(Thèse partie 1)

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Matériel et Méthodes
comparaison des quantités de radioactivités éluées respectivement avec les tampons 0,14
M et 0,4 M, permet de calculer le pourcentage d’hybridation.
La méthode utilisée est celle du DIG-DNA Labeling and detection kit (Boehringer
Mannheim Nick) décrite par Ziemke et al. (1998) et qui est une modification de la
technique de Lind et Ursing (1986). Elle consiste à faire un double marquage de la sonde
(sonde « froide ») par la digoxygénine-11-2’-dioxy-uridine-5’-triphosphate (DIG-11-
dUTP) et la biotine 16-2’-dioxy-uridine-5’-triphosphate (biotine-16-dUTP). La détection
s’est basée sur l’utilisation d’anticorps anti-digoxygénine ayant une activité phosphatase
alcaline (Anti-DIG-AP) qui se fixent sur des dNTP marqués à la digoxygénine (DIG)
contenus dans la sonde. La phosphatase alcaline provoque l’apparition d’un précipité
coloré (jaune) après réaction avec un substrat, le para-nitrophénylephosphate, révélant ainsi
le fragment nucléotidique recherché.
Préparation de la sonde
Les sondes sont obtenues par extraction de l’ADN génomique de la souche à
hybrider. Le marquage de cet ADN se fait en tubes eppendorf de 1,5 ml. Dans lequel sont
introduits 3 l d’ADN (0,3 g/ l), 5 l de mélange de nucléotides, 1 l de Tampon 10X et
1 l d’enzyme.
Le mélange de nucléotide est constitué de 3 volumes de dATP, 3 volumes de dCTP, 3
volumes de dGTP, 2 volumes de dTTP et 1 volume de dUTP (marqué avec 0,75 par la
digoxygénine et 0,25 par la biotine). Les tubes eppendorf sont incubés à 15°C pendant 90
minutes.
Après incubation et pour précipiter la sonde, 390 l d’eau MilliQ, 45 l d’acétate-Na (3 M
pH 5,2) et 890 l d’éthanol froid sont ajoutés au mélange précédent. L’ensemble est placé
à – 20 °C pendant 24 heures puis centrifugé à 13 000 rpm pendant 15 minutes. Le
surnageant est éliminé et le culot est resuspendu dans 500 µl d’éthanol froid à 70 % (v/v).
Le tout est centrifugé à 13 000 rpm durant 15 minutes. Le culot est séché puis dissous dans
100 µl d’eau MilliQ.
La vérification du marquage est faite en plaques de streptavidine (Streptavidin-Coated
Microtiter Plates, Boehringer cat. 1645692). On dépose sur la plaque, par puit, 200 l de
tampon phosphate (0,14 M et 0,2 % SDS à pH 6,8), 5 l d’albumine à 4 % (p/v) et 2 l de
sonde. La plaque est incubée à température ambiante avec agitation pendant 1 heure.