UNIVERSITÉ PAUL CÉZANNE, AIX MARSEILLE III - IMEP

UNIVERSITÉ PAUL CÉZANNE, AIX MARSEILLE III
École Doctorale des Sciences de l’Environnement
Culture du Lentinula edodes (Berk.) Pegler sur résidus oléicoles en fermentation
en milieu solide : Transformation des polyphénols des margines
THÈSE
présentée par
Hicham LAKHTAR
pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ PAUL CÉZANNE
Faculté des Sciences et Techniques - Saint Jérôme
(Discipline: Biologie des Populations et Ecologie)
Soutenue le 7 Décembre 2009
JURY:
N° 2009AIX30048
Pr. Jean LE PETIT Université Paul Cézanne, Marseille Président
Dr. Maurice BENSOUSSAN Université de Bourgogne, Dijon Rapporteur
Dr. Jean-Michel SAVOIE INRA, Bordeaux Rapporteur
Pr. Gerardo SAUCEDO-CASTANEDA UAM, México, Mexique Examinateur
Dr. Sevastianos ROUSSOS IRD, Marseille Directeur de Thèse
Pr. Mustapha ISMAILI-ALAOUI IAV-Hassan II, Rabat, Maroc Co-directeur de Thèse

Remerciements
Cette thèse a débuté en Novembre 2006 grâce au financement du Département
Soutien et Formation des communautés scientifiques du Sud (DSF SF SF) SF de l’Institut de
Recherche pour le Développement (IRD IRD IRD). IRD
Je tiens tout d’abord à adresser mes remerciements les plus sincères au Dr. Sevastianos
ROUSSOS de m’avoir accordé sa confiance depuis 4 ans déjà et de m’avoir permis de réaliser
ce travail de recherche dans son laboratoire. À travers ses qualités professionnelles, en tant
que directeur de recherche, il m’a transmis de précieuses connaissances en Fermentation en
Milieu Solide, et en Mycologie ainsi qu’une rigueur scientifique qui me seront très utiles
dans mon avenir professionnel. Je tiens également à le remercier à titre personnel d’avoir
toujours été présent pour me faciliter la vie en France, malgré ses préoccupations.
Je souhaite remercier également le Pr. Mustapha ISMAILI-ALAOUI d’avoir accepté
de participer à la co-direction de la thèse et de m’avoir accueilli dans son laboratoire à l’IAV IAV
durant mon séjour au Maroc. Je remercie également le Pr. Thierry TATONI, le directeur de
l’IMEP, de m’avoir accueilli au sein de l’Institut Méditerranéen d’Écologie et de
Paléoécologie (IMEP IMEP IMEP) IMEP de l’Université Paul Cézanne d’Aix-Marseille III.
Je remercie les membres de jury en particulier le Dr. Maurice BENSOUSSAN, maitre
de conférences à l’Université de Bourgogne-Dijon, et le Dr. Jean-Michel SAVOIE, chargé
de recherche à l’INRA, pour le temps qu’ils ont bien voulu consacrer à lire et à juger ce
travail en tant que rapporteurs . Egalement je remercie le Pr. Jean LE PETIT, professeur
Emérite de l’Université Paul Cézanne qui m’a fait l’honneur de présider ce jury et
Pr. Gerardo SAUCEDO-CASTANEDA, professeur à l’Université Autonome
Métropolitaine d’Iztapalapa au Mexique qui m’ont fait profité de leur large expérience en
Microbiologie et en Biotechnologie en me donnant de précieuses remarques pour améliorer
mon rapport écrit.

Je remercie le Dr. Antonis PHILIPPOUSSIS, chercheur à la fondation grecque
NAGREF d’Athènes, d’avoir accepté à nous fournir les souches de Lentinula edodes
utilisées pour la réalisation de ce travail.
Je remercie vivement mes collègues de l’IRD, qui ont collaboré à ce travail : Dr.
Isabelle GAIME-PERRAUD et Dr. Hervé MACARIE, ainsi que pour leur soutien et leurs
conseils. By the same occasion, I would like to thank my friend Roopesh
KRISHNANKUTTY for his help for improving the English of articles, and the moments
we spent together, in Marseille, will remain as sweet memories for ever.
J’exprime ma profonde reconnaissance à toutes les personnes du laboratoire IRD:
Martine MARTINEZ, Yoan LABROUSSE, Fanny BAROT, Claude CHARPPY
ROUBAUD pour leur aide et leur soutien.

Avant propos
Le travail de thèse a été effectué en partie à l’IMEP Equipe d’Ecologie Microbienne et
Biotechnologies à l’université Paul Cézanne, Marseille, France et en partie à l’Institut
Agronomique et Vétérinaire Hassan II, de Rabat, Maroc. Durant mon stage de 6 ème année
d’ingénieur en Industrie Agroalimentaire- IAV-Hassan II, j’ai réalisé un séjour en France de 3
mois à l’Unité Biotrans d’Avril à Juin 2006 dans le cadre d’un projet PRAD (Programme de
Recherche Agronomique pour le Développement) sur la valorisation des grignons d’olive par
la production d’enzymes fongiques. Cette collaboration nous a permis de préparer ce projet de
recherche afin d’obtenir une bourse de la part de l’IRD pour réaliser ma thèse de doctorat sur :
Culture du Lentinula edodes (Berk.) Pegler sur résidus oléicoles en fermentation en
milieu solide : Transformation des polyphénols des margines.
Cette thèse a été financée par le Département Soutien et Formation des communautés
scientifiques du sud (DSF), Institut de Recherche pour le Développement (IRD), France, pour
une durée de trois ans. Le Pr. Mustapha Ismaili-Alaoui, Professeur à l’IAV-Hassan II de
Rabat et le Dr. Sevastianos Roussos, Directeur de Recherche à l’IRD, ont assuré la direction
scientifique de ce travail de recherche scientifique. Dr. Isabelle Perraud-Gaime CR IRD et Dr.
Anne Marie Farnet (MC Université de Provence), ainsi que Dr. Hervé Macarie CR IRD, Dr.
Jean Michel Savoie, CR INRA-Bordeaux et Dr. Elisée Ferré MC UPCAM, ont participé aux
réunions du Comité de pilotage.

Résumé
L’objectif du travail a été d’étudier la valorisation de sous-produits oléicoles au
Maroc par la culture en fermentation en milieu solide de champignons comestibles avec une
double finalité: (i) la production de la biomasse fongique pour l’alimentation humaine et (ii)
la détoxification des margines par la dégradation des composés phénoliques. Une enquête
menée sur le terrain au Maroc a permis de faire le point sur la situation du secteur oléicole au
Maroc. A partir de seize souches de L. edodes, une souche performante à la détoxification des
margines a été sélectionnée pour mener la culture de L. edodes. La production de l’inoculum
sur les grains de blé (spawn) a été optimisée. Un mélange des substrats oléicoles solides
(SOS), composé de bois de taille d’olivier, de grignons d’olive et de margines, a été mis au
point et les conditions de croissance de L. edodes sur ce mélange ont été optimisées. Le
changement de la matière organique durant le développement de L. edodes sur le mélange
dans des conditions optimales a été analysé par les techniques spectroscopiques de la RMN
solide du 13 C couplées aux analyses biochimiques. Une technique de séchage solaire sous serre a
été mise au point permettant la réduction en volume et le conditionnement des grignons d’olives
mélangés aux margines. De ce travail, nous concluons la possibilité de valoriser l’ensemble des
co-produits de l’industrie oléicole par la culture de L. edodes permettant, d’une part, la
production d’une biomasse mycélienne importante et, d’autre part, la dégradation des
composés phénoliques présents dans les margines. Ces résultats novateurs ouvrent des
perspectives sérieuses pour la production de L. edodes sur le SOS.

Table de Matières
1. INTRODUCTION ............................................................................................................. 1
2. ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE.................................................................................. 5
2.1. Le Secteur oléicole au Maroc .................................................................................... 5
2.1.1. L’olivier ............................................................................................................... 5
2.1.2. L’huile d’olive ..................................................................................................... 5
2.1.3. Les unités de trituration d’olives au Maroc ..................................................... 6
2.1.4. Les bilans quantitatifs des sous produits de l’industrie oléicole .................... 8
2.1.5. Le bois de taille de l’olivier ................................................................................ 9
2.1.6. Les grignons d’olive ........................................................................................... 9
2.1.7. Les caractéristiques des margines d’olive ...................................................... 10
2.1.7.1. pH, conductivité et matière sèche ................................................................ 11
2.1.7.2. Charge minérale et métaux lourds .............................................................. 11
2.1.7.3. Fraction organique ....................................................................................... 12
2.1.7.4. Fraction phénolique ...................................................................................... 12
2.1.7.5. Caractéristiques microbiologiques .............................................................. 13
2.2. L’impact des margines d’olive sur l’environnement, traitements et valorisation .
................................................................................................................................... 14
2.2.1. L’impact sur les eaux : cas de l’Oued Sebou (Fès) ........................................ 14
2.2.2. L’impact sur le sol ............................................................................................ 15
2.2.3. Les traitements des margines .......................................................................... 16
2.2.4. La valorisation des margines ........................................................................... 17
2.2.4.1. Extraction des antioxydants (hydroxytyrosol) ........................................... 18

2.2.4.2. Culture de champignons supérieurs ........................................................... 18
2.3. Le champignon comestible, Lentinula edodes (Berk.) Pegler .............................. 19
2.3.1. Définition des champignons ............................................................................. 19
2.3.2. La physiologie de croissance des champignons ............................................. 19
2.3.3. Les techniques générales de culture de L. edodes .......................................... 20
2.3.3.1. Culture sur bûches........................................................................................ 20
2.3.3.2. Culture sur substrats synthétiques ............................................................. 21
2.3.3.3. Culture sur substrats alternatifs ................................................................. 22
2.3.4. Les phénoloxydases, les laccases ..................................................................... 23
2.3.4.1. Structure des laccases ................................................................................... 23
2.3.4.2. Mécanismes d’action des laccases ............................................................... 23
2.3.4.3. Applications des laccases .............................................................................. 24
2.4. Les fermentations en milieux solides ..................................................................... 24
2.4.1. Définition des FMS ........................................................................................... 25
2.4.2. Les principaux paramètres des FMS .............................................................. 25
2.4.2.1. Microorganismes et l’inoculation du milieu solide .................................... 26
2.4.2.2. Choix du support/substrat ........................................................................... 26
2.4.2.3. Activité de l’eau et l’humidité ...................................................................... 26
2.4.2.4. Aération des cultures en FMS ..................................................................... 27
2.4.2.5. Contrôle de la température pour les FMS .................................................. 28
2.4.2.6. Evolution du pH ............................................................................................ 28
2.4.3. Les applications des FMS ................................................................................ 29
2.4.4. Les avantages et les inconvénients de la FMS................................................ 30

2.5. Conclusion de l’analyse bibliographique ............................................................... 30
3. MATERIEL ET METHODES ...................................................................................... 33
3.1. Les substrats oléicoles de culture ........................................................................... 33
3.1.1. La description de l'unité de trituration semi industrielle ............................. 33
3.1.2. L’origine du substrat ....................................................................................... 34
3.1.3. La préparation et le conditionnement du substrat ........................................ 35
3.2. Les souches utilisées................................................................................................. 35
3.3. Les milieux de culture ............................................................................................. 36
3.3.1. Les milieux d'entretien ..................................................................................... 36
3.3.2. Les milieux gélosés de criblage des souches ................................................... 36
3.3.3. Les milieux à base de céréale pour la culture Spawn .................................... 36
3.4. Les stratégies d'inoculation..................................................................................... 37
3.4.1. L’inoculation par carrés de milieux gélosés ................................................... 37
3.4.2. L’inoculation sur feuille de cellophane........................................................... 37
3.4.3. L’inoculation par grain de céréales ................................................................ 38
3.5. La mise en œuvre des FMS ..................................................................................... 39
3.5.1. La préparation du substrat oléicole ................................................................ 39
3.5.2. Les cultures en Erlenmeyer ............................................................................. 39
3.5.3. Les cultures en colonnes de Raimbault .......................................................... 39
3.5.4. La régulation des paramètres de FMS ........................................................... 40
3.5.5. La description et le fonctionnement du PNEO .............................................. 40
3.6. L’échantillonnage et le traitement des échantillons en FMS ............................... 42
3.7. Les techniques d’analyse ......................................................................................... 42

3.7.1. La mesure de l’humidité .................................................................................. 42
3.7.2. La mesure du pH .............................................................................................. 43
3.7.3. La mesure de la croissance apicale ................................................................. 43
3.7.4. L’estimation indirecte de la biomasse par analyse de l’ergostérol .............. 43
3.7.4.1. Extraction de l’ergostérol ............................................................................ 43
3.7.4.2. Dosage de l’ergostérol en HPLC ................................................................. 43
3.7.5. Le dosage des sucres réducteurs ..................................................................... 44
3.7.6. Le dosage des sucres totaux ............................................................................. 44
3.7.7. Le dosage des phénols totaux .......................................................................... 44
3.7.8. Le dosage des activités enzymatiques ............................................................. 45
3.7.8.1. Activité Laccase ............................................................................................ 45
3.7.8.2. Activité Mn peroxydase................................................................................ 45
3.7.8.3. Activité Lignine peroxydase ........................................................................ 45
3.7.8.4. Activité tannase ............................................................................................. 45
3.7.8.5. Activité lipase ................................................................................................ 46
3.7.9. L’analyse des monomères phénoliques par HPLC ....................................... 46
3.7.10. Les analyses élémentaires : C et N .................................................................. 47
3.7.11. La résonance magnétique nucléaire 13 C du solide ......................................... 47
Chapitre I .................................................................................................................................. 51
Criblage des souches de Lentinula edodes cultivées sur des margines d’olive en culture
solide et liquide pour la biodégradation des polyphénols ................................................... 51
Chapitre II ................................................................................................................................ 70
Optimisation de la production de l’inoculum (spawn) de Lentinula edodes sur les grains
de blé (Ebly®) ......................................................................................................................... 70

Chapitre III ............................................................................................................................... 87
Culture de Lentinula edodes en fermentation en milieu solide sur substrat oléicole solide:
Evaluation des facteurs de croissance .................................................................................. 87
Chapitre IV ............................................................................................................................. 106
Transformation de la matière organique et détoxification des substrats oléicoles solides
par la culture de Lentinula edodes par fermentation en milieu solide............................. 106
Chapitre V .............................................................................................................................. 125
Disponibilité des substrats oléicoles : séchage solaire sous serre du mélange de grignons
d’olive et de margines .......................................................................................................... 125
Synthèse générale ................................................................................................................. 143
Conclusions et perspectives ................................................................................................. 151
Références bibliographiques ............................................................................................... 154

Liste des Tables
Tableau 1. Bilan matière en grignons et margines obtenus par différents procédés de
trituration des olives, 100 kg d’olives donnent en moyenne 20 kg d’huile d’olive 9
Tableau 2. Composition chimique indicative des différents types de grignons 10
Tableau 3: Valeurs minimales et maximales des minéraux et métaux lourds déterminées sur
les margines issues des deux systèmes d'extraction de l’huile 11
Tableau 4. Structure te teneur des monomères phénoliques rencontrés dans les margines 13
Tableau 5. Procédés de traitement des margines 17
Tableau 6 : Exemples de substrats utilisés et les applications en FMS 29
Tableau 7. Comparaison de la fermentation en milieu liquide (FML) avec la fermentation en
milieu solide (FMS) 30
Tableau 8. Liste des espèces et origine des souches de champignons comestibles étudiées 35
Tableau 9. Conditions d’analyses en HPLC pour la détection des monomères phénoliques 46
Tableau 10. Conditions d’élution pour la détection des monomères phénoliques 47
Tableau 11 . Attribution des régions RMN 13 C aux différents groupes fonctionnels trouvés
dans la matière organique 48

Liste des Figures
Figure 1. Evolution de la superficie de culture de l'olivier au Maroc 5
Figure 2. Evolution de la production de l'huile d'olive au Maroc 6
Figure 3. Répartition de la production mondiale de l’huile d’olive (%) pendant les 5 dernières
années (2003 – 2008) 6
Figure 4. Répartition et capacités de trituration des unités artisanales et industrielles au Maroc
7
Figure 5. Schéma de l’industrie oléicole équipée d’un procédé triphasique avec le système de
presse 8
Figure 6. Evolution de la DCO dans les eaux l’Oued Sebou avant, pendant et après la période
d’activité des huileries 15
Figure 7. Processus général de culture de L. edodes sur bûches 21
Figure 8. Localisation de la région Tadla Azilal au Maroc 33
Figure 9. Unité de trituration semi industrielle au Maroc 34
Figure 10 . Olives de la variété picholine de maturité avancée 34
Figure 11. Technique pour le suivi de la croissance apicale du mycélium et la mesure de
biomasse des champignons en milieu gélosé 38
Figure 12. Dispositif de FMS utilisé: 1, Entrée d’air ; 2, Bain marie thermostaté ; 3, Colonnes
de Raimbault 40
Figure 13 . Photographie du respiromètre PNEO et description de ses différents composants
41
Figure 14. Exemple de spectre CPMAS RMN 13 C d’une litière de Quercus ilex L. 48
Figure 15 : Activité laccase produite par L. edodes Le119 sur des grains d’Ebly sans margines
et avec des margines à 10% (v/v), incubés à 25°C avec aération forcée de 25 mL.min -1
pendant 20 jours 71

1. INTRODUCTION
Introduction
Au Maroc, le secteur oléicole joue un rôle très important sur le plan socio-économique.
Il contribue activement à la fixation des populations en milieu rural en offrant plus de
15 millions de journées de travail (DPV, 2009). Avec une production nationale de
75 000 tonnes d’huile d’olive, le Maroc occupe le 6 ème rang après l’Espagne, l’Italie, la
Tunisie, la Turquie, et la Grèce. L’industrie oléicole engendre, en plus de l’huile comme
produit principal, de grandes quantités de sous produits solides (grignons d’olive, feuilles et
bois de taille), et liquides (margines). Les quantités annuelles des grignons ont été estimées à
180 000 tonnes, tandis que les margines représentent un volume de 250 000 m 3 (Ben Sassi et
al., 2006). Selon les estimations, 25 kg de feuilles et brindilles (diamètre inférieur à 3 cm)
sont produites par an et par arbre (Nefzaoui, 1995).
Avec la promotion des vertus bénéfiques de l’huile d’olive pour la santé, la demande
mondiale ne cesse d’augmenter et par conséquent la production croît constamment pour
répondre aux besoins des consommateurs (COI, 2005). Ainsi, la création des moulins pour la
trituration des olives de plusieurs producteurs, forme des points de concentration des
polluants non résorbables par le pouvoir épurateur des milieux. Or, pour les huileries, la
nécessité de produire une huile de qualité, avec le minimum d’impacts négatifs sur
l’environnement, est une condition essentielle pour qu’elles puissent rester concurrentielles
sur le marché. De plus, l’image de pollueur peut nuire à l’image de marque de l’entreprise et
peut l’exposer à des sanctions Pollueur- Payeur en fonction de la législation qui devient de
plus en plus contraignante (Benyahia et Zein, 2003).
Au Maroc, le bois de taille de l’olivier (rameaux, brindilles et feuilles) ne connaît pas
d’utilité à part quelques utilisations comme combustible et aliment pour bétail (Nefzaoui,
1995). Par ailleurs dans d’autres pays, leur composition chimique, en particulier des feuilles, a
orienté de nombreuses études vers l’extraction et la bioconversion des polyphénols en
antioxydants d’intérêt industriel (Bouaziz et al., 2008 ; Lee et al., 2009).
Les moulins industriels de grande capacité posent de sérieux problèmes
environnementaux. Les margines, provenant de ces moulins, ne subissent aucun traitement et
sont souvent déversées dans les égouts d’assainissement, stockées dans des bassins
d’évaporation et/ou épandues directement sur le sol sans contrôle. Il en résulte un impact
négatif sur l’environnement qui se traduit par le colmatage des sols, la pollution des eaux
superficielles et souterraines et le dégagement d’odeurs nauséabondes. L’exemple de la
situation de l’Oued Sebou (Fès) est une illustration de ce fléau (Foutlane et al., 2002).
1

Introduction
La toxicité des margines est attribuée à la présence des acides gras libres à longue
chaîne et de composés récalcitrants, difficiles à dégrader comme les composés phénoliques,
en grande concentration (4-15 g.L -1 ), qui sont responsables d’effets phytotoxiques et
antimicrobiens (Sayadi et al., 2000; El Hajjouji et al., 2007). Les grignons d’olive possèdent
une filière de valorisation bien développée qui consiste à leur utilisation dans plusieurs
domaines comme l’extraction d’huile de grignons destinée à la fabrication du savon (Serghini
et al., 2007), l’alimentation de bétail (Haddadin et al., 2002), comme substrat pour la
production d’enzymes (Cordova et al., 1998) et pour la culture de champignons comestibles
Pleurotus sp. (Zervakis et al., 1996) et Agaricus bisporus (Altieri et al., 2009).
De nombreuses études ont été menées avec le souci de trouver des solutions permettant
le traitement des margines par des voies physiques, chimiques et/ou biologiques (Ranalli,
1991 ; Achak et al., 2008 ; Hajjouji et al., 2008). Certes, l’épandage des margines dans les
champs d’oliviers est une technique permettant un apport de minéraux (N, P) au sol et une
élimination radicale des margines. Cependant, cette technique est une pratique controversée
par la communauté scientifique (Mekki et al., 2007). Actuellement, avec les contraintes
économiques, il n’existe pas encore une solution universelle pour le traitement des margines.
Bien que la plupart des micro-organismes ne puisse se développer sur des substrats
contenant des polyphénols, certains champignons filamenteux comme les Aspergillus et des
champignons comestibles, comme Pleurotus sp. (Pleurotes) et Lentinula edodes (shiitake),
sont capables de se développer et de produire des enzymes impliquées dans la dégradation ou
la biotransformation de ces molécules en les utilisant comme sources de carbone (Tomati et
al., 2004).
Au niveau mondial, après l’A. bisporus (champignon de Paris), le deuxième
champignon commercialisé est L. edodes avec une production de plus de deux millions de
tonnes en 2002 (Royse et Sanchez-Vazquez, 2003). Depuis 25 ans (1985) le taux
d’augmentation de la production mondiale de L. edodes est d’environ 25% (Chang, 1999). La
plus grande partie de cette production commerciale (90% de la production mondiale) est
réalisée dans le Sud Est Asiatique principalement en Chine (Royse, 2001). Le champignon a
attiré l’attention de plusieurs chercheurs par ses aptitudes thérapeutiques qui sont attribuées
principalement au lentinan (Tomati et al., 2004). Le lentinan est utilisé pour ses effets anti-
tumoral, anti-inflammatoire, antiviral, antibactérien, antiparasite. Il permet la régulation de la
pression artérielle, et il est utilisé également comme agent antidiabétique et hypoglycémiant
(Tomati et al., 2004).
2

Introduction
L'utilisation de la fermentation en milieu solide (FMS) constitue une approche originale
pour connaître la physiologie de croissance du mycélium des champignons comestibles
(Martínez-Carrera et al., 1985; Roussos et al., 1997), étant donné que la plupart des études
réalisées sur la culture de champignons comestibles concernent essentiellement la production
de carpophores pour l'alimentation humaine (Martínez-Carrera et al., 1985; Pandey et al.,
2000) sans tenir compte des potentialités offertes par la biomasse mycélienne pour
l’enrichissement en protéine du résidu solide (meule) destiné à l’alimentation animale (sobal,
2002).
Le but de ce travail est de maîtriser la culture du mycélium de L. edodes sur un mélange
des substrats oléicoles (grignons d’olive, bois de la taille et les margines d’olive) pour (i) la
production de la biomasse mycélienne de L. edodes qui servira à la production du carpophore
destiné à l’alimentation humaine, et (ii) la détoxification des margines. Le substrat épuisé
pourrait être destiné à l’alimentation animale après sa détoxification.
Tout au long de ce travail, nous suivrons l’évolution de la production de la biomasse
mycélienne de L. edodes ainsi que la dégradation des phénols totaux des margines. Nous
étudierons, dans un premier temps, la tolérance des souches de L.edodes aux margines afin de
sélectionner une souche avec double compétence ;(i) production d’une grande biomasse
mycélienne en milieu solide et (ii) réduction importante de la charge phénolique des
margines. Puis nous procéderons à l’optimisation de la production de l’inoculum de
L. edodes sur les grains de blé « spawn », ainsi que les conditions de culture de L. edodes sur
les substrats oléicoles. Par la suite, une fermentation en milieu solide de L. edodes sur les
substrats oléicoles dans des conditions optimales sera suivie par respirométrie. Cette
expérience nous permettra de vérifier l’hypothèse initiale de ce travail:
« Est il possible de valoriser les trois co-produits de l’industrie oléicole (bois de taille,
grignons d’olives et margines) pour en faire un seul substrat oléicole solide, utilisé pour la
culture de Lentinula edodes en FMS».
L’étude bibliographique que nous présentons au début de ce travail, permettra de définir
la problématique des substrats de l’industrie oléicole, les techniques de culture de L.edodes,
ainsi qu’un état des connaissances des techniques de FMS. Au cours de cette étude, nous
ferons également le point sur l’état actuel des recherches sur le traitement et valorisation des
substrats de l’industrie oléicole.
3

2. ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE
2.1. Le Secteur oléicole au Maroc
2.1.1. L’olivier
Matériel et Méthodes
L'olivier constitue la principale espèce fruitière plantée au Maroc; il occupe une surface
de 650 000 ha (DPV, 2009) soit plus de 58% de la superficie arboricole totale (Fig. 1). Bien
que la superficie des oliveraies connaisse une évolution progressive ces dernières années,
l’évolution ne répond pas aux objectifs du plan national oléicole (PNO) visant de porter la
superficie oléicole à un million d'hectares à l'horizon de 2010 (DPV, 2009).
Figure 1. Evolution de la superficie de culture de l'olivier au Maroc (DPV, 2009).
2.1.2. L’huile d’olive
La production d'olives enregistrée en 2007/2008 est de l’ordre de 750.000 tonnes (DPV,
2009). La variété Picholine marocaine représente 95% des variétés cultivées au Maroc, pour
produire à la fois, les olives de table (4 ème place mondiale) et l’huile d’olive (HO). Malgré le
caractère fluctuant de la production d’HO, son évolution depuis 2002 montre une tendance à
la hausse qui est due essentiellement à une extension des superficies plutôt qu'à une
amélioration des rendements (oscillant entre 0,7 et 1,7 T.Ha -1 d’après DPV, 2008), lesquels
rendements restent faibles comparativement aux autres pays oléicoles (Grèce : 1,7 T.Ha -1 ,
Espagne : 1,6 T.Ha -1 ) (COI, 2008). La production en 2003-2004 a connu une exception, avec
une production d'huile d'olive de 112 000 tonnes (Fig. 2). Le Maroc occupe ainsi le sixième
rang mondial parmi les producteurs du pourtour méditerranéen, qui génère près de 95% de la
production mondiale en huile d’olive (Fig. 3).
5

Matériel et Méthodes
Figure 2. Evolution de la production de l'huile d'olive au Maroc (DPV, 2009).
Huile d’olive (%)
Figure 3. Répartition de la production mondiale de l’huile d’olive (%) pendant les 5
dernières années (2003 – 2008) (COI, 2008).
2.1.3. Les unités de trituration d’olives au Maroc
Au Maroc, le secteur de trituration d’olive est caractérisé par la coexistence de moulins
traditionnels (maâsras) et d’unités semi-industrielles et industrielles. Concernant le secteur
traditionnel, on note l’existence de plus de 15 600 maâsras avec une capacité annuelle de
trituration qui couvre près de 50% de la production nationale, alors que le secteur moderne et
semi-moderne est représenté par 334 unités ayant une capacité minimale de trituration
d’environ 10 tonnes/jour et susceptible d’être augmentée de façon substantielle (Fig. 4).
6

Matériel et Méthodes
Les maâsras fonctionnent majoritairement avec le procédé triphasique par le système de
presse ou de centrifugation; et ce procédé génère deux types d’effluents solides (grignons
d’olive) et liquide (margines d’olive). En plus de cette technologie, le Maroc a introduit le
procédé à deux phases qui génère des grignons humides (50 et 60 %), et une faible production
de margines.
Figure 4. Répartition et capacités de trituration des unités artisanales et industrielles au
Maroc (DPV, 2009).
Nombre de maâsras
Dans les maâsras fonctionnant avec le système de presse, les olives sont broyées et
malaxées à l’aide de broyeurs comportant une ou deux meules qui tournent avec une énergie
électrique. La pâte d’olive obtenue est répartie manuellement dans des sacs ou scourtins qui
sont ensuite empilés sous des presses hydrauliques. Il en résulte, après pression, un résidu
solide appelé grignon brut et un moût huileux constitué de l’eau de végétation (les margines)
7

Matériel et Méthodes
et de l’huile d’olive. La récupération de l’huile est obtenue après décantation accompagnée
d’une séparation par une centrifugation (Fig. 5).
Figure 5. Schéma de l’industrie oléicole équipée d’un procédé triphasique avec le
système de presse (Ismaili-Alaoui et Heddoun, 2006).
2.1.4. Les bilans quantitatifs des sous produits de l’industrie oléicole
L’industrie oléicole engendre, en plus de l’huile d’olive comme produit principal, trois
sous produits de type solide (produits de la taille des oliviers, les grignons d’olive) et de type
liquide (margines d’olive) (Fig. 6).
Après la récolte des olives, les oliviers subissent en général une taille sévère un an sur
deux et une taille légère l’année suivante. Les quantités des produits de la taille ont été
estimées à 25 kg de feuille et brindilles (diamètres inferieurs à 3 cm) produites par an et par
arbre, selon Nefzaoui (1995).
8

Matériel et Méthodes
Par ailleurs, les quantités des grignons d’olive et des margines dépendent étroitement du
procédé de trituration appliqué. Les bilans massiques en grignons et en margines pour chaque
procédé de trituration appliqué au Maroc sont reportés dans le Tableau 1.
Tableau 1. Bilan matière en grignons et margines obtenus par différents procédés de
trituration des olives, 100 kg d’olives donnent en moyenne 20 kg d’huile d’olive.
Procédé de Grignons d’olive Margines Références
trituration
d’olive
Triphasique par 40 kg avec 30-40% 40 kg Amirante et al., 1993
presse
d’humidité
Triphasique avec
centrifugation
55 kg avec 40-50%
d’humidité
biphasique 70 kg avec 60-70%
d’humidité
2.1.5. Le bois de taille de l’olivier
>100 kg Amirante et al., 1993
10 kg Di Giovacchino, 1988 ;
Bing et al., 1994
La composition chimique des feuilles et brindilles varie en fonction de nombreux
facteurs; variété, conditions climatiques, époque de prélèvement, âge des plantations
(Nefzaoui, 1995). La teneur en matières azotées totales des feuilles varie de 9 à 13%, alors
que celle des rameaux ne dépasse guère 3 à 6 %. La teneur en lignine est de 18 à 20 %. Les
résidus de la taille ont des applications nombreuses, entre autres l’utilisation dans
l’alimentation animale. Ils peuvent être utilisés comme combustibles, servir à la fabrication de
compost, ou constituer la matière première dans l’industrie du papier ou la fabrication des
meubles (Nefzaoui, 1995). Récemment, une étude a été menée dans le but d’améliorer la
digestibilité et la valeur nutritive de cette biomasse (feuilles d’olive et brindilles) par un
traitement biologique (Fayed et al., 2009) consistant en une culture de moisissures. D’autres
études ont porté sur la bioconversion des polyphénols des feuilles en antioxydants destinés
aux industries agroalimentaire et pharmaceutique (Bouaziz et al., 2008 ; Lee et al., 2009). Par
ailleurs, à cause de la disponibilité saisonnière des feuilles d’oliviers, d’autres auteurs ont mis
l’accent sur le séchage des feuilles afin d’assurer une conservation et une disponibilité de
cette biomasse toute l’année pour des éventuelles applications (Molina-Alcaide, 2008; Erbay
et Icier 2009).
2.1.6. Les grignons d’olive
Les principaux déchets solides générés lors de l’élaboration de l’huile d’olive sont les
grignons. Les grignons d’olives contiennent une quantité d’huile résiduelle qu’il n’est pas
possible d’extraire par des moyens physiques et qui est obtenue dans les installations
d’extraction d’huile de grignons par l’utilisation des solvants comme l’hexane. La
9

Matériel et Méthodes
composition des grignons dépend étroitement de la variété d’olives, le degré de maturation
des olives et le système employé lors de l’extraction de l’huile d’olive. Le tableau 2 montre la
composition chimique des grignons obtenus lors de l’élaboration de l’huile d’olive avec
différents procédés et provenant d’origines variées.
Contrairement aux autres tourteaux oléagineux, les grignons d’olive bruts sont pauvres
en matières azotées et riches en cellulose brute. Ils restent relativement riches en matières
grasses (huile d’olive). Le dénoyautage partiel réduit les teneurs en cellulose brute par
l’élimination partielle des noyaux d’olives. Dans une autre étude, Chiofalo et al. (2004) ont
constaté une nette différence entre le rendement gras des grignons de pressoir et les grignons
des systèmes en continu. La différence est due fondamentalement à l’efficacité d’extraction
des systèmes en continu par rapport aux systèmes traditionnels.
Tableau 2. Composition chimique indicative des différents types de grignons (DPV, 2009).
Type Matière
* p.d. = partiellement dénoyauté
2.1.7. Les caractéristiques des margines d’olive
Les margines ont un aspect trouble, une coloration brun-rougeâtre à noire. Cette couleur
est fonction de l’état de dégradation des composés phénoliques et des olives dont ils dérivent
(Hamdi et Ellouz, 1993). Leur odeur rappelle celle de l’huile d’olive, mais elle peut devenir
gênante lors des phénomènes de rancissement ou de fermentation anaérobie (Ranalli, 1991).
Les composés fondamentaux des margines sont l’eau (83.2 %), les substances organiques
(15 %) et les substances minérales (1.8 %) (Fiestas et Borja 1992). Les variations des
caractéristiques des margines résultent du type du procédé d’extraction de l’huile, de la
qualité et de la variété des olives et de la conduite des opérations d’extraction (Mouncif et al.,
1993).
sèche (%)
% de la matière sèche
Matière
minérale
Matière
azotée totale
Cellulose
brute
Matière
grasse
Grignon brut 75 - 80 3 - 5 5 - 10 35 - 50 8 - 15
Grignon gras p. d.* 80 - 95 6 - 7 9 - 12 20 - 30 15 - 30
Grignon épuisé 85 - 90 7 - 10 8 - 10 35 - 40 4 - 6
Grignon épuisé p.d. 85 - 90 6 - 8 9 - 14 15 - 35 4 - 6
Pulpe grasse 35 - 40 5 - 8 9 - 13 16 - 26 26 - 33
10

2.1.7.1. pH, conductivité et matière sèche
Matériel et Méthodes
Les margines ont un pH acide avec des valeurs comprises entre 4.2 et 5.9 (Eroglu et al.,
2008). Lors des traitements biologiques des margines, une correction du pH peut s'avérer
nécessaire (El Hajjouji et al., 2008). La chaux vive a été souvent utilisée pour ajuster le pH
des margines. En effet, Ranalli (1991) rapporte qu'il faut 1 kg de chaux par 1 m 3 d'effluent
afin de faire augmenter le pH d'un point.
La conductivité électrique est étroitement liée à la concentration des substances
dissoutes et à leur nature. Dans le cas des margines, les valeurs de cette conductivité varient
entre 18 et 50 ms.cm -1 (Di Serio et al., 2008). Cette mesure ne donne pas forcément une idée
immédiate sur la charge minérale du milieu (Paredes et al., 2005). L'extrait sec des margines
est extrêmement élevé et variable. Il est situé entre 15.5 et 266.5 kg.m -3 pour les margines de
pression et entre 9.5 et 161.2 kg.m -3 pour les margines de centrifugation (Di Giovacchino et
al, 1988).
2.1.7.2. Charge minérale et métaux lourds
Les margines sont très riches en cendres, leur teneur varie de 4 à 42 g.L -1 pour celles
issues de l'extraction par pression et 0.4 à 12.5 g.L -1 pour celles de centrifugation (COI, 2008).
Tableau 3: Valeurs minimales et maximales des minéraux et métaux lourds déterminées sur les
margines issues des deux systèmes d'extraction de l’huile (COI, 2008).
Eléments
(mg.L -1 )
Procédé d’extraction de l’huile
Pression Centrifugation
Sodium 38 - 285 18 - 124
Potassium 1500 - 5000 630 - 2500
Calcium 58 - 408 47 - 200
Magnésium 90 - 336 60 - 180
Fer 16.40 - 86.40 8.80 - 31.50
Cuivre 1.10 - 4.75 1.16-3.42
Zinc 1.60 - 6.50 1.42-4.48
Manganèse 2.16 - 8.90 0.87 - 5.20
Nickel 0.44 - 1.58 0.29 - 1.44
Cobalt 0.18 - 0.96 0.12-0.48
Plomb 0.40 - 1.85 0.35 - 0.72
11

