(Thèse partie 1)

Tableau 9. Cycles employés.
Paires
d’amorces
Pré
dénaturation
73
Matériel et Méthodes
Dénaturation Association Elongation Fin
F8/1462R 1 min à 94°C 1 min à 55°C 2 min à
72°C
21F/1525R 5 min à 94°C 30s à 95°C 1 min à 53°C 1 min 30s à
72°C
16F27/1525R 5 min à 95°C 30s à 95°C 1 min à 55°C 1 min 30S à
72°C
d’amplification
10 min à 72°C
1 min à 72°C
1 min à 72°C
Electrophorèse sur gel d’agarose et purification des produits de la PCR
Pour s’assurer de la qualité et de la spécificité de l’amplification, une électrophorèse
des produits de PCR est effectuée sur un gel d’agarose-TAE (Tris-HCl 1,6 mM ; acétate de
sodium 1,6 mM ; EDTA 0,04 mM (pH 8) ; agarose 1 % (p/v) ; bromure d’éthydium (0,5
µg/µl). Les produits de la PCR sont additionnés de 0,1 % d’une solution de dépôt (bleu de
bromophénol 0,25 % (p/v) ; xylène cyanol 0,25 % (p/v) ; EDTA 25 mM ; glycérol 50 %
(v/v)). La migration se fait dans un tampon TAE, sous une tension de 100 volts.
L’électrophorèse est suivie grâce au dépôt dans un puit d’un marqueur ou « ladder »
(Amplisize TM Molecular Ruler de 2000 à 50 paires de bases). Les fragments d’ADN sont
visibles aux UV à 300 nm grâce aux BET contenu dans le gel et qui s’insère entre les
plateaux de base de l’ADN. Le gel est ensuite photographié sur une table UV.
Le séquençage de l’ADN produit par PCR nécessite une étape de purification
éliminant les impuretés consécutives aux réactions antérieures. Dans ce but, nous avons
utilisé les MicroSpin Columns (Microcon-100 concentrator, Amicon) qui permettent de
récupérer 50 à 90 % de l’ADN initialement présent avec un taux de pureté de 70 à 90 %,
selon les estimations du fabricant.
La réaction de séquence et le séquençage