3
C-4 àC-9/C-4 àC-9,
C-2/C-2
C-1/C-1
Figure 94 : Spectre RMN 13 C de la -CD-Succ-L-Glu(C12)-C12 24 (125,77 MHz, 20 mM, pyr-d5, 298 K).
C-6 I

II.4.2. Spectrométrie de Masse Haute Résolution
Des mesures de masse exacte des six peptidolipidyl-cyclodextrines synthétisées ont été
réalisées en mode positif, sur les ions [MH] + et [MNa] + avec une résolution de masse de 5000,
en utilisant NaI comme étalon interne, introduit de manière continue par un second nébuliseur
(Lockspray). Les résultats de ces mesures sont présentés dans le tableau 11 :
Tableau 11 : Mesures de masse exacte des peptidolipidyl-cyclodextrines 23, 24, 25, 26, 27, 33
Composé Ion
23
MH +
24 MH +
25
26 MNa +
Masse
mesurée
165
Masse
calculée
ppm Formule
1683,8441 1683,8441 0,0 C74H131N4O38
MNa + 1705,8169 1705,8261 5,4 C74H130N4O38Na
1697,8624 1697,8598 1,6 C75H133N4O38
MH + 1866,0394 1866,0476 4,4 C87H157N4O38
MNa + 1888,0214 1888,0295 4,3 C87H156N4O38Na
1902,0529 1902,0452 4,0 C88H158N4O38Na
27 MNa + 1986,1432 1986,1391 2,1 C94H170N4O38Na
33
MH +
MNa +
II.5. Conclusion
1739,8983 1739,9670 4,8 C78H139N4O38
1761,8866 1761,8887 1,2 C78H138N4O38Na
Nous avons réalisé la synthèse de six conjugués peptidolipidyl-cyclodextrines en faisant
varier la nature de la CD, de l’acide aminé et la longueur des chaînes lipidiques.
Il va maintenant falloir tester les aptitudes de cette série raisonnée de CDs amphiphiles à
s’auto-organiser dans l’eau ou bien à s’insérer dans des membranes phospholipidiques modèle
pour former de nouvelles structures lipidiques supramoléculaires potentielles capables de
vectoriser des principe actifs.

III. Propriétés d’organisation des peptidolipidyl-CDs
Les propriétés d’organisation des peptidolipidyl-cyclodextrines seront étudiées sous deux
aspects différents. Dans un premier temps, des mesures de concentration micellaire critique et
de solubilité permettront d’évaluer les capacités de ces nouveaux dérivés à s’auto-organiser
dans l’eau. Nous pourrons alors établir un point de comparaison avec les phospholipidylcyclodextrines.
Les propriétés d’insertion de certaines peptidolipidyl-CDs dans des bicouches
phospholipidiques préformées (liposomes de DMPC) seront ensuite largement étudiées par
RMN du deutérium.
III.1. Propriétés d’auto-organisation dans l’eau : mesures de CMC
Les concentrations micellaires critiques des composés 23, 24, 25, 26 et 27 sont déterminées à
partir des courbes de variation de la tension superficielle en fonction de la concentration
(s = f(Log(C)). Les mesures de tensions de surface sont réalisées par la méthode de la plaque
de Wilhelmy à 20°C. Les résultats sont indiqués dans le tableau 12 :
Tableau 12 : CMC et solubilités des peptidolipidyl-CDs 23, 24, 25, 26 et 27
Composé CMC (mol.L -1 ) Solubilité (mol.L -1 )
-CD-Succ-L-Asp(C12)-C12 23 Pas de CMC ou non détectée

(< 10 -5 mol.L -1 ). Les dérivés de la DIMEB 25 et 26, et de la TRIMEB 27, possèdent une CMC
très faible (de l’ordre de 10 -5 -10 -6 mol.L -1 ), et sont également faiblement solubles dans l’eau
(de l’ordre de 10 -3 mol.L -1 ).
Les peptidolipidyl-CDs dont la partie macrocyclique est partiellement ou complètement
méthylée sur les hydroxyles possèdent une CMC, et leur solubilité est plus importante que
celle du dérivé de la -CD. On retrouve cette caractéristique pour les phospholipidyl-
cyclodextrines et les cholestéryl-CD 194,196 . Il semble donc acquis que la nature de la CD joue
un rôle prépondérant dans les propriétés surfactantes des cyclodextrines amphiphiles
monosubstituées. On suppose que le caractère hydrophile de la DIMEB et de la TRIMEB est
plus important que celui de la -CD, en raison du réseau d’hydratation qui se forme autour
des dérivés méthylés de la cyclodextrine et améliore leur solubilité.
Toutefois, les solubilités des peptidolipidyl-DIMEB 25 et 26, et de la peptidolipidyl-
TRIMEB 27 sont très inférieures à leurs analogues phospholipidyl-cyclodextrines et les
caractéristiques de ces molécules (faible CMC, faible solubilité) sont plus proches de
surfactants tels que les phospholipides.
Aussi nous n’étudierons pas les propriétés d’auto-organisation de ces composés en milieu
aqueux mais leur capacité à s’insérer dans des systèmes déjà organisés comme des bicouches
de phospholipides. Une telle approche pourrait conduire à des système mixtes.
III.2. Insertion des peptidolipidyl-CDs dans des membranes
lipidiques modèles de DMPC : Etude par RMN 2 H
Cette étude a été menée en collaboration avec le D r Michel ROUX (SBPM / DBCM / DSV,
CEA Saclay) qui a réalisé les expériences de RMN du deutérium.
La RMN du deutérium est très différente de celle du proton ou du carbone-13. Ces principes
fondamentaux sont brièvement décrits en annexe V. Pour notre compréhension, nous allons
nous limiter à expliquer de façon très succincte quelles sont les informations essentielles qui
peuvent être extraites d’un spectre RMN 2 H.
Le spectre RMN du deutérium de la POPC-d31, une phosphatidylcholine deutériée sur la
chaîne sn-1 est représenté figure 95 :
167

POPC-d31
Fréquence (KHz)
Figure 95 : Spectre RMN du deutérium (a) brut et (b) déconvolué de la POPC-d31
A chaque groupement CD2 de la chaîne, correspond un doublet ou écart quadrupolaire q. La
superposition de l’ensemble des doublets conduit au spectre composite représenté figure 17 a.
Par déconvolution de ce spectre, on obtient le spectre représenté figure 17 b, qui permet une
mesure précise de chaque écart quadrupolaire, notamment ceux des groupements CD2 et CD3
localisés en bout de chaîne (positions 9 à 16) qui apparaissent au centre du spectre. Les
groupements CD2 proches du glycérol (2 à 8) sont superposés et apparaissent aux bornes du
spectres.
Pour chaque liaison CD, l’écart quadrupolaire est de la forme :
q
Q SCD
où Q est la constante du couplage quadrupolaire statique ( 125 KHz pour les groupes CD
aliphatiques) et SCD, le paramètre d’ordre orientationnel. Dans le cas de liposomes
multilamellaires, SCD contient deux composantes, une d’ordre géométrique, soit l’angle
moyen que fait cette liaison CD avec la normale de la bicouche, et une autre d’ordre
168

dynamique, qui rend compte de l’amplitude des fluctuations angulaires du vecteur CD. Ce
paramètre d’ordre SCD peut fournir des informations d’ordre macroscopique sur l’organisation
globale de la membrane (phase lamellaires, hexagonales ou cubique, micelles, vésicules…) et
microscopique au niveau de perturbations plus spécifiques du groupement considéré et de son
environnement local. Le travail présenté ici a été effectué au moyen de la
dimyristoylphosphatidylcholine deutériée sur les deux chaînes hydrophobes (DMPC-d54),
dont la structure est représentée figure 96.
N
O P
O-
O H
O
O
O
O
O
D
D
D D
D D DDDD DD DD D D D
DD
D
D
D D
169
DD
D
D
D D
DD
D
D
D D
D
D
D D
Figure 96 : Structure de la DMPC-d54
La figure 97 représente les spectres du deutérium déconvolués de la DMPC-d54 seule
(figure 97 a), sous forme de liposome hydraté, et en présence de quantités croissantes de
-CD-Succ-L-Asp(C12)-C12 23 non marquée (figure 97 b-f).
DD
D
D
D D
DD
D
D D
DD
D D

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
Phase L
DMPC seule
Fréquence (KHz)
170
Phase mixte L
DMPC / 23
Figure 97 : Spectres RMN 2 H déconvolués de membranes de DMPC d-54 à 21 °C, préparées (a) en
absence ou (b-f) en présence de (b) 2,5 %, (c) 5 %, (d) 7,5 %, (e) 10 % et (f) 20 % de
-CD-Succ-L-Asp(C12)-C12 23.
Le spectre RMN 2 H de la DMPC seule sous forme de bicouche en phase fluide (L) a une
forme spécifique correspondant au spectre représenté figure 17 (a). On peut considérer deux
signaux caractéristiques, l’un à -32 KHz (groupements CD2 proches du glycérol), et l’autre à
-5 KHz (CD3 terminaux) représentés par des pointillés.
L’addition de quantités croissantes de 23 fait apparaître deux nouveaux pics à -26 KHz et
-3 KHz (traits pleins), correspondant à une nouvelle phase mixte DMPC / 23. Entre 2,5 % et
10 % de 23, la persistance des signaux à -33 KHz et -5 KHz laisse supposer la coexistence de
deux phases, une pure de DMPC d’une part, l’autre mixte DMPC / 23 d’autre part.
Avec 20 % de 23 et plus, les signaux à -33 KHz et -5KHz disparaissent indiquant l’absence de
phase pure de DMPC et donc la présence d’une phase mixte DMPC / 23 unique.

Par simulation des raies de résonances des groupements méthyle de la DMPC en phase fluide
L avec une fonction gaussienne, on peut déterminer les quantités relatives de DMPC
présentes dans la phase pure de DMPC et dans la phase mixte DMPC /
-CD-Succ-L-Asp(C12)-C12 23 (tableau 13) :
Tableau 13 : Répartition des phospholipides à divers taux -CD-Succ-L-Asp(C12)-C12 23,
Proportion de
-CD-Succ-L-Asp(C12)-C12 23
Phase L DMPC Phase mixte L DMPC / 23
0,0 % 100 % 0 %
5,0 % 76 % 24 %
7,5 % 57 % 43 %
10,0 % 49 % 51 %
20,0 % 0 % 100 %
30,0 % 0 % 100 %
Quelque soit le pourcentage de CDs amphiphiles 23, la phase mixte est constante, c'est-à-dire
constituée de 4 à 5 molécules de DMPC pour une molécule de 23. Au fur et à mesure que l’on
augmente le pourcentage de 23, la phase pure de DMPC est consommée, jusqu’à disparaître
pour un pourcentage de 20 % de 23.
Cependant, lorsque la phase mixte contient au moins 30 % de 23, on constate une diminution
de sa stabilité sans doute due à un déficit de phospholipides.
La température de transition fluide-gel de la phase mixte DMPC / 23 peut-être facilement
déterminée à l’aide des spectres RMN 2 H effectués sur l’échantillon à 20 % de 23 à des
températures différentes (figure 98).
171

°C
Fréquence (KHz)
Figure 98 : Spectre RMN 2 H déconvolués de membranes de DMPC-d54 préparées en présence de 20 % de
-CD-Succ-L-Asp(C12)-C12 23 et enregistré à différentes températures.
On peut constater un brutal changement de l’allure générale des spectres pour des
températures inférieures ou égale à 12 °C. Ce brusque effondrement des signaux est
caractéristique d’une transition de phase fluide-gel de la bicouche de la phase mixte
DMPC / 23.
Des résultats similaires ont été obtenus pour les composés -CD-Succ-L-Glu(C12)-C12 24.
En conclusion, lorsque les membranes de DMPC sont préparées en présence de
peptidolipidyl-cyclodextrines, on observe une ségrégation de phase avec formation d’une
phase mixte parfaitement organisée, constituée de 4 à 5 molécules de phospholipides pour une
molécule de peptidolipidyl-CD, et avec une transition de phase fluide-gel très bien définie et
très basse (T° fluide-gel : 12°C).
Ces résultats sont à comparer avec ceux obtenus précédemment sur le dérivé Chol--CD, pour
lequel une ségrégation de phase a également été observée 199 . Une phase mixte
172

Chol--CD / DMPC constituée de 3 phospholipides pour 2 CDs amphiphiles est formée et
coexiste avec la phase pure de DMPC. Contrairement aux peptidolipidyl-CDs, il a été montré
que la partie cholestéryle induisait une désorganisation locale de la membrane
phospholipidique et aucune transition fluide-gel franche n’a été observée pour la phase mixte
Chol--CD / DMPC.
IV. Conclusion de la deuxième partie
Nous avons réalisé la synthèse de six conjugués peptidolipidyl-cyclodextrines en faisant
varier la nature de la CD, de l’acide aminé et la longueur des chaînes lipidiques. Ces produits
ont été obtenus à l’échelle de plusieurs centaines de milligrammes par un couplage de type
peptidique entre les dérivés “CD-espaceur” et des synthons à base d’un acide aminé chiral sur
lequel sont greffées deux chaînes lipidiques, qui ont été préparés en trois ou quatre étapes de
synthèse. Les produits finaux ont été purifiés par HPLC ou sur colonne chromatographique
selon la nature de la partie CD. Chacun des composés a fait l’objet d’une caractérisation
structurale par RMN 1 H et 13 C mono et bidimensionnelle et d’une analyse de spectrométrie de
masse à haute résolution. Des analyses physico-chimiques complémentaires ont permis de
compléter la caractérisation.
Les propriétés d’auto-organisation des peptidolipidyl-CDs dans l’eau ont été étudiées par des
mesures de tensions de surface. Les dérivés DIMEB et TRIMEB possèdent une très faible
CMC et une faible solubilité dans l’eau , alors que les dérivés -CD ne s’auto-organisent pas.
Par contre, ces nouvelles CDs amphiphiles conduisent à l’obtention de systèmes organisés de
type bicouches lipidiques mixtes DMPC / peptidolipidyl--CD. Ces phases sont stables et
bien organisées, avec une température de transition fluide-gel très bien caractérisée et
particulièrement basse. Ces derniers résultats laissent espérer l’obtention de vésicules mixtes
phospholipides / peptidolipidyl-CD.
173

L’objectif de ce travail de thèse était de synthétiser, de caractériser et d’évaluer les propriétés
physico-chimiques et biologiques de nouvelles cyclodextrines amphiphiles monosubstituées.
La préparation de composés hybrides comportant une cyclodextrine normale ou modifiée,
greffée à une molécule très hydrophobe, a pour but de combiner les propriétés d’organisation
de structures lipidiques (micelles, vésicules, liposomes,…) à la spécificité de taille de la cavité
des cyclodextrines pour y inclure de petites molécules organiques hydrophobes. La finalité de
cette étude est de concevoir de nouveaux vecteurs pour le transport de principes actifs.
Dans une première partie, nous avons utilisé un phospholipide comme ancre hydrophobe, en
raison des propriétés de polymorphisme lipidique des ces molécules (bicouches lipidiques des
membranes biologiques, liposomes). Nous avons donc préparé une série de trois
phospholipidyl-CDs, en greffant la 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidyléthanolamine
(DMPE) sur une -CD native, partiellement méthylée (DIMEB) ou complètement méthylée
(TRIMEB). Ce couplage est effectué par l’intermédiaire d’une fonction de type succinique
jouant le rôle de bras espaceur. Les produits obtenus sont respectivement nommés
-CD-Succ-DMPE, DIMEB-Succ-DMPE et TRIMEB-Succ-DMPE. Nous avons caractérisé
la structure de chacun des dérivés préparés, de façon rigoureuse et détaillée, par RMN du
proton et du carbone-13, à partir d’expériences bidimensionnelles, ainsi que par spectrométrie
de masse à basse et haute résolution.
Le comportement de ces composés en milieu aqueux a été étudié par plusieurs techniques
physico-chimiques complémentaires. L’existence d’un phénomène d’auto-organisation dans
l’eau des dérivés DIMEB-Succ-DMPE et TRIMEB-Succ-DMPE a été mis en évidence par
RMN 1 H. Des mesures de tension de surface ont permis de déterminer une concentration
micellaire critique (CMC) faible pour ces deux composés. Enfin, des expériences de
diffusions dynamique et statique de la lumière ont été employées pour caractériser la forme et
la taille de ces assemblages supramoléculaires qui semblent être de longues fibres micellaires
fluctuantes et polydisperses de grosse taille (> 200 nm).
Nous avons par ailleurs démontré, toujours à partir d’expériences RMN 1 H, que les cavités
des parties CDs des phospholipidyl-cyclodextrines méthylées conservaient leurs propriétés de
complexation dans l’eau vis-à-vis du 4-tertbutylbenzoate de sodium, connu pour s’inclure
dans la cavité de la -CD naturelle et de ses dérivés méthylés.
175

Afin de comprendre les interactions mises en jeu entre les phospholipidyl-CDs et les
membranes biologiques, nous avons tout d’abord étudié, en collaboration avec le D r J.-J.
Benattar du Service de Physique de l’Etat Condensé (DSM / DRECAM, CEA Saclay), la
structure d’une bicouche constituée uniquement de DIMEB-Succ-DMPE et de
TRIMEB-Succ-DMPE, par la méthode des films noirs de Newton. La structure de ces films,
caractérisée par réflectivité de rayons X, indique un empilement compact des chaînes
lipidiques, et de fortes interactions des CDs entre elles et avec les molécules d’eau
environnantes. Ces interactions créent un réseau d’ordre à longue distance des molécules
d’eau.
Les interactions entre les phospholipidyl-CDs et des matrices phospholipidiques préformées
ont été étudiées par RMN du phosphore-31. Les CDs amphiphiles ont des propriétés
détergentes vis-à-vis des membranes modèles de DMPC.
Enfin, nous avons voulu mettre en œuvre une application biologique en étudiant les capacités
de la DIMEB-Succ-DMPE à passer à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE). Il a été
prouvé que ces molécules traversent effectivement les membranes hermétiques des cellules
endothéliales de la BHE sans les détruire (pour une concentration de 10 µmol.L -1 ).
Toutefois, les inconvénients liés à la difficulté de synthèse des phospholipidyl-CDs et à la
fragilité de ces produits, nous ont conduits à préparer une nouvelle famille de CDs
amphiphiles : les peptidolipidyl-CDs, dont la structure mime les caractéristiques structurales
des phospholipidyl-CDs tout en s’affranchissant des problèmes de réactivité de couplage et de
stabilité chimique des phospholipides.
Les peptidolipidyl-CDs ont été synthétisées en greffant sur une cyclodextrine munie d’un bras
espaceur, un acide aminé naturel bifonctionnalisé par deux chaînes lipidiques. Six composés
différents ont été obtenus en faisant varier la nature de la cyclodextrine (-CD, DIMEB,
TRIMEB), la nature de l’acide aminé (acide aspartique, acide glutamique) et la longueur des
chaînes lipidiques (deux chaînes de même longueur en C12, deux chaînes de longueurs
différentes, l’une en C12, l’autre en C16). Nous leur avons attribués les codifications suivantes :
-CD-Succ-L-Asp(C12)-C12, -CD-Succ-L-Glu(C12)-C12, DIMEB-Succ-L-Asp(C12)-C12,
DIMEB-Succ-L-Glu(C12)-C12, TRIMEB-Succ-L-Asp(C12)-C12 et -CD-Succ-L-Asp(C16)-C12.
Ces molécules ne sont pratiquement pas solubles dans l’eau, mais les dérivés méthylés
possèdent une CMC très faible.
176

Par contre, les peptidolipidyl-CDs ont des propriétés d’organisation étonnantes dans les
matrices phospholipidiques de DMPC. La -CD-Succ-L-Asp(C12)-C12 et la -CD-Succ-L-
Glu(C12)-C12 s’insèrent dans les membranes modèles de DMPC et forment dans des
proportions peptidolipidyl-CD / DMPC 20/80 (m/m), une phase mixte unique de type
bicouche lipidique. Cette phase a été parfaitement caractérisée par RMN du deutérium pour le
système -CD-Succ-L-Asp(C12)-C12 / DMPC, en collaboration avec le D r M. Roux, Chargé de
Recherches CNRS, URA CNRS 2096, Section de Biophysique des Protéines et des
Membranes (DBCM / DSV, CEA Saclay). Celle-ci est constituée de quatre à cinq molécules
de DMPC pour une molécule de -CD-Succ-L-Asp(C12)-C12 et possède une température de
transition gel-fluide franche à 12 °C. Les chaînes lipidiques ne désorganisent pas du tout la
membrane de la phase, à la différence des systèmes Chol--CD / DMPC. Elles interagissent
au contraire parfaitement avec les chaînes de DMPC.
La structure générale des cyclodextrines amphiphiles que nous avons synthétisées peut-être
schématisée de la manière suivante (figure 99) :
CD espaceur
-CD
DIMEB
TRIMEB
connecteur
succinique
177
Ancre
hydrophobe
DMPE
peptidolipidyls
Figure 99 : Structure générale des cyclodextrines amphiphiles
En faisant varier tous les critères, beaucoup de composés peuvent être synthétisés (taille de la
CD, fonctionnalisation ou non des hydroxyles libres de la CD, longueur du bras espaceur,
longueur des chaînes lipidiques, une chaîne ou deux, saturées ou insaturées…). A ce stade,
neuf composés ont été obtenus et entièrement caractérisés. Ceci est certes insuffisant pour
effectuer une approche rationnelle de la relation entre la structure et les propriétés
d’organisation. Toutefois, certaines hypothèses peuvent être avancées :
La présence de la -CD comme tête polaire conduit à des composés insolubles en
milieu aqueux mais qui s’incorporent dans des systèmes organisés de type bicouche

phospholipidique. Les propriétés de la phase mixte obtenue semblent dépendre de la
nature de l’ancre hydrophobe (par exemple, la phase mixte
peptidolipidyl--CD / DMPC a des proportions différentes et un degré d’organisation
plus important que la phase mixte cholestéryl-CD / DMPC).
La méthylation partielle ou totale de la CD conduit à des composés amphiphiles
solubles en milieu aqueux, présentant une CMC relativement basse. La solubilité, la
valeur de la CMC et la forme des objets obtenus semble dépendre de l’ancre
hydrophobe (les dérivés cholestéryl forment des micelles, les dérivés phospholipidyl
des fibres micellaires et les dérivés peptidolipidyl des agrégats non caractérisés). Les
capacités d’inclusion sont conservées, et comme pour les CDs seules, les dérivés
DIMEB forment les complexes les plus forts.
A partir des composés obtenus, deux applications potentielles se sont dégagées :
Grâce à une collaboration entre le Laboratoire Mixte Institut Pasteur-Université
d’Artois (Faculté Jean Perrin, LENS) dirigé par le P r Monflier, le laboratoire du
D r Créminon, du Service de Pharmacologie et d’Immunologie (DRM / DSV, CEA
Saclay) dirigé par le D r Jacques Grassi et nos laboratoires, une méthode d’évaluation
du passage de la BHE “in vitro” suivi par dosage immunoenzymatique de nos CDs
amphiphiles a pu être mise au point. Les premiers résultats montrent qu’un passage
passif et sans cytotoxicité de la DIMEB-Succ-DMPE est possible. Ceci est un premier
résultat certes encourageant mais qui doit être confirmé par des études beaucoup plus
approfondies impliquant l’étude des CDs commerciales (et en particulier de la DIMEB
seule), d’autres CDs amphiphiles et enfin de complexes d’inclusion dont la molécule
invitée ne franchit pas seule la BHE.
La formation de liposomes mixtes phospholipides / peptidolipidyl-CDs stables avec
les dérivés de la -CD permet d’envisager par la suite de former des vésicules mixtes
stables. Les propriétés d’inclusion de ces nouveaux objets supramoléculaires
pourraient être testés par des techniques de diffusion par RMN. Nous obtiendrions
alors de nouveaux systèmes de vectorisation très performants pour le transport de
principes actifs.
178

I. Matériels et méthodes
I.1. Produits chimiques et solvants
La majorité des réactifs et des solvants proviennent de chez SIGMA-ALDRICH SARL (Saint
Quentin Fallavier, France) et FLUKA (division de SIGMA-ALDRICH SARL, Saint Quentin
Fallavier, France), et ont été utilisés sans traitements spécifiques. La -cyclodextrine provient
de chez Roquette frères SA (Lestrem, France). Toutes les cyclodextrines naturelles ou
modifiées sont lyophilisées avant chaque réaction, lorsque celles-ci sont hydrosolubles. Le
chlorure de toluène para-sulfonyle (TsCl) est recristallisé dans l’éther de pétrole. L’azoture de
lithium provient de chez ACROS ORGANICS (Noisy-le-Grand, France) et est vendu sous
forme d’une solution aqueuse à 20 % (m/v). Les phospholipides (DMPE et DMPC)
proviennent de chez AVENTI POLAR LIPIDS (Alabaster, AL, USA) et de chez FLUKA. Les
acides aminés utilisés pour la synthèse des peptidolipidyl-cyclodextrines proviennent
respectivement de chez FLUKA pour l’acide L-aspartique, de chez MERCK Eurolab
(Fontenay-sous-Bois, France) pour l’acide L-Glutamique et de chez BACHEM Biochimie
SARL (Voisins-le-Bretonneux, France) dans le cas du FMOC-L-Asp(OtBu)-OH.
Tous les solvants anhydres sont achetés chez SIGMA-ALDRICH et FLUKA et utilisés tels
quels, excepté pour le chloroforme, qui est séché sur pentoxyde de di-phosphore avant d’être
distillé.
I.2. Chromatographie
La Chromatographie sur Couche Mince (CCM) est réalisée sur des plaques d’aluminium
5 7,5 cm recouvertes de gel de silice 60 F254 (MERCK). Les composés sont révélés sous
lumière UV ( = 254 nm), puis par pulvérisation d’une solution aqueuse d’acide sulfurique à
10 % suivie d’une étape de chauffage à 150 °C pour tous les dérivés de cyclodextrines, ou par
aspersion d’une solution à 0,2 % de ninhydrine dans l’éthanol suivi d’une étape de chauffage
à 150°C pour les composés possédant une fonction amine primaire.
Les séparations chromatographiques flash sont effectuées sur gel de silice 60 FLUKA (220 -
440 mesh ASTM). Les chromatographies sur colonne échangeuse d’ions sont réalisées avec
180

une résine échangeuse de cations fortement acide MERCK (Lewatit ® SP1080, 60 – 150 mesh
ASTM), en utilisant 140 cm 3 de résine pour 1,5 g de produit à purifier.
L’analyse et la purification de certaines cyclodextrines modifiées sont effectuées par
Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP) sur un appareil Waters DELTA PREP
3000, en utilisant un détecteur évaporatif à diffusion de lumière SEDEX 55 203 . Les colonnes
CLHP employées sont une colonne µPorasil WATERS (10µm, 125 Å) en phase normale et
une colonne µBondapak C18 WATERS (10µm, 125 Å) en polarité de phase inversée.
I.3. Infra-Rouge, pouvoir rotatoire, point de fusion
Les spectres Infra-Rouge sont réalisés sur un spectromètre THERMO NICOLET Avatar 320
ESP (ATR) et sont traités grâce au logiciel EZ OMNIC.
Les pouvoirs rotatoires optiques sont déterminés à 20-25 °C au moyen d’un polarimètre
digital JASCO DIP-370, utilisant une lampe de sodium ( = 589 nm).
Les points de fusion sont réalisés sur un banc chauffant de KOFLER. Les substances
d’étalonnages proviennent de chez MERCK Eurolab.
I.4. Spectrométrie de Masse
Préparation des échantillons
Les produits à analyser sont dissous (0,01 mg.mL -1 ) dans un mélange méthanol/eau
50/50 (v/v) ou acétonitrile/eau 50/50 (v/v) et les solutions sont directement introduites
(5µL.mn -1 ) dans la source électrospray par l’intermédiaire d’une pompe à seringue (Harvard
Apparatus, Les Ulis, France).
Appareillage
Les spectres de masse sont réalisés sur un appareil Waters-Micromass (Manchester, U.K.)
Q-TOF équipé d’une source d’ion électrospray assistée pneumatiquement (Z-Spray). L’azote
est utilisé comme gaz de désolvatation et de nébulisation avec un débit de 250 et 50 L/h,
respectivement. Les températures de la source et du gaz de désolvatation sont respectivement
fixées à 80 et 150 °C. La tension du capillaire est de ± 3,5 kV et la tension du cône de
± 180 V (± ESI). Pour les expériences de dissociation induite par collision (CID : Collision
181

