Sabine Caussanel - EPHE

MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE
ET DE LA RECHERCHE
ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES
Sciences de la Vie et de la Terre
MEMOIRE
présenté
par
CAUSSANEL Sabine
Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes
CONTRIBUTION A L’ETUDE DU ROLE DE CKIP-1 DANS LA DIFFERENCIATION
MUSCULAIRE REGULEE PAR PI3-K – IDENTIFICATION DES ARN MESSAGERS
CORRESPONDANT AUX FORMES DE LA PROTEINE CKIP-1
soutenu le 17 Novembre 2003 devant le jury suivant :
EXBRAYAT Jean-Marie - Président
VAYSSIERE Jean-Luc – Examinateur
GOILLOT Evelyne – Examinateur
DE KERCHOVE Alban - Examinateur
Laboratoire de : Directeur : MIGNOTTE Bernard
Génétique Moléculaire et Physiologique- CNRS UPRES- A8087 – Université Versailles/Saint-
Quentin - mignotte@génétique.uvsq.fr
Laboratoire de : Directeur : BRUN Gilbert
Biologie des Régulations Cellulaires – UMR 5161 CNRS- Ecole Normale Supérieure de Lyon -
egoillot@ens-lyon.fr
CAUSSANEL Sabine – 17 Novembre 2003 – Pr.MIGNOTTE Bernard
CONTRIBUTION À L’ÉTUDE DU RÔLE DE CKIP-1 DANS LA DIFFERENCIATION MUSCULAIRE
RÉGULÉE PAR PI3-K - IDENTIFICATION DES ARN MESSAGERS CORRESPONDANT AUX DEUX
FORMES DE LA PROTÉINE CKIP-1
EPHE Banque de Monographies SVT 1

Au cours de l’étude du rôle de CKIP-1 dans la différenciation musculaire régulée par PI3-K dans la lignée de myoblastes
C2C12, nous avons mis en évidence une nouvelle forme de la protéine CKIP-1. Cette forme a un poids moléculaire de 28kDa
tandis que la protéine entière CKIP-1 a un poids moléculaire de 55kDa. Nous avons réalisé différents mutants de CKIP-1 et
observé que cette forme courte semble correspondre à une protéine CKIP-1 initiée au niveau du deuxième ATG et par
conséquent dépourvue de son domaine pleckstrine. Ce domaine est essentiel à la stimulation de la myogenèse par CKIP-1.
Nous avons caractérisé les ARNm correspondant à ces deux formes en utilisant deux approches expérimentales différentes : la
technique des ARN circulaires et la protection à la RNAse. Nous avons identifié trois populations de transcrits différents
ayant des sites multiples d’initiation de la transcription. Deux d’entre elles ont des sites d’initiation de la transcription situés
en aval du premier codon ATG initiateur.de la traduction et sont donc susceptibles de donner naissance à la forme courte de
CKIP-1 initiée au deuxième ATG. L’analyse de la représentation de ces différentes populations de transcits suggère une
représentation égale des deux protéines dans les cellules C2C12. Ceci a été confirmé en western blot. Ces résultats nous ont
permis de déterminer deux régions pouvant jouer le rôle de régions promotrices. L’analyse de la séquence de ces régions a
révélé des régions riches en GC pouvant correspondre à des régions promotrices de type GC riche dépourvue de boîtes
d’initiation de la transcription comme la boîte TATA ou la boîte CAAT. De plus, cette région possède de nombreux sites Sp-1
qui sont connus pour guider l’initiation de la transcription de gènes ayant des promoteurs dépourvus de boite TATA. En
accord avec nos résultats, ce type de régions promotrices est fréquemment associé à de multiples sites d’initiation.
Mot-Clefs : muscle, différenciation, CKIP-1, promoteurs, ARN messager, protéines.
SOMMAIRE
SOMMAIRE.... …………………………………………………………………………………...3
LISTE DES ABRÉVIATIONS.... ………………………………………………………………...5
INTRODUCTION... ………………………………………………………………………………7
I- Régulation de la Transcription ……………………………………………………………...8
1- Structure d’un gène……........ …………………………………………………………………..8
2- Eléments régulateurs de la transcription dans le promoteur minimal………....... ……………...9
2-1- Promoteur avec boîte TATA (ou boîte Goldberg-Hogness) …………………...... ….9
2-1-1- Mise en place du complexe de pré-initiation de la transcription..... ……….9
2-1-2- Les différentes boîtes pouvant être associée à la boîte TATA .. …………10
2-1-3- Autres éléments initiateurs de la transcription pouvant être associés
à la boîte TATA.. ………………………………………………………………..11
2-1-4- Conclusion …….... ……………………………………………………….12
2-2- Promoteur dépourvu de boîte TATA.... ……………………………………………12
2-2-1- Boîte GC ……….…………………………………………………………12
2-2-2- Rôle de l’Inr en absence de boîte TATA …….…………………………...13
2-2-3- L’élément DPE (Downstream Promoter Element) …….…………………14
2-2-4- L’élément BRE (IIB Recognition Element) ……….……………………..14
2-2-5- Conclusion …………………………………………………………….….15
3- Eléments régulateurs de la transcription dans le promoteur distal…….... ……………………15
II- Maturation des ARN pré-messagers………………………………………………………16
1- La coiffe……………………………………………………………………………………..............
16
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2- La queue polyA……………………………………………………………………….... …….17
3- L’excision-épissage des introns……………………………………………….... …………….17
3-1- mécanisme d’excision-épissage constitutif………...... ………………………………….17
3-2- mécanisme d’épissage alternatif………………………………………………..... ……..18
3-3- Importance de l’épissage alternatif dans la myogenèse………………....... ……………..19
3-3-1- Le facteur de trancription MEF2 et l’intégrine b1………....... ……………19
3-3-2- Anomalie de l’épissage et pathologie musculaire……………………....…21
3-3-2-1- Le gène MTMR1 (myotubularin-related 1) ……………….……21
3-3-2-2- Les gènes IR (Insulin Receptor) et CIC-1 (chloride channel)..... .22
4- Promoteurs alternatifs…….... ………………………………………………………………...23
Utilisation du promoteur spécifique du muscle (pM) de l’Aldolase A………....... ……….23
III- Régions Régulatrices de l’ARN messager …….………………………………………...24
1- Interactions entre la coiffe, la séquence codante et la queue polyA…………………..... …….24
2- Régulation par la coiffe et la queue polyA………..... ………………………………………...26
3- Régulations par la région 5’UTR…..... ………………………………………………………..26
3-1- IRES (Internal Ribosomal Entry Site)...... ………………………………………………27
3-2- uORF (upstream Open Reading Frame)...... ……………………………………………28
3-3- Présence de Structures Secondaires…...... ………………………………………………30
4- Régulations par la région 3’UTR…..... ………………………………………………………..30
4-1- CPE (Cytoplasmic Polyadenylation Element).... ……………………………………...31
4-2- ARE (AU Rich Element).... ……………………………………………………………31
4-3- Présence de Structures Secondaires...... …………………………………………………32
5- Conclusion ………………...... ………………………………………………………………..33
LISTE DES ABREVIATIONS
+1 : site d’initiation de la transcription ou site de démarrage de la transcription
3’UTR : 3’ UnTranslated Region
5’UTR : 5’ UnTranslated Region
A : adénine
ADN : Acide DésoxyriboNucléique
ADNc : Acide DésoxyriboNucléique complémentaire
Apaf-1 : Apoptosis protease activating factor-1
ARE : AU Rich Element
ARN : Acide RiboNucléique
ARNr : Acide RiboNucléique ribosomal
ARNm : Acide RiboNucléique messager
ARNt : Acide RiboNucléique de transfert
ATG : codon d’initiation de la traduction
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AUF1 : AU Factor 1
BRE : IIB Recognition Element
C : Cytosine
CBC : Cap Binding Complex
CBP : Cap Binding Protein
CF : Cleavage Factor
CGRP : Calcitonin Gene Related Peptide
CIC-1 : chloride channel-1
CPE : Cytoplasmic Polyadenylation Element
CPEB : CPE Binding protein
CPSF : Cleavage Polyadenylation Specificity Factor
CstF : Cleavage stimulating Factor
CTF: CCAAT binding Transcription Factor
CUG-BP: CUG-Binding Protein
DM : Dystrophie Myotonique
DPE : Downstream Promoter Element
eIF4-(F, E, A, G) : eukaryotic translation Initiation Factor 4-(F, E, A, G)
G : Guanine
GMP : Guanosine Mono-Phosphate
IGF : Insulin Growth Factor
IGFBP-2 : Insulin-like Growth Factor-Binding Protein-2
IgM : Immunoglobuline M
IR : Insulin Receptor
IRE : Iron Responsive Element
IRES : Internal Ribosomal Entry Site
IRP (1 ou 2) : Iron Responsive Protein (1 ou 2)
MCK : Créatine Kinase Musculaire
MEF2 : Myocyte-specific Enhancer-binding Factor 2
MRF : Myogenic Regulatory Factor
MSE : Muscle-specific Splicing Enhancers
MTMR1 : myotubularin-related 1
NLS : Nuclear Import Signal
PABP (I ou II): PolyA Binding Protein (I ou II)
PAP : PolyA Polymérase
PI3-K : PhosphatidylInositol 3-Kinase
PtdIns: PhosphatidylInositol
R : purine (A, G)
snRNA: small nuclear RNA
T : Thymidine
TAFs : TBP Associated Factors
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TBP : TATA Binding Protein
TFII (A, B, D, E, F, H, J) : Transcriptional Factor II (A, B, D, E, F, H, J)
TfR : Transferrine
U : Uridine
XIAP : X-linked Inhibitor Apoptosis Protein
XLMTM : Myopathie Myotubulaire liée à l’X
Y : pyrimidine (C, U, T)
INTRODUCTION
L’étude de l’expression des gènes nécessite de connaître toutes les zones de régulations
possibles au niveau des gènes et par conséquent des ARN messagers. Il est surprenant de voir qu’un
organisme contenant un nombre de gène défini comporte autant de régulations au niveau moléculaire
et cellulaire. En effet, si l’on prend le cas de l’Homme qui n’a, d’après le séquençage du génome, que
35 000 gènes, on comprend difficilement comment on peut arriver à une complexité moléculaire aussi
grande. Cependant, il a été montré au cours du temps, qu’un même gène pouvait donner naissance à
différents transcrits qui eux-mêmes pouvaient être à l’origine de la synthèse de plusieurs protéines
différentes en fonction des conditions physiologiques et environnementales. Ceci sous-entend que
cette complexité se situe en aval des gènes c’est-à-dire au niveau des étapes de la transcription et de
la traduction.