Matériel et Méthodes
Il ressort du Tableau 3 que les margines sont très riches en potassium, ce qui a conduit
plusieurs chercheurs à tester leur pouvoir fertilisant. La différence de concentration, en
minéraux et métaux lourds des margines entre les deux procédés, peut être expliquée par le
fait que, durant la trituration des olives par le procédé de centrifugation, on ajoute de l’eau
chaude, ce qui entraîne une diminution de la concentration des éléments minéraux.
2.1.7.3. Fraction organique
Les margines d’olive ont un pouvoir polluant très important avec une demande
biologique en oxygène (DBO) de 100 g.L -1 (Rosario et al., 1999) et une demande chimique en
oxygène (DCO) de 200 g.L -1 (Rosario et al., 1999). Ces valeurs sont 200 à 400 fois
supérieures à celles des eaux municipales (Cossu et al., 2001). La matière organique des
effluents d’huileries d’olive est constituée par des polysaccharides (13-53%), des protéines (8-
16%), des composés phénoliques (2-15%), des lipides (1-14%), des polyalcools (3-10%) et
des acides organiques (3-10%) (Fiestas et Borja, 1992). Cette composition résulte de la
destruction des tissus de l’olive au cours de la trituration et de l’extraction de l’huile (Cossu et
al., 1993 ; Al Mallah et al., 2000; Centi et al., 2000; Chamkha et al., 2001).
2.1.7.4. Fraction phénolique
Les phénols totaux sont en quantité appréciable (5,5 à 12 g.L -1 de margines) dans les
effluents des huileries d'olive (Fenice et al., 2003 ; Ben Sassi et al., 2006). Les monomères les
plus rencontrés dans les margines sont présentés dans le Tableau 4. La formation des phénols
libres dans les margines est due à l'hydrolyse enzymatique des glucosides et des esters de la
pulpe des olives, au cours du processus d'élaboration de l'huile (Ranalli, 1991). Le pigment
catéchol-mélaninique (flavonoïde) ne se retrouve pas dans les olives mais se forme pendant le
broyage des olives à partir des ortho-diphénols dont la pulpe est riche, sous l'action des
polyphénol-oxydases (enzymes inactives dans les drupes entières) qui en déterminent la
quinonisation, puis la polymérisation. Les margines sont riches en hydroxytyrosol qui possède
une activité antioxydante très importante recherchée dans le domaine agroalimentaire,
cosmétique et pharmaceutique (Manna et al., 1999 ; D'Angelo et al., 2005 ; Hamden et al.,
2009).
12

Matériel et Méthodes
Tableau 4. Structure te teneur des monomères phénoliques rencontrés dans les margines.
Composés phénoliques Structure Teneurs Références
Acide cafféique (mM)
Acide p-coumarique
(mM)
Oleuropéine (mM)
Hydroxytyrosol (mg.L -1 )
Tyrosol (mg.L -1 )
Acide vanillique (mg.L -1 )
Acide ferrulique (mg.L -1 )
0,32-1,36 D’Annibale et al.,
2004 ; El Hajjouji et
al., 2007
0,19- 0,57 D’Annibale et al.,
2004 ; El Hajjouji et
al., 2007
0,056 El Hajjouji et al.,
2007
37,9-143,34 Fki et al., 2005 ;
Ergül et al., 2009
8,51-9,43 Fki et al., 2005 ;
Ergül et al., 2009
20 Azabou et al., 2007
95 D’Annibale et al.,
2004 ; Fki et al., 2005
La variation de la quantité des composés phénoliques dans les margines citée dans la
littérature, dépend, en plus des conditions citées auparavant (procédé de trituration, variété
d’olives, l’âge des margines), du procédé d’extraction et des techniques d’analyses qualitative
et quantitative des monomères phénoliques (Hamdi 1996; De Marco et al., 2007).
2.1.7.5. Caractéristiques microbiologiques
Dans les margines d’olive, seuls quelques microorganismes arrivent à se développer. Ce
sont essentiellement des levures et des moisissures. Dans la plupart des cas, il y a absence de
microorganismes pathogènes et ils ne posent alors aucun problème de point de vue sanitaire.
Le pouvoir antimicrobien des margines (Ramos-Cormenzana et al., 1996) est lié
essentiellement à l’action exercée par les phénols monomériques et les pigments bruns ou
13

Matériel et Méthodes
catéchol-mélaninique (Hamdi et Ellouz 1993). Ces effluents agissent sur les bactéries en
dénaturant les protéines cellulaires et en altérant les membranes (Ranalli, 1991). Ils peuvent
inhiber également l’activité des bactéries symbiotiques fixatrices d’azote dans le tube digestif
des ruminants en inhibant leur activité enzymatique (Hattenschwiler et Vitousek 2000).
2.2. L’impact des margines d’olive sur l’environnement, traitements
et valorisation
Le rejet des margines d’olive sans traitement est un problème majeur dans les pays
producteurs de l’huile d’olive du bassin méditerranéen. Au Maroc, la production annuelle de
ces effluents est estimée à environ 250 000 m 3 (FODEP, 2004). Ces margines engendrent de
sérieux dégâts environnementaux. L’absence de méthodes de traitements adaptées aux
besoins des unités de trituration pousse les propriétaires à rejeter ces eaux dans la nature sans
aucun contrôle et par la suite à surcharger le réseau d’égouts avec des substances toxiques. La
concentration et la charge en matières organiques ne peut qu’entraîner un disfonctionnement
des stations d’épuration.
2.2.1. L’impact sur les eaux : cas de l’Oued Sebou (Fès)
En plus des désagréments visuels et des mauvaises odeurs, la forte charge organique des
margines détruit totalement la faune et la flore aquatique par absorption de tout ou partie de
l'oxygène dissous dans les eaux. Le déversement de la totalité des margines dans l’oued
Sebou provoque de graves pollutions (Foutlane et al., 2002). Les rejets lors des campagnes de
trituration font augmenter la DBO des eaux du Sebou d'une manière dramatique, au point de
faire chuter à zéro le taux d'oxygène dissous et ce sur plusieurs dizaines de kilomètres
(Fig. 6). La capacité d'autoépuration de l'oued est ainsi annihilée. Conjuguée aux effets de la
salinité des margines déversées dans l’Oued, toute vie aquatique s'en trouve totalement
inhibée.
Pendant la campagne oléicole au Maroc qui dure approximativement d'octobre à février
(4 à 5 mois), la qualité des eaux de l'Oued Sebou en aval de la ville de Fès, se trouve en effet
très dégradée. À titre d'exemple pendant la campagne 1991/92, ses eaux étaient tellement
polluées que l'Office National des Eaux Potables (ONEP) s'est trouvé dans l'obligation
d'arrêter trois stations de traitement de l'eau de l'oued Sebou pour la production de l'eau
potable, et la ville de Fès était sur le point de manquer d'eau potable.
14

Matériel et Méthodes
Figure 6. Evolution de la DCO dans les eaux l’Oued Sebou avant, pendant et après
la période d’activité des huileries (Foutlane et al., 2002).
2.2.2. L’impact sur le sol
La diminution progressive du contenu de substance organique dans les sols,
subordonnée à l´agriculture intensive, est particulièrement préoccupante, étant donné la
décomposition rapide de la substance organique. Les conséquences d’une telle diminution
sont immédiatement identifiables par la dégradation des propriétés physiques des sols
accompagnée de l’augmentation des risques d´érosion. L'utilisation agronomique de la
biomasse résiduelle, comme les sous-produits de l´industrie oléicole, demeure un moyen pour
réintégrer la perte de substance organique, pour recycler de manière correcte les éléments
nutritifs et finalement pour la possibilité d'écouler ces refus au plus bas coût possible.
15

Matériel et Méthodes
Pour une évaluation quantitative des modifications physiques et chimiques des terrains
traités avec les restes de trituration des olives, il est nécessaire de tenir compte de la
considérable variabilité de la composition chimique de ces matériaux, tous caractérisés par un
pH bas et une concentration élevée en sels et en substances organiques contenant des fractions
difficilement biodégradables. En outre, la composition chimique de ces matériaux est même
variable pendant leur stockage soit du fait de la sédimentation partielle de la fraction
insoluble, soit de la transformation microbiologique de la substance organique et l'évaporation
de la composante aqueuse.
2.2.3. Les traitements des margines
Dans la littérature, on rencontre de multiples solutions de traitement des margines
d’olive. Les techniques de traitement des margines sont basées sur différents procédés
physiques, chimiques et/ou microbiologiques. Bien qu’il n’existe pas encore de solution
parfaite permettant d’éliminer la pollution des margines, certains procédés semblent être plus
efficaces que d’autres. Les choix opérés par les décideurs dépendront ainsi des contraintes, du
moment et des facteurs multiples et complexes d'ordres socio-économique, technique et
politique. Le Tableau 5 résume les différents procédés de traitement des margines rencontrés
dans la littérature.
16

Tableau 5. Procédés de traitement des margines.
Procédé Traitement Remarques Références
Thermiques
Physico-
chimique
Biologique
Evaporation
naturelle
Procédé ralenti, grandes
superficies,
Evaporation forcée 40 fois plus importante que
l’évaporation naturelle
Incinération L'énergie nécessaire est
Filtration/
Ultrafiltration
obtenue par combustion du
grignon.
Ozonation 80% de réduction des
Matériel et Méthodes
Ranalli, 1991
Fiestas et Borja,1992
Ranalli, 1991
Réduction de 63% de DCO Pietro et al., 1988
polyphénols
Décoloration 15% de décoloration avec
Traitement
électrochimique
coagulation-
floculation
(CaO) [4 à 35 g.L -1 ]
Oxydation des composés
phénoliques par électrolyse
Andreozzi, 1988
Flouri et al., 1997
Longhi et al., 2001
Scandia vision Jaouani et al., 2005 ;
Achak et al., 2008
électrocoagulation Seam Adelpa Inan et al., 2004 ;
traitement
anaérobie
Prétraitement exigé pour
augmenter le rendement
Khoufi et al., 2008
Hamdi, 1992 ; Azbar et
al., 2008
traitement aérobie Champignons Balice et al., 1988 ; El
2.2.4. La valorisation des margines
Hajjouji et al., 2008
Compte tenu de leur pourcentage en matière organique (10 à 25%) et de leur
composition chimique, les margines seules ne peuvent constituer un produit de valeur ajoutée
intéressante. Enrichies, mélangées à d’autres résidus agricoles, concentrées, séchées et/ou
purifiées, elles peuvent être valorisées et employées pour la production de certains
composants de valeur ajoutée. Au cours des dernières décennies, des études de plus en plus
17

Matériel et Méthodes
nombreuses ont été conduites par plusieurs chercheurs avec la vision de développer
différentes applications de valorisation des margines en vue de limiter leur effet polluant.
2.2.4.1. Extraction des antioxydants (hydroxytyrosol)
En vue de proposer des solutions adéquates, la société Biovalor a investi plus de 2
millions de DH dans une unité sise dans la région de Fès pour l'extraction des antioxydants
existant dans les margines, en particulier l’hydroxytyrosol. Elle est dotée d’un laboratoire
d’analyse, une chaîne de froid pour le stockage des margines, et deux machines de traitement
et de valorisation. Le procédé d’extraction des polyphénols de margines consiste à ajouter un
polysaccharide aux margines, puis à atomiser le mélange pour obtenir une poudre contenant
les composés phénoliques encapsulés à l’intérieur de la structure du polymère. Si cette
opération est coûteuse, elle est néanmoins efficace et permet en même temps de traiter les
margines en récupérant une eau utilisable dans l’agriculture.
Reste à signaler que le traitement des margines de Fès, en grande quantité (10 tonnes
par jour), nécessite au moins 70 millions de Dirham marocain. La rentabilité annuelle est
estimée par Biovalor à 15% du total des investissements. Il serait, en outre, judicieux de
souligner que, par rapport aux autres procédés proposés actuellement, celui-ci donne une
solution efficace et valorisante à ces résidus.
2.2.4.2. Culture de champignons supérieurs
Les champignons, en particulier les basidiomycètes, sont connus pour produire des
enzymes impliquées dans la dégradation de la lignine (Mishra et Leatham 1990; Elisashvili et
al., 2008). Dans cette vision, plusieurs études ont été menées sur la dégradation des
polyphénols des margines par les champignons, en particulier les basidiomycètes et des
ascomycètes de genre d’Aspergillus (Garcia et al., 2000; D'Annibale et al., 2004; Olivieri et
al., 2006; Zenjari et al., 2006; Di Serio et al., 2008). L’arsenal d’enzymes impliquées dans la
décoloration, et la réduction des polyphénols des margines, diffère en fonction de l’espèce de
champignon. Les enzymes les plus rencontrées dans la dégradation des polyphénols sont les
laccases, Mn peroxydase et lignine peroxydase (Sayadi et Ellouz, 1993; D'Annibale et al.,
2004; Silva et al., 2008).
Par ailleurs, il y a peu d’études traitant l’utilisation des margines dans la culture des
champignons comestibles. En effet, différents substrats lignocellulosiques mélangés avec des
margines d’olive à différentes concentrations ont été testés pour la culture de Pleurotus sp.
(Zervakis et al., 1996; Kalmis et Sargin 2004).
18

Matériel et Méthodes
2.3. Le champignon comestible, Lentinula edodes (Berk.) Pegler
2.3.1. Définition des champignons
Les champignons sont définis comme des organismes eucaryotes sporogènes non
chlorophylliens, se reproduisant par voie sexuée ou asexuée. Ils sont à la base de nombreux
procédés biotechnologiques allant de la production d’aliments fermentés comme les fromages
à celle de molécules à haute valeur ajoutée comme les vitamines, les antibiotiques ou les
enzymes (Cohen et al., 2002). Le développement des champignons se fait par croissance
apicale du mycélium dans toutes les directions et de façon identique. Ce mode de croissance
se traduit par la mise en place de colonies circulaires caractéristiques des champignons sur
milieu gélosé (Roussos et Raimbault 1982; Gervais et Bensoussan, 1994).
2.3.2. La physiologie de croissance des champignons
Les champignons macromycètes (champignons supérieurs), par opposition aux
moisissures (micromycètes), présentent un cycle de développement en deux phases
(Alexopoulos et Mims, 1979) : i) la phase haploïde conduisant à la formation de mycélium
capable de coloniser le milieu, ii) la phase dicaryotique conduisant à la formation du
carpophore, communément appelé champignon où se trouvent les basides et les basidiospores.
Pendant la croissance du mycélium, il y a une production de métabolites primaires et
secondaires, de CO2 et une consommation d’O2. De façon générale, le métabolisme des
champignons filamenteux est divisé en métabolisme primaire et secondaire. Le métabolisme
primaire est le résultat de quelques réactions chimiques catalysées par les enzymes qui
procurent aux cellules l’énergie nécessaire pour la production de nouvelles cellules et la
formation de macromolécules indispensables (protéines, polymères structuraux et ADN). À
partir de ce métabolisme, on peut obtenir un grand nombre de molécules d’intérêt industriel
comme l’acide citrique, différents acides organiques, alcools et aussi de nombreuses
d’enzymes comme les cellulases, lipases, etc. (Roussos et Raimbault 1982; Cordova et al.,
1998). Ces métabolites primaires se produisent en général pendant la phase de croissance
exponentielle du mycélium.
Les champignons filamenteux comme Aspergillus, Penicillium, Rhizopus et
Trichoderma sont les microorganismes les mieux adaptés pour la culture en milieu solide
(Roussos, 1985; Oriol, 1987; Cordova et al., 1998). Les champignons saprophytes (Agaricus,
Pleurotus, Lentinula) se développent très bien en milieu solide sur différents substrats
19

Matériel et Méthodes
agricoles (Philippoussis et al., 2001; Royse et Sanchez-Vazquez 2001; Philippoussis et al.,
2003; Philippoussis et al., 2007). Ces microorganismes sont adaptés à certaines conditions de
culture, température, pH, disponibilité en eau et oxygène, et peuvent se développer en culture
solide sur différents substrats agricoles.
Les champignons ectomycorriziens (Lactarius, Pisolithus, Suillus) ont été également
cultivés en FMS, mais des recherches sont encore nécessaires afin de maîtriser leur
domestication pour la production de carpophores (De Araujo et al., 2000). En raison des
grandes potentialités présentées par le mycélium de certains champignons supérieurs, diverses
études ont trouvé des applications de la phase végétative comme le Claviceps (Trejo-
Hernandez, 1992) et les morilles qui développent des arômes caractéristiques (Kabbaj, 1997).
2.3.3. Les techniques générales de culture de L. edodes
La culture de L. edodes s’effectue selon deux méthodes différentes ; culture sur buches,
qui est la culture traditionnelle, et culture sur des substrats synthétiques, qui est la méthode la
plus répandue actuellement. Le principe de la culture, consiste à ensemencer un substrat
donné avec le mycélium du L. edodes qui s’est développé auparavant sur un support à base de
bois ou de grains de céréale (spawn). Par la suite, le substrat inoculé est incubé dans les
conditions favorables de la souche utilisée, pour le développement du mycélium et pour la
formation des carpophores. La technique générale de culture de L. edodes dans les colonnes
de Raimbault est basée sur les travaux de Sobal (2002) et Kabbaj (1997).
2.3.3.1. Culture sur bûches
L’intérêt de cette technique réside dans l’utilisation des installations simples pour sa
réalisation. Par ailleurs, il est recommandé d’appliquer cette technique traditionnelle dans des
régions tempérées et humides avec une variation de température allant de 15 à 25°C (Royse,
2001). Le processus de culture est résumé en 5 étapes ; préparation des buches, inoculation,
incubation, induction et fructification (Figure 7).
20

Figure 7. Processus général de culture de L. edodes sur bûches.
2.3.3.2. Culture sur substrats synthétiques
Matériel et Méthodes
A cause de la limitation géographique du chêne, bois sur lequel se développe
naturellement L. edodes, différents substrats agricoles synthétiques ont été testés pour la
production de L. edodes (Philippoussis et al., 2000 ; 2001). Parmi les avantages de cette
technique, on trouve la possibilité d’utiliser des sous-produits de l’agriculture et des industries
agroalimentaires, la réduction du temps de culture, l’augmentation de l’efficience biologique
et la possibilité d’avoir une production indépendante des conditions climatiques (Mata, 1997).
Mais ce processus de culture nécessite des installations sophistiquées, une bonne maitrise de
la technologie et de la biologie du champignon. Les étapes de la culture sont les
suivantes (Mata, 1997) :
a) Préparation du substrat. Le substrat pour la culture de L. edodes est obtenu à partir
d’un mélange de produits lignocellulosiques, de suppléments nutritifs et d’eau. Le
champignon L. edodes est capable de se développer sur une gamme diverse de substrats
lignocellulosiques qui ne nécessitent pas de traitement de compostage au préalable. Toutefois,
la sciure du bois a été utilisée comme substrat de culture de L. edodes.
21

Matériel et Méthodes
b) Traitement thermique. Pour éviter toute contamination du substrat par d’autres
communautés microbiennes compétitrices, deux procédés de traitement sont utilisés:
i) La stérilisation élimine tous les microorganismes présents dans le substrat. Elle est
utilisée pour les substrats fortement supplémentés. Le substrat est conditionné dans des sacs
plastiques et stérilisé en autoclave à 121°C pendant 1 heure.
ii) La pasteurisation consiste à maintenir dans le substrat une température constante,
autour de 65°C pendant au moins 24 h.
c) Inoculation ou lardage. L’inoculation avec le blanc (spawn) est une étape très
importante de la culture. Pour les substrats stérilisés, l’inoculation s’effectue dans un local
stérile avec de l’air filtré. Par contre, pour un substrat pasteurisé, le substrat peut être inoculé
juste dans un endroit propre. Le taux d’inoculation varie en fonction du procédé thermique
utilisé, du substrat, et de la souche. En général un apport de 3 à 10% est pratiqué (Royse et
Sanchez-Vazquez, 2001; Zhang et al., 2002; Royse et Sanchez-Vazquez, 2003).
d) Incubation. Les conditions nécessaires pour le développement du mycélium sont la
température, l’oxygénation et les périodes d’éclairage. Ce dernier est indispensable durant la
période de formation des sporophores. La durée d’incubation varie entre 1 et 3 mois selon la
souche utilisée et la nature du substrat (Philippoussis et al., 2001; Philippoussis et al., 2003;
Royse et Sanchez-Vazquez 2007; Shen et al., 2008).
e) Induction de fructification. Apres l’envahissement total du substrat, le mycélium
forme de petites agrégations à l’origine des primordia. A ce stade, il faut enlever le sac
plastique et placer le bloc dans une sale éclairée, humidifiée (85-90%) et à une température
entre 15-18°C. L’application d’un choc thermique est pratiquée pour certaines souches.
f) Production et récolte. Durant la fructification, les conditions d’induction sont
maintenues. La maturité des carpophores est atteinte après 10-15 jours de leur apparition.
2.3.3.3. Culture sur substrats alternatifs
Dans la littérature, plusieurs formules de substrats ont été testées pour remplacer la
culture de L. edodes sur les buches. La sciure de bois de chêne a été utilisée pour la culture de
base de L. edodes (Levanon et al., 1993; Royse et Sanchez-Vazquez 2007). Par ailleurs des
substituts du bois, riches en lignocellulose, permettant un meilleur rendement en L. edodes ont
été testés (Zervakis et al., 1996; Curvetto et al., 2002a,b; Özçelik et Peksen 2007).
La formulation des substrats dédiés à la culture de L. edodes nécessite de tenir compte
de leur composition chimique. La composition des résidus lignocellulosiques varie selon leur
nature et leur structure. Ainsi, la teneur en lignine est un facteur qui limite la croissance des
22

Matériel et Méthodes
champignons. La décomposition d’un résidu lignocellulosique comprend au moins deux
étapes selon Chalaux (1993) ; tout d’abord, les sucres solubles et une partie de la cellulose et
des hémicelluloses sont dégradés; ensuite, la dégradation des composés lignifiés est réalisée.
Selon ce modèle, la vitesse de transformation des résidus lignocellulosiques est
essentiellement conditionnée par la composition des substrats. Cependant, d’autres facteurs
affectent la décomposition de ces matériaux, en l’occurrence la température, l’humidité, et la
qualité du matériel.
2.3.4. Les phénoloxydases, les laccases
Les phénoloxydases (PO) jouent un rôle polyvalent dans la transformation des produits
agricoles, puisqu’elles sont impliquées dans la minéralisation de composés phénoliques
récalcitrants naturels, tels que la lignine, et dans la formation des substances humiques
(Widsten et Kandelbauer, 2008). Les PO utilisant l’O2 dans leur cycle catalytique
comprennent deux classes d’enzymes: les laccases et les tyrosinases (Durán et Esposito,
2000).
2.3.4.1. Structure des laccases
Les laccases (E.C. 1.10.3.2 benzenediol: oxygen oxidoreductase) sont des
métalloenzymes contenant des atomes de cuivre au niveau de leurs sites actifs respectifs; elles
assurent simultanément l’oxydation de composés phénoliques et la réduction de l’O2 (Enguita
et al., 2003). Les atomes de cuivre présents dans la structure des laccases sont de trois types.
• Le cuivre de type 1 confère à la molécule sa couleur bleue et présente un pic
d’absorption à 610 nm.
• Le cuivre de type 2 n’a pas d’absorption dans le visible.
• Les 2 atomes de cuivre de types 3 présentent une absorption à 330 nm.
2.3.4.2. Mécanismes d’action des laccases
Le mécanisme d’action général des laccases consiste en une réaction d’oxydation de
composés aromatiques, faisant intervenir quatre électrons, couplée à la réduction de l’oxygène
moléculaire en eau. Au niveau du site réactionnel, le cluster formé par les atomes de cuivre de
type 2 et 3 est crucial pour la réduction de l’oxygène. L’oxydation des substrats aboutit à la
formation d’un radical actif qui peut subir d’autres réactions non enzymatiques :
i) Polymérisation des monomères : l’oxydation enzymatique des composés phénoliques
conduit à la formation des intermédiaires qui sont des radicaux libres qui réagissent entre eux
23

Matériel et Méthodes
pour former des dimères, des oligomères ou des polymères couplés avec des liaisons
covalentes C-C, C-O ou C-N.
ii) dégradation des polymères : les laccases sont impliquées dans la dégradation de
polymères naturels, tels que la lignine, les acides humiques (Claus et Filip 1998). En effet, la
formation des radicaux produits conduit à la rupture de liaisons covalentes et par la suite à la
libération des monomères. La dépolymérisation peut avoir lieu également indirectement, par
l’intermédiaire des médiateurs, qui sont des composés organiques ou des métaux oxydés par
l’action des laccases tels que l’alcool vératrylique ou les atomes de manganèse. Dans les
procédés biotechnologiques, les médiateurs sont souvent utilisés pour accroître le potentiel
d’oxydation des laccases (Claus et al., 2002; Farnet et al., 2004).
2.3.4.3. Applications des laccases
Les laccases sont des enzymes d’intérêt majeur dont la régulation est associée à la
morphogenèse du corps fructifère chez les basidiomycètes et leur production est influencée
par la qualité du substrat de culture (Lechner et Papinutti 2006). Elles semblent aussi être
impliquées dans les processus de production de la biomasse mycélienne (Mansur et al., 2003)
et d’inhibition du développement des moisissures comme les Trichoderma (Velazquez-
Cedeño et al., 2008). Les laccases ont montré une grande capacité à l’oxydation d’un large
spectre de molécules phénoliques (Durán et Esposito 2000). Elles sont utilisées pour
délignifier des complexes lignocellulosiques et améliorer la production du bioéthanol obtenu
à partir de ces complexes. Elles sont employées dans différents procédés de bioremédiation
pour protéger l’environnement de dommages créés par des effluents industriels (Mayer et
Staples 2002). Les laccases fongiques sont capables de décolorer l’eau de teinture des textiles
(Eichlerova et al., 2006; Zouari-Mechichi et al., 2006). Après la récolte des champignons, le
compost résiduel est une source potentielle de laccases et qui pourrait être valorisée par
différents usages (Trejo-Hernandez et al., 2001). Les laccases ont été utilisées aussi pour le
traitement des margines d’olive qui seraient utilisées comme amendement des sols
(D'Annibale et al., 2000; 2004).
2.4. Les fermentations en milieux solides
Les fermentations en milieu solide (FMS) ont été pratiquées depuis très longtemps de
façon artisanale en alimentation humaine traditionnelle. Elles concernent essentiellement les
transformations de produits agricoles par les champignons inférieurs. En occident, les FMS
sont devenues des techniques essentielles pour la fabrication de produits fermentés tels que le
24

Matériel et Méthodes
fromage. Par contre dans les pays asiatiques, ces fermentations sont utilisées essentiellement
dans la fabrication des produits à base de protéines végétales comme celle issues du soja
(Raimbault, 1980).
2.4.1. Définition des FMS
La FMS est définie comme étant la croissance de micro-organismes sur des substrats
solides en absence totale ou presque d’eau libre (Raimbault, 1980, Pandey et al., 2000). Sa
traduction en anglais est Solid State cultivation ou Solid Substrate Fermentation ou encore
Solid State Fermentation. Hesseltine (1987) l’a définie comme étant, une fermentation dans
laquelle le substrat n’est pas soluble dans une phase liquide.
Selon d’autres chercheurs (Raimbault, 1980; Lonsane et al., 1985; Oriol, 1987; Trejo-
Hernandez, 1992; Saucedo-Castañeda, 1995), la FMS est une culture microbienne qui se
développe en surface et à l’intérieur d’une matrice poreuse et en absence de tout écoulement
liquide. La matrice poreuse peut être constituée d’un substrat humide ou d’un support inerte
capable d’absorber les nutriments qui se trouvent à l’état dissous. D’après ces définitions, les
auteurs s’accordent à définir la FMS comme étant une fermentation ou une culture de micro-
organismes sur un milieu ou substrat solide en absence d’eau libre. En fonction de la nature
du support, on peut distinguer deux types de fermentations en milieu solide (Raimbault,
1980 ; Roussos, 1985, Saucedo-Castañeda, 1995) :
i) Culture solide sur une phase substrat-support qui est constituée d’un matériau
assurant une double fonction : support et source de nutriments.
ii) Culture solide avec une phase support constituée d’un matériau inerte, imprégné d’un
milieu liquide nutritif.
Dans la FMS, la capacité d’absorption d’une culture liquide est un facteur important à
contrôler. Les matériaux utilisés sont divers et la plupart ont une forte capacité de rétention
d’eau tels que la bagasse de canne à sucre, l’écorce de bois ou la mousse de polyuréthane
(Contreras-Domínguez, 2007; Hassouni, 2007).
2.4.2. Les principaux paramètres des FMS
Le développement de microorganismes sur différents substrats ou supports solides
dépend principalement des paramètres suivants ; la quantité d’inoculum, l’humidité et
l’activité de l’eau, l’aération et le transfert d’oxygène, la régulation de la température et du
pH. Pour mesurer la croissance du microorganisme en FMS, on peut faire appel à la
respirométrie, aux analyses de la biomasse avec différentes méthodes indirectes
25

Matériel et Méthodes
(protéines, chitine, ergostérol, acides nucléiques) ou à la production de différents métabolites
(Durand, 2003).
2.4.2.1. Microorganismes et l’inoculation du milieu solide
Les champignons filamenteux, contrairement aux organismes unicellulaires, sont les
mieux adaptés à la FMS en raison de leur capacité à la colonisation des substrats par
l’émission de filaments. Dans les procédés de FMS, on utilise deux types d’inoculation : la
microflore endogène du substrat ou des ferments contrôlés (Raimbault et Alazard, 1980;
Roussos et al., 1989). Dans les procédés de compostage et d’ensilage, on utilise la microflore
naturelle, alors que dans les procédés de production d’enzymes et d’aliments fermentés, on
utilise des ferments avec une ou plusieurs souches, cultures mixtes, (Perraud-Gaime, 1995).
2.4.2.2. Choix du support/substrat
Le support solide doit combler les besoins nutritifs du microorganisme, mais aussi
assurer quelques impératifs physiques essentiels au bon déroulement de la FMS comme le
transfert de chaleur et de masse, la granulométrie, la porosité, la capacité d’absorption de
l’eau et la résistance à la compression et à l’agitation (Raimbault, 1980). La sélection du
substrat dépend de son coût et de sa disponibilité. Sur le plan économique, il faut considérer le
prix du milieu, le coût du fonctionnement de la fermentation et la valeur du produit final. Le
plus économique est d’utiliser des substrats naturels comme les résidus de l’agriculture ou de
l’agro-industrie. Grâce à la FMS, de nombreuses recherches ont été faites dans le but
d’assurer une valorisation des sous-produits industriels pour différentes finalités telles que la
détoxication, l’enrichissement en protéines microbiennes, ou la production de produits à forte
valeur ajoutée (Bellon-Maurel et al., 2003).
2.4.2.3. Activité de l’eau et l’humidité
Le rôle de l’eau dans le processus de FMS est multiple. Elément dominant dans la
composition de la biomasse, l’eau sert à véhiculer les enzymes et les composés nutritifs, et
facilite les interchanges gazeux. La quantité maximale de liquide présente dans la phase solide
est fonction de la capacité de rétention d’eau du substrat ou du support solide. Toutefois, cette
quantité de liquide doit être suffisante à la croissance des microorganismes sans détruire la
structure solide ou réduire la porosité du substrat ou du support (Oriol, 1987).
Le développement microbien en FMS nécessite une humidité du substrat supérieure à
50 %. Une humidité très élevée dans le substrat provoque une diminution de la porosité du
substrat, une baisse de la diffusion d’oxygène et une augmentation du risque de la
26

Matériel et Méthodes
contamination. En FMS, du fait de son faible taux d’humidité, le substrat se comporte comme
un milieu sélectif qui favorise le développement des champignons filamenteux puisque la
croissance des bactéries et des levures nécessite des activités de l’eau plus élevées
(0.85

2.4.2.5. Contrôle de la température pour les FMS
Matériel et Méthodes
Les champignons filamenteux utilisés dans les procédés de FMS sont souvent
mésophiles et se développent à des températures optimales comprises entre 25 et 30°C
(Roussos, 1985). Cependant, la production de chaleur métabolique au cours de la FMS cause
une augmentation importante de la température dans les bioréacteurs et si cette chaleur n’est
pas éliminée rapidement du milieu de culture, elle peut causer l’arrêt de la croissance des
microorganismes. L’élévation de la température dans les réacteurs de FMS s’explique par la
faible teneur en eau, l’absence d’agitation dans les fermenteurs statiques et la faible
conductivité thermique des matériaux biologiques.
L’augmentation excessive de la température est nocive pour la croissance des
microorganismes, la production et la stabilité des produits d’intérêt. Il faut donc agir sur la
culture afin de diminuer cette augmentation de la température. Différentes stratégies ont été
proposées pour la régulation de la température. Le passage de l’air à travers le fermenteur
peut réguler simultanément la température et l’humidité (Lonsane et al., 1992). Ainsi,
l’aération et l’évaporation de l’eau sont utilisées constamment pour contrôler
automatiquement l’humidité et la température dans les processus de FMS (Saucedo-Castañeda
et al., 1995). D’autres moyens peuvent également être utilisés, comme les bains thermostatés,
chambres thermorégulées ou doubles enveloppes (Bagnon, 1999). Une nouvelle stratégie a été
proposée en utilisant des microorganismes thermophiles ou thermorésistants (Cordova et al.,
1998). En conclusion, le problème de production excessif de chaleur au cours de la FMS ne se
pose pas dans le cas des champignons supérieurs qui ont un métabolisme assez lent,
faiblement exothermique et facilement contrôlable. De ce fait, très peu d’études ont été
réalisées pour le transfert de chaleur au cours de la culture du mycélium des champignons
supérieurs (Van Lier et al., 1994; Sobal, 2002).
2.4.2.6. Evolution du pH
L’activité métabolique des micro-organismes provoque une variation du pH du substrat
de culture influençant par la suite la bonne croissance des micro-organismes. Les
champignons filamenteux se développent bien dans des milieux acides et peuvent tolérer
d’importants changements de pH (2,5 jusqu’à 7,5). Cependant le pH initial d’une culture doit
être ajusté à son optimum par l’ajout d’une solution nutritive tamponnée. Le maintien du pH
stable au cours de la fermentation reste une tâche très difficile à réaliser en particulier pour les
FMS non agitées (Saucedo-Castañeda, 1995). L’utilisation des tampons permet de résoudre ce
problème. Par ailleurs, Raimbault (1980) et Roussos (1985) ont démontré qu’un mélange de
28

