(Thèse partie 1)

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Matériel et Méthodes
L’équilibrage de l’hydroxyapatite est effectué par répartition d’1 ml d’hydroxyapatite à 0,1
% (p/v) par eppendorf. La phase aqueuse est éliminée et le dépôt est rincé avec 1 ml de
tampon phosphate 0,14 M et 0,2 % (p/v) SDS. Le surnageant est éliminé après
centrifugation à 13 000 rpm pendant 1 minute. Cette opération est répétée trois fois.
Addition de 200 l par eppendorf d’hydroxyapatite. On élimine le surnageant après une
centrifugation à 13 000 rpm pendant 1 minute.
Séparation des brins simples
Deux aliquotes de 50 l de chaque mélange d’ADN sont déposés dans un tube
eppendorf contenant l’hydroxyapatite équilibrée. On mélange doucement et on incube à Tm
- 35°C pendant 30 minutes. Le surnageant est récupéré après centrifugation à 13 000 rpm
pendant 1 minute. Les eppendorf à hydroxyapatite reçoivent chacun 450 l de tampon
phosphate 0,14 M et 0,2 % (p/v). On mélange doucement et on incube à Tm - 35°C
pendant 5 minutes. Le surnageant est récupéré et rajouté au précédent après une
centrifugation dans les mêmes conditions. On ajoute 500 µl du tampon précédent, on
mélange et on incube dans les mêmes conditions. Le surnageant récupéré est rajouté aux
précédents.
Séparation des doubles brins
Les eppendorf à hydroxyapatite précédents reçoivent chacun 200 µl de tampon
phosphate 0,4 M. On mélange rapidement et on centrifuge à 13 000 rpm pendant 1 minute.
Les surnageants sont transférés dans de nouveaux eppendorfs. On ajoute 200 l du même
tampon aux eppendorf à hydroxyapatite. Après mélange rapide, on centrifuge. On récupère
le surnageant qui est additionné au précédent.
La réalisation de la droite étalon
Une courbe étalon est élaborée, 4 l d’une solution d’ADN marqué à une
concentration de 5 ng/µl sont mélangés avec 800 l de tampon phosphate 0,14 M et 0,2 %
SDS (p/v) (solution mère). Une série de dilution décimale est effectuée. Les tubes
d’eppendorf de la courbe d’étalonnage (solution mère et dilutions) et ceux contenant les