Effectivement, lors de la transcription d’un même gène, on peut aboutir à plusieurs messagers ;
néanmoins la complexité s’accroît encore chez les Eucaryotes puisque l’on est confronté à une étape
de maturation des messagers. Ainsi chaque pré-messager peut être initié à partir de plusieurs
promoteurs et/ou subir différents épissages alternatifs. Ces étapes peuvent varier en fonction du type
cellulaire ou tissulaire, des conditions physiologiques ou environnementales, ce qui augmente encore
la complexité moléculaire. Cette diversité se poursuit lors de l’étape de traduction. Chaque messager à
la possibilité de donner naissance à plusieurs protéines. La plupart du temps, l’initiation de la
traduction se fait à partir d’un codon AUG. Or, il ne faut toutefois pas exclure les initiations
exceptionnelles se faisant à partir de séquences permettant l’entrée des ribosomes de manière
indépendante au codon AUG comme, par exemple les IRES. Ces deux phénomènes génèrent
plusieurs isoformes protéiques à partir d’un même transcrit.
Toutes ces diversités vont moduler la stabilité, la localisation et l’efficacité de la traduction des
messagers.
En résumé, la régulation d’un gène est contrôlée au niveau de:
- la chromatine par des phénomènes de méthylation.
- la transcription par sa région promotrice qui lui permet de fixer des facteurs de transcription
modulant son expression.
- la maturation des pré-messagers par la mise en place de la coiffe et de la queue polyA ainsi que les
mécanismes d’épissage alternatif.
- les initiations variables de la traduction
- les différentes régulations des régions UTR (5’et 3’ UnTranslated Region)
- les étapes post-traductionnelles.
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Dans la première partie de cette introduction, nous rappellerons brièvement les différentes étapes de la
régulation de la transcription en utilisant des exemples précis concernant des gènes impliqués dans le
développement et la pathologie du tissu musculaire. Lors de notre étude du gène CKIP-1, nous avons
été confrontés à certains de ces processus de régulation de l’expression d’un gène. Ces résultats
seront présentés et discutés après une présentation des mécanismes moléculaires de la différenciation
musculaire dans lesquels CKIP-1 est impliqué.
I – Régulation de la Transcription
La transcription aboutit à la synthèse de l’ARN messager (ARNm) à partir du brin négatif de la
molécule d’ADN. Cette étape a lieu dans le noyau des cellules eucaryotes.
1- Structure d’un gène
Un gène est généralement composé de quatre parties bien distinctes :
- La première partie correspond au promoteur.
Ce promoteur est composé d’un promoteur proximal (ou minimal) et d’un promoteur distal. Le
promoteur proximal correspond à l’ensemble des éléments régulateurs permettant la fixation indirecte
de l’ARN polymérase II. Les éléments régulateurs sont situés en amont du site d’initiation de la
transcription et sont indispensables à sa reconnaissance. Le promoteur distal, quant à lui, possède des
séquences reconnues par différents facteurs de transcription qui agiront comme des trans-activateurs
ou des trans-répresseurs selon les signaux reçus par la cellule.
- La seconde partie correspond à la région 5’ UTR.
Elle est bornée par le site d’initiation de la transcription (+1) et le codon d’initiation de la traduction
(ATG).
- La troisième partie correspond à une séquence codante discontinue. Cette séquence
contient des exons qui possèdent l’information génétique et codent pour la protéine ainsi que des
introns qui s’intercalent entre les différents exons. Ces séquences seront transcrites mais pas traduites.
Elles peuvent posséder des éléments régulateurs de la transcription (enhancers ou silencers).
- La dernière partie du gène correspond à une région 3’ transcrite mais non traduite
(3’UTR) qui se situe en aval de la séquence codante précédemment décrite. Cette partie contient la
séquence génomique 5’AATAAA3’ appelée signal de polyadénylation qui sera interpretée par l’ARN
polymérase comme un signal de fin de la transcription
2- Eléments régulateurs de la transcription dans le promoteur minimal
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Parmi les plus fréquemment utilisés, on retrouve la boîte TATA présente dans la majorité des gènes.
Cependant, certains promoteurs contiennent d’autres éléments permettant l’initiation de la
transcription comme la boîte TATA : l’Inr, le DPE et le BRE. Dans certains promoteurs, aucun de ces
sites remarquables n’est retrouvé.
2-1- Promoteurs avec boîte TATA (ou boîte Goldberg-Hogness)
La séquence de la boîte TATA est riche en A et T et son motif consensus est : 5’TATAAA3’. Cette
boîte TATA est située à –30 nucléotides en amont du site d’initiation de la transcription. Ce motif
TATA permet la fixation de l’ARN polymérase II sur l’ADN par l’intermédiaire de la protéine TBP
(TATA Binding protein). Cette protéine appartient avec les TAFs (TBP Associated Factors) au
complexe multiprotéique de pré-initiation de la transcription TFIID.
2-1-1- Mise en place du complexe de pré-initiation de la transcription
Lors de l’initiation de la transcription, le complexe multiprotéique TFIID (Transcriptional Factor II D)
se fixe par l’intermédiaire de la protéine TBP (TATA-binding protein) sur la boîte TATA, constituée
d’une séquence riche en T et A et située 30 nucléotides en amont du premier nucléotide qui sera
transcrit. La fixation de ce complexe multiprotéique permet la reconnaissance du site de démarrage de
la transcription par l’ARN polymérase II. Le complexe I, constitué de TFIID sur la boîte TATA,
s’associe à TFIIB et génère le complexe II. L’addition de TFIIF à ce complexe permet l’entrée de
l’ARN polymérase II en aval de la région TATA et permet la formation du complexe III. Ce nouveau
complexe ainsi formé va permettre l’association de TFIIE et TFIIH pour faire le complexe V. Ces
derniers auraient pour rôle de dénaturer la double hélice d’ADN au site d’initiation de la transcription
grâce à leur activité hélicase. Cependant, des études récentes ont montré que l’entrée de TFIIH dans
le cycle de transcription dépend de l’association du complexe III avec TFIIE et donc implique la
présence d’un complexe intermédiaire (complexe IV) [1]. Ces études nous permettent juste de dire
qu’une coopération entre TFIIE, TFIIH et le complexe de pré-initiation (complexe III) est
indispensable pour former le complexe V. Ce dernier quand il est associé à TFIIJ forme le complexe
VI. TFIIA, quant à lui, semble pouvoir s’associer avec tous les complexes intermédiaires de préinitiation.
Des études ont montré que seule la présence du complexe I est nécessaire à l’association de
TFIIA. TFIIA se lie donc de manière dépendante à TFIID en amont de la région TATA. Son effet
semble être indirect sur la transcription et son rôle consiste probablement à induire un changement de
conformation d’un état inactif de TFIID à un état actif.
2-1-2- Les différentes boîtes pouvant être associées à la boîte TATA
La boîte CCAAT se trouve en amont de la boîte TATA, entre la position –120 et la position -80
nucléotides du site de démarrage de la transcription. La modification de cette boîte a permis de
montrer qu’elle est indispensable pour accentuer la vitesse de transcription des gènes la contenant.
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Cette boîte peut se trouver sur le brin sens comme sur le brin antisens. Dans ce dernier cas, elle est
alors sous sa forme complémentaire sur le brin sens, c’est-à-dire : 5’ATTGG3’. Sa séquence permet
d’interagir avec un facteur trans-régulateur appelé CTF (CCAAT binding Transcription Factor) isolé
de cellules de mammifères.
La boîte GC est formée d’éléments riches en bases G et C. Si elle est présente, elle est localisée en
principe entre la boîte TATA et la boîte CCAAT. Le motif riche en GC est généralement unique en
présence d’une boîte TATA. Sa séquence permet la fixation du facteur de transcription Sp-1.
Cependant la protéine Sp-1 ne se lie pas forcément de manière égale à toutes les boîtes GC [2]. En
effet, ces séquences seraient sensibles à la méthylation au niveau de leur cytosine.