Matériel et Méthodes
sulfate d’ammonium et d’urée confère au milieu de culture un pouvoir tampon et permet donc
de maintenir le pH à des valeurs favorables à la croissance des micro-organismes.
2.4.3. Les applications des FMS
Les applications des FMS pour la valorisation des sous-produits agro-industriels sont
nombreuses et variées (Tableau 6). Les domaines d’application des FMS sont chaque jour
plus variés. Elle a été employée dans plusieurs domaines de recherche ; dépollution des sols,
biodégradation de composés à risque, détoxication de résidus agro-industriels,
biotransformation des cultures et de leurs résidus pour améliorer leurs qualités nutritionnelles
(compenser les manques en vitamines, minéraux ou protéines).
Tableau 6 : Exemples de substrats utilisés et les applications en FMS (Bellon-Maurel et al.,
2003).
Substrats Applications Substrats Applications
L’application de la FMS dans les Bio-raffineries (biogaz, bioéthanol) a révélé l’intérêt
de la FMS, qui apporte par la suite une valorisation aux déchets agricoles (Sukumaran et al.,
2005 ; Singhania et al., 2007). Par ailleurs, la production de cellulase par la FMS sur des
résidus agro-industriels pour la fabrication des biocarburants connaît une demande accrue.
Ainsi, par l’emploi de la FMS, la production d’hydrogène, d’acides organiques, d'éthanol et
de biodiesel a été concrétisée avec succès en utilisant soit des substrats solides soit des
supports solides (Hama et al., 2007; Wu et al., 2007; Jo et al., 2008).
29

2.4.4. Les avantages et les inconvénients de la FMS
Matériel et Méthodes
Le Tableau 7 contient une liste non exhaustive des avantages et des inconvénients de la
fermentation en milieu solide par rapport à la fermentation en milieu liquide.
Tableau 7. Comparaison de la fermentation en milieu liquide (FML) avec la fermentation en
milieu solide (FMS) (D’après Sobal, 2002).
Substrat
FML
FMS
Conditions aseptiques Stérilisation par choc thermique Stérilisation ± obligatoire
Eau Grands volumes consommés Consommation limitée
Chaleur métabolique Contrôle facile de la température Transfert de chaleur faible
Aération Limitée à l'oxygène soluble, haut
niveau d'air requis
Aération facile, surface
d'échange air/substrat
Contrôle du pH Facile Substrat solide tamponné
Agitation mécanique Bonne homogénéisation Conditions statiques
Inoculation Procédé continu Par spores ou mycélium
Contamination Risque pour une seule souche de
bactérie
Risques si le champignon
pousse lentement
Energie Beaucoup d'énergie consommée Peu d'énergie consommée
Volume de l'équipement Grand volume, grand coût Petit volume, petit coût
Effluents, pollutions Grands volumes d'effluents pollués Pas d'effluents, pas de
pollution
Culture Pour tous les microorganismes Surtout les champignons
2.5. Conclusion de l’analyse bibliographique
(conditions naturelles)
La synthèse bibliographique sur les principaux mots clés de la thèse, a permis en
premier temps, de définir le secteur oléicole au Maroc qui se caractérise par la coexistence de
plusieurs types d’unités de trituration dominées par les maâsras avec le procédé triphasique
fonctionnant avec le système de presse (16 000 d’unités). En plus du bois de la taille (feuilles
et les brindilles des oliviers), le procédé triphasique génère un co-produit solide (grignons) et
un déchet liquide (margines). Les différents substrats oléicoles ont été étudiés
individuellement afin de trouver des solutions de traitement et de valorisation.
30

Matériel et Méthodes
Les perspectives de certaines études ont mis l’accent sur l’utilisation des substrats de
l’industrie oléicole pour la culture de champignons comestibles. C’est dans cette vision que
notre projet de thèse s’inscrit, avec l’originalité de proposer un procédé qui permet la
valorisation de la biomasse totale de l’industrie oléicole, incluant le bois de taille, par la
culture de L. edodes en fermentation en milieu solide.
En deuxième temps, les différentes études menées sur la culture de L. edodes ont mis en
lumière les différentes capacités de ce champignon vis-à-vis de la dégradation des composés
récalcitrants, par la synthèse d’un arsenal enzymatique varié et qui dépend de plusieurs
paramètres de culture. Par ailleurs, d’autres études ont été focalisées sur la description et
l’application des laccases dans différents domaines de traitement et de valorisation.
En troisième temps, le procédé de fermentation en milieu solide a été discuté en mettant
l’accent sur les différents paramètres influençant le procédé. Cette partie a soulevé
l’importance de cette technique pour la culture du mycélium de champignons comestibles et
médicinaux, en l’occurrence la culture de L. edodes, et qui est en accord avec la nature du
substrat utilisé pour l’étude.
Finalement, à partir de ces données bibliographiques, le chapitre suivant sur le Matériel
et Méthodes a pu être établi, en particulier les techniques de culture du mycélium de
basidiomycètes sur milieux gélosés munis de feuilles de cellophane permettant la séparation
de la biomasse mycélienne du milieu gélosé épuisé. La technique de mesure de la biomasse
mycélienne par l’analyse de l’ergostérol a permis d’estimer indirectement la quantité du
mycélium présent dans le produit fermenté. Les résultats des mesures des polyphénols et des
activités enzymatiques ont été comparés à ceux décrits dans la littérature.
31

Matériel et Méthodes
32

3. MATERIEL ET METHODES
3.1. Les substrats oléicoles de culture
Matériel et Méthodes
Les échantillons ont été collectés dans une unité semi industrielle située dans la
province de Béni Mellal situé dans la région de Tadla-Azilal (Fig. 8). Avec une superficie
oléicole de 47.650 hectares, la région assure 20% de la production nationale d’olives. En
2008, la production d’olive a atteint 112.550 tonnes d'après l'ORMVAT (Office Régional de
la Mise en Valeur Agricole à Tadla). A titre d'exemple, la production d’huile d’olive en 2003-
2004 a atteint 16.600 tonnes et en 2006-2007, 8550 tonnes. Le secteur de trituration est
dominé par les maâsras traditionnelles et semi industrielle avec des capacités de trituration
très variables. L'unité modèle choisie pour effectuer notre échantillonnage est un type des
maâsras qui assurent près de 50% de la production nationale en huile d’olive.
Figure 8. Localisation de la région Tadla Azilal au Maroc.
3.1.1. La description de l'unité de trituration semi industrielle
L'unité de trituration des olives au Maroc est d’une taille semi industrielle avec le
procédé de presse (Fig. 9). Les olives sont broyées par des meules en granit agitées par un
moteur électrique. Une fois la pâte d’olive obtenue homogène, elle est placée dans la presse
pour l'extraction de l'huile d'olive mélangée avec l'eau végétale. La pression appliquée sur la
pâte d’olive monte jusqu'à 400 kg.cm -2 . La séparation de l'huile des margines est faite par une
décantation suivie d'une centrifugation. La capacité moyenne de trituration de ces unités est
de l'ordre de 6 tonnes par jour.
33

Figure 9. Unité de trituration semi industrielle au Maroc.
3.1.2. L’origine du substrat
Matériel et Méthodes
Les échantillons de margines et de grignons d’olive ont été obtenus à partir d'un lot
d'olives destinées à la trituration. Les olives sont de la variété picholine marocaine de maturité
avancée (Fig.10). Le lot d'olives est de 600 kg avec une maturité avancée. Après l'extraction
de l'huile d'olive par le procédé, on a obtenu 127 litres d'huile, 220 litres de margines et 253
kg de grignons d'olive avec une humidité de 35%.
Figure 10 . Olives de la variété picholine de maturité avancée.
Toute la quantité de grignons d’olive a été placée dans des sacs de 30 kg, et les
margines ont été reparties dans des bidons de 10 litres. Le bois de la taille des oliviers a été
fourni par le propriétaire de l'unité.
34

3.1.3. La préparation et le conditionnement du substrat
Matériel et Méthodes
Après 24 heures de récupération des échantillons, les margines qui sont restées intactes
ont été homogénéisées, et réparties de nouveau dans les bidons de 10 litres. Les margines ont
été stockées dans un congélateur à -20°C jusqu'à leur départ vers Marseille.
Les grignons d’olive ont subi un séchage sous serre pour diminuer leur humidité de
35% à 10%, pour assurer leur conservation. Les grignons d’olive ont été séchés sous serre à
l'obscurité. Un contrôle de l'humidité a été fait chaque jour pour atteindre 10% d'humidité. Le
conditionnement des grignons séchés a été fait dans des sacs en plastique.
3.2. Les souches utilisées
Les 16 souches de champignons supérieurs comestibles de L. edodes utilisées dans notre
étude proviennent de la collection du Laboratoire de recherche « Athens Mushroom
Research Laboratory, AMRL » dirigé par le Dr. Philippoussis en Grèce ainsi que de la
collection du laboratoire de Mycologie et Sécurité des Aliments de l’INRA-Bordeaux dirigé
par le Dr. Savoie. La liste complète des souches utilisées dans ce travail est reportée dans le
Tableau 8.
Tableau 8. Liste des espèces et origine des souches de champignons comestibles étudiées.
Souches Origine Provenance
Le 118 AMRL* Chine
Le 119 AMRL Chine
Le 120 AMRL Chine
Le 121 AMRL Europe
Le 122 AMRL Europe
Le 123 AMRL Europe
Le 124 AMRL Taïwan
Le 125 Souche commerciale Osaka Japon
Le 126 Souche commerciale Osaka Japon
Le 127 Souche commerciale France Mycélium
Le 128 Souche commerciale France Le Champion
Le 129 Souche commerciale Belgique Mycelia
Le 130 Souche commerciale USA, Lamber spawn
Le 131 Souche commerciale Japon
Le 132 Souche hybride INRA France
Le 133 Homocaryon d’une souche commerciale Le Lion France
35

3.3. Les milieux de culture
3.3.1. Les milieux d'entretien
Matériel et Méthodes
Les souches ont été repiquées régulièrement et conservées sur milieu PDA (Sigma) et
PDA avec 10% des margines. Trente neuf grammes de Patate Dextrose Agar (PDA) ont été
dissous dans un litre d’eau distillée en absence ou présence de margines. Le milieu a été porté
à ébullition et stérilisé à 120°C pendant 20 min et distribué en boîtes de Petri (9 cm) à raison
de 20 mL par boîte. Les cultures ont été incubées à 25°C jusqu'à la colonisation complète de
la surface gélosée et ensuite conservées à 4°C pendant 4-6 mois. Le mycélium de différents
âges, obtenu dans ces conditions, a été utilisé pour inoculer le milieu Ebly® (grains de blé
achetés auprès du supermarché Casino, France) et la culture en milieu liquide.
3.3.2. Les milieux gélosés de criblage des souches
Le même milieu d’entretien PDA (Sigma, France) qui a été utilisé pour conserver les
souches et pour produire l’inoculum, a été également utilisé pour caractériser les souches en
mesurant la croissance apicale, la morphologie de la colonie et la biomasse produite. De la
même façon, le milieu PDA + 10% de margines a été préparé en ajoutant 39 g.L -1 de PDA à
un mélange de 100 mL de margines et 900 mL d’eau et il a été aussi utilisé pour caractériser
les souches. Le milieu ME (Extrait de Malt, 24 g.L -1 ) a été utilisé pour réaliser des cultures en
milieu liquide.
3.3.3. Les milieux à base de céréale pour la culture Spawn 1
Le blé de marque Ebly® (Casino, France) a été utilisé comme substrat pour la
production d’inoculum et la culture mycélienne de L. edodes en FMS. Il s’agit d’un produit
standard commercialisé en grande surface. Deux types de Spawn ont été préparés, le Spawn
blanc et le Spawn gris. La préparation du substrat a été réalisée de la manière suivante : dans
un saladier on a introduit 250 mL d’eau, sans ou avec 10% de margines, portée à ébullition,
une quantité de 250 g d’Ebly® a été ajoutée pour préparer le Spawn blanc et gris
respectivement. On a laissé reposer le mélange pendant 5 min pour assurer l’absorption totale
de l’eau. Ensuite, l’Ebly® humidifié a été réparti dans des récipients à fermeture hermétique
et stérilisé à 120°C pendant 30 min.
1 Dans notre étude, on appelle Spawn tout mycélium cultivé sur les grains de céréales.
36

3.4. Les stratégies d'inoculation
Matériel et Méthodes
Pour initier la culture des champignons supérieurs au laboratoire, on utilise toujours du
mycélium obtenu sur différents milieux de culture (Sobal, 2002). Cet inoculum peut provenir
d’un milieu gélosé ou de grains de céréales colonisés pour une inoculation industrielle à
grande échelle. La taille de l’inoculum a été exprimée soit en nombre de carrés de milieu
gélosé déposés sur le milieu gélosé, soit en pourcentage (% ; poids/poids) pour le spawn
introduit dans les colonnes de Raimbault contenant le substrat.
3.4.1. L’inoculation par carrés de milieux gélosés
À l’aide d’un emporte pièce et d’un pic stériles, un disque de gélose PDA a été prélevé
dans la partie où le mycélium du champignon est le plus jeune. Ce morceau de mycélium a été
ensuite utilisé pour ensemencer la gélose vierge d’une boîte de Petri ou pilulier pour assurer le
repiquage et la conservation des souches. Les morceaux de gélose ont été aussi utilisés pour
l’inoculation des grains de blé pour la préparation du spawn, et pour l’inoculation des
Erlenmeyers pour la culture en milieu liquide. L’incubation a été réalisée dans une étuve à
25±2°C pour les milieux solides, alors que les Erlenmeyers sont incubés sous agitation de
100-120 rpm à la même température.
3.4.2. L’inoculation sur feuille de cellophane
Pour l’étude physiologique des souches, on a adopté la technique de papier cellophane
(De Araujo et al., 2000). Cette technique permet la séparation du mycélium, pour déterminer
la biomasse et sa composition chimique, du milieu de culture qui sert à déterminer les
caractéristiques physiologiques du mycélium. Cette technique est décrite en détail ci-après.
Préparation des feuilles de cellophane: les disques de film de cellophane d’un
diamètre légèrement inférieur de celui de la boîte de Pétri ont été coupés en série. Ils ont été
par la suite placés dans un bocal remplie d’eau, afin d’éviter le dessèchement des feuilles de
cellophane lors de l’autoclavage. La stérilisation a été faite à 120°C pendant 20 min. Une fois
les disques refroidis, ils ont été placés à la surface de la gélose, et laissés pendant 30 min pour
assurer une bonne adhésion de la feuille de cellophane.
Inoculation des cultures sur cellophane et incubation: Le mode d’inoculation de la
surface gélosée a été le même que pour la production d’inoculum en utilisant du milieu PDA.
Un carré d’inoculum gélosé contenant du mycélium est déposé au centre de la boîte de Petri
sur un disque de cellophane préalablement placé stérilement sur la gélose. Les cultures ont été
incubées à 25°C pendant 21 jours.
37

Matériel et Méthodes
Mesure du poids sec de la biomasse: Après une période d’incubation, les cultures ont
été arrêtées pour estimer la biomasse produite, le mycélium ainsi que la feuille de cellophane
ont été prélevés et introduits dans une coupelle, puis séchés à 105°C afin de déterminer le
poids sec de la biomasse du champignon (Fig.11).
Figure 11. Technique pour le suivi de la croissance apicale du mycélium et la mesure de
biomasse des champignons en milieu gélosé (De Araujo et al., 2000).
3.4.3. L’inoculation par grain de céréales
Il s’agit d’utiliser une masse de grains de céréales colonisés par le mycélium du
champignon pour ensemencer une masse supérieure de grains de céréales stériles. Afin de
savoir à quel taux on réalise l’inoculation grain à grain, il est nécessaire de peser la quantité
d’inoculum et de milieu (% poids/poids frais). Une fois pesés, les grains colonisés par le
mycélium ont été soigneusement séparés individuellement et ajoutés stérilement au nouveau
milieu ; on a agité doucement afin d’assurer une inoculation homogène, sachant qu’une
38

Matériel et Méthodes
agitation trop violente abîmerait le mycélium et diminuerait aussi sa vigueur. Pour nos
expériences, les substrats ont été inoculés avec différentes quantités d'inoculum (5, 10, et 20
% poids frais) à base d'Ebly® colonisé.
suivante :
3.5. La mise en œuvre des FMS
3.5.1. La préparation du substrat oléicole
La préparation des différents substrats utilisés dans l’étude a été réalisée de la façon
• Le bois de la taille de l’olivier est composé des feuilles et des brindilles et
branches de l’olivier; il a été broyé et tamisé selon la taille des particules désirées.
• Les grignons d’olive ont été mécaniquement homogénéisés.
• Les margines d’olive ont été décongelées juste avant leur utilisation, et
conservées à 4°C pendant une semaine.
Apres l’homogénéisation du bois de la taille avec les grignons d’olive selon différentes
portions, le mélange a été humidifié avec les margines à différentes concentrations (25-50-75-
100%). On a autoclavé, par la suite, l’ensemble des mélanges à 121°C pendant 30 min.
L’humidité du substrat utilisé pour la FMS a été fixée à 50% (p/p).
3.5.2. Les cultures en Erlenmeyer
Des Erlenmeyers de 250 mL ont été remplis avec 45 g de substrat solide à une humidité
de 50 %. Ces flacons ont été stérilisés par autoclavage pendant 30 min à 121°C. L’inoculation
a été réalisée avec 5 g de spawn en mélangeant délicatement l’ensemble pour assurer une
répartition homogène du spawn dans le substrat.
3.5.3. Les cultures en colonnes de Raimbault
Les cultures en FMS ont été réalisées en utilisant les colonnes décrites par Raimbault et
Alazard (1980). Pour nos expériences, nous avons utilisé des colonnes de verre de deux
dimensions différentes 20 et 40 cm de hauteur et de 2 cm de diamètre avec un volume utile de
100 mL pour les substrats céréales et de 250 mL pour le substrat oléicole. Après l’autoclavage
(121°C pendant 20 min) des colonnes préparées vides, elles ont été remplies avec le substrat
solide inoculé. Les colonnes remplies ont été placées dans le dispositif FMS équipé d’un bain
thermostaté à 25±2°C.
39

3.5.4. La régulation des paramètres de FMS
Matériel et Méthodes
Le dispositif de FMS, mis au point par Raimbault (1980), permet le contrôle et le suivi
de la fermentation de L. edodes sur le substrat oléicole (Fig. 12). L'aération dans les
fermenteurs se fait grâce à une canalisation d'air comprimé à haute pression. A la sortie du
manodétendeur, la pression de l'air a été maintenue à 0,2 bar. L'air a été ensuite humidifié
deux fois à température ambiante à l'aide de bulleurs en verre frité et distribué en passant par
un ballon à fond rond muni d'une entrée et de plusieurs sorties. L'aération de substrat dans les
colonnes a été donc assurée par un flux d'air saturé en humidité et contrôlé par l'intermédiaire
de vannes à pointeaux. Afin d’assurer la saturation et de la mise à température de l'air, un
humidificateur individuel (petit bulleur) a été disposé sous chaque colonne FMS. Les
effluents gazeux, collectés à la sortie de chaque colonne, ont été analysés à l’aide du
respiromètre PNEO.
Figure 12. Dispositif de FMS utilisé : 1, Entrée d’air ; 2, Bain marie thermostaté ; 3, Colonnes
de Raimbault (Saucedo-Castañeda, 1995).
3.5.5. La description et le fonctionnement du PNEO
Un appareil prototype de respirométrie PNEO (Fig. 13) a été construit par l'équipe ITE
du CNRS (Faculté des Sciences et Techniques de St Jérôme). Il a été mis au point au cours de
cette étude pour suivre en ligne et de manière non destructive les principaux paramètres de
FMS.
40

Matériel et Méthodes
Figure 13 . Photographie du respiromètre PNEO et description de ses différents
composants, la partie supérieure étant composée des capteurs d'analyse de l'air sortant
des colonnes et la partie inférieure étant la partie électronique avec la transmission des
informations à l'ordinateur (ITE, 2009).
PNEO est un appareil de respirométrie qui assure simultanément le suivi en ligne de
quatre paramètres au cours de la FMS. Il permet la mesure de l'humidité relative de l'air
passant à travers la colonne de fermentation entre 0 et 100%. Une mise à niveau du capteur
est faite par passage d’un flux d'air sec entre chaque mesure pour éliminer la condensation qui
pourrait se former sur le capteur.
Il permet également la détermination de la température de l’air ,entre 0°C et 150°C, en
sortie de colonne. Cependant la température mesurée est souvent sous-estimée par rapport à la
température réelle, car l'air est refroidi dans le tuyau par l'air ambiant. Cela permet tout de
même de savoir si la température reste stable au cours du temps.
Le troisième paramètre qu’on peut mesurer avec le PNEO est le débit d'air en sortie de
la colonne de fermentation. Le système permet l’ajustement du débit d’air. Le capteur peut
mesurer des débits entre 0 et 200 mL.min -1 , ce qui laisse une marge puisque, le plus souvent,
les débits utilisés sont compris entre 5 et 60 mL.min -1 . Le dernier paramètre mesuré est le CO2
dégagé par le champignon. Le capteur infrarouge peut détecter des taux de CO2 compris entre
41

Matériel et Méthodes
0 et 10%. Ce paramètre permet de suivre en ligne la croissance du champignon.
L’enregistrement des paramètres se fait grâce à un logiciel conçu par le même groupe qui
permet l’exportation des données pour les calculs.
3.6. L’échantillonnage et le traitement des échantillons en FMS
A la différence des cultures liquides, la prise d’échantillons homogènes au cours des
FMS est une chose difficile à obtenir. En effet, pour que les échantillons soient homogènes, il
est nécessaire de sacrifier une colonne complète et de récupérer l’ensemble du produit
fermenté et de l’homogénéiser avec un simple mélange manuel.
Après chaque prélèvement, les produits fermentés ont été immédiatement homogénéisés
et les échantillons frais ont été utilisés pour mesurer le poids sec et le pH. Les échantillons ont
été congelés et lyophilisés dans un lyophilisateur (Heto Power Dry LL1500 Freeze Dryer,
Thermo Electron Corporation, U.S.A.). Parallèlement, 10 g d’échantillons frais ont été
congelés pour les analyses d’enzymes. Les échantillons lyophilisés ont subi un broyage dans
un micro-broyeur (IKA Labortechnik) pour leur complète homogénéisation.
3.7. Les techniques d’analyse
3.7.1. La mesure de l’humidité
En fermentation solide, il est indispensable de suivre l'évolution de la matière sèche du
milieu de culture. En effet, l'eau produite lors de la dégradation des substrats carbonés, de
même que la perte du poids sec due à la respiration (minéralisation des composés organiques)
ainsi que le transfert de l'eau par le flux d'air saturé en eau conduisent à des variations
importantes de l'humidité des produits au cours de la fermentation. Cette mesure de l'humidité
permet d'exprimer la perte en poids après la fermentation. Le poids sec est évalué par
différence de pesée.
Environ 5 à 10 g d’échantillon de matière fraîche ont été pesés (P0) dans des coupelles
en aluminium préalablement tarées (Pvide), à l’aide d’une balance de précision (Sartorius
BP121S). L’échantillon a été mis à sécher à 105°C jusqu’à l’évaporation totale de l’eau dans
le substrat (Psec). Les résultats sont exprimés en pourcentage de poids sec. La mesure a été
effectuée en triplicata.
Humidité (%) = [(P0 – Psec)/(P0 – Pvide)] x 100
42

3.7.2. La mesure du pH
Matériel et Méthodes
Les mesures des valeurs du pH du substrat fermenté ont été réalisées dans une
suspension (0,1 g.mL -1 d’eau distillée). La mesure a été réalisée à l'aide d'un pH-mètre digital
Knick muni d'une électrode combinée. L'étalonnage de l'appareil a été obtenu avec des
solutions tampon pH 4,0 - 7,0 et 10.0 (Schott-Geräte).
3.7.3. La mesure de la croissance apicale
La croissance apicale correspond à l’élongation du mycélium cultivé sur une surface
solide. Cette élongation a été mesurée régulièrement à l’aide d’une règle graduée. La
croissance apicale a été exprimée en millimètres rapportés au temps. Généralement, cette
mesure a été réalisée pour des cultures en boîtes de Petri sur des milieux gélosés ou céréaliers.
Vmoy = Vitesse de croissance apicale moyenne (mm.j -1 )
Dmax = Diamètre de la colonie au moment de l’arrêt de la FMS (mm)
C = Diamètre du disque de gélose (mm)
T = Temps (h)
Vmoy = [(Dmax- C)/2]/T
3.7.4. L’estimation indirecte de la biomasse par analyse de l’ergostérol
3.7.4.1. Extraction de l’ergostérol
L’extraction de l’ergostérol a été faite à partir d’échantillons de produits fermentés: un
échantillon de 50 mg d’échantillon lyophilisé a été mis en suspension dans 1 mL de méthanol
pur (SIGMA) dans un tube Eppendorf de 1,5 mL en 5 exemplaires. Les échantillons ont été
agités au vortex à 1500 rpm pendant 20 sec et laissés reposer pendant une nuit à 4°C à
l’obscurité. Ces échantillons ont été ensuite agités au vortex à la même vitesse et centrifugés à
14000 tr.min -1 dans une centrifugeuse SIGMA 3K15 à 4°C pendant 10 min. Les surnageants
ont été récupérés pour les analyses de l’ergostérol en HPLC.
3.7.4.2. Dosage de l’ergostérol en HPLC
La plateforme HPLC-DAD Agilent technologies 1200 Series est composée d’un
dégazeur (1200 Series Degasser, Agilent technologies), d’une pompe quaternaire (1200 Series
Quaternary Pump, Agilent technologies), d’un échantillonneur automatique (1200 Series
Automatic Liquid Sampler, Agilent technologies) et d’un détecteur à barrette de diodes (1200
Series Diode-Array Detector, Agilent technologies). L’élution a été isocratique en utilisant le
43

Matériel et Méthodes
méthanol grade-HPLC comme phase mobile à un débit de 1 mL.min -1 . Un volume de 20-50
µL de chaque échantillon a été injecté dans l’HPLC. Un lavage de la colonne a été effectué
par l’injection du méthanol (qualité HPLC). Le pic de l’ergostérol a été déterminé par
comparaison avec le temps de rétention du standard et en vérifiant le spectre d’absorption
caractéristique de l’ergostérol. La DO pour l’ergostérol a été mesurée à 280 nm.
3.7.5. Le dosage des sucres réducteurs
Les sucres réducteurs ont été dosés par la méthode de Miller (1959). Les sucres
réduisent l'acide 2,3-dinitrosalicylique (DNS) en acide 3-amino-5-nitrosalicylique, à chaud.
Le produit de la réaction au milieu basique développe une coloration jaune orangé avec un pic
d'absorption à 575 nm. L'échantillon à doser a été dilué convenablement de façon à obtenir
une concentration en sucres réducteurs voisine de 1g.L -1 . A 1 mL de cette dilution, on a ajouté
1 mL de réactif au DNS. Le mélange a été porté à ébullition pendant 5 min et refroidi
rapidement. Après addition de 8 mL d'eau distillée, le contenu des tubes a été homogénéisé au
vortex, et la densité optique a été lue à 575 nm. La courbe d’étalonnage a été réalisée avec une
solution de glucose de 0 à 1g.L -1 .
3.7.6. Le dosage des sucres totaux
La réaction à l’anthrone constitue la base d’une méthode rapide pour la détermination
des hexoses, acides hexouroniques et aldopentoses. Le complexe formé donne une couleur
bleu-vert qui absorbe à 625 nm (Dubois et al.,1956). La présence de protéines contenant du
tryptophane donne une couleur rouge à l’échantillon et peut donc interférer avec la réaction.
Pour la préparation du réactif, 200 mg d’anthrone ont été dissous dans 100 mL d’acide
sulfurique à 96 %. Ce réactif peut être conservé au frais pour 4 mois. Pour réaliser la courbe
étalon, la solution mère a été préparée avec 5 g.L -1 de glucose (0,5 g.100 mL -1 ) et la courbe
d’étalonnage a été établie pour des concentrations en glucose de 0 à 50 mg.L -1 .
3.7.7. Le dosage des phénols totaux
La détermination de la concentration des phénols totaux dans les différents échantillons
a été réalisée par la technique de Folin Ciocalteu décrite par Bärlocher et Graça (2005). Le
réactif de Folin Ciocalteu est réduit par le complexe phényl-cuivre qui donne une coloration
bleue dont l’absorbance est maximale à 760 nm.
La concentration des phénols totaux a été déterminée sur 0,1 mL d'échantillon
(convenablement dilué dans de l'eau distillée) auquel sont rajoutés 5 mL du réactif C (2% de
44

Matériel et Méthodes
Na2CO3 dans NaOH, 0,1N). Après 5 min d’incubation à température ambiante, 0,5 mL de
réactif de Folin Ciocalteu a été ajouté. Le milieu a été placé 2h à l'obscurité. L'absorbance a
été lue à 760 nm contre un tube témoin. La gamme étalon a été réalisée dans les mêmes
conditions en présence de l’acide cafféique (0 à 250 µg.mL -1 ).
3.7.8. Le dosage des activités enzymatiques
3.7.8.1. Activité Laccase
L’extraction de laccase a été faite dans un tampon acétate (0,1M, pH 5,0) contenant
5mM de CaCl2, 0,05% de tween et 5% de polyvinylpolypyrrolidone PVPP (Sampedro et al.,
2007). Le mélange a été incubé pendant 1h sous agitation (100 rpm) à température ambiante.
L’activité des laccases a été déterminée selon la méthode Criquet et al. (1999). Le
milieu réactionnel a été constitué de 1mL d’extrait enzymatique et de 15 µL de syringaldazine
(6 mg.mL -1 du méthanol). L’oxydation de syringaldazine en quinone a été déterminée en
mesurant la densité optique à 525 nm (ε= 65 000 M -1 cm -1 ). L’activité des laccases a été
exprimée en µmole de quinone formée par minute (U) et par gramme de matière sèche (U.g -1
MS).
3.7.8.2. Activité Mn peroxydase
L’activité a été déterminée selon la méthode de Wariishi et al., (1992). Le milieu
réactionnel a été composé de 1 mL de l’extrait enzymatique, 0.5 mM MnSO4 dans 50 mM du
tampon malonate à pH 4,5, en présence de H2O2 (75 µM). La formation du complexe (Mn 3+ -
Malonate) a été suivie à 270 nm (ε=11 590 M -1 cm -1 ).
3.7.8.3. Activité Lignine peroxydase
L’activité a été déterminée par le suivi de l’oxydation de l’alcool vératrylique à 310 nm
(ε= 9 300 M -1 cm -1 ) en présence de H2O2. Le milieu réactionnel a été composé de 2,1 mL de
tampon tartrate (0,1M, pH3), de 0,3 mL de H2O2 (50 µM), de 0,1 mL d’alcool vératrylique et
0.5 mL d’extrait enzymatique.
3.7.8.4. Activité tannase
Nous avons utilisé la technique de Sharma et al., (2000) pour l’analyse des activités
tannases produites par Pleurotus ostreatus cultivé sur coques de café en FMS. Cette technique
utilise le méthylgallate comme substrat et sous l’action de la tannase, l’acide gallique libéré
est colorée par la rhodanine. Cette nouvelle technique est très simple à réaliser et elle est trois
fois plus sensible que les méthodes classiques. La gamme étalon a été réalisée avec de l’acide
45

Matériel et Méthodes
gallique (1 g.L -1 ). Une unité tannase correspond à la libération d’une µmole d’acide gallique
par min à 35°C dans un tampon citrate 0,05 mM pH 5,0.
3.7.8.5. Activité lipase
Le milieu réactionnel est composé de 1 g du produit fermenté, 10 mM de laurate de p-
nitrophényl (PNP), 2 mL d’heptane et de 2 mL d’eau. Il faut noter que la laurate de PNP est
soluble dans l’heptane. Après l’incubation du mélange à l’obscurité à 30°C pendant 2 h avec
agitation sur un secoueur, 4 mL d’eau ont été ajoutés et le tout a été filtré pour récupérer la
fraction organique. Quatre mL de NaOH 0,1M ont été ajoutés à 200 µL du surnageant et la
densité optique du mélange a été mesurée à 412 nm. La gamme d’étalonnage a été préparée
avec différentes concentrations de PNP (Sigma, France).
3.7.9. L’analyse des monomères phénoliques par HPLC
L’extraction de la fraction phénolique a été effectuée avec une solution organique de
méthanol : eau (60 :40). Un échantillon d’un gramme du substrat fermenté lyophilisé a été
mélangé avec 10 mL de la solution organique, et le mélange a été homogénéisé et incubé
pendant 1 h à 4°C. L’extraction a été répétée trois fois. Après la centrifugation du mélange,
les surnageants ont été collectés et évaporés sous vide à 1/3 du volume. Une deuxième
extraction a été faite par 10 mL l’acétate d’éthyle. Le surnageant a été évaporé sous vide à
sec. Le résidu sec a été dissous dans 1 mL de méthanol pur (qualité HPLC) et injecté en
HPLC.
Les monomères phénoliques ont été déterminés par l’HPLC suivant la méthode
modifiée de De Marco et al. (2007). Les conditions d’analyse sont décrites dans le Tableau 9.
Tableau 9. Conditions d’analyses en HPLC pour la détection des monomères
phénoliques.
Débit 1 mL.min -1
Volume d’injection 50 µL
Température 25 ± 2 °C
Solvant A Eau : Acide acétique, 97 :3 (v/v)
Solvant B Acétonitrile : Méthanol, 80 : 20 (v/v)
UV de détection 280 nm
Spectre d’absorption 200-700 nm
46

Matériel et Méthodes
Tableau 10. Conditions d’élution pour la détection des monomères phénoliques.
Condition Solvant A (%) Solvant B (%) Temps (min)
3.7.10. Les analyses élémentaires : C et N
Les teneurs en C et N, dans les échantillons de culture de L. edodes, ont été déterminées
à l’aide d’un analyseur élémentaire (Flash EA 1212 Elemental Analyzer, France). Les
échantillons ont été finement broyés, pesés et placés dans l’analyseur. L’analyseur a été
calibré avec l’acide aspartique à différentes concentrations.
3.7.11. La résonance magnétique nucléaire 13 C du solide
Les spectres haute résolution ont été réalisés sur le spectromètre Bruker DSX 400 kHz
du Spectropole (Université Paul Cézanne). Les spectres 13 C CP/MAS ont été enregistrés à la
fréquence de 100,7 MHz avec découplage du proton. Environ 300 mg de substrat fermenté
sont placés dans une sonde de 7 mm inclinée à l’angle magique (angle de 54,7° par rapport au
champ magnétique statique) tournant à 6 kHz. Les paramètres d’acquisition utilisés pour un
enregistrement optimal sont une impulsion de 90° pour le proton de 2,8 µs, un délai de
répétition de 3 s, un nombre d’acquisition de 2000, et enfin un temps de contact de 2 ms. La
déconvolution des spectres a été effectuée grâce au logiciel DmFit (Massiot et al., 2002). Le
Tableau 11 et la Figure 14 présentent les principales régions obtenues en RMN du 13 C, et
attribuées aux différents groupes fonctionnels trouvés dans la matière organique des litières et
de compost.
isocratique 80 20 10
linéaire 60 40 15
linéaire 45 65 20
linéaire 25 75 30
linéaire 0 100 45
isocratique 0 100 50
47

Matériel et Méthodes
Tableau 11 . Attribution des régions RMN 13 C aux différents groupes fonctionnels trouvés
dans la matière organique.
Shift chimiques Désignation
(ppm)
Composés
0-45 Alkyle C Lipides, acides aminés,
45-60 N-Alkyle/méthoxyle C Acides aminés, (OCH3- lignine)
60-110 O-Alkyle C Cellulose, hémicelluloses, autres polysaccharides
110-145 Aryle C Polyphénols, Lignine (C aromatique)
145-165 O-Aryle C Phénols, lignine (C phénolique)
165-190 Carboxyle C acides organiques, amide et ester C
Figure 14. Exemple de spectre CPMAS RMN 13 C d’une litière de Quercus ilex L.
(Alarcon-Gutierrez, 2007).
48

