(Thèse partie 1)

3. 7. 3. Détermination du contenu en G+C de l’ADN génomique
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Matériel et Méthodes
Le contenu en guanine et cytosine de l’ADN génomique des souches est déterminé
par la méthode de dénaturation thermique selon Marmur et Doty (1962). En effet, lorsque
l’ADN natif est soumis à un agent dénaturant comme la température, la double hélice se
sépare. Cette modification se traduit par une augmentation de l’absorbance à 260 nm. Un
système analyseur ; programmateur de température et enregistreur de type recorder R 100A
couplé à un spectrophotomètre de type Perkin-Elmer UV-Vis Lambda 3B a été utilisé. Il
permet de suivre les variations de densité optique de la solution de l’ADN en fonction de la
température. La température de fusion Tm « pour melting temperature » est celle qui
correspond à une augmentation de la DO atteignant 50 % de la DO maximale. Elle est
déterminée par la méthode graphique décrite par Ferragut et Leclerc (1976). Le contenu en
G+C est calculé à partir du Tm selon l’équation de Owen et Hill (1979) dans un tampon
SSC 1× (0,15 M NaCl et 0,015 M tri-sodium citrate, pH 7,0).
Tm = 69,3 + 0,41 (G+C)
3. 7. 4. La Réaction de Polymérisation en Chaîne ou technique PCR
La PCR (Polymerase Chain Reaction) consiste à amplifier sélectivement une
séquence particulière d’ADN par action d’une ADN polymérase thermostable.
L’amplification s’effectue sur un fragment d’ADN à partir de deux amorces
oligonucléotidiques s’appariant spécifiquement aux extrémités des deux brins
complémentaires qui délimitent la partie d’ADN à amplifier.
Amplification des séquences des ADNr
Le marqueur moléculaire choisi dans cette étude phylogénétique est le gène
ribosomal 16S. Très représenté dans les banques de données, ce marqueur nous permettra
d’affilier nos séquences à un groupe d’organismes connus.
Les gènes codant l’ARN ribosomal 16S des haloarchaea sont amplifiés par utilisation de
deux paires d’amorces (ou primers) : le premier jeux : amorce directe F8 et la reverse
1462R (Lizama et al., 2002) et le second jeux d’amorce : directe 21F (DeLong, 1992) et la