Philippe DELANNOY - EPHE

MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE
ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES
Sciences de la Vie et de la Terre
MEMOIRE
présenté
par
Philippe DELANNOY
pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes
Expression et rôle de la N-cadhérine dans la différenciation
ostéoblastique et l'ostéogenèse
devant le jury suivant suivant :
Soutenu le : 5 Octobre 2001
Laboratoire E.P.H.E : Laboratoire de Pharmacologie Cellulaire et Moléculaire.
Professeur Jean CHAMBAZ, sophie.thenet-u505@bhdc.jussieu.fr
Centre de Recherches Biomédicales des Cordeliers
15, rue de l’école de Médecine 75006 PARIS
Laboratoire d’accueil : INSERM U349, Biologie et Pathologique de l'Os.
Monsieur le Docteur Bernard LACOUR - Président
Madame le Docteur Sophie THENET - Rapporteur
Madame le Docteur Elisabeth LAJEUNIE - Examinateur
Monsieur le Docteur Pierre MARIE - Examinateur
EPHE Banque de Monographies SVT 1

Docteur Pierre MARIE, pierre.marie@inserm.lrb.ap-hop-paris.fr
2, Rue Ambroise Paré 75010 PARIS
ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES
Sciences de la Vie et de la Terre
EXPRESSION ET ROLE DE LA N-CADHERINE DANS LA
DIFFERENCIATION OSTEOBLASTIQUE ET L'OSTEOGENESE
Philippe DELANNOY
Soutenance le : 5 Octobre 2001
RESUME
Les interactions cellulaires jouent un rôle essentiel dans l'induction de la différenciation ostéoblastique. C'est
pourquoi, il est important d'identifier le type de protéines d'adhésion cellulaire (cadhérine en particulier) qui peuvent jouer un
rôle initial dans l'ostéogenèse et de déterminer la régulation de ces protéines.
L'objectif de ce travail est d'identifier le type de cadhérine exprimé in vivo et in vitro par les cellules
ostéoblastiques humaines en lien avec les caractéristiques phénotypiques de ces cellules, de déterminer si ces cadhérines sont
impliquées dans l'ostéogenèse normale ou pathologique (syndrome Apert), et d'identifier le rôle de la PKC dans le contrôle de
l'adhésion intercellulaire et la différenciation ostéoblastique.
Le syndrome d'Apert induit une augmentation de la différenciation cellulaire in vitro et in vivo sans modification
de la prolifération cellulaire. L'expression de la N-cadhérine et de la E-cadhérine est plus forte dans les cellules Apert que
dans les cellules normales. Ces résultats nous montre que l'expression de la N-cadhérine et de la E-cadhérine est associée à
une augmentation de la différenciation ostéoblastique.
Les variations de l'expression de la N-cadhérine ont été également étudiées sous l'effet d'un agent connu pour
activer la PKC dans une lignée d'ostéoblastes de calvaria humaine et immortalisés. Le phorbol ester en activant la PKC a pour
effet d'augmenter l'expression de la N-cadhérine et la différenciation ostéoblastique. De plus, un test d'agrégation permet de
préciser que cette augmentation de la N-cadhérine se traduit par une augmentation fonctionnelle de l'agrégation cellulaire.
En conclusion, l'ensemble de ces données montre le rôle important de la PKC dans l'induction de l'adhésion
cellules-cellules et dans la différenciation cellulaire induite par la N-cadhérine dans les cellules ostéoblastiques humaines.
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Mots-Clefs : N-cadhérine, Apert, différenciation, ostéoblaste, PKC
1) Le tissu osseux
INTRODUCTION
L’os est un tissu conjonctif très spécialisé formant, avec le cartilage, le squelette. Il est constitué de cellules et d’une
matrice extracellulaire qui a la particularité de se minéraliser. Le tissu osseux est mis en place dès la période fœtale et reste
sous le contrôle de facteurs hormonaux et locaux pendant toute la croissance. Ce tissu assure trois fonctions : une fonction
mécanique (support et site de fixation des muscles pour la locomotion), une fonction protectrice (des organes vitaux) et une
fonction métabolique par sa capacité à stocker et à relarguer un certain nombre d’éléments minéraux, principalement du
calcium et du phosphate, afin d’assurer l’homéostasie minérale.
Deux types d’os dans le squelette sont à distinguer. Ils dérivent de deux mécanismes histogénétiques différents : les os longs
(tels que tibia, fémur, humérus) dérivant d’une ossification endochondrale, dans laquelle l’os se forme à partir du
mésenchyme indifférencié par l’intermédiaire d’une maquette cartilagineuse ; et les os plats (os du crâne, omoplates) dérivant
d’une ossification membranaire, dans laquelle le tissu osseux se développe directement par différenciation du tissu
mésenchymateux embryonnaire (Uhthoff et coll., 1990 ; Larsen et coll., 1993).
- la diaphyse qui est un os compact très rigide (formé par une couche minéralisée dense et fine) creusé en son centre par la
cavité médullaire remplie de moelle osseuse,
- les métaphyses, situées sous la plaque de croissance, qui sont le siège de l’ossification endochondrale, responsable de la
croissance en longueur de l’os,
- et les épiphyses composées d’os spongieux (ou trabéculaires), recouvertes à l’extrémité par le cartilage articulaire.
Cette organisation fournit une surface externe (ou périoste, qui est une membrane recouvrant l’os complètement sauf au
niveau des épiphyses qui sont revêtues de cartilage hyalin) et une surface interne (ou endoste).
1.1) Structure osseuse chez l'adulte
1.1.1) Os cortical
Le squelette est contitué essentiellement d'os cortical (80 % à 90 %), formant la diaphyse des os longs et entourant
les os plats. Cet os est compact, 95 % de son volume étant occupé par la matrice osseuse (Marie 1998 ; Sims et Baron, 2000).
Ce type d'os est composé principalement de systèmes haversiens ou ostéons, unités structurales osseuses
cylindriques formant la trame essentielle de l'os compact et orientées parallèlement à l'axe principal de l'os. Les ostéons sont
constitués de lamelles concentriques de collagène entourant un canal central ; ils sont entourés d'os intersticiel plus ancien et
plus calcifié provenant de la résorption d'anciens ostéons. Les canaux haversiens peuvent être reliés entre eux par des canaux
latéraux : les canaux de Volkan. Ces derniers sont orientés perpendiculairement aux ostéons et permettent le passage de
vaisseaux sanguins et lymphatiques ainsi que de nerfs provenant du périoste.
