MASTER 2 - SPÉCIALITÉ "BIOPHYSIQUE" - UPMC

Université PARIS 6 et Université PARIS 7
MASTER 2 - SPÉCIALITÉ
"BIOPHYSIQUE"
Proposition de Stage - Année 2011 – 2012
Sujet du stage (sous forme de titre court) :
Recrutement du complexe WASH à la membrane endosomale
Laboratoire
Nom du Responsable : Jacqueline CHERFILS
Affiliation administrative (CNRS, INSERM...) et n° l'Unité : CNRS UPR 3082
Adresse précise du Laboratoire : Laboratoire d’Enzymologie et Biochimie Structurales
Avenue de la Terrasse
F-91198 GIF-SUR-YVETTE Cedex
Équipe d'accueil des Doctorants
Nom de l'équipe: Cytosquelette et Morphogénèse Celllulaire
Nom du Responsable : Alexis GAUTREAU
École Doctorale de rattachement : ED 426 Gènes, Génome, Cellules (GGC)
Responsable du Stage
Nom : Emmanuèle HELFER
Numéro de téléphone : 01 69 82 34 64
Numéro de télécopie : 01 69 82 31 29
Adresse électronique : Emmanuele.Helfer@lebs.cnrs-gif.fr
Profil de l'étudiant(e) souhaité : Formation en physique, spécialité biophysique,
Intérêt fort pour la biologie,
Bonne aptitude pour le travail expérimental
Renseignements complémentaires
Perspectives de poursuite de thèse : x oui Non
Avec une bourse spécifique : oui x Non
si oui précisez :
Laboratoire d'accueil (Unité CNRS, INSERM, etc..) :
Nombre de chercheurs : 21 (dont 2 dans l'équipe d'accueil)
Nombre d'enseignants- chercheurs : 1 (dont 0 dans l'équipe
d'accueil)
Nombre de "HDR" : 18 (dont 1 dans l'équipe d'accueil)
Nombre d'ITA : 14 (dont 0,5 dans l'équipe d'accueil)
Nombre de "post-docs" : 16 (dont 1 dans l'équipe d'accueil)
Nombre de visiteurs étrangers : 0 (dont dans l'équipe d'accueil)
http://www.master.phys.upmc.fr/S_biophysique/
master.phys.biophys@upmc.fr

Sujet de stage (et principales techniques) :
Mécanisme de recrutement du complexe WASH à la membrane endosomale
Situation du sujet :
Notre équipe cherche à comprendre comment la cellule détermine sa forme et la forme de
ses compartiments internes. Nous savons que les membranes cellulaires sont remodelées
par le cytosquelette d’actine et la force qu'il génère. Le complexe Arp2/3 génère des réseaux
d'actine branchés qui jouent un rôle essentiel dans la formation de structures de migration et
dans le trafic membranaire. Les projets de l’équipe portent sur la caractérisation des
complexes multiprotéiques qui régulent le complexe Arp2/3, et leurs mécanismes de
régulation à l'échelle moléculaire. Ainsi, le complexe WAVE active le complexe Arp2/3 au
niveau de la membrane plasmique en projection, lors de la migration cellulaire. Le complexe
WASH, lui, active le complexe Arp2/3 à la surface des endosomes et permet la fission de
vésicules assurant le transport intracellulaire de molécules importantes. Le projet de stage
porte sur le mécanisme de recrutement du complexe WASH à la membrane des
endosomes.
Projet scientifique :
Nous avons identifié le complexe protéique WASH (nommé WASH par la suite) et montré
qu'il est impliqué dans la fission de vésicules de transport à partir des endosomes. Une autre
équipe a également montré qu'il se lie aux lipides via le domaine U3 de sa sous-unité VPEF.
WASH interagit, via VPEF également, avec le complexe rétromère qui est impliqué dans le
transport rétrograde dans les cellules, mais la nature de cette interaction reste controversée,
notamment quelle partie du complexe est reconnue par WASH. En découpant U3 en
fragments de plus en plus petits, nous avons abouti au fragment U3c qui, lorsqu’il est surexprimé
dans les cellules, suffit à déplacer le WASH endogène. Cette observation prouve que
ce fragment U3c est impliqué dans la liaison à la membrane. Finalement, nous avons
récemment identifié par protéomique une des sous-unités du rétromère associée à U3c, ce qui
confirme que le complexe rétromère est un récepteur possible de WASH via son interaction
avec U3c.
Le but du stage est de comprendre le processus de recrutement de WASH à la
membrane endosomale, par une approche in vitro. Pour cela, nous utiliserons des
vésicules géantes artificielles (GUVs), qui sont observables en microscopie optique, et dont la
composition lipidique sera basée sur celle des endosomes.
1) Nous purifierons les complexes WASH et rétromère avec la technique de purification de
complexes protéiques fonctionnels à partir de lignées cellulaires, une méthode qui a été
établie par l’équipe. Les complexes seront exprimés avec des protéines de fusion GFP ou
mCherry pour pouvoir les observer en microscopie de fluorescence.
2) Nous verrons d’abord si WASH peut se lier directement aux GUVs, sans intermédiaire.
3) Si ce n’est pas le cas, nous ancrerons artificiellement le complexe rétromère à la
membrane, via un tag Histidine qui permettra sa liaison à des lipides Nickel (Ni-NTA-DOGS)
insérés dans la membrane. Nous verrons alors si WASH est ensuite bien recruté sur les
GUVs, confirmant ainsi le rôle du rétromère comme récepteur de WASH.
4) Finalement, le système sera optimisé (composition membranaire des vésicules,
concentration des protéines) pour obtenir les meilleurs taux de recrutement. Cela permettra de
comprendre les paramètres qui contrôlent la liaison de WASH à la membrane des endosomes.
Techniques utilisées :
Fabrication de membranes lipidiques
Purification de protéines, biochimie des protéines
Microscopie optique, analyse d’images
Modélisations / simulations