Denis LE PASLIER - CNRS

Bouche d’égout de la Cloaca maxima
se jetant dans le Tibre
Si la légende dit que lorsque l’on met la main dans la Bouche de la Vérité, on ne peut l’en
ressortir que si l’on n’a jamais menti…
Il en est fait une fonction beaucoup plus terre à terre qui lui fut assignée par le passé: celle d’une
bouche d’égout de la Cloaca maxima ̏ le très grand égout˝ construit pour assécher la vallée du
Forum Romain, dont la construction a été entreprise par Tarquin l’Ancien (Lucius Tarquinius
Priscus, 5 ème Roi de Rome, 534 à 509 av. J-C.)

Cloaca maxima
rencontre entre les anciens et les modernes
Denis Le Paslier
Ecole Thématique Expert Génomique Environnementale (ETEGE)
23 - 27 Avril 2012, Aussois

Depuis les Romains le traitement des eaux a évolué…

Traitements
primaires
eau
ésiduaire
Décanteur
primaire
Principe de l’épuration
Traitement des eaux
Bassins
biologiques
Recirculation
Traitement des boues
digestion anaérobie
Clarificateur
secondaire
Extraction
des boues en excès
eau traitée
boues traitées

Flottateur
Décanteur
primaire
Bassin
d'anoxie Bassin aérobie
Digesteur

Inventaire des microorganismes
Inventaire des gènes
Objectifs
Inventaire des activités enzymatiques
Quels sont les processus métaboliques impliqués dans le traitement des eaux,
avec un intérêt particulier pour la digestion anaérobie

Un inventaire moléculaire a été réalisé par l’approche classique de
clonage et séquençage de produits PCR ciblant l’ADNr 16S :
trois principaux bassins : aérobie
anoxie
digesteur anaérobie mésophile
avec amorces spécifiques : Archaea, Bacteria, Planctomycetales,
Acidobacteria, Verrucomicrobia, WS6, BRC1
une grande diversité d’Archaea et Bacteries
nouvelles lignées phylogénétiques et
nouvelles divisions candidates bactériennes
Chouari et al., Microb. Ecol. 2010
Chouari et al., Environ. Microbiol. 2005
Chouari et al., Appl. Environ. Microbiol. 2005
Chouari et al., Appl. Environ. Microbiol. 2003

Bassin aérobie
BACs
> 564 000 clones -> 330 K lectures
taille moyenne 60 kb
Digesteur anaérobie mésophile
Fosmides
1 M clones -> 1,8 M lectures
plasmides 3kb -> 1 M lectures

5
4
3
2
1
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
G + C % distribution
FES
PES
GS-FLX
454

Hypothèse : existe-t-il d’autres divisions bactériennes inconnues?
Hybridations
Sondes oligonucléotidiques (ex: Eub338 I, II, III …)
Sondes complexes (ADNr 16S à partir de pools de produits PCR
représentatifs des différentes divisions bactériennes
(Archaea, Planctomycetales, OP11, WS6 etc …)
Digesteur anaérobie 1 membrane (27 648 Fosmides)
599 fosmides
séquençage direct à partir de 4 amorces
8 330 1100 1517

40
35
30
25
20
15
10
5
0
16S rRNA gene distribution
Archara + 40 divisions bactériennes
%FES
%PES
%FOS
%FLX
r454%

Découverte d’une nouvelle division bactérienne : WWE3
Séquençage ADNr 16S (avec amorces universelles) ne donne rien sur 30 fosmides
Séquençage d’un de ces fosmides : contient un ADNr 16S (et 23S)
Cet ADNr 16S ne peut être amplifié ni séquencé par amorces universelles car Il y a au moins deux
mis-appariements avec ces amorces
Ces 30 fosmides ont la même séquence d’ADNr 16S
WWE3 représente 5% des fosmides (5% des bactéries?)
Une seule séquence similaire dans les bases de données (88% d’identité)
Amorces spécifiques pour PCR et FISH : détecté dans 20 / 48 digesteurs testés