L'organisation de l'os compact lui confère des propriétés fonctionnelles particulières : la rigidité de l'os cortical
résulte de l'arrangement compact des structures ostéonales maintenues entre elles par l'os intersticiel ; ses propriétés
d'élasticité résultent de l'apposition parallèle et alternée des fibres de collagène le long de l'axe principal de l'os et sa
résistance dépend de l'activité du processus de remodelage dans son ensemble.
1.1.2) Os spongieux
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L'os spongieux ou trabéculaire constitue 10 % à 20 % du squelette est situé au niveau des métaphyses et des épiphyses des os
longs et à la partie centrale des os plats ; cet os est constitué essentiellement de tissu hématopoïétique et pour 20 % de matrice
osseuse. La matrice osseuse est arrangée en travées de 150 à 200 m de diamètre, connectées entre elles. Ces travées
anastomosées forment un réseau tridimensionnel dont l'orientation est imposée par les forces mécaniques principales
s'exerçant sur l'os.
Les propriétés mécaniques de résistance à la compression de l'os trabéculaire dérivent de l'orientation et de la répartition des
travées osseuses. En dehors de ses fonctions d'ordre structural, l'os trabéculaire tient une place importante dans le contrôle de
l'équilibre phospho-calcique. L'étendue de l'os trabéculaire en contact avec la moelle osseuse est importante et permet une
mobilisation rapide du calcium de l'os calcifié.
Bien que l'os compact et l'os trabéculaire soient différents du point de vue de leur structure, l'activité cellulaire présidant à
leur renouvellement est qualitativement identique. Os cortical et os trabéculaire sont tous deux formés d'unités fonctionnelles,
correspondant aux canaux de Havers au niveau de l'os cortical, au niveau trabéculaires les sites de remodelage ne sont pas
constitués en tunnel mais sont disposés linéairement le long des travées.
Au sein de chacune de ces unités fonctionnelles se succèdent les différentes phases du remodelage osseux.
1.2) Le remodelage osseux
Le remodelage se caractérise par deux activités opposées, la formation d'os nouveau par les ostéoblastes, et la dégradation
(résorption) d'os ancien par les ostéoclastes et permet ainsi le maintien et le renouvellement permanent de la matrice osseuse.
Ces deux activités qui définissent le remodelage osseux sont étroitement couplées dans le temps et dans l'espace.
Ce processus est complexe et régulé de façon indépendante au niveau de chaque unité fonctionnelle de remodelage.
Il se caractérise par la succession de cinq phases (Marie, 1992) :
- Une phase d’activation, où les précurseurs mononucléés des ostéoclastes prolifèrent et fusionnent au niveau d’une
zone particulière de la surface osseuse destinée à être résorbée. Cette phase est probablement initiée par des facteurs
systémiques et locaux agissant directement sur les ostéoclastes et leurs précurseurs. Cependant, la nature des facteurs et les
mécanismes par lequels ces facteurs activent les préostéoclastes ne sont pas tous connus.
- Une phase de résorption, pendant laquelle l’ostéoclaste résorbe la matrice minéralisée, creusant une lacune de résorption.
- Une phase d’inversion, pendant laquelle les précurseurs ostéoblastiques prolifèrent et se différencient en ostéoblastes
matures. Le recrutement de ces cellules ostéogéniques serait dû à la libération de facteurs cellulaires et matriciels durant la
phase de résorption.
- Une phase de formation, pendant laquelle les ostéoblastes comblent la lacune de résorption en apposant une nouvelle
matrice collagénique. Le tissu ostéoïde sera ensuite minéralisé. La surface osseuse retourne alors dans un état latent. Cette
activité de formation dépend davantage du nombre d’ostéoblastes que de l’activité propre de chaque cellule.
1.3) Les cellules osseuses
Chez l’adulte, la matrice extracellulaire calcifiée est le siège d’un remodelage permanent, qui dépend de l’action
concertée des ostéoclastes et des ostéoblastes. L’intégration de la fonction de ces deux types cellulaires est nécessaire lors du
remodelage osseux qui a lieu pendant la croissance de l’os, pour le maintien qualitatif et quantitatif du squelette durant la vie
adulte, pour réparer l’os après un traumatisme ou une fracture, et pour assurer l’homéostasie du calcium sérique de
l’organisme.
1.3.1) Les ostéoclastes
Les ostéoclastes différenciés sont des cellules géantes (de 50 à 200 m de diamètre) multinucléées (de 4 à 20
noyaux), étroitement associées à la matrice minéralisée et chargées de résorber l’os en formant des lacunes de résorption. Ces
cellules couvrent moins de 1 % de la surface osseuse chez le jeune adulte et ont une durée de vie très courte.
Les cellules ostéoclastiques sont polarisées, leurs noyaux sont apicaux, elles ont un appareil de Golgi très abondant
disposé autour de chaque noyau, et de nombreuses mitochondries et lysosomes. La zone de contact avec l’os est caractérisée
par une membrane cytoplasmique présentant de nombreux replis. L’ostéoclaste est une cellule très mobile et son attachement
sur la matrice se fait par l’intermédiaire de podosomes. La cellule ostéoclastique possède des protéines transmembranaires de
la famille des intégrines, pouvant lier les protéines adhésives synthétisées par les ostéoblastes et incorporées dans la matrice
osseuse : la thrombospondine, l’ostéopontine et la sialoprotéine osseuse (Helfrich et coll., 1992). L’ostéoclaste, fixé à la
matrice par ses podosomes, forme ainsi un microcompartiment entre la bordure plissée et l’os.
