(Thèse partie 1)

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Matériel et Méthodes
* : la sonde a été préalablement dénaturée à 100 °C pendant 10 minutes et conservée sur
glace avant son dépôt.
Pour détecter le marquage, les puits sont rincés avec 200 µl de tampon 1 (Annexe 6)
chacun puis séchés. Cette opération est répétée trois fois. On dépose 200 l d’une solution
de détection (Annexe 6) par puit. On incube à température ambiante avec agitation pendant
1 heure.
Le marquage est révélé par élimination de la solution de détection des puits. On rince les
puits avec 200 µl de tampon 1 chacun suivi d’un séchage. On ajoute 250 l de la solution
de révélation (Annexe 6) et on incube à 37°C. La lecture est faite dans le lecteur d’ELISA
à 405 nm après développement de la couleur jaune.
Hybridation
Elle est réalisée en tubes eppendorf à température au dessous de la Tm de l’ADN de la
souche à étudier et dont le mélange est constitué de 15 g ADN (0,3 g / l) et 8 l d’ADN
marqué. Un des tubes eppendorf a reçu le mélange formé par l’ADN marqué et son
homologue non marqué et les autres contiennent l’ADN marqué et celui provenant de la
souche avec laquelle a lieu l’hybridation. Les tubes contenant les solutions sont portés à
100°C durant 10 minutes puis placés immédiatement sur la glace pendant 10 minutes.
Après centrifugation, on ajoute 28 l de tampon phosphate 1 M et on complète le mélange
à 100 l avec de l’eau MilliQ. Le mélange est recouvert d’une goutte d’huile de paraffine
et l’hybridation se déroule durant 16 heures à une température T*(°C) au dessous de la Tm.
La purification de l’ADN est effectuée par élimination de toute l’huile et le mélange est
transféré dan un nouveau tube eppendorf. Le volume est estimé à l’aide d’une micro-
pipette puis on lui ajoute un volume égal d’eau MilliQ. La séparation des simples brins des
doubles est faite sur un support d’hydroxyapatite (HA) équilibrée. Les brins simples sont
élués par le tampon phosphate 0,14 M (pH 6,8) et les doubles brins par le tampon
phosphate à 0,36 M.
T* (°C) = Tm (°C) – 30 (°C)