UNIVERSITÉ PAUL CÉZANNE, AIX MARSEILLE III - IMEP

Matériel et Méthodes
gallique (1 g.L -1 ). Une unité tannase correspond à la libération d’une µmole d’acide gallique
par min à 35°C dans un tampon citrate 0,05 mM pH 5,0.
3.7.8.5. Activité lipase
Le milieu réactionnel est composé de 1 g du produit fermenté, 10 mM de laurate de p-
nitrophényl (PNP), 2 mL d’heptane et de 2 mL d’eau. Il faut noter que la laurate de PNP est
soluble dans l’heptane. Après l’incubation du mélange à l’obscurité à 30°C pendant 2 h avec
agitation sur un secoueur, 4 mL d’eau ont été ajoutés et le tout a été filtré pour récupérer la
fraction organique. Quatre mL de NaOH 0,1M ont été ajoutés à 200 µL du surnageant et la
densité optique du mélange a été mesurée à 412 nm. La gamme d’étalonnage a été préparée
avec différentes concentrations de PNP (Sigma, France).
3.7.9. L’analyse des monomères phénoliques par HPLC
L’extraction de la fraction phénolique a été effectuée avec une solution organique de
méthanol : eau (60 :40). Un échantillon d’un gramme du substrat fermenté lyophilisé a été
mélangé avec 10 mL de la solution organique, et le mélange a été homogénéisé et incubé
pendant 1 h à 4°C. L’extraction a été répétée trois fois. Après la centrifugation du mélange,
les surnageants ont été collectés et évaporés sous vide à 1/3 du volume. Une deuxième
extraction a été faite par 10 mL l’acétate d’éthyle. Le surnageant a été évaporé sous vide à
sec. Le résidu sec a été dissous dans 1 mL de méthanol pur (qualité HPLC) et injecté en
HPLC.
Les monomères phénoliques ont été déterminés par l’HPLC suivant la méthode
modifiée de De Marco et al. (2007). Les conditions d’analyse sont décrites dans le Tableau 9.
Tableau 9. Conditions d’analyses en HPLC pour la détection des monomères
phénoliques.
Débit 1 mL.min -1
Volume d’injection 50 µL
Température 25 ± 2 °C
Solvant A Eau : Acide acétique, 97 :3 (v/v)
Solvant B Acétonitrile : Méthanol, 80 : 20 (v/v)
UV de détection 280 nm
Spectre d’absorption 200-700 nm
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