Induced Dissociation), l’argon est utilisé comme de gaz de collision, à une pression de
l’analyseur indiqué à 5 × 10 -5 Torr et une énergie de collision réglée à 90 V.
Les mesures de masse exacte sont effectuées sur un appareil Waters-Micromass (Manchester,
U.K.) LCT, équipé d’une source d’ion électrospray assistée pneumatiquement (Z-spray), et
muni d’un nébuliseur additionnel (Lockspray) pour le composé de référence (NaI). L’azote est
utilisé comme gaz de désolvatation et de nébulisation avec un débit de 500 et 20 L/h,
respectivement. Les températures de la source et du gaz de désolvatation sont respectivement
fixées à 80 et 120 °C. La tension du capillaire est de ± 3,0 kV et la tension du cône de
± 100 V (± ESI).
Les spectres sont accumulés à une vitesse de 3 secondes par scan pour une gamme de masse
comprise entre 100 et 3500 uma. La résolution utilisée est de 9000 FWHM pour le Q-TOF et
5000 FWHM pour le LCT. L’acquisition des données et leur traitement sont réalisés avec le
programme MassLynx V3.5.
I.5. Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)
I.5.1. RMN 1 H et 13 C
Les expériences RMN du proton et du carbone sont enregistrées respectivement à la fréquence
de 500,13 MHz et 125,77 MHz sur un appareil BRUKER DRX 500 équipé d’une sonde
Broad Bande Inverse (bbi) 3 axes 5 mm. Les déplacements chimiques sont donnés par rapport
à une référence externe, le tetraméthylsilane ( = 0 ppm), et les calibrations internes sont
effectuées à l'aide du signal résiduel de solvant, avec une éventuelle correction pour le signal
de l’eau en fonction de la température. Les solvants deutériés employés (D2O, DMSO-d6,
CDCl3, Pyr-d5) proviennent de chez Eurisotop (Gif sur Yvette, FRANCE). Les mesures sont
effectuées à l’aide d’un contrôle rigoureux de la température (+/- 0.1 K) à 298 K sauf
indication contraire. Les valeurs de pulses 90° sont d’environ 11 µs pour 1 H (atténuation
0 dB), et d’environ 20 µs pour le 13 C (atténuation 2 dB).
Les spectres monodimensionnels sont acquis sur 16 K points, et transformés sur 32 K points
(zero-filling). Un éventuel traitement à l’aide d’une fonction exponentielle (1

Les spectres bidimensionnels sont acquis sur 2048 points en F2 avec 256 incréments de temps
en F1, le temps de recyclage pour chaque scan étant d’environ 1,5 sec. Les expériences
phasées sont acquises en mode TPPI, et transformées en matrice de 1K x 1K points (matrice
réels-réels). Les spectres sont traités par une fonction d’apodisation en sinus décalé de /2
dans les deux dimensions, avec une correction de la ligne de base.
Tous les spectres sont traités à l’aide du logiciel UXNMR (Bruker Analytische Messtechnik)
sur la station de travail INDY (Silicon Graphics) ou sur PC.
I.5.2. RMN 31 P
Les expériences RMN du phosphore sont enregistrées à la fréquence de 81,0 MHz sur un
spectromètre AC200. Dans tous les cas, les échantillons sont préparés dans l’eau et les
mesures sont effectuées à l’aide d’un contrôle rigoureux de la température à 298 K ou 303 K
sauf indication contraire.
I.5.3. RMN 2 H
L’eau appauvrie en deutérium provient de chez Eurisotop (Gif sur Yvette, FRANCE). Les
spectres RMN du deutérium sont enregistrées à la fréquence de 46,0 MHz sur un spectromètre
BRUKER DMX 300 équipé d’une sonde conçue spécialement pour les expériences RMN 2 H
à l’état solide (Morris Instrument Inc., Gloucester, Ontario, Canada). Les spectres sont acquis
entre -12°C et 37°C, sur 4096 points (DW = 2µs), le temps de recyclage pour chaque scan
étant d’environ 200 ms.
Une séquence d’écho quadrupolaire est utilisée avec une longueur de pulse de 3 µs et un
intervalle de temps de 40 µs entre les pulses. La phase est ajustée pour n’obtenir plus aucun
signal dans le canal imaginaire, suivi de la transformation de Fourier de l’écho. Quand cela
est nécessaire, la phase de l’écho est ajustée par une modification de la valeur de 2 par une
fraction de la période d’échantillonage DW.
Préparation des échantillons
Les membranes de lipides purs ou de mélanges lipides / CDs amphiphiles sont obtenues en
mélangeant des solutions chloroformiques de DMPC et méthanoliques des glycoconjugués
dans les proportions requises. La solution mixte est alors concentrée à sec, séchée sous vide
183

poussé pendant 12 h. Le film obtenu est dispersé dans 100 à 300 µL d’eau appauvrie en
deutérium ajustés à pH = 8,0 et fortement agités pour obtenir des suspensions à la
concentration en lipides d’environ 200 mM.
I.6. Mesures de tensions de surface
Les tensions de surface ( sont mesurées à 20°C pour chacune des solutions, obtenues par
dilution d’une solution mère S0 dans la gamme S0/2, S0/4, S0/8, S0/16, S0/32, S0/64 et S0/128,
et après avoir atteint les équilibres thermique et surfacique (plus de 12 h.). Les mesures sont
réalisées avec un tensiomètre TD 2000 Prolabo, en utilisant la méthode de Wilhelmy. Les
valeurs de CMC sont déterminées à partir des graphiques f(Log C), dans lesquels C
représente la concentration molaire du composé étudié.
I.7. Diffusion de lumière
Les expériences de diffusions statique et dynamique de la lumière sont effectuées sur un
goniomètre AMTEC 2000 pourvu d’un laser à argon ionisé comme source lumineuse (Spectra
Physics 2016) dont on utilise la longueur d’onde 514,5 nm. Le domaine de vecteur de
diffusion q (Å -1 ) = 4n/ sin(/2) (n étant l’indice de réfraction du milieu dans lequel les
particules sont suspendues, la longueur d’onde du rayon incident et l’angle de diffusion)
couvert est 5,6×10 -4 Å -1 < q < 2,7×10 -3 Å -1 . Les échantillons sont préparés dans l’eau
(n = 1,33) et thermostatés à 25°C. La fonction de corrélation et les mesures d’intensité de
lumière sont obtenues et traitées à partir d’un corrélateur BI30 et d’un logiciel Brookhaven
Instrument.
I.8. Expériences de réflectivité de rayons X
Les films noirs verticaux macroscopiques (35 mm × 3 mm) sont obtenus en utilisant un cadre
rectangulaire à l’intérieur d’une boite scellée pour maintenir la saturation en vapeur d’eau.
Les mesures de réflectivité de rayons X sont effectuées sur un diffractomètre à haute
résolution (Micro-Contrôle Optix), en utilisant une anticathode de cuivre comme source de
rayons X ( = 1,5405 Å, (raie CuK1)).
184

I.9. Dosages immuno-enzymatiques
I.9.1. Dosages par compétition: protocoles opératoires standards
Les plaques de microtitration (96 puits, plaque MAXISORB, 12x8 puits) ont été
préalablement sensibilisées par un anticorps monoclonal de souris dirigé contre les
immunoglobulines de lapin, puis saturées avec du tampon EIA. Avant utilisation, les plaques
sont lavées avec une solution de Tween 20 (0.05 %) dans un tampon phosphate (0.01 M, pH
7.4). Dans chaque puits, on distribue alors 50 µL de traceur enzymatique, 50 µL de sérum
polyclonal de lapin, et 50 µL d’échantillon ou d’étalon cyclodextrine (toutes les dilutions sont
réalisées en tampon EIA). Le traceur est utilisé à une concentration de 5 unités Ellman (pour
définition, voir Grassi et coll 254 ). La dilution à laquelle est employé le sérum de lapin a été
préalablement estimée en effectuant une série de dilution de l’anti-sérum.
Après 18 h de réaction à 4 °C, les plaques sont lavées (5 lavages avec avec une solution de
Tween 20 (0.05 %) dans un tampon phosphate (0.01 M, pH 7.4)). On distribue alors dans
chaque puits 200 µL de réactif d'Ellman. Après une heure de réaction enzymatique (à l'abri de
la lumière et sous agitation douce), l'absorbance de chaque puits est mesurée à 414 nm.
Pour chaque plaque, 4 puits sont reservés à la mesure de l'absorbance maximale (B0, réalisé
en remplaçant le volume destiné à l’échantillon ou à la solution étalon par 50 µL de tampon
EIA), et 2 puits sont destinés à la mesure de la liaison non-spécifique du traceur sur la phase
solide (le volume destiné à l’échantillon ou à la solution étalon et le volume de sérum
polyclonal étant alors remplacées par 100 µL de tampon EIA).
Chaque point de mesure est réalisé en double, et la mesure du B0 en quatre exemplaires.
Les résultats sont exprimés en (B/B0)x100, en fonction de la dose de cyclodextrines
introduites (échelle semi-logarithmique, voir courbe au chapitre des rappels d’immunologie).
I.9.2. Tampons
Tampon Ringer-HEPES :
Pour 1L de tampon :
NaCl : 8,8g ; KCl : 0,387g ; CaCl2 : 0,244 g ; MgCl2, 6 H2O : 0,0406 g ; NaHCO3 : 0,504 g ;
HEPES : 1,19 g ; glucose : 0,504 g.
Dissoudre dans EPPI, ajuster le pH à 7,4, ajuster le volume en fiole jaugée puis filtrer.
185

Réactif d'Ellman pour le dosage par compétition:
Tampon phosphate 10 -2 M (pH 7,4), iodure d'acétylthiocholine (76 mM), 5,5'-dithiobis-(2nitrobenzoique
acide) (DTNB, 250 µM), NaCl (1,45 M).
Tampon EIA (pH 7.4):
[K2HPO4] = 0,08 M, [KH2PO4] = 0,02 M, [NaCl] = 0,15 M, [BSA] = 145 µM,
[NaN3] = 1,5 mM.
186

II. Synthèses
6 I -(O-p-tolylsulphonyl)-cyclomaltoheptaose (2)
S a
O
O b c'
b
c
d
e
'
HO
O
O
OH
O
2
4
6
5
O
HO
3
2
OH
1
O
Dans un erlenmeyer de 1 L, 70,16 g (61,8 mmol ; 1 éq.) de -CD 1, préalablement séchée
sous vide, sont mis en suspension dans 525 mL d’eau sous forte agitation (Ultraturax,
8000 tours/min). Le pH de la solution est amené à 11-12 par ajout de 24,5 mL de soude
8 N (la -CD se solubilise). Le milieu réactionnel est ensuite refroidi à 0°C dans un bain de
glace, puis 14,12 g (74,1 mmol ; 1,2 éq.) de chlorure de p-toluènesulfonyle (fraîchement
recristallisé dans l’éther de pétrole), dissous dans 35 mL d’acétonitrile, sont additionnés
goutte à goutte (durée d’addition : 10 min). La solution obtenue est immédiatement acidifiée
en ajoutant 25 mL d’acide chlorhydrique 6 N (pH ~ 1-2) : il se forme un précipité abondant.
L’erlenmeyer est laissé à 4°C durant 12 h. Le précipité est alors filtré puis solubilisé dans
150 mL d’eau bouillante (recristallisation à 4°C pendant 24 h). Le précipité est filtré, lavé à
l’eau, puis à l’acétone, et enfin séché 24 h à l’étuve à vide. On obtient 14,99 g du composé 2,
sous forme d’une fine poudre blanche.
Composé 2 :
Formule brute : C49H76O37S, M = 1289,17 g.mol -1
Rendement : 14,99 g (11,6 mmol ; 31 %)
CCM : Rf 2 = 0,4 (NH4OH 6% / EtOH / BuOH 5 / 5 / 4 (v/v/v) ; Rf 1 = 0,2)
HPLC : k’ 2 = 3,3 (µBondapak C18 ; Gradient linéaire de 10 à 100 % de CH3CN dans H2O
en 30 min.)
187
OH
6

p.f. 179 °C (lente déc.)
ESI-MS +: m/z mesuré à 1290,2 pour [M+H] + , calculé à 1290,2 pour C49H77O37S
RMN 1 H (dmso-d6, 500,13 MHz) (ppm) 7,75 (d, 2H, H-arom. b/b’) ; 7,42 (d, 2H, H-
arom. c/c’) ; 5,6-5,9 (14 OH, OH-2, OH-3) ; 4,81 – 4,86 (m, 6H, H-1 II-VII CD) ; 4,76 (d, 1H, H-
1 I CD) ; 4,33 (d, 1H, H-6 I CD) ; 4,18 (dd, 1H, H-6’ I CD) ; 3,4 – 3,7 (m, 18H, H-5 I-VII CD / H-6 II-VII CD
/ H-6’ II-VII CD / H-3 I-VII CD) ; 3,2 – 3,4 (m, 14H, H-2 I-VII CD / H-4 I-VII CD) ; 2,42 (s, 3H, CeH3)
Les données analytiques sont en accord avec la littérature 105 :
6 I -azido-6 I -désoxy-cyclomaltoheptaose (3)
HO
N 3
O
OH
O
3
4
6
5
O
HO
3
2
OH
1
O
Dans un ballon de 1 L, 7,16 g (5,55 mmol ; 1 éq.) du composé 2 sont mis en suspension dans
605 mL d’eau sous agitation. 13,6 mL (55,5 mmol ; 10 éq.) d’une solution aqueuse d’azoture
de lithium à 20 % (m/v) sont ajoutés et le tout est porté à reflux, sous agitation, durant 4 h
(Tbain = 110°C). Le milieu réactionnel est alors maintenu 15 h sous agitation douce et à
température ambiante. Puis, après filtration des insolubles, la solution est concentrée à
l’évaporateur rotatif (40°C), jusqu’à obtenir un volume d’environ 10 mL. Le résidu huileux
est ensuite précipité dans 200 mL d’éthanol sous agitation. Le mélange est porté à ébullition
puis filtré à chaud (élimination de l’azoture de lithium en excès). Le solide obtenu est lavé
avec de l’éthanol bouillant propre, puis avec de l’acétone et séché à l’étuve à vide. On isole
5,96 g d’une fine poudre blanche, correspondant au composé 3, et à de la -CD régénérée
pendant la réaction (hydrolyse du tosylate 2). Une analyse par CLHP à polarité de phase
inversée (H2O / CH3CN 85 / 15 (v/v)) permet d’estimer que ce mélange contient ~ 35 % de -
CD, qui sera éliminée ultérieurement.
188
OH
6

Composé 3 :
Formule brute : C42H69N3O34, M = 1160,01 g.mol -1
Rendement estimé : 5,96 g 65 % = 3,87 g (3,34 mmol ; 60 %)
CCM : Rf 3 = 0,3 (NH4OH 6% / EtOH / BuOH 5 / 5 / 4 (v/v/v) ; Rf 2 = 0,4)
HPLC : k’ 1 (-CD) = 0,2 ; k’ 3 = 0,9 (µBondapak C18 ; H2O / CH3CN 85 / 15 (v/v) en
15 min.)
p.f. 160°C (déc.)
ESI-MS + : m/z mesuré à 1166,5 pour [M+Li] + , calculé à 1166,4 pour C42H69N3O34Li
RMN 1 H (D2O, 500,13 MHz) (ppm) 5,10 (d, H-1CD) ; 3,99 (t, H-3CD) ; 3,86 – 3,97 (m, H-
5CD / H-6CD / H-6’CD) ; 3,68 (dd, H-2CD) ; 3,61 (d, H-4CD)
6 I -amino-6 I -désoxy-cyclomaltoheptaose (4)
HO
NH2
O
OH
O
4
6
4 O
5
HO 2
3
OH
1
O
Dans un ballon de 500 mL, 3,03 g (2,61 mmol ; 1 éq.) du composé 3 sont dissous dans
200 mL de DMF sous agitation. Une solution de 2,74 g (10,4 mmol ; 4 éq.) de
triphénylphosphine (fraîchement recristallisée dans l’éthanol bouillant) dissous dans 10 mL de
DMF est ajoutée. Après 2 h sous agitation à température ambiante, le milieu réactionnel est
refroidi à 0°C dans un bain de glace et 98,5 mL d’ammoniaque (solution à 20 % v/v) sont
lentement additionnés. La réaction est maintenue 18 h sous agitation à température ambiante.
La solution est ensuite concentrée à l’évaporateur rotatif (40°C) et le résidu huileux est repris
dans 150 mL d’eau. Le précipité blanc formé (mélange de triphénylphosphine et d’oxyde de
triphénylphosphine) est filtré et lavé (2 20 mL d’eau). Le filtrat est concentré sous vide à
40°C, puis repris dans un minimun d’eau et ajusté à pH = 4,5 par ajout de quelques gouttes
d’HCl 1 N. Cette solution est passée sur une colonne de résine échangeuse d'ions
189
OH
6

(V = 140 cm 3 ), remplie de résine anionique LEWATIT 1080 (MERCK), préalablement
régénérée par trois cycles de lavages successifs alternant ammoniaque 10 %, eau, et HCl
0,1 M. La mono-amine 4 est fortement retenue sur la colonne, tandis que la -CD présente est
éluée avec de l'eau (5 volumes de colonne). Le produit 4 est à son tour élué avec une solution
d'ammoniaque à 10 % (3 volumes de colonne). L’éluat basique est évaporé à sec sous vide
(40°C), repris dans un minimum d’eau puis lyophilisé. On isole ainsi 1,68 g du composé 4,
sous forme d’une poudre blanche.
composé 4 :
Formule brute : C42H71NO34, M = 1134,01 g.mol -1
Rendement estimé : 1,68 g (1,48 mmol ; 87 %)
CCM : Rf 4 = 0,2 (NH4OH 6% / EtOH / BuOH 5 / 5 / 4 (v/v/v) ; Rf 3 = 0,3)
p.f. 160°C (déc.)
IR : absence de bande (N3)
ESI-MS + : m/z mesuré à 1134,5 [M+H] + , calculé à 1134,4 pour C42H72NO34
RMN 1 H (D2O, 500,13 MHz) (ppm) 5,09 – 5,13 (7H, H-1CD) ; 3,86 – 4,01 (H-3CD / H-6 II-
VII
CD / H-5CD / H-6’ II-VII CD) ; 3,68 (ddl, H-4CD) ; 3,62 (tl, H-2CD) ; 3,51 (t, 1H) ; 3,19 (d, 1H,
H-6 I CD) ; 2,95 (dd, 1H, H-6’ I CD)
6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxy-cyclomaltoheptaose (5)
HO
NH
OH
O c d
a b O
O
OH
O
5
6
4 O
5
HO 2
3
OH
1
O
190
OH
6

Dans un ballon de 100 mL, 990,5 mg (0,87 mmol ; 1 éq.) du composé 4, préalablement
lyophilisés, sont dissous dans 20 mL de DMF anhydre sous agitation et sous atmosphère
inerte. 137,7 mg (1,31 mmol ; 1,5 éq.) d’anhydride succinique en solution dans 5 mL de DMF
anhydre sont alors additionnés. Le milieu réactionnel est maintenu sous agitation et sous
atmosphère inerte pendant 18 h à température ambiante. La réaction est stoppée par ajout de
100 µL d’eau puis la solution est concentrée à l’évaporateur rotatif (40°C). Le résidu huileux
est ensuite précipité dans 200 mL d’acétone sous agitation. Le solide obtenu est filtré, lavé
avec de l’acétone puis séché. Le produit est repris dans un minimum d’eau et lyophilisé, après
filtration des insolubles sur filtre Millex. On obtient 1,04 g du composé 5, sous forme d’une
poudre blanche.
Composé 5 :
Formule brute : C46H75NO37, M = 1234,09 g.mol -1
Rendement : 1,04 g (0,84 mmol, 97 %)
CCM : Rf 5 = 0,6 (DMF / BuOH / H2O 1 / 2 / 1 (v/v/v) ; Rf 4 = 0,1)
p.f. 160°C (déc.)
ESI-MS + : m/z mesuré à 1234,5 [M+H] + , calculé à 1234,4 pour C46H76NO37
RMN 1 H (Pyr-d5, 500,13 MHz) (ppm) 8,67 (t, 1H, NHCD, 3 JNH-6 I = 5,7 Hz) ; 7,4 – 7,9 (14
OH) ; 5,51 – 5,61 (6H, H-1 II-VII CD) ; 5,45 (d, 1H, H-1 I CD, 3 J1 I -2 I = 3,5 Hz) ; 4,63 – 4,78 (H-3 II-
VII
CD) ; 4,64 (H-3 I CD) ; 4,62 – 4,69 (H-6 II-VII CD) ; 4,31 – 4,57 (H-5 II-VII CD / H-6’ II-VII CD) ; 4,46
(H-5 I CD) ; 4,04 – 4,27 (H-4 II-VII CD) ; 4,19 (H-6 I CD) ; 4,12 (H-6’ I CD) ; 3,98 – 4,11 (H-2 II-VII CD) ;
3,88 (H-2 I CD) ; 3,87 (H-4 I CD) ; 2,77 – 2,94 (4H, H-b / H-c, syst. AA’B)
191

6 I -(1,2-ditétradecanoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamido)succinylamido-6 I -désoxy-
cyclomaltoheptaose (-CD-Succ-DMPE) (6)
HO
NH
NH
O c d
a b O
O
OH
O
OH
4
6
5
O
HO
3
2
OH
1
O
O
H
O
1
O
O
P
O
O-
O
1
O
6
6
Dans un ballon de 50 mL sec, 576 mg (0,47 mmol ; 1 éq.) du composé 5, préalablement
lyophilisés, sont dissous dans 15 mL de DMF anhydre sous agitation et sous atmosphère
inerte. 109 µL (0,70 mmol ; 1,5 éq.) de diisopropylcarbodiimide (DIC), puis 84,1 mg
(0,73 mmol ; 1,5 éq.) de N-hydroxysuccinimide (NHS) dissous dans 5 mL de DMF anhydre
sont successivement ajoutés. La réaction est laissée 2 h sous agitation et sous atmosphère
inerte à température ambiante. Cette solution est alors versée dans un tricol de 500 mL
surmonté d’un réfrigérant et d’un piège à CaCl2, dans lequel 358,3 mg (0,56 mmol ; 1,2 éq.)
de DMPE sont préalablement mis en solution dans 200 mL de chloroforme anhydre
(fraîchement distillé sur P2O5), en présence de 107 µL (0,76 mmol ; 1,6 éq.) de triéthylamine,
le tout placé dans un bain marie à 45 °C sous agitation et sous atmosphère inerte. L’ajout de
180 mL de DMF anhydre permet de se placer dans un milieu DMF / CHCl3 1/1 (v/v). Le
milieu réactionnel est alors maintenu 24 h à 45°C, sous agitation, et dans des conditions
anhydres. La réaction est enfin stoppée par ajout de 100 µL d’eau. La solution est alors
concentrée à l’évaporateur rotatif (40°C) jusqu’à obtenir un résidu huileux, qui est ensuite
précipité dans 200 mL d’éther sous agitation. Le précipité est récupéré par centrifugation
(10000 tours/min ; 15 min), lavé avec de l’éther et séché une nuit sous hotte. 372,3 mg de
produit brut sont ainsi isolés et sont purifiés sur CLHP à polarité de phase normale (µPorasil ;
192
14
14

A/B 10 / 90 (v/v) avec A = CH3OH et B = CHCl3 / CH3OH / NH3 20 % (80/19,5/0,5) (v/v/v)
en 15 min.). On isole 130,5 mg du composé 23 sous forme d’une poudre blanche.
Composé 6 :
Formule brute : C79H138N2O44P, M = 1850,93 g.mol -1
Rendement : 130,5 mg (0,07 mmol, 15 %)
CCM : Rf 6 = 0,2 (CHCl3 / MeOH / H2O 65 / 35 / 8 (v/v/v))
p.f. 160°C (déc.)
[]D 20 + 69 ° (c 0,26, pyridine)
ES-HRMS (haute résolution avec détection en mode négatif) : m/z mesuré à 1849,8464 [M] - ,
calculé à 1849,8360 pour C79H138N2O44P (déviation : 5,6 ppm)
RMN 1 H (Pyr-d5, 500,13 MHz) (ppm) 8,80 (tl, 1H, NHDMPE) ; 8,71 (tl, 1H, NHCD) ; 5,57
(m, 1H, H-) ; 5,47 – 5,54 (m), 5,43 (d) (6H, H-1 II-VII CD) ; 5,39 (d, 1H, H-1 I CD) ; 4,65 (H-) ;
4,56 - 4,65 (H-3 II-VII CD) ; 4,51 - 4,58 (H-6 II-VII CD) ; 4,52 (H-3 I CD) ; 4,43 (H-’) ; 4,29 - 4,44 (H-
5 II-VII CD) ; 4,36 (H-) ; 4,31 (H-5 I CD) ; 4,17 - 4,23 (H-6’ II-VII CD) ; 4,19 (H-) ; 4,16 (H-6 I CD) ;
4,05 - 4,15 (H-4 II-VII CD) ; 3,89 - 4,10 (H-2 II-VII CD) ; 3,96 (dd, 1H, H-2 I CD) ; 3,84 (H-6’ I CD) ;
3,77 (t, 1H, H-4 I CD) ; 3,57 (H-) ; 2,62 – 2,93 (ml, 4H, H-b / H-c) ; 2,27 (dt, 4H, H-2 / H-
2) ; 1,52 (m, 4H, H-3 /H-3) ; 1,07 - 1,22 (ml, 40H, H-4 à H-13 / H-4 à H-13) ; 0,73
(t, 6H, H-14 / H-14)
RMN 13 C (CDCl3, 125,77 MHz) (ppm) 173,9, 173,7, 173,5, 173,4 (4s, CO-d, CO-a,
CO-1, CO-1) ; 103,8 - 104,4 (C-1 I-VII CD) ; 85,4 (C-4 I CD) ; 83,4 – 84,0 (C-4 II-VII CD) ; 73,7 –
75,1 (C-2 I-VII CD / C-5 II-VII CD / C-3 I-VII CD) ; 72,1 (C-5 I CD) ; 71,7 (C-) ; 64,8 (C-) ; 64,5 (C-) ;
63,6 (C-) ; 61,5 - 62,1 (C-6 II-VII CD) ; 41,5 (C-) ; 41,1 (C-6 I CD) ; 34,6, 34,8 (2s, C-2, C-2) ;
32,4 (C-12 / C-12) ; 29,6 - 30,4 (C-4 à C11 / C-4 à C-11) ; 25,5, 25,6 (2s, C-3 / C-
3) ; 23,2 (C-13 / C-13) ; 14,6 (C-14 / C-14)
193

