(Thèse partie 1)

Technique 1 (Marmur, 1961)
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Matériel et Méthodes
Les cellules contenues dans 200 ml de culture ont été récupérées par centrifugation à
4°C pendant 15 minutes à 8 000 rpm. Le culot est lavé deux fois par une solution de NaCl
à 25 % (p/v) suivi de centrifugation dans les conditions déjà décrites. Le culot est dissous
dans 50 ml d’eau MilliQ stérile additionné de SDS à 25 % (p/v) pour avoir une
concentration finale de 1 %. Le tout est placé dans un bain marie à 60°C pendant 10
minutes. Les lysats sont placés sur la glace. Une solution de NaCl 5 M est rajoutée pour
avoir une concentration finale de 1 M. On ajoute 1 volume de chloroforme et l’ensemble es
centrifugé à 7 000 rpm pendant 15 minutes. 0,1 volume d’acétate-Na (3 M, pH 5,2) et 2
volumes d’éthanol froid sont rajoutés au surnageant. Le tout est placé à - 20°C durant 30
minutes. La pelote est récupérée et resuspendue dans 4 ml de 0,1 × SSC puis 20 × SSC
pour avoir une concentration finale de 1 M. Ajouter 100 µl d’une solution d’ARNase (60
µg/ml) et le tout est incubé pendant 2 heures à 60°C. Ajouter 50 µl d’une solution de
protéinase K (10 mg/ml) et le tout est incubé à 37°C pour 1 heure. Un volume de
chloroforme est ajouté, suivi d’une centrifugation à 3 200 rpm pendant 10 minutes pour
séparer entre les deux phases. Le surnageant est récupéré dans un nouveau tube et l’ADN
est extrait par 0,1 volume d’acétate-Na (3 M pH 5,2) et 0,56 volume d’isopropanyl.
L’ADN libéré est dissout dans 500 µl d’eau MilliQ. L’ADN a été purifié par une extraction
avec 250 µl de phénol et 250 µl de chloroforme suivi d’une centrifugation à 13 000 rpm
pendant 5 minutes. Le surnageant est précipité par 0,1 volume d’acétate-Na (3 M pH 5,2)
et 2 volumes d’éthanol absolu froid. Le tout est placé à - 20°C durant 24 heures. L’ADN a
été obtenu sous forme de culot suite à une centrifugation à 13 000 rpm pendant 15 minutes
Le culot est resuspendu dans 500 µl d’éthanol 70 % (v/v) (lavage de l’ADN et élimination
des sels). Centrifugation pendant 15 minutes à 13 000 rpm. Le culot d’ADN est séché à
l’air à température ambiante, repris dans 500 µl d’eau MilliQ stérile et conservé à - 20°C.
Technique 2 (Marmur, 1961 modifiée par Lind & Ursing, 1986)
La seconde méthode d’extraction et de purification de l’ADN utilisée est celle décrite
par Lind et Ursing (1986) qui une est une modification de la technique de Marmur (1961)
et applicable aux halobactéries.
200 ml de culture en phase exponentielle sont centrifugés durant 20 minutes à 9 000 rpm
et à 4°C dans une centrifugeuse de type Sorvall RC 5B. Le culot est lavé deux fois par une