2-1-3- Autres éléments initiateurs de la transcription pouvant être associés à la
boîte TATA
Certains promoteurs ayant une boîte TATA peuvent également posséder d’autres éléments initiateurs
de la transcription
L’élément initiateur Inr correspond à un motif qui chevauche le site d’initiation de la transcription
et dont la séquence consensus est la suivante :
5’YYA N(T/A)YY3’ chez les mammifères.
+1
N = nucléotides
Y = pyrimidine
Des études ont montré que l’Inr semble ne pas être important ni pour la localisation du site de
démarrage de la transcription ni pour la direction de la transcription. Deux hypothèses ont été
avancées. Dans la première, si l’affinité de liaison ADN-protéines est forte, l’Inr pourrait augmenter
l’intensité du promoteur dans le cas d’une boîte TATA bien localisée et jouer le rôle d’activateur.
Dans la seconde hypothèse, l’Inr serait reconnu comme un simple élément de la machinerie
transcriptionnelle. Ainsi comme la boîte TATA facilite un haut niveau de transcription, l’Inr en aval
de cette dernière conduirait à un très fort niveau basal de transcription [3]
L’élément BRE (IIB Recognition Element)
La séquence consensus du BRE est 5’(G/C)(G/C)(G/A)CGCC3’. Elle est immédiatement suivie du
5’T de la séquence consensus 5’TATAA3’ constituant la boîte TATA [4]. Elle est reconnue par le
facteur de transcription TFIIB par son motif hélice-boucle-hélice de liaison à l’ADN. Plus la
séquence consensus est conservée in vitro, plus le facteur TFIIB se fixe à celle-ci pour permettre
l’assemblage du complexe de pré-initiation et donc l’initiation de la transcription. Des études ont
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montré que l’interaction TFIIB-BRE pourrait jouer un rôle dans :
- la détermination de l’activité globale transcriptionnelle du promoteur,
- l’ordre d’assemblage du complexe de pré-initiation à un promoteur,
- l’étape limitante dans l’initiation de la transcription d’un promoteur,
- la sensibilité d’un promoteur envers des activateurs transcriptionnels
spécifiques.
BRE semble également être capable de déterminer la direction amont/aval de l’assemblage du
complexe de pré-initiation ainsi que de l’initiation de la transcription en présence de l’interaction
TBP-boîte TATA.
2-1-4- Conclusion
En conclusion, l’initiation de la transcription pour un promoteur avec une boîte TATA peut se faire
par :
(1) la boîte TATA seule, localisée en position –30 par rapport au site de démarrage de la transcription
et reconnue par la TBP.
(2) la boîte TATA en combinaison avec d’autres éléments :
- l’élément initiateur Inr, localisé près de la position –1.
- l’élément BRE (IIB Recognition Element), localisé en position –7 de la boîte TATA et reconnu par
TFIIB.
Toutefois, on ne peut pas écarter la possibilité que des séquences régulatrices présentes dans les
promoteurs distaux puissent réguler spécifiquement la transcription par interaction avec la boîte
TATA ou les éléments Inr ou BRE présents dans le promoteur proximal.
2-2- Promoteur dépourvu de boîte TATA
La boîte TATA n’est pas indispensable car la majorité des gènes constitutifs ou domestiques
(housekeeping genes) n’en possèdent pas. Des études ont montré que des délétions ou des mutations
de la boîte TATA n’abolissent pas totalement la transcription. Les deux effets observés sont : une
diminution du taux de transcription et une perte de la fidélité du site d’initiation.
2-2-1- La boîte GC
En l’absence de boîte TATA, la séquence de type 5’GGGCGG3’, située de manière variable, et
connue sous le nom de boîte GC semble pouvoir la remplacer. Le motif riche en GC est généralement
répété plusieurs fois. Le facteur trans-régulateur le plus connu pour se fixer dessus est la protéine Sp-
1. Ce facteur de transcription est un activateur ubiquitaire. Il est requis pour l’expression constitutive
et inductible d’un grand nombre de gènes. Les études qui ont permis de mettre en évidence le rôle de
Sp-1 ont été réalisé dans le virus SV40. Les auteurs ont montré que Sp1 lie sélectivement une
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séquence riche en GC, présente en 6 répétitions d’hexanucléotides dans le promoteur proximal du
virus SV40 [5].
Depuis, d’autres études ont montré qu’une grande variété de promoteurs cellulaires et viraux
contenaient des boîtes GC et qu’elles pouvaient être activées par Sp-1 in vitro. Ces boîtes GC sont
souvent retrouvées près de sites de liaisons à d’autres facteurs de transcription, suggérant que ces
facteurs pourraient agir en coopération pour moduler la transcription. C’est le cas du promoteur à
l’IGFBP-2 (Insulin-like Growth Factor-Binding Protein-2) [2] du rat qui tout en étant dépourvu de
boîte TATA ainsi que de boîte CCAAT, possède cependant une région riche en GC dans sa partie
proximale. Cette région contient quatre boîtes GC, dont trois sont très proches les unes des autres.
Elles peuvent être toutes des sites potentiels de fixation du facteur de transcription Sp-1. Une étude a
démontré que la fixation de Sp-1 aux trois plus proches boîtes GC était essentielle pour l’activité
promotrice. Cependant, la fixation de facteurs de transcription à leur site consensus situés en amont
est nécessaire pour l’expression du gène. Bien que des études aient démontré que Sp-1 est nécessaire
pour atteindre un niveau basal de la machinerie transcriptionnelle et qu’il semble indispensable pour
obtenir une activité maximale des promoteurs chez les mammifères, on ignore toujours si cette
transcription est activement régulée dans les cellules de mammifères ou si elle est simplement
influencée par la quantité de protéine Sp-1 contenue dans le noyau [6, 7].
2-2-2- Rôle de l’Inr en absence de boîte TATA
L’élément initiateur, Inr, en absence de boîte TATA, aurait pour rôle de guider l’ARN polymérase II
vers un site de démarrage de la transcription et peut donc permettre l’initiation de la transcription à
partir d’un site unique.
L’Inr pourrait également influencer la direction de la transcription en absence de boîte TATA [3].
L’initiation de la transcription par l’intermédiaire d’une séquence Inr fait intervenir le facteur TFIID
[8].
Les promoteurs dépourvus de boîte TATA n’ont pas tous un élément initiateur mais ils possèdent
d’autres éléments activateurs capables de permettre l’initiation de la transcription :
2-2-3- L’élément DPE (Downstream Promoter Element)
Le DPE est un site de reconnaissance de TFIID fréquemment trouvé dans les promoteurs dépourvus
de boîte TATA. En effet, parmi les 205 éléments régulateurs de la transcription chez Drosophila
melanogaster, il a été estimé : que 29% des promoteurs contiennent une boîte TATA (sans DPE),
26% contiennent un élément DPE (sans boîte TATA), 14% contiennent les motifs DPE et TATA et
31% ne contiennent ni l’un ni l’autre. La séquence DPE est conservée de Drosophila melanogaster à
l’Homme et semble être aussi commune que la boîte TATA.
Sa séquence consensus est localisée entre la position +28 et +32: 5’(A/G)G(A/T)(C/T)(G/A/C)3’ [5].
Par rapport au site d’initiation de la transcription. Des études ont montré une coopération entre les
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motifs Inr et DPE. Ainsi, une mutation dans le motif Inr ou dans le motif DPE entraîne une forte
diminution de l’activité du promoteur. Il en est de même dans le cas d’une insertion ou d’une délétion
de nucléotides dans ces deux motifs. Ces observations indiquent que la transcription basale
dépendante de DPE implique une liaison coopérative de TFIID (et plus précisément de certaines
TAFs) avec les motifs DPE et Inr [9]. De plus, il a été montré que si l’on inactive le motif TATA
d’un promoteur, son activité transcriptionnelle est totalement restaurée si l’on ajoute à ce dernier la
séquence DPE dans sa position originelle (à +28 nucléotides du site de démarrage de la transcription)
[10].
2-2-4- L’élément BRE (IIB Recognition Element)
Le motif BRE, quant à lui, joue un rôle important en absence de boîte TATA car il interagit avec
TFIIB. En effet, des études ont montré que cette interaction pourrait avoir un rôle dominant dans
l’assemblage du complexe de pré-initiation de la transcription mais aussi dans l’initiation de la
transcription d’un promoteur dépourvu de boîte TATA. De plus, lors d’une recherche dans des bases
de données de promoteurs eucaryotes, le motif BRE apparaît à une fréquence significative dans des
promoteurs sans boîte TATA [4].
2-2-5- Conclusion
En conclusion, l’initiation de la transcription pour un promoteur dépourvu de boîte TATA peut se
faire par :
- la ou les boîtes GC reconnue(s) par le facteur de transcription ubiquitaire Sp-1.
- l’élément initiateur Inr combiné ou non avec l’élément DPE.
- l’élément BRE, localisé en position –37
Tous les promoteurs n’étant pas isolés, il est difficile d’estimer la représentation des différents motifs
dans les promoteurs proximaux. Cependant, il est maintenant clairement établi que le promoteur
proximal ne dirige pas seulement le démarrage de la transcription. Il joue également un rôle crucial
dans la régulation de la transcription en collaboration avec le promoteur distal.
