(Thèse partie 1)
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Matériel et Méthodes<br />
L’équilibrage de l’hydroxyapatite est effectué par répartition d’1 ml d’hydroxyapatite à 0,1<br />
% (p/v) par eppendorf. La phase aqueuse est éliminée et le dépôt est rincé avec 1 ml de<br />
tampon phosphate 0,14 M et 0,2 % (p/v) SDS. Le surnageant est éliminé après<br />
centrifugation à 13 000 rpm pendant 1 minute. Cette opération est répétée trois fois.<br />
Addition de 200 l par eppendorf d’hydroxyapatite. On élimine le surnageant après une<br />
centrifugation à 13 000 rpm pendant 1 minute.<br />
Séparation des brins simples<br />
Deux aliquotes de 50 l de chaque mélange d’ADN sont déposés dans un tube<br />
eppendorf contenant l’hydroxyapatite équilibrée. On mélange doucement et on incube à Tm<br />
- 35°C pendant 30 minutes. Le surnageant est récupéré après centrifugation à 13 000 rpm<br />
pendant 1 minute. Les eppendorf à hydroxyapatite reçoivent chacun 450 l de tampon<br />
phosphate 0,14 M et 0,2 % (p/v). On mélange doucement et on incube à Tm - 35°C<br />
pendant 5 minutes. Le surnageant est récupéré et rajouté au précédent après une<br />
centrifugation dans les mêmes conditions. On ajoute 500 µl du tampon précédent, on<br />
mélange et on incube dans les mêmes conditions. Le surnageant récupéré est rajouté aux<br />
précédents.<br />
Séparation des doubles brins<br />
Les eppendorf à hydroxyapatite précédents reçoivent chacun 200 µl de tampon<br />
phosphate 0,4 M. On mélange rapidement et on centrifuge à 13 000 rpm pendant 1 minute.<br />
Les surnageants sont transférés dans de nouveaux eppendorfs. On ajoute 200 l du même<br />
tampon aux eppendorf à hydroxyapatite. Après mélange rapide, on centrifuge. On récupère<br />
le surnageant qui est additionné au précédent.<br />
La réalisation de la droite étalon<br />
Une courbe étalon est élaborée, 4 l d’une solution d’ADN marqué à une<br />
concentration de 5 ng/µl sont mélangés avec 800 l de tampon phosphate 0,14 M et 0,2 %<br />
SDS (p/v) (solution mère). Une série de dilution décimale est effectuée. Les tubes<br />
d’eppendorf de la courbe d’étalonnage (solution mère et dilutions) et ceux contenant les