Résultats et discussion
49

Résultats et discussion
La partie « Résultats et Discussion » regroupe cinq chapitres préparés sous forme
d’articles qui correspondent chacun à des étapes de mise au point technologique ou
méthodologique afin de progresser vers la maîtrise de la valorisation des substrats oléicole par
la culture de L. edodes. Chaque chapitre commence par une introduction en français qui
justifie et relie entre les différents chapitres. Un résumé récapitule l’ensemble des résultats de
chaque chapitre.
Chapitre 1 :
Criblage des souches de Lentinula edodes cultivées sur des margines d’olive en culture
solide et liquide pour la biodégradation des polyphénols
Lakhtar, H., Ismaili-Alaoui M., M., Philippoussis A., Perraud-Gaime I., Roussos S. (2009).
Screening of strains of Lentinula edodes grown on model olive mill wastewater in solid and
liquid state culture for polyphenol biodegradation. International Biodeterioration and
Biodegradation (in press) (DOI: 10.1016/j.ibiod.2009.10.006).
Chapitre 2:
Optimisation de la production de l’inoculum (spawn) de Lentinula edodes sur les grains
de blé (Ebly®).
Lakhtar, H., Ismaili-Alaoui M., Roussos S., Non-esterified ergosterol analysis for Lentinula
edodes spawn quantity estimation. A soumettre dans la revue Food Chemistry.
Chapitre 3 :
Culture de Lentinula edodes en fermentation en milieu solide sur substrat oleicole solide:
Evaluation des facteurs de croissance.
Lakhtar, H., Ismaili-Alaoui M., Labrousse Y., Roussos S., Solid state fermentation of
Lentinula edodes on solid olive substrate: Evaluation of growth factors. A soumettre dans la
revue Bioresource Technology.
Chapitre 4 :
Transformation de la matière organique et détoxification des substrats oléicoles solides
par la culture de Lentinula edodes par fermentation en milieu solide.
L’article de ce chapitre est en préparation.
Chapitre 5 :
Disponibilité des substrats oléicoles : séchage solaire sous serre du mélange de grignons
d’olive et de margines
Lakhtar, H., Macarie, H., Ismaili-Alaoui M., M., Perraud-Gaime I., Roussos, S., Solar drying
in greenhouse of a mixture of olive cake and olive mill wastewater, a solution for olive mill
wastewater disposal?. Accepté avec révision dans la revue Journal of Environmental
Management.
50

Résultats et discussion. Chapitre 1 : Criblage des souches de L. edodes
Chapitre I
Criblage des souches de Lentinula edodes cultivées sur des
margines d’olive en culture solide et liquide pour la
biodégradation des polyphénols
Parmi les effluents les plus toxiques de l’industrie oléicole, on trouve les margines
d’olive qui se caractérisent par un pH acide et une charge organique élevée associée à la
présence i) des polyphénols à grande concentration et ii) des acides gras libres (Sayadi et al.,
2000). En plus de la composition chimiques des margines, leurs volumes très importants
produits durant la campagne oléicole causent d’énormes problèmes de gestion et
d’environnement (Ben Sassi et al., 2006).
La valorisation des margines par les champignons comestibles a attiré l’attention de
plusieurs auteurs, par le fait que ces microorganismes sont capables de produire plusieurs
enzymes ligninolytiques non spécifiques, telles que les laccases, les Mn peroxydases et les
lignines peroxydases, impliquées dans la diminution de la toxicité des margines par la
dégradation des polyphénols. Bien que les champignons comestibles (Pleurotus sp. et
L. edodes) sont capables de se développer en présence des polyphénols, leur pouvoir à
dégrader ces molécules diffère en fonction des souches de chaque genre (Sayadi et Ellouz,
1993). Ainsi, une sélection de souches les plus performantes reste une étape importante dans
le développement d’un procédé de valorisation des margines en vue d’éliminer leur toxicité.
Dans ce premier chapitre sont présentés les résultats de l’étude de criblage des souches
de L. edodes pour leur pouvoir de réduction des polyphénols de margines. Pour ce faire, une
51

Résultats et discussion. Chapitre 1 : Criblage des souches de L. edodes
collection de 16 souches de L. edodes provenant de différentes régions du monde a été établie
et ces souches ont été évaluées pour leur tolérance aux margines. Le criblage des souches de
la collection a été effectué en deux étapes : la première étape en culture en milieu solide
gélosé et la deuxième étape en culture en milieu liquide en présence de margines. Plusieurs
critères de sélection ont été choisis pour sélectionner une souche performante : tolérance aux
margines, croissance apicale, biomasse mycélienne, décoloration des margines, dégradation
des phénols totaux et production d’enzymes ligninolytiques.
Ce chapitre a fait l’objet d’un article accepté pour publication dans la revue
International Biodeterioration & Biodegradation (10.1016/j.ibiod.2009.10.006).
52

Résultats et discussion. Chapitre 1 : Criblage des souches de L. edodes
Screening of Lentinula edodes strains cultivated on model olive mill
wastewater in solid and liquid state culture for polyphenols biodegradation
Authors:
Hicham Lakhtar 1 , Mustapha Ismaili-Alaoui 2 , A. Philippoussis 3 , Isabelle Perraud-
Gaime 1 , Sévastianos Roussos 1*
Author’s address:
1 Institut Méditerranéen d'Ecologie et de Paléoécologie UMR CNRS/IRD 193; IMEP Case
441; FST Saint Jérôme; Université Paul Cézanne; Av. Escadrille Normandie-Niemen; 13397
Marseille cedex 20; France ;
2 IAV –Hassan II, Laboratoire des Bioconversions ; BP. 6202-Instituts, 10101 Rabat, Maroc ;
3 National Agricultural Research Foundation, IAMC, Laboratory of Edible and Medicinal
Fungi, 61 Democratias St., 135 61 Ag. Anargyri, Athens, Greece
*Corresponding author:
Sévastianos Roussos: Institut Méditerranéen d'Ecologie et de Paléoécologie UMR CNRS/IRD
193; IMEP Case 441; FST Saint Jérôme; Université Paul Cézanne; Av. Escadrille
Normandie-Niemen; 13397 Marseille cedex 20; France ;
E-mail: s.roussos@univ-cezanne.fr
Tel: (+33) 04 91 28 91 03
Fax: (+33) 04 91 28 86 68
Scientific relevance of the study: Evaluation of shiitake cultivation (Lentinula
edodes) as a biotechnological process (biodegradation and biotransformation) for
simultaneous detoxification of phenol-rich olive mill wastewater (OMW) and the production
of fungal enzymes and mycelial biomass. Application of an environmentally friendly fungal
technology in the food (olive oil) chain production, medical research (L. edodes biomass) and
bioremediation purposes (detoxification of OMW).
53

Résultats et discussion. Chapitre 1 : Criblage des souches de L. edodes
Criblage des souches de Lentinula edodes cultivées sur des margines d’olive
en culture solide et liquide pour la biodégradation des polyphenols
RESUME
Au Maroc, l’industrie oléicole génère de grands volumes des margines d’olive dans une
période courte (250 000 m 3 de margines pendant 4 mois, Novembre-Février). La présence des
composés phénoliques confère une propriété phytotoxique ainsi qu’un effet antimicrobien.
Plusieurs études ont été effectuées sur le traitement biologique et enzymatique des margines .
Tandis que les perspectives d’utilisation des margines pour l’élaboration des produits à valeur
ajoutée, telle que la culture de champignons comestibles, sont moins exploitées. Notre étude a
pour objectif de sélectionner une souche de champignon comestible et médicinal capable de
se développer en présence de margines produisant une grande quantité de biomasse
mycélienne. La décoloration et la dégradation des phénols totaux des margines ont été
également testées. Seize souches de Lentinula edodes ont été initialement évaluées pour leurs
tolérance, croissance apicale et production de biomasse, sur milieux gélosés contenant les
margines à différentes concentrations. Parmi les souches testées, la meilleur production de
biomasse a été observée pour les souches (Le118, Le119, Le121 and Le122) et même en
présence de 20% (v/v) de margines. Pour la seconde évaluation, la capacité des souches
présélectionnées, pour décolorer et dégrader les phénols totaux de margines, a été testée en
milieu liquide contenant des margines sans addition de nutriments. La souche de L. edodes
Le119 a montré une décoloration des margines de 65% associée à l’élimination de 75% des
phénols totaux mesurés par la méthode de Folin Ciocalteu. Cette souche a été selectionnée
pour la culture en FMS de L. edodes sur les co-produits oléicoles. La reussite du procédé de
FMS necessite la preparation d’un inoculum de très bonne qualité.
Mots clé : Lentinula edodes, Margines d’olive, Culture en milieu solide, Culture en milieu
liquide, Biomasse, Phénols totaux, Laccase, Détoxification.
54

ABSTRACT
Résultats et discussion. Chapitre 1 : Criblage des souches de L. edodes
In Morocco, olive industry produces great amounts of Olive Mill Wastewater (OMW)
in short time period (250 000 m 3 of liquid wastes in four months, November-February).
Phenolic compounds are largely responsible for the phytotoxicity and antimicrobial effects of
OMW. Several studies have been carried out focusing on the biological and enzymatic
treatment of OMW. However, the use of OMW to produce value-added products, e.g.
mushroom cultivation, are less explored. This research aimed to select shiitake mushroom,
capable of growing on OMW, involving decolorization, removal of total phenol and high
production of mycelial biomass. Sixteen strains of Lentinula edodes were evaluated for their
tolerance to OMW, apical growth rate and biomass production on agar media. The highest
biomass yields were recorded in four L. edodes strains (Le118, Le119, Le121 and Le122)
grown in the presence of 20% (v/v) OMW. The ability of these pre-selected strains to
decolorize and to remove total phenol from OMW was then tested by using the technique of
liquid culturing, without any other nutriment supplement. L. edodes strain Le119 exhibited
65% decolorization along with 75% elimination of total phenol as resulted from Folin
Ciocalteu assays. The laccase activity was the main lignolytic activity observed, with one
isoform of the enzyme got stained on native PAGE with p-phenylenediamine as the substrate
at pH 5.0.
Keywords: Lentinula edodes, Olive Mill Wastewater, Solid State Culture, Liquid State
Culture, Biomass, Total Phenol, Laccase, Detoxification.
55

1. Introduction
Résultats et discussion. Chapitre 1 : Criblage des souches de L. edodes
The production of olive oil is expanding in the Mediterranean region, which accounts
for 95% of total worldwide production (Ismaili-Alaoui and Heddoun, 2006). Main producers
of olive oil are Spain, Italy, Greece, Tunisia and Morocco (International Olive Oil Council,
2008). The extraction of oil from olives generates large quantities of liquid by-products,
which have been estimated in excess of 30 x 106 m3 per year (Crognale et al., 2006).
Chemical characteristics of these liquid wastes depend on olive varieties, as well as the olive
oil extraction system.
In Morocco, about 50% of olive oil production comes from traditional mills called
“Maâsra”, which use the conventional “three-phase system” (Ismaili-Alaoui and Heddoun,
2006). A major drawback of this system is that huge amounts of olive mill wastewater
(OMW) are discarded, containing a high concentration of polyphenols (Ben Sassi et al.,
2006). OMW are now generating pollution problems in the Mediterranean region, particularly
in Morocco, where suitable treatments for these effluents are poorly developed (Ben Sassi et
al., 2006).
Detrimental effects of OMW (Sayadi et al., 2000) on plant growth (Isidori et al.,
2005), microbial activity, and soil properties have already been described (Saadi et al., 2007).
The presence of phenolic compounds in high concentrations is considered the main factor
from OMW causing harmful effects (Sayadi et al., 2000; El Hajjouji et al., 2007). Extensive
research on white-rot basidiomycetous fungi has been conducted in order to select strains
showing high detoxification capability (i.e., simultaneous removal of phenolic compounds
and color) on OMW (Sayadi and Ellouz, 1993; D’Annibale et al., 2004). Other research
efforts are focused on the use of fungal enzymes involved in the degradation of polyphénols
(D’Annibale et al., 2000; Tsioulpas et al., 2002). The cultivation of edible mushrooms
(Pleurotus or Lentinula) using OMW as a wetting agent has also been carried out (Zervakis et
al., 1996; Kalmis and Sargin, 2004; Kalmis et al., 2008).
Lentinual edodes (shiitake) is a white-rot mushroom 1 cultivated commercially, which
has medicinal properties, as well as biodegradation and biotransformation abilities
(Philippoussis et al., 2007; Israilides et al., 2008; Philippoussis, 2009). This species produces
extracellular oxidizing enzymes capable of biodegrading lignin-related recalcitrant
compounds, such as polyphenols (D’Annibale et al., 1998). The efficiency of polyphenol
degradation by L. edodes is associated with several enzymes, including lignin peroxidase,
56

Résultats et discussion. Chapitre 1 : Criblage des souches de L. edodes
manganese peroxidase and laccase (D’Annibale et al., 2004; Ayed et al., 2005; Matos et al.,
2007). However, the production of these enzymes depends on substrate composition,
cultivation system and environmental factors affecting fungal growth (Alaoui et al., 2008;
Elisashvili et al., 2008).
In previous research work, it has been shown that mycelial growth rate, biomass yield
and enzymatic activities are important factors for successful mushroom cultivation
(Philippoussis et al., 2003; Silva et al., 2005). In this study, we selected strains of L. edodes
capable not only of tolerating the phenolics present in OMW, but also of using them as a
carbon source to yield high mycelial biomass. Decolorization and removal of phenolic
compounds were also criteria of selection.
2. Materials and methods
2.1. Substrates
OMW was obtained from an olive oil plant at Beni-Mellal (central Morocco), after the
three-phase extraction. OMW was stored at -20°C until used. The composition of untreated
OMW is such as: pH (4.9), suspended solids (13.84 %), total sugar (12,8 g l-1), reducing
sugar (10.08 g l-1) and total phenol (12.54 g l-1).
2.2. Microorganisms
Sixteen strains of Lentinula edodes (Berk.) Pegler were obtained from different
laboratories (Table 1). These strains were already selected for their ability to colonize
agricultural residues. All strains were routinely grown on potato dextrose agar (PDA, Sigma,
St Quentin Fallavier, France) plates. Inoculum was prepared by growing the mycelium on
agar plates for 2 weeks.
57

Résultats et discussion. Chapitre 1 : Criblage des souches de L. edodes
Table 1: Origin and source of different strains of Lentinula edodes
Strains Origin Source
Le118 AMRL* China
Le119 AMRL China
Le120 AMRL China
Le121 AMRL Europe
Le122 AMRL Europe
Le123 AMRL Europe
Le124 AMRL Taïwan
Le125 Commercial strain Osaka Japon
Le126 Commercial strain Osaka Japon
Le127 Commercial strain France Mycelium
Le128 Commercial strain France Le Champion
Le129 Commercial strain Belgique Mycelia
Le130 Commercial strain USA, Lamber spawn
Le131 Commercial strain Japon
Le132 Hybrid strain INRA France
Le133 Homocaryon of commercial strain Le Lion France
* Athens Mushroom Research Laboratory (NAGREF)
2.3. Solid State Culture
Tolerance of shiitake mycelium was investigated on PDA containing different
concentrations of OMW, ranging from 0-100%. The agar medium was sterilized at 121°C for
20 min, cooled, and used to prepare PDA plates. These plates were inoculated with agar disks
(10 mm diameter) from an actively growing colony, and then incubated at 25°C. Linear
growth rates were determined as the average distance covered by the mycelium in two
perpendicular directions. After complete colonization of Petri plates (90 mm diameter), the
mycelial biomass was assessed using a sterile cellophane disc placed on the agar surface, as
described by De Araujo et al. (2000). The mycelium was allowed to grow on the cellophane
disc, and then lifted away to be dried at 105°C.
58

2.4. Liquid State Culture
Résultats et discussion. Chapitre 1 : Criblage des souches de L. edodes
The inoculum of strains was prepared by growing the mushroom mycelium on PDA
containing 2% (v/v) OMW. Erlenmeyer flasks containing 100 mL of OMW at 10% (v/v) were
sterilized (121°C for 20 min), inoculated with three agar plugs (10 mm diameter), and
incubated at 25±2°C for 30 days, under shaking (120 rpm) conditions. Controls were prepared
by OMW without inoculum, and incubated under the same conditions. Experiments were
performed in triplicate
2.5. Analytical assays
Total phenols were quantified by the method of Folin and Ciocalteu (Bärlocher and
Graça, 2005). The blue reactive complex formed was determined spectrophotometrically at
760 nm. The phenolic content of the samples were expressed as caffeic acid equivalent. After
filtration of OMW from the liquid culture, decolorization of OMW was measured at 395 nm
as reported by Sayadi and Ellouz (1993).
2.6. Molecular weight distribution of polyphenols
Gel filtration chromatography using Sephadex G-50 was carried out for the analysis of
polyphenolic compounds present in raw and treated OMW (Sayadi and Ellouz, 1993). The
column was previously equilibrated with NaOH 0.05 M, LiCl 0.025 M. The flow rate was
adjusted to 0.3 mL.min -1 . The column was calibrated with polymeric standards (Blue Dextran,
2 000 kDa; Carbonic anhydrase from Bovine, 29 kDa; Cytochrome C from Horse Heart,
12.4 kDa; Aprotinin: 6.5 kDa and Syringic acid: 0.195 kDa).
2.7. Chromatographic analyses
The monomeric composition of the phenolic fraction in OMW was extracted with
ethyl acetate as described by De Marco et al., (2007), and it was analysed by reversed phase
HPLC using binary gradient elution. The analysis was performed on an Agilent HPLC system
(USA) equipped with diode array detector. The chromatographic separation was achieved on
5 µm dC18 (4.6x250 mm) reversed-phase column (Atlantis, Ireland). The solvent system used
was a gradient of solvent A (water : acetic acid, 97:3 v/v) and solvent B (acetonitrile :
methanol, 80:20 v/v). The gradient used was previously described by De Marco et al., (2007).
59

Résultats et discussion. Chapitre 1 : Criblage des souches de L. edodes
Peak detection was carried out at 280 nm. The monomeric phenols were identified by
comparing the retention time of eluted peaks to that of standards.
2.8. Enzyme assays
Laccase (E.C. 1.10.3.2: benzenediol: oxygen oxidoreductase) activity was assayed
spectrophotometrically at 30°C using syringaldazine as substrate and monitoring the
formation of quinone at 525 nm (ɛ=65.000 M -1 cm -1 ) (Criquet et al., 1999). Manganese
peroxidase (MnP) and Lignin peroxidase (LiP) activities were determined by the oxidation of
veratrylic alcohol at 310 nm (ɛ= 93 000 M -1 cm -1 ) to veratrylic aldehyde. One international
unit of enzyme activity (IU) is defined as the amount of enzyme that produces 1 µmol of
product per min. Interferences in enzymatic assays due to OMW were eliminated by adding
insoluble polyvinylpolypyrrolidone (PVPP), as described by Sampedro et al. (2007).
2.9. Statistical treatment
One way analysis of variance (ANOVA) was used to analysze the biomass production
data and multiple pair-wise comparisons were performed by the Tukey test using Xlstat®
software.
3. Results
Strain selection involved two steps. In solid state culture, apical growth and biomass
yield were determined for all strains in order to select the best ones for OMW bioremediation.
The second step was carried out in liquid state culture, in the presence of OMW. Kinetics of
decolorization and the removal of total phenol from OMW were assessed during 30 days with
respect to the ligninolytic system. The change of polymeric and monomeric phenol
compounds was determined.
60

Résultats et discussion. Chapitre 1 : Criblage des souches de L. edodes
3.1. Tolerance of OMW by Shiitake strains
All strains of L. edodes were capable of growing on PDA with 10% and 20% of OMW
(v/v), while no mycelial growth was observed above 40% of OMW. The period of initial
growth varied among strains. By contrast, the period for complete colonization of the Petri
plate by L. edodes strains varied from 10-30 days. Apical growth rates were significantly
different among strains. They were reduced by 50% as the concentration of OMW increased
in PDA (Fig. 1).
Apical growth ( mm day -1 )
12,00
10,00
8,00
6,00
4,00
2,00
0,00
118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133
L. edodes strains
Figure 1: Growth rate (mm day -1 ) of sixteen L. edodes strains on PDA with 10% and 20% of
OMW in solid culture at 25°C until complete colonization of the Petri plate (diam. 90mm).
The apical growth of all strains was higher on PDA without OMW (data not shown).
The highest growth rate was recorded for Le118 growing on agar medium containing 10%
and 20% of OMW (10.72 and 4.97 mm day -1 , respectively), while the lowest growth rate was
shown by the strain Le126 (1.38 and 0.46 mm day -1 , respectively).
61

3.2. Biomass production
Résultats et discussion. Chapitre 1 : Criblage des souches de L. edodes
Dried mycelial biomass produced on PDA containing OMW was different among the
strains of L. edodes (Table 2). The strain Le119 showed the highest biomass production (7.02
mg day -1 l -1 ), followed by Le121, Le122, and Le118 (5.43 mg day -1 l -1 , 5.26 mg day -1 l -1 , and
4.75 mg day -1 l -1 , respectively). The lowest biomass yield was recorded in the strain Le 133
(2.29 mg day -1 l -1 ). In the case of strain Le119, the addition of 10% of OMW to PDA resulted
in a threefold increase of biomass production. However, the increase of OMW concentration
to 20% reduced the biomass yield of all strains. On the basis of mycelial growth
characteristics (apical growth rate and biomass production) on PDA containing with 10% and
20% of OMW, four strains (Le118, Le119, Le121, Le122) were selected for further
evaluation.
Table 2: Mycelial biomass production (mg day -1 l -1 ) during solid culture of sixteen L.
edodes strains on PDA with 10% and 20% of OMW in 25°C.
L. edodes PDA with 10%
PDA with 20%
strains of OMW
of OMW
Le119 7,02 a 1 4,49 a
Le121 5,43 b 4,40 a
Le122 5,26 b,c 3,96 b
Le118 4,75 c,d 3,99 b
Le124 4,33 d,e 0,36 g
Le127 4,30 d,e 3,47 c
Le129 4,23 d,e 2,49 d
Le125 4,18 d,e 2,43 d
Le123 4,15 d,e 0,44 g
Le128 4,07 e 3,96 b
Le131 4,05 e 0,35 g
Le130 4,02 e 3,54 c
Le126 3,28 f 3,67 b
Le132 3,13 f 1,42 f
Le120 2,90 f 0,00 h
Le133 2,29 g 1,85 e
1
Mean values of each parameter within the same column not sharing common letters
are significantly different (p

3.3. Decolorization of OMW
Résultats et discussion. Chapitre 1 : Criblage des souches de L. edodes
The decolorization of OMW by four selected strains of L. edodes is shown in Figure 2.
The maximum amount of color removal was recorded in the strain Le119 (65%), while the
strain Le118 exhibited low OMW decolorization during the initial stage of incubation but
increased absorbance values with time. The other two strains were found to be moderate
decolorizers of OMW. At the end of incubation period, a progressive darkening of the
biomass was observed, which could be due to the adsorption of phenolic polymers by the
mycelium. Accumulation of colored compounds into the mycelium has been estimated in
about 10 % of the initial total color.
Absorbance at 395 nm
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0 5 10 15 20 25 30
Time (day)
Figure 2: Profiles of color in OMW incubated, without inoculation (control) ( ) and with
four L. edodes strains Le118 ( ), Le119 ( ), Le121 ( ) and Le122 ( ), at 25°C.
63

Résultats et discussion. Chapitre 1 : Criblage des souches de L. edodes
3.4. Degradation of total phenol
The kinetics of total phenol degradation by L. edodes on OMW is shown in Figure 3.
Degradation appeared to be correlated with decolorization (r 2 = 0.867, P

Résultats et discussion. Chapitre 1 : Criblage des souches de L. edodes
3.5. Laccase enzyme production
Laccase production was the main enzymatic activity observed during experiments,
which involved degradation of the phenolic fraction. Figure 4 shows significant difference in
laccase activity among the four strains studied of L. edodes.
Laccase activity (UI ml -1 )
2
1,6
1,2
0,8
0,4
0
0 5 10 15 20 25 30
Figure 4: Time courses of laccase activity of four L. edodes strains Le118 ( ), Le119 ( ),
Le121 ( ) and Le122 ( ) grown on OMW liquid culture without supplement, incubated at
25°C.
The onset of laccase occurred after 5 days of incubation, while the maximum enzyme
activity was reached by the strain Le119 after 15 days (1.6 ± 0.21 UI ml -1 ). The strain Le118
produced low and steady titer of laccase (less than 0.2 UI ml -1 ). The strain Le122 exhibited
the maximum enzyme activity (0.65 UI ml -1 ) after 15 days, while the strain Le121 towards the
end of the incubation period (20-30 days).
Time (day)
65

Résultats et discussion. Chapitre 1 : Criblage des souches de L. edodes
3.6. Molecular weight distribution of OMW
The evolution of molecular weight distribution from extractable polymeric fraction of
OMW during the incubation of selected strains of L. edodes is shown in Figure 5.
OD 280nm
Fractions (Volume)
Figure 5: Evolution of the molecular weight distribution of aromatic polymer present in
OMW without inoculation ( ) (control) and after 30 days of incubation at 25°C with four L.
edodes strains ( ) Le118, ( ) Le119, ( ) Le121 and ( ) Le122. A: Carbonic anhydrase
from Bovine, 29kDa; B: Cytochrome C from Horse Heart, 12.4 kDa; C: aprotinin, 6.5 kDa).
The untreated OMW showed three groups of aromatic compounds. The first peak had
a molecular weight (MW) higher than 30 kDa, the second one less than 12.5 kDa, and the
third one apparently less than 5.5 kDa. This clearly indicated that, after 30 days of incubation
of strains, the MW distribution of polyphenol was affected. The reduction of the first fraction
(MW >30 kDa) was recorded in the strains Le119, Le121 and Le122, while the same fraction
was highly produced by the strain Le118.The strains Le118, Le119, and Le121 produced
lower depolymerization of high molecular weight aromatics than the strain Le122.
66

Résultats et discussion. Chapitre 1 : Criblage des souches de L. edodes
3.7. Phenolic monomer compound
Ethyl acetate OMW extracts were analyzed with reversed-phase HPLC in order to
assess degradation of individual monomeric aromatic components (Table 3).
Chromatographic analyses showed that the strain Le119 was capable of completely removing
hydroxytyrol, caffeic acid, and para-coumaric acid. The removal of other phenolic
compounds was of 67.12% and 89.81% for vannilic acid and tyrosol, respectively. The other
three strains (Le118, Le121, Le122) completely removed at least one compound, and partially
removed 22% of oleuropein (strain Le122) and 93.25% of para-coumaric acid (Le118). Non-
phenolic compound, such as trans-cinnamic acid, was not degraded.
Table 3: Monomeric aromatic compound removal (%) with four L. edodes strains (Le118,
Le119, Le121 and Le122), in liquid culture of OMW at 25°C after 30 days of incubation.
OMW component Le118 Le119 Le121 Le122
3,4-Dihydroxyphenylethanol
(hydroxytyrosol)
67 100 57 73.51
4-Hydroxyphenylethanol (tyrosol) 88.83 89.81 79.04 77
(+)-Catechin 73.35 68.98 100 65
Vannilic acid 0 67.12 20.29 11.97
Caffeic acid 100 100 100 100
Para-Coumaric acid 93.25 100 53.07 100
Trans-Cinnamic acid 0 0 0 0
Oleuropein 74.07 77.85 84.14 22
4. Discussion
The use of cellophane membrane allowed the growth of all strains studied of
L. edodes, as well as the color change of OMW agar medium after incubation (PDA
containing 10% and 20% OMW). The initial color was black turning to clear brown after
incubation, excepting the strain Le118 which exhibited dark color at the end of colonization.
This change of color is an indicator of the action of fungal enzymes on the hydrolysis of
phenols during mycelial growth (Sobal et al., 2003). The presence of OMW in the culture
medium affected mycelial growth of all strains. Three selected strains (Le119, Le121, Le122)
showed mycelial colonies of high density, while the strain Le118 had low density. The use of
PDA allowed better assessment of decolorization efficiency in all strains. In fact, it has been
67

Résultats et discussion. Chapitre 1 : Criblage des souches de L. edodes
shown that the metabolism for decolorization requires the presence of readily available carbon
source, such as glucose (D’Annibale et al., 1998). Enzymatic determination using ABTS
(2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) test (Collins et al., 1998), showed
that most selected strains, except Le118, were capable of producing laccase on PDA without
OMW (data not shown).
Comparative assessment, based on apical growth rate and biomass yield on OMW
agar medium, showed that the strains Le118, Le119, Le121 and Le122 were the most
efficient, and accordingly selected for further evaluation of decolorization and the removal of
total phenol from OMW. The inhibitory effects of OMW on fungi have already been reported
(Fountoulakis et al., 2002; Alaoui et al., 2008). Considering this fact, dilutions of OMW were
prepared to allow mycelial growth of L. edodes. In this study, the use of mycelium previously
grown on PDA containing 2% of OMW resulted in enhanced tolerance of strains to inhibitory
compounds from liquid OMW. This positive effect of pre-adaptation to OMW, previously
reported for several white-rot fungi (Leontievsky et al., 2002; D’Annibale et al., 2004), has
been attributed to the triggering effect of phenolic compounds for inducing the production of
ligninolytic enzymes (Fenice et al., 2003 ; Farnet et al., 2004).
Laccase was detected as the main lignin-degrading enzyme in strains studied, which
was similar to previous reports (D’Annibale et al., 2004; Olivieri et al., 2006). It has also been
reported that LiP and MnP are capable of decolorizing and removing phenolics from OMW
(Sayadi and Ellouz 1993, 1995). The molecular weight of phenolic compound from OMW
was modified by all strains at different levels. The strains Le119 and Le121 were able to
reduce all fractions obtained from OMW extract. This was in agreement with previous results
from Jouani et al. (2003) and D’Annibale et al. (2004). However, Casa et al. (2003) reported
the appearance of a novel phenolic fraction in OMW after treatment with laccase.
The difference of distribution patterns from aromatic compounds was also observed in
OMW incubated with the fungus P. chrysosporium in liquid culture, which was associated to
the production of LiP, and with purified LiP (Sayadi and Ellouz, 1993, 1995). This
interpretation is based on the assumption that other auxiliary degradative mechanisms
involving enzymes and small molecular weight agents, such as hydrogen peroxide and oxalic
acid (D’Annibale et al., 1998), are implicated in the breakdown of aromatic substances, which
could serve as substrates brought about by white-rot fungi (Durán and Esposito, 2000). The
68

Résultats et discussion. Chapitre 1 : Criblage des souches de L. edodes
fact that low molecular weight aromatics remained could be explained by the limitation of
incubation time or the enzymatic system (Sayadi and Ellouz 1993).
In relation to the effect of mycelial culture on OMW phenolic compounds, the strain
Le119 was found to be more efficient than the other strains for completely removing
hydroxytyrosol, caffeic acid and para-coumaric acid. The monomeric phenol compounds
have been shown to be particularly phytotoxic, and this toxicity increases with the synergistic
effect of monomers (Boukhoubza et al., 2007). Therefore, Isidori et al. (2005) showed that the
most toxic compounds were catechol (EC50s ranging from 0.40 mmol l -1 for Sorghum bicolor
to 1.09 mmol l -1 for Cucumis sativus) and hydroxytyrosol (EC50s ranging from 0.47 mmol l -1
for S. bicolor to 1.55 mmol l -1 for C. sativus). The non degradation of trans-cinnamic could be
due to the lack of appropriate substituent in the aromatic ring to enable laccase action
(D’Annibale et al., 2004).
Considering all screening parameters studied (Table 4), the strain Le119 of Lentinula
edodes showed the highest performance for treatment of OMW. Accordingly, it has been
selected for further experimental work in solid state cultures, using a mixture of olive
biomass, including olive tree wood and olive cake, as substrate, where OMW acts as the
wetting/moistening agent.
Table 4: Comparison of performance of four L. edodes strains (Le118, Le119, Le121 and
Le122) tested in liquid culture of OMW at 25°C.
L. edodes
strains
Decolorization (%)
30 th day
Total phenols
removal (%)
30 th day
Laccase activity
15 th day (UI.ml -1 )
Monomeric
phenols
removal (%)*
Le119 65 75 1.50 75
Le121 50 59 0.69 61
Le122 42 38 0.65 56
Le118 - 21 0.12 62
* average of degradation of the eight monomeric compounds tested.
Acknowledgements
Hicham Lakhtar is thankful to DSF-IRD France for awarding the PhD fellowship. The
authors wish to thank Dr. J. M. Savoie who kindly provided some of the L. edodes strains.
69

Résultats et discussion. Chapitre 2: Optimisation de la production du spawn
Chapitre II
Optimisation de la production de l’inoculum (spawn) de
Lentinula edodes sur les grains de blé (Ebly®)
Dans le chapitre précédent, nous avons montré que la souche L. edodes Le119 était la
plus performante parmi celles de la collection; nous l’avons retenue pour la suite du travail.
Ce chapitre a pour but d’étudier la production de l’inoculum (spawn) de la souche Le119 sur
les grains de céréales. Nous avons étudié la physiologie de croissance de la souche Le119 sur
les grains de blé de marque Ebly ® pour la production d’inoculum en grande quantité et
acclimaté pour la culture sur margines. Car pour initier la culture de L. edodes en FMS et
éviter la contamination du milieu par d’autres microorganismes antagonistes, il faut disposer
d’un inoculum performant (Mamiro et Royse, 2008). En effet, lors des premiers essais de
culture de la souche Le119 sur des mélanges de substrats oléicoles (bois de la taille, grignons
d’olive et margines), nous avons rencontré des problèmes de contamination des cultures par
des moisissures antagonistes (Aspergillus niger, Trichoderma harzianum). Pour surmonter ce
problème, nous avons modifié la technique de préparation du spawn, par l’ajout des margines
à 10% (v/v) lors de la préparation de l’Ebly ® .
Cette technique de culture du mycélium sur Ebly ® imbibé de margines a permis
d’obtenir d’une part l’induction de la production de laccases par le mycélium et d’autre part la
production importante de mycélium sur les grains de l’Ebly ® . Dans un premier temps, nous
présentons l’induction du mycélium développé sur l’Ebly ® pour la production de laccases et,
dans un deuxième temps, l’estimation de la biomasse mycélienne sur les grains de l’Ebly ® par
la quantification de l’ergosterol sera présentée sous forme d’article.
70

Résultats et discussion. Chapitre 2: Optimisation de la production du spawn
I. Induction de l’activité laccase
Dans la figure 15 sont présentés les résultats comparés de la production des activités
laccases produites par L. edodes Le119 cultivé sur deux milieux de culture en présence ou en
absence de margines.
Activité laccase (UI.g -1 SPS)
Figure 15 : Activité laccase produite par L. edodes Le119 sur des grains d’Ebly sans margines
( ) et avec des margines à 10% (v/v) ( ), incubés à 25°C avec aération forcée de 25 mL.min -1
Temps (jour)
pendant 20 jours.
On observe que, dans le milieu Ebly ® sans margines, l’activité laccase produite reste
très faible, alors que sur le milieu d’Ebly avec des margines à 10% l’activité laccase produite
est importante (1,7 UI.g -1 SPS après 12 jours d’incubation à 25°C). La présence de margines
dans le milieu de culture induit fortement la production de laccases par L. edodes Le119. Ces
résultats sont en accord avec les résultats rapportés par plusieurs auteurs (Munoz et al., 1997;
Shicheng et al., 2003; Farnet et al., 2004), qui montrent que l’addition au milieu de culture
des molécules phénoliques, telles que l’acide vanillique et l’acide férulique, induit une
importance augmentation de l’activité laccase par les basidiomycètes. D’autres composés,
telles que les atomes de cuivre et de cadmium ont été également utilisés comme inducteurs
pour l’augmentation de la production des laccases (Velazquez Cedeño, 2005).
Par ailleurs, plusieurs études ont montré que les laccases sont impliquées dans le
mécanisme de défense de L.edodes face aux antagonistes tels que les moisissures de genre
Trichoderma sp. en culture sur paille de blé (Mata et Savoie, 1998 ; Savoie et Mata, 1999,
Savoie et Mata, 2003). En effet, les souches de L. edodes forment des barrières mélanisées
71