3- Eléments régulateurs de la transcription dans le promoteur distal
Le promoteur distal présente des séquences régulatrices spécifiques de chaque gène. Ces motifs
spécifiques sont reconnus spécifiquement par des facteurs de transcription. Ces facteurs recrutent, par
des interactions protéines-protéines avec d’autres facteurs de transcription et/ou des co-facteurs, la
machinerie basale de la transcription et ainsi régulent la transcription
Les séquences cis-régulatrices du gène qui permettent la fixation de facteur trans-régulateurs ont des
effets sur la vitesse de la transcription. En effet, le taux de transcription du gène peut être
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usquement modifié positivement si l’on est en présence d’une séquence activatrice (enhancer) ou
négativement si l’on est en présence d’une séquence inhibitrice (silencer). Ce mécanisme régulateur
dépend le plus souvent de circonstances physiologiques. Il permet d’ajuster le taux de transcription
aux besoins cellulaires.
Les cellules répondent donc à des signaux (intra et extra-cellulaires) en activant ou réprimant certains
gènes, ainsi qu’en modulant l’importance de la transcription des gènes actifs. La transcription d’un
gène est donc régulée par les facteurs de transcription qui se fixent aussi bien sur le promoteur
proximal que sur le promoteur distal. Cette régulation aboutit à la synthèse d’un ARN pré-messager.
En effet, chez les eucaryotes, l’ARN subit une maturation post-transcriptionnnelle au niveau du noyau
avant d’être traduit en protéine dans le cytoplasme.
II- Maturation des ARN pré-messagers
L’ARN messager chez les eucaryotes va subir de nombreuses modifications post-transcriptionnnelles.
Les exons comme les introns sont transcrits pour donner une longue molécule d’ARN appelée
transcrit primaire ou précurseur de l’ARNm (pré-ARNm). L’ARNm va se voir rajouté une coiffe dans
sa région 5’, une série d’adénosines dans sa région 3’ et va subir un mécanisme d’excision-épissage.
Ces modifications se font dans le noyau. Elles se déroulent au cours de l’étape de transcription et
aboutissent à la maturation de l’ARNm. Elles sont dépendantes les unes des autres, comme nous le
verrons dans le paragraphe III-1.
1- La coiffe
La mise en place de la coiffe ou ²capping² est la première étape de maturation du messager.
La coiffe ou ²cap² est un 7-methyl-guanosine c’est-à-dire un GMP (Guanosine Mono-Phosphate)
ayant un groupement méthyl sur l’atome d’azote en position 7.
Elle se met en place dès le début de la transcription, avant que 30 nucléotides ne soient assemblés.
Elle est reliée au premier nucléotide du transcrit primaire par une liaison phosphoanhydre. En effet, le
groupement tri-phosphate du premier nucléotide est hydrolysé en di-phosphate par une ARN 5’ triphosphatase.
Une guanylyltransférase catalyse la liaison GMP avec le premier nucléotide diphosphate,
créant une liaison 5’-5’ triphosphate. Une méthyltransférase méthyle ensuite l’atome
d’azote en position 7 du GMP.
D’autres modifications peuvent également se produire, telle une méthylation de l’OH en 2’ des
riboses situés sur les deux premiers nucléotides de l’extrémité 5’ du transcrit primaire. L’ARNm
n’aura donc plus une extrémité 5’ phosphate libre. La coiffe protègerait ainsi l’extrémité 5’ des
ARNm de l’attaque par des enzymes (phosphatases, nucléases). La coiffe joue également un rôle
important dans la reconnaissance des ARN. Enfin, elle est nécessaire pour la liaison de la petite sousunité
du ribosome qui assurera par la suite le processus de traduction.
EPHE Banque de Monographies SVT 12

2- La queue polyA
La polyadénylation s’effectue immédiatement après que le messager a été transcrit.
En effet, une fois synthétisés, les ARN messagers sont clivés dans leur partie 3’ une vingtaine de
bases en aval de la séquence AAUAAA. Cette séquence est reconnue par la protéine de clivage CPSF
(Cleavage Polyadenylation Specificity Factor) et est suivie d’une seconde séquence riche en GU ou en
U reconnue par une autre protéine de clivage CstF (Cleavage stimulating Factor). Ces facteurs, en
association avec les protéines de clivages CFI et CFII (Cleavage Factor I and II) et la polyA
polymérase (PAP), clivent l’ARN pré-messager et permettent l’addition d’environ 250 adénosines
consécutives. Par la suite une protéine de 70kDa, la PABPII (PolyA Binding Protein II) se fixe sur la
queue polyA. La queue polyA (associée à la PABP) semble jouer un rôle dans la stabilisation des
messagers et dans l’initiation de la traduction [11, 12].
3- L’excision-épissage des introns
Elle consiste en l’élimination de toutes les séquences introniques du transcrit primaire. Ce mécanisme
est commun à la grande majorité des ARN messagers. Le premier élément dans la connaissance des
mécanismes de l’épissage fut la mise en évidence de séquences dinucléotidiques, appelées séquences
consensus retrouvées aux extrémités des introns. Ces dinucléotides sont GU en 5’ et AG en 3’ de
l’intron (règle de Breathnatch.R et Chambon.P). Des expériences de mutagenèse ont confirmé
l’importance de ces séquences. De plus, des expériences d’épissage in vitro ont permis de montrer
que l’intron formait une structure en lasso au cours de l’épissage.
3-1- Mécanisme d’excision-épissage constitutif
Les éléments qui jouent un rôle important lors de l’excision-épissage du transcrit primaire sont [12] :
- La région 5’ de la jonction exon-intron qui possède la séquence consensus : AG/GURAGU
(R= purines). La séquence dinucléotidique GU de l’intron est appelé site donneur d’épissage.
- La région 3’ de la jonction intron-exon contenant un motif YAG/RNNN. La séquence AG se trouve
dans l’intron et est appelé site accepteur d’épissage.
- Le site de branchement du lasso qui est : CURA20HY. Il se trouve à peu près à 100 nucléotides en
amont du site accepteur d’épissage. Dans ce motif, le nucléotide adénosine (A) suivi des
pyrimidines (Y) est très conservé.Le mécanisme d’épissage peut être décomposé en 2 étapes de
trans-estérification et nécessite aussi la présence de petits ARN de type snRNA (small nuclear
RNA). Ces petits ARN agissent sous forme de complexes avec des protéines et sont alors
nommés : snRNP (small nuclear RiboNucleoprotein Particles). Plusieurs types de snRNP existent,
ils diffèrent par leur structure mais ils sont tous riches en uracile: U1, U2, U3, U4, U5, U6. Dans
un premier temps, l’ARN U1 s’hybride au niveau du site donneur de l’ARN messager par
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homologie de séquence et en présence du facteur d’épissage de la famille des phosphoprotéines
SR (Sérine Arginine): SF2. Cette fixation permet :- l’initiation de l’assemblage du "spliceosome"
au niveau de l’intron à éliminer - la coupure en 5’ du G de la séquence consensus GU. L’ARN U2
se fixe ensuite au niveau du site de branchement ; cette fixation nécessite un autre facteur
protéique : U2AF (U2 small nuclear ribonucleoprotein Auxiliary Factor). L’extrémité 5’ libérée
du site donneur subit une liaison phosphodiester un peu particulière avec le 2’OH du ribose de
l’adénosine du site de branchement auquel s’est fixé l’ARN U2. A cette structure sont associés U4
et U6. L’ARN U5 s’est fixé au niveau du site accepteur d’épissage. La première étape consiste
donc en la formation du lasso à proprement parlé.Dans un second temps, le premier exon, bien
que coupé, reste associé à l’intron via des protéines. La formation du "spliceosome" fait que
l’extrémité 3’OH libre de l’exon se trouve en face du site accepteur. Une seconde réaction de
trans-estérification va entraîner sa ligation à l’extrémité 5’ de l’exon suivant. La seconde étape du
mécanisme d’épissage a donc pour but de raccorder puis fusionner les deux exons et d’induire la
libération de l’intron sous forme de lasso [12, 13].
3-2- Mécanisme d’épissage alternatif
L’épissage est dit alternatif lorsque les messagers résultent de l’utilisation alternative de sites
accepteurs et/ou donneurs d’épissage "faibles" pouvant conduire, après traduction, à des protéines
différentes. Ces sites d’épissage "faibles" (par opposition aux sites d’épissage constitutifs) sont
reconnus dans certaines conditions et conduisent à l’addition ou l’exclusion d’exon(s), la rétention
entière ou partielle d’intron(s) ou d’exon(s). Ce mécanisme permet d’augmenter la capacité de codage
des gènes et il se rencontre en particulier dans les gènes impliqués dans la physiologie du cerveau et
du muscle.