6 I -azido-6 I -désoxy-2 I -O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,6 II-VII -di-O-méthyl)cyclomaltoheptaose (7)
HO
N 3
O
OCH 3
O
7
4
6
5
O
HO
3
2
OCH
1
3
O
Dans un bicol de 250 mL sec, 4,45 g (3,84 mmol ; 1 éq.) du composé 3, préalablement séchés
à l’étuve à vide, sont dissous dans 55,7 mL de DMF anhydre sous agitation et sous
atmosphère inerte. Après avoir placé le milieu réactionnel dans un bain à 8°C, 55,7 mL de
DMSO anhydre sont introduits, puis 8,25 g (53,8 mmol ; 14 éq.) d’oxyde de baryum et 8,50 g
(26,9 mmol ; 7 éq.) d’hydroxyde de baryum octahydraté sont successivement ajoutés. On
additionne enfin 6 mL (63,0 mmol) de sulfate de méthyle, et le tout est maintenu pendant 72 h
à 8°C, sous agitation et sous atmosphère inerte. A la suspension grisâtre obtenue, sont ensuite
ajoutés lentement 27,5 mL d’ammoniaque (solution à 20 % v/v). Le mélange est alors
maintenu 3 h sous agitation et à température ambiante. Après avoir laissé décanter la
suspension 2 h à 4°C, le surnageant est isolé dans un ballon de 500 mL, concentré à
l’évaporateur rotatif (50°C) jusqu’à obtenir un résidu huileux, puis repris dans 300 mL de
dichlorométhane. Le solide résiduel de la décantation est repris avec du dichlorométhane
(3 100 mL) puis filtré. Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution
aqueuse saturée en chlorure de sodium (3 130 mL), puis à l’eau (3 130 mL), séchées sur
sulfate de sodium et concentrées à l’évaporateur rotatif (40°C) jusqu’à l’obtention d’une huile
résiduelle. Ce résidu est précipité dans 250 mL d’hexane sous agitation. Le précipité est filtré,
lavé avec de l’hexane et séché à l’étuve à vide. On isole 3,59 g d’une fine poudre blanche,
correspondant au composé 7, et à de la per(2,6-di-O-méthyl)cyclomaltoheptaose (DIMEB),
formée à partir de la -CD régénérée lors de la synthèse du composé 3. Ce mélange sera
194
OCH 3
purifié lors de l’étape suivante (synthèse du composé 8).
composé 7 :
Formule brute : C55H95N3O34, M = 1342,36 g.mol -1
Rendement : 3,59 g (2,67 mmol ; 70 %)
6

CCM : Rf 7 = 0,9 (CHCl3 / MeOH 9 / 1 (v/v) ; Rf 3 = 0)
p.f. 160°C (déc.)
IR : 2101 cm -1 (N3)
ESI-MS + : m/z mesuré à 1364,5 [M+Na] + , calculé à 1364,6 pour C55H95N3O34Na
RMN 1 H (CDCl3, 500,13 MHz) (ppm) 5,25 – 5,32 (H-1CD) ; 3,99 – 4,05 (H-3CD) ; 3,88 –
3,98 (H-5CD) ; 3,70 – 3,85 (H-6CD / H-6’CD) ; 3,60 (OCH3-6CD) ; 3,53 – 3,68 (H-4CD) ; 3,43
(OCH3-2CD) ; 3,40 – 3,46 (H-2CD)
6 I -amino-6 I -désoxy-2 I -O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,6 II-VII -di-O-méthyl)cyclomaltoheptaose (8)
HO
NH 2
O
OCH 3
O
8
4
6
5
O
HO
3
2
OCH
1
3
O
Dans un ballon de 500 mL, 3,51 g (2,61 mmol ; 1 éq.) du composé 7 sont dissous dans
200 mL de DMF sous agitation. Une solution de 2,74 g (10,46 mmol ; 4 éq.) de
triphénylphosphine (fraîchement recristallisée dans l’éthanol bouillant) dissous dans 10 mL de
DMF est ajoutée. Après 2 h sous agitation à température ambiante, le milieu réactionnel est
refroidi à 0°C dans un bain de glace et 99 mL d’ammoniaque (solution à 20 % v/v) sont
lentement additionnés. La réaction est maintenue 18 h sous agitation à température ambiante.
La solution est ensuite concentrée à l’évaporateur rotatif (40°C) et le résidu huileux est repris
dans 150 mL d’eau. Le précipité blanc formé (mélange de triphénylphosphine et d’oxyde de
triphénylphosphine) est filtré et lavé (2 20 mL d’eau). Le filtrat est concentré sous vide à
40°C, puis repris dans un minimun d’eau et ajusté à pH = 4,5 par ajout de quelques gouttes
d’HCl 1 N. Cette solution est passée sur une colonne de résine échangeuse d'ions
(V = 160 cm 3 ), remplie de résine anionique LEWATIT 1080 (MERCK), préalablement
régénérée par trois cycles de lavages successifs alternant ammoniaque 10 %, eau, et HCl
0,1 M. La mono-amine 8 est fortement retenue sur la colonne, tandis que la DIMEB présente
est éluée avec de l'eau (5 volumes de colonne). Le produit 8 est à son tour élué avec une
195
OCH3
6

solution d'ammoniaque à 10 % (3 volumes de colonne). L’éluat basique est évaporé à sec à
l’évaporateur rotatif (40°C) ; le résidu est repris dans un minimum d’eau puis lyophilisé. On
isole ainsi 1,68 g du composé 8, sous forme d’une poudre blanche.
Composé 8 :
Formule brute: C55H97NO34, M = 1316,36 g.mol -1
Rendement estimé : 1,68 g (1,28 mmol ; 75 %)
CCM : Rf 8 = 0,4 (CHCl3 / MeOH 9 / 1 (v/v) ; Rf 7 = 0,9)
p.f. 160 °C (déc.)
IR : absence de bande (N3)
ESI-MS + : m/z mesuré à 1316,8 [M+H] + , calculé à 1316,6 pour C55H98NO34
RMN 1 H (D2O, 500,13 MHz) (ppm) 5,24 – 5,30 (7H, H-1 I-VII CD) ; 3,92 – 3,98 (H-3 I-VII CD) ;
3,80 – 3,90 (H-5 II-VII CD) ; 3,72 – 3,80 (H-6 II-VII CD, H-6’ II-VII CD) ; 3,71 (H-5 I CD) ; 3,61 (OCH3-
6CD) ; 3,58 – 3,65 (H-4 II-VII CD) ; 3,55 (H-4 I CD) ; 3,43 (OCH3-2CD) ; 3,38 – 3,44 (H-2 I-VII CD) ;
3,06 (dd, 1H, H-6 I CD) ; 2,92 (dd, 1H, H-6’ I CD)
RMN 13 C (D2O, 125,77 MHz) (ppm) 99,3 – 99,9 (C-1 I-VII CD) ; 81,5 – 82,2 (C-4 I-VII CD / C-
2 I-VII CD) ; 72,4 – 72,7 (C-3 I-VII CD) ; 70,4 – 72,7 (C-5 I-VII CD / C-6 II-VII CD) ; 59,6 – 59,8 (OCH3-
6CD) ; 58,8 – 59,0 (OCH3-2CD) ; 41,5 (C-6 I CD)
6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxy-2 I -O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,6 II-VII -di-O-méthyl)
cyclomaltoheptaose (9)
HO
OH
O c d
a b O
NH
O
OCH 3
O
9
6
4 O
5
HO 2
3
OCH
1
3
O
196
OCH 3
6

Dans un ballon de 100 mL, 1,093 g (0,83 mmol ; 1,1 éq.) du composé 8, préalablement
lyophilisés, sont dissous dans 20 mL de DMF anhydre sous agitation et sous atmosphère
inerte. 75,7 mg (0,76 mmol ; 1 éq.) d’anhydride succinique en solution dans 5 mL de DMF
anhydre sont alors additionnés. Le milieu réactionnel est maintenu sous agitation et sous
atmosphère inerte pendant 18 h à température ambiante. La réaction est stoppée par ajout de
100 µL d’eau. Le solvant est évaporé à sec sous vide (40°C) puis le résidu est repris dans un
minimum d’eau jusqu’à dissolution complète. Cette solution acide est passée sur une colonne
de résine échangeuse d'ions (V = 10 cm 3 ), remplie de résine anionique LEWATIT 1080
(MERCK), préalablement régénérée par trois cycles de lavages successifs alternant
ammoniaque 10 %, eau, et HCl 0,1 M. Le composé 9 est élué avec de l’eau alors que la
mono-amine 8 en excès (sous forme d’un ion ammonium) est fortement retenue dans la
colonne. L’éluat est concentré à l’évaporateur rotatif (40°C) puis lyophilisé. On obtient
821 mg du composé 9 sous forme d’une poudre blanche.
Composé 9 :
Formule brute : C59H101NO37, M = 1416,44 g.mol -1
Rendement : 821 mg (0,58 mmol, 77 %)
CCM : Rf 9 = 0,2 (CHCl3 / MeOH 9 / 1 (v/v) ; Rf 8 = 0,4)
p.f. 160 °C (déc.)
ESI-MS - : m/z mesuré à 1414,5 pour [M-H] - , calculé à 1414,6 pour C59H100NO37
197

6 I -(1,2-ditétradecanoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamido)succinylamido-6 I -désoxy-2 I -
O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,6 II-VII -di-O-méthyl)cyclomaltoheptaose (DIMEB-Succ-DMPE)
(10)
HO
NH
O c d
a b O
NH
O
OCH 3
O
OCH 3
6
4 O
5
HO 2
3
OCH
1
3
O
O
H
O
1
O
O
P
O
O-
O
1
O
6
10
Dans un ballon de 50 mL sec, 340 mg (0,26 mmol ; 1 éq.) du composé 8, préalablement
lyophilisés, sont dissous dans 20 mL de DMF anhydre sous agitation et sous atmosphère
inerte. 26 mg (0,26 mmol ; 1 éq.) d’anhydride succinique en solution dans 5 mL de DMF
anhydre sont alors additionnés. Le milieu réactionnel est maintenu sous agitation et sous
atmosphère inerte pendant 18 h à température ambiante. La réaction est ensuite traitée par
ajout de 48 µL (0,31 mmol ; 1,2 éq.) de diisopropylcarbodiimide (DIC), puis de 36 mg
(0,31 mmol ; 1,2 éq.) de N-hydroxysuccinimide (NHS) dissous dans 5 mL de DMF anhydre,
et laissée 2 h sous agitation et sous atmosphère inerte à température ambiante. Cette solution
est alors versée dans un tricol de 250 mL surmonté d’un réfrigérant et d’un piège à CaCl2,
dans lequel 197 mg (0,31 mmol ; 1,2 éq.) de DMPE sont préalablement mis en solution dans
120 mL de chloroforme anhydre (fraîchement distillé sur P2O5), en présence de 48 µL
(0,34 mmol ; 1,3 éq.) de triéthylamine, le tout placé dans un bain marie à 35 °C sous agitation
et sous atmosphère inerte. Le milieu réactionnel maintenu 24 h à 35°C, sous agitation, et dans
des conditions anhydres. La réaction est enfin stoppée par ajout de 100 µL d’eau et les
solvants sont évaporés à sec sous vide primaire (40°C). Le solide résiduel est repris dans du
chloroforme et la diisopropylurée filtrée. Le filtrat est concentré à l’évaporateur rotatif (35°C)
et purifié grâce à une colonne chromatographique sur gel de silice (élution avec
198
14
14

CHCl3/CH3OH 95/5 puis 90/10 (v/v)). On isole ainsi 304 mg du composé 10 sous forme
d’une poudre blanche après lyophilisation.
Composé 10 :
Formule brute : C92H164N2O44P, M = 2033,27 g.mol -1
Rendement : 304 mg (0,15 mmol, 58 %)
CCM : Rf 10 = 0,3 (CHCl3 / MeOH 8 / 2 (v/v))
p.f. 160°C (déc.)
[]D 20 + 76 ° (c 0,26, CHCl3)
IR : 1738 cm -1 (C=O esters) ; 1651 cm -1 (C=O amides)
ES-HRMS (haute résolution avec détection en mode négatif) : m/z mesuré à 2032,0479 [M] - ,
calculé à 2032,0395 pour C92H164N2O44P (déviation : 4,1 ppm)
RMN 1 H (CDCl3, 500,13 MHz) (ppm) 7,50 (1H, NHDMPE) ; 6,71 (1H, NHCD) ; 5,19 (m,
1H, H-) ; 4,92 – 5,08 (m, H-1 I-VII CD) ; 4,38 (dd, 1H, H-) ; 4,13 (dd, 1H, H-’) ; 3,92 (H-) ;
3,88 – 3,96 (m, H-3 I-VII CD) ; 3,64 (m, OCH3-6CD ) ; 3,55 – 3,77 (m, H-5 I-VII CD / H-6 I-VII CD / H-
6’ I-VII CD) ; 3,4 – 3,5 (m, H-4 I-VII CD) ; 3,40 (m, OCH3-2CD) ; 3,23 – 3,32 (H-2 I-VII CD) ; 2,5 – 2,6
(ml, H-b / H-c) ; 2,28 (dt, 4H, H-2 /H-2) ; 1,57 (ml, 4H, H-3 /H-3) ; 1,25 (ml, 40H, H-
4 à H-13 / H-4 à H-13) ; 0,88 (t, 6H, H-14 / H-14)
RMN 13 C (CDCl3, 125,77 MHz) (ppm) 173,4, 173,1 (2s, C-d, C-a) ; 172,5 (2s, CO-1,
CO-1) ; 100,6 – 101,6 (C-1 I-VII CD) ; 82,6 – 84,2 (C-4 I-VII CD ) ; 81,4 – 82,6 (C-2 I-VII CD) ; 72,6 –
73,4 (C-3 I-VII CD) ; 70,5 – 71,2 (C-6 II-VII CD) ; 70,0 – 70,5 (C-5 I-VII CD) ; 60,1 – 60,5 (OCH3-6CD) ;
58,8 – 59,4 (OCH3-2CD) ; 34,1, 34,2 (2s, C-2, C-2) ; 31,9 (C-12 / C-12) ; 29,1 – 29,7 (C-
4 à C11 / C-4 à C-11) ; 24,9 (2s, C-3 / C-3) ; 22,7 (C-13 / C-13) ; 14,1 (C-14 / C-
14)
199

6 I -azido-6 I -désoxy-2 I ,3 I -di-O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,3 II-VII ,6 II-VII -tri-O-méthyl)
cyclomaltoheptaose (11)
H 3CO
N 3
O
OCH3 O 4
6
5
O
H3CO 3
2
OCH
1
3
O
11
Dans un bicol de 500 mL sec, 6,2 g (0,26 mol ; ~ 100 éq.) d’hydrure de sodium (enrobé sous
huile à 60 % m/m, soit 10 g d’enrobé) sont introduits. Le produit est placé sous atmosphère
inerte, lavé avec de l’hexane anhydre (2 50 mL) pour éliminer l’enrobage puis séché sous
un courant d’azote. L’hydrure de sodium est alors mis en suspension dans 130 mL de DMF
anhydre sous agitation. 3,01 g (2,60 mmol ; 1 éq.) du composé 3, préalablement séchés à
l’étuve à vide, sont dissous dans 200 mL de DMF anhydre sous agitation et sous atmosphère
inerte, puis ajoutés au milieu réactionnel. Le mélange est refroidi à 0°C dans un bain de glace
puis 30 mL (0,48 mol ; ~ 185 éq.) d’iodure de méthyle sont additionnés. La réaction est
maintenue sous agitation pendant 24 h à température ambiante. Le milieu réactionnel est
ensuite filtré et le filtrat est concentré à l’évaporateur rotatif (40°C). Le résidu huileux est
repris dans un minimum d’eau puis extrait au chloroforme (4 40 mL). La phase organique
est lavée à l’eau (2 50 mL), séchée sur sulfate de sodium, filtrée, et concentrée à
l’évaporateur rotatif (40°C). Le résidu huileux est repris dans un minimum d’eau, les
insolubles sont filtrés et la solution est lyophilisée. On isole 3,38 g d’une poudre blanche,
correspondant au composé 11, et à de la per(2,3,6-tri-O-méthyl)cyclomaltoheptaose
(TRIMEB), formée à partir de la -CD régénérée lors de la synthèse du composé 3. Ce
200
OCH 3
mélange sera purifié lors de l’étape suivante (synthèse du composé 12).
composé 11 :
Formule brute : C62H109N3O34, M = 1440,55 g.mol -1
Rendement : 3,38 g (2,35 mmol ; 90 %)
CCM : Rf 11 = 0,9 (CHCl3 / MeOH 9 / 1 (v/v) ; Rf 3 = 0)
p.f. 160°C (déc.)
6

IR : 2096 cm -1 (N3)
ES-MS + : m/z mesuré à 1462,8 [M+Na] + , calculé à 1462,7 pour C62H109N3O34Na
RMN 1 H (CDCl3, 500,13 MHz) (ppm) 5,31 – 5,36 (H-1CD) ; 3,88 – 3,96 (H-5CD / H-6CD) ;
3,69 – 3,84 (H-4CD / H-6’CD / H-3CD) ; 3,65 (OCH3-6CD) ; 3,56 (OCH3-3CD) ; 3,43 (OCH3-
2CD) ; 3,38 – 3,42 (H-2CD)
6 I -amino-6 I -désoxy-2 I ,3 I -di-O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,3 II-VII ,6 II-VII -tri-O-méthyl)
cyclomaltoheptaose (12)
H 3CO
NH2
O
OCH3 O 4
6
5
O
H3CO 3
2
OCH
1
3
O
12
Dans un ballon de 500 mL, 3,37 g (2,34 mmol ; 1 éq.) du composé 11 sont dissous dans
180 mL de DMF sous agitation. Une solution de 2,46 g (9,38 mmol ; 4 éq.) de
triphénylphosphine (fraîchement recristallisée dans l’éthanol bouillant) dissous dans 10 mL de
DMF est ajoutée. Après 2 h sous agitation à température ambiante, le milieu réactionnel est
refroidi à 0°C dans un bain de glace et 88,5 mL d’ammoniaque (solution à 20 % v/v) sont
lentement additionnés. La réaction est maintenue 18 h sous agitation à température ambiante.
La solution est ensuite concentrée à l’évaporateur rotatif (40°C) et le résidu huileux est repris
dans 140 mL d’eau. Le précipité blanc formé (mélange de triphénylphosphine et d’oxyde de
triphénylphosphine) est filtré et lavé (2 20 mL d’eau). Le filtrat est concentré sous vide à
40°C, puis repris dans un minimun d’eau et ajusté à pH = 4,5 par ajout de quelques gouttes
d’HCl 1 N. Cette solution est passée sur une colonne de résine échangeuse d'ions
(V = 160 cm 3 ), remplie de résine anionique LEWATIT 1080 (MERCK), préalablement
régénérée par trois cycles de lavages successifs alternant ammoniaque 10 %, eau, et HCl
0,1 M. La mono-amine 12 est fortement retenue sur la colonne, tandis que la TRIMEB
présente est éluée avec de l'eau (5 volumes de colonne). Le produit 12 est à son tour élué avec
une solution d'ammoniaque à 10 % (3 volumes de colonne). L’éluat basique est évaporé à sec
201
OCH 3
6

sous vide (40°C) ; le résidu est repris dans un minimum d’eau puis lyophilisé. On isole ainsi
1,85 g du composé 12, sous forme d’une poudre blanche.
composé 12 :
Formule brute : C62H111NO34, M = 1414.55 g.mol -1
Rendement estimé : 1,85 g (1,31 mmol ; 86 %)
CCM : Rf 12 = 0,7 (CHCl3 / MeOH 8 / 2 (v/v) ; Rf 11 = 1)
p.f. 160°C (déc.)
IR : Absence de la bande (N3)
ES-MS + : m/z mesuré à 1414,8 [M+H] + , calculé à 1414,7 pour C62H112NO34
RMN 1 H (D2O, 500,13 MHz) (ppm) 5,36 (d, 1H, H-1 I CD, 3 J1 I -2 I = 3,6 Hz) ; 5,30 – 5,35 (m,
6H, H-1 II-VII CD) ; 3,86 – 3,96 (m, H-5 II-VII CD) ; 3,87 – 3,92 (m, H-6 II-VII CD) ; 3,83 (H-5 I CD) ;
3,75 – 3,83 (m, H-4 II-VII CD) ; 3,76 (H-3 I CD) ; 3,69 – 3,79 (m, H-3 II-VII CD) ; 3,71 (H-4 I CD) ; 3,65
– 3,73 (m, H-6’ II-VII CD) ; 3,64 – 3,66 (m, OCH3-6CD) ; 3,55 – 3,57 (m, OCH3-3CD) ; 3,43 (H-
2 I CD) ; 3,42 – 3,43 (m, OCH3-2CD) ; 3,36 – 3,44 (m, H-2 II-VII CD) ; 3,05 (dd, 1H, H-6 I CD, 3 J6 I -5 I =
5,5 Hz, 3 J6 I -6’ I = 14,2 Hz) ; 2,96 (dd, 1H, H-6’ I CD, 3 J6’ I -5 I = 3,0 Hz, 3 J6’ I -6 I = 14,2 Hz)
RMN 13 C (D2O, 125,77 MHz) (ppm) 97,1 – 97,8 (C-1 I-VII CD) ; 80,9 – 81,6 (C-3 I-VII CD) ;
80,2 – 80,6 (C-2 I-VII CD) ; 76,7 – 78,6 (C-4 I-VII CD) ; 71,0 – 71,4 (C-6 II-VII CD) ; 70,7 – 71,7 (C-5 I-
VII
CD) ; 59,8 – 60,4 (OCH3-6CD) ; 58,3 – 59,0 (OCH3-3CD / OCH3-2CD) ; 41,6 (C-6 I CD)
6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxy-2 I ,3 I -di-O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,3 II-VII ,6 II-VII -tri-O-méthyl)
cyclomaltoheptaose (13)
H 3CO
OH
O c d
a b O
NH
O
OCH3 O 4
6
5
O
H3CO 3
2
OCH
1
3
O
13
202
OCH 3
6

Dans un ballon de 100 mL, 996,7 mg (0,70 mmol ; 1 éq.) du composé 12, préalablement
lyophilisés, sont dissous dans 20 mL de DMF anhydre sous agitation et sous atmosphère
inerte. 105,7 mg (1,06 mmol ; 1,5 éq.) d’anhydride succinique en solution dans 5 mL de DMF
anhydre sont alors additionnés. Le milieu réactionnel est maintenu 18 h sous agitation, sous
atmosphère inerte et à température ambiante. La réaction est stoppée par ajout de 100 µL
d’eau. Le solvant est éliminé à l’évaporateur rotatif (40°C) puis le résidu est repris dans
50 mL de chloroforme. Les insolubles (acide succinique) sont filtrés sur filtre Téflon (PTFE)
0,22 µm et le chloroforme est évaporé à sec sous vide (40°C). Le résidu est repris dans un
minimum d’eau et lyophilisé. On obtient 1,03 g du composé 13, sous forme d’une poudre
blanche.
Composé 13 :
Formule brute: C66H115NO37, M = 1514,62 g.mol -1
Rendement : 1,03 g (0,68 mmol, 96 %)
CCM : Rf 13 = 0,6 (CH2Cl2 / MeOH 9 / 1 (v/v))
p.f. 160°C (déc.)
IR : 1733 cm -1 (C=O acide) ; 1676 cm -1 (C=O amide)
ES-MS + : m/z mesuré à 1536,9 [M+Na] + , calculé à 1536,7 pour C66H115NO37Na
RMN 1 H (CDCl3, 500,13 MHz) (ppm) 6,40 (t, 1H, NHCD, 3 JNH-6 I = 5,6 Hz) ; 5,24, 5,22,
5,14, 5,11, 5,07, 5,07 (6d, H-1 II-VII CD, 3 J1-2 = 3,7 Hz) ; 5,08 (d, H-1 I CD, 3 J1 I -2 I = 3,7 Hz) ; 3,85 –
3,95 (m, H-6 II-VII CD) ; 3,87 (H-5 I CD) ; 3,86, 3,73, 3,78, 3,87, 3,82, 3,79 (H-5 II-VII CD) ; 3,77 (H-
6 I CD) ; 3,62 – 3,68 (m, OCH3-6CD) ; 3,63, 3,63, 3,63, 3,60, 3,62, 3,70 (H-4 II-VII CD) ; 3,55 – 3,65
(H-6’ II-VII CD) ; 3,57 (H-3 I CD) ; 3,46, 3,57, 3,56, 3,50, 3,50, 3,44 (H-3 II-VII CD) ; 3,49 – 3,53 (m,
OCH3-3CD) ; 3,38 – 3,42 (m, OCH3-2CD) ; 3,36 (H-4 I CD) ; 3,35 (H-6’ I CD) ; 3,20, 3,19, 3,18,
3,18, 3,18, 3,18 (H-2 II-VII CD) ; 3,18 (H-2 I CD) ; 2,74, 2,65, 2,49 (4H, H-b / H-c, syst. AA’B)
RMN 13 C (CDCl3, 125,77 MHz) (ppm) 174,5 (C-d) ; 172,7 (C-a) ; 98,7 – 99,9 (7s, C-1 I-
VII
CD) ; 82,0 – 82,9 (C-3 I-VII CD / C-2 I-VII CD) ; 79,6 – 81,4 (C-4 I-VII CD) ; 71,5 – 72,2 (C-6 II-VII CD) ;
70,7 – 71,9 (C-5 I-VII CD) ; 61,7 – 62,3 (OCH3-6CD) ; 58,9 – 60,1 (OCH3-3CD / OCH3-2CD) ; 42,0
(C-6 I CD) ; 31,5, 30,5 (C-b, C-c)
203

6 I -(1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethalomamido)succinylamido-6 I -deoxy-
2 I ,3 I -di-O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,3 II-VII ,6 II-VII -tri-O-méthyl)cyclomaltoheptaose
(TRIMEB-Succ-DMPE) (14) :
H 3CO
NH
O c d
a b O
NH
O
OCH3 6
4 O
O
5
H3CO 2
3
OCH
1
3
O
OCH 3
O
H
O
1
O
O
P
O
O-
O
1
6
14
Dans un ballon de 50 mL sec, 448,0 mg (0,30 mmol ; 1 éq.) du composé 13, préalablement
lyophilisés, sont dissous dans 25 mL de DMF anhydre sous agitation et sous atmosphère
inerte. 69 µL (0,45 mmol ; 1,5 éq.) de diisopropylcarbodiimide (DIC), puis 51,4 mg
(0,45 mmol ; 1,5 éq.) de N-hydroxysuccinimide (NHS) dissous dans 5 mL de DMF anhydre
sont successivement ajoutés. La réaction est laissée 2 h sous agitation et sous atmosphère
inerte à température ambiante. Cette solution est alors versée dans un tricol de 250 mL
surmonté d’un réfrigérant et d’un piège à CaCl2, dans lequel 226,3 mg (0,36 mmol ; 1,2 éq.)
de DMPE sont préalablement mis en solution dans 120 mL de chloroforme anhydre
(fraîchement distillé sur P2O5), en présence de 55 µL (0,40 mmol ; 1,3 éq.) de triéthylamine,
le tout placé dans un bain marie à 35 °C sous agitation et sous atmosphère inerte. Le milieu
réactionnel est maintenu 24 h à 35°C, sous agitation, et dans des conditions anhydres. La
réaction est enfin stoppée par ajout de 100 µL d’eau et les solvants sont évaporés à sec sous
vide primaire (40°C). Le solide résiduel est repris dans du chloroforme et la diisopropylurée
filtrée. Le filtrat est concentré à l’évaporateur rotatif (35°C) et purifié grâce à une colonne
chromatographique sur gel de silice (élution avec CHCl3/CH3OH 95/5 puis 90/10 puis 80/20
(v/v)). On isole ainsi 452,5 mg du composé 14 sous forme d’une poudre blanche après
lyophilisation.
O
204
14
14

