UNIVERSITÉ PAUL CÉZANNE, AIX MARSEILLE III - IMEP

Matériel et Méthodes
méthanol grade-HPLC comme phase mobile à un débit de 1 mL.min -1 . Un volume de 20-50
µL de chaque échantillon a été injecté dans l’HPLC. Un lavage de la colonne a été effectué
par l’injection du méthanol (qualité HPLC). Le pic de l’ergostérol a été déterminé par
comparaison avec le temps de rétention du standard et en vérifiant le spectre d’absorption
caractéristique de l’ergostérol. La DO pour l’ergostérol a été mesurée à 280 nm.
3.7.5. Le dosage des sucres réducteurs
Les sucres réducteurs ont été dosés par la méthode de Miller (1959). Les sucres
réduisent l'acide 2,3-dinitrosalicylique (DNS) en acide 3-amino-5-nitrosalicylique, à chaud.
Le produit de la réaction au milieu basique développe une coloration jaune orangé avec un pic
d'absorption à 575 nm. L'échantillon à doser a été dilué convenablement de façon à obtenir
une concentration en sucres réducteurs voisine de 1g.L -1 . A 1 mL de cette dilution, on a ajouté
1 mL de réactif au DNS. Le mélange a été porté à ébullition pendant 5 min et refroidi
rapidement. Après addition de 8 mL d'eau distillée, le contenu des tubes a été homogénéisé au
vortex, et la densité optique a été lue à 575 nm. La courbe d’étalonnage a été réalisée avec une
solution de glucose de 0 à 1g.L -1 .
3.7.6. Le dosage des sucres totaux
La réaction à l’anthrone constitue la base d’une méthode rapide pour la détermination
des hexoses, acides hexouroniques et aldopentoses. Le complexe formé donne une couleur
bleu-vert qui absorbe à 625 nm (Dubois et al.,1956). La présence de protéines contenant du
tryptophane donne une couleur rouge à l’échantillon et peut donc interférer avec la réaction.
Pour la préparation du réactif, 200 mg d’anthrone ont été dissous dans 100 mL d’acide
sulfurique à 96 %. Ce réactif peut être conservé au frais pour 4 mois. Pour réaliser la courbe
étalon, la solution mère a été préparée avec 5 g.L -1 de glucose (0,5 g.100 mL -1 ) et la courbe
d’étalonnage a été établie pour des concentrations en glucose de 0 à 50 mg.L -1 .
3.7.7. Le dosage des phénols totaux
La détermination de la concentration des phénols totaux dans les différents échantillons
a été réalisée par la technique de Folin Ciocalteu décrite par Bärlocher et Graça (2005). Le
réactif de Folin Ciocalteu est réduit par le complexe phényl-cuivre qui donne une coloration
bleue dont l’absorbance est maximale à 760 nm.
La concentration des phénols totaux a été déterminée sur 0,1 mL d'échantillon
(convenablement dilué dans de l'eau distillée) auquel sont rajoutés 5 mL du réactif C (2% de
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