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Une fois fixé sur la matrice osseuse, l’ostéoclaste synthétise puis sécrète par sa bordure en brosse apicale plusieurs
types d’enzymes (dont la phosphatase acide). De plus, une acidification du microcompartiment par une pompe à protons
ATPasique de la membrane ostéoclastique induit une dissolution de la phase minérale de la matrice osseuse et permet à ces
différentes enzymes de dégrader complètement le collagène. Cette dégradation de la matrice entraîne une augmentation du
taux de calcium intracellulaire qui va provoquer une désorganisation des podosomes et par conséquent un détachement de
l’ostéoclaste.
1.3.2) Les ostéoblastes
Les ostéoblastes sont des cellules ostéoformatrices, responsables de la production des constituants de la matrice osseuse et de
sa minéralisation. Les cellules de la lignée ostéoblastique jouent un rôle important dans le contrôle du remodelage osseux, de
par leur capacité à synthétiser de nombreux facteurs de croissance (Marie, 1994).
a) Origine et différenciation des ostéoblastes
Les ostéoblastes ont pour origine une cellule souche mésenchymateuse présente principalement dans le stroma médullaire,
mais que l’on peut retrouver au niveau du périoste et de l’endoste. Ces cellules ostéogéniques du stroma médullaire
proviennent de la prolifération clonale de cellules souches pluripotentes pouvant donner naissance à des clones de cellules
adipeuses mésenchymateuses ou chondroblastiques après induction par des facteurs hormonaux et locaux. Ceci suggère
l’existence d’un précurseur commun aux chondroblastes, aux ostéoblastes aux adipocytes, aux myoblastes et aux fibroblastes
(Owen, 1988).
La différenciation des cellules précurseurs vers la voie ostéoblastique se caractérise in vitro par la succession :
- d'une phase de prolifération cellulaire, associée à l'expression de gènes précoces (oncogènes fos et myc, histone H4),
- puis d'une phase de maturation cellulaire caractérisée par l'induction de gènes associés à la production de la matrice
extracellulaire (phosphatase alcaline, collagène de type 1, TGF ß, fibronectine, ostéopontine), puis associés à sa minéralisation
(sialoprotéine osseuse, ostéocalcine) (Owen et coll., 1990 ; Machwate et coll., 1995 ; Aubin et Liu, 1996).
- les contacts cellule-cellules entre les ostéoblastes et les interactions entre les cellules et les protéines matricielles sont
importants pour l'expression du phénotye ostéoblastique. D’autre part, les protéines non collagéniques jouent un rôle dans
l’attraction et l’adhérence cellulaire (la fibronectine et l’ostéopontine, par exemple, favorisent l’adhésion cellulaire) et
pourraient ainsi être impliquées dans la régulation de l’activité fonctionnelle des cellules osseuses.
b) Marqueurs phénotypiques des ostéoblastes
Les ostéoblastes différenciés sont des cellules cuboïdales alignées le long de la matrice osseuse. Leur cytoplasme,
basophile, est riche en réticulum endoplasmique granulaire, en mitochondries et présente un appareil de Golgi très développé,
démontrant une activité de synthèse très importante. Les cellules préostéoblastiques ont le même aspect morphologique, mais
ne montrent pas d’activité de biosynthèse importante. Les ostéoblastes mâtures, en tant que cellules différenciées, ne se
divisent pas. A la fin de leur activité de synthèse, certains ostéoblastes sont englobés dans la matrice, et deviennent des
ostéocytes reliés entre eux et aux ostéoblastes par des jonctions cellulaires (Marie, 1992). D’autres cellules prennent un aspect
aplati le long de la nouvelle matrice et sont dites bordantes.
Les différents marqueurs caractéristiques du phénotype ostéoblastique au cours de la différenciation sont :
- une activité phosphatase alcaline. Celle-ci est précoce et apparaît dés le stade de précurseur ostéoblastique. Son activité se
traduit par l’hydrolyse des pyrophosphates inorganiques, qui sont des inhibiteurs de la calcification.
- le collagène de type I et l'ostéopontine : le collagène, essentiellement de type I, contitue 90 % de la matrice osseuse
organique. Il forme une trame fibrillaire, qui sera ensuite minéralisée. L'ostéopontine est une phosphoglycoprotéine qui n'est
pas spécifique de l'os. Elle comporte une séquence RGD et intervient dans la phase d'ancrage des ostéoblastes à la matrice
osseuse minéralisée. Son degré de phosphorylation pourrait moduler la mobilité des ostéoblastes à la surface de la matrice.
Lorsqu'elle est phosphorylée, elle inhibe la formation des cristaux d'hydroxyapatite et pourrait donc réguler le processus de
minéralisation de la matrice osseuse.
La sialoprotéine osseuse et l'ostéocalcine sont des marqueurs plus tardifs et ne sont exprimés que par les ostéoblastes
différenciés. La sialoprotéine osseuse est une phosphoglycoprotéine également synthétisée par les ostéoclastes. Elle a les
mêmes effets que l'ostéopontine sur les ostéoclastes, mais par contre favorise, in vitro, la formation et la nucléation de
cristaux d'hydroxyapatite. L'ostéocalcine est spécifique du tissu osseux et y existe en quantité abondante, représentant 15 à 25
% des protéines non collagèniques de l'os. Elle semble avoir un rôle chimiotactique pour les ostéoclastes et favoriser
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l'adhésion et l'étalement de ces cellules.
c) Fonction de l'ostéoblaste mature
La fonction essentielle de l'ostéoblaste mature est la synthèse, le dépôt et la minéralisation de la matrice osseuse
organique.
_ Production de la matrice osseuse (Malaval et coll., 1996)
La matrice ossseuse organique est constituée essentiellement de collagène de type I, de protéoglycanes, de protéines non
collagèniques et de facteurs de croissance.
L'ostéoblaste mature synthétise du collagène de type I, qui forme la majorité de la substance organique osseuse ; les
molécules de collagène s'assemblent dans le milieu extracellulaire en fibrilles après coupure enzymatique des propeptides C et
N terminaux. La stabilité et l'organisation des fibrilles de collagène assurent la rigidité nécessaire à la résistance aux forces de
compression tout en assurant une certaine élasticité. Un rôle important de la trame collagénique osseuse est de se lier aux
protéines non collagéniques et aux facteurs de croissance produits par l'ostéoblaste ; cette liaison assure leur stabilité
moléculaire.