Composé 14 :
Formule brute : C99H178N2O44P, M = 2131.46 g.mol -1
Rendement : 452,5 mg (0,21 mmol, 72 %)
CCM : Rf 14 = 0,5 (CHCl3 / MeOH 8 / 2 (v/v))
p.f. 160°C (déc.)
[]D 24 + 89,4 ° (c 0,1, CHCl3)
IR : 1738 cm -1 (C=O esters) ; 1662 cm -1 (C=O amides)
ES-HRMS (haute résolution avec détection en mode négatif) : m/z mesuré à 2130,1614 [M] - ,
calculé à 2130,1490 pour C99H178N2O44P (déviation : 5,8 ppm)
RMN 1 H (CDCl3, 500,13 MHz) (ppm) 7,29 (1H, NHDMPE) ; 6,71 (1H, NHCD) ; 5,24 (m,
1H, H-) ; 5,07 – 5,16 (m, H-1 I-VII CD, 3 J1-2 = 3,6 Hz) ; 4,36 (dd, 1H, H- 3 J- = 3,8 Hz, 3 J-’ =
12,1 Hz) ; 4,17 (dd, 1H, H-’, 3 J’- = 6,3 Hz, 3 J’- = 12,1 Hz) ; 4,12 (H-) ; 4,10 (H-) ; 3,75 –
3,90 (m, H-5 I-VII CD / H-6 I-VII CD) ; 3,5 – 3,7 (m, H-4 II-VII CD / H-6’ I-VII CD) ; 3,63 – 3,66 (m,
OCH3-6CD) ; 3,45 – 3,57 (m, H-3 I-VII CD) ; 3,50 – 3,55 (m, OCH3-3CD) ; 3,50 (H-) ; 3,43 – 3,39
(m, OCH3-2CD) ; 3,39 (1H, H-4 I CD) ; 3,17 – 3,22 (m, 7H, H-2 I-VII CD) ; 2.5 – 2.6 (m, H-b / H-
c) ; 2,32 (dt, 4H, H-2H-2 3 J2-3 = 3 J2-3 = 7,7 Hz) ; 1,61 (ml, 4H, H-3/ H-3) ; 1,26
(ml, 40H, H-4à H-13/ H-4 à H-13) ; 0,89 (t, 6H, H-14 / H-14 3 J13-14 = 3 J13-14 =
6,9 Hz)
RMN 13 C (CDCl3, 125,77 MHz) (ppm) 174.1 (C-d) ; 173,8 (CO-1, CO-1) ; 173.2 (C-
a) ; 102,0 – 99,5 (7s, C-1 I-VII CD) ; 83,0 – 80,2 (C-3 I-VII CD / C-2 I-VII CD / C-4 I-VII CD) ; 73,9, 71,7 –
70,6 (C-5 I-VII CD) ; 71,4 – 72,3 (C-6 II-VII CD) ; 70,5 (C-) ; 66,2 (C-) ; 64,9 (C-) ; 62,9 (C-) ;
62,2 – 60,4 (OCH3-6CD) ; 59,0 – 59,7 (OCH3-3CD / OCH3-2CD) ; 40,9 (C-) ; 40,2 (C-6 I CD) ;
34,7, 34,9 (2s, C-2, C-2) ; 32,6 (C-12 / C-12) ; 31,4, 31,0 (C-a, C-b) ; 30,4 – 29,8 (C-4
à C-11 / C-4 à C-11) ; 25,5 (C-3 C-3) ; 23,4 (C-13 / C-13) ; 14,8 (C-14 C-14)
205

Acide N-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-L-aspartique, Fmoc-L-Asp-OH (17) :
2
1
3
6
4
6'
5
1'
2'
7
5'
3'
4'
8
O
17
Dans un ballon de 250 mL sec, 3,03 g (22,8 mmol ; 1,2 éq.) d’acide L-aspartique 15 sont
dissous dans 54 mL (68,8 mmol ; 3,6 éq.) d’une solution aqueuse de carbonate de sodium à
13,5 % (m/v). Le milieu est refroidit dans un bain de glace à 0°C, puis une solution de 6,41 g
(19,0 mmol ;1 éq.) de N-(9-Fluorenylmethoxycarbonyloxy)succinimide (Fmoc-OSu) dissous
dans 44 mL de DMF est additionnée sous forte agitation (un précipité se forme dans le milieu
réactionnel). L’agitation est maintenue pendant 1 h à température ambiante. La mixture est
alors diluée dans 665 mL d’eau, extraite à l’éther (1 80 mL) puis à l’acétate d’éthyle
(2 60 mL). La phase aqueuse résultante est refroidie dans un bain de glace et acidifiée à
pH = 2 avec de l’acide chlorhydrique concentré (HCl 6 N). La phase aqueuse contenant le
produit précipité (sous forme d’huile) est extraite à l’acétate d’éthyle (6 60 mL). La phase
organique issue de l’extraction est lavée avec une solution aqueuse saturée en chlorure de
sodium (3 35 mL), puis à l’eau (2 35 mL), séchée sur sulfate de sodium et concentrée à
l’évaporateur rotatif (35°C) jusqu’à l’obtention d’un petit volume résiduel. Le composé 17 est
recristallisé par ajout d’éther de pétrole (environ 10 fois le volume résiduel) sous forte
agitation. Après avoir laissé décanter 2 h à 4°C, le précipité est filtré puis séché 24 h à l’étuve
à vide. On isole 6,22 g du composé 17 sous forme d’une fine poudre blanche.
Composé 17 :
Formule brute : C19H17NO6, M = 355,35 g.mol -1
Rendement : 6,22 g (17,5 mmol ; 92 %)
CCM : Rf 17 = 0,8 (AcOH 60 % / BuOH 4 / 6 (v/v) ; Rf 15 = 0,2)
p.f. 181 °C
ESI-MS + : m/z mesuré à 378,1 [M+Na] + , calculé à 378,1 pour C19H17NO6Na
O
9
206
HN
H
O
OH
OH
O

RMN 1 H (dmso-d6, 500,13 MHz) (ppm) 12,60 (sl, 2H, COOH) ; 7,89 (d, 2H, H-4 / H-4’,
3 J4-3 = 3 J4’-3’ = 7,5 Hz) ; 7,72 (d, 1H, NH) ; 7,70 (d, 2H, H-1 / H-1’, 3 J1-2 = 3 J1’-2’ = 7,5 Hz) ;
7,42 (t, 2H, H-3 / H-3’, 3 J3-2 = 3 J3-4 = 3 J3’-2’ = 3 J3’-4’ = 7,5 Hz) ; 7,33 (t, 2H, H-2 / H-2’, 3 J2-1 =
3 J2-3 = 3 J2’-1’ = 3 J2’-3’ = 7,5 Hz) ; 4,34 (m, 1H, H-) ; 4,29 (d, 2H, H-8) ; 4,22 (t, 1H, H-7) ; 2,73
(dd, 1H, H- 3 J = 5,5 Hz, 3 J-’ = 16,4 Hz) ; 2,58 (dd, 1H, H-’, 3 J’ = 8,3 Hz, 3 J-’ = 16,4
Hz)
RMN 13 C (dmso-d6, 125,77 MHz) (ppm) 172,8, 171,8 (CH-COOH, CH2-COOH) ; 155,9
(C-9) ; 143,9 (C-5 / C-5’) ; 140,8 (C-6 / C-6’) ; 127,7 (C-3 / C-3’) ; 127,2 (C-2 / C-2’) ; 125,4
(C-1 / C-1’) ; 120,2 (C-4 / C-4’) ; 65,8 (C-8) ; 50,6 (C-) ; 46,7 (C-7) ; 36,1 (C-)
Acide N-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-L-glutamique, Fmoc-L-Glu-OH (18) :
2
1
3
6
4
6'
5
1'
2'
Même protocole expérimental que pour la synthèse du composé 17.
Bilan molaire :
Acide L-glutamique 16 : 3,40 g (23,1 mmol ; 1,2 éq.)
Na2CO3 aq. 13,5 % (m/v) : 54,5 mL (69,3 mmol ; 3,6 éq.)
Fmoc-OSu : 6,50 g (19,3 mmol ; 1 éq.)
composé 18 :
Formule brute : C20H19NO6, M = 369,37 g.mol -1
Rendement : 6,07 g (16,4 mmol ; 85 %)
CCM : Rf 18 = 0,9 (AcOH 60 % / BuOH 4 / 6 (v/v) ; Rf 16 = 0,2)
7
5'
3'
4'
8
O
18
O
9
HN
207
H
O
O
OH
OH

p.f. 197 °C
ESI-MS + : m/z mesuré à 392,2 [M+Na] + , calculé à 392,1 pour C20H19NO6Na ; m/z mesuré à
408,2 [M+K] + , calculé à 408,1 pour C20H19NO6K
RMN 1 H (dmso-d6, 500,13 MHz) (ppm) 12,42 (sl, 2H, COOH) ; 7,89 (d, 2H, H-4 / H-4’,
3 J4-3 = 3 J4’-3’ = 7,5 Hz) ; 7,72 (d, 2H, H-1 / H-1’, 3 J1-2 = 3 J1’-2’ = 7,5 Hz) ; 7,67 (d, 1H, NH,
3 J-H= 8,2 Hz) ; 7,42 (t, 2H, H-3 / H-3’, 3 J3-2 = 3 J3-4 = 3 J3’-2’ = 3 J3’-4’ = 7,5 Hz) ; 7,33 (t, 2H,
H-2 / H-2’, 3 J2-1 = 3 J2-3 = 3 J2’-1’ = 3 J2’-3’ = 7,5 Hz) ; 4,28 (d, 2H, H-8) ; 4,23 (t, 1H, H-7) ; 4,00
(ddd, 1H, H- 3 J- = 5,0 Hz , 3 J-’ = 1,6 Hz, 3 J-NH = 8,2 Hz) ; 2,32 (m, 1H, ) ; 1,99 (m,
1H, H-) ; 1,79 (m, 1H, H-’)
N’,N’’-Didodecyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-L-aspartamide,
Fmoc-L-Asp(NHC12H25)-(NHC12H25) (19) :
2
1
3
6
4
6'
5
1'
2'
7
5'
3'
4'
8
O
O
9
H
HN
O
N'H
O
N''H
1
1
19
Dans un ballon de 500 mL sec, 5,03 g (14,2 mmol ; 1 éq.) du composé 17 sont dissous dans
30 mL de DMF anhydre sous agitation et sous atmosphère inerte. 6,6 mL (42,5 mmol ; 3 éq.)
de N,N’-diisopropylcarbodiimide (DIC) puis 5,74 g (42,5 mmol ; 3 éq.)
d’hydroxybenzotriazole (HOBT), en solution dans 20 mL de DMF anhydre, sont
successivement additionnés. Le réaction est alors maintenue 2 h sous agitation et sous
atmosphère inerte à température ambiante. 7,91 g (42,7 mmol ; 3 éq.) de dodécylamine, en
solution dans 100 mL de chloroforme anhydre (fraîchement distillé sur P2O5), sont enfin
ajoutés au milieu réactionnel et le tout est laissé 24 h sous agitation et sous atmosphère inerte
à température ambiante (un précipité abondant se forme rapidement). La mixture est ensuite
concentrée à l’évaporateur rotatif (40°C) et reprise dans du DMF. Le solide pâteux est filtré et
lavé, d’abord avec du DMF, puis à l’éther. Après une nuit de séchage à l’étuve à vide, on isole
6,95 g du composé 19, sous forme d’une poudre blanche fine.
208
12
12

composé 19 :
Formule brute : C43H67N3O4, M = 690,02 g.mol -1
Rendement : 6,95 g (10,1 mmol ; 71 %)
CCM : Rf 19 = 0,9 (CHCl3 / MeOH 9 / 1 (v/v) ; Rf 17 = 0)
p.f. 174 °C
RMN 1 H (CDCl3, 500,13 MHz) (ppm) 7,78 (d, 2H, H-4 / H-4’, 3 J4-3 = 3 J4’-3’ = 7,5 Hz) ;
7,61 (d, 2H, H-1 / H-1’, 3 J1-2 = 3 J1’-2’ = 7,5 Hz) ; 7,41 (tt, 2H, H-3 / H-3’, 3 J3-2 = 3 J3-4 = 3 J3’-2’ =
3
J3’-4’ = 7,5 Hz) ; 7,32 (tt, 2H, H-2 / H-2’, 3 J2-1 = 3 J2-3 = 3 J2’-1’ = 3 J2’-3’ = 7,5 Hz) ; 7,00 (tl, 1H,
N’H) ; 6,55 (d, 1H, NH) ; 5,85 (tl, 1H, N’’H) ; 4,48 (ml, 1H, H-) ; 4,42 (d, 2H, H-8, 3 J8-7 =
7,2 Hz) ; 4,23 (t, 1H, H-7, 3 J7-8 = 7,2 Hz) ; 3,23 (m, 4H, H-1/ H-1) ; 2,87 (d, 1H, H- 3 J-’
= 14,8 Hz) ; 2,52 (dd, 1H, H-’, 3 J’- = 6,8 Hz , 3 J-’ = 14,8 Hz) ; 1,49 (m, 4H, H-2/ H-2) ;
1,25 – 1,32 (m, H-3 à H-11/ H-3 à H-11) ; 0,89 (t, 6H, H-12/ H-12)
RMN 13 C (CDCl3, 125,77 MHz) (ppm) 170,9, 170,3 (-CO-N’H, -CO-N’’H) ; 156,1 (C-9) ;
143,6 (C-5 / C-5’) ; 141,2 (C-6 / C-6’) ; 127,6 (C-3 / C-3’) ; 127,0 (C-2 / C-2’) ; 125,0 (C-1 /
C-1’) ; 119,9 (C-4 / C-4’) ; 67,1 (C-8) ; 51,6 (C-) ; 47,0 (C-7) ; 39,6 (C-1/ C-1) ; 37,9 (C-
) ; 31,8 (C-10/ C-10) ; 29,1 – 29,6 (C-2, C-4 à C-9/ C-2, C-4 à C-9) ; 26,8 (C-
3/ C-3) ; 22,6 (C-11/ C-11) ; 14,0 (C-12/ C-12)
N’,N’’-Didodecyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-L-glutamide, ,
Fmoc-L-Glu(NHC12H25)-(NHC12H25) (20) :
2
1
3
6
4
6'
1'
5
2'
7
5'
3'
4'
8
O
O
9
H
HN
Même protocole expérimental que pour la synthèse du composé 19.
O
O
N'H
1
N''H
20
1
209
12
12

Bilan molaire :
Fmoc-L-Glu-OH 18 : 5,89 g (16,0 mmol ; 1 éq.)
DIC : 7,4 mL (47,8 mmol ; 3 éq.)
HOBT : 6,47 g (47,9 mmol ; 3 éq.)
Dodécylamine : 8,87 g (47,9 mmol ; 3 éq.)
Composé 20 :
Formule brute : C44H69N3O4, M = 704,05 g.mol -1
Rendement : 9,29 g (13,2 mmol ; 83 %)
CCM : Rf 20 = 0,9 (CHCl3 / MeOH 9 / 1 (v/v) ; Rf 18 = 0)
p.f. 165 °C
RMN 1 H (CDCl3, 500,13 MHz) (ppm) 7,77 (d, 2H, H-4 / H-4’, 3 J4-3 = 3 J4’-3’ = 7,5 Hz) ;
7,61 (d, 2H, H-1 / H-1’, 3 J1-2 = 3 J1’-2’ = 7,5 Hz) ; 7,41 (t, 2H, H-3 / H-3’, 3 J3-2 = 3 J3-4 = 3 J3’-2’ =
3
J3’-4’ = 7,5 Hz) ; 7,32 (t, 2H, H-2 / H-2’, 3 J2-1 = 3 J2-3 = 3 J2’-1’ = 3 J2’-3’ = 7,5 Hz) ; 6,69 (tl, 1H,
N’H) ; 6,24 (dl, 1H, NH, 3 J-H = 6,8 Hz) ; 5,81 (tl, 1H, N’’H) ; 4,37 (d, 2H, H-8, 3 J8-7 =
7,2 Hz) ; 4,22 (t, 1H, H-7, 3 J7-8 = 7,2 Hz) ; 4,17 (m, 1H, H-) ; 3,26 (q, 4H, H-1/ H-1) ;
2,40 (m, 1H, H-) ;2,31 (m, 1H, H-’) ;2,11 (m, 1H, H-) ; 2,00 (m, 1H, H-’) ; 1,51 (m, 4H,
H-2/ H-2) ; 1,23 – 1,33 (m, H-3 à H-11/ H-3 à H-11) ; 0,89 (t, 6H, H-12/ H-12)
N’,N’’-Didodecyl-L-aspartamide, H-L-Asp(NHC12H25)-(NHC12H25) (21) :
H 2N
H
O
N'H
O
N''H
1
1
21
210
12
12

Dans un ballon de 100 mL, 2,09 g (3,03 mmol ; 1 éq.) du composé 19 sont mis en solution
dans 40 mL d’une solution à 20 % (v/v) de pipéridine dans le chloroforme. La solution est
chauffée quelques minutes à 40°C. Le milieu réactionnel, d’abord hétérogène à cause de la
faible solubilité du produit de départ dans le chloroforme, devient rapidement limpide. La
solution est ensuite évaporée à sec, sous vide primaire (40°C), pour éliminer le maximum de
pipéridine (bp 101-106°C). Le résidu solide est repris dans 10 mL de chloroforme pour être
ensuite précipité dans 200 mL d’hexane sous agitation. Après avoir laissé décanter 2 h à 4°C,
le précipité est filtré puis séché. Une ultime étape de recristallisation dans le méthanol
(dissolution dans un minimum de méthanol bouillant, filtration des insolubles à chaud et
recristallisation à 4°C) permet d’isoler par filtration, et après une nuit de séchage à l’étuve à
vide, 1,20 g du composé 21 sous forme d’une poudre blanche pulvérulente.
Composé 21 :
Formule brute : C28H57N3O2, M = 467,78 g.mol -1
Rendement : 1,20 g (2,57 mmol ; 85 %)
CCM : Rf 21 = 0,4 (CHCl3 / MeOH 9 / 1 (v/v) ; Rf 19 = 0,9)
p.f. 121 °C
[]D 20 + 5 ° (c 0,27, CHCl3)
IR : 3311 cm -1 (large) (NH2) ; 1630 cm -1 (C=O amides)
ESI-MS + : m/z mesuré à 468,5 [M+H] + , calculé à 468,5 pour C28H58N3O2 ; m/z mesuré à
490,5 [M+Na] + , calculé à 490,4 pour C28H57N3O2Na.
RMN 1 H (CDCl3, 500,13 MHz) (ppm) 7,51 (t, 1H, N’H, 3 JN’H-1 = 5,7 Hz) ; 6,26 (t, 1H,
N’’H, 3 JN’’H-1 = 5,5 Hz) ; 3,65 (dd, 1H, H- 3 J = 4,5 Hz, 3 J-’ = 7,1 Hz) ; 3,21 (m, 4H, H-
1/ H-1) ; 2,61 (dd, 1H, H- 3 J = 4,5 Hz, 3 J-’ = 14,4 Hz) ; 2,54 (dd, 1H, H-’, 3 J’ =
7,1 Hz, 3 J’- = 14,4 Hz) ; 1,48 (m, 4H, H-2/ H-2) ; 1,25 – 1,32 (m, H-3 à H-11/ H-
3 à H-11) ; 0,88 (t, 6H, H-12/ H-12)
RMN 13 C (CDCl3, 125,77 MHz) (ppm) 173,7 (-CO-N’H) ; 170,8 (-CO-N’’H) ; 52,7 (C-
) ; 40,9 (C-) ; 39,4, 39,2 (C-1C-1) ; 31,8 (C-10/ C-10) ; 29,1 – 29,6 (C-2, C-
4 à C-9/ C-2, C-4 à C-9) ; 26,8 (C-3/ C-3) ; 22,6 (C-11/ C-11) ; 14,0 (C-12/
C-12)
211

N’,N’’-Didodecyl-L-glutamide, H-L-Glu(NHC12H25)-(NHC12H25) (22) :
H 2N
H
O
O
N'H
1
N''H
Même protocole expérimental que pour la synthèse du composé 21.
Bilan molaire :
Fmoc-L-Glu(NHC12H25)-(NHC12H25) 20 : 9,29 g (13,2 mmol ; 1 éq.)
composé 22 :
1
22
Formule brute : C29H59N3O2, M = 481,81 g.mol -1
Rendement : 5,01 g (10,4 mmol ; 79 %)
CCM : Rf 22 = 0,4 (CHCl3 / MeOH 9 / 1 (v/v) ; Rf 20 = 0,9)
p.f. 118 °C
[]D 20 + 45 ° (c 0,25, CHCl3)
IR : 3324 cm -1 (NH2) ; 1633 cm -1 (C=O amides)
ESI-MS + : m/z mesuré à 504,6 [M+Na] + , calculé à 504,5 pour C29H59N3O2Na
RMN 1 H (CDCl3, 500,13 MHz) (ppm) 7,37 (tl, 1H, N’H) ; 6,27 (tl, 1H, N’’H) ; 3,40 (t,
1H, H- 3 J = 6,8 Hz) ; 3,21 (m, 4H, H-1/ H-1) ; 2,30 (m, 2H, H-) ; 1,93 (m, 2H, H-) ;
1,48 (m, 4H, H-2/ H-2) ; 1,22 – 1,33 (m, H-3 à H-11/ H-3 à H-11) ; 0,87 (t, 6H, H-
12/ H-12 3 J11 = 3 J11 = 7,0 Hz)
RMN 13 C (CDCl3, 125,77 MHz) (ppm) 174,6 (-CO-N’H) ; 172,5 (-CO-N’’H) ; 54,1 (C-
) ; 39,5, 38,9 (C-1C-1) ; 33,1 (C-) ; 31,8 (C-10/ C-10) ; 31,6 (C-) ; 29,1 – 29,6 (C-
2, C-4 à C-9/ C-2, C-4 à C-9) ; 26,8 (C-3/ C-3) ; 22,5 (C-11/ C-11) ; 14,0 (C-
12/ C-12)
212
12
12

N’,N’’-Didodecyl-N-(6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxycyclomaltoheptaose)-L-aspartamide,
-CD-Succ-L-Asp(NHC12H25)-NHC12H25 (23) :
HO
NH
NH
O c d
a b O
O
OH
O
HO
O
1
H N'H
12
4
OH
O
N''H
6
O
5
2
3 1
OH
O
23
Dans un ballon de 100 mL sec, 407,7 mg (0,33 mmol ; 1 éq.) du composé 5, préalablement
lyophilisés, sont dissous dans 10 mL de DMF anhydre sous agitation et sous atmosphère
inerte. 205 µL (1,32 mmol ; 4 éq.) de DIC puis 179,3 mg (1,33 mmol ; 4 éq.) de HOBT, en
solution dans 5 mL de DMF anhydre, sont successivement additionnés. Le réaction est alors
maintenue 2 h sous agitation et sous atmosphère inerte à température ambiante. 185,3 mg
(0,40 mmol ; 1,2 éq.) du composé 21, dissous dans 15 mL de chloroforme anhydre
(fraîchement distillé sur P2O5), sont enfin ajoutés au milieu réactionnel. Après 24 h
d’agitation à température ambiante et sous atmosphère inerte, la réaction est stoppée par ajout
de 100 µL d’eau. La solution est concentrée à l’évaporateur rotatif (40°C) jusqu’à obtenir un
résidu huileux, qui est ensuite précipité dans 100 mL d’acétone sous agitation. Le précipité est
récupéré par centrifugation (10000 tours/min ; 15 min), lavé avec de l’acétone propre et séché
une nuit sous hotte. 486,8 mg de produit brut sont ainsi isolés et sont purifiés sur CLHP à
polarité de phase normale (µPorasil ; A/B 20/80 (v/v) avec A : CH3OH et
B : CHCl3/CH3OH/NH3 20 % (80/19,5/0,5) (v/v/v) en 20 min.). On isole 465,9 mg du
composé 23 sous forme d’une fine poudre blanche après lyophilisation.
composé 23 :
Formule brute : C74H130N4O38, M = 1683,85 g.mol -1
Rendement : 465,9 g (0,28 mmol ; 85 %)
CCM : Rf 23 = 0,2 (CHCl3 / MeOH / H2O 6 / 3 / 0,5 (v/v/v))
1
6
213
12

p.f. 160°C (déc.)
[]D 20 + 83 ° (c 0,26, DMF)
IR : 3000-3500 cm -1 (large) (OH) ; 1647 cm -1 (C=O amides)
ESI-HRMS (haute résolution avec détection en mode positif) : m/z mesuré à 1683,8441
[M+H] + , calculé à 1683,8441 pour C74H131N4O38 (déviation : 0 ppm) ; m/z mesuré à
1705,8169 [M+Na] + , calculé à 1705,8261 pour C74H130N4O38Na (déviation : 5,4 ppm)
RMN 1 H (pyridine-d5, 500,13 MHz) (ppm) : 9,14 (d, 1H, NH) ; 8,80 (t, 1H, NHCD) ; 8,68
(t, 1H, N’’H) ; 8,51 (t, 1H, N’H ) ; 5,38 (m, 1H, H-) ; 5,42 – 5,61 (m, 6H, H-1 II-VII CD) ; 5,43
(d, 1H, H-1 I CD) ; 4,62 – 4,75 (m, H-3 II-VII CD) ; 4,62 (H-3 I CD) ; 4,55 – 4,64 (m, H-6 II-VII CD) ;
4,31 – 4,52 (m, H-5 II-VII CD / H-6’ II-VII CD) ; 4,42 (H-5 I CD) ; 4,15 – 4,29 (m, H-4 II-VII CD) ; 4,19
(H-6 I CD) ; 4,06 (H-6’ I CD) ; 3,99 – 4,14 (m, H-2 II-VII CD) ; 3,91 (dd, 1H, H-2 I CD) ; 3,81 (t, 1H, H-
4 I CD) ; 3,36, 3,31 (2m, 4H, H-1, H-1) ; 3,12 (d, 1H, H-) ; 3,07 (d, 1H, H-’) ; 2,5 – 3,0 (m,
4H, H-b / H-c) ; 1,53, 1,46 (2m, 4H, H-2, H-2) ; 1,20, 1,18 (H-3, H-3) ; 1,13 (H-11/
H-11) ; 1,05 – 1,25 (m, H-4 à H-10/ H-4 à H-10) ; 0,75 (t, 6H, H-12/ H-12)
RMN 13 C (pyridine-d5, 125,77 MHz) (ppm) 173,6 (C-a) ; 173,4 (C-d) ; 172,3 (-CO-N’H) ;
171,5 (-CO-N’’H-) ; 104,1 – 104,6 (C-1 I-VII CD) ; 85,8 (C-4 I CD) ; 83,7 – 84,3 (C-4 II-VII CD) ; 74,1
– 75,4 (C-3 I-VII CD / C-5 II-VII CD / C-2 I-VII CD) ; 72,3 (C-5 I CD) ; 61,9 – 62,6 (C-6 II-VII CD) ; 52,0 (C-
) ; 41,6 (C-6 I CD) ; 40,3, 40,5 (C-1, C-1) ; 39,1 (C-) ; 32,6 (C-10/ C-10) ; 32,1, 32,4
(C-b, C-c) ; 30,5 (C-2/ C-2) ; 30,1 (C-4/ C-4) ; 30,1 – 30,6 (C-5 à C-9/ C-5 à C-
9) ; 27,8, 27,9 (C-3, C-3) ; 23,4 (C-11 / C-11) ; 14,8 (C-12/ C-12)
214

N’,N’’-Didodecyl-N-(6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxycyclomaltoheptaose)-L-glutamide,
-CD-Succ-L-Glu(NHC12H25)-NHC12H25 (24) :
HO
NH
NH
O c d
a b O
O
OH
O
HO
H
4
O
N'H
O
1
N''H
6
O
5
2
3 1
OH
O
Même protocole expérimental que pour la synthèse du composé 23.
Bilan molaire :
OH
6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxy-cyclomaltoheptaose 5 : 1,04 g (0,84 mmol ; 1 éq.)
DIC : 525 µL (3,39 mmol ; 4 éq.)
HOBT : 456,5 mg (3,38 mmol ; 4 éq.)
N’,N’’-Didodecyl-L-glutamide 22 : 610,2 mg (1,27 mmol ; 1,5 éq.)
composé 24 :
Formule brute : C75H132N4O38, M = 1697,88 g.mol -1
Rendement : 1,10 g (0,65 mmol ; 77 %)
CCM : Rf 24 = 0,2 (CHCl3 / MeOH / H2O 6 / 3 / 0,5 (v/v/v))
p.f. 160°C (déc.)
[]D 20 + 69 ° (c 0,27, DMF)
IR : 3000-3500 cm -1 (large) (OH) ; 1647 cm -1 (C=O amides)
24
ES-HRMS (haute résolution avec détection en mode positif) : m/z mesuré à 1697,8624
[M+H] + , calculé à 1697,8598 pour C75H133N4O38 (déviation : 1,6 ppm)
6
1
215
12
12