3-3- Importance de l’épissage alternatif dans la myogenèse
3-3-1- Le facteur de transcription MEF2 et l’intégrine b1
Les gènes MRF (Myogenic Regulatory Factor) de la famille MyoD régulent le programme de
différenciation du muscle squelettique. Il existe quatre facteurs régulateurs du muscle (MRF) de la
famille MyoD : la myogénine, MRF4, Myf5 et MyoD lui-même. Ces facteurs de transcription ont des
motifs de type hélice-boucle-hélice (helix-loop-helix) qui se lient sur une séquence spécifique de
l’ADN, appelée boîte E, après hétérodimérisation. Des expériences d’inactivation par recombinaison
homologue chez la souris ont montré que MyoD et Myf5 ont des rôles partiellement chevauchant
dans la détermination des cellules précurseurs du muscle, alors que la myogénine apparaît être
essentielle pour la différenciation de ces cellules en cellules musculaires. Si des cellules non
musculaires sont transfectées avec un des MRF, elles vont soit se transformer en cellules
myogéniques soit ne pas exprimer le phénotype musculaire, tout dépend du type de cellules analysées.
L’étude des cellules NIH3T3 [14] montrent qu’elles subissent une transformation myogénique
EPHE Banque de Monographies SVT 14

incomplète après transfection avec les différents MRF. En effet, ces cellules transfectées sortent du
cycle cellulaire et expriment les marqueurs moléculaires de la différenciation mais ne rentrent pas en
différenciation terminale, c’est-à-dire qu’elles ne forment pas de myotubes multinuclés.
L’incapacité à fusionner des cellules NIH3T3 transfectées par un membre de la famille MyoD est
principalement due à l’impossibilité de générer, par épissage différentiel, les transcrits spécifiques du
muscle comme la sous-unité de l’intégrine b1D et le facteur de transcription MEF2-D (Myocytespecific
Enhancer Factor 2-D).
Cette sous-unité b1D de l’intégrine est localisée dans le muscle squelettique au niveau de diverses
structures d’adhésion où elle est en contact direct avec la taline et l’a-actinine [15]. Elle est associée
dans le muscle squelettique adulte avec les sous-unités a7A et a7B de l’intégrine. Elle est exprimée
après la fusion des myoblastes et son expression continue à augmenter pendant la croissance et la
maturation des myotubes, par opposition avec l’isoforme b1A dont l’expression diminue pendant la
myodifférenciation pour disparaître lorsque les myotubes différenciés arrivent à maturation (après la
fusion des cellules). En effet, dans les myoblastes C2C12, b1A est progressivement remplacée par
b1D. Le domaine cytoplasmique de la sous-unité b1D correspond à un épissage alternatif unique de
50 acides aminés. Les 24 derniers acides aminés ajoutés par cet épissage sont codés par un nouvel
exon du gène de l’intégrine b1. Parmi ces 24 acides aminés, 13 sont uniques et 11 sont conservés par
comparaison avec l’isoforme b1A. Les deux isoformes possèdent deux motifs conservés NPXY à la
même position. L’incapacité des cellules NIH3T3 surexprimant les MRF à fusionner est directement
corrélée à un très faible niveau d’épissage alternatif de l’isoforme b1 D spécifique du muscle. Ces
cellules présentent un épissage défectueux du gène MEF2-D.
Le facteur de transcription MEF2-D appartient à la famille des Myocyte-specific Enhancer-binding
Factor 2. Ce facteur de transcription se lie et active la transcription sous forme d’hétérodimères avec
MEF2A et MEF2C, en reconnaissant une séquence d’ADN conservée riche en A/T :
5’CTA(A/T) 4TA(G/A)3’. MEF2D lie cette séquence consensus avec une haute affinité et semble être
un puissant activateur transcriptionnel. Ce facteur de transcription partage par la boîte MADS (qui
permet la liaison à l’ADN et la dimérisation) et le domaine MEF2 une forte homologie d’acides
aminés avec d’autres membres de la famille MEF2. L’ADNc codant MEF2D montre un cadre de
lecture ouvert non interrompu de 514 acides aminés correspondant à une protéine de 55kDa.
L’épissage alternatif de ce gène peut conduire à quatre transcrits : un sans les exon 1a et 1b ni l’exon
2, un avec l’exon 1a, un avec l’exon 1b et un dernier avec l’exon 2. Ces différentes isoformes lient
l’ADN de la même manière et ont des activités transcriptionnelles comparables dans les tissus où ils
sont présents [16].
Des études de son patron d’expression ont montré qu’il y avait prédominance du transcrit contenant
l’exon 1b dans les myotubes C2C12 ainsi que dans le muscle squelettique. Les transcrits contenant
l’exon 1a et l’exon 1b sont présents à des niveaux similaires dans le muscle cardiaque. Il a été montré
que dans les cellules NIH3T3, l’épissage alternatif aboutissant à la forme MEF2D 1b spécifique du
muscle est défectueux.
EPHE Banque de Monographies SVT 15

En conclusion, les différentes isoformes de l’intégrine b1 et/ou du facteur de transcription MEF2 sont
tissu-spécifiques et l’incapacité à générer les formes musculaires des ARNm de ces deux gènes dans
les cellules NIH3T3 ne permet donc pas l’obtention du ²phénotype musculaire².
L’épissage alternatif est donc un mécanisme qui génère une diversité protéique importante et présente
une régulation complexe. Des anomalies de ce processus peuvent conduire à des disfonctionnements
importants comme nous allons le voir dans le paragraphe suivant.
3-3-2- Anomalie de l’épissage et pathologie musculaire
3-3-2-1- Le gène MTMR1 (myotubularin-related 1)
Le gène MTMR1 appartient à une famille de lipides phosphatases. Le premier membre de cette
famille de gène, MTM1 code pour la myotubularine, une phosphatase spécifique du
phosphatidylinositol 3-phosphate [PI(3)P]. MTM-1 est muté dans la myopathie myotubulaire liée à
l’X (XLMTM) provoquant de sérieux désordres congénitaux qui affectent le muscle squelettique.
MTM1 et MTMR1 sont homologues, adjacents sur le chromosome X et codent pour des protéines
présentant 59% d’identité de séquence. Six isoformes d’ARNm de MTMR1 ont été mis en évidence
par différents épissages alternatifs de trois exons (2.1, 2.2, 2.3) dans l’intron 2 du gène [17]. Les six
isoformes issues des différents épissages alternatifs des trois exons supplémentaires sont :
- A (absence des trois exons) et B (présence de l’exon 2.1). Ils sont ubiquitaires au stade
embryonnaire.
- C (présence des exons 2.1 et 2.2). Il est spécifique du muscle squelettique adulte.
- D (présence des exons 2.1 , 2.2 et 2.3). Il se trouve dans le muscle et le cœur au stade embryonnaire
tardif.
- E (présence de l’exon 2.3) et F (présence des exons 2.1 et 2.3). Ils sont spécifiques du cerveau.
L’isoforme C (contenant les exons 2.1 et 2.2) est majoritaire dans le muscle squelettique adulte et
induite pendant la myogenèse aussi bien in vivo qu’in vitro. Les isoformes A et C de la protéine
MTMR1 ont la même spécificité de substrat (PI(3)P) et montrent la même localisation sub-cellulaire.
Buj-bello et col. ont montré que l’épissage alternatif conduisant à cette forme C spécifique du muscle
est altéré dans une pathologie du muscle où de nombreuses pertubations d’épissages ont été décrites :
la dystrophie myotonique (DM). Ceci aboutit à une réduction de cette isoforme et à la présence d’une
nouvelle isoforme G. Dans des cellules ainsi que dans des tissus fœtaux DM, ce transcrit est anormal
et ne contient que l’exon 2.2. Cet ARNm n’est pas affecté dans la myopathie myotubulaire liée à l’X
(XLMTM). Cependant, l’importance de ce phénomène dans la pathologie DM n’est pas encore
établie. D’autres défauts d’épissage ont été décrits pour les gènes IR (Insulin Receptor) et CIC-1
(chloride channel) impliqués dans cette pathologie.
3-3-2-2- Les gènes IR (Insulin Receptor) et CIC-1 (chloride channel)
EPHE Banque de Monographies SVT 16

Chez les patients atteints de DM1, le transcrit du gène DMPK comporte des répétitions multiples de
triplet CTG dans sa partie 3’UTR [18]. Ces ARNm mutants de DMPK contiennent jusqu’à milles
répétitions CTG et la sévérité de la maladie est directement corrélée à la longueur de ces extensions.
L’expression de DMPK dans les cellules DM1 est très faible. Il a été montré que la faible traduction
de ces transcrits n’est pas due à un épissage défectueux mais à leur rétention dans le noyau. En effet,
ces transcrits mutants sont accumulés au niveau du noyau et étroitement associés à la matrice
nucléaire. Cette perte de fonction de DMPK dans les cellules DM1 est donc due à un mauvais export
des ARNm et par conséquent à une traduction réduite de DMPK. Cependant, ce phénomène n’est pas
directement responsable de la maladie. En effet, la maladie développée par les souris dont le gène
DMPK a été inactivé par recombinaison homologue n’est pas similaire à DM1. Aucune autre
mutation dans le gène DMPK n’a jamais été observée chez les patients DM1. De plus, la maladie
DM2, une autre forme de dystrophie myotonique, phénotypiquement très proche de DM1, est causée
par des extensions CCTG dans l’intron 1 du gène ZNF9. Le transcrit de ZNF9 est également retenu
dans le noyau.