L'ostéoblaste synthétise de nombreuses protéines non collagéniques qui se lient au collagène osseux. Certaines protéines
contiennent des résidus acides carboxyglutamiques (gla) dont la carboxylation est dépendante de la vitamine K : la "matix Gla
protein" (MGP), présente dans le cartilage et l'os immature et la "Bone Gla Protein" (BGP) ou ostéocalcine, spécifiquement
produite par les ostéoblastes et incorporée dans l'os mature. Certaines de ces protéines se caractérisent par la présence de la
séquence de trois acides aminés RGD, qui se lient aux récepteurs membranaires cellulaires (intégrines) et permettent
l'attachement cellulaire à la matrice : il s'agit de la fibronectine, de la thrombospondine et des sialoprotéines (ostéopontine,
sialoprotéine osseuse).
_ Minéralisation de la matrice
Le processus de minéralisation du tissu osseux dépend d'une part de la présence d'une structure matricielle extracellulaire, et
d'autre part d'une concentration adéquate en minéraux. La minéralisation de la matrice doit être initiée par un processus de
nucléation. Les cristaux sont ensuite disposés régulièrement et parallèlement aux fibres de collagène de la matrice. Le
collagène de type I est un site possible de nucléation ; certaines protéines telles que l'ostéocalcine et l'ostéonectine, ont une
forte affinité pour le calcium et pourraient contribuer à la minéralisation du collagène auquel elles sont associées.
1.4) Régulation de l'ostéogenèse
L'activité de formation osseuse dépend essentiellement du nombre de cellules ostéoblastiques plutôt que de
l'activité de chaque ostéoblaste (Marie, 1994). Un grand nombre d'hormones et de facteurs de croissance agissant au niveau
du recrutement et de la prolifération des cellules ostéoblastiques jouent donc un rôle essentiel dans le contrôle de la formation
osseuse.
1.4.1) La régulation hormonale
Les hormones peuvent avoir soit une action directe via des récepteurs spécifiques, soit une action indirecte en
augmentant la synthèse de facteurs locaux par les ostéoblastes. Ainsi l’hormone parathyroïdienne (PTH), la 1,25dihydroxyvitamine
D (1,25(OH)2D3) mais également les œstrogènes et l’hormone de croissance régulent la formation
osseuse.
1.4.2) La régulation par les facteurs de croissance et les cytokines
L’ostéogenèse est régulée par de nombreux facteurs de croissance produits par les cellules médullaires ou les
ostéoblastes. Certains de ces facteurs de croissance sont systémiques, d’autres sont locaux et peuvent être incorporés dans la
matrice osseuse (Marie, 1994 ; Marie et deVernejoul, 1996). Parmi ces facteurs de croisssance, on peut citer les "Fibroblast
Growth Factor "ou FGF, les "Transforming Growth Factor b"ou TGFb et "l’Insulin-Like growth Factor" ou IGF.
2) Développement du tissu osseux
Le développement des os composant le squelette comporte deux processus distincts (Sims et Baron, 2000).
2.1) Ossification endochondrale
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L'ossification endochondrale est un processus au cours de laquelle l'os se forme à partir du mésenchyme
indifférencié par l'intermédiaire d'une maquette cartilagineuse. La base du crâne, les vertèbres, les côtes et les os longs des
membres subissent ce processus d'ossification.
Le développement des os longs commence avec la condensation du mésenchyme formant tout d'abord un modèle
cartilagineux. Les cellules mésenchymateuses se divisent et se différencient en préchondroblastes puis en chondroblastes ; ces
derniers sécrètent la matrice cartilagineuse et sont progessivement emmurés dans la matrice à l'intérieur de lacunes puis
deviennent des chondrocytes qui continuent à proliférer.
L'ossification des longs débute au centre du fût diaphysaire. Au niveau du centre du modèle cartilagineux, les
chondrocytes se différencient et s'hypertrophient ; la matrice se minéralise puis les chondrocytes meurent par apoptose ou par
nécrose. Aprés cette phase de minéralisation, des vaisseaux sanguins envahissent au niveau du point d'ossification primaire et
permettent la formation de la moelle osseuse hématopoïétique et l'apparition par les ostéoclastes pour la résorption du
cartilage calcifié. Aprés ces phases de résorption et d'inversion, des ostéoblastes se différencient et commencent à édifier du
tissu osseux sur les vestiges de la matrice cartilagineuse calcifiée.
De part et d’autre de la zone d’hypertrophie, les chondrocytes s'aplatissent, prolifèrent et s’organisent en colonnes
parallèles à l'axe de l'os, constituant le cartilage prolifératif qui assurera la croissance en longueur de l'os jusqu'à la puberté.
Ainsi se constitue la plaque de croissance , ou site de l'ossification endochondrale, assurant l'ostéogenèse.
2.2) Ossification membranaire
L'ossification membranaire (ou endoconjonctive) est une ossification au cours de laquelle le tissu osseux se
développe directement par différenciation du tissu mésenchymateux embryonnaire.
Cette ossification est responsable de la croissance en épaisseur des os de la voûte du crâne, de la plupart des os de
la face, des clavicules et de la partie périostée des os longs. Elle n'implique pas la formation de cartilage.
Des cellules mésenchymateuses au niveau d'une zone très vascularisée du tissu conjonctif embryonnaire prolifèrent,
formant des condensations cellulaires puis les cellules se différencient directement en préostéoblastes puis en ostéoblastes.
Ces cellules synthétiseront une matrice osseuse, alors qu'à la périphérie, des cellules mésenchymateuses continuent à se
différencier en ostéoblastes ; des vaisseaux sanguins sont incorporés entre les travées osseuses et formeront la moelle osseuse
hématopoïétique. Plus tard, cet os fibreux sera remodelé et progressivement remplacé par un os mature lamellaire.
2.3) Développement de la calvaria
Les os du crâne peuvent être divisés en deux catégories : le viscerocrâne qui représente les os de la face, et le
neurocrâne qui entoure le cerveau. Le neurocrâne comprend la base du crâne et la calvaria (ou voûte crânienne). Cette
dernière est composée de deux os frontaux, deux os pariétaux et d'un os interpariétal. La base et la voûte du crâne ont des
structures et des modes de croissance complètement différents. Alors que la base du crâne s’ossifie à partir de maquettes
cartilagineuses, la voûte est constituée d’os membranaire. Les os de la voûte crânienne se différencient au sein d’une
membrane de mésenchyme assez dense qui sépare l’encéphale de la peau.