RMN 1 H (pyridine-d5, 500,13 MHz) (ppm) : 9,17 (d, 1H, NH) ; 8,82 (t, 1H, NHCD) ; 8,56
(t, 1H, N’H) ; 8,37 (t, 1H, N’’H ) ; 5,56 – 5,60 (m), 5,55 (d), 5,46(d) (6H, H-1 II-VII CD) ; 5,43
(d, 1H, H-1 I CD) ; 4,94 (m, 1H, H-) ; 4,62 – 4,76 (m, H-3 II-VII CD) ; 4,62 (H-3 I CD) ; 4,56 – 4,64
(m, H-6 II-VII CD) ; 4,28 – 4,53 (m, H-5 II-VII CD / H-6’ II-VII CD) ; 4,41 (H-5 I CD) ; 4,14 – 4,27
(m, H-4 II-VII CD) ; 4,19 (H-6 I CD) ; 4,06 (H-6’ I CD) ; 3,98 – 4,13 (m, H-2 II-VII CD) ; 3,92 (dd, 1H,
H-2 I CD) ; 3,80 (t, 1H, H-4 I CD) ; 3,35, 3,30 (m, 4H, H-1, H-1) ; 2,6 – 3,0 (m, H-b / H-c) ;
2,61 (m, H-/ H-’) ; 2,61 (m, H-) ; 2,34 (m, 1H, H-’) ; 1,50, 1,47 (m, 4H, H-2, H-2) ;
1,18 (H-3/ H-3) ; 1,05 – 1,25 (m, H-4 à H-11/ H-4 à H-11) ; 0,75 (t, 6H, H-12/
H-12)
RMN 13 C (pyridine-d5, 125,77 MHz) (ppm) 173,7 (C-a) ; 173,6 (C-d) ; 173,2
(-CO-N’’H) ; 172,9 (-CO-N’H) ; 104,1 – 104,6 (C-1 I-VII CD) ; 85,8 (C-4 I CD) ; 83,8 – 84,2
(C-4 II-VII CD) ; 74,1 – 75,4 (C-3 I-VII CD / C-5 II-VII CD / C-2 I-VII CD) ; 72,3 (C-5 I CD) ; 62,0 – 62,7
(C-6 II-VII CD) ; 54,4 (C-) ; 41,6 (C-6 I CD) ; 40,3 (C-1/ C-1) ; 33,8 (C-) ; 32,6 (C-10/
C-10) ; 32,1, 32,3 (C-b, C-c) ; 30,5 (C-2/ C-2) ; 30,1 (C-4/ C-4) ; 30,1 – 30,7
(C-5 à C-9/ C-5 à C-9) ; 30,0 (C-) ; 27,8, 27,9 (C-3, C-3) ; 23,4 (C-11/ C-11) ;
14,8 (C-12 / C-12)
N’,N’’-Didodecyl-N-(6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxy-2 I -O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,6 II-VII -di-O-
méthyl)cyclomaltoheptaose)-L-aspartamide, DIMEB-Succ-L-Asp(NHC12H25)-NHC12H25
(25) :
HO
O
H N'H
1
12
NH O
O c d
a
NH
b O
N''H
1
O
OCH 3
O
OCH 3
6
4 O
5
HO 2
3
OCH
1
3
O
25
6
216
12

Dans un ballon de 50 mL sec, 338,9 mg (0,24 mmol ; 1 éq.) du composé 9, préalablement
lyophilisés, sont dissous dans 10 mL de DMF anhydre sous agitation et sous atmosphère
inerte. 149 µL (0,96 mmol ; 4 éq.) de DIC puis 129,3 mg (0,96 mmol ; 4 éq.) de HOBT, en
solution dans 5 mL de DMF anhydre, sont successivement additionnés. Le réaction est alors
maintenue 2 h sous agitation et sous atmosphère inerte à température ambiante. 169,6 mg
(0,36 mmol ; 1,5 éq.) du composé 21, dissous dans 15 mL de chloroforme anhydre
(fraîchement distillé sur P2O5), sont enfin ajoutés au milieu réactionnel. Après 24 h
d’agitation à température ambiante et sous atmosphère inerte, la réaction est stoppée par ajout
de 100 µL d’eau. La solution est évaporée à sec sous vide primaire (40°C), le résidu est repris
dans 20 mL de chloroforme et les insolubles sont filtrés. Le filtrat est concentré à
l’évaporateur rotatif (30°C) et purifié grâce à une colonne chromatographique sur gel de silice
(élution avec CHCl3/CH3OH 98/2 puis 95/5 (v/v)). On isole ainsi 267,0 mg du composé 25
sous forme d’une poudre blanche après lyophilisation.
composé 25 :
Formule brute : C87H156N4O38, M = 1866,20 g.mol -1
Rendement : 267 mg (0,14 mmol ; 60 %)
p.f. 160°C (déc.)
CCM : Rf 25 = 0,3 (CHCl3 / MeOH 8 / 2 (v/v))
[]D 20 + 84 ° (c 0,25, CHCl3)
IR : 3300-3500 cm -1 (large) (OH) ; 1655 cm -1 (C=O amides)
ES-HRMS (haute résolution avec détection en mode positif) : m/z mesuré à 1866,0394
[M+H] + , calculé à 1866,0476 pour C87H157N4O38 (déviation : 4,4 ppm) ; m/z mesuré à
1888,0214 [M+Na] + , calculé à 1888,0295 pour C87H156N4O38Na (déviation : 4,3 ppm)
RMN 1 H (CDCl3, 500,13 MHz) (ppm) : 7,50 (t, 1H, N’H ou N’’H) ; 7,44 (d, 1H, NH) ;
6,27 (t, 1H, N’H ou N’’H) ; 6,11 (t, 1H, NHCD) ; 4,93 – 5,10 (m, H-1 I-VII CD / OH-3CD) ; 4,64
(m, 1H, H-) ; 3,88 – 3,96 (m, H-3 I-VII CD) ; 3,63 (m, OCH3-6CD) ; 3,55 – 3,77 (m, H-5 I-VII CD /
H-6 I-VII CD / H-6’ I-VII CD) ; 3,40 (m, OCH3-2CD) ; 3,38 – 3,50 (m, H-4 I-VII CD) ; 3,22 – 3,32 (m, H-
2 I-VII CD) ; 3,19 (m, H-1/ H-1) ; 2,88 (dd, 1H, H-) ; 2,4 – 2,7 (m, 4H, H-b / H-c) ; 2,42
217

(dd, 1H, H-’) ; 1,47 (m, H-2/ H-2) ; 1,24 – 1,31 (m, H-3 à H-11/ H-3 à H-11) ;
0,87 (t, 6H, H-12/ H-12)
RMN 13 C (CDCl3, 125,77 MHz) (ppm) 171,9, 171,8, 171,2, 170,2 (4s, -CO-NH) ; 100,8 –
101,5 (C-1 I-VII CD) ; 83,0 – 83,7, 84,9 (C-4 I-VII CD) ; 81,7 – 82,3 (C-2 I-VII CD) ; 73,0 – 73,3 (C-3 I-
VII
CD) ; 69,6 – 71,6 (C-5 I-VII CD) ; 70,6 – 71,0 (C-6 I-VII CD) ; 60,2 – 60,5 (OCH3-6CD) ; 58,9 –
59,1, 59,5 (OCH3-2CD) ; 50,0 (C-) ; 39,7 (C-1/ C-1) ; 37,4 (C-) ; 31,9 (C-10/ C-10) ;
31,1, 31,4 (C-b, C-c) ; 29,6 (C-2/ C-2) ; 29,2 – 29,7 (C-4 àC-9/ C-4 à C-9) ; 26,9
(C-3/ C-3) ; 22,6 (C-11/ C-11) ; 14,0 (C-12/ C-12)
N’,N’’-Didodecyl-N-(6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxy-2 I -O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,6 II-VII -di-O-
méthyl)cyclomaltoheptaose)-L-glutamide, DIMEB-Succ-L-Glu(NHC12H25)-NHC12H25
(26) :
HO
O
H N'H
NH
O c d
a b O
NH
O
O
OCH 3
O
OCH 3
1
N''H
6
4 O
5
HO 2
3
OCH
1
3
O
Même protocole expérimental que pour la synthèse du composé 25.
Bilan molaire :
6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxy-per(2,6-di-O-méthyl)cyclomaltoheptaose 9 : 804 mg
(0,57 mmol ; 1 éq.)
DIC : 355 µL (2,29 mmol ; 4 éq.)
HOBT : 313,4 mg (2,32 mmol ; 4 éq.)
N’,N’’-Didodecyl-L-glutamide 22 : 411,8 mg (0,855 mmol ; 1,5 éq.)
26
6
1
218
12
12

composé 26 :
Formule brute : C88H158N4O38, M = 1880,23 g.mol -1
Rendement : 672,6 g (0,36 mmol ; 63 %)
CCM : Rf 26 = 0,3 (CHCl3 / MeOH 8 / 2 (v/v))
p.f. 160°C (déc.)
[]D 20 + 98 ° (c 0,26, CHCl3)
IR : 3300-3500 cm -1 (large) (OH) ; 1655 cm -1 (C=O amides)
ES-HRMS (haute résolution avec détection en mode positif) : m/z mesuré à 1902,0529
[M+Na] + , calculé à 1902,0452 pour C88H158N4O38Na (déviation : 4,0 ppm)
RMN 1 H (CDCl3, 500,13 MHz) (ppm) : 7,29 (d, 1H, NH) ; 7,04 (tl, 1H, N’H ou N’’H) ;
6,31 (tl, 1H, NHCD) ; 6,05 (t, 1H, N’H ou N’’H) ; 4,94 – 5,06 (m, 7H, H-1 I-VII CD) ; 4,31 (m,
1H, H-) ; 3,82 – 4,01 (m, H-3 I-VII CD) ; 3,63 (m, OCH3-6CD) ; 3,55 – 3,80 (m, H-5 I-VII CD / H-6 I-
VII
CD / H-6’ I-VII CD) ; 3,39 – 3,52 (m, H-4 I-VII CD) ; 3,40 (m, OCH3-2CD) ; 3,15 – 3,33 (m, H-2 I-
VII CD) ; 3,21 (m, H-1/ H-1) ; 2,5 – 2,6 (m, 4H, H-b / H-c) ; 2,46 (m, 1H, H-) ; 2,29 (m, 1H,
H-’) ; 2,08 (m, 1H, H-) ; 1,99 (m, 1H, H-’) ; 1,49 (m, 4H, H-2/ H-2) ; 1,24 – 1,32 (m,
H-3 à H-11/ H-3 à H-11) ; 0,88 (t, 6H, H-12/ H-12)
RMN 13 C (CDCl3, 125,77 MHz) (ppm) 172,9, 172,1, 172,0, 170,9 (4s, -CO-NH) ; 100,8 –
101,5 (C-1 I-VII CD) ; 83,0 – 83,7, 85,0 (C-4 I-VII CD) ; 81,7 – 82,4 (C-2 I-VII CD) ; 73,0 – 73,4 (C-3 I-
VII
CD) ; 69,7 – 71,7 (C-5 I-VII CD) ; 70,5 – 71,4 (C-6 I-VII CD) ; 60,1 – 60,5 (OCH3-6CD) ; 58,9 –
59,2, 59,4 (OCH3-2CD) ; 52,8 (C-) ; 39,7, 39,8 (2s, C-1C-1) ; 32,9 (C-) ; 31,9 (C-10/
C-10) ; 31,4 (C-b / C-c) ; 29,4 (C-2/ C-2) ; 29,2 – 29,7 (C-4 àC-9/ C-4 à C-9) ; 29,1
(C-) ; 27,0, 26,9 (2s, C-3, C-3) ; 22,6 (C-11/ C-11) ; 14,0 (C-12/ C-12)
219

N’,N’’-Didodecyl-N-(6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxy-2 I ,3 I -di-O-méthyl-hexakis(2 II-VII ,3 II-
VII II-VII
,6 -tri-O-méthyl)cyclomaltoheptaose)-L-aspartamide,
TRIMEB-Succ-L-Asp(NHC12H25)-NHC12H25 (27) :
H 3CO
O
H N'H
1
12
NH O
O c d
a b O
N''H
NH
1
O
OCH 3
OCH3 O 4
6
5
O
H3CO 3
2
OCH
1
3
O
27
Dans un tricol de 100 mL sec, 1,01 g (0,67 mmol ; 1 éq.) du composé 13, préalablement
lyophilisés, sont dissous dans 15 mL de DMF anhydre sous agitation et sous atmosphère
inerte. 415 µL (2,68 mmol ; 4 éq.) de DIC puis 361,4 mg (2,68 mmol ; 4 éq.) de HOBT, en
solution dans 5 mL de DMF anhydre, sont successivement additionnés. Le réaction est alors
maintenue 2 h sous agitation et sous atmosphère inerte à température ambiante. 376,1 mg
(0,80 mmol ; 1,2 éq.) du composé 21, dissous dans 20 mL de chloroforme anhydre
(fraîchement distillé sur P2O5), sont enfin ajoutés au milieu réactionnel. Après 24 h
d’agitation à température ambiante et sous atmosphère inerte, la réaction est stoppée par ajout
de 100 µL d’eau. La solution est évaporée à sec sous vide primaire (40°C), le résidu est repris
dans 20 mL de chloroforme et les insolubles sont filtrés. Le filtrat est concentré à
l’évaporateur rotatif (30°C) et purifié grâce à une colonne chromatographique sur gel de silice
(élution avec CHCl3/CH3OH 99/1 puis 98/2 puis 95/5 (v/v)). On isole ainsi 605 mg du
composé 27 sous forme d’une poudre blanche après lyophilisation.
composé 27 :
Formule brute : C94H170N4O38, M = 1964,39 g.mol -1
Rendement : 605 mg (0,31 mmol ; 46 %)
CCM : Rf 27 = 0,4 (CHCl3 / MeOH 95 / 5 (v/v))
p.f. 160°C (déc.)
6
220
12

[]D 20 + 107 ° (c 0,27, CHCl3)
IR : Absence de bande (OH) ; 1651 cm -1 (C=O amides)
ES-HRMS (haute résolution avec détection en mode positif) : m/z mesuré à 1986,1432
[M+Na] + , calculé à 1986,1391 pour C94H170N4O38Na (déviation : 2,1 ppm)
RMN 1 H (CDCl3, 500,13 MHz) (ppm) : 7,56 (t, 1H, N’H ou N’’H) ; 7,45 (d, 1H, NH) ;
6,37 (t, 1H, N’H ou N’’H) ; 6,16 (t, 1H, NHCD) ; 5,08 – 5,17 (m, H-1 I-VII CD) ; 4,65 (m, H-) ;
3,70 - 3,90 (H-5 I-VII CD / H-6 I-VII CD) ; 3,4 - 3,7 (H-4 II-VII CD / H-6’ I-VII CD) ; 3,63 (m, OCH3-6CD) ;
3,42 - 3,56 (H-3 I-VII CD) ; 3,50 (m, OCH3-3CD) ; 3,38 (m, OCH3-2CD) ; 3,36 (H-4 I CD) ; 3,12 -
3,24 (H-2 I-VII CD) ; 3,18 (m, H-1/ H-1) ; 2,87 (dd, 1H, H-) ; 2,4 – 2,7 (m, 4H, H-b / H-c) ;
2,43 (dd, 1H, H-’) ; 1,47 (m, H-2/ H-2) ; 1,23 – 1,31 (m, H-3 à H-11/ H-3 à H-
11) ; 0,87 (t, 6H, H-12/ H-12)
RMN 13 C (CDCl3, 125,77 MHz) (ppm) 170,3, 171,1, 171,8, 171,9 (4s, -CO-NH) ; 98,0 –
99,2 (C-1 I-VII CD) ; 79,1 – 82,3 (C-3 I-VII CD / C-2 I-VII CD / C-4 I-VII CD) ; 70,5 – 71,5 (C-6 II-VII CD /
C-5 II-VII CD) ; 70,0 (C-5 I CD) ; 61,0 – 61,6 (OCH3-6CD) ; 58,0 – 59,5 (OCH3-2CD / OCH3-3CD) ;
49,9 (C-) ; 40,1 (C-6 I CD) ; 39,6 (C-1/ C-1) ; 37,3 (C-) ; 31,8 (C-10/ C-10) ; 31,0,
31,4 (C-b, C-c) ; 29,0 – 29,7 (C-4 àC-9/ C-4 à C-9) ; 26,8 (C-3/ C-3) ; 22,5 (C-
11/ C-11) ; 14,0 (C-12/ C-12)
N’-dodécyl-N’’-(tert-butyloxycarbonyl)-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-
L-aspartamide, Fmoc-L-Asp(O-tBu)-NHC12H25 (29) :
2
1
3
6
4
6'
5
1'
2'
7
5'
3'
4'
8
O
O
9
HN
H
O
O
N'H
C
O
1
29
Dans un ballon de 100 mL sec, 504,7 mg (1,23 mmol ; 1 éq.) de Fmoc-L-Asp(O-tBu)-OH 28
sont dissous dans 5 mL de DMF anhydre sous agitation et sous atmosphère inerte. 285 µL
221
12

(1,84 mmol ; 1,5 éq.) de N,N’-diisopropylcarbodiimide (DIC) puis 249,5 mg (1,85 mmol ;
1,5 éq.) d’hydroxybenzotriazole (HOBT) dissous dans 1 mL de DMF anhydre, sont
successivement additionnés. Le réaction est alors maintenue 2 h sous agitation et sous
atmosphère inerte à température ambiante. 344,2 mg (1,86 mmol ; 1,5 éq.) de dodécylamine,
en solution dans 20 mL de chloroforme anhydre, sont enfin ajoutés au milieu réactionnel.
Après 18 h d’agitation à température ambiante et sous atmosphère inerte, la réaction est
stoppée par ajout de 100 µL d’eau. La solution est évaporée à sec sous vide primaire (40°C),
le résidu est repris dans 20 mL de chloroforme et les insolubles sont filtrés. Le filtrat est
concentré à l’évaporateur rotatif (30°C) et purifié grâce à une colonne chromatographique sur
gel de silice (élution avec CHCl3 + AcOH (0,2 %)). L’éluat est évaporé à sec et le résidu
repris dans un minimum de MeOH. Le composé 29 est alors précipité par ajout de 50 mL
d’eau. Le solide est filtré sur verre fritté et lavé avec de l’eau. Après une nuit de séchage à
l’étuve à vide, on isole 619,4 mg du composé 29, sous forme d’une poudre blanche.
composé 29 :
Formule brute : C35H50N2O5, M = 578,79 g.mol -1
Rendement : 619,4 mg (1,07 mmol, 87 %)
CCM : Rf 29 = 0,9 (CHCl3 / MeOH 9 / 1 (v/v))
p.f. 120 °C
IR : 3349 cm -1 (large) (NH- amide) ; 1744 cm -1 (C=O ester) ; 1701 cm -1 (C=O
carbamate) ; 1646 cm -1 (C=O amide)
ESI-MS + : m/z mesuré à 601,5 [M+Na] + , calculé à 601,4 pour C35H50N2O5Na
RMN 1 H (CDCl3, 500,13 MHz) (ppm) 7,77 (d, 2H, H-4 / H-4’, 3 J4-3 = 3 J4’-3’ = 7,5 Hz) ;
7,62 (d, H-1, 3 J1-2 = 7,5 Hz) ; 7,61 (d, H-1’, 3 J1’-2’ = 7,5 Hz) ; 7,41 (t, 2H, H-3 / H-3’, 3 J3-2 =
3
J3-4 = 3 J3’-2’ = 3 J3’-4’ = 7,5 Hz) ; 7,32 (t, 2H, H-2 / H-2’, 3 J2-1 = 3 J2-3 = 3 J2’-1’ = 3 J2’-3’ = 7,5 Hz) ;
6,09 (d, 1H, NH, 3 JN- = 8,3 Hz) ; 5,62 (tl, 1H, N’H) ; 4,48 (m, 1H, H-) ; 4,40 (dd, 1H,
H-8) ; 4,32 (dd, 1H, H-8’) ; 4,23 (t, 1H, H-7) ; 3,24 (m, 2H, H-1) ; 2,87 (dd, 1H, H- 3 J-’ =
15,5 Hz, 3 J= 5,1 Hz) ; 2,71 (dd, 1H, H-’, 3 J’- = 15,5 Hz, 3 J’- = 4,3 Hz) ; 1,49 (s,
3×CH3 tBu) ; 1,47 (m, H-2) ; 1,24 – 1,32 (m, 18H, H-3 à H-11) ; 0,89 (t, 3H, H-12, 3 J12
- 11 = 6,8 Hz)
222

RMN 13 C (CHCl3, 125,77 MHz) (ppm) 170,7 (-CO-N’H) ; 170,3 (-CO-OtBu) ; 156,9
(C-10) ; 144,6, 144,5 (C-5, C-5’) ; 141,9 (C-6 / C-6’) ; 128,4 (C-3 / C-3’) ; 127,7 (C-2 / C-
2’) ; 125,9 (C-1 / C-1’) ; 120,6 (C-4 / C-4’) ; 83,0 (-C- tBu) ; 67,9 (C-8) ; 52,1 (C-) ; 47,8
(C-7) ; 40,3 (C-1) ; 38,8 (C-) ; 32,6 (C-10) ; 29,9 – 30,4C-4 à C-9) ; 30,0 (C-2) ;
28,6 (3×CH3 tBu) ; 27,6 (C-3) ; 23,4 (C-11) ; 14,8 (C-12)
N’-dodécyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-L-aspartamide,
Fmoc-L-Asp(OH)-NHC12H25 (30) :
2
1
3
6
4
6'
1'
5
2'
7
5'
3'
4'
8
O
O
9
H
HN
O
N'H
OH
O
1
30
Dans un ballon de 50 mL, 542,6 mg (0,94 mmol ; 1 éq.) du composé 29 sont dissous dans
10 mL d’une solution à 20 % (v/v) d’acide trifluoroacétique dans le dichlorométhane. Le
milieu réactionnel est maintenu 3 h sous agitation à température ambiante. La solution est
alors évaporée à sec sous vide primaire (30°C). Le résidu est repris dans un minimum
d’acétate d’éthyle et précipité par ajout de 40 mL d’éther de pétrole. Après avoir laissé
décanter 2 h à 4°C, le précipité est filtré sur verre fritté puis séché une nuit à l’étuve à vide.
On obtient 461,7 mg du composé 30 sous forme d’une poudre de couleur blanche.
composé 30 :
Formule brute : C31H42N2O5, M = 522,68 g.mol -1
Rendement : 461,7 mg (0,88 mmol, 94 %)
CCM : Rf 30 = 0,1 (CHCl3 / MeOH 9 / 1 (v/v) ; Rf 29 = 0,9)
p.f. 155 °C
223
12

IR : 3306 cm -1 (large) (NH- amide) ; 1703 cm -1 (2s) (C=O acide) et (C=O carbamate) ;
1645 cm -1 (C=O amide)
ESI-MS + : m/z mesuré à 545,5 [M+Na] + , calculé à 545,3 pour C31H42N2O5Na
RMN 1 H (DMSO-d6, 500,13 MHz) (ppm) 12,8 (sl, -COOH) ; 7,99 (d, 2H, H-4 / H-4’, 3 J4-3
= 3 J4’-3’ = 7,5 Hz) ; 7,92 (tl, 1H, N’H) ; 7,80 (d, 2H, H-1 / H-1’, 3 J1-2 = 3 J1’-2’ = 7,5 Hz) ; 7,64
(d, 1H, NH, 3 JN- = 8,3 Hz) ; 7,51 (t, 2H, H-3 / H-3’, 3 J3-2 = 3 J3-4 = 3 J3’-2’ = 3 J3’-4’ = 7,5 Hz) ;
7,42 (t, 2H, H-2 / H-2’, 3 J2-1 = 3 J2-3 = 3 J2’-1’ = 3 J2’-3’ = 7,5 Hz) ; 4,46 (dt, 1H, H- 3 J-N=
3 J’= 8,3 Hz, 3 J= 5,2 Hz) ; 4,34 (H-8) ; 4,31 (H-7) ; 3,12 (m, 2H, H-1) ; 2,67 (dd, 1H,
H- 3 J-’ = 15 Hz, 3 J= 5,2 Hz) ; 2,57 (dd, 1H, H-’, 3 J’- = 15 Hz, 3 J’- = 8,3 Hz) ; 1,45
(m, 2H, H-2) ; 1,28 – 1,36 (m, 18H, H-3 à H-11) ; 0,94 (t, 3H, H-12, 3 J12 - 11 = 6,8
Hz)
RMN 13 C (DMSO-d6, 125,77 MHz) (ppm) 173,1 (-COOH) ; 168,8 (-CO-N’H) ; 155,7
(C-10) ; 143,7 (C-5 / C-5’) ; 140,7 (C-6 / C-6’) ; 127,6 (C-3 / C-3’) ; 127,0 (C-2 / C-2’) ;
125,2 (C-1 / C-1’) ; 120,1 (C-4 / C-4’) ; 65,7 (C-8) ; 50,7 (C-) ; 46,6 (C-7) ; 38,6 (C-1) ;
37,0 (C-) ; 31,3 (C-10) ; 28,6 – 29,1 (C-2C-4 à C-9) ; 26,3 (C-3) ; 22,1 (C-11) ;
13,9 (C-12)
N’-dodécyl-N’’-hexadécyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-L-aspartamide,
Fmoc-L-Asp(NHC16H33)-NHC12H25 (31) :
2
1
3
6
4
6'
5
1'
2'
7
5'
3'
4'
8
O
O
9
H
HN
O
N'H
O
N''H
1
1
31
Dans un ballon de 50 mL sec, 396,0 mg (0,76 mmol ; 1 éq.) du composé 30 sont dissous dans
5 mL de DMF anhydre sous agitation et sous atmosphère inerte. 176 µL (1,14 mmol ; 1,5 éq.)
de N,N’-diisopropylcarbodiimide (DIC) puis 155,2 mg (1,15 mmol ; 1,5 éq.)
d’hydroxybenzotriazole (HOBT) dissous dans 1 mL de DMF anhydre, sont successivement
additionnés. Le réaction est alors maintenue 2 h sous agitation et sous atmosphère inerte à
224
12
16

température ambiante. 276,9 mg (1,15 mmol ; 1,5 éq.) d’hexadécylamine, en solution dans
20 mL de chloroforme anhydre, sont enfin ajoutés au milieu réactionnel et le tout est laissé
24 h sous agitation et sous atmosphère inerte à température ambiante (un précipité abondant
se forme rapidement). La mixture est ensuite concentrée à l’évaporateur rotatif (40°C) et
reprise dans du DMF. Le solide pâteux est filtré sur verre fritté et lavé, d’abord avec du DMF,
puis à l’éther. Après une nuit de séchage à l’étuve à vide, on isole 335,7 mg du composé 31,
sous forme d’une poudre blanche fine.
composé 31 :
Formule brute : C47H75N3O4, M = 746,13 g.mol -1
Rendement : 341,7 mg (0,46 mmol, 61 %)
CCM : Rf 31 = 0,85 (CHCl3 / MeOH 95 / 5 (v/v))
N’-dodecyl-N’’-hexadécyl-L-aspartamide, H-L-Asp(NHC16H33)-NHC16H25 (32) :
H 2N
H
O
N'H
O
N''H
1
1
32
Dans un ballon de 50 mL, 330 mg (0,44 mmol ; 1 éq.) du composé 31 sont mis en solution
dans 10 mL d’une solution à 20 % (v/v) de pipéridine dans le chloroforme. La solution est
chauffée quelques minutes à 40°C. Le milieu réactionnel, d’abord hétérogène à cause de la
faible solubilité du produit de départ dans le chloroforme, devient rapidement limpide. La
solution est ensuite évaporée à sec, sous vide primaire (40°C), pour éliminer le maximum de
pipéridine (bp 101-106°C). Le résidu solide est repris dans 1 mL de chloroforme pour être
ensuite précipité dans 100 mL d’hexane sous agitation. Après avoir laissé décanter 2 h à 4°C,
le précipité est récupéré par centrifugation (10000 tours/min, 20 min.). Le solide est séché,
225
12
16

puis une ultime étape de recristallisation dans le méthanol (dissolution dans un minimum de
méthanol bouillant, filtration des insolubles à chaud et recristallisation à 4°C) permet d’isoler
par filtration, et après une nuit de séchage à l’étuve à vide, 196 mg du composé 32 sous forme
d’une poudre blanche.
composé 32 :
Formule brute : C32H65N3O2, M = 523,89 g.mol -1
Rendement : 196 mg (0,37 mmol, 84 %)
CCM : Rf 32 = 0,5 (CHCl3 / MeOH 9 / 1 (v/v))
p.f. 104 °C
[]D 20 -7 ° (c 0,26, CHCl3)
IR : 3315 cm -1 (large) (NH- amide) et (NH2) ; 1631 cm -1 (C=O amide)
ESI-MS + : m/z mesuré à 524,6 [M+Na] + , calculé à 524,5 pour C32H66N3O2
RMN 1 H (CDCl3, 500,13 MHz) (ppm) 7,50 (tl, 1H, N’H) ; 6,23 (tl, 1H, N’’H) ; 3,65 (m,
1H, H-) ; 3,21 (m, 4H, H-1 /H-1) ; 2,61 (dd, 1H, H-2,55 (dd, 1H, H-’) ; 1,48 (m,
4H, H-2 /H-2) ; 1,24 – 1,32 (m, 44 H, H-3 à H-11H-3 à H-15) ; 0,88 (t, 6H,
H-12 / H-16)
RMN 13 C (CDCl3, 125,77 MHz) (ppm) 174,4 (CO-N’H) ; 171,6 (CO-N’’H) ; 53,5 (C-) ;
41,7 (C-) ; 40,2, 40,0 (C-1, C-1) ; 32,6 (C-10 / C-14) ; 30,2 – 30,4
(C-4 à C-9C-4 à C-13) ; 30,0 (2s, C-2 / C-2) ; 27,6 (2s, C-3 / C-3) ; 23,4 (C-11 /
C-15) ; 14,8 (C-12 / C-16)
226