40
35
30
25
20
15
10
5
0
%FES
%PES
%FOS
%FLX
r454%

WWE1: une nouvelle division candidate bactérienne
10% des ADNr 16S
séquençage de fosmides "16S"
recherche de séquences
d’extrémité de fosmides
chevauchantes
(Blastn2, RI 99% & RZ 0,9)
couverture homogène et élevée
(10 à 15 X)
Il devrait être possible d’assembler
de grands fragments de génome
d’un représentant de cette
division candidate

Assemblage itératif
(. . .)
≥ 99% identité & ≥ 90% longueur lecture
1. ancrage : fosmide
2. lectures ancres
3. lectures opposées
4. assemblage
5. sélection des contigs
6. itérations...

"Candidatus Cloacamonas aminacidovorans" (2,2% des FES)
a disparu du digesteur d’Evry depuis la construction de la banque de fosmides
Mais a réapparu et disparu plusieurs fois depuis
Cloacamonas a été détecté par PCR dans 13 / 43 digesteurs anaérobies testés
(Amérique, Europe) et d’autres représentants de la division candidate WWE1 dans 32
/ 43
A été maintenu en culture pendant plus de 2 ans, mais toujours en très faible quantité

lectures
Assemblage
taille
moyenne
(pb)
N
lectures
%
assemblées
Fosmides 40 kb FES 645 1,8E+06 48
pCNS 3 kb PES 662 1,0E+06 47
454 FLX 231 3,4E+05 26
contigs supercontigs
Nombre 7495 2827
total Mb 75 102
taille moyenne (kb) 10 36
plus grand (kb) 894 5705
30 supercontigs plus grands que 500 kb

Digesteur anaérobie Evry
Library sequence # reads average in assembly fraction assembled
size bp RI>=99 & RZ >= 0,9 Arachne
Fosmid FES 1,7 M 645.3 40.1% 47.6
Plasmid PES 1 M 665.6 41.7% 46.8
GS-FLX 342 K 231.5 11.5% 26.2
7495 contigs organisés en 2827 scaffolds (75 Mb total)
40 -50 % FES dans assemblage Arachne
Sondes choisies 50% FES dans assemblage Arachne

SC_Id Mb GC% Organism
0 5,7 0,62 Methanomicrobiales xxx Archaea
1 4,6 0,49 Bacteroidetes xxx 16S rDNA
2 3,7 0,64 Betaproteobacteria xxx protéines ribosomales
3 3,0 0,62 Verruvomicrobiales inconnus
4 2,8 0,40 Bacteroidetes
5 2,8 0,52 Methanosarcinales
6 2,2 0,38 Cloacamonas
7 2,2 0,66 Actinobacteria
8 2,1 0,66 Actinobacteria
9 2,2 0,56 Deltaproteobacteria
10 1,9 0,57 Synergistetes
11 2,0 0,58 Methanomicrobiales
12 1,6 0,55 Deltaproteobacteria
13 1,1 0,55
14 1,7 0,42 Methanomicrobiales
15 1,3 0,40 WWE1
16 0,9 0,57
17 0,7 0,39 OD1
18 0,7 0,35 WWE3
19 0,9 0,49
20 0,6 0,35 WS6
21 0,6 0,47
22 0,5 0,49
23 0,6 0,40 ZB2
25 0,5 0,35
26 0,7 0,50 Betaproteobacteria
28 0,6 0,58
33 0,6 0,44
36 0,7 0,56
41 0,6 0,48
4 Archaea
6 divisions candidates
10 affiliation inconnue !
Annotation MaGe

8 scaff

Sequence capture : un outil pour la métagénomique ?

Un des problèmes majeurs en génétique humaine : le séquençage de nombreux génomes
Coût du séquençage en baisse
Projet 1000 génomes etc.
1000 US$
Première approche : séquençage exome (30 Mb, 85% mutations responsables maladies génétiques)
Stratégie développée par Roche Nimblegen: Direct Genomic Selection (DGS)
the Sequence Capture Human Exome 2.1M Array to capture ~ 180,000 coding exons
=> Application à la métagénomique ex: MetaHit 3,9 M génes = 1,5 M incomplets
qques ref:
Basiardes S et al., (2005) Direct Genomic Selection. Nature Methods 1, 63-69.
Kahvejian A et al., (2008) What would you do if you could sequence everything? Nature Biotechnology 26, 1125 - 1133.
Mamanova et al., (2010) Target-enrichment strategies for nextgeneration sequencing, Nature methods 2010
Feb;7(2):111-8
Biesecker L. (2010) Exome sequencing makes medical genomics a reality. Nature Genetics. 42:13-14.