Résultats et discussion. Chapitre 2: Optimisation de la production du spawn
liées à une forte production de laccase lors de confrontations avec des Trichoderma sp.
(Savoie et al., 2001). Ces résultats confirment bien l’intérêt d’addition des margines durant la
préparation de l’Ebly ® pour l’élaboration du spawn, afin d’éliminer la contamination des
cultures de la souche Le119 sur les substrats oléicoles (Bois de taille, grignons d’olive,
margines) et d’accélérer le démarrage des points d’inoculation.
II. Analyse de l’ergostérol non estérifié pour l’estimation quantitative de l’inoculum
(blanc) de Lentinula edodes
Contrairement à la fermentation en milieu liquide, la détermination directe de la
biomasse mycélienne durant la FMS est très difficile à réaliser à cause des filaments qui
restent enlacés au substrat de culture (Raimbault et Alazard, 1980). Différentes méthodes
indirectes ont été proposées par plusieurs auteurs, mais ces méthodes ne sont pas très
efficaces (Matcham et al., 1985 ; Bellon-Maurel et al., 2003 ; Couri et al., 2006). Dans notre
travail, nous avons choisi la méthode de la quantification de l’ergostérol non estérifié pour
l’estimation indirecte de la biomasse fongique de L.edodes Le119 développé sur les grains de
l’Ebly ® . Cette méthode reste tributaire d’une bonne proportionnalité entre l’élément dosé et la
quantité de biomasse (Sobal, 2002). Egalement la stabilité de la teneur en ergosterol des
parois du mycélium en fonction de l’âge de la culture, des conditions environnementales et de
la composition du milieu de culture doivent être vérifiés. Le dosage de l’ergosterol sur les
différents échantillons prélevés réalisés tout au long des FMS doit permettre de suivre
l’évolution de la biomasse mycélienne contenue dans les produits fermentés, mais aussi
d’estimer le pourcentage de biomasse fongique présente dans le produit fermenté par rapport
au substrat initial.
Le travail sur l’analyse de l’ergostérol a fait l’objet d’un article à soumettre à la revue
Food Chemistry.
72

Résultats et discussion. Chapitre 2: Optimisation de la production du spawn
Biomass estimation and physiological state evaluation of Lentinula edodes
spawn by non-esterified ergosterol analysis
Authors:
Hicham Lakhtar 1 , Mustapha Ismaili-Alaoui 2 , S. Roussos 1*
Author’s address:
1 Institut Méditerranéen d'Ecologie et de Paléoécologie UMR CNRS/IRD 193; IMEP Case
441; FST Saint Jérôme; Université Paul Cézanne; Av. Escadrille Normandie-Niemen; 13397
Marseille cedex 20; France ;
2 IAV –Hassan II, Laboratoire des Bioconversions ; BP. 6202-Instituts, 10101 Rabat, Maroc ;
*Corresponding author:
Sevastianos Roussos: Institut Méditerranéen d'Ecologie et de Paléoécologie UMR CNRS/IRD
193; IMEP Case 441; FST Saint Jérôme; Université Paul Cézanne; Av. Escadrille
Normandie-Niemen; 13397 Marseille cedex 20; France ;
E-mail: s.roussos@univ-cezanne.fr
Tel: (+33) 04 91 28 91 03
Fax: (+33) 04 91 28 86 68
73

Résultats et discussion. Chapitre 2: Optimisation de la production du spawn
Analyse de l’ergosterol non estérifié pour l’stimation de la biomasse et
l’evaluation de l’état physiologique de l’inoculum (blanc) de Lentinula
edodes
RESUME
A cause de la demande accrue, la production des champignons comestibles et
médicinaux connaît actuellement une expansion importante. De ce fait, la culture des
champignons est devenue de plus en plus populaire à travers le monde en raison de la maîtrise
au niveau industriel de leur culture sur différents substrats lignocellulosiques avec des
rendements élevés. La réussite de la culture de champignons dépend essentiellement de la
qualité, de l'état physiologique et de la taille de l’inoculum utilisé. Cependant, la
quantification de spawn (mycélium produit sur les grains de céréales) est très difficile. Dans
ce travail, la détermination de la biomasse mycélienne de L. edodes sur les grains d’Ebly ® au
cours de la phase végétative est décrite pour la première fois. L’ergostérol, composé de la
paroi du mycélium de L.edodes Le119, a été mesuré. L’extraction non alcaline de l’ergosterol
a été réalisée dans l’éthanol à 4° C durant une nuit. L'ergostérol extrait du mycélium a été
quantifié par l’HPLC en comparaison avec l’ergostérol pur comme standard. L’effet du
substrat et de l’âge du mycélium des cultures a été évalué et aucune différence statistique n'a
été observée pour L. edodes Le119. L’addition des margines d’olive sur les grains d’Ebly à
raison de 10% (v/v) a montré l’amélioration du rendement de la biomasse de la souche de L.
edodes. En outre, la respirométrie (production de CO2) de L. edodes Le119 cultivées en FMS
sur des grains d’Ebly ® durant la phase végétative a été corrélée avec la teneur de l'ergostérol
(r 2 = 0,80) dans le produit fermenté.
Mots clé: Lentinula edodes, Ergostérol, Inoculum (spawn), Biomasse fongique, HPLC,
Respirométrie, Fermentation en milieu solide, Facteur de conversion.
74

ABSTRACT
Résultats et discussion. Chapitre 2: Optimisation de la production du spawn
Edible and Medicinal Mushroom production is nowadays under huge expansion owing
to extensive demand in world Market. Thereby, mushroom culture is becoming more popular
throughout the world because of the improvement of mushroom culture utilizing various
lignocellulosic substrates with good yield of production. However, mushroom culture
successful depends primarily to quality, physiological state and size of spawn used. While the
quantification of spawn (mycelium produced on cereal grain) is very difficult to obtain. In the
present work, the determination of mycelial biomass of L. edodes spawn on wheat grain
Ebly® during spawn running is reported for the first time. Ergosterol of Le119 L. edodes
strain mycelium was measured. Non-Alkaline extractions were performed with ethanol at 4°C
for overnight. The extracted ergosterol was quantified by RP-HPLC against ergosterol pure as
standard. Effect of different substrates and ages of L. edodes mycelium were evaluated. No
statistical differences were exhibited for the Lentinula edodes Le119 strain. Presence of
supplement on wheat grain as olive mill wastewater in 10% (v/v) exhibited enhancement of
mycelial biomass yield of L. edodes strain. Furthermore, the respirometry (CO2 production) of
L. edodes cultivated in solid state fermentation on wheat grain during spawn running was
correlated to ergosterol content of fermented products (r 2 = 0.80).
Keywords: L. edode, Ergosterol, Spawn, Fungal Biomass, HPLC, Respirometry, Solid State
Fermentation, Conversion Factor.
75

1. Introduction
Résultats et discussion. Chapitre 2: Optimisation de la production du spawn
Ergosterol is principal sterol present in fungi biomass (Czub and Baginski, 2006) with
its two forms, as free ergosterol and esterified ergosterol. The relative abundances of free to
esterified ergosterol are different among the various species of fungi (Czub and Baginski
2006; Yuan et al., 2007). Therefore, the determination of ergosterol consists in measuring of
living fungal biomass, because of the assumption of its instability after death of biomass
(Mille-Lindblom et al., 2004). This ergosterol was also subject for certain investigations in
order to study its conversion to Vitamin D2 (Jasinghe and Perera, 2005; 2006) which has been
suggested for therapeutic applications in the treatment of several diseases including
hyperproliferative diseases, secondary hyperparathyroidism, post-transplant survival, and
various malignancies (Morgan, 2001).
Culture of L. edodes attracks attention of several authors for its proved medicinal
properties and antimicrobial effect (Kitzberger et al., 2007; Israilides et al., 2008; Rao et al.,
2009) and biodegradation as well as biotransformation abilities of phenolic compound as
lignin by producing large spectrum of enzymes involved in transformation of these
recalcitrant compounds (Philippoussis al., 2007). While the kinetics of growth of the
mycelium is related to nutritional and environmental factors, several authors (Mamiro and
Royse 2008; Kuforiji and Fasidi 2009; Royse and Chalupa 2009) demonstrated that the high
quality crop of mushroom depends primarily on the quality of the spawn, which in turn
depends on the purity and size of biomass and physiological state of the culture. However,
direct quantification of biomass during spawn running is very difficult or even impossible,
owing to the problem of separating the fungal mycelium from the substrate, where the fungal
hyphae penetrate into and bind tightly to the substrate (Bellon-Maurel et al., 2003; Singhania
et al., 2009).
However, several techniques of indirect fungal biomass in Solid state fermentation
(SSF) were reported depending to measuring the biological activity (e.g respiration O2 intake
and/or CO2 production) or measuring the content of certain cell components. Recently digital
image processing has been developed as a tool for measuring of biomass of Aspergillus niger
strains in SSF (Couri et al., 2006). The growth of this strain was quantified as the total area
occupied by the hyphae, while this technique was poorly correlated with glucosamine test.
The drawback of this technique consists in setting up of the focus and illumination parameters
which become more difficult when complex substrates are used (Couri et al., 2006).
76

Résultats et discussion. Chapitre 2: Optimisation de la production du spawn
Therefore, to our knowledge, there is no report on estimation of quantity and quality of
biomass during the production of medicinal Lentinula edodes spawn on wheat grain. In the
present study, we report for the first time ergosterol-biomass conversion factor in spawn of L.
edodes. Non-alkaline protocol of extraction of ergosterol is developed for estimation of both
quantity and quality ways of L. edodes biomass during spawn running. Effect of substrate of
culture and age of mycelium were evaluated in model system to determine the quantity of
spawn. The correlation between ergosterol levels and CO2 production was determined to
estimate the quality of L. edodes spawn.
2. Materiel and methods
2.1. Microorganism
Lentinula edodes Le119 was previously selected among collection of sixteen strains
for its capability of colonization of olive wastes. The preserved stock culture of strain was
maintained in sterilized Potato Dextrose Agar (PDA) (39 g.L -1 , Sigma, France) with 10% of
Olive mill wastewater (OMW) (Lakhtar et al., 2009) with periodic transfer of one month.
2.2. Culture Media
2.2.1. Liquid state cultivation
Liquid cultures were grown on Malt Extract medium (ME) (30 g.L -1 , Sigma, France)
and on diluted OMW (10% of v/v) without any supplements. The culture media (100 mL)
were sterilized (121°C, 20 min) and then inoculated with three plugs (1 cm diameter) of
earlier uniformly colonized PDA of one week. Medium was incubated at 25°C under shaking
(120 rpm). Triplicate flasks were harvested for determination of mycelial biomass dry weight
and ergosterol content. Mycelium was harvested from the liquid medium by filtration
(Watman filter N°1) and frozen dried.
2.2.2. Solid state Cultivation on model system
Three different culture media were used for solid culture: PDA, PDA supplemented
with 10% of OMW and Ebly Agar (EbA) consisting of 24 g of wheat grain (Ebly®, Casino,
France), which were milled to powder, and 15 g of agar in 1 mL of distillated water. These
media were used to determine ergosterol content in mycelial biomass of L. edodes Le119
strain. Biomass and ergosterol content was estimated using sterilized cellophane disc placed
on the agar surface from Petri dishes (diam. 90 mm) (De Araujo et al., 2002). After
colonization, the mycelium was separated from the substrate and cellophane membrane. It
77

Résultats et discussion. Chapitre 2: Optimisation de la production du spawn
was then cut out and frozen dried. Each part of mycelial colony with different ages was tested
to quantify ergosterol content (Fig. 1).
1 2 3 4
Figure 1. Mycelium growth of L.edodes Le119 on solid medium with cellophane membrane
incubated at 25°C, 1: Inoculum (6 mm), 2: with mycelium 20 days old, 3: with mycelium 12
days old, 4: with mycelium 5 days old.
2.3. Solid state fermentation of L. edodes on wheat grain
Tow spawn kinds of L. edodes Le119 strain were prepared. White spawn (WS) was
prepared as described by Sobal (2002) with modification. Quantity of 200 g of wheat grain of
Ebly® were humidified with distilled water to 50% (w/w). While the brown spawn (BS), was
prepared with addition of OMW; 200 g of wheat was wetted with 10% of OMW to get 50%
(w/w) of humidity, heated with microwave for 5 minutes to allow absorption of OMW by
Ebly®. The substrates were autoclaved for 30 min at 121°C and allowed to cool for 24h. Pre-
weighed “Raimbault columns” (De Araujo et al., 1997) were filled with sterilized Ebly®
alternated by inoculum (three plugs of 5 mm) cut from PDA previously colonized with Le119
strain of 1 week. Forced aeration of the substrate was regulated to 25 mL.min -1 (which
allowed five time of air renewal in column per hour). The CO2 production was recorded using
Infra-red detector which was calibrated with air containing 1 and 5% of CO2.
2.4. Extraction of non esterified ergosterol
Pure mycelium and spawn (Ebly® fermented) samples were frozen-dried to constant
weight and milled to a uniform fine powder using grinder (IKA Labortechnik, Germany).
Ergosterol was extracted from 50 mg samples of pure mycelium and spawn by
homogenization in 1 mL of methanol. The mixtures were vortexed for 1 minute and
subsequently shaken vigorously and then incubated at 4°C for overnight in the dark.
Supernatants were recovered by centrifugation for 10 minutes at 14 000 rpm. The supernatant
was then filtered through 0.2 µm syringe filter (Iso-Disc TM Filters, USA).
78

Résultats et discussion. Chapitre 2: Optimisation de la production du spawn
2.5. Recovery of ergosterol from spawn spiked with ergosterol and mycelium.
Assessment of the recovery efficiency of ergosterol was carried out by artificially
addition of pure ergosterol (from Sigma) or mycelium which its ergosterol content was
already determined [3.55 mg (ergosterol).g -1 (mycelium)]. Recovery of pure ergosterol was
determined after mixing 0.5 mL of methanol containing 100 µg dissolved ergosterol with 10 g
(dry weight basis) of Le119 spawn. After mixing, sub-samples were extracted using the
described procedures and ergosterol was determined by HPLC. For recovery of fungal
ergosterol, portion of 100 mg of pure mycelium were mixed with 10 g (dry weight) of spawn.
After mixing, sub-samples were extracted using the described procedures and the amount of
ergosterol was determined.
2.6. HPLC analysis
Final separation of ergosterol from extract matrix was performed by reversed-phase
high-performance liquid chromatography (RP-HPLC). The chromatographic systems used
were an Agilent Series 2000. Volume injection was 20 µl of sample. The chromatographic
separation was achieved on 5 µm dC18 (4.6x250 mm) reversed-phase column (Atlantis,
Ireland) and detection was set at 282 nm. Elution of ergosterol at column temperature of 40°C
was performed with isocratic run with 100% methanol at a flow rate of 1 mL.min -1 . Peak
identity was checked on the basis of retention times of pure ergosterol. Correlation between
dry biomass and ergosterol content was verified by measuring the peak height and area. UV
spectrum of ergosterol extracted from spawn was recorded using the same apparatus from 265
to 300 nm. All experiments were carried out in triplicate.
2.7. Statistical Analysis
One way analyses of variance were tested for effects of medium composition and
culture age on the ergosterol concentration in mycelium. The significance level was set at P =
0.05. The correlation coefficient was used to determine the relationship two properties
(biomass and ergosterol; ergosterol and CO2 production). The analysis were performed using
Xlstat® software.
79

3. Results
Résultats et discussion. Chapitre 2: Optimisation de la production du spawn
The present study was aimed to evaluate ergosterol from mycelium of a basidiomycete
(Lentinula edodes), for indirect estimation of quantity of biomass culturing in solid state
fermentation for production of spawn on Ebly®. The effects of medium of culture and age of
mycelium were evaluated in liquid state and in agar plate covered with cellophane membrane
as model system for solid state culture. This system allows the growth of mycelium and
prevents penetration of the mycelium into the substrate of the culture.
3.1. Growth curves in liquid state culture.
The growth curves of L. edodes cultivated on different media in liquid state culture are
shown in Fig. 2. The highest ratio of biomass was obtained on ME (102 ±6.0 mg.L -1 ).
However, the ergosterol content (3.6 mg.g -1 dw) of L. edodes in both media (ME and 10% of
OMW) was not statistically different during cultivation time.
Dry weight of mycelium (mg)
150
130
110
90
70
50
30
10
-10
0 7 14
Incubation Time (day)
21 28 0
Figure 2. Time course of biomass production (solid lines) and ergosterol content (mg.g -1 dw)
(dashed lines) on ME ( ) and OMW ( ) at 25°C.
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
Ergosterol content mg.g -1
80

Résultats et discussion. Chapitre 2: Optimisation de la production du spawn
3.2. Conversion factor of Lentinula edodes in solid state culture:
In solid state culture, the biomass produced in PDA, PDA supplemented with 10% of
OMW and EbA is shown in Table1. Maintain of mycelium on agar slants in the presence of
OMW was successful to produce high biomass yield compared to that produced in PDA (268
and 75 mg respectively at 20 days of incubation), while the biomass produced in EbA was
moderate (105 mg at 20 days of incubation). EbA was used to determine conversion factor
(ergosterol content in mycelium) in medium that contain the substrate used for production of
spawn. The agar media used were analyzed and were found not to contain ergosterol (Data
not shown). Differences among media were not significant when all data were analyzed
together. In 20-day old mycelium, ergosterol content exhibited the highest variability in all
culture media (Table1).
Table1. Effect of age and substrate on mycelial ergosterol contents
Medium Culture age Biomass Ergosterol content
(days) (mg)
(mg.g -1 of dry weight)
PDA 5 20 3,46 ± 0,28
PDA +10 %
of OMW
12 45 3,72 ± 0,32
20 75 3,17 ± 0,74
5 75 3,97 ± 0,21
12 170 3,82 ± 0,54
20 268 3,32 ± 1,02
EbA 5 43 3,64 ± 0,45
12 65 3,71 ± 0,23
20 105 3,32 ± 0,95
Straight line relationship between fungal dry biomass and ergosterol content was
observed and the statistical analysis proved a high correlation (r 2 =0.99) (Fig. 3). Under the
HPLC conditions tested, the calibration curve was established by plotting the peak area and
peak height against ergosterol standard.
81

Ergosterol (mg)
Résultats et discussion. Chapitre 2: Optimisation de la production du spawn
0,2
0,16
0,12
0,08
0,04
0
y = 0,003x - 0,000
R² = 0,999
0 10 20 30 40 50
Figure 3. Relationship between fungal dry weight and ergeosterol content, for L. edodes
Le119 cultivated in solid state culture with cellophane system, incubated during 20 days at
25°C.
3.3. Recovery of spiked ergosterol:
The recovery of methanol-dissolved ergosterol from spawn was estimated to 75-80%
for both in brown and white spawn respectively, and the recovered value did not differ
significantly (Table 2). However, 90% of recovery of fungal ergosterol was found for Le119
strain.
Biomass dry weight (mg)
Table 2. Recovery of Sigma pure ergosterol and fungal ergosterol (homogenized
mycelium of L. edodes Le119) added to Brown and White spawn
Samples Recovery of pure
ergosterol µg.g -1
Brown Spawn 7 .52 3.17a 1
White spawn 8.04 3.21a
Added amount 2 10.0 3.55b
Recovery of fungal
ergosterol
1 Different letters indicate significant differences.
2 Added amount of ergosterol for Le119 was based on direct measurements of ergosterol in
the mycelium using described protocol for extraction.
82

Résultats et discussion. Chapitre 2: Optimisation de la production du spawn
3.4. Growth curves of spawn
The growth curves of L. edodes Le 119 shiitake strains on different preparation of
Ebly® (white and brown spawn) presented by ergosterol content and CO2 production by
mycelium are shown in Figure 4. On Ebly® supplemented with 10% OMW, the biomass
produced, which was represented and determined by measuring ergosterol contained in
spawn, was higher than on wheat without supplementation [0.6 and 1.8 mg (biomass).g -1 dw
(spawn) respectively after 20 days of incubation]. These results indicated that presence of
OMW is more efficient for spawn production of Le119 strain of L. edodes. At the end of the
growth period, high variation of ergosterol was observed for both media.
CO2 production (mL .h -1 .g -1 dw)
Time (day)
Figure 4. Time course of biomass production (mg.g -1 substrate dw) (solid lines) and CO2
production (dashed lines) of Le119 strain on wheat with ( , ) and without OMW ( , ) at
25°C.
The time courses of CO2 production were similar for all two media. Strong CO2
production was observed after 6-8 days until 14-16. After this period, the amount of CO2
produced was slightly increased. The mycelial biomass produced on both media was
estimated using conversion factor of 281 (f = 1/3.56 x 1 000, average of factor conversion
found by culturing of mycelium on EbA). Estimating ergosterol in spawn preparation, close
correlation coefficient between ergosterol content in spawn and CO2 production was found for
the both media WS (r 2 = 0.965 and 0.956 for BS and WS respectively) (Fig. 5).
Ergosterol content (mg.g -1 )
83

Ergosterol content (mg.g -1 )
Résultats et discussion. Chapitre 2: Optimisation de la production du spawn
Figure 5. Correlation between ergosterol content and CO2 production by L. edodes Le119 in
WS ( ) and BS ( ) incubated at 25°C during 20 days.
4. Discussion
CO2 production (mL .h -1 .g -1 dw)
Estimation of fungal biomass in solid state fermentation was subject of several studies
(Ooijkaas et al., 1998; Scotti et al., 2001; Niemenmaa et al., 2008). Therefore, respiration
measurement (O2 consumption or/and CO2 production) and biochemical analysis of cell
components were evaluated to find a good indicator for biomass estimation. Thus, the
combination of different indicators was carried out in order to offer a significant improvement
of correlation between real biomass and which was estimated (Matcham et al., 1985; Ooijkaas
et al., 1998). Whereas, higher the number of indicators, the more difficult to interpret the
results and the conversion of growth become totally impracticable.
In our study, ergosterol was tested for estimation of L. edodes biomass cultivated in
solid state fermentation to produce spawn of L. edodes which is the main factor of the
attainment for high quality crop of mushroom (Mamiro and Royse 2008; Kuforiji and Fasidi
2009; Royse and Chalupa 2009). Ergosterol content showed close correlation to mycelial
growth (r= 0.987). Similar result was obtained for Agaricus bisporus (Matcham et al., 1985)
which was cultivated on different media in solid and liquid state culture, while it was in
disagreement with Coniothyrium minitans produced on PDA (Ooijkaas et al., 1998).The
explanation could be that the spore production of C.minitans affects the ergosterol content
which in return was depending to the nature of substrate. Thus the determination of ergosterol
could present a good result for estimation of basidiomycete mycelium.
84

Résultats et discussion. Chapitre 2: Optimisation de la production du spawn
The substrates used for L. edodes growth in both liquid and solid state culture exhibited
constant ergosterol content in mycelium. Mean value of ergosterol content in pure mycelium
3.57± 0.56 (mg.g-1 of dry weight) was within the range found in other experiments with other
microorganism (Pasanen et al., 1999; Barajas-Aceves 2000; Jasinghe and Perera 2005). While
some of fungal species exhibited large differences in ergosterol content between the isolates,
as can be seen from the relatively large standard deviation (Klamer and Bååth 2004; Mille-
Lindblom et al., 2004; De Ridder-Duine et al., 2006).
It would appear that culturing of mycelium on EbA could allow for operating nearly to
natural condition so as to gain insight into the magnitude of variation and hence the potential
error when calculating fungal biomass from ergosterol concentration measured in spawn
fermentation (Gessner and Chauvet 1993). Determination of ergosterol allowed for reducing
the use of hazardous organic solvents which involved in saponification step of ergosteryl ester
(De Ridder-Duine et al., 2006), and this thereby permeates for measuring of living fungal
biomass (Mille-Lindblom et al., 2004) based on the assumption that the ergosterol have been
considered as kind of lipids storage (Klamer and Bååth 2004). Furthermore, the recovery of
ergosterol with this simple protocol was exhibited in the most of case very high as could be
reported by several authors (Gong et al., 2001; De Ridder-Duine et al., 2006; Yuan et al.,
2007).
The identification of ergosterol with HPLC was achieved by comparing its retention
time and spectrum against ergosterol standard (Fig. 6). The ergosterol spectrum exhibited
characteristic pattern, because it has a conjugated pair of double bonds at carbons 5-6 and 7-8,
it absorbs UV light strongly between 240 and 300 nm. The interference of sterol containing in
wheat, as reported by Seitz et al. (1977), was eliminated by verification of purity of ergosterol
peak detected by HPLC, and verification of spectrum of peak corresponding to ergosterol.
The conversion of ergosterol, which was considered as precursor, to vitamin D2
(Ergocalciferol) by UV irradiation was reported by several authors (Jasinghe and Perera 2005;
Jasinghe and Perera 2006; Teichmann et al., 2007). Certain author investigated conversion
kinetics of ergosterol to vitamin D2 in natural products such as in L. edodes mushrooms so as
to modeling of conversion in order to predict the yield of vitamin D2 after the irradiation
process.
85

D.O (mAU)
Résultats et discussion. Chapitre 2: Optimisation de la production du spawn
Figure 6. UV spectrum (260- 300 nm) of ergosterol extracted from mycelium of L. edodes
Le119 strain grown on Ebly ® in solid state fermentation.
5. Conclusion
The results presented in this paper showed that the non-esterified ergosterol
measurement of L. edodes can be considered as a reliable indirect method for estimating
fungal biomass present in spawn. In fact, non-esterified ergosterol content is constant
whatever the age of the mycelium, culture conditions and medium composition. In the other
hand, this study demonstrated that the established correlations between Ergosterol and CO2
rate production in solid state fermentation permit a good estimation of the physiological state
of mycelial biomass. By using the linear regression equation obtained in solid state culture,
quantities of non-esterified ergosterol measured could be easily converted into fungal dry
matter quantities per gram of dry solid medium (1 g of mycelial biomass contain 3.57 mg of
ergosterol). To optimize a solid state fermentation process for biomass production, the use of
such method cannot be avoided.
Wavelength (nm)
86

Résultats et discussion. Chapitre 3: Evaluation des facteurs de croissance
Chapitre III
Culture de Lentinula edodes en fermentation en milieu solide sur
substrat oléicole solide: Evaluation des facteurs de croissance
Dans les chapitres précédents, nous avons optimisé la préparation de l’inoculum
(spawn) de L. edodes Le119 sur les grains de l’Ebly® par l’addition des margines à 10%.
L’ajout des margines a permis de produire un inoculum avec une biomasse mycélienne active,
abondante et induite pour la production des laccases, permettant ainsi d’éliminer la
contamination des cultures par des moisissures indésirables. Après cette étape cruciale qui
conditionne la réussite de la culture de L. edodes sur les substrats oléicoles, nous avons
cherché à optimiser les conditions de culture de L. edodes Le119 sur un mélange optimisé, de
bois de taille, grignons d’olive et de margines, qui va constituer tout le long de ce travail le
Substrat Oléicole Solide (SOS).
Avant toute démarche d’optimisation des conditions de culture d’un microorganisme,
la première étape consiste en la détermination des facteurs susceptibles d’avoir une influence
sur la culture. Plusieurs méthodologies ont été rapportées dans la littérature, entre autres la
méthode ‘Une variable à la fois’ et la méthode de plan d’expérience (Mathieu et Phan-Tan-
Luu, 1997). La méthode ‘Une variable à la fois’ consiste à fixer tous les facteurs sauf un, pour
connaître son effet sur la réponse. Elle est coûteuse en nombre d'essais, et inefficace : elle ne
permet pas d'optimiser le processus ni de trouver un modèle prédictif s'il existe des
interactions entre les facteurs. Dans un plan d'expérience au contraire, toutes les données sont
87

Résultats et discussion. Chapitre 3: Evaluation des facteurs de croissance
utilisées simultanément pour calculer le poids de chaque effet, d'où une précision accrue et un
faible nombre d'essais.
Plusieurs matrices d’expériences ont été utilisées selon l’objectif de l’étude et selon la
qualité d’information recherchée (Mathieu et Phan-Tan-Luu, 1997). Dans notre étude, nous
avons sélectionné une matrice factorielle fractionnaire asymétrique, ayant 5 facteurs (pH
initial du substrat, débit d’aération, âge de l’inoculum, taux de l’inoculum et taille des
particules) avec deux niveaux et un facteur (solution minérale) avec 5 niveaux sur 16
expériences (2 5 5 1 //16).
Dans un premier temps, l’approche expérimentale a consisté en la détermination d’un
mélange optimal de bois de taille, grignons d’olive et de margines permettant une bonne
production de la biomasse mycélienne de L. edodes Le119. Dans un deuxième temps, on a
évalué l’influence des six facteurs, définis auparavant, sur la biomasse mycélienne produite
sur le mélange optimisé et sur la dégradation des phénols totaux du mélange en fermentation
en milieu solide dans des colonnes de Raimbault.
Technology.
Ce chapitre a fait l’objet d’un article à soumettre dans la revue Bioresource
88

Authors:
Résultats et discussion. Chapitre 3: Evaluation des facteurs de croissance
Solid state fermentation of Lentinula edodes on solid olive substrate:
Evaluation of growth factors.
Hicham Lakhtar 1 , Mustapha Ismaili-Alaoui 2 , Sévastianos Roussos 1*
Author’s address:
1 Institut Méditerranéen d'Ecologie et de Paléoécologie UMR CNRS/IRD 193; IMEP Case
441; FST Saint Jérôme; Université Paul Cézanne; Av. Escadrille Normandie-Niemen; 13397
Marseille cedex 20; France ;
2 IAV –Hassan II, Laboratoire des Bioconversions ; BP. 6202-Instituts, 10101 Rabat, Maroc ;
*Corresponding author:
Sevastianos Roussos: Institut Méditerranéen d'Ecologie et de Paléoécologie UMR CNRS/IRD
193; IMEP Case 441; FST Saint Jérôme; Université Paul Cézanne; Av. Escadrille
Normandie-Niemen; 13397 Marseille cedex 20; France ;
E-mail: s.roussos@univ-cezanne.fr
Tel: (+33) 04 91 28 91 03
Fax: (+33) 04 91 28 86 68
89

Résultats et discussion. Chapitre 3: Evaluation des facteurs de croissance
Culture de Lentinula edodes en fermentation en milieu solide sur substrat
oleicole solide: Evaluation des facteurs de croissance
RESUME
L’objectif de l’étude a été d’optimiser la culture de Lentinula edodes Le119 en
fermentation en milieu solide sur les substrats oléicoles composés de bois de taille, des
grignons d’olive et des margines constituant ainsi un substrat oleicole solide destiné à la
culture du mycélium. Tout d’abord, la formule optimale de mélange de substrats oléicoles
pour la fermentation en milieu solide de la souche de L. edodes Le119 a été déterminée. Par la
suite, les facteurs de croissance (pH initial, aération, âge d’inoculum, taux d’inoculum, taille
de particules, et solution minérale) ont été évalués suivant la méthodologie de plan de criblage
sous la forme d’un plan d’expérience factoriel factionnaire 2 5 5 1 //16 expériences. Les résultats
de la première série d’expériences ont montré que la quantité de chaque composant du
mélange est la suivante ; 20% de bois, 30% de grignons d’olive et 50% de margines. Ce
mélange permet une croissance abondante du mycélium et une production de la biomasse
mycélienne de 16,24 mg.g -1 substrat poids sec (SPS). Les résultats de la deuxième série
d’expériences ont montré que l’addition de la solution minérale exerce un effet négatif sur la
production de la biomasse mycélienne ainsi que la dégradation des phénols totaux, tandis que
le taux d’inoculum, utilisée pour démarrer les cultures, exerce un effet positif sur les deux
réponses. La croissance mycélienne de L. edodes Le119 a montré une bonne corrélation avec
la réduction des phénols totaux (r 2 = 0,81, P< 0.001). Les conditions optimisées de culture de
L. edodes Le119 sur SOS avec 10% (p/p) d’inoculum et sans addition de solution minérale a
abouti à la production de la biomasse mycélienne de 30,44 mg.g -1 SPS, à l’absence de
contamination de culture et à 48% de réduction en phénols totaux initialement présents dans
les margines.
Mots clé : Bois de la taille, Grignons d’olive, Margines, Fermentation en milieu solide,
Planification expérimentale, Optimisation, Dégradation des phénols.
90

ABSTRACT
Résultats et discussion. Chapitre 3: Evaluation des facteurs de croissance
The aim of the present work was to optimize the conditions of solid state fermentation
of Lentinula edodes on solid olive substrate (SOS) including olive twigs and leaves (OTL),
olive cake (OC) where olive mill wastewater (OMW) acts as the wetting/moistening agent. To
do so, the optimal formulation of substrate for L. edodes Le119 strain culture was determined.
In the other hand, the growth factors (Initial pH, aeration, inoculum age, inoculum size
particle size and mineral solution) were evaluated following the experimental screening
design methodology using 2 5 5 1 //16 experiments. The results of a first series of experiments
showed the optimal formulation of substrate for Le119 strain was OTL (20%) + OC (30%) +
OMW (50%) allowing mycelial biomass production of 16,24 mg.g -1 of substrate dry weight.
For a second series of experiments, the results showed that the nutriment added to the
substrate exercised a negative effect on mycelial growth of L. edodes Le119 strain and total
phenol removal of substrate, while the spawn size exercised a positive effect on both
responses. The mycelial growth appeared to be in correlation with reduction of total phenols
(r 2 = 0.81, P< 0.001). Optimized conditions of Le119 culture on SOS with 10% of spawn and
without solution mineral led to production of mycelial biomass of 30.44 mg.g -1 of substrate
dry weight, absence of culture contamination and to a 48% drop in total phenols initially
present in OMW.
Keywords: Olive twigs and leaves, Olive cake, Olive mill wastewater, Solid state
fermentation, Experimental design methodology, Optimization. Phenol degradation.
91

1. Introduction
Résultats et discussion. Chapitre 3: Evaluation des facteurs de croissance
The importance of olive oil mill industry in Mediterranean countries is well known, as
well as the serious problems that olive mill factories have in disposing their by-products
(Cayuela et al., 2006, Altieri and Esposito 2008). Commonly, olive mills produce residual
solids, the olive cake (OC) which make up a fibrous lignocellulosic waste and generally used
as fuel (Ait Baddi et al., 2009); and a black liquid effluent, the olive mill wastewater or
(OMW), which is a strong pollutant mainly due to its high phenolic content and organic load
(Mekki et al., 2007). In addition, it has been estimated that each olive tree could produces 25
kg leaves and twigs per year (Fayed et al., 2009).
In the past, several investigations were carried out to select microorganisms (notably
fungi) capable of eliminating the inhibitory effects of those substances and of converting the
initial waste either directly into a useful end-product or by making it susceptible to further
physicochemical and biological treatments (Jaouani et al., 2003; Lakhtar et al., 2009). Among
Basidiomycotina in particular, white-rot fungi belonging to the genus Pleurotus and Lentinula
were selectively tested for their ability to decompose the lignin and are among the most
efficient producers of lignocellulosic enzymes (Elisashvili et al., 2008). In addition, they can
be cultivated on a large lignocellulosic substrates transforming them into food and feed
(Zhang et al., 1995).
Lentinula edodes (Berk.) Pegler (shiitake) is the second most popular edible
mushroom in the world because of its flavor, taste and quality ((Tsai et al., 2009)). In
addition, L. edodes is one of the best known and the best characterized mushrooms used for
medicinal purposes (Hadar and Dosoretz 1991; Hirasawa et al., 1999; Hatvani 2001; Gu and
Belury 2005; Israilides et al., 2008; Shen et al., 2009). Owing to L. edodes characteristic,
different substrate formulations have been developed in different countries, depending on
their readily available raw material. Agricultural wastes such as oak, cereal straw, corn cobs,
sugarcane bagasse are used alone or in combination with other wastes in L. edodes cultivation
(Sunchez et Royse 2001; Philippoussis et al., 2003; Kalmis et Sargin 2004; Özçelik and
Peksen 2007; Philippoussis et al., 2007). However, for the first time, the use of mixture of
olive cake, olive twigs and leaves supplemented with OMW is reported.
To determine the parameters affecting biomass production of L. edodes and
polyphenol removal from OMW, with the intention to optimize the conditions of solid state
fermentation, the set of factors influencing the growth of L. edodes on olives residues was
92