Il a donc été suggéré que la présence de ces répétitions CUG dans ces ARNm (ARN (CUG)n ) est
responsable de ces maladies indépendamment du locus considéré [19]. La ribonucléoprotéine
nucléaire (hnRNP) CUG-BP fixe l’ARN et est impliquée dans la régulation de l’épissage alternatif
d’ARNm spécifiques en se fixant sur des séquences introniques conservées contenant des éléments
riches en U/G. Cette protéine est surexprimée dans les cellules DM1 et DM2, c’est à dire dans les
cellules contenant des (ARN (CUG)n ). Le mécanisme de régulation de son expression par ces
séquences CUG n’est pas connu. Les cibles spécifiques de CUG-BP sont entre autres, le gène du
récepteur à l’insuline et le gène CIC-1 (chloride channel). L’accumulation nucléaire et donc la
fixation de CUG-BP à des motifs U/G provoque des épissages aberrants. Par exemple, l’insertion
d’un codon de terminaison prématuré entre deux exons aboutit à la perte d’expression de la protéine
CIC-1 sauvage et à la myotonie. Dans le cas de IR, l’élimination de l’exon 11 de l’ARNm conduit à
une isoforme courte du récepteur responsable de la résistance à l’insuline observée dans la pathologie
DM.
4- Promoteurs alternatifs
Dans le cas de la synthèse de plusieurs ARNm à partir d’un même gène, deux possibilités se
présentent quant à la régulation de la transcription : soit les transcrits sont régulés par les mécanismes
que l’on vient d’illustrer précédemment, c’est-à-dire l’épissage alternatif, soit chacun d’eux est régulé
sous le contrôle d’un promoteur distinct. Ce dernier mécanisme peut induire des différences
d’épissage en fonction des espèces, des tissus d’expression ou même des conditions
environnementales. Par conséquent, on peut rencontrer simultanément les deux mécanismes.
Utilisation du promoteur spécifique du muscle (pM) de l’aldolase A
La spécialisation des fibres musculaires squelettiques a lieu durant la période postnatale. Elle est
caractérisée par la contractibilité (fibres rapides ou lentes) et par leur métabolisme qui est soit
glycolytique soit oxydatif. Ces différences sont dues à la présence de différentes protéines contractiles
EPHE Banque de Monographies SVT 17

et métaboliques. L’aldolase A est une enzyme glycolytique présente en grande quantité dans les fibres
musculaires adultes rapides. Le gène murin codant pour l’enzyme glycolytique aldolase A est
transcrit à partir de trois promoteurs alternatifs [20]: le promoteur pM muscle spécifique qui se situe
entre les promoteurs pN et pH actifs dans la majorité des tissus y compris le muscle squeletique et
cardiaque. Dans les cellules C2C12, le promoteur M est activé dans les 24 heures suivant l’induction
de la différenciation et les trois promoteurs sont actifs dans les phases tardives de ce processus et le
restent dans les myotubes différenciés [21]. Le promoteur pM est activé spécifiquement dans les
fibres musculaires glycolytiques rapides et son niveau d’expression augmente durant la période
postnatale de maturation du muscle. pM est beaucoup plus actif dans les muscles du corps que de la
tête. Ce promoteur est activé en deux étapes : la spécificité de fibres est acquise très tôt durant la
période après la naissance alors que la dichotomie corps/tête apparaît 15 jours après la naissance.
Différents sites de fixation pour des facteurs de transcription ont été caractérisés dans cette région. La
génération de souris transgéniques pour cette région, soit sous sa forme sauvage ou mutée pour
certains des sites a montré que les sites de fixation requis pour l’expression dans les fibres rapides par
rapport aux fibres lentes ainsi que ceux utilisés par différents types de fibres rapides sont différents.
Ces résultats montrent que l’utilisation d’un promoteur alternatif permet de cibler l’expression d’un
gène dans un tissu donné à un moment précis.
III- Régions Régulatrices de l’ARN messager
La régulation de l’expression d’un gène implique un contrôle de la transcription permettant d’aboutir
à la maturation de l’ARN mais aussi à un contrôle post-transcriptionnel (c’est-à-dire le transport de
l’ARNm du noyau vers le cytoplasme, l’efficacité de sa traduction, sa localisation cellulaire et sa
stabilité). Ce dernier contrôle se fait principalement grâce à des éléments ARN généralement situés
dans les régions transcrites mais non traduites de l’ARNm (à savoir le 5’ et le 3’ UTR)
1. Interactions entre la coiffe, la séquence codante et la queue polyA
Comme nous l’avons précisé précedemment, des études in vitro ont montré que la mise en place de la
coiffe, de l’épissage et de la polyadénylation sont dépendantes les unes des autres.
En particulier, il semble que la structure de la coiffe joue un rôle important au niveau du phénomène
d’épissage. L’incubation in vitro d’un pré-ARNm dans un extrait nucléaire, montre que l’addition
d’une coiffe augmente de façon significative la formation de l’ARNm épissé. L’interconnexion de la
coiffe et de l’épissage est importante pour l’intron le plus proximal et diminue avec la distance. Cette
étroite relation implique la protéine nucléaire CBC (Cap Binding Complex) associée à la coiffe.
L’élimination de la protéine CBC d’extraits nucléaires entraîne une inhibition significative de
l’épissage. Des études complémentaires ont montré que CBC influe de manière positive sur
l’interaction du U6snRNA avec le site donneur d’épissage en affectant le remplacement du U1snRNP
par U6 [12]. Ce mécanisme montre bien qu’un épissage efficace est dépendant de la coiffe.
EPHE Banque de Monographies SVT 18

Il semble que la coiffe interfère également avec la polyadénylation. Des expériences similaires ont
permis de montrer que la présence de CBC stabilise le complexe de polyadénylation en présence du
transcrit primaire [22].
Enfin, il existe deux liens étroits entre l’épissage et la polyadénylation
- Le premier consiste en la délimitation des exons dans le mécanisme d’épissage de l’ARN. Pour les
exons ²internes² au gène, les sites d’épissage 3’ et 5’ sont le plus souvent reconnus par des
interactions entre les facteurs d’épissage aux bornes de l’exon. Ce mécanisme de délimitation des
exons est également appliqué au dernier exon du gène, bien que dans ce cas le dernier exon soit
délimité par le signal de polyadénylation. L’épissage et la polyadénylation à chaque extrémité de
l’exon se régulent positivement entre eux. Cette régulation fait intervenir une interaction entre le
facteur d’épissage U2AF et la polyA polymérase [23].
- Le second lien qui existe entre l’épissage et la polyadénylation peut être mis en évidence dans le
cas d’une polyadénylation alternative. En effet, la position de la queue polyA peut être variable
s’il existe plusieurs sites de clivage dans la région 3’UTR de l’ARN pré-messager. Cette
polyadénylation alternative peut conduire à l’expression de différents produits à partir d’un même
gène. Deux exemples ont été bien caractérisés : le gène codant pour la chaîne lourde de
l’immunoglobuline M (IgM) et le gène de la calcitonine [24].
Le gène IgM possède un premier site de polyadénylation dans un intron qui est sujet à une répression
par le site donneur d’épissage situé en amont. Ce site est finalement éliminé par épissage de l’intron
le contenant. L’ARNm résultant utilise son second site de polyadénylation situé en aval, produisant
ainsi la forme membranaire de la protéine, qui prédomine au cours du développement précoce des
cellules B. Dans les cellules B matures, le premier site de polyadénylation, jusque-là réprimé, va être
beaucoup plus sollicité, pour synthétiser une forme sécrétée plus courte de la protéine. Dans ces
cellules, contrairement aux cellules B immatures, le facteur de polyadénylation CstF-64 (Cleavage
stimulation Factor-64) est fortement exprimé et cette protéine a une haute affinité pour le plus court
signal de polyadénylation. Elle entre donc en compétition avec le mécanisme d’épissage [25] et
favorise ainsi la synthèse de la forme courte.
Une situation similaire existe pour le gène de la calcitonine. Le transcrit du gène de la calcitonine
subit un épissage alternatif spécifique de tissu qui conduit au messager de la calcitonine (dans la
thyroïde) ou au messager d’un neuromédiateur, le CGRP (Calcitonin Gene Related Peptide) dans le
cerveau. Il semble que cet épissage alternatif résulte de la présence, dans la thyroïde, d’un élément
activateur (enhancer) impliqué dans le recrutement des facteurs d’épissage conduisant à la production
de messagers de la calcitonine. Dans le cerveau, cet élément de régulation positif est présent, mais ne
semble plus pouvoir agir. Ceci conduit à la production de CGRP plutôt qu’à la calcitonine [24].
2. Régulation par la coiffe et la queue polyA [26]
Les protéines qui interagissent avec la coiffe et la queue polyA induisent généralement deux
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processus de régulations supplémentaires. Le premier consiste en la reconnaissance de l’intégrité de
l’ARNm par le système de surveillance. En effet, dans le cas où des anomalies seraient détectées, ce
système empêche l’export de l’ARNm vers le cytoplasme. Le second mécanisme de régulation
consiste en l’export de l’ARNm dans le cytoplasme à proprement parler. Les protéines mises en jeu
lors de la reconnaissance de l’intégrité de l’ARNm vont interagir avec les protéines du pore nucléaire
afin de permettre le transport de cet ARNm. Ces phases de régulation permettent la prise en charge
d’un ARNm ²correct² par la machinerie traductionnelle.