ADN
18 mars 2002, fosmides, plasmides, GS-FLX
3 µg, shearing, 500 pb sizing
+ adaptors Titanium
amplification (10x) durant séquençage Titanium ou Illumina
Sondes
contigs (gènes incomplets) 10 K
FES 2,4 M
Enlever redondance etc. 6 M sondes
2,1 M spots
50 – 98 bases 70 moyenne

#reads
GC%
FES
capture

FES # Hits
Phage terminase 11601
Phage terminase, large subunit 6699
decarboxylase 6107
Long-chain-fatty-acid--CoA ligase (EC 6.2.1.3) 4988
Glycosyltransferase 4212
GTP-binding protein 3729
Phage terminase large subunit 3622
Integrase 3415
Phage protein 3079
Type I restriction-modification system, restriction subunit R (EC 3.1.21.3) 2400
Capture
decarboxylase 1028
Long-chain-fatty-acid--CoA ligase (EC 6.2.1.3) 925
GTP-binding protein 848
Translation elongation factor G 598
Excinuclease ABC subunit A 585
Glycosyltransferase 564
DNA-directed RNA polymerase beta' subunit (EC 2.7.7.6) 528
Type I restriction-modification system, restriction subunit R (EC 3.1.21.3) 499
DNA-directed RNA polymerase beta subunit (EC 2.7.7.6) 492
Copper-translocating P-type ATPase (EC 3.6.3.4) 459
Top 10 subsystems (élimination de la redondance lors du choix des sondes) MG-RAST

G + C % similaire mais différences
Redondance peu de séquences identiques OK
Elimination "repeats" (sondes) OK
Scaffolding > 150 contigs reliés par captures OK
Séquences nouvelles # 15% OK
Assemblage 90% captures dans assemblage OK
Incomplets + sondes + captures
25 Mb nouveaux contigs OK

Digesteur anaérobie Evry
Library sequence # reads average in assembly fraction assembled
size bp RI>=99 & RZ >= 0,9 Arachne
Fosmid FES 1,7 M 645.3 40.1% 47.6
Plasmid PES 1 M 665.6 41.7% 46.8
GS-FLX 342 K 231.5 11.5% 26.2
7495 contigs organisés en 2827 scaffolds (75 Mb total)
40 -50 % FES dans assemblage Arachne
Sondes choisies 50% FES dans assemblage Arachne

Conclusions
Les stations d’épurations des eaux usées hébergent une grande diversité de
microorganismes dont une grande partie est totalement inconnue
Ces systèmes ne sont pas stables: des divisions entières de bactéries peuvent apparaitre
puis disparaitre (sans doute suite à l’action de phages) et sans que le fonctionnement général
ne semble être modifié
Les banques "grand insert" sont utiles pour identifier des ADNr 16S "exotiques"
De nouvelles divisions bactériennes peuvent être découvertes et caractérisées par des
approches métagénomiques
Il n’est pas impossible de reconstituer le génome complet de bactéries appartenant à des
divisions sans représentant cultivable, même à partir d’un métagénome complexe
Les banques "grand insert" sont très utiles pour les études fonctionnelles
Les séquences métagénomiques permettent la mise en évidence de nouvelles enzymes et
de voies métaboliques alternatives
La capture de séquence peut être un atout pour étendre des gènes incomplets,
relier des contigs entre eux et pour le finishing (génomes complexes, eucaryotes)

Merci pour votre attention

Nicholson & Lindon, Nature, 2008

This urine wheel was
published in 1506 by
Ullrich Pinder, in his book
Epiphanie Medicorum.
It describes the possible colours, smells and tastes of urine, and uses them to diagnose disease.