Résultats et discussion. Chapitre 3: Evaluation des facteurs de croissance
studied. Asymmetrical screening design was established and processing the results with the
Nemrodw software (New Efficient Methodology for Research using Optimal Design) enabled
us to quantify the direct effects of the various factors on the responses chosen and to identify
those that will require fine-tuning during the optimization phase.
2. Materials and methods
2.1. Microorganism and spawn preparation
Single strain of L.edodes (Le119) was used in the experiments. The strain was
maintained at 4 °C on potato dextrose agar (PDA, Sigma, France) supplemented with 10% of
OMW (Lakhtar et al., 2009). Wheat grains (Ebly®, Casino, France) were used as substrate
and growth support for spawn preparation. The grains were cooked for 5 min in a water
solution containing 10% (v/v) of OMW at a ratio of 1:1 (Ebly®: Solution; w: v). Once
cooked, the wheat grains were packaged (250 g of wheat grains in jar of 250 ml) and
sterilized in an autoclave at 121 °C for 30 min. After sterilization, the grains were inoculated
with 5 agar disks of 5 mm diameter containing mycelium and then placed in “Raimbault
columns” (De Araujo et al., 1997) and incubated at 25±2 °C in the absence of light for a
periode of 10 and 25 days.
2.2. Preparation of substrates
The substrates were composed of different parts; OC, olive twigs and leaves (OTL)
and OMW as wetting agent. OC was dried in greenhouse retaining 10% of humidity (w/w).
OC and OMW used throughout the study were taken from a three phase system used in the
conventional press type olive oil mill plant (Beni-Mellal, Morocco). The OC and OTL were
dried in solar greenhouse with 10% (w/w) of moisture retained. OMW was stored at -20°C
until it was used. OMW dilutions were performed in distillate water, unless otherwise stated.
The OTL were ground and sieved to desirable particle size. The individual ingredients of the
substrate were mixed thoroughly by mechanical means to achieve a homogenous mixture.
2.3. Formulation of substrate for L. edodes culture
In order to determine the optimal formulation of substrates allowed for high mycelia
biomass, different mixtures of OC and OTL (max. particle size: 5 mm) were soaked with 50%
(v/v) of OMW to obtain 50% of moisture (Table 1). Sterilization was carried out at 121°C for
30 min. After cooling, 5g of grains of wheat spawn (15 days age) added to 45 g of sterile
substrate were gently mixed and placed in sterile 200 mL Erlenmeyer flask. The Erlenmeyer
flasks were then incubated at 25±2 °C for 1 month. Mycelial biomass was estimated using
93

Résultats et discussion. Chapitre 3: Evaluation des facteurs de croissance
ergosterol analysis as reported previously. At least three Erlenmeyers flasks per treatment
were evaluated.
Table 1. Mixing ratio of olive twigs and leaves (OTL), olive cake (OC) and olive mill
wastewater (OMW) used as substrate for L.edodes growth.
Treatment No Ingredient
OTL (%) Olive cake (%) OMW (%)
1 0 50 50
2 20 30 50
3 30 20 50
4 50 0 50
2.4. Experimental methodology
2.4.1. Asymmetrical screening design
For systems with a great number of variables different approaches of experimental
factorial designs can be applied to achieve a screening of critical variables and to estimate
their main effects on the responses. Inspiration was drawn from previous works (Baçaoui et
al., 2001; Alinsafi et al., 2005; El Hajjouji et al., 2008). In this study, a 2 5 5 1 //16 experimental
design was processed using Nemrodw software (Mathieu et al., 2000). It allowed the
investigation of six factors (A-F) in sixteen experiments, five factors A-E each at two levels
and one factor F at five levels. Tables 2 and 3 listed the values given to each factor; the choice
was based on our preliminary experiments. Table 4 showed the 2 5 5 1 //16 experimental design.
The results treatment was processed using Nemrodw software.
From the 16 runs we can compute, using the least square method (Baçaoui et al., 2001;
El Hajjouji et al., 2008), the ‘‘weight’’ of each factor level. For each factor, the weight of
each level is related to the upper level weight, which becomes the ‘‘reference state’’ among
each factor (Mathieu and Phan-Tan-Luu, 1997). The weight describes the factor effects on the
response when changing factor levels with respect to the reference state. The obtained results
are generally presented as histograms which graphically illustrate the variable differential
weights (Lewis et al., 1999).
94

Résultats et discussion. Chapitre 3: Evaluation des facteurs de croissance
Table 2. Particle size and Composition of mineral solution used in experimental conditions
Particle size
0.8

Résultats et discussion. Chapitre 3: Evaluation des facteurs de croissance
Table 4. Experimental conditions of the screening design with 6 factors (A-F).
Run No A B C D E F
1 5 20 25 20 T2 SO
2 6 30 10 10 T1 SO
3 5 20 25 20 T1 MS1
4 6 30 10 10 T2 MS1
5 5 20 10 10 T2 MS3
6 6 30 25 20 T1 MS3
7 5 20 10 10 T1 MS2
8 6 30 25 20 T2 MS2
9 5 30 25 10 T2 MS4
10 6 20 10 20 T1 MS4
11 5 30 25 10 T1 MS3
12 6 20 10 20 T2 MS3
13 5 30 10 20 T2 MS1
14 6 20 25 10 T1 MS1
15 5 30 10 20 T1 SO
16 6 20 25 10 T2 SO
2.5. Methods of analysis
2.5.1. Standard chemical analysis
The pH value of the sample of substrates was assayed following dilution of 1 g in
10 mL of distilled water, and by using a digital pH meter. Mycelial biomass was measured by
determination of non esterified ergosterol. A sample of 50 mg of frozen-dried sample was
used to extract non esterified ergosterol which was determined with HPLC. Pure ergosterol
(Sigma, France) was used as standard. The total phenol was determined as reported by
Lakhtar et al. (2009). Five replicates per treatment were used.
2.5.2. Elemental analysis
The instrument used for carbon and nitrogen concentrations was a Flash EA 1212
Elemental Analyzer (France). About 1 mg (0.8 - 1.2 mg) of the sample in a capsule made of
silver (assay of C and N) was burned at 920-1000°C. The quantity of each element is
expressed in percent mass. Each determination was performed in duplicate. The instrument
was calibrated with aspartic acid standard.
96

Résultats et discussion. Chapitre 3: Evaluation des facteurs de croissance
2.5.3. 13 C-nuclear magnetic resonance ( 13 C-NMR) analysis
Freeze-dried samples were used directly in NMR experiments without special
preparation. Owing to their size, the samples were gently ground (IKA Labortechnik,
Germany) in order to fill the rotor. Solid-state 13 C CPMAS NMR spectra were obtained on a
Bruker Avance-400 MHz spectrometer (Bruker, Bremen, Germany) operating at a 13 C
resonance frequency of 100.7 MHz. Samples were placed in a 7-mm zirconium rotor and spun
at the magic-angle at 6 kHz. All measurements were made at room temperature. The 13 C
chemical shifts were referred to tetramethylsilane and calibrated with the glycine carbonyl
signal, set at 172.5 ppm. Deconvolution of the NMR spectra was performed using the DmFit
software (Massiot et al., 2002). This software adjusts the spectra to obtain the line width and
the peak positions (in ppm) and to integrate each peak so as to obtain the percentage of each
contribution. The deconvolution and determination of different measurements were performed
as reported previously.
3. Results
3.1. Physico-chemical characterisation of substrates
The physical and chemical characteristics of the three substrates are presented in Table
5. The pH of all the three substrates was between 5.45 and 4.9 for OTL and OMW
respectively. While nitrogen content was the same for all substrates (0.82±0.1 %), the C/N
ratio was different for all substrate and OTL presented the lowest value (54.07±2.12) followed
by OC and OMW (60.11± 3.24 and 63.2±0.65 respectively). Statistical analysis (P=0.05)
showed no significant difference in carbohydrate and lignin content were observed for OMW
and OC but significant difference for OTL which presented the highest carbohydrate content
(68.64±2.68 %) and lowest lignin content (16.87±1.86 %).
97

Résultats et discussion. Chapitre 3: Evaluation des facteurs de croissance
Table 5. Chemical composition of olive twigs and leaves (OTL), olive cake (OC) and
olive mill wastewater (OMW) used as substrate in different culture media for L.edodes
growth.
Physicochemical
properties
Substrate
OTL OC OMW (dry matter)
Moisture content (%) 10.0±0.41 10±0.35 90±1.2
pH 5.45±0.15 5.1±0.2 4.9±0.4
C (%) 42.72±2.01 51.12±0.18 41.6±1.5
N (%) 0.81±0.15 0.85±0.09 0.8±0.01
C/N 54.07±2.12 60.11± 3.24 63.2±0.65
Carbohydrate (%) 68.64±2.68 53.00±2.32 49.72±1.62
Lignin (%) 16.87±1.86 25.81±1.31 22.25±3.65
Carbohydrate:lignin ratio 4.07±0.02 2.05±0.01 2.23±0.35
Fat (%) - 10±1.20 10±2.21
3.2. Formulation of solid olive substrate
Lentinula edodes strains Le119, selected from previous screening experiments in
respect to their efficacy in decolorizing OMW (Lakhtar et al., 2009), was initially grown on
PDA supplemented with 10% of OMW. The effect of various olive substrate mixtures on
mycelial biomass of L. edodes Le119 strain is shown in Table 6. Treatments two and three,
containing a mixture of OTL and OC, had mycelial biomass of 16.24 and 14.58 mg.g -1 of
substrate dry weight (dw), respectively. The treatment containing OTL wetted with OMW
were considered group d containing the lowest mycelial yield (5.98 mg.g -1 of substrate dw).
The best formulation of SOS contains OTL (20 %), OC (30 %) and OMW (50 %). This
mixture will used to follow this work.
Table 6. Mycelial Biomass of L. edodes (Le119 strain) on different mixtures of substrate.
Trt. No Ingredient Mycelial biomass
OTL (%) Olive cake (%) OMW (%) (mg.g -1 )*
1 0 50 50 9.91 c**
2 20 30 50 16.24 a
3 30 20 50 14.58 b
4 50 0 50 5,98 d
* Biomass produced after 1 month of incubation.
** Means followed by the different letter are significantly different (P= 0.05 after LSD).
98

3.3. Screening design
Résultats et discussion. Chapitre 3: Evaluation des facteurs de croissance
Sixteen experiments have been carried out according to the preparation method
described above and the conditions fixed by the experimental design. Although the main
purpose was to achieve the maximization of mycelial biomass production and the
maximization of total phenol removal. The obtained values related to the mycelia biomass
(mg of mycelium/g of substrate) and total phenol removal (%) are as shown in Table7.
Table 7. Experimental conditions of the screening design with 6 factors (A-F) and the
corresponding experimental responses.
Run
no
A B C D E F Biomass
Yield (mg.g -1 )
Total phenol
removal (%)
1 5 20 25 20 T2 SO 48.72 82.35
2 6 30 10 10 T1 SO 20.30 41.28
3 5 20 25 20 T1 MS1 34.50 61.65
4 6 30 10 10 T2 MS1 16.24 42.00
5 5 20 10 10 T2 MS3 12.18 24.12
6 6 30 25 20 T1 MS3 33.50 51.91
7 5 20 10 10 T1 MS2 29.44 36.23
8 6 30 25 20 T2 MS2 38.56 63.75
9 5 30 25 10 T2 MS4 12.18 15.48
10 6 20 10 20 T1 MS4 22.32 29.49
11 5 30 25 10 T1 MS3 14.20 31.51
12 6 20 10 20 T2 MS3 28.42 47.20
13 5 30 10 20 T2 MS1 34.50 45.45
14 6 20 25 10 T1 MS1 18.26 40.71
15 5 30 10 20 T1 SO 44.66 82.68
16 6 20 25 10 T2 SO 30.44 47.98
3.4. Variable effects on mycelial biomass response
Coefficient values (the weight associated to each factor level) and statistical analyses,
using t-test are reported in Table 8a. These results are illustrated by the two histograms shown
in Fig.1. Fig. 1a represents the weight of each factor taking its highest level as reference. Fig.
1b represents the differential effects of each factor when considering two different levels
taken two by two (Mathieu and Phan-Than-Luu 1997; Lewis et al., 1999).
99

Résultats et discussion. Chapitre 3: Evaluation des facteurs de croissance
From Figure 1 and Table 8a was observed that the significant parameter effects were
mineral solution (F) and inoculum size (D), while the rest of the parameters had no significant
effects. Figure 1a showed that inoculum size exhibited significant positive effects on the
response: the increase of these variables resulted in the increase of mycelial biomass which
was correlated to the total phenol removal. The mineral solution, on the other hand, exhibited
a negative effect on the response. Finally, the use of OMW without supplements showed an
interesting positive effect on the mycelial biomass (Fig. 1a).
3.5. Variable effects on total phenol removal response
Coefficient values and related statistical analyses are reported in Table 8b. These results
are illustrated by the two histograms shown in Figure 2. The significant parameter effects
were found, at all levels studied, as mineral solution (F) and inoculum size (D). Initial pH of
substrate, inoculum age, particle size and aeration seemed to have no significant effects. The
results showed a correlation between the parameters effecting the mycelial biomass and total
phenol removal.
3.6. Substrate composition
Measurements of pH and of different experiments after the colonization process by
L. edodes Le119 were different. A steady decrease of pH in all media without supplement
tested was observed; the initial pH values (5.0–6.0) fell at the end of incubation to 4.39 and
4.66 for experiment 1 and 16 respectively. The initial pH of substrates affected slightly the
final pH after the colonization. On the other hand, the supplemented media showed an
increase of pH after incubation (from 5 to 5.6 for experiment 9).
100

Résultats et discussion. Chapitre 3: Evaluation des facteurs de croissance
Table 8. Estimates and statistics on the coefficients response for each factor.
Factor Coefficient F.Inflation Standard texp. Significance
Name
deviation
(% )
(a)Mycelial Biomass response
Cst 5.31 3.31 1.60 12.3
A1 2.87 1.00 1.83 1.57 13.2
B1 1.37 1.00 1.83 0.75 46.2
C1 2.62 1.00 1.83 1.43 16.7
D1 16.12 1.00 1.83 8.78 < 0.01 ***
E1 0.37 1.00 1.83 0.20 84.0
F1 18.50 2.25 3.18 5.81 < 0.01 ***
F2 8.50 2.25 3.18 2.67 1.93*
F3 4.75 2.25 3.18 1.49 15.0
F4 17.00 1.75 3.67 4.63 0.0130
(b) total phenol removal response
Cst 8,31 3.529 1.57 13.6
A1 3,37 1.00 1.957 1.15 26.8
B1 -1,52 1.00 1.957 -0.52 61.2
C1 4,26 1.00 1.957 1.45 16.6
D1 24,25 1.00 1.957 8.26 < 0.01 ***
E1 -2,48 1.00 1.957 -0.85 41.0
F1 38,66 2.25 3.390 7.60 < 0.01 ***
F2 25,21 2.25 3.390 4.96 0.0143 ***
F3 16,44 2.25 3.390 3.23 0.521 **
F4 28,74 1.75 3.915 4.90 0.0162 ***
101

Résultats et discussion. Chapitre 3: Evaluation des facteurs de croissance
Figure 1. Graphical study of the effects of the factors A-F on the mycelial biomass response,
(a) Graphical study of the total effects, (b) Differences of the weights of the different levels.
102

Résultats et discussion. Chapitre 3: Evaluation des facteurs de croissance
Figure 2. Graphical study of the effects of the factors A-F on total phenol removal, (a)
Graphical study of the total effects, (b) Differences of the weights of the different levels.
4. Discussion
The present study was aimed at the screening 6 factors of L. edodes growth on OTL
and OC supplemented with OMW. A pure culture of L. edodes, which was previously
selected for its capability to remove phenolic compounds from OMW (Lakhtar et al., 2009),
was employed to both convert the substrate into mycelial biomass and remediate the
phytotoxic effects of OMW through the growth of L. edodes mycelium.
Mycelial biomass revealed that the substrate formulation exercised a considerable
influence on the mycelium production and therefore on morphologic aspect of mycelium. The
fact that the treatment 1, 2 and 4 (9.91, 16.24 and 5.98 mg.g-1 respectively) supported
different yield biomass indicates that mycelium growth is related to the composition and
structure of the substrate. The use of OTL supplemented with 50% OMW was limited for the
bioavailability of carbohydrate which was reported as an important factor at the beginning of
103

Résultats et discussion. Chapitre 3: Evaluation des facteurs de croissance
cultivation. Moyson and Verachtert (1991) have demonstrated that the growth of L.edodes is
initially associated to hemicellulose content of substrate, since hemicellulose and other water-
soluble sugars are mainly utilized during the active growth phase, prior to the breakdown of
lignin and cellulose. On the other hand, the use of OC supplemented with OMW caused in the
oxygen (O2) depletion could be the cause which reduces mycelial biomass development in
substrates (Ohga, 1990). Small air spaces present in OC supplemented may slow gas
exchange from deep within the interior of the substrate to the surface (Royse and Sanchez-
Vazquez 2001).
In many cases, different factorial designs were used in the literature for assessing the
effect of environmental factor on biological responses (Ranz and Lankmayr 2006; Swalley et
al., 2006; Purama and Goyal 2008). The factorial design and statistical analysis were
performed with NemrodW software (Mathieu and Phan-Tan-Luu, 2000). The combination of
moisture content, which was maintained at 50% (v/v) with the incubation of substrate in oven
for two days without forced aeration, allowed preventing any contamination of L. edodes
culture with filamentous fungi which are known as major antagonistic agent in mushroom
culturing (Savoie and Mata, 1999; Terashima et al., 2002; Kalmis and Sargin 2004). The
supply of culture with humidified air allowed gradual increase of the substrate moisture
contentand keeping the substrate with suitable moisture content.
The influence of the composition of the substrate on mushroom production characters
has been emphasized in recent studies (Philippoussis et al., 2001; Sunchez and Royse 2001;
Philippoussis et al., 2003). In the framework of the present study, the nutriment added to the
substrate and the spawn size were the main parameter that affected the growth of L. edodes.
This can be attributed to the nitrogen content, imported with addition of the mineral solution,
which exercised a negative effect on mycelial growth. Indeed, Nitrogen has been recognized
as a growth limiting factor for the L. edodes cultivation (Boyle 1998; Kalberer 2000), while
recently a positive correlation of mycelial growth to low C/N ratio values of substrates used
for the cultivation has been demonstrated as well (Philippoussis et al., 2003; 2007). However,
in L. edodes cultivation on synthetic composite media (OTL + OC + OMW), supplementary
nutritive solution should not be used. Otherwise, when the nutritive solution was added, we
observed that the risk of contamination of the growth media was increased considerably.
Similar findings were reported by Schunemann (1988).
The data obtained on polyphenol removal from the substrate by the culture of
L. edodes, showed that there was a negative effect of mineral solution added to initial
104

Résultats et discussion. Chapitre 3: Evaluation des facteurs de croissance
substrate on polyphenol removal. These results are in accordance with previous findings
demonstrating that high content of N had a negative effect of the degradation of procyanidins
by Aspergillus fumigatus (Contreras-Dominguez, 2006). Our results, demonstrating decrease
of pH in the substrate without supplement after the incubation period, are comparable to those
obtained on oak-wood sawdust substrates (Philippoussis et al., 2003), and they confirm
previous observations stating that a low pH value of the substrate is probably a prerequisite
for primordia formation (Kalberer 1995).
Spawn inoculation size was found an important factor that affects the mycelial growth.
Compared to the straw, spawn is a relatively expensive item. Using the lowest inoculation
size possible without sacrificing the mushroom yield would give the best economics. The
spawn size is defined as the weight ratio of spawn to substrate on a fresh weight basis. The
optimum spawn size depends on the type of substrate, mushroom species, spawn quality, and
the cultivation conditions. Among the two spawn size (10 and 20%) tested, the 10% spawn
size resulted in significantly lower mycelial biomass than the other size. The mycelial
biomass at the 10% size was 37.5% lower than at the 20% size for the substrate without
supplement. The mycelial growth at the 10% size showed contamination by green and black
moulds during cultivation of the L.edodes Le119 strain. Therefore, based on these results, it
would be recommended that at least 10% spawn level be used to achieve a colonization of the
substrate by L. edodes without any mould contamination.
5. Conclusion
The growth of L. edodes Le119 on SOS using different mixture allowed us to
determine the optimal formulation which was OTL (20%) + OC (30%) + OMW (50%)
allowing mycelial biomass production of 16,24 mg.g -1 of substrate dry weight. The nutriments
added to the substrate which negative effect and spawn size which positive effect were the
main parameter that affected the growth of L. edodes Le119 on optimal SOS. Thus, the
optimal condition of growth of L. edodes Le119 on SOS are the following; SOS composition
(20% of OTL, 30% of OC and 50% of OMW), initial pH of 5, temperature of incubation
25°C, aeration flow 20 mL.min -1 , inoculum age of 10 days, inoculum size 10%, 70% of
particle size between 2 and 0.8 mm mixed with 30% of particle size less than 0.8 mm and
with addition of nutrients.
105

Résultats et discussion. Chapitre 4: Transformation de la matière organique
Chapitre IV
Transformation de la matière organique et détoxification des
substrats oléicoles solides par la culture de Lentinula edodes par
fermentation en milieu solide
Dans le chapitre précédent, nous avons évalué l’influence de six facteurs de croissance
de L. edodes Le119 sur le SOS en fermentation en milieu solide. Les résultats ont montré que
l’ajout de la solution minérale en concentration élevée limite la croissance, tandis que le taux
d’inoculum exerce un effet positif sur la croissance. Pour étudier la cinétique de croissance de
L. edodes Le119 sur le SOS, on a choisi les conditions optimales de croissance qui sont les
suivantes : pH initial 5, température d’incubation 25°C, débit d’aération 20 mL.min -1 , âge
d’inoculum 10 jours, taille d’inoculum 10%, particules avec une taille entre 2 et 0,8 mm à
raison de 70% et des particules avec une taille inferieure de 0,8 à raison de 30% , sans
addition de la solution minérale et l’humidité du substrat a été ajustée à 50% avec les
margines.
Dans la littérature, de nombreuses études ont été menées sur la physiologie de
croissance des champignons filamenteux en fermentation en milieu solide (Raimbault, 1980 ;
Roussos, 1985 ; Brand, 2006 ; Hassouni, 2007), tandis que l’information sur la physiologie
des basidiomycètes de pourriture blanche est peu nombreuse et en particulier celle de
L. edodes cultivée sur des substrats oléicoles reste toujours rare (D’Annibale et al., 2004,
Tomati et al., 2004). Par conséquent, il est apparu intéressant de mettre l’accent sur la
physiologie de croissance et la respirométrie de L. edodes sur le SOS qui regroupe l’ensemble
des substrats oléicoles: bois de taille, grignons d’olive et margines.
106

Résultats et discussion. Chapitre 4: Transformation de la matière organique
Dans ce nouveau chapitre sont donc présentés les résultats de l’étude de l’évolution
des paramètres physico-chimiques et biologiques au cours de la croissance de L. edodes
Le119 sur le SOS en fermentation en milieu solide. Il fait état des relations établies entre des
paramètres classiques tels que biomasse mycélienne, sucres réducteurs, phénols totaux, teneur
en carbone, teneur en azote, rapport C/N, les activités enzymatiques telles que l’activité
cellulase, laccase, Mn-peroxydase, Lignine peroxydase, lipase et les caractéristiques du SOS
fermenté déterminés par spectroscopie UV-visible et Résonance Magnétique Nucléaire 13 C du
solide.
107

1. Introduction
Résultats et discussion. Chapitre 4: Transformation de la matière organique
L’oléiculture représente une des plus anciennes activités agricoles dans le bassin
méditerranéen. Toutefois, elle présente l’inconvénient de générer d’énormes quantités de
déchets liquides dont la fraction organique complexe leur confère un pouvoir fortement
polluant (Fiorentino et al., 2003). A côté des margines, l’industrie oléicole produit deux co-
produits solides, les grignons d’olive et le bois de taille.
Nombreuses études ont été menées en vue de trouver des solutions pour le traitement
des déchets oléicoles, en particulier la réduction de la charge phénolique des margines par la
culture de champignons. Les perspectives de ces études ont mis l’accent sur la valorisation
des déchets de l’oléiculture par la culture des basidiomycètes en fermentation en milieu solide
(FMS). Les basidiomycètes de pourriture blanche, en particulier Lentinula edodes (Berk.)
Pegler, sont capables de se développer en présence de la lignine, et leur développement est
associé à la production des enzymes phénoloxydases non spécifiques. Pour cette raison, les
basidiomycètes ont été considérés comme de bons candidats pour permettre à la fois une
valorisation des substrats oléicoles lignocellulosiques et à la réduction des polyphénols des
margines (Zervakis et al., 1996, Kalmis et Sargin, 2009).
L’objectif de l’étude est d’évaluer la transformation de la composition chimique et la
réduction en polyphénols du mélange de substrats oléicoles solide (SOS) constitués de bois de
taille, grignons d’olive et margines durant la croissance du mycélium de L. edodes Le119.
Une attention particulière a été consacrée à l’évaluation de la production de CO2 durant la
croissance mycélienne de la souche Le119 au changement de l'abondance relative des
fractions de carbone, à la fois simples et complexes analysés par la technique de la CPMAS
RMN 13 C soutenue par les analyses de routine, pour relier l’activité métabolique du
champignon à la transformation des résidus oléicoles .
2. Matériel et méthodes
2.1. Origine des substrats
Les margines d’olive, ainsi que les grignons d’olive, ont été prélevés dans une unité de
trituration des olives avec le procédé triphasique fonctionnant avec le système de presse. Les
standards phénoliques ont été achetés auprès d’Extrasynthèse (France). Tous les solvants
utilisés pour l’extraction étaient de qualité HPLC (Sigma, France).
108

Résultats et discussion. Chapitre 4: Transformation de la matière organique
2.2. Microorganisme et préparation du spawn
Une souche de L. edodes Le119 a été préalablement sélectionnée pour sa capacité de
dégradation des polyphénols des margines (Lakhtar et al., 2009). La souche a été
régulièrement repiquée sur un milieu PDA contenant 10% des margines. Le blanc spawn a été
préparé sur les gains de blé contenant 10% de margines (Chapitre 3). La préparation du spawn
a été effectuée dans les colonnes de Raimbault et l’incubation a été faite à 25°C pendant 10
jours.
2.3. Préparation des substrats SOS
Le substrat a été préparé de la même façon précitée (Chapitre 4). Les grignons d’olive ont été
homogénéisés mécaniquement, à l’aide d’un mixeur, tandis que le bois de taille a été broyé et
tamisé à une taille de particule comprise entre 2 mm et 0,8 mm. Les particules ayant avec une
taille inférieure à 0,8 mm ont aussi été utilisées dans la composition du substrat représentant
30% du poids total du bois de taille. Les substrats ont été mélangés avec les margines et
chauffés pour assurer l’absorption totale de margines. Le mélange (SOS) a été stérilisé à
121°C pendant 30 min.
2.4. Inoculation sur mélange composite pour L. edodes
L’inoculation a été faite à raison de 10% (poids humide : poids humide), et le remplissage des
colonnes a été fait en alternant des couches de substrat et de spawn, pour assurer une
croissance homogène du mycélium. Les colonnes ont été incubées dans l’étuve sans aération
forcée à 25°C pendant 2 jours. Elles ont été, par la suite, placées dans le dispositif de la FMS
pour une durée d’incubation d’un mois. Deux colonnes témoins non inoculées ont été
préparées et incubées dans les mêmes conditions.
2.5. Montage du système de FMS
Les colonnes ont été placées dans un bac rempli d’eau maintenue à 25°C ; l’air traversant le
substrat a été humidifié 3 fois pour arriver à une humidité saturante de l’air. Le débit d’air a
été réglé avec des microvannes et régulièrement ajusté à 20 mL.min -1 . La Figure 4 montre le
fonctionnement du système. La fermentation a été suivie pendant 30 jours.
109

Résultats et discussion. Chapitre 4: Transformation de la matière organique
Figure 1. Dispositif de FMS connecté au Système de Respirométrie PNEO.
2.6. Analyse des échantillons
L’activité respiratoire a été mesurée trois fois par jour à l’aide du PNEO, qui permet de
mesurer à la fois quatre paramètres ; le débit d’aération, l’humidité de l’air, la température de
l’air et la teneur de l’air en CO2 à la sortie de la colonne. La biomasse fongique a été estimée
par la quantification de l’ergostérol (Chapitre 3). Les sucres réducteurs ont été analysés par la
méthode de Miller (1959) en utilisant le réactif de DNS et les sucres totaux ont été déterminés
par la méthode de DuBois et al. (2002) en utilisant l’anthrone. La fraction lipidique a été
extraite dans l’hexane à l’aide de l’appareil de Soxhlet (Cordova et al., 1998). L’extraction de
la fraction phénolique a été réalisée dans une solution eau-méthanol (40-60); à un gramme du
substrat fermenté lyophilisé et finement broyé, on a ajouté 10 mL de la solution organique. Le
mélange a été homogénéisé et incubé pendant 1h à 4°C. L’extraction a été répétée trois fois.
La quantification des phénols totaux a été faite suivant la méthode de Folin Ciocalteu
(Bärlochar et Garça, 2005) en utilisant l’acide cafféique comme standard (250 µg.mL -1 ).
Selon Chin et al., (1994), l’absorbance à 280 nm est une mesure approximative du degré
d’aromaticité des matières organiques dissoutes.
110

Résultats et discussion. Chapitre 4: Transformation de la matière organique
2.7. Analyses chromatographiques
L’extraction des monomères a été effectuée en deux étapes. La première étape consiste à
l’extraction de la fraction phénolique par une solution eau-méthanol (40-60). La deuxième
étape consiste en la purification des monomères phénoliques par l’extraction avec l’acétate
d’éthyle suivant la méthode modifiée de De Marco et al. (2007). L’analyse des monomères a
été réalisée par l’HPLC suivant la méthode modifiée de De Marco (2007). La plateforme
HPLC est composée d’un dégazeur (1200 Series Degasser, Agilent technologies), d’une
pompe quaternaire (1200 Series Quaternary Pump, Agilent technologies), d’un
échantillonneur liquide automatique ou passeur (1200 Series Automatic Liquid Sampler,
Agilent technologies) et d’un détecteur à barrette de diodes (1200 Series Diode-Array
Detector, Agilent technologies). La séparation des composés a été opérée sur la colonne
Atlantis d18 (5µm, 4,6 x 250 mm) Waters gardée à une température constante (température
ambiante de 23±2°C). La détection des composés a été effectuée à 280 nm. Les pics ont été
identifiés par comparaison avec les standards.
2.8. Activités enzymatiques
2.8.1. Extraction d’enzymes
L’extraction des enzymes a été effectuée sur 3 g du substrat fermenté frais, décongelé,
mélangé avec 10 mL de tampon acétate (0,1M, pH 5,0) contenant 5 mM de CaCl2, 0,05% du
Tween 80 et 3% du polyvinylpolypyrrolidone insoluble (PVPP) (Sampedro et al., 2007). Le
mélange a été incubé à la température ambiante pendant 1h et l’extrait aqueux a été récupéré
par centrifugation (4500 rpm pendant 10 min) suivie d’une filtration sur papier Watman N°2.
2.8.2. Activité enzymatique
L’activité endoglucanase (cellulase, EC 3.2.1.4) a été déterminée selon la méthode de
Mandels et al. (1976). L’activité enzymatique est exprimée en unité par g du substrat poids
sec (SPS) (1U= 1 µmole de sucres réducteurs libérés par min). L’activité lipase a été
déterminée suivant la technique rapportée par Goujard et al. (2009), en utilisant le p- laurate
de nitrophényl comme substrat. L’activité tannase a été mesurée suivant la technique de
Sharma et al. (2000). Les activités de Mn peroxydase, lignine peroxydase et laccase ont été
mesurées suivant la technique rapportée par Lakhtar et al. (2009). La technique décrite par
Santos et Linardi (2004) a été utilisée pour la détermination des activités catéchol-1,2-
dioxygénase et protocatéchuate-3,4-dioxygénase. L’activité est exprimée en unité par g SPS
(1U= 1 µmole de produit formé par min).
111

Résultats et discussion. Chapitre 4: Transformation de la matière organique
2.9. Analyses élémentaires : C et N
Les teneurs en C et N, dans les échantillons de culture de L. edodes, ont été déterminées à
l’aide d’un analyseur élémentaire CHN (Flash EA 1212 Elemental Analyzer, France).
L’analyseur CHN a été calibré avec l’acide aspartique à différentes concentrations.
2.10. Résonance Magnétique Nucléaire 13 C du solide (13 CP/MAS RMN)
Les spectres haute résolution ont été réalisés sur le spectromètre Bruker DSX 400 kHz
du Spectropole (Université Paul Cézanne). Les spectres 13 C CP/MAS ont été enregistrés à la
fréquence de 100,7 MHz avec découplage du proton. Environ 300 mg de l’échantillon ont été
placés dans une sonde de 7 mm inclinée à l’angle magique (angle de 54,7° par rapport au
champ magnétique statique) tournant à 6 kHz. Les paramètres d’acquisition utilisés pour un
enregistrement optimal sont une impulsion de 90° pour le proton de durée 2,8 µs, un délai de
répétition de 3 s, un nombre d’acquisition de 2000, et enfin un temps de contact de 2 ms. La
déconvolution des spectres a été effectuée grâce au logiciel DmFit (Massiot et al., 2002).
3. Résultats et discussions
3.1. Croissance de L. edodes sur SOS
Le remplissage des colonnes de Raimbault avec le substrat SOS prétraité a été alterné
avec l’ajout du spawn, qui permet un envahissement homogène et uniforme du substrat par le
mycélium. L’incubation des colonnes pendant deux jours dans l’étuve à 25°C nous a permis
d’éviter les contaminations par les moisissures. Après deux jours d’incubation, on a remarqué
que tous les grains du spawn inoculés ont démarré par le développement du mycélium.
L’envahissement total du substrat a été remarqué après 24 jours d’incubation. Par ailleurs,
aucune contamination n’a été observée sur les deux colonnes témoins non inoculées.
3.2. Analyses des effluents gazeux par PNEO
A la sortie des colonnes de Raimbault , les effluents gazeux ont été collectés afin de
suivre l’évolution de quatre paramètres (débit d’air, humidité relative, température et la
production de CO2) en fonction du temps (Fig. 1). L’humidité relative et la température de
l’air à la sortie des colonnes fluctuent entre deux valeurs (50 et 58 %) pour la l’humidité et
(23 et 27°C) pour la température de l’air. Avant la mesure de CO2 à la sortie de la colonne, le
débit de l’air traversant la colonne, a été ajusté à 20 mL/min.
112

Humidité
(%)
Température
(°C)
Résultats et discussion. Chapitre 4: Transformation de la matière organique
Figure 2. Evolution de trois paramètres; ( ) CO2 produit, ( ) température de l’air, ( )
humidité relative de l’air, au cours de 30 jours de culture de L. edodes sur SOS à 25°C.
Sur la figure 2, on remarque que l’évolution de CO2 suit quatre étapes alternées. Tout
d’abord, durant les 6 premiers jours d’incubation sur le dispositif FMS, une augmentation
continue de CO2 a été remarquée passant de 0 à 0,23%. Entre le 6 ème et 8 ème jour d’incubation,
on observe un premier plateau de stabilisation situé à 0,23% de CO2 produit. Par contre, entre
le 8 ème et le 14 ème jour d’incubation, une augmentation importante de la respiration du
mycélium de Le119 a été remarquée allant de 0,23 à 0,7. Un deuxième plateau de stabilisation
de CO2 a été observé entre le 14 ème et 16 ème jour de FMS. Enfin, à partir du 23 ème jour de FMS
la respiration a été maximum et constante pendant une semaine avec un taux élevé de CO2
produit (1,18%)
Temps (jour)
3.3. Evolution de la biomasse de L. edodes sur SOS
L’estimation de la biomasse a été déterminée indirectement par la quantification de
l’ergostérol contenu dans le substrat fermenté par L. edodes Le119. Le coefficient de
conversion de l’ergostérol en biomasse de L. edodes a été évalué à 3,57 mg d’ergostérol pour
1 g de biomasse pure (Chapitre 3). L’évolution de la biomasse au cours de la FMS (Fig.3) suit
relativement l’allure de production de CO2 mesuré dans les effluents gazeux (Fig.2).
CO2 (%)
113