N’-dodécyl-N’’-hexadecyl-N-(6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxy-cyclomaltoheptaose)-
L-aspartamide, -CD-Succ-L-Asp(NHC16H33)-NHC12H25 (33) :
HO
NH
NH
O c d
a b O
O
OH
O
O
1
H N'H
12
O
N''H
6
4 O
5
HO 2
3
OH
1
O
Même protocole expérimental que pour la synthèse du composé 23.
Bilan molaire :
OH
6 I -amidosuccinyl-6 I -désoxy-cyclomaltoheptaose 5 : 191,6 mg (0,16 mmol ; 1 éq.)
DIC : 96 µL (0,62 mmol ; 4 éq.)
HOBT : 86,0 mg (0,64 mmol ; 4 éq.)
N’-dodécyl-N’’-hexadecyl-L-aspartamide 32 : 122,9 mg (0,23 mmol ; 1,5 éq.)
composé 33 :
Formule brute : C78H138N4O38, M = 1739,96 g.mol -1
Rendement : 178 mg (0,10 mmol ; 66 %)
CCM : Rf 33 = 0,2 (CHCl3 / MeOH / H2O 6 / 3 / 0,5 (v/v/v))
p.f. 160°C (déc.)
[]D 20 + 80 ° (c 0,26, DMF)
IR : 3000-3500 cm -1 (large) (OH) ; 1652 cm -1 (C=O amides)
1
6
33
ES-HRMS : ESI-HRMS (haute résolution avec détection en mode positif) : m/z mesuré à
1739,8983 [M+H] + , calculé à 1739,9670 pour C78H139N4O38 (déviation : 4,8 ppm) ;
227
16

m/z mesuré à 1761,8866 [M+Na] + , calculé à 1761,8887 pour C78H138N4O38Na
(déviation : 5,4 ppm)
RMN 1 H (pyridine-d5, 500,13 MHz) (ppm) : 9,14 (d, 1H, NH) ; 8,79 (t, 1H, NHCD) ; 8,67
(t, 1H, N’’H) ; 8,50 (t, 1H, N’H ) ; 7,3 - 8,0 (OH) ; 5,57 – 5,60 (m), 5,55 (d), 5,47 (d) (6H, H-
1 II-VII CD) ; 5,44 (d, 1H, H-1 I CD) ; 5,38 (m, 1H, H-) ; 4,64 – 4,75 (m, H-3 II-VII CD) ; 4,62 (H-
3 I CD) ; 4,57 – 4,64 (m, H-6 II-VII CD) ; 4,33 – 4,52 (m, H-5 II-VII CD / H-6’ II-VII CD) ; 4,41 (H-5 I CD) ;
4,03 – 4,26 (m, H-4 II-VII CD) ; 4,19 (H-6 I CD) ; 4,06 (H-6’ I CD) ; 3,99 – 4,09 (m, H-2 II-VII CD) ; 3,92
(dd, 1H, H-2 I CD) ; 3,80 (t, 1H, H-4 I CD) ; 3,37, 3,32 (m, 4H, H-1, H-1) ; 3,07 (1H, H-) ;
2,98 (1H, H-’) ; 2,52 – 2,75 (m, 4H, H-b / H-c) ; 1,54, 1,46 (2m, 4H, H-2, H-2) ; 1,07 –
1,26 (m, H-3 à H-11/ H-3 à H-11) ; 0,76 (t, 6H, H-12/ H-12)
RMN 13 C (pyridine-d5, 125,77 MHz) (ppm) 173,2 (C-a) ; 173,1 (C-d) ; 172,0 (-CO-N’H) ;
171,2 (-CO-N’’H) ; 103,7 – 104,3 (C-1 I-VII CD) ; 85,5 (C-4 I CD) ; 83,4 – 83,9 (C-4 II-VII CD) ; 73,8
– 75,0 (C-3 I-VII CD / C-5 II-VII CD / C-2 I-VII CD) ; 72,0 (C-5 I CD) ; 61,7 – 62,3 (C-6 II-VII CD) ; 51,6
(C-) ; 41,2 (C-6 I CD) ; 40,1, 40,0 (C-1, C-1) ; 38,8 (C-) ; 32,3 (C-10/ C-10) ; 32,1,
31,7 (C-b, C-c) ; 29,7 – 30,3 (C-2 C-5 à C-9/ C-2C-5 à C-9) ; 27,5 (2s, C-3, C-
3) ; 23,1 (C-11 / C-11) ; 14,4 (C-12/ C-12)
228

ANNEXE I :
LISTE DE SPECIALITES PHARMACEUTIQUES COMMERCIALISEES CONTENANT DES
CYCLODEXTRINES (M. SKIBA, 2003)
Company
Type of cyclodextrin Drug molecule trade name Pharmaceutical forme Indication
country
Cefotiam-hexetil
Takeda
CD
Pansporin T Tablet Antibiotics
hydrochloride
Japan
Cefotiam-hexetil
Cassenne
CD
Taketiam Tablet Antibiotics
hydrochloride
France
Cefotiam-hexetil
CD
Texodil Tablet Antibiotics
hydrochloride
Takeda
Japan
Limaprost
Peripheral vascular
Ono
CD
Opalmon Tablet
disorders
Japan
PGE1
Chronic arterial
Ono
-CD
Prostandin Intra arterial
20g/amp.
occlusive disease
Japan
PGE1
Ono
-CD
Prostandin 500 Infusion Vasodilatator
500g/amp.
Japan
PGE1
Viridal
Intra arterial
Chronic arterial
Schwartz Pharma
-CD
20g/amp.
20g/646g
IV
occlusive disease
Germany, Italy
Shionogi
-CD Benexate Lonmiel Capsule Antiulcerant
Japan
-CD Benexate Ulgut Capsule Antiulcerant Teikoku
Japan
Tranxllium
Gador
-CD Chlordiazepoxide
Tablet Tranquilizer
5mg/25mg
Argentina
Analgesic,
Fujinaga
-CD Dexamethasone, glyteer Glymesason Ointment
Antiinflammatory
Japan
Diphenylhydramine HCl,
Stada
-CD
Stada-Travel Chewing tablet Travel sickness
chlortheophylline
Germany
Meiji Seika
-CD Cephalosporin Meiact Tablet Antibiotics
Japan
Xund
Bipharm
-CD Garlic oil
Dragees Anti-artherosclerotic
5mg/36mg
Germany
Tegra
-CD Garlic oil
5mg/36mg Dragees Anti-artherosclerotic Hermes
Germany
230

Company
country
Pharmafontana
Hungary
CTD
USA
Type of cyclodextrin Drug molecule trade name Pharmaceutical forme Indication
-CD Garlic oil Allidex Dragees Anti-artherosclerotic
-CD Garlic oil Garlessence Dragees Anti-artherosclerotic
Island
Mouth wash against aphta,
gingivitis, etc
HPCD Hydrocortisone Dexacort Liquid
Kyushin
Japan
Janssen
Europe/USA
Nippon Kayaku
Japan
Ono
Japan
Chiesi
Italy
Robapharm (P.Fabre),
France
Masterpharm
Italy,Belgium,Netherlands
and Switzeland
Promedica
France
Nycomed
Scandanavia
FarmiTalia
Germany
Aché
Brasil
Roussel Maestrett
Italy
Ono
Japon
-CD Iodine Mena-Gargle Gargling solution Throat disinfectant
Esophageal candidiosis
Oral Liquid
I.V. solution
HPCD Itraconazole Sporanox
-CD Nitroglycerin Nitropen Sublingual tablet Coronary dilator
PGE2
-CD
Prostarmon E Sublingual tablet Induction of labour
.
Anti inflammatory,
-CD Piroxicam Brexin Tablet, Sachet
analgesic
Anti inflammatory,
-CD Piroxicam Brexin Tablet, Sachet
analgesic
Anti inflammatory,
-CD Piroxicam Cycladol Suppository
analgesic
Anti inflammatory,
-CD Piroxicam Cycladol Tablet, Sachet
analgesic
Anti inflammatory,
-CD Piroxicam Brexidol Tablet, Sachet
analgesic
Anti inflammatory,
-CD Piroxicam Brexidol Tablet, Sachet
analgesic
Anti inflammatory
-CD Piroxicam Flogene Liquid
analgesic for pediatric use
Surgamyl
Anti inflammatory
-CD Tiaprofenic acide
Tablet
300mg/1400mg
analgesic for pediatric use
CD OP-1206 Opalmon Tablet Buerger's diease
231

Company
Type of cyclodextrin Drug molecule trade name Pharmaceutical forme Indication
country
Rectal pessary
Core Technologies
CD Morphine Moraxen Analgesic
Hydrgel
UK
HPCD Indomethacin Indocid Eye drop Chauvin
France
HPCD Flavopiridol IV Breast cancer NCI
USA
HP-CD Cisapride Prepulsid Rectal suppository Gastrointestinal
Janssen
Mobility stimulant
Belgium
Methyl--CD Cloramphenicol Clorocil Eye drop Antibiotic Oftalder
Portugal
Methyl--CD estradiol Aerodiol Voie nasale Servier
France
Betafarm
-CD Omeprazol comprimé Pompe à proton
Germany
-CD Cefotiam Pansporin-T comprimé Takeda
Japon
S-CD Ziprazidone Zeldox I.M. olution Pfizer
Sweden
HP-CD Diclofenac Voltaren ophtha Eye drop Anti-inflammatoire Novartis
France
Chiesi et Novartis
-CD Nimesulide Nimedex comprimé Anti-inflammatoire
Europe
232

ANNEXE II
DETERMINATION DE LA STŒCHIOMETRIE D’UN COMPLEXE
SOLUBLE CYCLODEXTRINE / “MOLECULE INVITEE” PAR LA
METHODE DES VARIATIONS CONTINUES OU METHODE DE JOB
L’équation stoechiométrique est
n C + m I Cn I m
L’évolution d’une variable physico-chimique est observée au cours d’une
titration au cours de laquelle la somme des concentrations totales en
cyclodextrine [C] t et en molécule « invitée » [I] t doit être maintenue constante.
[C] t
[I] t
c
Au cours de la titration la fraction molaire en cyclodextrine y varie en fonction des concentrations
totales en cyclodextrine et molécule « invitée » :
[C]
y t d’où [C] t cy et [I] t
c(1
y)
[C] t
[I] t
On exprime la concentration en complexe I ]
[Cn m en fonction des différents paramètres Ka, concentrations totales et concentrations à l’équilibre, [C] et [I], en cyclodextrine et molécule
invitée :
[Cn Im
] =
[Cn Im
] =
K
n m
a [C] [I]
(1)
[C] [
t
[ C] c y C]
n n
[I] c(1 y) ]
[Cn Im
] = t
[I]
[I
(3)
m m
La concentration en complexe I ] varie en fonction de y et passe par un maximum pour
d[C m
[Cn m
nI ]
0 . On calcule les dérivées à partir des trois équations précédentes et on les égale à
dy
zéro ce qui conduit aux trois relations :
d[C] d[I]
n [I] m [C]
0
dy
dy
(1’)
d[C]
c
(2’)
dy
d[I]
c
(3’)
dy
La combinaison de ces trois équations conduit à l’égalité suivante :
233
(2)

n [I] m [C]
(4)
La loi de conservation des masses appliquée au composé I s’écrit :
[I] m[C I ] c(1
y) (5)
[I] t
n m
d’où en remplaçant I ] par sa valeur tirée de (2) :
[Cn m
cy [ C]
c(1 y) [I]+ m
(6)
n
L’élimination de [C]et [I] entre (4) et (6) donne finalement la relation :
qui permet de préciser la composition du mélange optimal
y n
(7)
1 y m
Autrement dit si une variable physique directement liée à la concentration en complexe est
n
mesurée en fonction de y, sa valeur maximale est observée pour y . Cette relation est
m n
indépendante de la constante d’association Ka et de la valeur de c.
Lorsque la RMN du proton est utilisée comme méthode analytique dans le cas d’un
échange rapide à l’échelle de temps de la RMN, la valeur observée pour le déplacement chimique
d’un noyau i de la molécule « invitée » I, obs, est donnée par :
[I] m [C
I ]
m [CnIm
] I
c t n m Il
obs
(8)
[I]
t
Ic étant la valeur pour le noyau i dans le complexe pur C nI m et Il la valeur pour le noyau i dans
la molécule « invitée » à l’état libre. D’où la relation :
( ) [C I ] m (
) [C I ] cte (9)
[I] t obs Il n m Ic Il n m
Le produit ( ) directement proportionnel à [CnIm], est donc fonction de y. La
[I] t obs Il
[C]
courbe [I]
t
t ( obs
Il
) f(y) f passera par un maximum lorsque la composition du
[C] t
[I] t
mélange répondra à la condition :
y n
1 y m
Dans le cas d’un phénomène de complexation pur (en absence de tout phénomène
d’association) le coefficient stœchiométrique du complexe est déterminé à l’aide du tracé de la
fonction ( ) f(y) pour un proton donné de la molécule « invitée ».
[I] t obs If
Les constantes de couplage ou les vitesses de relaxation peuvent être aussi utilisées, en théorie.
234

ANNEXE III
DETERMINATION DE LA CONSTANTE D’ASSOCIATION D’UN
COMPLEXE 1:1 PAR LA METHODE DE BENESI-HILDEBRAND
Pour un complexe de stœchiométrie 1 :1, l’équation de réaction s’écrit :
C + I
CI
En supposant que l’échange de la molécule « invitée » entre forme associée et forme libre
soit rapide à l’échelle de temps de la RMN le déplacement chimique induit , est donné par:
[I] [CI]
[CI] Ic
t
Il
obs
Il
Il
(1)
[I]
où If et Ic sont respectivement les déplacements chimiques correspondant à la molécule
« invitée » et au complexe pur, obs le déplacement chimique observé à l’équilibre en présence de
cyclodextrine, [CI] et [I] t respectivement la concentration en complexe et la concentration totale
en espèce invitée.
On en déduit
[CI] Ic
[CI]
Il
soit
[I]
[CI]
Ic
(2)
[I]
La constante d’équilibre s’écrit :
K
a
t
avec Ic Ic
Il
t
[CI]
[CI]
(4)
[C] [I]
[C] [CI]
[I] [CI]
t
Sous réserve que la concentration en molécule « invitée » soit faible devant la concentration en
cyclodextrine, il est possible de négliger le terme [CI] 2 dans l’expression précédente ce qui conduit
à :
K
a
[CI]
(5)
[C] [I] [I]
[CI] [C]
[CI]
t
t
t
De l’équation (2), on tire la valeur de [CI] que l’on reporte dans l’expression simplifiée (5) de la
constante K a :
K a
(6)
[C]
[I]
[C]
t
Ic
t
A partir de cette équation en négligeant [I] t devant [C] t ( [I] t

1
K
a
1
Ic
[C]
t
1
La pente et l’ordonnée à l’origine des droites obtenues en portant 1/ en ordonnée en
fonction de 1/[C]t en abscisse et permettent d’atteindre les deux paramètres recherchés Ic et
Ka.
236
Ic
(7)

ANNEXE IV :
DOSAGES IMMUNOENZYMATIQUES
1. Le système immunitaire : présentation des anticorps
Les anticorps sont des protéines produites par le système immunitaire pour protéger un
organisme des agressions extérieures comme l’intrusion d’organismes pathogènes par
exemple. Ces molécules sont produites par les lymphocytes B en réponse à l’intrusion d’une
molécule étrangère à l’organisme hôte. Ces substances étrangères capables de déclencher une
réponse immunitaire sont dénommées antigènes, et ce sont en générale des composés
possédant des molécules de masse supérieure à 5000 Da. Les molécules plus petites (M

Figure 1. Représentation schématique d'un anticorps (ici, une molécule d’immunoglobuline G,
encore notée IgG)
Du point de vue structural, les anticorps sont des glycoprotéines constituées d’un arrangement
quaternaire de plusieurs sous-unités peptidiques. On distingue quatre chaînes protéiques :
deux chaînes dites lourdes (nommées VH, H pour Heavy, et dont la masse est proche de
50 kDa), et deux chaînes légères (nommées VL, L pour Light, de masse moléculaire environ
25 kDa). Ces quatre polypeptides sont arrangés de manière symétrique, chacune des chaînes
légères étant associée à une chaîne lourde, et l’assemblage global étant assuré par plusieurs
ponts disulfures intra- et inter-catennaires (figure 1).
On distingue dans les immunoglobulines deux grandes régions : une partie est dite constante,
et l’autre variable. Ce sont les parties constantes, constituées par les parties C-terminales des
polypeptides qui permettent de distinguer les différentes classes d’immunoglobulines. Ainsi,
il existe 5 classes d’immunoglobulines chez les mammifères, dénommées IgA, IgD, IgE, IgG
et IgM, qui se distinguent chacune par la partie constante de leurs chaînes lourdes, , , , ,
et µ, respectivement. Ce sont les IgG les plus fréquentes, et ce sont elles que nous avons
utilisées pour les expériences de reconnaissance immunologique.
238

Les parties variables sont, elles, responsables de la reconnaissance pour un antigène donné.
Elles sont constituées d’une partie des chaînes lourdes, et d’une partie des chaînes légères (les
extrémités N-terminales) qui créent ainsi 2 sites de liaisons par anticorps (voir schéma de
l’IgG). On distingue dans ces parties variables un sous-motif qualifié «d’hypervariable», et
qui est directement impliqué dans l’interaction avec l’antigène. Ces régions hypervariables
sont constituées d’un arrangement conformationel et fonctionnel (le paratope) spécifique à la
liaison avec une partie de l’antigène (l’épitope). Le phénomène pur de reconnaissance ne met
cependant en jeu que quelques uns des acides aminés de ces régions hypervariables.
2. Obtention des anticorps.
Nous décrirons ici une méthode générale d’obtention d’anticorps dirigés contre des haptènes,
en étudiant plus particulièrement la production d’anticorps anti-cyclodextrines.
Les haptènes sont de petites molécules (M < 5000Da) qui ne suffisent pas à elles seules à
induire une réponse immunitaire chez un mammifère. On fabrique donc un immunogène en
greffant de façon covalente l’haptène sur une protéine étrangère à l’hôte auquel on veut faire
produire des anticorps (typiquement, un lapin). Le système immunitaire va produire des
anticorps dirigés contre l’ensemble des épitopes portés par cette protéine étrangère (KLH +
haptène ou BSA + haptène), et dans cet ensemble d’anticorps, certains seront dirigés contre
l’haptène préalablement greffé.
Pour les cyclodextrines, on utilise les dérivés mono-6-désoxy-6-amino-cyclodextrines (CD-
NH2). Cet haptène est couplé de façon covalente à la Sérum Albumine Bovine (BSA),
protéine étrangère à l’organisme du lapin, en utilisant le glutaraldéhyde comme bras espaceur
(la façon dont le glutaraldéhyde lie les deux molécules n’est pas bien connue, mais le
glutaraldéhyde réagit probablement sous sa forme polymérique). L'agent de couplage réagit
en créant des fonctions imines à partir des fonctions amines primaires de la CD et de la BSA
(figure 2).
239

NH2
CD +
BSA
OHC CHO
240
CD
Figure 2: Préparation de l'immunogène.
H2 N CH N 3
IMMUNOGENE
Pour réaliser ceci, 900 nmol d'haptène et 30 mg de BSA sont dissouts dans 2 ml de tampon
phosphate (0.1 M, pH 7.4). On ajoute à cette solution 8 µL de solution aqueuse de
glutaraldéhyde (25 % (v/v)). La solution est agitée durant 16 H à Tamb, puis dialysée contre
deux litres de tampon phosphate 10 -1 M. L'immunogène est stocké à -30 °C jusqu'à utilisation.
Les lapins sont immunisés par injection intradermique de l’immunogène. Afin d’accroître la
réponse immunitaire du lapin, l’immunogène est émulsionné dans de l’adjuvant de Freund
complet 251 . 1 mg d’immunogène est injecté au lapin. Six semaines après la première injection,
les animaux reçoivent une injection de rappel. Cette opération est ensuite répétée tous les
mois, tandis que l’on vérifie la présence et le titre des anticorps spécifiques dans les saignées
effectuées avant et après chaque rappel.
Ce sont ces protéines générées par le système immunitaire qui sont la base des dosages
immunologiques.
3. Les dosages immunologiques
3.1 Principe
Sous le terme de dosages immunologiques sont regroupées différentes méthodes d’analyse
qui on toutes en commun d’utiliser à la fois des anticorps (Ac) et des molécules marquées.
Les anticorps ont la propriété de former des complexes spécifiques de haute affinité avec les
antigènes (Ag) contre lesquels ils ont été produits. Les dosages immunologiques exploitent les
propriétés de base de l’interaction Ag-Ac. Dans sa forme la plus simple, celle-ci peut être
décrite par l’équilibre suivant :
BSA

Ag + Ac AgAc
Il est admis que cet équilibre obéit à la loi d’action de masse et donc que les concentrations de
ces constituants sont reliées entre elles par la relation :
Kd [Ag] [Ac] [AgAc] –1
où Kd est la constante de dissociation du complexe Ag-Ac
De cet équilibre on peut déduire que la concentration des complexes AgAc formés dépend des
concentrations en Ag et en Ac introduites dans la réaction. Si l’on suppose constante la
concentration totale en Ac, on peut montrer qu’il existe une relation mathématique simple
reliant [Ag] à [Ag-Ac]. Cette relation va permettre de mesurer la concentration en Ag si l’on
est capable de mesurer la concentration du complexe formé.
On pourrait alors penser qu’il est possible de mesurer la concentration d’un Ag au moyen
d’un seul équilibre réalisé avec une quantité connue d‘Ac. Ceci serait possible si on pouvait
connaître avec précision la concentration totale en Ac, le Kd et la concentration du complexe
formé. En pratique, ces trois conditions ne sont jamais réalisées en même temps et tous les
dosages immunologiques sont, en fait, des méthodes d’analyses relatives faisant appel à des
courbes d’étalonnage. Celles-ci sont établies en réalisant plusieurs équilibres avec des
concentrations connues et variables d’Ag. En mesurant pour chaque équilibre la quantité de
complexe formé, on va établir une relation expérimentale entre la concentration de l’Ag et
celle du complexe AgAc. C’est à partir de cette relation que l’on va mesurer la concentration
de l’Ag dans un échantillon inconnu traité dans les mêmes conditions expérimentales que les
solutions étalons. Dans ces conditions, il n’est pas nécessaire de travailler dans des conditions
d’équilibre.
Pour effectuer un dosage immunologique, il faut donc pouvoir mesurer la concentration du
complexe AgAc formé. C’est pour rendre plus facile cette mesure que l’on a recours à
l’utilisation de molécules marquées. Il s’agit d’Ag ou d’Ac auxquels on associe un signal les
rendant facilement mesurables au moyen d’une méthode physico-chimique quelconque. De
très nombreux marqueurs ont été décrits mais les plus utilisés sont les marqueurs radioactifs
(dosage radioimmunologiques), les marqueurs fluorescents (dosages fluoroimmunologiques)
241

et les enzymes (dosages immunoenzymatiques). Nous nous concentrerons sur ce dernier cas
qui est la méthode que nous avons utilisée.
Pour permettre des dosages sensibles, un bon traceur doit pouvoir être détecté à des
concentrations très faibles, c’est à dira posséder une activité spécifique la plus élevée possible.
Il faut aussi que l’opération de marquage respecte les structures essentielles de l’Ac afin que
la stabilité du complexe ne soit pas affectée.
Les enzymes les plus utilisées restent la phosphatase alcaline et la peroxydase de Raifort. Au
laboratoire, nous utilisons plutôt l’acétylcholinesterase ou AchE en raison de sa très grande
activité catalytique qui confère aux traceurs synthétisés à partir de cette enzyme des activités
spécifiques très élevées souvent comparables à celles des traceurs radioactifs. La fonction
principale de cette enzyme est l’hydrolyse de l’acétylcholine dans la synapse cholinergique.
Pour détecter cette enzyme on utilise le réactif d’Ellman 252 (Figure 3) qui est un mélange
d’acétylthiocholine, un pseudo-substrat de l’AchE, et le DTNB. L’hydrolyse de
l’acétylthiocholine aboutit à la production de thiocholine qui réagit avec le DTNB ox., réactif
classiquement utilisé pour mesurer les groupements thiols, et entraîne la formation de DTNB
réduit. Ce dernier est un chromophore (max 414 nm, M 13600cm -1 .M -1 ) qui absorbe fortement
dans le visible en produisant une couleur jaune.
AChE
CH3COO
Acétylthiocholine Thiocholine
- + - S-CH2CH2N(CH3)3 + + 2H +
CH3COS-CH2CH2N(CH3)3 + + H2O
- S-CH2 -CH 2 -N + (CH 3 ) 3 +
O 2 N
-OOC
DTNB
S
S NO2 242
COO-
COO- HSNO2 C
H 3
C
H 3
N +
CH3 Figure 3. Principe de la méthode colorimétrique d’Ellman.
+
S
DTNB
Réduit (coloré)
COO-
S NO 2