2.3.1) Les sutures et les fontanelles
Les sutures sont les articulations entre les os du complexe crâniofacial chez les vertébrés. Lorsque la taille des os de
la calvaria augmente, leurs bords se rapprochent et forment une suture au lieu de fusionner. Ainsi, la suture est une
articulation avec deux fronts osseux entre lesquels on trouve du mésenchyme ou du tissu fibreux. Lorsque la suture est établie,
la formation ou la résorption osseuse peut alors se produire et contrôler la taille, la forme et l'orientation des parties de la
voûte crânienne au cours du développement et de la croissance de l'individu.
Les fontanelles ont des structures similaires aux sutures, mais sont généralement formées au niveau de la rencontre
de trois os de la voûte du crâne. Elles sont généralement plus larges que les sutures et se ferment juste après la naissance.
Les sutures et les fontanelles permettent une liberté de mouvement des os lors de la poussée cérébrale et facilitent
ainsi l'augmentation du rayon de courbure de chaque os (Cohen, 1993).
2.3.2) Morphologie des sutures
L'ossification membranaire est responsable de la formation des sutures. Elle est précédée par une phase de vascularisation
intense de la membrane au niveau des futurs centres d'ossification. Les cellules mésenchymateuses situées à l'intérieur de cette
zone hautement vascularise, se divisent et se différencient en préostéoblastes puis en ostéoblastes qui synthétisent une matrice
osseuse très dense composée de fibres de collagène (principalement de type I) non orientées : l’ostéoïde. L’ostéogenèse se
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poursuit au bout de quelques jours par la minéralisation de la substance ostéoïde (Decker et Hall, 1985). Les ostéoblastes
continuent de déposer de la matrice osseuse et l’os ainsi néoformé s’épaissit. En périphérie de l’ébauche osseuse, l’ossification
membranaire au niveau de la suture progresse et chaque point d’ossification s’étale dans la membrane, recouvrant l’encéphale.
Lorsque les fronts ostéogéniques se sont rapprochés, le tissu mésenchymateux s'épaissit et une zone centrale fibreuse apparaît
entre les os, qui ne sont séparés que d’une fraction de millimètre, et constituent une suture. Ces sutures membranaires sont
constituées schématiquement d’une zone centrale à croissance fibroblastique et de deux zones marginales composées
d’ostéoblastes. L’os membranaire restera jusqu’à la naissance de type fibreux, puis il prendra une texture lamellaire conférant
au tissu une résistance mécanique et une élasticité.
2.4) Les interactions cellulaires
2.4.1) Condensation cellulaire
La formation de condensation de cellules mésenchymateuses joue un rôle essentiel pour l'iniation du développement
embryonnaire du squelette. (Hall et Miyake, 2000). La squelettogenèse peut se diviser en quatre étapes :
1) migration des cellules vers le futur site de squelettogenèse,
2) interactions entre cellules épithéliales et mésenchymateuse,
3) condensation cellulaire,
4) différenciation des cellules en chondroblastes ou en ostéoblastes.
Le processus de condensation prend place lorsqu’une population de cellules mésenchymateuses s’agrège, ce qui est
le premier signe de l’initiation de la formation du squelette (Hall et Miyake, 1992; Hall et Miyake, 1995). Il résulte de la
combinaison d’un ou plusieurs évènements : les condensations peuvent être reconnues soit au niveau cellulaire, par la
formation d’un groupement de cellules, soit au niveau moléculaire par des taux élevés de molécules de la matrice
extracellulaire ou de protéines de la surface cellulaire comme les syndécans ou la N-CAM ("neural cell adhesion molecules")
(Hall et Miyake, 2000).
Des études récentes montrent l’importance de la taille de la condensation pour conduire à la différenciation
chondrogénique ou ostéoblastique (Richman et Mitchell, 1996).
2.4.2) Adhésion cellulaire
L'adhésion cellulaire est un phénomène d'importance majeure qui intervient à tous les stades du développement
embryonnaire, et est à la base de toute structure organisée.
Les molécules responsables des phénomènes d'adhérence cellulaire sont des glycoprotéines appelées CAM ("cell adhesion
molecules"). Ces molécules induisent des interactions entre les cellules elles-mêmes et entre cellules et matrice extracellulaire.
Il existe quatre grandes familles de CAM : les CAM de la superfamille des immunoglobulines avec en particulier la N-CAM,
les cadhérines, les intégrines et les sélectines.
Ces molécules d'adhésions cellulaires sont divisées en 2 grandes groupes : les CAM Ca2+ indépendantes représentées par la
première famille et les CAM Ca2+ dépendantes , auxquelles appartiennent les 3 dernières familles.
Chaque famille est définie par une similitude de structure au niveau des gènes et de leur séquence en acides aminés. Toutes
ces molécules comprennent en général un grand domaine extracellulaire, une région transmembranaire et une courte région
cytoplasmique.
Seules la N-CAM et les cadhérines induisant des interactions cellulaires homotypiques seront décrites ici, les autres
molécules n'ayant pas été étudiées dans notre travail.
2.4.3) N-CAM
La N-CAM est une molécule indépendante du calcium induisant des interactions cellulaires homotypiques. Les
trois formes majoritaires ont le même domaine extracellulaire avec 5 domaines d'homologie des immunoglobulines et des
domaines répétitifs de type III de la fibronectine (Mège, 1991). Elles diffèrent par leur mode d'ancrage ou la longueur de leur
domaine cytoplasmique.
2.4.4) Les cadhérines
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Les cadhérines représentent une superfamille de molécules d’adhésion cellulaire responsables des liaisons cellulecellule,
de façon calcium dépendante. Ces glycoprotéines transmembranaires ont été identifiées dans un grand nombre
d’organismes différents (Suzuki, 1996). La grande majorité des cadhérines sont constituées d’une région extracellulaire
amino-terminale comprenant cinq domaines internes répétitifs de sites de liaisons au calcium, une région transmembranaire,
et une région cytoplasmique carboxy-terminale, de 150 acides aminés, permettant des interactions avec le cytosquelette (Yagi
et Takeichi, 2000).