Biomasse (mg.g -1 SPS)
Résultats et discussion. Chapitre 4: Transformation de la matière organique
Figure 3. Evolution de la biomasse de la souche Le119 produite au cours de 30 jours
d’incubation sur SOS à 25°C.
L’évolution de la biomasse au cours de la FMS passe par trois phases de croissance
rapide alternant avec deux phases de croissance relativement lente. La biomasse évolue de
2.47 à 5 mg/g SPS du SOS pendant les 6 premiers jours d’incubation. Ensuite entre le 6 ème et
le 12 ème jour d’incubation, une augmentation importante de la biomasse produite a été
remarquée, allant de 5 à 11,4 mg.g -1 SPS du SOS. Par contre entre le 12 et 18 ème jour
d’incubation, la biomasse passe de 11,4 à 14,5 mg.g -1 SPS. Cette évolution de biomasse
correspond au deuxième plateau de CO2 produit durant le développement du mycélium
(Fig.2). Entre 18 et 24 jours d’incubation, une augmentation importante a été de nouveau
observée, allant de 14,5 à 20,5 mg.g -1 SPS du SOS. Cette augmentation correspond également
à l’augmentation de CO2 observée dans la Figure 2. Enfin, un plateau de biomasse a été
obtenu à partir de 24 jours de FMS pour arriver à une biomasse de 21,61 mg.g -1 après 30 jours
d’incubation. Après un mois d’incubation, la biomasse estimée dans notre étude dépasse 2,5
fois la biomasse du Pleurotus ostreatus produite sur les coques de café avec le même taux
d’inoculation (10%) (Sobal, 2002).
Temps (jour)
114

Résultats et discussion. Chapitre 4: Transformation de la matière organique
3.4. Evolution des sucres réducteurs, sucres totaux, pH du substrat fermenté
L’évolution de sucres réducteurs, des sucres totaux et du pH du substrat inoculé avec la
souche Le119 de L. edodes est présentée dans la Figure 4.
Sucres mg.g -1 SPS
Figure 4. Evolution des sucres réducteurs ( ), sucres totaux ( ) et du pH ( ) du substrat
fermenté au cours de 30 jours de culture de L. edodes Le119 sur SOS à 25°C.
On remarque une diminution de la teneur en sucres réducteurs et totaux dans le milieu
après 12 jours d’incubation, suivie d’une augmentation graduelle pour arriver à 108 et 120
mg.g -1 SPS du SOS respectivement. Accompagné de cette évolution, on remarque que les
valeurs du pH du substrat fermenté restent très stables tout au long de la FMS de la souche de
L. edodes sur SOS et fluctuent de 4,5 à 5.
3.5. Evolution des phénols totaux
Les phénols totaux ont été déterminés par la méthode standard de Folin Ciocalteu pour
pouvoir comparer nos résultats à ceux de la littérature. Selon Chin et al., (1994), l’absorbance
à 280 nm est une mesure approximative du degré d’aromaticité des matières organiques
dissoutes.
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
0 5 10 15 20 25
0
30
Temps (jour)
5
4
3
2
1
pH
115

mg.g -1 SPS du substrat fermenté
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Résultats et discussion. Chapitre 4: Transformation de la matière organique
0 6 12 18 24 30
Temps (jour)
Figure 5. Evolution de la décoloration de l’extrait phénolique ( ) et des phénols totaux ( ) du
substrat fermenté au cours de 30 jours de culture de L. edodes Le119 sur SOS à 25°C.
Au cours de la culture de L. edodes Le119 sur SOS en FMS pendant 30 jours, une
forte corrélation entre la dégradation des phénols et la décoloration du substrat a été observée.
Le développement du champignon a permis une dégradation de 80% des phénols totaux et
85% de décoloration du substrat (Fig. 5). Les spectres UV-vis des extraits d’échantillons
prélevés durant la croissance du champignon sont présentés dans la Figure 6. Les résultats
confirment ceux obtenus à partir de la décoloration et montrent l’apparition de molécules
absorbant aux alentours de 500 nm. Ces molécules peuvent être responsables de
l’augmentation légère des phénols totaux observée après 24 jours d’incubation. Sampedro et
al. (2007) ont mesuré de semblables chutes de teneurs en phénol totaux des grignons humides,
issues du système de trituration à deux phases, par la culture de Paecilomyces farinosus après
20 semaines d’incubation. Selon Aloui et al. (2007), l’ajout de la bagasse de canne de sucre
aux grignons humides favorise la dégradation des phénols totaux. En effet une réduction des
phénols totaux de 60% a été observée après l’ajout de 30% de la bagasse de canne à sucre
pour la culture de Phanerochaete chrysosporium après 6 jours d’incubation.
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Absorbance à 280 nm
116

Résultats et discussion. Chapitre 4: Transformation de la matière organique
Figure 6 : Spectres UV-visible de la fraction phénolique extraite des échantillons du substrat
fermenté au cours de 30 jours de culture de la souche Le119 sur SOS à 25°C.
3.6. Les monomères phénoliques
La disparition des monomères phénoliques, extraits du SOS fermenté par L. edodes
Le119, est présentée dans le Tableau 1.
Tableau 1. Concentration des monomères phénoliques (µmole.g -1 SPS du SOS) durant la
culture de L. edodes pendant 1 mois d’incubation à 25°C.
Temps Oleuropéine Hydroxy- Acide Tyrosol Acide trans- acide p-
(jours)
Absorbance
tyrosol
caféique
cinnamique
coumarique
0 6,54 4,32 3,22 2,32 2,32 4,51
6 4,21 2,35 3,21 2,12 2,23 3,54
12 3,21 3,21 3,15 1,63 2,35 4,16
18 2,54 2,32 2,36 1,33 2,16 5,54
24 1,02 0,32 1,06 1,03 2,03 3,21
30 0,95 0,32 1,01 0,03 1.97 3,32
Témoin 5.98 4.45 3.11 2.22 2.25 4.02
L’écart type a été estimé à 5%.
Longueur d’onde (nm)
Six monomères ont été identifiés dans l’extrait éthylique obtenu à partir du substrat
fermenté. Leur quantification, déterminée par HPLC, a montré que l’Oleuropéine est le
composé le plus abondant dans le SOS avant la fermentation (6,54 µmoles.g -1 SPS du SOS),
suivie par l’acide p-coumarique et l’hydroxytyrosol (4,51 et 4,32 µmoles.g -1 SPS du SOS
117

Résultats et discussion. Chapitre 4: Transformation de la matière organique
respectivement). Apres un mois de culture de la souche Le119, à l’exception de l’acide trans-
cinnamique qui présente une faible diminution de sa teneur (15 %), tous les composés
analysés ont subi une réduction de leur teneur avec des rendements variables (92 et 26 % de
réduction pour l’hydroxytyrosol et l’acide p-coumarique respectivement). Dans le SOS
témoin, non inoculé et incubé pendant 30 jours avec un débit d’aération de 20 mL.min -1 dans
les mêmes conditions que celles de la culture, on a remarqué une réduction partielle de tous
les composés analysés,. Leur réduction peut être expliquée par l’oxydation non enzymatique
qui pourrait être causée par le passage forcé de l’air dans le substrat durant son incubation
dans le dispositif de la FMS. El Hajjouji et al. (2008) ont reporté qu’une augmentation de
réduction des composés phénoliques est favorisée avec l’application d’une aération forcée sur
les margines.
3.7. Evolution de la composition élémentaire du substrat fermenté
L’évolution de cinq paramètres conventionnels (humidité du substrat, C, N, C/N, Perte
en matière) a été suivie à partir des prélèvements du substrat fermenté au cours de 30 jours
d’incubation à 25°C. Les résultats sont présentés dans le Tableau 2.
Tableau 2: Evolution de différents paramètres chimiques mesurés dans des échantillons du
substrat fermenté au cours de 30 jours de culture de L. edodes sur SOS à 25°C.
Temps
(jours)
C (%) N (%) C/N Humidité
(%)
Perte en
Matière (%)
0 48.52±1,3 0,95±0,10 51,07 44.30±0.49 -
6 46.17±0,7 0.95±0,06 48,60 45.14±2.61 1.87±0.67
12 43.89±1,4 0,96±0,04 45,72 45.94±1.14 4.99±1.01
18 42.89±1,7 1,09±0,07 39,35 46.47±0.92 6.73±1.80
24 41.32±1,2 1,31±0,08 31,54 48.39±0.37 9.48±1.59
30 40.32±0,6 1,52±0,10 26,53 46.41±1.07 12.18±1.39
Un test d’analyse de variance a été effectué pour l’ensemble des paramètres étudiés.
Les résultats montrent une différence significative entre les prélèvements (p= 0.05). Le
passage de l’air humidifié à travers les colonnes (volume utile de 200 mL) avec un débit de
20 mL.min -1 a permis de maintenir une humidité de 46±2 %. Les résultats des analyses
élémentaires, montrent que le carbone diminue en passant de 48.52 à 40,32 % pendant la
durée d’incubation, alors que l’azote présente une augmentation de 0.95 à 1.52% de la matière
118

Résultats et discussion. Chapitre 4: Transformation de la matière organique
sèche. La diminution de carbone est caractéristique de la dégradation des matières organiques.
En effet, de semblables profils de diminution de carbone ont été rapportés pour la dégradation
des matières organiques (Mena et al., 2003, Huang et al., 2004). Le ralentissement de la
diminution de la teneur en carbone peut être expliqué par la nature lignocellulosique du
substrat qui est dégradé beaucoup plus lentement. Par ailleurs, l’augmentation d’azote est due
à sa concentration engendrée par la dégradation des composés carbonés réduisant la masse
totale du substrat durant la culture. De ce fait, le rapport C/N diminue au cours de la culture
de 51,07 à 26.53. Cette diminution reflète le développement du champignon accompagné
d’une part avec un dégagement de CO2 et, d’autre part, la décomposition de la matière
organique, ainsi que l’enrichissement du substrat en matières azotées.
3.8. Caractérisation des échantillons du SOS par RMN
La caractérisation de la structure carbonée des prélèvements du substrat fermenté a été
effectuée par RMN dans le but d’approfondir la connaissance du changement de la matière
organique durant la croissance du champignon. Les spectres 13 C-RMN (CPMAS) de
l’évolution du SOS durant la croissance de L. edodes Le119 sont présentés dans la Figure 7.
0 jours 6 jours 12 jours 18 jours 24 jours 30 jours
Figure 7 : Spectres RMN solide du 13 C des échantillons du substrat fermenté au cours de 30
jours de culture de L. edodes sur SOS à 25°C.
La déconvolution des 6 spectres RMN du substrat fermenté, effectuée à l’aide du
logiciel DmFit (Massiot et al., 2002), a généré 21 pics correspondant à la distribution des
119

Résultats et discussion. Chapitre 4: Transformation de la matière organique
atomes de carbon dans les différentes structures chimiques. L’intégration de ces pics a permis
de calculer la contribution de chaque type de carbone. Les résonances exprimées en
déplacements chimiques (ppm) ont été assignées à des structures chimiques grâce à plusieurs
études sur la caractérisation des matières organiques (Ait Baddi et al., 2004; Albrecht et al.,
2008; Amir et al., 2004; Ait Baddi et al., 2003; El Hajjouji et al., 2008; Gilardi et al., 1995).
Ainsi, les déplacements chimiques de RMN sont attribués à des groupes chimiques : C-alkyle
(0-45 ppm), C-O-alkyle (45-110 ppm), C-aromatique (110-145 ppm), C-phénolique (145-165
ppm) et C-carbonyle & carboxyle (165-210 ppm). Les résultats sont présentés dans le
Tableau 3.
Tableau 3 : Valeurs des groupements carbonés à partir des intégrations des 21 spectres RMN
du substrat SOS fermenté avec L. edodes Le119, durant un mois d’incubation à 25°C.
Temps
(jour)
C Alkyle
0-45
C O-Alkyl
45-110
C Aromatique
110-145
CPhénolique
145-165
CCarbonyle & Carboxyle
165-210
0 15,67 65,09 8,68 2,22 8,31
6 15,55 64,95 8,89 1,77 8,82
12 17,75 61,96 8,48 1,95 9,83
18 16,89 62,54 8,44 2,06 10,05
24 16,08 63,41 8,34 2,33 9,82
30 16,32 62,94 8,29 2,18 10,25
Des différences significatives ont été calculées entre les prélèvements de culture pour
l’ensemble des groupements carbonés (p< 0,05). Cela signifie que touts les groupements ont
subi une transformation durant le développement de la souche de L. edodes Le119. En effet, à
l’exception du groupement CCarbonyle & Carboxyle qui présente une allure d’augmentation passant
de 8,31 à 10,25% (à l’état initial et après un mois d’incubation respectivement), tous les autres
groupements présentent de périodes d’augmentation et/ou de diminution alternées. Par
exemple, le groupement CPhénolique présente une phase de diminution passant de 2,23 à 1,7%
suivie par une phase d’augmentation allant de 1,77 à 2,33%.
L’examen de déconvolution des spectres montre que le changement du groupement
des CAlkyle est associé d’une part à la diminution des deux pics à 30 et 40 ppm assignés aux
CH2 des protéines et des lipides (Ait Baddi et al., 2004 ; Albreich et al., 2007) et, d’autre part,
à l’augmentation du pic 22 ppm correspondant au méthyl des groupement acétyl lié à la
dégradation de la fraction aromatique (Giraldi et al., 1997) et des hémicelluloses (Wikberg et
120

Résultats et discussion. Chapitre 4: Transformation de la matière organique
Maunu, 2004). La première phase de diminution des CAlkyle semble indiquer que le
champignon utilise, dans la première semaine de sa croissance, préférentiellement les
constituants les plus facilement métabolisables, tandis que la deuxième phase d’augmentation
semble être liée à la génération des produits de dégradation de la fraction aromatique. La
première phase est perçue à travers l’augmentation du taux des CAromatique, notamment
assignés à la lignine, alors que la deuxième phase, est perçue à travers la diminution du
groupement CAromatique. Par ailleurs, les CO-alkyle sont classiquement assignés aux
polysaccharides, car le signal combiné de la cellulose et des hémicelluloses écrase celui des
carbones aliphatiques de la lignine selon Haw et al. (1984) et Wikberg & Maunu (2004). Les
données des spectres, montrent la diminution de ce groupement qui se répercute sur
l’augmentation des sucres réducteurs passant de 68 à 108 mg/g SPS du SOS, du 12 ème au 30 ème
jour d’incubation de culture de la souche de L. edodes Le119.
Tableau 4 : Evolution au cours de culture de l’indice d’aromaticité, de l’estimation du contenu
en lignine, du rapport Syringyl sur Guaiacyl (S/G), du rapport 89/84 (ppm) et du degré de
cristallinité, et de l’estimation du contenu en hémicellulose calculés à partir des pics de RMN.
Temps Poly- Lignine Aromaticité Cristallinité S/G 89/84 C1
jours
saccharide
Hémicellulose
0 57,77 18,01 11,90 0,07 1,81 0,07 6,29
6 57,87 17,60 11,70 0,05 1,87 0,05 6,25
12 54,98 17,23 11,58 0,04 1,56 0,03 5,41
18 55,41 17,34 11,68 0,08 1,51 0,08 5,10
24 56,24 17,61 11,84 0,13 1,40 0,14 6,44
30 53,72 17,30 11,68 0,13 1,73 0,15 5,88
L’évolution de la cellulose et des hémicelluloses au cours du développement du
champignon a été déterminée en calculant le coefficient de cristallinité (Wikberg et Maunu,
2004) et l’intensité relative du pic 103 (Gilardi et al., 1995) respectivement. D’après les
résultats obtenus, on remarque que le mycélium est capable de dégrader simultanément des
hémicelluloses et de la cellulose au cours de sa croissance avec une attaque préférentielle de
la cellulose amorphe, ce qui a été confirmée par l’augmentation du degré de cristallinité. Nos
résultats sont en accord avec les résultats obtenus lors de la transformation du compostage des
boues de station d’épuration et des déchets verts par Albercht et al. (2008), qui ont montré une
augmentation de la cristallinité durant le procédé de co-compostage.
121

Résultats et discussion. Chapitre 4: Transformation de la matière organique
L’estimation de la lignine par le modèle de Giraldi et al. (1995) a permis de révéler la
tendance de la dégradation de la lignine par le mycélium. En effet, la dégradation passe par
deux étapes fondamentales: la première étape, entre le 6 ème et le 24 ème jour d’incubation,
consiste en la dégradation de la lignine riche en sous-unités syringyl, alors que la deuxième
étape, entre le 24 ème et 30 ème jour d’incubation, consiste en la dégradation de la lignine riche
en sous-unités guaiacyl avec des taux différents. Vane et al. (2006) ont rapporté de semblables
résultats et ceci pourrait être expliqué par une dégradation préférentielle des micro-
organismes des unités syringyl par rapport aux unités guaiacyl. En effet, Rio et al., (2001,
2002) ont suggéré que cette préférence de dégradation des unités syringyl est reliée à la
prédominance de liaisons éther en position C4 du cycle aromatique, alors que les unités
guaiacyl incluent une part de liaisons C-C en C5, (position libre i.e. sans groupement
méthoxyl), de laquelle résulte le fort degré de condensation et de résistance aux attaques
fongiques.
De même que la lignine, les groupements CPhenolique subissent des modifications
pendant le développement du mycélium de L. edodes. En effet, ces groupements diminuent de
2,22 à 1,77 après une semaine de croissance et augmentent pour arriver à une valeur 2,18
après un mois de croissance. Cette relative accumulation du groupement CPhenolic a été
reportée par Chen et al. (1989) pendant le compostage et cette accumulation a été attribuée à
la transformation de la lignine et à la polymérisation des monomères phénoliques (diminution
du facteur de l’aromaticité).
3.9. Activités enzymatiques
Les activités enzymatiques mesurées durant la croissance du champignon sur le SOS
sont présentées dans le Tableau 5. Parmi les activités enzymatiques impliquées dans la
décomposition de la matière organique, l’activité des cellulases a été mesurée. Il y a
apparition de cette activité après 6 jours d’incubation et elle atteint sa valeur maximale après
18 jours (1,13 U.g -1 SPS). L’activité lipase présente une augmentation au début de la culture
(de 0,01 à 0,02 U.g -1 SPS), et diminue après 18 jours de culture pour disparaître vers la fin de
l’incubation. Les activités peroxydases, Mn peroxydase et lignine peroxydase, présentent une
augmentation pour arriver à des valeurs maximales (0,231 et 0,321 UI.g -1 SPS du SOS après
18 et 24 jours d’incubation respectivement). Ensuite, les activités peroxydase diminuent.
122

Résultats et discussion. Chapitre 4: Transformation de la matière organique
Les activités laccases suivent relativement la même évolution avec une augmentation de
1,52 à 8,5 UI.g -1 SPS après 18 jours d’incubation, puis une diminution pour arriver à une
valeur de 4,63 UI.g -1 SPS. D’après les résultats, on a remarqué que l’activité laccase est
l’activité majeure parmi les activités enzymatiques impliquées dans la transformation des
polyphénols. A partir de l’ensemble des résultats, on a également remarqué que les activités
cellulases et les deux activités phénoloxydase présentent des tendances similaires avec une
augmentation au début de la culture pour atteindre un maximum, puis une diminution et une
stabilisation jusqu’à la fin de l’incubation. Cette tendance peut être expliquée par une
complémentarité entre ces activités pour aboutir à la dégradation du complexe
lignocellulosique. Par ailleurs, les activités catéchol-1,2-dioxygénase et protocatéchuate-3,4-
dioxygénase n’ont été pas détectées dans les conditions de culture.
Tableau 5 : Mesure des activités (UI.g -1 SPS) cellulase, lipase, laccase, Mn peroxydase,
lignine peroxydase et tannase de L. edodes Le119 durant un mois d’incubation à 25°C.
Temps Cellulase Lipase Laccase Mn Lignine Tannase
(jour)
peroxydase
peroxydase
0 0.02 0.001 1,52 0,04 0.001 0.004
6 0.4 0.002 5,838 0,124 0,121 0.121
12 0.82 0.0014 8,055 0,142 0,245 0.225
18 1.13 0.0018 8,518 0,231 0,214 0.154
24 0.76 0.010 7,602 0,1789 0,321 0.174
30 0.41 nd 4,630 0,1245 0,281 0.110
4. Conclusion
Les résultats de l’étude ont montré une bonne croissance de L. edodes Le119 sur le
SOS en FMS. L’inoculation du SOS avec un mycélium produit sur les grains de blé avec des
margines à 10% (v/v) a permis d’éviter la contamination de culture par des antagonistes. Le
suivi respiromètrique de L. edodes Le119 cultivée sur le SOS a mis en évidence la présence
de trois phases de croissance. L’étude des paramètres de sucres réducteurs, sucres totaux,
phénols totaux ainsi que les spectres RMN du 13 C a montré que la première phase de
croissance a été attribuée à la minéralisation des matières facilement dégradables, suivie par la
phase de dégradation des polysaccharides (hémicelluloses, cellulose). La dernière phase de
croissance correspondait à la dégradation légère de la lignine provenant du bois de taille.
L’étude des cinétiques enzymatiques au cours de la croissance de L. edodes Le119 en FMS
123

Résultats et discussion. Chapitre 4: Transformation de la matière organique
sur SOS a mis en évidence la présence d’un cocktail enzymatique qu’on pourrait utiliser pour
des applications biotechnologiques en particulier dans l’industrie agroalimentaire.
124

Résultats et discussion. Chapitre 5: Disponibilité des substrats oléicoles
Chapitre V
Disponibilité des substrats oléicoles : séchage solaire sous serre du
mélange de grignons d’olive et de margines
L’industrie oléicole génère d’énormes quantités de grignons d’olive et de margines
dans une période courte de quatre mois entre Novembre et Février. Avec l’humidité élevée
des grignons d’olive (35%) et des margines (90%), ces substrats sont facilement altérables par
le développement de la microflore endogène (Lakhtar 2006 ; Roussos et al., 2006). Par
conséquent, il est apparu nécessaire d’envisager un procédé permettant la réduction de leur
humidité et assurer leur conservation pour une disponibilité pour toute l’année. Le séchage
solaire pourrait être un processus d'un grand intérêt pour la stabilisation des ces substrats.
Le séchage est l’une des méthodes courantes de conservation de la plupart des
produits agroalimentaires et des fourrages, par diminution de leur teneur en eau jusqu’à des
valeurs résiduelles où le développement de tout micro-organisme est inhibé. Le stockage est
alors possible dans des conditions ambiantes (Kooli et al., 2007).
Depuis les premiers travaux de Lewis (1921) et de Sherwood (1929) sur le séchage
solaire, cette technique a fait l’objet de nombreuses communications scientifiques mais
demeure encore de nos jours un domaine de recherche privilégié notamment dans les pays où
l’utilisation de séchage solaire s'impose (Kooli et al., 2007).
Dans ce chapitre, nous présentons une étude préliminaire d’un nouveau procédé
consistant à mélanger les grignons d’olive frais avec les margines d’une unité de trituration
triphasique avec le système de presse, et sécher ce mélange dans une serre solaire pour réduire
l’humidité à 10%.
Ce chapitre a fait l’objet d’un article accepté avec révisions dans la revue Journal of
Environmental Management.
125

Résultats et discussion. Chapitre 5: Disponibilité des substrats oléicoles
Solar drying in greenhouse of a mixture of olive cake and olive mill
wastewater, a solution for olive mill wastewater disposal?
Authors:
Hicham LAKHTAR 1 , Hervé MACARIE 1 , Mustapha ISMAILI-ALAOUI 2 , Isabelle
PERRAUD-GAIME 1 , Sevastianos ROUSSOS 1*
Author’s address:
1 IRD, UMR IMEP (CNRS / IRD), Aix-Marseille Université, Faculté des Sciences de St.
Jérôme, Boîte 441, 13397 Marseille cedex 20, France,
Email: h.lakhtar@univ-cezanne.fr, herve.macarie@ird.fr, i.gaime@univ-cezanne.fr
2 IAV –Hassan II, Laboratoire des Bioconversions ; BP. 6202-Instituts, 10101 Rabat,
Morocco, m.ismaili@iav.ac.ma
*Corresponding author:
Sévastianos Roussos: Institut Méditerranéen d'Ecologie et de Paléoécologie UMR CNRS/IRD
193; IMEP Case 441; FST Saint Jérôme; Université Paul Cézanne; Av. Escadrille
Normandie-Niemen; 13397 Marseille cedex 20; France ;
E-mail: s.roussos@univ-cezanne.fr
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126

Résultats et discussion. Chapitre 5: Disponibilité des substrats oléicoles
Sechage solaire sous serre d’un mélange de grignons d’olive et de margines,
une solution pour le traitement des margines?
RESUME
Au Maroc, pays producteur de l’huile d’olive, l’industrie oléicole connait actuellement
une forte expansion. Les margines qui sont déversées dans l'environnement causent une
pollution environnementale grave, tandis que les grignons d’olive sont traités par la filière de
traitements appropriés. Dans le présent travail, un nouveau procédé intégré est décrit pour
réduire les volumes des margines produites par un système triphasique utilisant la technique
de presse. Notre procédé consiste à utiliser des grignons d'olive frais comme un agent
absorbant de margines produites puis à sécher le mélange dans une serre pour obtenir une
humidité finale de 10% (poids / poids). Les conditions optimales de mélange de grignons
d’olive avec les margines ont été déterminées à la suite de plusieurs essais de mélange-
séchage. Les performances expérimentales de séchage du mélange grignons d’olive-margines
ont été évaluées. La température de séchage de l'air asséchant a varié de 10 à 53 °C pendant le
séchage. Le mélange a été séché 3 fois plus vite dans la serre qu'à l'extérieur. Enfin, une
caractérisation du mélange séché par l’analyse à la RMN a été effectuée pour prévoir son
utilisation future et de déterminer si ce substrat lignocellulosique pourrait être valorisé dans
les voies existantes pour les grignons d'olive brutes.
Mots clé: grignons d’olive, margines, serre, séchage solaire, RMN.
127

ABSTRACT
Résultats et discussion. Chapitre 5: Disponibilité des substrats oléicoles
Morocco is a country which produces olive oil extensively and this industry within the
country is currently under huge expansion. The olive mill wastewater (OMW) which is being
dumped in the environment results in serious environmental pollution while olive cake (OC)
does have a proper disposal. In the present work, a new integrated process is described to
reduce the OMW produced by a triphasic system using the technique of pressing. Our process
consists in using olive cake as an absorbing agent of OMW produced and then to dry the
mixture in a greenhouse to get a final moisture of 10% (weight/weight). The optimal
conditions of mixing of OC with OMW were determined following various trials of mixing-
drying. The experimental performance of OC-OMW mixture drying in greenhouse was
evaluated. The drying air temperature varied from 10 to 53°C during drying. The mixture was
3 times dryer in the greenhouse than outside. Finally, a characterization of the dried mixture
by NMR analysis was performed to predict its future utilization and determine whether this
lignocellulosic material might be valued in the ways existing for crude olive cake.
Keywords: Olive cake, Olive mill wastewater, greenhouse, solar drying, NMR.
128

1. Introduction
Résultats et discussion. Chapitre 5: Disponibilité des substrats oléicoles
Mediterranean basin concentrates 97% of the world olive oil production (Ismaili-
Alaoui, 2006). Two technologies exist for oil extraction, the oldest three-phase and the more
recent two-phase. The three-phase which generates two wastes (olive mill wastewater and
olive cake) remains the dominating technology in the south of the Mediterranean bassin. It is
estimated that some 3x107 m3 of olive mill wastewater, accompagnied by 5x105 tons of olive
cake are generated each year as a result of olive oil production and this in a very short time of
4 months (November to February) (Gögüs and Maskan, 2006). With a production of 50,000
tonnes of olive oil per year, Morocco is presently located at the sixth rank of the world olive
oil producers. Fifty percent of this production still comes from traditional mills commonly
called “Maasra” which use the classic “three-phase system” with the technique of pressing.
Due to its residual oil content (10-30 % w/w) which depends on the extraction
technology and also to its other components, olive pit (42-54% w/w), skin (10-11% w/w) and
pulp (21-33% w/w) (Lopez-Villatta, 1998), OC has been the subject of many valorization
studies. To cite some of them, it has been evaluated for instance as animal feed (Haddadin et
al., 2002), as raw material for glycolipids’ biosynthesis (Bednarski et al., 2004), as
combustible in traditional furnaces of small building material factories (pottery works, brick
manufactures, etc.) (Masghouni and Hassairi, 2000) and as substrate for mushroom
cultivation (Zervakis et al., 1996) or enzyme production (Cordova et al., 1998). In a country
such as Morocco, its main use is still limited to the recovery of oil by extraction with hexane
for the production of soap (Serghini et al., 2007). The de-oiled OC which has excellent
calorific properties is usually reused directly as combustible by the OC oil extraction units to
dry OC to 6-10% (w/w) humidity before the extraction step. As a consequence, OC should
not be considered as a waste and it is actually rarely dumped into the environment.
Contrary to OC, OMW which contains high concentrations of toxic phenolic
compounds (Di Serio et al., 2008) and organic matter (100-200 g COD/l) is extremely
hazardous for the environment especially the water bodies. Until recently in Morocco, for
instance the potabilization plants furnishing the water to the city of Fes, which concentrates
40% of the country olive oil extraction capacities, had to be put out of operation during the
olive milling campaigns. This was due to the worsening of the Sebou river water quality
resulting from the direct discharge of OMW (Foutlane et al., 2002). Owing to economic
constraints, up to now, no widely accepted solutions exist for the disposal of this waste.
129

Résultats et discussion. Chapitre 5: Disponibilité des substrats oléicoles
Nowadays, in most countries which still use the three phase extraction technology, the
current practice to deal with OMW consists either to use it as amendment in olive fields or to
store it in evaporation ponds in order to reduce the volume to dispose off. Field amendment
which has the advantage to return to the soil part of the nutrients (N, P, minerals) exported
with OMW is a highly controversial practice in the scientific community (Mekki et al., 2007),
while the efficiency of the evaporation ponds is often very poor despite their high
construction costs to avoid OMW infiltration into the ground water.
OMW drying is actually a slow process since the olive oil and some mucilage cover
the surface and make it impermeable to water (Jimenez and Lao, 2004). As so, OMW drying
could be improved by increasing the surface of exchange with the atmosphere through the
addition of a high surface absorbing solid matrix. The OC readily available from the same
olive mill could be a good candidate for that. Thus, the amount of wastes, generated by olive
mill, could be controlled, based on the assumption that the resulting product could be
valorised in the same way as crude OC.
Open sun drying is the common drying method of agricultural materials used in
Morocco. However, this method results in long drying times and quality loses since the drying
materials are directly exposed to environmental conditions (Erbay and Icier, 2009). On the
other hand, artificial hot air dryers have high investment cost and high energy expenses
(Colak and Hepbasli, 2007). However, solar drying in greenhouse can be considered as an
advancement of natural sun drying and it is a more efficient technique of utilizing the
potential solar energy (Müller et al., 1989; Jain and Tiwari, 2004; Kooli et al., 2007; Janjai et
al., 2009). Many research and performance studies have been reported on solar drying in
greenhouse (Kooli et al., 2007; Janjai et al., 2009). Therewith, certain studies were focused on
OC drying for soap making, animal feed or fertilizer (Haddadin et al., 2002; Akgun and
Doymaz, 2005). Nevertheless, there have been no reports on the drying of the mixture of olive
cake with OMW in the literature.
The objectives of the present study were to determine under which conditions all the
OMW generated by a mill could be absorbed by the OC produced by the same mill and if the
resulting OC-OMW mixture could be dried to 10% (w/w) humidity in order to obtain a solid
matrix which could be valorized in the same way as crude OC. To achieve these objectives
we (1) performed a mass balance of the different products generated by a traditional maasra
mill (2) determined the OMW retention capacity by the mill OC, (3) performed several drying
130

Résultats et discussion. Chapitre 5: Disponibilité des substrats oléicoles
experiments in open sun and in a greenhouse under natural convection and (4) determined the
final quality of the dried material and compared it to that of dried crude OC.
2. Materials and methods
2.1. Origin of samples
OC and OMW were obtained from an olive oil mill plant located in Beni-Mellal in the
centre of Morocco. This mill used a three phase system with press and operated mostly with
the “picholine marocaine” which is the main olive variety cultivated in Morocco for
production of both olive oil and table olives. As so this mill can be considered as
representative of the ones used in the country.
2.2. Description of the greenhouse dryer
The greenhouse dryer, used in the study was located at HASSAN II Agronomic and
Veterinary Institute, in Rabat, Morocco. It was built on a concrete floor and oriented in the
north-south direction. It had a parabolic cross-section and a size of 7 (length), 3 (width) and
2.5 m (height) giving on the ground a surface of 21 m2. It was covered with polycarbonate
but the facade was made of transparent extern stratum. The air ventilation was obtained by
some openings at different levels of the sides. One set of iron shelves with iron trays was used
to place the products to be dried. The trays were located on three different levels (0.5, 1 and
1.5 m from the ground) on the shelves. The free space between them was sufficient for
loading and unloading the products. The trays were made of a wire netting to allow air
circulation. A second set of identical shelves and trays were used for the outdoor drying. The
structure of the greenhouse and of the shelves and trays is shown in Fig. 1.
Figure 1. General view of the greenhouse solar dryer (left) and of its interior with the shelves
(right). Only the lower and upper trays were used for loading the material to be dried.
131

Résultats et discussion. Chapitre 5: Disponibilité des substrats oléicoles
2.3. Determination of the OMW retention capacity by olive cake
This test consisted to contact 3 kg of crude OC with 3 L of OMW under gentle
periodic mixing. Every 15 min, an homogenous sample of the mixture was taken from which
the solids were recovered by filtration from the liquid and weighted (Sebabi et al., 2003). The
sampling was repeated until the weight of the solid phase did not change over 3 successive
measurements. The moisture of the solid phase was also determined at each sampling by
drying a subsample at 105°C in an oven for 24 hours. Humidity was determined in the same
way for all the other experiments. Besides the estimation of the maximum amount of OMW
which can be absorbed by OC, this test allowed to determine the minimal time required to
reach this objective. These experiments were performed in triplicate.
2.4. Drying experiments
Outdoor and greenhouse drying were performed under identical conditions in order to
be comparable. Saturated OC with OMW (no free liquid OMW present) were distributed
uniformly in thin layer on the trays the bottoms of which were covered by plastic mesh. The
solids on the trays were turned manually once every hour. The drying process was pursued
until reaching the target moisture. For that, the whole solid present on each trays were
weighted periodically at 1 h intervals using a digital balance and their moisture content was
determined. Solar radiation and temperature inside and outside the greenhouse were
determined periodically. In order to avoid the interference of rain on the outdoor drying
process, it was planned to cover the shelves with a plastic sheet during rainfall events. Finally
this was unnecessary since no rain occurred during all the experimental period (February
2008).
2.5. Chemical characterization of dried crude olive cake and OC-OMW mixture
OC and the new product (OC-OMW mixture) both dried at 10% (w/w) humidity in the
same conditions were characterized for their content in carbon, nitrogen (proteins), fats and
total phenols. Carbon and nitrogen concentrations were determined by a combustion-gas
chromatography technique (Flash EA 1212 Elemental Analyzer, France). The instrument was
calibrated with aspartic acid standard. The amount of proteins was estimated from the
nitrogen content using the general factor of 6.25 (Weinberg et al., 2008). Fats were obtained
by Soxhlet extraction with hexane as solvent according to established procedures (Cordova et
al., 1998). Phenol content was assessed as follows: 10 mL of 60% (v/v) ethanol-water were
added to 1 g of milled solid sample. The mixture was homogenized, incubated for 1 h at 4°C
132

