(Thèse partie 1)

2. Isolement, purification et conservation des souches
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Matériel et Méthodes
Des approches culturales et moléculaires ont été étudiées afin d’identifier la
microflore isolée de la sebkha Ezzemoul. Les prélèvements ont été effectués au niveau des
bassins de concentration et de cristallisation du sel.
2. 1. Composition chimique des milieux de cultures utilisés
Il est connu que les bactéries hyperhalophiles ont des exigences nutritionnelles
variables et leur étude nécessite l’utilisation de plus d’un milieu de culture (Oren et al.,
1997). Une dizaine de milieux spécifiques aux procaryotes neutrophiles et alcalophiles a
été utilisés au départ avant d’opter pour sept milieux de culture. Ces milieux contiennent
des sels minéraux, une source organique complexe (extrait de levure, casaminoacide…),
des acides organiques et/ou des sucres (Tableau 5-Annexe 3). Ils sont conçus pour cultiver
le plus grand nombre de procaryotes halophiles aérobies. Ces milieux ont servi, à la fois,
pour l’isolement, et aussi de base pour les tests d’identification physiologique, biochimique
et génétique.
Les milieux de culture solides sont obtenus par addition de 20 g.l -1 d’Agar-Agar aux
milieux liquides et stérilisés à 120°C pendant 20 minutes. Le pH est ajusté à 7,0 à l’aide
d’une solution de NaOH 4 M.
2. 2. Isolement
L’isolement a été effectué par étalement de 0,1 ml sur boite de l’échantillon ou de ses
dilutions. Ces dernières ont été effectuées en inoculant 9 ml d’une solution de NaCl à 20 %
(p/v) avec 1 ml d’échantillon.
2. 3. Conservation des souches
De chaque milieu, huit à neuf colonies d’aspect différent ont été prélevées au et
purifiées par stries sur les même de milieux solides. Les souches pures sont conservées sur