(Thèse partie 1)

3. 6. 2. Extraction et caractérisation de la bactériorubérine
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Matériel et Méthodes
La bactériorubérine est présente chez les haloarchaea et peut être extraite et
caractérisée. C’est un type de lipides neutres, dérivé isoprénoïde. Cette analyse a été
effectuée selon la technique décrite par Gochnauer et al. (1972).
20 ml d’une culture en phase exponentielle est centrifugée pendant 10 minutes à 12 000 ×
g. Le pellet est extrait par 1 ml d’un mélange méthanol-acétone 1 : 1 (v/v). Après 4 heures
d’agitation, le spectre d’absorption du mélange est déterminé par un spectrophotomètre sur
une longueur d’onde de 300 à 700 nm.
3. 6. 3. Analyse des acides gras membranaires bactériens
L’analyse des acides gras de la souche bactérienne B2 a été effectuée par l’équipe du
Professeur Reiner M. Kroppenstedt du DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
und Zellkulturen) à partir de cellules lyophilisées et broyées sous forme de poudre. La
poudre est traitée par un mélange de chloroforme-méthanol (80-20, v/v), puis le résidu subi
une méthanolyse en milieu basique par addition de 20 ml de méthanol-KOH (1M). Le
mélange est mis à reflux pendant deux heures.
La partie insoluble est filtrée et rincée avec 20 ml de méthanol. Au filtrat, on ajoute 120 ml
d’HCl à 10 % et 120 ml d’eau. Les lipides libérés par attaque basique et incluant les esters
méthyliques d’acides gras sont ensuite extraits du milieu réactionnel (à raison d’un aliquote
de 50 ml) par 150 ml d’heptane. La phase organique est lavée à l’eau jusqu’à pH neutre.
Elle est ensuite récupérée dans un erlenmeyer, et séchée par addition de 50 g de sulfate de
sodium. Après filtration et évaporation du solvant, le produit est repris dans environ 5 ml
d’heptane. Cette fraction est prête pour l’analyse en chromatographie en phase gazeuse.
Les esters méthylés des acides gras ont été identifiés en comparant les temps de rétention
d’acides gras connus.
3. 7. Etude phylogénétique
3. 7. 1. Extraction de l’ADN total