Dans le noyau, la protéine CBC se lie à la coiffe. Elle est composée de deux sous-unités : la sousunité
CBP80 qui contient un NLS (Nuclear Import Signal) classique et la sous-unité CBP20 qui
contient un domaine de liaison à l’ARN de type RNP. La protéine CBC est importante pour
l’épissage du transcrit primaire mais aussi pour l’export de l’ARNm du noyau vers le cytoplasme
grâce à des associations/dissociations avec les sous-unités des molécules d’importines a et b et les
snRNA.
La queue polyA, quant à elle, est associée à la PABPII qui semble jouer un rôle dans la stabilisation
des messagers et dans l’initiation de la traduction.
Une fois l’ARNm exporté vers le cytoplasme, les protéines CBC et PABPII vont être remplacées
respectivement par le complexe eIF4-F (eukaryotic translation Initiation Factor 4-F) et par la protéine
PABPI.
Le complexe eIF4-F comprend trois sous-unités : eIF4-E qui est en contact direct avec la coiffe,
eIF4-A qui possède une activité hélicase dépendante de l’ATP et eIF4-G (appelé aussi p220) qui
permet l’assemblage du complexe d’initiation de la traduction. Ce complexe permet la traduction de
l’ARNm.
La protéine PABPI recouvre la queue polyA afin de lui servir de bouclier contre les attaques des
ribonucléases de la cellule. Cette protéine va donc empêcher la dégradation de l’ARNm.
3. Régulation par la région 5’UTR
Rappelons que la région 5’UTR est délimitée par le site d’initiation de la transcription d’un côté et le
site de démarrage de la traduction de l’autre. La distance qui sépare ces deux sites peut varier puisque
dans un gène présentant plusieurs promoteurs, la transcription peut être initié à partir de plusieurs sites
de démarrage différents. Ce phénomène conduirait donc à la synthèse de régions 5’UTR différentes
pour un même ARNm. La région 5’UTR peut varier en taille car la traduction peut démarrer à
différents sites, permettant ainsi la synthèse de protéines avec des régions N-terminal différentes.
Une des premières régulations de la région 5’UTR est sa longueur. En effet, la distance entre la coiffe
et le codon d’initiation de la traduction semble jouer un rôle sur l’efficacité de l’initiation de la
traduction. La longueur minimale requise pour permettre la reconnaissance du premier codon AUG,
est d’environ 20 nucléotides, mais elle peut être compensée par la présence de structures secondaires
en aval de l’ATG [27]. Au-delà de 20 nucléotides, l’efficacité de l’initiation de la traduction
augmente avec la taille. Ceci pourrait s’expliquer en partie par l’accumulation de nombreuses sousunités
40S sur ces longs 5’UTR conférant ainsi un avantage pour la traduction. Des études ont montré
EPHE Banque de Monographies SVT 20

qu’une région UTR riche en dinucléotides GC est néanmoins beaucoup plus courte qu’une région
UTR pauvre en GC.
Plusieurs éléments régulateurs post-transcriptionnels spécifiques à la région 5’UTR ont été décris.
Ainsi, on peut retrouver en plus de la coiffe :
- des IRES (Internal Ribosome Entry Site) ou sites internes d’entrée des ribosomes qui peuvent
permettre la traduction de plusieurs protéines à partir d’un seul ARNm. L’IRES permet la traduction
sans reconnaissance de la coiffe par le ribosome.
- les uORF (upstream Open Reading Frame). Ce sont de petits cadres de lecture qui peuvent interférer
avec le site préférentiel d’initiation de la traduction du gène considéré.
- des structures secondaires en épingle à cheveux qui soit empêchent le balayage de l’ARNm par les
ribosomes soit permettent l’interaction entre l’ARN et des protéines régulatrices pour moduler la
traduction.
3-1- IRES (Internal Ribosomal Entry Site)
L’IRES est une structure d’initiation de la traduction qui ne nécessite pas la reconnaissance de la
coiffe par le ribosome. L’activité IRES est dépendante non pas du codon d’initiation de la traduction
(AUG) mais de structures secondaires ou tertiaires, de facteurs trans-activateurs, ou de séquences
complémentaires à la sous-unité 18S de l’ARNr [28]. Cette initiation nécessite la présence des
facteurs d’initiation de la traduction eIFs, à l’exception de eIF-4E (qui reconnaît spécifiquement la
coiffe). La majorité des IRES sont d’origine virale. Seules quelques-unes ont été décrites comme étant
d’origine cellulaire. Les séquences IRES cellulaires sont fréquemment activées lorsque la protéine
normalement synthétisée (de manière coiffe dépendante) est inhibée.
L’ARNm de c-myc comporte un long et complexe 5’UTR contenant un IRES. C-myc est un
protooncogène impliqué dans la régulation de la prolifération et l’apoptose. L’activité de l’IRES cmyc
dépend du type cellulaire et du stimulus appliqué à la cellule. Ainsi, lorsque la cellule entre en
apoptose, la traduction dépendante de la coiffe diminue, probablement par le clivage de eIF-4G ainsi
que d’autres facteurs de la traduction par les caspases et l’activité IRES augmente. D’autres gènes
impliqués dans la régulation de l’apoptose contiennent un IRES dans leur extrémité 5’UTR. C’est le
cas de Apaf-1 (Apoptosis protease activating factor-1) et de XIAP (X-linked Inhibitor Apoptosis
Protein).
Au cours de la phase G2/M du cycle cellulaire, la synthèse des protéines dépendante de la coiffe est
inhibée. C’est le cas pour les protéines kinases PITSLRE qui appartiennent à la famille des kinases
dépendantes des cyclines [29]. Elles agissent comme des gènes suppresseurs de tumeurs et ont été
montré comme ayant un rôle dans la progression du cycle cellulaire. Deux isoformes des protéines
kinases PITSLRE existent : p110 PITSLRE et p58 PITSLRE . p110 PITSLRE est produite par traduction
dépendante de la coiffe alors que p58PITSLRE résulte d’une traduction dépendante d’une IRES. Lors
de la phase G2/M du cycle cellulaire, l’ARNm des protéines kinases PITSLRE n’est pas traduit de
manière dépendante à la coiffe. En effet, lorsque l’inhibition de la traduction dépendante de la coiffe
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est levée, seule la protéine p110 PITSLRE est synthétisée. En contrepartie, lorsque la traduction
dépendante de la coiffe est inhibée, seule la protéine p58 PITSLRE est présente. Ces observations
révèlent donc un nouveau mécanisme de régulation de la traduction pendant la progression du cyle
cellulaire.
En général, la traduction d’ARNm par l’intermédiaire d’un IRES est activée lorsque les conditions ne
sont pas favorables à une traduction coiffe dépendante. C’est le cas de l’apoptose et de l’arrêt du
cycle cellulaire.
3-2- uORFs (upstream Open Reading Frame)
Il semble que la reconnaissance de la séquence de l’ARNm par le complexe ribosomal nécessite en
plus du contexte optimal du codon d’initiation de la traduction établit par Kozak : 5’GCCRCCaugG3’,
des éléments régulateurs situés en 5’UTR [30]. C’est ainsi que les uORFs ont été décrits. Ce sont de
petits cadres de lecture ouverts en amont de l’ATG. Tous les ARNm ne sont pas fonctionnels. Dans
certains cas, ces transcrits sont traduits en quantité équivalente à l’ARN fonctionnel majoritaire. Dans
d’autre cas, un transcrit incomplet peut parfois être plus abondant que l’ARN entièrement épissé et
théoriquement traduisible.
Après la reconnaissance et la traduction d’un uORF, le ribosome a quatre possibilités [31]:
- Le ribosome reste associé à l’ARNm et continue à avancer sur le messager.
- Le ribosome peut réinitier plus en aval après être resté associé et avoir avancé sur l’ARNm. Cette
réinitiation peut se faire aussi bien à un codon AUG proximal qu’à un codon AUG distal. Les
ribosomes traduisent souvent le petit cadre de lecture ouvert (uORF) et réinitient en aval avec une
grande efficacité, n’affectant pas l’expression du gène considéré. Cependant, la taille du cadre de
lecture (ORF) est un facteur limitant lors de réinitiation chez les eucaryotes. Cette réinitiation ne
peut avoir lieu qu’après la traduction d’un premier cadre de lecture court mais en aucun cas après
la traduction d’un premier cadre de lecture long et entier. La raison pour laquelle la réinitiation est
fréquemment liée à la taille du premier cadre de lecture peut s’expliquer par le fait que certains
facteurs impliqués dans l’initiation de la traduction se dissocient du ribosome progressivement
pendant la phase d’élongation. Par conséquent, si la phase d’élongation est brève (dans le cas d’un
premier cadre de lecture court), les facteurs requis pour la réinitiation d’un nouveau cadre de
lecture seront présents. Ceci ne sera pas le cas, si la première initiation de la traduction a lieu à
partir d’un cadre de lecture long et entier.
- Le ribosome s’arrête en cours de la phase d’élongation ou de terminaison de la traduction de
l’uORF, créant ainsi un blocus. Dans ce cas, la structure du peptide codée par l’uORF serait à
l’origine de l’arrêt. Il semblerait que ce peptide interagisse avec la machinerie traductionnelle.
Cette interaction semble perturber l’expression du gène lui-même et bloquer toute nouvelle
traduction à partir d’un uORF plus en aval.
