(Thèse partie 1)

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Matériel et Méthodes
reverse 1525R (McGenity et al., 1998). Pour les bactéries, les amorces utilisées pour
l’amplification du gène de l’ARNr 16S sont 16F27 et 1525R, décrits par (Saiki et al.,
1988) (Tableau 7).
Tableau 7. Spécificité et description des amorces d’amplification.
Amorces Localisation Séquence Spécificité
Sens
F8
21F
16F27
Sens
1462R
1525R
Forward (8-
29)
(7-26)
(8-27)
Reverse
(1462-1441)
(1541-1525)
5’-TTGATCCTGCCGGAGGCCATTC-3’
5’- TTCCGGTTGATCCTGCCGGA -3’
5’ - AGAGTTTGATCMTGGCTCAG -3’
5’- ATCCAGCCGCAGATTCCCCTAC -3’
5’ - AAGGAGGTGATCCAGCC -3’
Archaea
+
+
Bacteria
Tm est définie comme la température de fusion du primer et estimée par l’équation de
Suggs et al. (1981).
NG+C NA+T est la somme des nucléotides A, C, G et T.
L’amplification est réalisée pour un volume de 50 µl dans un thermocycleur de type
Perkin-Elmer Modèle 480 selon les cycles correspondant à chaque paire d’amorces. La
composition du milieu de réaction et les cycles employés figurent les tableaux 8 et 9.
Tableau 8. Mélange réactionnel.
Tm = 4NG+C + 2NA+T
Composés Volumes ( l)
ADN 1
Tampon (100 mM Tris/HCl, pH 8,3 ; 500 mM KCl) (Perkin Elmer) 5
MgCl2 (25 mM) (Perkin Elmer) 3
Taq polymérase (Amplitaq DNA polymerase, Perkin Elmer) 0,25
dNTPs (Ultrapure dNTP set, Pharmacia Biotech, cat. 27-2035-01) 1
Amorce F (20 pmol/ l) (Perkin Elmer) 1
Amorce R (20 pmol/ l) (Perkin Elmer) 1
Eau MilliQ 38,75
+
+
+
+