Les domaines répétitifs permettent des interactions généralement homotypiques avec les cadhérines des cellules
voisines. La superfamille des cadhérines peut être divisée en trois classes :
- Les protocadhérines : elles contiennent des domaines répétitifs au niveau extracellulaire et ont des activités
d’adhésion cellulaire, ce qui explique leur appartenance à cette superfamille.
- Les cadhérines desmosomales : elles sont des molécules d’adhésion cellulaire calcium dépendantes présentes au
niveau des desmosomes. Cette classe peut être divisée en deux sous classes appelées desmogleine et desmocolline. Leur
domaine cytoplasmique contient des séquences identiques aux cadhérines classiques (Goodwin et coll., 1990).
- Les cadhérines classiques : elle appartiennent à une famille de plus de quarante membres, dont les premières
caractérisées sont la E-, la N- et la P-cadhérine (Suzuki, 1996 ; Shimoyama et coll., 1999). La région extracellulaire,
permettant la liaison intercellulaire, contient cinq domaines répétitifs ayant de 30 % à 60 % d’homologie entre les différentes
cadhérines, et la région cytoplasmique peut atteindre 90 % d’homologie dans la même espèce.
Ces cadhérines jouent donc un rôle essentiel de régulateurs morphogènes dans la formation et le maintien des
tissus, spécialement dans les étapes de développement embryonnaire des vertébrés, durant la gastrulation, la neurulation et
l’organogenèse (Takeichi, 1991). Mais elles interviennent aussi dans la régulation de nombreux processus cellulaires tels que
la migration, la prolifération, l’apoptose et la différenciation cellulaire. En effet, elles assurent le lien entre l’adhésion
cellulaire et la transduction intracellulaire pouvant réguler la différenciation.
2.4.5) Interactions cadhérines-cytosquelette
Les cadhérines classiques forment des complexes avec des protéines du cytosquelette par l’intermédiaire de leur
région carboxy-terminale (Ozawa et coll., 1989) : la a-caténine, la b-caténine, et la g-caténine. Ces dernières relient les
cadhérines aux filaments d'actine. Cette liaison est nécessaire pour l'action d'adhésion des cadhérines et entraîne un signal de
tranduction (Grunwald,1993 ; Gumbiner, 1995 ;Aberle et coll. 1996 ; Daniel et Reynolds, 1997 ; Knudsen et coll., 1998).
Différentes études ont également montré que la phosphorylation des cadhérines et des caténines pourrait jouer un
rôle important dans leur fonction d’adhésion cellulaire (Sefton et coll., 1992).
2.4.6) Rôle des cadhérines au cours du développement et de la différenciation
L’expression des cadhérines est régulée de façon spatio-temporelle au cours du développement et ces modifications
d’expression sont associées à différents évènements morphogénétiques impliquant l’agrégation, ou non, des cellules, comme
dans le cas de la formation du tube neural (Takeichi, 1988).
La E-cadhérine joue un rôle essentiel très tôt au cours du développement embryonnaire et pendant l’organogenèse.
De plus, la E-cadhérine est essentielle pour la formation et le maintien des épithéliums, et une perte de sa fonction est corrélée
avec une augmentation de l’invasion tumorale et du nombre de métastases (Bracke et coll., 1996).
La N-cadhérine est responsable de l’adhésion cellulaire indispensable au moment de l’étape de condensation lors
du développement embryonnaire. Elle est aussi une molécule d’adhésion essentielle aux myocytes cardiaques et au
développement du cœur (Radice et coll., 1997).
2.4.7) Les cadhérines et le tissu osseux
L’importance de l’adhésion cellulaire au cours de l’ostéogenèse est montrée par la condensation cellulaire qui
s’effectue au cours du développement de la calvaria notamment, ainsi que par la tendance des cellules de la calvaria à former
des nodules ostéogéniques (structures tridimentionnelles) in vitro (Stein et coll., 1990).
La condensation est une étape primordiale dans le développement des tissus squelettiques. De plus, les cadhérines
peuvent réguler la différenciation et la morphogenèse en activant différentes voies de transduction. Cela a conduit à l'étude de
l’expression des cadhérines dans les cellules osseuses. In vitro, les cellules osseuses expriment, de façon variable, différentes
cadhérines : la E-cadhérine, la N-cadhérine, la cadhérine 11 ou la cadhérine 6.
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Pendant le développement embryonnaire, la N-cadhérine est exprimée au niveau des bourgeons des membres et une
perturbation de l’adhésion cellulaire médiée par la N-cadhérine, inhibe l’agrégation cellulaire du mésenchyme et la
chondrogenèse, in vivo et in vitro (Oberlender et Tuan, 1994a). Cette inhibition de la chondrogenèse semble être maximale
pendant la phase de condensation des cellules mésenchymateuses différenciées. La N-cadhérine est régulée de façon spatiotemporelle
au cours de la chondrogenèse et de la condensation cellulaire mésenchymateuse (Oberlender et Tuan, 1994b). En
effet, le taux initial élevé de N-cadhérine est ensuite diminué dans les stades plus différenciés.
Au cours de la formation osseuse, la N-cadhérine est transitoirement exprimée lors du développement des
ostéoblastes (Lee et chuong, 1992). Toutefois, l'expression de la N-cadhérine persiste dans les os mâtures au niveau des
cellules bordantes du périoste et des ostéocytes du tibia de rat (Ferrari et coll., 2000). Il a été observé que les cellules fœtales
de calvaria humaine expriment principalement la N-cadhérine et la E-cadhérine, et que leur expression est augmentée par la
BMP-2 (Haÿ et coll., 2000). De plus, l'effet de la BMP-2 sur l'expression des gènes de différenciation ostéoblastique dépend
de la E- et de la N-cadhérine dans les ostéoblastes humains. Dans les cellules ostéoblastiques trabéculaires humaines et les
cellules stromales de moelle osseuse, la BMP-2 ne régule pas l'expression de la N-cadhérine (Cheng et coll., 1998). Ainsi,
cette régulation peut être différente en fonction du type d'ostéogenèse (membranaire ou endochondral) ou du stade de
développement.