Résultats et discussion. Chapitre 5: Disponibilité des substrats oléicoles
and centrifuged at 4500 rpm for 10 min. The extraction was repeated three times. The
supernatant was then filtered under vacuum. The non phenolic fraction still presents in the
filtered liquid (e.g. fats) was eliminated by extraction with 10 mL of n-hexane, repeated three
times. The total phenolic content of the remaining aqueous phase was quantified by the
method of Folin and Ciocalteu (Bärlocher et al., 2005). The blue reactive complex formed
was dosed spectrophotometrically at 760 nm. Caffeic acid being used as standard for the
calibration, the phenolic content of the samples was expressed as caffeic acid equivalent.
2.6. NMR analysis of dried crude olive cake and OC-OMW mixture
Dried crude OC and the mixture OC-OMW were used directly in NMR experiments
without special preparation. Owing to their size, the samples were gently ground (IKA
Labortechnik, Germany) in order to fill the rotor. Solid-state 13 C CPMAS NMR spectra, of
dried crude OC and dried mixture OC-OMW, were obtained on a Bruker Avance-400 MHz
spectrometer (Bruker, Bremen, Germany) operating at a 13 C resonance frequency of
100.7 MHz. Samples were placed in a 7-mm zirconium rotor and spun at the magic-angle at
6 kHz. All measurements were made at room temperature. The 13 C chemical shifts were
referenced to tetramethylsilane and calibrated with the glycine carbonyl signal, set at
172.5 ppm.
Deconvolution of the NMR spectra was performed using the DmFit software (Massiot
et al., 2002). This software adjusts the spectra to obtain the linewidth and the peak positions
(in ppm) and to integrate each peak so as to obtain the percentage of each contribution. The
aromaticity of dried mixture OC-OMW and crude OC was calculated by expressing aromatic
C (110–165 ppm) as a percentage of aliphatic C (0–110 ppm) + aromatic C (Wikberg and
Liisa Maunu, 2004). The lignin content was calculated according to the model of Gilardi et al.
(1995), which takes into account the total lignin carbon. These authors calibrated lignin
content from aromatic carbons plus aliphatic carbons of lignin. The cellulose crystallinity (Xc)
was expressed by the ratio between the signal at 84 ppm, assigned to the C-4 of amorphous
cellulose, and the signal at 89 ppm, assigned to the C-4 of crystalline cellulose (Newman and
Hemmingson, 1990).
2.7. Statistical treatment of results
Data of drying, chemical analysis and NMR spectra were subjected to analysis of
variance (ANOVA). The error square was obtained from the analysis of variance and used to
calculated the least significant difference (LSD, P=0.05). Variations between data are
significant when the difference between is more than the LSD.
133

3. Results and discussion
Résultats et discussion. Chapitre 5: Disponibilité des substrats oléicoles
3.1. Waste balance in the model traditional mill and liquid retention capacity of olive
cake
Three different pressing of 600 kg of olives in such a mill produced in average 127 kg
of olive oil, 220 kg of OMW (volumetric mass of 1.014 kg/L) and 253 kg of OC with an
initial moisture of 35% (w/w). This gave a production ratio of 87 kg OMW / 100 kg OC.
OMW absorbed
(L/100 kg of OC
80
60
40
20
0
0 20 40 60 80 100
Figure 2. Retention capacity of olive mill wastewater by crude olive cake at 25°C. Error bars
represent standard deviation.
Time (min)
The kinetics of OMW absorption by OC, indicated that 60 min were necessary to
completely saturate OC with OMW and that the maximum retention capacity of OC was of 62
L of OMW / 100 kg of OC giving a final product with moisture of 56% (w/w) (Fig. 2). This
means that the amount of OC generated by this type of mill was only sufficient to absorb
around 72% of the OMW produced at the same site. The sole way, to absorb the remaining
OMW without the need of adding extra exogenous absorbing material, would be to recover
the original absorption capacity of OC or at least part of it. This may be achieved through
partial drying of the OC-OMW mixture obtained and its reuse as new absorbing agent.
Therefore, the objective to absorb all the OMW generated by a mill on the OC may then be
only achieved by a two-step absorption-drying process
134

Résultats et discussion. Chapitre 5: Disponibilité des substrats oléicoles
3.2. Drying of the mixture of OMW-Olive cake
After a set of trials, it was found that the best way to perform the two step absorption-
drying was the one shown in Table 1.
Table 1. Optimized procedure for the two-step drying process of OMW absorbed on OC.
The first step consisted to saturate OC with OMW (resulting product with 56%
moisture w/w) and then to limit the drying of the mixture up to a final moisture of 40% (w/w).
This level of humidity was found as a good compromise to achieve three objectives. It
allowed the evaporation of enough water (42 L from 166 kg of OC-OMW mixture) to give to
the partial dried OC-OMW mixture the capacity to absorb all the OMW remaining to absorb
(25 L). It permeated to avoid the problems generated by a more intensive drying which could
have affected the absorption capacity, because OC became more water repellent upon drying
due to the shrink of the water absorbing solid material that it contains resulting in a loss of
porosity of this material, porosity which is the driving motor of absorption (Liu and Lee,
2006). It also allowed a fast drying for this first step since the drying from a humidity of 56%
to 40% (w/w) concerned mostly to free water which is easy to be removed (Ekechukwu,
1999). Quantitatively, the total mass of by-products (OC and OMW) generated by a maasra
mill (78 kg / 100 kg of olives processes) can be reduced by 56.15% (final amount of 35-36 kg
/ 100 kg of olives processes) thanks to such drying.
135

Résultats et discussion. Chapitre 5: Disponibilité des substrats oléicoles
3.3. Drying kinetics of OC-OMW mixture
A typical pattern of the first and second step of drying of OC-OMW mixture outdoor
and in the greenhouse is shown in figures 3 and 4. The data shown are for an OC-OMW
loading of 10 kg.m -2 . Solar radiation varied from 5 to 10 W.m -2 during the drying period.
Temperature (°C)
Temperature (°C)
Time (h)
Time (h)
Figure 3. Change of temperature inside the greenhouse ( ) and open sun ( ) during the (a)
first drying and (b) second drying of OC-OMW mixture in Rabat-Morocco during February
2008.
The evolution of the temperature in the greenhouse was as expected from what is
published in the literature for such systems (Ivanova and Andonov, 2001; Jain and Tiwari,
2004; Kooli et al., 2007; Janjai et al., 2009). It was significantly different from the outdoor
temperature during the day time and part of the night (9:00 am to 11:00 pm) but identical to
the outdoor temperature after 11:00 pm and up to 9:00 am (Fig. 3). In average, the air in the
dryer was at 16°C higher than outside during the first period. This difference reached a peak
at noon when the air temperature inside the greenhouse became higher than or equal to 50°C,
a condition which was maintained for 3 hours (12:00 am to 3:00 pm). At this temperature the
a
b
136

Résultats et discussion. Chapitre 5: Disponibilité des substrats oléicoles
heat gain in the greenhouse was 10% higher than the outside. In accordance with the
increased temperature and heat gain, the drying of the OC-OMW mixture was much faster in
the greenhouse than outside (Fig. 4).
Moisture content (%)
Figure 4. Typical drying curve of the OC-OMW mixture in the greenhouse ( ) and open sun
( ) in Rabat-Morocco during February 2008; (a) First drying; (b) second drying.
For the first drying, height hours of the day time were sufficient to reach the target
moisture (40% w/w) in the greenhouse compared to 12 hours outside, which means that the
drying process was some 1.5 times quicker in the greenhouse. For the second drying, the
products obtained after 35 hours of drying including a night during which a very low loss of
moisture occurred (less than 5% w/w in 10 hours) were also 3 times dryer in the greenhouse
than outside (10% moisture against 30% w/w). The main limiting factor in the drying process
corresponds to the very low drying efficiency achieved during the night period. This
efficiency could be improved by implementing forced convection through the use of a fan
powered with batteries recharged in the day by means of solar cell modules installed on the
top of the greenhouse (Chow, 2009). Further, it is possible to imagine a complete automation
of the absorption drying-process. OC may be loaded in the greenhouse with Archimedes
screws and humidified with OMW through a dispositive of showers which could allow
controlling precisely the humidity of the mixture.
a
Time (h)
b
137

Résultats et discussion. Chapitre 5: Disponibilité des substrats oléicoles
3.4. Effect of the amount of OC-OMW mixture to be dried and location in the
greenhouse
To test the impact of these two parameters on the drying efficiency, five different
amounts (10 to 35 kg/m 2 ) of OC-OMW mixture were loaded on the trays located in the lower
and upper part of the greenhouse. The mixtures were dried during 2 days. Their final moisture
is shown in Figure 5. Without surprise, higher was the amount to dry and slower was the
drying process resulting in a product with higher moisture after the same time of drying. In
this particular case, only the lowest amount tested (10 kg fresh weight/m 2 ) could be dried up
to 10% moisture during the length of the experiment. A slight difference of moisture could be
observed among the products dried in the lower and upper trays, but the difference was
statistically not significant (P=0.05).
Moisture content (%)
Sample
Figure 5. Effect of the amount of OC-OMW mixture to be dried and of its location in the
greenhouse, bottom ( ) and top ( ) on the final moisture of the substrate after drying for 2
days. The initial moisture of the mixture was of 56% (w/w).
3.5. Chemical characterization of dried crude OC and OC-OMW mixture
Chemical analysis results for the dried crude OC and the dried OC-OMW mixture are
presented in table 2. Statistical analysis (P=0.05) showed significant differences in pH, C, N,
C/N and total phenols, but no significant difference in fat content. Incorporation of OMW into
OC allowed to increase by 24% of the protein content in the mixture compared to dried crude
OC which is considered as a poor material for animal feed (Martin Garcia et al., 2003).
However, this was counterbalanced by total phenol content which was 5 times higher than
that in the dried crude OC since phenols are known for their anti-digestive properties
(Grabber, 2009). On the other hand, this converted the OC-OMW mixture into a good raw
Thickness (kg .m- 2 )
138

Résultats et discussion. Chapitre 5: Disponibilité des substrats oléicoles
material candidate for the extraction of antioxidants which are used in the food, cosmetic and
pharmaceutical fields (Erbay and Icier, 2009). The fat content and dryness of the mixture
indicates also that it could be used directly by the traditional oil recovery units in place of OC.
Table 2. Global chemical composition of the OC-OMW mixture and crude OC both dried at
10% moisture*
Component OC-OMW dried mixture Dried crude OC
pH 5.1± 0.1 4.9+0.2
C (%) 52.49 ± 0.01 51.11 ± 0.18
N (%) 1.06 ± 0.01 0.85 ± 0.09
C/N 49.51 ± 0.64 59.77 ± 2.00
Protein (%) 6.62 ± 0.08 5.34 ± 0.56
Olive oil (%) 10.00 ± 1.02 10.00 ± 0.54
Total Phenol (%) 4.1 ± 0.81 1.20 ± 0.15
*All % in w/w, the values after ± represent standard deviation
3.6. NMR analysis of OMW-olive cake
The 13 C NMR spectra of dried crude OC and dried OMW-OC mixture are presented in
Figure 6. The peak assignments and interpretations (Table 3) are based on previous NMR
studies of organic matter (Albrecht et al., 2008; Baddi et al., 2004; Farnet et al., 2009).
Figure 6. Solid-state 13 C NMR spectra of, (a) dried OC-OMW mixture and (b) dried
crude OC.
a
b
139

Résultats et discussion. Chapitre 5: Disponibilité des substrats oléicoles
Table 3. 13 C-NMR spectral assignment of C functional groups
Chemical shift (ppm) Assignment Compounds included
0-45 Alkyl C Lipids, Amino-acids,
45-60 N-Alkyl/methoxyl C Amino acids
60-110 O-Alkyl C Celluloses, hemicellulose, polysaccharides
110-145 Aryl C Polyphenols, Lignin (aromatic C)
145-165 O-Aryl C Phenols, lignin (phenolic C)
165-190 Carboxyl C Organic acids, amide and ester C
Deconvolution of spectra allowed integration of 27 peaks. Figure 7 showed relative
integration values for the major C-types from the dried substrates. A comparison of the
spectra of dried OC-OMW mixture and crude OC showed that the major difference are in the
Alkyl C (0-45 ppm), O-alkyl C (60-110 ppm) and Carboxyl C (165-190 ppm). The addition of
OMW to OC led to an apparent low content of carbohydrate in the dried mixture. The high
intensity of O-alkyl C in the dried mixture was consistent with total phenol content which was
5 times higher than in OC. The dried mixture showed more intense peaks at 175 ppm, because
of the carboxyl group which can result from the degradation of OMW upon drying,
especially, during the first stage of drying. The intensities of the peaks at 84 and 89 ppm
showed a very low degree of crystallinity of cellulose both for the dried OC-OMW mixture
and OC and the lignin content was not affected by the additions of OMW (Table 4).
Integration value (%)
Chemical shift (ppm)
Figure 7. Integration values for the major C-types in the 13 C NMR spectra of dried OC-OMW
mixture ( ) and dried OC ( ).
140

Résultats et discussion. Chapitre 5: Disponibilité des substrats oléicoles
Table 4. Calculated parameters from NMR data of dried mixture OC-OMW and dried
crude OC.
Parameters OC-OMW dried mixture Dried crude OC
Aromaticity % 17.42±0.26* 16.78±0.33
Lignin% 25.23±1.24 25.81±1.31
Carbohydrate% 47.11±1.02 53.00±2.32
Crystallinity 89/84
ppm 0.15±0.01 0.15±0.02
*The values after ± represent standard deviation
4. Conclusions
The absorption of all the OMW produced by an olive mill on the OC generated by the
same mill was found to be possible. It was carried out in two steps with alternate drying. The
experimental results showed that the drying of the OC-OMW mixture in greenhouse was very
effective, and that the drying period to achieve the same level of moisture was shortened
relatively to the open sun drying. The homogeneity of air in the greenhouse under natural
convection eliminated any difference in drying rate at different levels of trays. The chemical
and NMR analysis of the dried OC-OMW mixture showed that the new product was
sufficiently similar to OC to be at least valorised in the same way with the advantage to avoid
the dumping of OMW in the environment.
Acknowledgements:
Hicham Lakhtar is thankful to DSF-IRD France for the award of a PhD fellowship. The
authors are grateful to Dr. Fabio Ziarelli of Paul Cezanne University, France, for providing
the NMR facility.
141

Synthèse générale
142

Synthèse générale
Synthèse générale
Cette partie de synthèse générale a pour but de récapituler les différents résultats
obtenus. Au cours de ce travail, nous avons étudié la valorisation des substrats oléicoles (bois
de taille, grignons d’olive, et margines) par la culture de Lentinula edodes en fermentation en
milieu solide pour :
1. La production de la biomasse mycélienne servant à la production du carpophore pour
l’alimentation humaine
2. Apporter une solution technique permettant la détoxification des effluents des huileries
en particulier les margines d’olive, qui pourrait être destiné à l’alimentation animale
3. Apporter une bonne compréhension de la physiologie de croissance de Lentinula
edodes sur le mélange de substrats oléicoles solides.
Pour atteindre ces objectifs, nous avons fait appel et développé, au cours de ce travail,
des approches microbiologiques (FMS, respirométrie), physicochimiques (dosage des phénols
totaux, sucres réducteurs, monomères phénoliques, ergostérol), enzymologiques (dosages
d’activités, révélation d’isoformes), et spectroscopique (RMN solide du 13 C).
Avec l’augmentation de la production de l’huile d’olive au Maroc, les huileries d’olive
accentuent la pollution de l’environnement, en particulier dans les régions de production (Fès,
Meknès, Marrakech, Béni-Mellal). Cette pollution est due principalement au rejet des
margines d’olives qui contiennent des composés récalcitrants perturbant les écosystèmes
microbiens des réceptacles environnementaux. En effet, ces composés récalcitrants, en
particulier les molécules phénoliques qui exercent une action antimicrobienne et
phytotoxique, limitent les procédés de valorisation de ces effluents qui sont de caractère
saisonnier et produits en grands volumes.
Dans cette vision de développement durable du secteur oléicole, nous avons souhaité
mettre au point un procédé novateur qui converge vers une valorisation intégrale des sous-
143

Synthèse générale
produits de l’industrie oléicole (bois de taille, grignons d’olives et margines) dans le but de
vérifier l’hypothèse suivante : « Est-il possible de valoriser les trois co-produits de l’industrie
oléicole (bois de taille, grignons d’olives et margines) pour en faire un seul substrat oléicole
solide utilisé pour la culture de Lentinula edodes en FMS». Le choix du L. edodes repose sur
trois critères :
La nature du substrat de culture : Contrairement aux champignons de Paris,
Agaricus bisporus, Lentinula edodes n’exige pas un substrat composté et se développe sur des
substrats lignocellulosiques ayant subi peu de transformations.
La commercialisation du champignon : Lentinula edodes (Shiitake) est le deuxième
champignon comestible, commercialisé sur le marché mondial avec une production qui
dépasse deux millions de tonnes en 2002. Cette production augmente de 25% annuellement.
La production des enzymes ligninolytiques : Le potentiel de L. edodes de
production des enzymes ligninolytiques, en particulier les phénoloxydases, a été mis en
évidence par plusieurs auteurs. Ainsi, D’Annibale et al. (2004) ont démontré l’implication des
laccases, produites par L. edodes, dans la dégradation des composés phénoliques, favorisant
ainsi une détoxification des margines.
Pour la culture de L. edodes en FMS sur le SOS, une étude de criblage des souches a
été réalisée pour la sélection d’une souche performante, tolérante aux margines, productrice
d’une biomasse mycélienne importante et capable de dégrader des phénols totaux. Les
résultats de criblage des souches de L. edodes en présence de margines à 10 et 20 % (v/v)
(Lakhtar et al., 2009) ont permis de sélectionner la souche Le119. Cette souche a montré une
tolérance aux margines à 20% avec une production de biomasse mycélienne de 4,49 mg.j -1 L -1 .
En milieu liquide à base de margines à 10%, L. edodes Le119 était capable de dégrader les
phénols totaux de margines à raison de 75% après 30 jours de culture à 25°C et une activité
laccase de 1,5 (UI.mL -1 ) après 15 jours de culture. Ce résultat a permis également de mettre
en évidence la relation d’induction de la production de laccase par la présence des margines.
En effet, une augmentation de l’activité laccase a été remarquée après l’addition des margines
dans les milieux de culture solides et liquides. Par ailleurs, il a été reporté que les laccases
sont impliquées dans la dégradation des molécules phénoliques (D’Annibale et al., 2004) ainsi
que dans le mécanisme de défense de L.edodes à l’égard d’antagonistes tels que les
moisissures (Savoie et Mata, 2003). Une fois la souche de L. edodes Le119 sélectionnée, nous
avons procédé à la production d’inoculum de cette souche sur Ebly ® , un substrat amylacé
commercial.
144

Synthèse générale
Bien que la technique de préparation de l’inoculum des basidiomycètes (spawn) soit
bien décrite dans la littérature (Royse et al., 1998), la complexité des substrats à fermenter
conditionne cette technique pour faire face aux contaminations occasionnées par les
antagonistes opportunistes (moisissures). En effet, les contaminations répétitives des cultures
de L. edodes Le 119 sur le SOS nous a poussé à exploiter les deux critères que nous avons
fixés, entre autres, pour la sélection de L. edodes Le119 (Chapitre 1) qui sont: (i) la tolérance
aux margines et (ii) l’induction de la production des laccases (Chapitre 2).
L’addition des margines à 10% (v/v) aux grains de blé Ebly ® durant la préparation de
l’inoculum a favorisé une bonne production de mycélium avec une activité métabolique
accentuée. En effet, la biomasse produite de L. edodes Le119 sur les grains d’Ebly ® avec
margines 10% était trois fois plus élevée que celle obtenue en absence de margines (1,8 et 0,6
mg.g -1 MS du «spawn» après 20 jours d’incubation respectivement). Quant à l’activité
métabolique, la présence de margines a multiplié l’activité respiratoire du mycélium de
L. edodes cultivé sur les grains d’Ebly ® avec les margines à 10%, tandis que l’activité laccase
passait de 0,2 à 1,7 UI.g -1 SPS au 12 ème jour d’incubation pour le spawn produit sans et avec
margines à 10% respectivement (Chapitre 2).
La deuxième partie de chapitre 2 a concerné certains aspects méthodologiques relatifs
à l’estimation indirecte de la biomasse mycélienne de L. edodes Le119 cultivé sur les grains
d’Ebly ® en FMS par la détermination de l’ergostérol. Compte tenu qu’aucune méthodologie
fiable n’existait dans la littérature, il a été nécessaire de mettre au point le protocole de
l’estimation de la biomasse mycélienne en FMS. De plus, les conditions de culture peuvent
affecter la fiabilité et la reproductibilité de l’estimation de la biomasse. Ainsi, il est apparu
nécessaire d’étudier l’effet de la nature du substrat de culture ainsi que l’âge du mycélium sur
la teneur de l’ergostérol dans le mycélium de L. edodes Le119.
Les résultats obtenus ont montré qu’il ya une forte corrélation (r 2 = 0.987) entre la
teneur en ergostérol et la quantité de biomasse mycélienne correspondante quelles que soient
les conditions de culture (composition du milieu de culture et âge du mycélium). De plus, la
corrélation directe de la teneur en ergostérol du mycélium des produits fermentés avec le taux
de production de CO2 (r 2 = 0,88) a permis d’évaluer l’état physiologique du mycélium par la
détermination de l’ergostérol. Ainsi, cette technique mise au point au cours de ce travail nous
a servi pour l’estimation de la biomasse mycélienne de L. edodes sur le SOS (Chapitres 3
et 4).
145

Synthèse générale
Suite à l’optimisation de la production d’inoculum « spawn » de L. edodes Le119,
nous avons cherché, d’une part, à optimiser la composition du SOS afin d’obtenir une
production importante de la biomasse mycélienne de L. edodes Le119. Le résultat de la
biomasse estimée par quantification d’ergostérol a montré que le mélange optimal SOS est
composé de 20% de bois de taille, 30% de grignons d’olive et 50% de margines. D’autre part,
nous avons adopté la méthodologie des plans d’expériences afin de déterminer l’effet relatif
de 6 facteurs sur la production de biomasse mycélienne ainsi que sur la dégradation rapide des
phénols totaux. Les six facteurs (pH initial, aération, âge d’inoculum, taille d’inoculum, taille
de particules et solution minérale) ont été choisis judicieusement pour recouvrir des
conditions physiques, chimiques et biologiques. L’utilité des plans d’expérience réside dans
le fait que toutes les données expérimentales sont utilisées simultanément pour calculer l’effet
de chaque facteur avec une précision accrue et un faible nombre d'essais. Cette stratégie
convient particulièrement à la culture lente de L. edodes sur le SOS qui demande un temps
d’incubation très long (un à deux mois).
Les deux facteurs essentiels ayant un effet sur les deux réponses, biomasse mycélienne
et dégradation des phénols totaux, sont : (i) le taux d’inoculum et (ii) l’addition de la solution
minérale. En effet, le taux d’inoculum a montré un effet positif sur la quantité de biomasse
mycélienne produite ainsi que sur le taux des phénols dégradés. Un taux minimal de 10%
(p/p) permet d’éviter la contamination des cultures par des antagonistes. Tandis que l’addition
de la solution minérale (Chapitre 4) a présenté un effet négatif sur les mêmes réponses et que
les margines, malgré leur toxicité, contiennent des éléments nutritifs, comme des sucres
solubles, des protéines et des éléments minéraux, qui favorisent le développement de
L. edodes Le119. Les autres facteurs testés n’ont pas montré d’effet sur les deux. Ainsi donc,
les conditions optimales de culture de L. edodes Le119 sur le SOS sont les suivantes :
la composition du SOS (20% de bois de taille, 30% de grignons d’olive et 50% de
margines) ;
pH initial 5 ;
température d’incubation 25°C ;
débit d’aération 20 mL.min -1 ;
âge d’inoculum 10 jours ;
taux d’inoculum 10% ;
particules avec une taille entre 2 et 0,8 mm à raison de 70% et des particules avec une
taille inferieure de 0,8 à raison de 30% ;
sans addition de solution minérale.
146

Synthèse générale
Afin de suivre le développement du mycélium de L. edodes Le119 sur le SOS dans des
conditions optimales des cultures en FMS été effectuées (Chapitre 4). Au cours des FMS nous
avons adopté la technique de respirométrie qui permet le suivi de la croissance de L. edodes
Le119 d’une manière non destructive en analysant le CO2 présent dans les effluents gazeux à
la sortie des colonnes de Raimbault (De Araujo, 2002). Pour ce faire, on a mis au point un
prototype nouveau « PNEO » qui permet de mesurer simultanément quatre paramètres (Débit
d’air, température d’air, humidité relative d’air et taux de CO2). Le suivi respirométrique a
montré que la croissance de L. edodes Le119 cultivé sur le SOS passe par trois phases de
croissance rapide alternées par trois phases de croissance ralentie. La production de biomasse
suit également cette évolution en trois phases pour arriver à une biomasse importante (21,61
mg.g -1 ) après un mois d’incubation à 25°C. L’évolution de production de la biomasse
mycélienne estimée par analyse d’ergostérol qui suit l’évolution de la production de CO2
confirme l’adaptabilité de la technique développée (Chapitre 3) pour estimer l’état
physiologique de L. edodes Le119 en FMS. Par ailleurs, l’analyse des échantillons fermentés
a mis en évidence une dégradation des phénols totaux à 80% durant la croissance de L.
edodes. Cette dégradation des phénols est accompagnée, d’une part, d’une décoloration du
SOS de 85% et, d’autre part, d’une production élevée d’enzymes spécifiques.
Les résultats des analyses spectroscopiques de la RMN ont mis en évidence le
changement de composition en groupement carbonés du SOS durant le développement de
L. edodes Le119 en FMS, en particulier les polysaccharides et la lignine. L’accumulation en
sucres réducteurs enregistré après 12 jours d’incubation confirme la diminution observée dans
les spectres de RMN correspondant aux polysaccharides en particulier aux hémicelluloses.
Avec la composition diversifiée du substrat oléicole solide (SOS) mis au point dans notre
étude (Chapitre 3), le mycélium de L. edodes Le119 a synthétisé un cocktail enzymatique
varié et composé essentiellement de laccases, Mn peroxydases, lignine peroxydases et
cellulases. L’évolution de la composition du cocktail enzymatique ainsi que les spectres de
RMN accompagnés de l’évolution des sucres réducteurs, montre que le mycélium commence
par la minéralisation des matières facilement dégradables (phase 1) et poursuit son
développement en dégradant les polysaccharides, en particulier les hémicelluloses et la
cellulose (phase 2). La dernière phase de croissance correspondrait à une légère dégradation
de la lignine provenant principalement du bois de taille, tandis que chaque phase de
ralentissement de croissance (Chapitre 4) serait attribuée à la phase d’organisation du
mycélium pour la préparation de son arsenal enzymatique responsable de la dégradation des
147

Synthèse générale
molécules rencontrées. L’ensemble de ces résultats confirme bien notre hypothèse de départ.
Il est donc possible de cultiver L. edodes Le119 sur un substrat oléicole solide SOS composé
de bois de taille (20%), de grignons d’olive (30%) et de margines (50%). Ainsi, cette étude a
permis de valoriser l’ensemble des substrats oléicoles par la culture de L. edodes.
Enfin, la réussite de la culture de L. edodes Le1119 sur le SOS nous a poussés à
rechercher une technique qui permet d’assurer la disponibilité durant toute l’année des
substrats oléicoles (grignons d’olive et margines) qui sont facilement altérables et de caractère
saisonnier (Novembre et Février). En effet, la teneur élevée en eau de ces substrats, grignons
d’olive (35%) et margines (90%), ainsi que leur composition biochimique, présence des
sucres, de protéines, pectines et autres nutriments, favorisent le développement de la
microflore endogène et posent le problème de conservation de ce matériau. Dans le dernier
chapitre de la thèse, nous avons envisagé d’appliquer le procédé de séchage solaire sous serre
pour le mélange de grignons d’olive avec les margines provenant de la même unité de
trituration. Ce procédé convient parfaitement au procédé de trituration triphasique ainsi que
les conditions météorologiques du Maroc qui se caractérisent par un pouvoir asséchant élevé
de l’air. Les premiers résultats ont montré que la capacité d’absorption des margines par les
grignons d’olives (62 kg margines par 100 kg de grignons) est plus faible que la quantité des
margines produites (87 kg margines par 100 kg de grignons). Cela nous a amené à procéder
au séchage en deux étapes.
La première étape consiste à humidifier les grignons d’olive par les margines jusqu'à
56% (p/p) d’humidité, en incorporant ainsi environ de 72% de margines, et à leur appliquer
un séchage pour ramener cette humidité à 40%. La deuxième étape de séchage consiste à ré-
humidifier le mélange pour atteindre une humidité de 50% et à le faire sécher jusqu'à 10%. La
saturation en margine des grignons de départ à 56% a permis d’accélérer le premier séchage et
le fait de limiter ce premier séchage à 40% a permis d’incorporer plus facilement par la suite
les margines sur les grignons en vue du deuxième séchage. La caractérisation biochimique du
nouveau mélange séché a montré que l’incorporation des margines permet d’augmenter la
teneur du mélange grignons-margines en protéines de 1,2 fois et en phénols totaux de 5 fois,
comparée à la teneur en protéines et en phénols totaux des grignons bruts. Le spectre de la
RMN solide du 13 C du mélange grignons-margines a été comparé à celui des grignons bruts
séchés dans les mêmes conditions. Le résultat montre qu’il ya une seule différence enregistrée
dans le groupement carboxyle (165-190 ppm) qui pourrait être due à la dégradation des
margines durant la première phase de séchage (Chapitre 5).
148

Synthèse générale
En conclusion, ce travail nous a permis de démontrer qu’il possible de fabriquer, à
partir de l’ensemble des co-produits oléicoles solides (bois de taille et grignons d’olives) et
liquides (margines), un seul substrat oléicole solide (SOS) pour la culture de L. edodes en
fermentation en milieu solide, et que les portions mises au point de chaque co-produit
convient parfaitement aux quantités produites par l’industrie oléicole avec le procédé
triphasique de presse.
149

Conclusions et perspectives
150

Conclusions et perspectives
Conclusions et perspectives
L’objectif de ce travail a été d’étudier la valorisation des substrats oléicoles (bois de
taille, grignons d’olive, et margines) par la culture de Lentinula edodes en fermentation en
milieu solide, pour i) la production de la biomasse mycélienne servant à la production du
carpophore pour l’alimentation humaine et ii) pour la détoxification du SOS qui pourrait être
destiné à l’alimentation animale.
Malgré l’existence des composés récalcitrants en particulier les composés phénoliques
qui confèrent la toxicité des co-produits oléicoles (grignons et margines d’olive), ces substrats
contiennent également des éléments nutritifs qu’on peut exploiter. La culture d’un
champignon qui tolère la présence des composés phénoliques peut tirer parti de ces substrats
pour son développement. Les études de criblage de L. edodes sur des milieux contenant des
margines ont permis de sélectionner une souche très performante et de prévoir l’addition des
margines aux grains de blé durant la préparation de l’inoculum. Les résultats obtenus amènent
à plusieurs conclusions.
Tout d’abord, L. edodes Le119 a montré une bonne tolérance aux margines avec la
production d’une biomasse importante. La présence des composés phénoliques dans les
margines induit la production des phénoloxydases qui servent à la fois à la déphénolisation
des margines et à la défense de L. edodes face aux antagonistes opportunistes tels que les
moisissures.
Les résultats de la méthode d’estimation de la biomasse mycélienne par quantification
d’ergostérol ont clairement démontré l’applicabilité de cette technique à l’estimation de l’état
physiologique du mycélium de L. edodes cultivé en FMS.
De plus la conclusion principale de l’étude sur l’évaluation des facteurs de culture est
que le taux d’inoculation est le facteur le plus important de la réussite de la culture de
L. edodes sur le SOS. Il serait intéressant d’envisager la production de l’inoculum sur des
sous-produits agricoles comme la bagasse de canne à sucre et le son de blé, afin de réduire le
coût de production de l’inoculum.
151

Conclusions et perspectives
La mise au point du prototype du respiromètre « PNEO » a permis de suivre
l’évolution de la production de CO2 par L. edodes Le119 cultivé sur le SOS en FMS. On peut
envisager d’ajouter d’autres détecteurs pour élargir le champ d’application de ce nouveau
dispositif essentiel au suivi en ligne de la croissance et la respirométrie des champignons
filamenteux.
L’association des phases d’activités biologiques (respirométrie, activité enzymatique)
avec des phases de dégradation des constituants principaux du SOS a permis de conclure que
la croissance de L. edodes Le119 sur le SOS n’est pas continue et mériterait d’être modélisée
pour pouvoir orienter cette culture dans des applications biotechnologiques telles que
l’enrichissement en protéines du SOS, la production d’un cocktail enzymatique et la culture
des microorganismes en général.
Ces résultats prometteurs doivent être validés à l’échelle pilote en particulier pour la
production de carpophores. Cette technique de préparation du substrat SOS couplée à une
culture de champignons comestibles et médicinaux ouvre des perspectives très intéressantes
d’une part pour diminuer la pollution autour des moulins de trituration d’olive et, d’autre part,
pour contribuer au développement durable du secteur oléicole non seulement pour le Maroc,
mais aussi pour les autres pays méditerranéens.
152

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Culture du Lentinula edodes (Berk.) Pegler sur résidus oléicoles en fermentation en
milieu solide : Transformation des polyphénols des margines
Résume :
L’objectif du travail a été d’étudier la valorisation de sous-produits oléicoles au Maroc par la culture
en fermentation en milieu solide de champignons comestibles avec une double finalité: (i) la
production de la biomasse fongique pour l’alimentation humaine et (ii) la détoxification des margines
par la dégradation des composés phénoliques. A partir de seize souches de L. edodes, une souche
performante à la détoxification des margines a été sélectionnée pour mener la culture de L. edodes. La
production de l’inoculum sur les grains de blé (spawn) a été optimisée. Un mélange des substrats
oléicoles solides (SOS), composé de bois de taille d’olivier, de grignons d’olive et de margines, a été
mis au point et les conditions de croissance de L. edodes sur ce mélange ont été optimisées. Le
changement de la matière organique durant le développement de L. edodes sur le mélange dans des
conditions optimales a été analysé par les techniques spectroscopiques de la RMN solide du 13 C
couplées aux analyses biochimiques. Une technique de séchage solaire sous serre a été mise au point
permettant la réduction en volume et le conditionnement des grignons d’olives mélangés aux
margines. De ce travail, nous concluons la possibilité de valoriser l’ensemble des co-produits de
l’industrie oléicole par la culture de L. edodes permettant, d’une part, la production d’une biomasse
mycélienne importante et, d’autre part, la dégradation des composés phénoliques présents dans les
margines. Ces résultats novateurs ouvrent des perspectives sérieuses pour la production de L. edodes
sur le SOS.
Mots clés : Industrie oléicole, Bois de taille, Grignons d’olive, Margines, Lentinula edodes,
Fermentation en milieu solide, Enzymes
Culture of Lentinula edodes (Berk.) Pegler on olive résidues in solid state fermentation:
Transformation of polyphenols existing in olive mill wastewater
Abstract :
The main objective of this research was to study the recovery of olive by-products in Morocco by
culturing, in solid state fermentation (SSF), of edible mushroom having double purpose: (i) production
of fungal mycelial biomass for food and (ii) detoxification of olive mill wastewater (OMW) by
degradation of phenolic compounds. From sixteen strains of L. edodes, one efficient strain for OMW
detoxification was selected to perform further experimental work in SSF. The production of L. edodes
spawn was optimized. Mixture of solid olive substrate (SOS), including olive twigs, leaves, olive cake
and OMW, was developed and the growth conditions of L. edodes on this mixture was then optimized.
The change in organic matter of SOS during L. edodes growth under optimal conditions was analyzed
using solid state 13C NMR technique combined to biochemical analysis. A solar drying in greenhouse
was developed in order to reduce the volume of OMW and to store the OC mixed to OMW. In this
work, we conclude the possibility to valorize all co-products of olive industry by growing L. edodes,
firstly, for production of high mycelial biomass, on the other hand, degradation of phenolic
compounds existing in OMW. These results open up the possibility to produce L. edodes on SOS.
Key words: Olive industry, Olive tree pruning, Olive cake, Olive mill wastewater, Lentinula edodes,
Solid state fermentation, Enzymes
Discipline: Biologie des populations et Ecologie
U.F.R Faculté des Sciences et Techniques, IMEP Equipe d’Ecologie Microbienne, CNRS UMR 6116,
Service 441, Avenue Escadrille Normandie-Niémen F13397, Marseille cedex 20