Il est courant d’exprimer les concentrations d’AchE en fonction des mesures effectuées avec
la méthode d’Ellman. Une unité Ellman correspond à la quantité d’enzyme produisant un
accroissement d’absorbance d’une unité à 414 nm pendant une minute, dans un volume de
1 mL de milieu Ellman, pour 1 cm de trajet optique à 25°C.
Dans certains cas, la formation de complexe s’accompagne d’une modification du signal porté
par le traceur. Les dosages de ce type sont appelés homogène car la mesure est effectuée
directement sur l’ensemble des constituants de l’équilibre immunologique. A l’opposé on
distingue les dosages hétérogènes, pour lesquels la formation des complexes Ag-Ac ne
modifie pas le signal porté par le traceur. Dans ce cas, pour accéder à la mesure des complexe
Ag-Ac, il faut procéder à une séparation des différents constituants de l’équilibre et
notamment séparer le traceur non complexé de celui engagé dans les complexes Ag-Ac. Cette
séparation, qui doit être effectuée avant la mesure finale, fait presque toujours appel à une
séparation de phase (liquide/solide). Dans la suite de cet exposé nous envisagerons seulement
le cas des dosages hétérogènes que nous avons utilisé.
Nous venons d’examiner les principes de base sur lesquels reposent les dosages
immunologiques et nous avons vu comment la formation de complexes Ag-Ac et l’utilisation
de molécules marquées permettait de mesurer des concentrations d’Ag ou d’Ac. Ces principes
ne sont pas propres aux dosages immunologiques et on pourrait les appliquer, par exemple,
aux dosages faisant intervenir des récepteurs. Si les dosages immunologiques ont connu un
développement si spectaculaire ces trente dernières années, c’est parce qu’ils sont dotés
d’autres propriétés remarquables. Ce sont d’abord des méthodes très générales dans la mesure
où il est possible d’obtenir des Ac contre à peu près n’importe quelle molécule. Le succès des
dosages immunologiques est aussi dû à deux propriétés essentielles de l’interaction Ag-Ac :
spécificité et affinité. C’est grâce à la spécificité des Ac, c’est à dire à leur aptitude à ne
former des complexes qu’avec le seul Ag contre lequel ils ont été produit, que les dosages
immunologiques pourront être effectués dans des milieux biologiques complexes (plasma,
urines, extraits de tissus) sans purification préalable. Et c’est grâce à la grande stabilité des
complexes que les dosages immunologiques pourront être très sensibles. Or ces complexes ne
se formeront de façon mesurable, à de très faibles concentrations, que si la constante de
dissociation de ces complexes le permet. Avec des Kd de l’ordre de 10 -9 M et pouvant aller
jusqu’à 10 -12 M, les Ac permettent de mesurer de très faibles concentrations d’Ag. Ainsi, que
243

ce soit en termes de spécificité ou d’affinité, les Ac sont les réactifs les plus performants
actuellement accessibles aux biologistes avec les sondes nucléotides.
Il ne saurait être question ici de décrire les très nombreuses méthodes faisant intervenir la
relation Ag-Ac. Nous nous bornerons à décrire succinctement le type de dosage hétérogène
que nous avons utilisé : le dosage par compétition.
3.2 Dosage par compétition
Les dosages par compétition mettent en jeu 3 composants: un anticorps (poly ou monoclonal),
un antigène marqué (le traceur) et le même antigène non marqué. Le fait d’utiliser comme
traceur l’antigène marqué est l’une des caractéristiques essentielles des dosages par
compétition. Le traceur (Ag * ) et l’antigène (Ag) non marqué sont aptes à se lier tous les deux
aux mêmes anticorps (Ac), et de ce fait, à établir une compétition si la concentration des sites
anticorps est limitante. Le principe de compétition met donc en œuvre deux équilibres :
Ag * + Ac Ag * Ac Kd * = [Ac][Ag * ]/[Ag * Ac]
Ag + Ac AgAc Kd= [Ac][Ag]/[AgAc]
On peut montrer que si la concentration en anticorps et en traceurs est constante, la
concentration en complexe Ag * Ac diminue quand la concentration d’antigènes non marqués
introduite dans l’équilibre augmente, et ceci pour toutes valeurs de Kd et Kd * .
3.2.1 Préparation du traceur pour le dosage par compétition
Comme indiqué précédemment, un traceur pour dosage par compétition est obtenu en
couplant de façon covalente l’haptène étudié à l’acétylcholinestérase. Il existe de nombreuses
façons de coupler l’haptène sur l’enzyme. La méthode employée dépend uniquement des
fonctions chimiques réactives disponibles sur l’haptène. Dans le cas des cyclodextrines, le
traceur est préparé en exploitant la fonction amine du dérivé mono-6-désoxy-6-aminocyclodextrines
(CD-NH2), en utilisant le protocole précédemment décrit pour les haptènes 253
ou pour les protéines 254 .
244

CD
A C
h E
NH 2
NH 2
SMCC
SATA
NH2OH A C
h E
O
NH
CD
AChE-G4-SMCC
NHCOCH 2 SH
N
O
O
245
A C
h E
O
NH
Traceur CD-G4
Figure 4. Synthèse du traceur enzymatique CD-AChE-G4.
Le dérivé mono-6-désoxy-6-amino-cyclodextrine (CD-NH2) est d’abord thiolé en faisant
réagir le groupe amine de la CD-NH2 avec le N-succinimidyl-S-acétylthioacétate (SATA) en
milieu alcalin. A une solution de CD-NH2 (1µmol) en tampon borate (1 ml de tampon borate
0.1 M, pH 8.5) on ajoute 50 µl d'une solution de SATA dans le DMF anhydre (2.13 mg, 9.2
µmol). La réaction a lieu à température ambiante durant 30 mn avant purification de la CD-
SATA sur cartouche de SEP-PAK C18. Le dérivé thiolé est élué avec du méthanol, lyophilisé
et repris dans 1.6 ml de tampon phosphate préalablement dégazé (tampon phosphate 0.1 M,
pH 6). On ajoute alors 400 µL d'une solution de chlorure d'hydroxylamine (pH 7). Après 30
mn de réaction, le nombre de fonctions thiols est estimé par colorimétrie, en faisant réagir le
milieu réactionnel avec 0.5 mM de 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoique acide) (DTNB) selon la
procédure décrite par Ellman 255 .
L'acétylcholinestérase (sous sa forme globulaire G4, préalablement extraite à partir des
organes électriques de Gymnote et purifiée par chromatographie d'affinité 256 ) est de son côté
fonctionnalisée par réaction avec le N-succinimidyl-4-(N-maléimidométhyl) cyclohexane-1carboxylate
(SMCC, un agent bifonctionnel), puis purifiée comme précédement décrit 254 . Le
couplage de la cyclodextrine thiolée (3 nmol) avec l'AChE fonctionnalisée (0.3 nmol AChE-
G4-SMCC) est réalisé en milieu tampon phosphate (0.1 M, pH 6, 275 µL) durant 3 h à 30°C.
Le traceur CD-AChE est alors purifié par filtration sur gel de sépharose (Biogel A, colonne de
90 x 1.5 cm, éluant tampon EIA).
N
O
O
S
O
NH
CD

3.2.2 Mise en œuvre ; interprétations
La mise en œuvre d’un dosage immunoenzymatique par compétition nécessite la préparation
d'un traceur (antigène étudié lié de façon covalente à l’acétylcholinestérase), et d’avoir à notre
disposition un anticorps spécifique de l’antigène étudié (voir le chapitre concernant la
préparation de l’immunogène à partir d’un haptène).
Les dosages immunologiques sont réalisés dans des plaques de microtitration comprenant 96
puits. Un prétraitement nécessaire à la bonne réalisation du dosage (schéma 1, fig 5), consiste
à recouvrir les puits avec un anticorps monoclonal de souris dirigé contre la partie constante
des immunoglobulines de lapin. La première étape du dosage consiste à mélanger dans un
même puits, une quantité constante de ces anticorps spécifiques de lapin avec une quantité
constante de traceur (antigène-AChE), et une quantité variable de l’antigène étudié (schéma 2,
fig 5). Après l’étape de réaction immunologique (typiquement 18 h à 4 °C) et après une étape
de lavage soigné, on se retrouve dans la situation du schéma 3, où certains sites sont occupés
par une molécule de traceur, ou bien, par une molécule d’antigène, l’excédant ayant été
éliminé par l’étape de lavage.
Figure 5. Principe du dosage immunoenzymatique par compétition.
La quantité d’AChE fixée sur la phase solide est alors détectée par la méthode colorimétrique
d’Ellman en ajoutant dans chacun des puits un mélange d’acétylthiocholine et de DTNB
(schéma 4, fig 5). Après une à deux heures de réaction enzymatique, l’absorbance
( = 414 nm) de chaque puits est mesurée à l’aide d’un lecteur approprié.
246

La réalisation de ces mesures sur une gamme de concentration de l’antigène étudié conduit à
l’obtention de courbe de type B = f([concentration]), B étant l’absorbance du milieu à 414
nm, pour une concentration donnée d’antigène. Il est cependant plus pratique de représenter
ces courbes sous une forme semi-logarithmique, en traçant 100*B/B0 = f([concentration]), B0
étant l’absorbance mesurée en absence d’antigène non marqué (figure 6).
Figure 6. Courbe dose-réponse obtenue lors d'un dosage immunologique par compétition.
Il est à noter que des mesures de liaison non spécifique (absorbance mesurée en absence
d’anticorps spécifiques) sont effectuées à chaque dosage.
On peut estimer grossièrement la sensibilité d’un dosage par la valeur de la concentration en
antigène qui correspond à une valeur de B*100/B0 de 50 % de B0. Cette valeur caractérise la
zone de concentration dans laquelle le dosage présente la précision maximale. Lors du dosage,
on doit donc trouver les dilutions de l’échantillons permettant d’obtenir des valeurs de
concentration compris dans cette zone. (La sensibilité d’un dosage par compétition est définie
de façon plus rigoureuse par la « concentration minimale détectable », c’est à dire la plus
petite concentration d’antigène capable d’induire une diminution statistiquement significative
de la valeur de B0. Expérimentalement, elle est déterminée en calculant la concentration
d’antigène correspondant à B0-3, étant l’écart type estimé sur la mesure de B0).
247

La spécificité d’un dosage peut être évaluée en réalisant des courbes d’étalonnage avec des
substances structuralement et fonctionnellement apparentées. On définit alors le pourcentage
de réaction croisée RC (%) (critère d’Abraham 257 ):
RC (%) =
[Ag]50%
[analogue]
248
50%
x 100
Figure 7. Formule du critère d'Abraham (Abraham, 1974).
[Ag]50% et [analogue]50% représentant respectivement les concentrations d’antigène et
d’analogue qui engendrent un signal de 50 % de B0. La comparaison des valeurs de B/B0 à
50% mesurées pour une série de produits testés dans les mêmes conditions permet d’estimer
l’affinité relative de chacun de ces produits pour les anticorps étudiés.
Dans le cas du dosage de la Rameb, notre limite de détection est de 0.1 ng/mL et le B/B0 50%
correspond à environ 1.5 ng/mL.
La sensibilité d’un dosage dépend de nombreux paramètres et notamment de la concentration
du traceur et de l’Ac. La règle générale est que le dosage sera d’autant plus sensible que
l’anticorps et le traceur sont plus dilués. Cette règle découle du principe de la compétition,
celle-ci s’exerçant plus facilement à l’avantage de l’antigène non marqué, si le traceur est peu
concentré et si la concentration en Ac est limitante. En conséquence, si l’on veut utiliser un
traceur à de très faibles concentrations, il faut que celui-ci possède une activité spécifique telle
qu’à ces concentrations il fournisse encore un signal mesurable. C’est le cas de l’AchE dont la
limite théorique de détection, dans les conditions d’utilisation habituelles (200µL d’Ellman,
trajet optique de 0.44 cm, 1 heure de réaction) est de 1.85 10 -18 mole.
Avec des traceurs aussi performants, c’est presque toujours la stabilité du complexe qui limite
les dilutions que l’on peut faire subir à l’Ac. Même s’il est possible dans certains cas
d’influencer la réponse immunitaire, il faut considérer que l’affinité des Ac produits par un
animal échappe en grande partie à l’expérimentateur. Bien entendu, il n’est pas possible de
diluer indéfiniment traceurs et anticorps et il existe, en théorie pour chaque dosage (un traceur
et un Ac donné) une combinaison idéale qu’il conviendrait de déterminer à chaque fois. En
pratique, on opère souvent de façon plus empirique en fixant arbitrairement la concentration

du traceur et en déterminant ensuite par dilutions successives, la concentration minimale
d’anticorps utilisable. C’est la technique que nous avons utilisée.
Pour chaque échantillon, nous avons évalué la qualité du dosage grâce au critère de
répétabilité ou précision intra-essai, qui exprime la variation des résultats au cours d’une
même analyse et est évaluée en dosant systématiquement sur une même plaque chaque
échantillon à 4 concentrations différentes. Pour être pris en compte les résultats doivent bien
sur se situer dans la zone proche du B/B0 50% (généralement 30% B/B0 70%).
249

ANNEXE V
PRINCIPE DE LA RMN DU DEUTERIUM
Le deutérium possède un spin égal à 1, c’est donc un noyau quadrupolaire. Son rapport
gyromagnétique est 6 fois plus faible que celui du proton. Ces paramètres vont fortement
affecter les données que l’on peut en déduire et la méthode d’acquisition et de traitement des
spectres.
-Le faible rapport gyromagnétique et la faible abondance naturelle du deutérium
(0,0156 %) rendent impossible l’observation directe des signaux et impose donc de travailler
sur des composés marqués ce qui constitue une première limitation d’un point de vue
économique.
- Le couplage quadrupolaire important (de l’ordre de la centaine de KHz) n’est pas
moyenné à zéro par le mouvement et sera donc présent sur les spectres qui seront répartis sur
de très grandes largeurs spectrales. Nous verrons ultérieurement que l’accès à ce couplage
résiduel est néanmoins très utile pour les systèmes organisés.
- la faiblesse du rapport gyromagnétique implique également que les différences de
déplacements chimiques exprimés en Hertz seront 6 fois plus faibles que les équivalents en
RMN du proton. Ceci peut conduire à des difficultés pour l’attribution des différents
deutérons. Ces difficultés seront contournées par l’utilisation des couplages quadrupolaires.
- En ce qui concerne les processus de relaxation, la situation est très différente de celle
rencontrée pour les noyaux non quadrupolaires. Dans le cas du deutérium, la relaxation par les
processus quadrupolaires sera dominante (en comparaison de celle induite par des voies
dipolaires ou par anisotropie de déplacement chimique) et extrêmement efficace, conduisant à
des valeurs de T1 et surtout de T2 très faibles (inférieures à la milliseconde). Des T2 aussi
faibles conduiront à un signal de très courte durée de vie et à des largeurs de raie importantes
(plusieurs KHz), imposant des conditions d’acquisition et de traitement très particulières afin
de récupérer la totalité du signal.
- La très grande largeur spectrale et la très courte durée de vie du signal requièrent
d’une part des impulsions radio-fréquences très courtes (donc des émetteurs de très forte
puissance) pour exciter totalement et de manière homogène tout le spectre et, d’autre part, des
délais très courts pour réduire les pertes par relaxation. Dans le cas présent les spectres ont été
obtenus par la séquence d’écho quadrupolaire 258 que l’on peut exprimer comme suit
(figure 1) :
250

90° 90°
1
2
251
×
×
×
×
×
×
×
×
Figure 1 : Séquence de l’écho quadrupolaire (ou écho solide)
Les temps 1et 2sont de l'ordre de 40 microsecondes et si on se place dans les conditions
pour lesquelles 2 est inférieur à 1, on peut observer la formation de l’écho. Les points
antérieurs au maximum de l’écho sont éliminés. Le positionnement fin d'un point au sommet
de l'écho s'effectue en variant 2 par de petites fractions de la période d'échantillonage DW.
Avant transformée de Fourier, la partie imaginaire de l’interférogramme est mise à zéro pour
augmenter le rapport signal sur bruit. En raison du caractère non orienté des échantillons, les
spectres obtenus sont des spectres de poudre issus de la somme des spectres individuels
correspondants à toutes les orientations que peut prendre chaque vecteur C-D par rapport au
champ magnétique externe. Le spectre correspondant à celui qui serait obtenu avec un
monocristal ou un échantillon orienté peut être obtenu par déconvolution (de-Paking) selon
les algorithmes décrits dans la littérature 259 .
Paramètres accessibles grâce à la RMN 2 H
L’analyse est en général réalisée sur les spectres déconvolués. Le rapport entre l’écart
quadrupolaire mesuré pour un deutéron donné à celui d’un système rigide (environ 125 KHz)
fournit directement le paramètre d’ordre du segment considéré lié à la mobilité locale. Dans la
suite de cette étude les données seront essentiellement déduites des signaux des méthyles des
DW

chaînes aliphatiques qui présentent le plus grand désordre et sont donc au centre du spectre.
Par simulation des signaux et intégration il est alors possible de déduire les proportions des
différentes phases coexistantes 199 . Le traitement et l'attribution de spectres deutérium sera
illustré sur un exemple particulièrement pédagogique concernant des liposomes
multilamellaires de POPC-d31 ou 1-palmitoléyl-d31,2-oleoyl-glycero-3-phosphatidylcholine
pour laquelle seule la chaîne palmitoyl est totalement deutériée. (figure 2)
POPC-d31
écart quadrupolaire
Fréquence (KHz)
Figure 2 : Spectre RMN du deutérium (a) brut et (b) déconvolué de la POPC-d31
A chaque deutéron de la chaîne, correspond un doublet caractérisé par un écart quadrupolaire
q et centré par rapport à la fréquence porteuse située au centre du spectre. En ce point se
trouve un singulet fin correspondant au signal du deutérium résiduel de l'eau. La superposition
de l’ensemble des doublets conduit au spectre composite représenté figure 17 a. Par
déconvolution de ce spectre, on obtient le spectre représenté figure 17 b, qui permet une
mesure précise de chaque écart quadrupolaire, notamment ceux des groupements CD2 et CD3
localisés en bout de chaîne (positions 9 à 16) qui apparaissent au centre du spectre. Les
252

groupements CD2 proches du glycérol (2 à 8) sont superposés et apparaissent aux bornes du
spectre. Les signaux les plus proches du centre correspondent aux deutérons présentant la plus
grande mobilité donc les écarts quadrupolaires les plus faibles. Ce principe général permet
d'attribuer chaque groupe méthylène ou méthyle de la chaîne deutériée et d'extraire les
paramètres d'ordre.
Pour chaque liaison CD, l’écart quadrupolaire est de la forme :
q
Q SCD
où Q est la constante du couplage quadrupolaire statique (=125 KHz pour les groupes
CD aliphatiques) et SCD, le paramètre d’ordre orientationnel. Dans le cas de liposomes
multilamellaires, SCD contient deux composantes, une d’ordre géométrique, soit l’angle
moyen que fait cette liaison CD avec la normale de la bicouche, et une autre d’ordre
dynamique, qui rend compte de l’amplitude des fluctuations angulaires du vecteur CD. Ce
paramètre d’ordre SCD peut fournir des informations d’ordre macroscopique sur l’organisation
globale de la membrane (phase lamellaires, hexagonales ou cubique, micelles, vésicules…) et
microscopique au niveau de perturbations plus spécifiques du groupement considéré et de son
environnement local.
253

BIBLIOGRAPHIE
1 Szejtli J., Chem. Rev. 1998, 98(5), 1743-1753
2 Villiers A., C. R. Acad. Sci. 1891, 112, 536
3 Schardinger F., Wien. Klin. Wochschr. 1904, 17, 207
4 Schardinger F., Zentralbl. Bakteriol. Parasintenkd. 1905, 14, 772
5 Schardinger F., Zentralbl. Bakteriol. Parasintenkd. 1911, 29, 188
6 Prigsheim H., Chemistry of the saccharides, McGraw-Hill : New-York, 1932, p 280
7 Prigsheim H., A Comprehensive Survey of Starch Chemistry, Walton R. P., Ed., Chemical
Catalogue Co., Inc. : New York, NY, 1928, p 35
8 Freudenberg K., Blomquist G., Ewald L., Soff K., Ber. Dtsch. Chem. Ges. 1936, 69, 1258
9 Freudenberg K., Cramer F., Z. Naturforsc. 1948, 3b, 464
10 Cramer F., Einschlussverbindungen (Inclusion compounds), Springer-Verlag : Berlin, 1954
11 Freudenberg K., Cramer F., Plieninger H., German Patent 895769, 1953
12 Cyclodextrin News 2003, 17(4)
13 Saenger W., Jacob J., Gessler K., Steiner T., Hoffmann D., Sanbe H., Koizumi K.,
Smith S. M., Takaha T., Chem. Rev. 1998, 98(5), 1787-1802
14 Harata K., Chem. Rev. 1998, 98(5), 1803-1828
15 Wenz G., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1994, 33, 803-822
16 Schneider H.-J., Hacket F., Rüdiger V., Ikeda H., Chem. Rev. 1998, 98(5), 1755-1786
17 Rekharsky M. V., Inoue Y., Chem. Rev. 1998, 98(5), 1875-1918
255

18
Szente L., Comprehensive Supramolecular Chemistry, Atwood J.L., Davies J.E.D.,
MacNicol D.D., Vögtle F., Lehn J.-M., Eds., vol. 3, Cyclodextrins, chap. 8, Pergamon :
Oxford, U.K., 1996, 253-278
19
Tsukube H., Furuta H., Odani A., Takeda Y., Kudo Y., Inoue Y., Liu Y., Sakamoto H.,
Kimura K., Comprehensive Supramolecular Chemistry, Atwood J.L., Davies J.E.D.,
MacNicol D.D., Vögtle F., Lehn J.-M., Eds., vol. 8, Physical methods in supramolecular
chemistry, chap. 10, Pergamon : Oxford, U.K., 1996, 425-482
20 Connors K.A., Chem. Rev. 1997, 97, 1325-1357
21 Uekama K., Hirayama F., Irie T., Chem. Rev. 1998, 98(5), 2045-2076
22 Cyclodextrins and their industrial uses, Ed. D. Duchêne, Edition de santé : Paris, 1987,
p 448
23 New trends in cyclodextrins and derivatives, Ed. D. Duchêne, Edition de santé : Paris,
1991, p 635
24 Rajewski R. A., Stella V. J., J. Pharm. Sci. 1996, 85(11), 1142-1159
25 Fröming K.-H., Szejtli J., Cyclodextrins in pharmacy, Kluwer Academic Publishers :
Dordrecht, 1994, p 224
26 Hedges A. R., Chem. Rev. 1998, 98(5), 2035-2044
27 Hashimoto H., J. Incl. Phenom. Macro. Chem. 2002, 44(1-4), 57-62
28 Petersson P., Reese S.L., Yi G., Yun H., Malik A., Bradshaw J.S., Rossiter B.E., Lee M.L.,
Markides K.E., J. Chromatogr. A, 1994, 684, 297-309
29 Schurig V., Nowotny H-P., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1990, 29, 939-957
30 Takahashi K., Chem. Rev. 1998, 98(5), 2013-2034
31 Kunishima K., Yoshimura K., Morigaki H., Kawamata R., Terao K., Tani S., J. Am. Chem.
Soc. 2001, 123, 10760
256

32 Motherwell W. B., Bingham M. J., Six Y., Tetrahedron 2001, 57, 4663
33 Breslow R., Zhang B., J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 5882-5883
34 Zhang B., Breslow R., J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 1676-1681
35 Breslow R., Dong S. D., Chem. Rev. 1998, 98(5), 1997-2012
36 Szejtli J., Cyclodextrin Technology, Kluwer Academic Publishers : Dordrecht, 1988, p 450
37 Comprehensive Supramolecular Chemistry, Atwood J. L., Lehn J.-M., Eds., vol. 3,
Cyclodextrins, Szejtli J., Osa T., Eds., Pergamon : Oxford, U.K., 1996, p 693
38 Kahn A. R., Forgo P., Stine K. J., D’Souza V. T., Chem. Rev. 1998, 98(5), 1977-1996
39 Hybl A., Rundle R. E., William D. E., J. Am. Chem. Soc. 1965, 87, 2779
40 Saenger W., Noltemeyer M., Manor P. C., Himgerty B., Klar B., Bioorg. Chem. 1976, 5,
187
41 Takeo K., Uemura K., Mitoh H. J., Carbohydr. Chem. 1988, 7, 293
42 Cramer F., Mackensen G., Kensee K., Chem. Ber. 1969, 102, 494
43 Rong D., D’Souza V. T., Tetrahedron Lett. 1990, 31, 4275
44 Ueno A., Breslow R., Tetrahedron Lett. 1982, 23, 3451
45 Fujita K., Nagamura S., Imoto T., Tetrahedron Lett. 1984, 25, 5673
46 Takahashi K., Hattori K., Toda F., Tetrahedron Lett. 1984, 25, 3331
47 Takeo K., Mitoh H., Uemara K., Carbohydr. Res. 1989, 187, 203
48 Boger J., Corcoran R. J., Lehn J.-M., Helv. Chim. Acta 1978, 61, 2190
49 Croft A. P., Bartsch R. A., Tetrahedron 1983, 39, 1417
257

50
Jicsinszky L., Fenyvesi E., Cyclodextrin Derivatives. In Comprehensive Supramolecular
Chemistry, Atwood J. L., Lehn J.-M., Eds., vol. 3, Cyclodextrins, Szejtli J., Osa T., Eds.,
Pergamon : Oxford, U.K., 1996, p57
51 Fügedi P., Nánási P., Carbohydr. Res. 1988, 175, 173
52 Cottaz S., Driguez H., Synthesis 1989, 755
53 Elwood P., Spencer C. M., Spencer N., Stoddart J. F., Zarzycki R. J., J. Inclusion Phenom.
Mol. Recognit. Chem. 1992, 12, 121
54 Szejtli J., Lipták A., Jodál I., Fügedi P., Nánási P., Neszmélyi A., Starch / Staerke 1980, 32,
165
55 Keim W., Koehns A., Meltzow W., Roemer H., J. High Res. Chromatogr. 1991, 14, 507
56 Bates P. S., Chem. Ber. 1992, 211
57 Bates P. S., Kataky R., Parker D. J., J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1993, 691
58 Bates P. S., J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1992, 153
59 Gibson A. R., Melton L. D., Slessor K. N., Can. J. Chem. 1974, 52, 3905
60 Irie T., Fukunaga K., Pitha J., Uekama K., Fales H. M., Sokolowski E. A., Carbohydr. Res.
1989, 192, 167
61 Bergeron R., Melley M. P., Machida Y., Bioorg. Chem. 1976, 5, 121
62 Hirayama F., Kurihara M., Horiuchi Y., Utuski T., Uekama K., Yamasaki M., Pharm. Res.
1993, 10, 208
63 Armstrong D. W., Chang C. J., J. Agric. Food Chem. 1990, 38, 1674
64 Armstrong D. W, Li W., Anal. Chim. Acta 1990, 234, 365
65 Bates P. S., Parker D., Patti A. F., J. Chem. Soc., Perkin Trans 2 1994, 657
258

66 Guillo F., Hamelin B., Jullien L., Canceill J., Lehn J.-M., De Robertis L., Driguez H., Bull.
Soc. Chim. Fr. 1995, 132, 857-866
67 Parrot-Lopez H., Ling C.-C., Zhang P., Baszkin A., Abrecht G., Rango C. D., Coleman A.
W., J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 5479-5480
68 Parazak D. P., Khan A. R., D’Souza V. T., Stine K. J., Langmuir 1996, 12, 4046
69 Baer H. H., Berenguel A. V., Carbohydr. Res. 1992, 228, 307-314
70 Ling C.-C., Darcy R., Risse W., J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1993, 438-439
71 Chmurski K., Coleman A. W., Jurezak J., J. Carbohydr. Chem. 1996, 15, 787
72 Kawabata Y., Matsumoto M., Tanaka M., Takahashi H., Irinatsu Y., Tamura S., Tagaki W.,
Nakahara H., Chem. Lett. 1986, 1933-1934
73 Peroche S., Parrot-Lopez H., Tetrahedron Lett. 2003, 44(2), 241-245
74 De Robertis L., Lancelon-Pin C., Driguez H., Attioui F., Bonaly R., Marsura A., Bioorg.
Med. Chem. Lett. 1994, 4(9), 1127-1130
75 Ashton P. R., Königer R., Stoddart J. F., J. Org. Chem. 1996, 61, 903-908
76 Von W. Lautsch, Wiechert R., Lehmann H., Kolloid-Ztg. 1954, 135, 134
77 Umezawa S., Tatsuta K., Bull. Chem. Soc. Jpn. 1968, 41, 464-468
78 Cramer F., Mackensen G., Sensse K., Chem. Ber. 1969, 102, 494
79 Breslow R., Czarniecki M. F., Emert J., Hamagushi H., J. Am. Chem. Soc. 1980, 102, 762-
770
80 Ashton P. R., Elwood P., Staton I., Stoddart J. F., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1991, 1, 80-
81
81 Ashton P. R., Elwood P., Staton I., Stoddart J. F., J. Org. Chem. 1991, 56, 7274-7280
259