L'étude de la régulation transcriptionnelle de la N-cadhérine et de la E-cadhérine par le FGF-2 indique que le FGF-2 induit,
dans les cellules de calvaria normale de nouveau-nés, une augmentation de l'expression de la N-cadhérine alors que celle de
la E-cadhérine n'est pas affectée. Ces résultats suggèrent donc un effet sélectif du FGF-2 sur les cadhérines (Debiais et coll.,
2001).
Toutes ces études montrent une régulation différente des cadhérines au cours de la différenciation ostéoblastique et
certaines suggèrent un rôle de ces molécules d'adhésion cellulaire dans le contrôle de la différenciation cellulaire. Il existe
encore peu d'études sur le rôle des cadhérines au cours de la différenciation ostéoblastique et les mécanismes impliqués
restent encore àdéterminer.
3) Les facteurs de croissance fibroblastiques (FGFs) et leurs récepteurs (FGFRs)
3.1) Les facteurs de croissance fibroblastiques ou fibroblast growth factors
Les facteurs de croissance fibroblastiques (FGFs) représentent une famille de polypeptides. Initialement, deux types
de FGFs ont été isolés et nommés selon leur point isoélectrique respectif : le FGF acide (appelé maintenant FGF-1) et basique
(appelé maintenant FGF-2). Cette famille est en constante évolution, puisqu’elle est passée de 15 membres en 1997 (Coulier
et coll., 1997), à 19 à l’heure actuelle chez les vertébrés. Ces FGFs ont des activités diverses et présentent une régulation
spatio-temporelle de leur expression au cours du développement. Outre leurs effets observés sur la réplication cellulaire et
l’angiogenèse, les FGFs sont impliqués dans de nombreuses activités biologiques dont la survie cellulaire, l’apoptose,
l’adhésion, la motilité et la différenciation cellulaire.
Au niveau du tissu osseux, les FGFs ont d’importants effets directs ou indirects sur le recrutement, la différenciation
et la survie des cellules osseuses au cours du développement, de la croissance et du remodelage osseux. Il semble que les
effets cellulaires des FGFs soient dépendants de leur localisation cellulaire et tissulaire, de l’expression et la fonction de leurs
récepteurs à tyrosine kinase et de leurs interactions avec leurs cofacteurs de faible affinité.
Le FGF-2 est présent au niveau de la matrice extracellulaire et bien qu’il soit également présent dans le noyau des cellules
ostéoblastiques humaines néonatales de calvaria (Debiais et coll., 1998), sa fonction reste inconnue.
3.2) Les FGFRs
Quatre récepteurs aux "fibroblast growth factors" peuvent être distingués Dénommés communément FGFR1,
FGFR2, FGFR3 et FGFR4, Ils proviennent probablement d’un même gène ancestral (Coulier et coll., 1997).
Les gènes des FGFRs peuvent coder pour des formes transmembranaires longues qui possèdent deux domaines
intracytoplasmiques à activité tyrosine kinase et une région extracellulaire formée le plus fréquemment de deux ou trois
structures pseudo-immunoglobulines (Ig).
Les effets biologiques du FGF résultent de la transduction d'un signal intracellulaire initié par les FGFR activés.
L'action peut intervenir directement au niveau nucléaire ou indirect via des molécules de transduction du signal qui sont la
PLC-, Src Kinases et le FRS2 ("FGF receptor substrate 2").
La phosphorylation de PLC- s'accompagne d'une hydrolyse du phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate en inositol 1,
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4, 5 triphosphate (IP3) et diacylglycérol (DAG). IP3 entraîne la libéralisation de Ca 2+ intracellulaire, alors que le DAG est un
activateur de la famille de la protéine-kinase C (PKC), une sérine / thréonine kinase.
3.3) Les PKCs
Les voies de signalisation induites par les FGFs vias les FGFRs sont complexes et impliquent de nombreuses
protéines, dont les PKCs.
La famille des PKCs est constituée d'au moins dix membres (Nishizuka,1986 ; Newton, 1995). Elle est divisée en
trois sous classes : les PKCs classiques dépendantes du calcium et du DAG qui regroupe les isoformes a, bI, bII, et g ; les
PKCs nouvelles, indépendantes du calcium, mais dépendantes du DAG, qui regroupe les isoformes q, h, d et e; les PKCs
atypiques qui sont indépendantes du calcium et du DAG, et regroupent les isoformes x, l et m.
Contrairement aux PKC atypiques, les PKC classiques et nouvelles dépendantes du DAG sont sensibles à l'ester de
phorbol. Un traitement court par l'ester de phorbol active les PKCs sensibles au DAG. Cependant un traitement prolongé
régule négativement l'activité PKC en augmentant sa dégradation (Sanders et Stern, 1996).
L'activité PKC est impliquée dans les signaux associés à de nombreuses réponses cellulaires, incluant la résorption osseuse.
Cependant, le rôle de la PKC dans le remodelage osseux n'est pas clairement défini.
Peu d'informations sont connues sur l'implication possible de ces isoenzymes dans le contrôle de l'ostéogenèse. La PKC est
connue pour être activée par l'hormone parathyroïdienne (PTH) et pourrait être impliquée dans la production IL-6 induite par
la PTH dans les ostéoblastes (Abou-Samra et coll., 1999 ; Fujimori et coll., 1992 ; Sanders et coll., 2000). D'autre part, l'effet
mitogénique du FGF-2 dans les cellules ostéoblastiques de rat implique des isoformes de la PKC non sensibles à l'ester de
phorbol (Hurley et coll., 1996).
Plusieurs isoformes de PKC (a, bI, e, x, l) ont été identifiées dans les cellules ostéoblastiques (Sakai et coll., 1992 ; Bourgoin
et coll., 1990 ; Fragale et coll.1999). Seules quelques-unes d'entres elles pourraient intervenir dans le contrôle de
l'ostéogenèse.
