UNIVERSITÉ PAUL CÉZANNE, AIX MARSEILLE III - IMEP

Matériel et Méthodes
Na2CO3 dans NaOH, 0,1N). Après 5 min d’incubation à température ambiante, 0,5 mL de
réactif de Folin Ciocalteu a été ajouté. Le milieu a été placé 2h à l'obscurité. L'absorbance a
été lue à 760 nm contre un tube témoin. La gamme étalon a été réalisée dans les mêmes
conditions en présence de l’acide cafféique (0 à 250 µg.mL -1 ).
3.7.8. Le dosage des activités enzymatiques
3.7.8.1. Activité Laccase
L’extraction de laccase a été faite dans un tampon acétate (0,1M, pH 5,0) contenant
5mM de CaCl2, 0,05% de tween et 5% de polyvinylpolypyrrolidone PVPP (Sampedro et al.,
2007). Le mélange a été incubé pendant 1h sous agitation (100 rpm) à température ambiante.
L’activité des laccases a été déterminée selon la méthode Criquet et al. (1999). Le
milieu réactionnel a été constitué de 1mL d’extrait enzymatique et de 15 µL de syringaldazine
(6 mg.mL -1 du méthanol). L’oxydation de syringaldazine en quinone a été déterminée en
mesurant la densité optique à 525 nm (ε= 65 000 M -1 cm -1 ). L’activité des laccases a été
exprimée en µmole de quinone formée par minute (U) et par gramme de matière sèche (U.g -1
MS).
3.7.8.2. Activité Mn peroxydase
L’activité a été déterminée selon la méthode de Wariishi et al., (1992). Le milieu
réactionnel a été composé de 1 mL de l’extrait enzymatique, 0.5 mM MnSO4 dans 50 mM du
tampon malonate à pH 4,5, en présence de H2O2 (75 µM). La formation du complexe (Mn 3+ -
Malonate) a été suivie à 270 nm (ε=11 590 M -1 cm -1 ).
3.7.8.3. Activité Lignine peroxydase
L’activité a été déterminée par le suivi de l’oxydation de l’alcool vératrylique à 310 nm
(ε= 9 300 M -1 cm -1 ) en présence de H2O2. Le milieu réactionnel a été composé de 2,1 mL de
tampon tartrate (0,1M, pH3), de 0,3 mL de H2O2 (50 µM), de 0,1 mL d’alcool vératrylique et
0.5 mL d’extrait enzymatique.
3.7.8.4. Activité tannase
Nous avons utilisé la technique de Sharma et al., (2000) pour l’analyse des activités
tannases produites par Pleurotus ostreatus cultivé sur coques de café en FMS. Cette technique
utilise le méthylgallate comme substrat et sous l’action de la tannase, l’acide gallique libéré
est colorée par la rhodanine. Cette nouvelle technique est très simple à réaliser et elle est trois
fois plus sensible que les méthodes classiques. La gamme étalon a été réalisée avec de l’acide
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