82 Yamamura H., Ezuka T., Kawase Y., Kawai M., Butsugan Y., Fujita K., J. Chem. Soc.,
Chem. Commun. 1993, 636-637
83 Yamamura H., Kawase Y., Kawai M., Butsugan Y., Bull. Chem. Soc. Jpn. 1993, 66, 585-
588
84 Tsujihara K., Kurita H., Kawazu M., Bull. Chem. Soc. Jpn. 1977, 50(6), 1567-1571
85 Takeo K., Sumimoto T., Kuge T., Staerke 1974, 24, 111-118
86 Gadelle A., Defaye J., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1991, 1, 78-80
87 Kahn A. R., D’Souza V. T., J. Org. Chem. 1994, 59, 7492-7495
88 Gorin B. I., Riopelle R. J., Thatcher G. R.J., Tetrahedron Lett. 1996, 37(27), 4647-4650
89 Chmurski K., Defaye J., Tetrahedron Lett. 1997, 38(42), 7365-7368
90 Chmurski K., Defaye J., Supramol. Chem. 2000, 12, 221-224
91 Zhang P., Ling C.-C., Coleman A. W., Parrot-Lopez H., Galons H., Tetrahedron Lett. 1991,
32(24), 2769-2770
92 Coleman A. W., Zhang P., Ling C.-C., Mahuteau J., Parrot-Lopez H., Miocque M.,
Supramol. Chem. 1992, 1
93 Kahn A. R., Barton L., D’Souza V. T., J. Org. Chem. 1996, 61, 8301
94 Ashton P. R., Boyd S. E., Gattuso G., Hartwell E. Y., Köeniger R., Spencer N., Stoddart J.
F., J. Org. Chem. 1995, 60, 3898
95 Kahn A. R., Tong W., D’Souza V. T., Supramol. Chem. 1995, 4, 243
96 Alker D., Ashton P. R., Harding V. D., Königer R., Stoddart J. F., White A. J.P., Williams
D. J., Tetrahedron Lett. 1994, 35(48), 9091-9094
97 Coleman A. W., Zhang P., Parrot-Lopez H., Ling C.-C., Miocque M., Mascrier L.,
Tetrahedron Lett. 1991, 32, 3997
260

98 Murakami Y., Kikuchi J., Hisaeda Y., Yayashida O., Chem. Rev. 1996, 96, 721
99 Melton L. D., Slessor K. N., Carbohydr. Res. 1971, 18, 29-37
100 Ueno A., Breslow R., Tetrahedron Lett. 1982, 23, 3451
101 Tsujihara K., Kurita H., Kawazu M., Bull. Chem. Soc. Jpn. 1977, 50, 1567
102 Lainé V., Coste-Sarguet A., Gadelle A., Defaye J., Perly B., Djedaïni-Pilard F., J. Chem.
Soc., Perkin Trans 2 1995, 1479-1487
103 Defaye J., Perly B., Gadelle A., Descamps V., Coste-Sarguet A., Brevet CNRS-CEA FR
9400778, 1994, Chem. Abstr. 1995, 123, 322100y
104 Fikes L. E., Winn D. T., Sweger R. W., Johnson M. P., Czarnik A. W., J. Am. Chem. Soc.
1992, 114, 1493-1495
105 Petter R. C., Salek J. S., Sikorski C. T., Kumaravel G., Lin F. T., J. Am. Chem. Soc. 1990,
112, 3860-3868
106 Lin J., Creminon C., Perly B., Djedaïni-Pilard F., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2 1998,
2639-2646
107 Hanessian S., Benalil A., Laferriere C. J., J. Org. Chem. 1995, 60, 4786-4797
108 Yockot D., Moreau V., Demailly G., Djedaïni-Pilard F., Org. Biomol. Chem. 2003, 1,
1810-1818
109 Djedaïni-Pilard F., Désalos J., Perly B., Tetrahedron Lett. 1993, 34(15), 2457-2460
110 Péan C., Créminon C., Wijkhuijen A., Grassi J., Guenot P., Jéhan P., Dalbiez J.-P., Perly
B., Djedïni-Pilard F., J. Chem. Soc., Perkin Trans 2 2000, 853-863
111 Bellanger N., Perly B., J. Mol. Struct. 1992, 215-226
112 Nelles G., Weisser M., Back R., Wohlfart P., Wenz G., Mittler-Neher S., J. Am. Chem.
Soc. 1996, 118, 5039-5046
261

113 Sallas F., Leroy P., Marsura A., Nicolas A., Tetrahedron Lett. 1994, 35(33), 6079-6082
114 Martin K. A., Czarnik A. W., Tetrahedron Lett. 1994, 35(37), 6781-6782
115 Yoon J., Hong S., Martin K. A., Czarnik A. W., J. Org. Chem. 1995, 60, 2792-2795
116 Cornwell M. J., Huff J. B., Bienarz C., Tetrahedron Lett. 1995, 36(46), 8371-8374
117 Yi G., Bradshaw J. S., Rossiter B. E., Malik A., Li W., Lee M. L., J. Org. Chem. 1993, 58,
4844-4850
118 Gao X.-M., Tong L.-H., Inoue Y., Tai A., Synth. Commun. 1995, 25(5), 703-710
119 Petter R. C., Salek J. S., J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 7897-7899
120
Djedaïni-Pilard F., Gosnat M., Steinbruckner S., Dalbiez J.-P., Crini G., Perly B, Gadelle
A., Proc. Int. Symp. Cyclodextrins, 9 th , Santiago de Compostella : Spain, Kluwer Eds., 1998,
73-76
121 Brady B., Lynam N., O’Sullivan T., Ahern C., Darcy R., Org. Synth. 2000, 220-224
122 Djedaïni-Pilard F., Azaroual-Bellanger N., Gosnat M., Vernet D., Perly B., J. Chem. Soc.,
Perkin Trans 2 1995, 723-730
123 Palin R., Simon J. A. G., Prosser A. B., Zhang M.-Q., Tetrahedron Lett. 2001, 42, 8897-
8899
124 Defaye J., Crouzy S., Evrard N., Law, Ho., PCT Int. Appl. 1999, 25pp, WO9961483, CAN
132:24077
125
van Dienst E. V., Snellink B. H. M., von Piekartz I., Gansey, M. H. B. G., Venema F.,
Feiters M. C., Nolte R. J. M., Engbersen J. F. J., Reinhoudt D. N., J. Org. Chem 1995, 60,
6537
126 Teranishi K., Ueno F., J. Incl. Phenom. Macro. Chem. 2002, 44(1-4), 307-311
127 Fujita K., Matsunaga A., Imoto T., Tetrahedron Lett. 1984, 25, 5533
262

128
(a) Tabushi I., Shimkawa K., Shimizu N., Shirakata H. Fujita K., J. Am. Chem. Soc. 1976,
98, 7855 ; (b) Tabushi I., Shimkawa K., Fujita K., Tetrahedron Lett. 1977, 18, 1527 ; (c)
Tabushi I., Kuroda Y., Yokota K., Yuan L.C., J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 711
129 Tabushi I., Yuan L.C., Fujita K., Tetrahedron Lett. 1977, 18, 2503
130 Cucinotta V., D’Alessandro F., Impellizzeri G., Vecchio G., Carbohydr. Res. 1992, 224,
95
131 Breslow R., Canary J. W., Varney M., Waddell S. T., Yang D., J. Am. Chem. Soc. 1990,
112, 5212
132 Teranishi K., J. Incl. Phenom. Macro. Chem. 2002, 44(1-4), 313-316
133 Pearce A. J., Sinaÿ P., Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39(20), 3610-3612
134 Wang W., Pearce A. J., Zhang Y., Sinaÿ P., Tetrahedron: Asymmetry 2001, 12, 517-523
135 De Roizel B., Baltaze J.-P., Sinaÿ P., Tetrahedron Lett. 2002, 43, 2371-2373
136 Cottaz S., Apparu C., Driguez H., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 1991, 2235
137 Kawabata Y., Matsumoto M., Tanaka M., Takahashi H., Irinatsu Y., Tamura S., Tagaki
W., Nakahara H., Fukuda K., Chem. Lett. 1986, 1933-1934
138 Kawabata Y., Matsumoto M., Nakamura T., Tanaka M., Manda E., Takahashi H., Tamura
S., Tagaki W., Nakahara H., Fukuda K., Thin Solid Films 1988, 159, 353-358
139 Nakahara H., Tanaka H., Fukuda K., Matsumoto M., Tagaki W., Thin Solid Films 1996,
284/285, 687-690
140 Tanaka M., Azumi R., Tachibana H., Nakamura T., Kawabata Y., Matsumoto M.,
Miyasaka T., Tagaki W., Nakahara H., Fukuda K., Thin Solid Films 1994, 244, 832-835
141 Parazak D. P., Kahn A. R., D'Souza V. T., Stine K. J., Langmuir 1996, 12, 4046-4049
263

142
Tanaka M., Ishizuka Y., Matsumoto M., Nakamura T., Yabe A., Nakanishi H., Kawabata
Y., Takahashi H., Tamura S., Tagaki W., Nakahara H., Fukuda K., Chem. Lett. 1987, 1307-
1310
143 Yabe A., Kawabata Y., Niino H., Tanaka M., Ouchi A., Takahashi H., Tamura S., Tagaki
W., Nakahara H., Fukuda K., Chem. Lett. 1988, 1-4
144 Yabe A., Kawabata Y., Niino H., Tanaka M., Matsumoto M., Ouch i. A., Takahashi H.,
Tamura S., Tagaki W., Nakahara H., Fukuda K., Thin Solid Films 1988, 160, 33-41
145 Niino H., Yabe A., Ouchi A., Tanaka M., Kawabata Y., Tamura S., Miyasaka T., Tagaki
W., Nakahara H., Fukuda K., Chem. Lett. 1988, 1227-1230
146 Matsumoto M., Tanaka M., Azumi R., Tachibana H., Nakamura T., Kawabata Y.,
Miyasaka T., Tagaki W., Nakahara H., Fukuda K., Thin Solid Films 1992, 210/211, 803-805
147 Taneva S., Ariga K., Okahata Y., Tagaki W., Langmuir 1989, 5, 111-113
148 Taneva S., Ariga K., Tagaki W., Okahata Y., J. Colloid Interface Sci. 1989, 131, 561-566
149 Niino H., Miyasaka H., Akihiko O., Kawabata Y., Yabe A., Miyasaka T., Tagaki W.,
Nakahara H., Fukuda K., Thin Solid Films 1989, 179, 53 -57
150 Fukuda K., Shibasaki Y., Nakahara H., Tagaki W., Takahashi H., Tamura S., Kawabata
Y., Thin Solid Films 1992, 210/211, 387-389
151 Ling C.-C., Darcy R., Risse W., J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1993, 438-439
152 Ravoo B. J., Darcy R., Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39(23), 4324-4326
153 Darcy R., Penkler L. J., Ravoo B. J., PCT IPN WO 01/83564 A1, 2001
154 Mazzaglia A., Ravoo B. J., Darcy R., Gambadauro P., Mallamace F., Langmuir 2002, 18,
1945-1948
155 Mazzaglia A., Donohue R., Ravoo B. J., Darcy R., Eur. J. Org. Chem 2001, 1715-1721
156 Donohue R., Mazzaglia A., Ravoo B. J., Darcy R., Chem. Commun. 2002, 2864-2865
264

157 Mazzaglia A., Scolaro L. M., Darcy R., Donohue R., Ravoo B. J., J. Inclusion Phenom.
Macrocycl. Chem. 2002, 44, 127-132
158 Sortino S., Petralia S., Darcy R., Donohue R., Mazzaglia A., New J. Chem. 2003, 27,
602-608
159 Nicolis I., Coleman A. W., Charpin P., Villain F., Zhang P., Ling C.-C., de Rango C.,
J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 11596-11597
160 Kaselouri A., Munoz M., Parrot-Lopez H., Coleman A. W., Polish J. Chem. 1993, 67,
1981-1985
161 Alexandre S., Coleman A. W., Kasselouri A., Valleton J. M., Thin Solid Films 1996, 284-
285, 765-768
162 Chmurski K., Coleman A. W., Jurczak J., J. Carbohydr. Chem. 1996, 15, 787
163 Chmurski K., Bilewicz R., Jurczak J. Langmuir 1996, 12, 6114-6118
164 Dodziuk H., Chmurski K., Jurczak J., Komiski W., Lukin O., Sitkowski J., Stefaniak L.,
J. Mol. Struct. 2000, 519, 33-36
165 Granger C. E., Félix C. P., Parrot-Lopez H. P., Langlois B. R., Tetrahedron Lett. 2000, 41,
9257-9260
166 Memiolu E., Bochot A., en M., Charon D., Duchêne D., Atilla Hincal A., J. Pharm.
Sci. 2002, 91(5), 1214-1224
167 Ringard-Lefebvre C., Bochot A., Memiolu E., Charon D., Duchêne D., Baszkin A., Coll.
Surf. B Biointerf. 2002, 25, 109-117
168 Memiolu E., Bochot A., en M., Duchêne D., Atilla Hincal A., Int. J. Pharm. 2003, 251,
143-153
169 Memiolu E., Bochot A., Özalp M., en M., Duchêne D., Atilla Hincal A., Pharm. Res.
2003, 20(1), 117-125
265

170 Zhang P., Ling C.-C., Coleman A. W., Parrot-Lopez H., Galons H., Tetrahedron Lett.
1991, 32(24), 2769-2770
171 Zhang P., Parrot-Lopez H., Tchoreloff P., Baszkin A., Ling C.-C., de Rango C., Coleman
A. W., J. Phys. Org. Chem. 1992, 5, 518 - 528
172 Schalchli A., Benattar J. J., Tchoreloff P. C., Zhang P., Coleman A. W., Langmuir 1993, 9,
1968-1970
173 Tchoreloff P. C., Boissonnade M. M., Coleman A. W., Baszkin A., Langmuir 1995, 11,
191-196
174 Gulik A., Delacroix H., Wouessidjewe D., Skiba M., Langmuir 1998, 14, 1050-1057
175 Skiba M., Duchêne D., Puisieux F., Wouessidjewe D., Int. J. Pharm. 1996, 129, 113-121
176 Skiba M., Wouessidjewe D., Puisieux F., Duchêne D., Gulik A., Int. J. Pharm. 1996, 142,
121-124
177 Lemos-Senna E., Wouessidjewe D., Lesieur S., Duchêne D., Int. J. Pharm. 1998, 170,
119-128
178 Duchêne D., Ponchel G., Wouessidjewe D., Adv. Drug Del. Rev. 1999, 36, 29-40
179 Munoz M., Deschenaux R., Coleman A. W., J. Phys. Org. Chem. 1999, 12, 364-369
180 Parrot-Lopez H., Ling C.-C., Zhang P., Baszkin A., Albrecht G., de Rango C., Coleman A.
W., J. Am. Chem Soc. 1992, 114, 5479-5480
181 Godinez L. A., Lin J., Munoz M., Coleman A. W., Rubin S., Parikh A., Zawodzinski A.,
Jr., Loveday D., Ferraris J. P., Kaifer A. E., Langmuir 1998, 14, 137-144
182 Kasselouri A., Coleman A. W., Baszkin A., J. Colloid Interface Sci. 1996, 180, 384 - 397
183 Kasselouri A., Coleman A. W., Albrecht G., Baszkin A., J. Colloid Interface Sci. 1996,
180, 398 - 404
266

184 Dubes A., Bouchu D., Lamartine R., Parrot-Lopez H., Tetrahedron Lett. 2001, 42, 9147-
9151
185 Sukegawa T., Furuike T., Niikura K., Yamagishi A., Monde K., Nishimura S., Chem.
Commun. 2002, 430-431
186 Skiba M., Skiba-Lahiani M., Arnaud P., J. Inclusion Phenom. Macrocycl. Chem. 2002, 44,
151-154
187 Jullien L., Lehn J.-M., Tetrahedron Lett. 1988, 29, 3803-3806
188 Canceill J., Jullien L., Lacombe L., Lehn J.-M., Helv. Chim. Acta 1992, 75, 791-812
189 Jullien L., Lehn J.-M., J. Inclusion Phenom. Mol. Recognit. Chem. 1992, 12, 55-74
190 Pregel M. J., Jullien L., Lehn J.-M., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1992, 31(12), 1637-1640
191 Greenhall M. H., Lukes P., Kataky R., Agbor N. E., Badyal J. P. S., Yarwood J., Parker D.,
Petty M. C., Langmuir 1995, 11, 3997-4000
192 Petter R. C., Salek J. S., J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 7897-7899
193 Bellanger N., Perly B., J. Mol. Struct. 1992, 273, 215-226
194 Auzély-Velty R., Perly B., Taché O., Zemb T., Jéhan P., Guenot P., Dalbiez J.-P.,
Djedaïni-Pilard F., Carbohydr. Res. 1999, 318, 82-90
195 Auzély-Velty R., Djedaïni-Pilard F., Perly B., Fr. 99-05460, 29-04-1999
196 Auzély-Velty R., Djedaïni-Pilard F., Désert S., Perly B., Zemb T., Langmuir 2000, 16,
3727
197 Auzély-Velty R., Péan C., Djedaïni-Pilard F., Zemb T., Perly B., Langmuir 2001, 17, 504-
510
198 Javierre I., Nedyalkov M., Petkova V., Benattar J.-J., Weisse S., Auzély-Velty R.,
Djedaïni-Pilard F., Perly B., J. Colloid Interface Sci. 2002, 254, 120-128
267

199 Roux M., Auzély-Velty R., Djedaïni-Pilard F., Perly B., Biophys. J. 2002, 82, 813-822
200 Weisse S., Thèse de doctorat de l’université Paris XI, 2002
201 Perroche S., Parrot-Lopez H., Tetrahedron Lett. 2003, 44, 241-245
202 Knouzy N., Thèse d’état de l’université de Rennes I 1975
203 Caron I., Elfakir C., Dreux M., J. Liq. Chrom. & Rel. Technol. 1997, 20(7), 1015-1035
204 Jeener J., Ampere International Summer SchoolBasko Polje Yugoslavia 1971
205 Bax A., Freeman R., J. Magn. Reson. 1981, 44, 542
206 Wagner G., J. Magn. Reson. 1983, 55, 151
207 Bax A., Griffey R. H., Hawkins B. L., J. Magn. Reson. 1983, 55, 301
208 Bengsch E., Perly B., Deleuze C., Valero A., J. Magn. Reson. 1986, 68, 1-13
209 Jeener J., Meier B. H., Ernst R. R., J. Chem. Phys. 1979, 71, 4546-4553
210 Bax A., Davis D. G., J. Magn. Reson. 1985, 65, 355-360
211 Neuhaus D., Keeler J., J. Magn. Reson. 1986, 68, 568-574
212 Farmer II B. T., Macura S., Brown L. R., J. Magn. Reson. 1987, 72, 347-352
213 Desvaux H., Berthault P., Birlirakis N., Goldman M., C. R. Acad. Sci. Paris 1993, 317(II),
19-25
214 Desvaux H., Berthault P., Birlirakis N., Goldman M., Piotto M., J. Magn. Reson. Ser. A
1995, 113, 47-52
215 Hwang T-L., Shaka A. J., J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 3157-3159
216 Hwang T-L., Shaka A. J., J. Magn. Reson. Ser. B 1993, 102, 155-165
217 Spencer C. M., Stoddart J. F., Zarzycki R., J. Chem. Soc., Perkin Trans 2 1987, 1323
268

218 Deleu M., Paquot M., Bleker C. In Encyclopedia of Surface Science; Hubbard A. T. Ed.;
Marcel Dekker, Inc.: New York, 2002, vol. 4, 5119-5126
219 Wilhelmy L., Ann. Physik 1863, 119, 117
220 Espinat D., Revue de l’Institut Français du Pétrole 1990, 45(6), 775-820
221 Ernst R. R., Angew. Chem. Int. Ed. 1992, 31(7), 805-823
222 Job P., Compt. Rend. Acad. Sci. Paris 1925, 180, 928-930
223 Job P., Ann. Chim. 1928, 9, 113-203
224 Benesi H. A., Hildebrand J. H., J. Am. Chem. Soc. 1949, 71, 2703-2707
225 Hanna M. W., Ashbaugh A. L., J. Phys. Chem. 1964, 68, 811-816
226 Mathur R., Becker E. D., Bradley R. B., Li N. C., J. Phys. Chem. 1963,67, 2190-2194
227 Fielding L., Tetrahedron 2000,56, 6151-6170
228 Djedaïni F., Thèse de doctorat de l’université de Paris XI 1990
229 Höfler Th., Wenz G., J. Inclusion Phenom. Mol. Recognit. Chem. 1996, 25, 81-84
230 Lin J., Thèse de doctorat de l’université de Paris VI 1995
231 Mysels K., Shinoda K., Frankel S., Soap Films, Pergamon: New York, 1959
232 Exerowa D, Kruglyakov P. M., Foam and Foam Films: Theory, Experiment, Application,
Studies in Interface Science, vol. 5, Elsevier: Amsterdam, 1998
233 Belorgey O., Benattar J.-J., Phys. Rev Lett. 1991, 66, 313-316.
234 Cuvillier N., Millet F., Petkova V., Nedyalkov M., Benattar J.-J., Langmuir 2000, 16, 5029
235 Javierre I., Nedyalkov M., Petkova V., Benattar J.-J., Weisse S., Auzély-Velty R.,
Djedaïni-Pilard F., Perly B., J. Colloid Interface Sci. 2002, 254, 120-128
269

236 Aree T., Hoier H, Schulz B., Reck G., Saenger W., Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39, 897-
899
237 Starikov E. B., Bräsicke K., Knapp E. W., Saenger W., Chem. Phys. Lett. 2001, 336, 504-
510
238 Germain P., Bilal M., de Brauer C., Thermochim. Acta 1995, 259, 187-198
239 Smith I. C. P., Eikel I., Phosphorus-31 NMR, principles and application, Ed. D.
Gorenstein, Academic Press: New York, 1984, p447
240 Kohler S. G., Klein M. P., Biochemistry 1976, 18, 967
241 Griffin R. G., Powers L., Pershan P. S., Biochemistry 1978, 17, 2718
242 Seelig J., Biochim. Biophys. Acta 1978, 515, 105
243 Taylor P. C., Baugher J. F., Kriz H. M., Chem. Rev. 1975, 75, 203
244 Djedaïni-Pilard F., Nevers M.-C., Weisse S., Grassi J., Perly B., Créminon C., Carbohydr.
Res., sous presse
245 Créminon C., Djedaïni-Pilard F., Grassi J., Perly B., Pradelles P., Carbohydr. Res. 1994,
258, 179-186
246 Créminon C., Djedaïni-Pilard F., Vienet R., Péan C., Grognet J.-M., Grassi J., Perly B.,
Pradelles P., Pharm. Res. 1999, 16(9), 1407-1411
247 Lapatsanis L., Milias G., Froussios K., Kolovos M., Synthesis 1983, 671-673
248 Hachisako H., Murata Y., Ihara H., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2 1999, 2569-2577
249 Lajoie G., Crivici A., Adamson G., Synthesis 1990, 571-572
250 Köhler G., Milstein C., Nature 1975, 256, 495-497
251 Hoogenraad N. J., Wraight, C. J., Methods in immunology 1986, 121, 375-381
270

252 Ellman G., Courtney K., Andres V., Featherstone R., Biochem. Pharmacol. 1961, 7, 88-95
253 McLaughlin L. L., Wei Y., Stockman P. T., Leahy K. M., Needleman P., Grassi J.,
Pradelles P., Biochem Biophys. Res. Commun. 1987, 144, 469-476
254 Grassi J., Robert Y., Pradelles P., Chercuitte D., Gruaz D., Dayer J. M., Poubelle P., J.
Immunol. Methods 1989, 123, 193-210
255 Ellman G. L., Arch. Biochem. Biophys. 1959, 82, 70-77
256 Massoulié J., Bon S., Eur. J. Biochem. 1976, 68, 531-539
257 Abraham G., Acta Andocrinol. 1974, 183, 1
258 Davis J. H., Jeffrey K. R., Bloom M., Valic M. L., Higgs T. P., Chem. Phys. Lett. 1976, 44,
390-394
259 Sternin E., Bloom M., MacKay A. L., J. Magn. Reson. 1983, 55, 274-282
271

Résumé :
Depuis plusieurs années, une attention spéciale a été portée sur la synthèse de cyclodextrines
amphiphiles afin de les utiliser comme de nouveaux matériaux supramoléculaires ou pour les insérer
dans des matrices phospholipidiques préformées telles que des liposomes. Dans les deux cas, le but est
de combiner la spécificité de taille de la cavité des CDs pour l’inclusion et la solubilisation de petites
molécules hydrophobes, et les propriétés de transport de structures organisées lipidiques (vésicules,
liposomes, micelles,…). L’objectif est d’obtenir des composés pour le transport et/ou la vectorisation
de composés biologiquement actifs.
Dans un premier temps, une nouvelle famille de CDs amphiphiles a été préparée en greffant un
phospholipide : le 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DMPE) sur une cyclodextrine
méthylée ou non par l’intermédiaire d’un bras espaceur. Les composés obtenus (les phospholipidylcyclodextrines)
ont été entièrement caractérisés par RMN et spectrométrie de masse haute résolution.
Les dérivés méthylés s’auto-organisent spontanément dans l’eau à de faibles CMC pour former des
fibres micellaires fluctuantes. Le pouvoir d’inclusion de la cavité des CDs est préservé au sein de ces
objets supramoléculaires. Les interactions de ces molécules avec les systèmes membranaires ont été
étudiées sous forme de films noirs, par réflectivité de rayons X et par l’évaluation de leur pouvoir
détergent vis-à-vis des membranes modèles de DMPC. La capacité de ces composés à passer la
barrière hémato-encéphalique a été mise en évidence par une nouvelle approche utilisant les dosages
immunoenzymatiques.
Dans un second temps, nous avons synthétisé une autre catégorie de CDs amphiphiles, les
peptidolipidyl-cyclodextrines, mimant les caractéristiques structurales des phospholipidylcyclodextrines
tout en s’affranchissant des contraintes liées à la synthèse et à la stabilité des
phospholipides. Ces composés ont été entièrement caractérisés et leurs propriétés d’organisation ont
été évaluées par des mesures de CMC d’une part, et par l’étude par RMN du deutérium d’une phase
lamellaire mixte peptidolipidyl--CD / DMPC unique et homogène d’autre part. Cette dernière famille
de composés apparaît comme très prometteuse pour la préparation de formulations galéniques à base
de CDs.
Mots clés : cyclodextrines, phospholipides, glycoconjugués, amphiphiles, chimie supramoléculaire,
RMN, applications biologiques.
Abstract :
Since a number of years, special attention and efforts have been made to prepare amphiphilic
cyclodextrins (CDs) with the objective to use them to obtain supramolecular assemblies as such or in
the presence of preformed lipidic structures. The aim of these investigation is in both cases to combine
the size specificity of cyclodextrins for guests and the transport properties of phospholipidic structures.
The final objects could be of importance to transport or target biologically relevant molecules such as
drugs using new galenic formulations. In a first step, a new family of amphiphilic CDs was prepared
from a pure phospholipids (DMPE) onto cyclodextrins or methylated derivatives through a spacing
arm. The afforded compounds (phospholipidyl-cyclodextrins) were fully characterized by high field
NMR and high resolution mass spectrometry. The methylated derivatives were shown to self-organize
in water with low CMC to form fluctuating micellar fibers retaining the inclusion capacity of the
cyclodextrin cavities. The interactions of these compounds with membrane systems were investigated
as black films using X-ray reflectivity and by evaluation of their detergent power towards model
DMPC liposomes. Their ability to cross over the Blood Brain Barrier was evidenced by a new
approach making use of novel immuno-enzymatic assays. In a second step, a new class of amphiphilic
cyclodextrins was considered (peptidolipidyl-cyclodextrins). Although they are structurally similar to
phospholipidyl-CDs, their preparation overcomes the tedious steps of the later and lead to a
considerable versatility in terms of the number of possible molecules to be prepared. Moreover, the
stability problems encountered with phospholipids are avoided. Several examples have been prepared,
fully characterized and their organization properties investigated by the determination of CMC and by
deuterium NMR on a pure and homogeneous mixed peptidolipidyl-CD / DMPC lamellar phase. This
novel class of amphiphilic CDs appears as very promising candidates to develop new galenic
formulations.
Key-words : cyclodextrins, phospholipids, glycoconjugate, amphiphilic, supramolecular chemistry,
NMR, biological applications.