- L’uORF synthétisée peut affecter l’expression du gène en altérant la stabilité de son messager. En
effet, il semblerait qu’un complexe multiprotéique agisse au niveau de la terminaison de la
traduction dans le but de réguler le devenir du ribosome et de l’ARNm. A ce moment là, l’uORF a
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la possibilité de provoquer la dégradation de l’ARNm et donc d’éliminer l’expression du gène. Le
mécanisme qui entraîne cette dégradation est très mal connu.
D’autre part, il existe des mécanismes qui éliminent les uORFs quand une forte synthèse de protéine
est requise dans un tissu précis ou à un moment donné.
En conclusion, les uORFs agissent au niveau de l’expression des gènes. Dans certains cas, ils servent
d’éléments régulateurs importants.
3-3- Présence de Structures Secondaires
Le contrôle de la traduction d’un ARNm peut également être modulé par des interactions entre des
séquences de réponse spécifiques à structures secondaires et des protéines régulatrices de l’initiation
de la traduction, qui sont généralement des répresseurs. C’est le cas du facteur IRP1 (Iron Responsive
Protein-1) [28]. Ce facteur se lie à un motif IRE (Iron Responsive Element) de manière dépendante à
une homéostasie en fer dans la cellule. Le motif IRE correspond à une épingle à cheveux et est
localisé près de la coiffe dans la région 5’UTR de l’ARNm de la ferritine. Cette protéine est requise
pour le stockage du fer ainsi que pour son utilisation sauf lorsque le niveau en fer de la cellule est trop
faible. En effet, si la quantité de fer intracellulaire est insuffisante, cela accroît l’activité de liaison de
IRP1 à la structure en épingle à cheveux IRE. Ce complexe est stabilisé par IRP2 (Iron Responsive
Protein-2). La liaison de IRP à IRE empêche l’accrochage du complexe ribosomale 40S à l’ARNm et
donc inhibe fortement la traduction de la ferritine. Inversement, lorsque la concentration en fer est
élevée, IRP2 est dégradée par le protéasome et IRP1 capture les ions fer, ce qui l’empêche de se lier
au motif IRE. Dans ces conditions, les facteurs d’initiation à activité hélicase (eIFs) détruisent la
structure en épingle à cheveux de l’IRE, et permettent l’entrée et la fixation à l’ARNm du complexe
de pré-initiation 40S. Le ribosome ainsi assemblé peut donc entraîner l’initiation de la traduction.
4. Régulation par la région 3’UTR
La région 3’UTR se situe entre le codon de fin de la traduction et la queue polyA. Cette région peut
être variable s’il existe plusieurs codons stop, des épissages alternatifs du dernier exon et un usage
alternatif de sites de polyadénylation. On a pu constater que la région 3’UTR est impliquée dans la
fixation de certains facteurs d’élongation (eIFs) ainsi que dans la réinitiation de la traduction en
permettant de recycler les sous-unités ribosomales en direction de l’extrémité 5’ du même ARNm.
Par conséquent, la région 3’UTR participe à l’optimisation de l’initiation de la traduction.
Cette région est également impliquée dans le contrôle de la traduction, la localisation sub-cellulaire et
la stabilité des messagers par l’intermédiaire d’éléments régulateurs tels que :
- des éléments de polyadénylation cytoplasmique riches en U nommés CPE
- des éléments de désadénylation riches en A + U nommés ARE (AU Rich Element)
- des éléments de réponse (de type tige-boucle) à des facteurs spécifiques
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4-1- CPE (Cytoplasmic Polyadenylation Element)
La présence et la taille de la queue polyA contribuent à l’efficacité de la traduction des ARNm. La
longueur de la séquence polyA des ARNm cytoplasmiques varie. Elle est régie par un phénomène
dynamique qui dépend de séquences spécifiques de l’ARNm ainsi que du type cellulaire, ceci
indépendamment des événements nucléaires. La taille de la queue polyA de l’ARNm est réduite au
cours du temps, mais la vitesse de désadénylation varie en fonction de l’ARNm, du type cellulaire et
de l’efficacité de traduction. Des réactions de désadénylation précèdent la dégradation de l’ARNm.
Dans certaines circonstances, des réactions de ré-adénylation peuvent se produire dans le cytoplasme.
Ces réactions de ré-adénylation cytoplasmiques ont lieu au moment où l’ARNm devient traductible et
est recruté par la machinerie traductionnelle. Ces réactions nécessitent le signal AAUAAA, le CPSF
et la PAP, comme cela est le cas dans le noyau, mais aussi une séquence riche en résidus U, appelée
CPE. Le mécanisme par lequel le motif CPE permet la fixation de la CPEB (CPE Binding protein)
pour entraîner la polyadénylation cytoplasmique n’est pas encore clairement établi.
4-2- ARE (AU Rich Element)
On sait que la présence de la coiffe s’oppose à la digestion des ARNm par des exoribonucléases dans
le sens 5’-3’. Deux mécanismes indiquent que la queue polyA protège également les ARNm de la
dégradation. L’un de ces mécanismes a déjà été évoqué puisqu’il s’agit de l’interaction de la PABP
sur la queue polyA, formant ainsi un complexe qui protège les ARNm polyadénylés contre leur
digestion par les exoribonucléases dans le sens 3’-5’. Le second mécanisme correspond à l’étape qui
précède la dégradation des ARNm : la désadénylation. Les séquences qui stimulent ce mécanisme et
favorisent donc la dégradation des messagers sont des séquences riches en résidus A et U et sont
localisées dans la région 3’UTR des messagers de courte durée de vie : les ARE. Aucune séquence
consensus n’a été rigoureusement établie, mais une classification a été proposée, divisant les ARE en
trois groupes [32].
Le premier groupe est constitué par les séquences renfermant une ou plusieurs copies du motif
pentamérique AUUUA (classe I) ou tétramérique AUUU (classe II), entouré de diverses répétitions de
A et U, et couplé à une longue région continue riche en U.
Le second groupe consiste en des séquences divisées en deux domaines dont un est formé par environ
60% de A ou U et un autre domaine constitué par trois copies du motif pentamérique GUUUG.
Le troisième groupe contient une continuité de U sans aucun pentamère.
La seule protéine isolée capable de se fixer sur les ARE est : AUF1 (AU Factor 1). Sa fixation induit
in vitro la déstabilisation des ARNm de c-myc et du GM-CSF par exemple. Cependant, il semble
qu’il existe d’autres protéines non encore identifiées capables d’induire au contraire la stabilisation de
ces messagers.
L’ARE est donc reconnu par différents facteurs qui, selon leur nature, stabilisent ou déstabilisent
l’ARNm. Ceci permet la synthèse de protéines à des moments précis dans de conditions particulières.
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4-3- Présence de Structures Secondaires
Si l’on reprend le cas de la ferritine, on s’aperçoit que ce même élément de réponse au fer de type
tige-boucle IRE est également présent en 5 exemplaires dans la région 3’UTR de l’ARNm du
récepteur de la transferrine (TfR) [28]. En présence de faibles concentrations en fer, les protéines
IRP1et IRP2 inhibent la traduction de l’ARNm de la ferritine. En revanche, ces protéines stabilisent
l’ARNm codant pour la TfR. Ceci aboutit à une augmentation du taux de ce récepteur permettant
ainsi à la cellule d’absorber le fer par endocytose de la transferrine. Inversement, lorsque la
concentration en fer est élevée, les protéines IRP1 et IRP2 ne sont plus actives. En effet, elles
n’empêchent plus la traduction du messager de la ferritine et par conséquent le stockage du fer dans la
cellule. En parallèle, elles ne protègent plus la région 3’UTR de l’ARNm du récepteur à la
transferrine. Cet ARNm est donc susceptible d’être dégradé par des endoribonucléases dans le sens
3’-5’. Ainsi selon les stimuli reçus par la cellule ou les variations cellulaires, les ARNm présentant
des séquences particulières dans leur région 3’UTR sont dégradés ou stabilisés afin qu’une protéine
soit ou non synthétisée
En conclusion, les séquences ou les structures présentes dans les régions 5’UTR et 3’UTR sont très
importantes pour la stabilité et la localisation des messagers mais aussi pour l’efficacité de la
traduction d’un messager.
5. Conclusion
Tous les mécanismes que nous avons évoqués ici, à savoir l’utilisation de promoteurs alternatifs, les
mécanismes d’épissages alternatifs mais aussi les régulations par les régions 5’ et 3’ des ARN
messagers, permettent une grande variabilité tant au niveau de l’ARNm qu’au niveau de la protéine.
Ils sont importants et nécessaires car ils permettent l’expression d’une protéine à un moment donné
dans une cellule définie. Ceci confirme bien l’hypothèse selon laquelle la complexité moléculaire se
situe en aval des gènes (ou du génome) et plus particulièrement au niveau des étapes de la
transcription et de la traduction. Cependant d’autres mécanismes, non évoqués ici, sont capables
d’induire encore une plus grande diversité protéique en régulant l’état de la chromatine, l’édition des
ARN, l’interférence par les ARN ou les modifications post-traductionnelles.
La régulation de la myogenèse fait intervenir certains de ces mécanismes, comme nous l’avons vu à
travers les exemples d’épissages et de promoteurs alternatifs.
Au laboratoire, nous avons isolé une protéine impliquée dans la différenciation musculaire régulée
par la voie de signalisation PI3-K: la protéine CKIP-1.
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