UNIVERSITÉ PAUL CÉZANNE, AIX MARSEILLE III - IMEP

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3.7.2. La mesure du pH Matériel et Méthodes Les mesures des valeurs du pH du substrat fermenté ont été réalisées dans une suspension (0,1 g.mL -1 d’eau distillée). La mesure a été réalisée à l'aide d'un pH-mètre digital Knick muni d'une électrode combinée. L'étalonnage de l'appareil a été obtenu avec des solutions tampon pH 4,0 - 7,0 et 10.0 (Schott-Geräte). 3.7.3. La mesure de la croissance apicale La croissance apicale correspond à l’élongation du mycélium cultivé sur une surface solide. Cette élongation a été mesurée régulièrement à l’aide d’une règle graduée. La croissance apicale a été exprimée en millimètres rapportés au temps. Généralement, cette mesure a été réalisée pour des cultures en boîtes de Petri sur des milieux gélosés ou céréaliers. Vmoy = Vitesse de croissance apicale moyenne (mm.j -1 ) Dmax = Diamètre de la colonie au moment de l’arrêt de la FMS (mm) C = Diamètre du disque de gélose (mm) T = Temps (h) Vmoy = [(Dmax- C)/2]/T 3.7.4. L’estimation indirecte de la biomasse par analyse de l’ergostérol 3.7.4.1. Extraction de l’ergostérol L’extraction de l’ergostérol a été faite à partir d’échantillons de produits fermentés: un échantillon de 50 mg d’échantillon lyophilisé a été mis en suspension dans 1 mL de méthanol pur (SIGMA) dans un tube Eppendorf de 1,5 mL en 5 exemplaires. Les échantillons ont été agités au vortex à 1500 rpm pendant 20 sec et laissés reposer pendant une nuit à 4°C à l’obscurité. Ces échantillons ont été ensuite agités au vortex à la même vitesse et centrifugés à 14000 tr.min -1 dans une centrifugeuse SIGMA 3K15 à 4°C pendant 10 min. Les surnageants ont été récupérés pour les analyses de l’ergostérol en HPLC. 3.7.4.2. Dosage de l’ergostérol en HPLC La plateforme HPLC-DAD Agilent technologies 1200 Series est composée d’un dégazeur (1200 Series Degasser, Agilent technologies), d’une pompe quaternaire (1200 Series Quaternary Pump, Agilent technologies), d’un échantillonneur automatique (1200 Series Automatic Liquid Sampler, Agilent technologies) et d’un détecteur à barrette de diodes (1200 Series Diode-Array Detector, Agilent technologies). L’élution a été isocratique en utilisant le 43
Matériel et Méthodes méthanol grade-HPLC comme phase mobile à un débit de 1 mL.min -1 . Un volume de 20-50 µL de chaque échantillon a été injecté dans l’HPLC. Un lavage de la colonne a été effectué par l’injection du méthanol (qualité HPLC). Le pic de l’ergostérol a été déterminé par comparaison avec le temps de rétention du standard et en vérifiant le spectre d’absorption caractéristique de l’ergostérol. La DO pour l’ergostérol a été mesurée à 280 nm. 3.7.5. Le dosage des sucres réducteurs Les sucres réducteurs ont été dosés par la méthode de Miller (1959). Les sucres réduisent l'acide 2,3-dinitrosalicylique (DNS) en acide 3-amino-5-nitrosalicylique, à chaud. Le produit de la réaction au milieu basique développe une coloration jaune orangé avec un pic d'absorption à 575 nm. L'échantillon à doser a été dilué convenablement de façon à obtenir une concentration en sucres réducteurs voisine de 1g.L -1 . A 1 mL de cette dilution, on a ajouté 1 mL de réactif au DNS. Le mélange a été porté à ébullition pendant 5 min et refroidi rapidement. Après addition de 8 mL d'eau distillée, le contenu des tubes a été homogénéisé au vortex, et la densité optique a été lue à 575 nm. La courbe d’étalonnage a été réalisée avec une solution de glucose de 0 à 1g.L -1 . 3.7.6. Le dosage des sucres totaux La réaction à l’anthrone constitue la base d’une méthode rapide pour la détermination des hexoses, acides hexouroniques et aldopentoses. Le complexe formé donne une couleur bleu-vert qui absorbe à 625 nm (Dubois et al.,1956). La présence de protéines contenant du tryptophane donne une couleur rouge à l’échantillon et peut donc interférer avec la réaction. Pour la préparation du réactif, 200 mg d’anthrone ont été dissous dans 100 mL d’acide sulfurique à 96 %. Ce réactif peut être conservé au frais pour 4 mois. Pour réaliser la courbe étalon, la solution mère a été préparée avec 5 g.L -1 de glucose (0,5 g.100 mL -1 ) et la courbe d’étalonnage a été établie pour des concentrations en glucose de 0 à 50 mg.L -1 . 3.7.7. Le dosage des phénols totaux La détermination de la concentration des phénols totaux dans les différents échantillons a été réalisée par la technique de Folin Ciocalteu décrite par Bärlocher et Graça (2005). Le réactif de Folin Ciocalteu est réduit par le complexe phényl-cuivre qui donne une coloration bleue dont l’absorbance est maximale à 760 nm. La concentration des phénols totaux a été déterminée sur 0,1 mL d'échantillon (convenablement dilué dans de l'eau distillée) auquel sont rajoutés 5 mL du réactif C (2% de 44
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Je remercie le Dr. Antonis PHILIPPO
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