4) Les craniosténoses
4.1) Généralités
Les craniosténoses sont des pathologies liées à la disparition prénatale ou à la fusion prématurée d’une ou plusieurs
sutures crâniennes (Renier et Marchac, 1989). La très grande majorité des craniosténoses a un début prénatal, évoquent une
anomalie embryologique. La fréquence des craniosténoses est élevée, puisqu’elle est estimée à environ 1 pour 2000
naissances. Des facteurs génétiques et environnementaux sont à l'origine de craniosténoses.
Les craniosténoses non syndromiques n’ont pas d’origine génétique connue, et les cas sporadiques sont de loin les
plus nombreux (Renier et Marchac, 1989). Les bases cellulaires des fusions prématurées sont encore inconnues et peuvent être
attribuées à des facteurs vasculaires, mécaniques ou génétiques. Il a été montré que l’activité de formation osseuse est
augmentée (De Pollack et coll., 1996) dans les sutures fusionnées prématurément par rapport aux sutures normales. De plus,
cette activité est associée, in vitro, à une augmentation des paramètres de différenciation des cellules ostéoblastiques (De
Pollack et coll., 1996). Cette maturation précoce des cellules ostéoblastiques au site de la suture pourrait conduire à
l’ossification prématurée.
Les craniosténoses syndromiques ont un déterminisme génétique assez bien connu : mutation dominante pour la
maladie d’Apert, transmission autosomique dominante pour les syndromes de Crouzon et Pfeiffer.
4.2) Le syndrome d’Apert
Bien que la plupart des cas de syndrome d’Apert soient sporadiques et corrélés à l’âge du père, de rares
observations familiales montrent que cette malformation sévère présente un caractère autosomique dominant, avec une
fréquence d’apparition de 1 naissance sur 65000 (Cohen et coll., 1992).
4.2.1) Aspects cliniques
Ce syndrome est caractérisé par une fusion prématurée des sutures du crâne et la présence de syndactylies, mais plusieurs
autres malformations ont été décrites. La déformation du crâne est présente in utero permettant, avec les anomalies des
extrémités, le diagnostic anténatal de la maladie. La suture coronale est fermée dès la naissance et le crâne a une hauteur
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excessive, surtout au niveau frontal. La brachycéphalie est très importante, avec un os frontal très étroit. Ces nouveau nés
présentent un hypertélorisme et des malpositions dentaires dues à un palais étroit et parfois arqué. Le nez a une forme de bec
d’aigle.
Les anomalies des extrémités sont variables : parfois tous les doigts sont fusionnés, dans d’autres cas, plus
fréquents, la fusion n’intéresse que les quatre derniers doigts, et un pouce plus ou moins mal formé est présent. La syndactylie
peut n’atteindre que les 3 doigts médians, la brachydactylie est fréquente, avec des anomalies de longueur des phalanges,
surtout au niveau du pouce, et les ongles sont malformés (Lajeunie et coll., 1999)
Ces synostoses augmentent avec le temps, de même qu’apparaissent des fusions des articulations interphalangiennes.
Progressivement, se développent également des synostoses vertébrales ou des os longs. Les mêmes variations existent au
niveau des orteils. Alors que la taille est normale à la naissance, un défaut de croissance peut s’établir, lié à des anomalies de
la morphologie épiphysaire ou à des synostoses (Cohen et Kreiborg, 1993). Le retard mental est constant, même après
prise en charge chirurgicale précoce, à rapprocher probablement de la fréquence des malformations cérébrales associées.
4.2.2) Aspect moléculaire
Le syndrome d’Apert est consécutif à la substitution d’acides aminés situés au niveau de l’exon IIIa, entre le
deuxième et le troisième domaine immunoglobuline du FGFR-2. Deux substitutions principales ont été décrites : le
tryptophane remplaçant une sérine en position 252 (Ser252Trp, ou S252W), ou une arginine remplaçant une proline en
position 253 (Pro253Arg, ou P253R) (Wilkie et coll., 1995). La fréquence des mutations S252W et P253R est respectivement
de 71 % et de 26 % (Park et coll., 1995). La première mutation semble correspondre à une atteinte moins sévère des mains,
mais s’associe plus fréquemment à une fente palatine (Slaney et coll., 1996).
Dans ce syndrome, les mutations de FGFR-2 engendrent un gain de fonction. C'est à dire qu'elles augmentent la
liaison du récepteur par les ligands FGF et/ou augmentent la durée de signalisation du récepteur. Elles peuvent induire
également une dimérisation des monomères de FGFRs, indépendamment du ligand, et conduire alors à une activation
permanente, constitutive, du récepteur (Neilson et Friesel, 1996; Webster et Donoghue, 1996.
Bien que Slaney et coll. (1996) aient décrits des différences phénotypiques cliniques entre la mutation S252W et la mutation
P253R, les répercussions phénotypiques, biochimiques ou moléculaires de ces mutations dans les cellules ou les animaux
transgéniques ne sont pas encore bien caractérisées. Des études récentes sont contradictoires en ce qui concerne le phénotype
cellulaire dans le syndrome d'Apert. En effet, alors que Fragale et coll. (1999) montrent une augmentation de la
différenciation cellulaire dans des cultures primaires ostéoblastiques de patients présentant un syndrome d'Apert, Mansukhani
et coll. (2000) montrent une diminution de la différenciation ostéoblastique dans des cellules transfectées avec la mutation
S252W du FGFR-2.
Au laboratoire, une première approche a été réalisée sur les conséquences phénotypiques des mutations de FGFR-2 à un
niveau cellulaire et tissulaire (Lomri et coll., 1998). In vivo, les sutures sont caractérisées au cours du syndrome d'Apert par
une augmentation du dépôt de matrice osseuse par les ostéoblastes au niveau sous périosté par rapport à la suture normale. La
prolifération des cellules mésenchymateuse ou préostéoblastiques apparaît normale mais l'expression de collagéne de type I,
d'ostéopontine, et d'ostéocalcine est retrouvée plus précocement. Les cellules primaires humaines de calvaria avec la mutation
Ser252Trp du FGFR-2 présentent également une augmentation de l'expression des gènes des marqueurs du phénotype
ostéoblastique et de l'ostéogenèse in vitro (Lomri et coll., 1998).
Toutefois, les répercussions phénotypiques plus complète induites par les mutations dans le syndrome d'Apert
restent à déterminer.
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