Université Paris XI THESE - iramis - CEA
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<strong>Université</strong> <strong>Paris</strong> <strong>XI</strong><br />
FACULTE DE PHARMACIE DE CHÂTENAY-MALABRY<br />
ECOLE DOCTORALE :<br />
INNOVATION THERAPEUTIQUE : DU FONDAMENTAL A L’APPLIQUE<br />
PÔLE : PHARMACOTECHNIE ET PHYSICO-CHIMIE<br />
ANNEE 2001-2002 SERIE DOCTORAT N° 741<br />
<strong>THESE</strong><br />
Présentée<br />
A L’UNITE DE FORMATION ET DE RECHERCHE<br />
FACULTE DE PHARMACIE DE CHÂTENAY-MALABRY<br />
UNIVERSITE PARIS <strong>XI</strong><br />
pour l’obtention du grade de<br />
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE PARIS <strong>XI</strong><br />
par<br />
M elle Sandrine WEISSE<br />
Titre : Complexes cyclodextrines / ester de vitamine A :<br />
stabilisation, solubilisation et promotion de l’absorption cutanée.<br />
Soutenance le 14 octobre 2002 devant la commission d’examen composé de :<br />
J-C. DEBOUZY ………..Rapporteur E. FATTAL<br />
D. WOUESSIDJEWE …..Rapporteur F. DJEDAÏNI-PILARD<br />
D. DUCHÊNE ………….Président du jury P. ANDRE<br />
B. PERLY
2<br />
A mon père, à ma mère<br />
présents dans les bons comme dans les pires moments.<br />
« Le poison est dans chaque substance et rien n’est exempt de poison.<br />
Ce n’est que le dosage qui en fait soit un poison, soit un remède »<br />
Paracelse (1493-1541)
1 H-RMN : résonance magnétique nucléaire du proton<br />
Ac : anticorps<br />
AchE : acétylcholinestérase<br />
Ag : antigène<br />
BSA : bovine serum albumine<br />
CCM : chromatographie couche mince<br />
CD : cyclodextrine(s)<br />
CMC : concentration micellaire critique<br />
Chol-βCD-Ac : cholestéryl béta-cyclodextrine acylée<br />
COSY : correlation spectroscopy<br />
DIMEB : heptakis-(2,6-di-O-methyl)cyclomaltoheptaose<br />
ou diméthyl béta-cyclodextrine<br />
D2O : eau deutérée<br />
DMPC : dimyristoylphosphatidylcholine<br />
DMSO :diméthyle sulphoxyde<br />
d6-DMSO : diméthyle sulphoxyde hexadeutéré<br />
DSC : differential scanning calorimetry<br />
DTNB : 5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoique acide)<br />
E : épiderme<br />
EDTA : acide éthylène diamine tétra acétique<br />
EIA : enzyme immuno-assay<br />
HCl : acide chlorydrique<br />
HPLC : high performance liquide chromatography<br />
IgG : immonoglobuline G<br />
LR : liquide récepteur<br />
Na2CO3 : carbonate disodique<br />
NOESY : nuclear Overhauser effect<br />
PVA : propionate de vitamine A<br />
SC : stratum cornéum ou couche cornée<br />
RAMEB : randomized heptakis-(2,6-di-O-methyl)cyclomaltoheptaose<br />
ROESY : rotating frame Overhauser effect spectroscopy<br />
T : température<br />
T-ROESY : transverse rotating frame Overhauser effect spectroscopy<br />
UV : ultra-violet<br />
3
4<br />
TABLE DES MATIERES
TABLE DES MATIERES<br />
5<br />
6<br />
INTRODUCTION GENERALE 8<br />
PRESENTATION DES ACTEURS ET DU SUJET 13<br />
1.2 LE RETINOL 13<br />
1.2.1Historique 13<br />
1.2.2Structure et origine 13<br />
1.2.3Devenir dans l’organisme 15<br />
1.2.4Rôles physiologiques 17<br />
1.2.5Pénétration et absorption percutanée 22<br />
1.2.6Inconvénients liés à ses propriétés physico-chimiques 23<br />
1.3LES CYCLODEXTRINES 24<br />
1.3.1Historique des cyclodextrines 24<br />
1.3.2Structure et propriétés des cyclodextrines 26<br />
1.3.3Inclusion – Complexation 29<br />
1.3.4Applications des cyclodextrines. 33<br />
1.3.5Toxicité des cyclodextrines 34<br />
1.3.6Interaction avec les membranes biologiques 36<br />
2. TRAVAUX ANTERIEURS 42<br />
2.1MOYENS UTILISES POUR AMELIORER LA STABILITE ET LA<br />
SOLUBILITE DE LA VITAMINE A DANS LES FORMES PHARMACEUTIQUES 42<br />
2.1.1Emulsions et antioxydants 42<br />
2.1.2Microparticules 44<br />
2.1.3Divers 46<br />
2.2INCLUSION DU RETINOL DANS LES CYCLODEXTRINES 47<br />
2.2.1Méthodes de caractérisation des complexes d'inclusion 47<br />
2.2.2Essais d'inclusion du rétinol et/ou de ses esters dans les cyclodextrines<br />
naturelles ou modifiées 52<br />
3.TRAVAUX PERSONNELS 60<br />
3.2Chapitre 1 63<br />
3.2.2Article n°1 63<br />
3.2.3Brevet FR0201241 82<br />
3.2.4Article n° 2 95<br />
3.2.5Article n° 3 108<br />
3.2.6DISCUSSION 126<br />
3.3 CHAPITRE 2 132<br />
3.3.1Article n°4 138<br />
3.3.2Article n° 5 164<br />
3.3.3DISCUSSION 179<br />
CONCLUSION GENERALE 183<br />
ANNEXES 186
ANNEXE 1 : LA PEAU 187<br />
ANNEXE 2 : DOSAGES IMMUNOENZYMATIQUES 201<br />
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 214<br />
6
7<br />
INTRODUCTION GENERALE
INTRODUCTION GENERALE<br />
L'organisme vivant, en particulier humain est constitué d'un ensemble d'organes<br />
interconnectés qui communiquent entre eux par la voie de messagers, de connections directes<br />
et en particulier de la vascularisation. Ce système complexe est fragile. Il est donc important<br />
d'établir une barrière entre ce fragile assemblage de fonctions vitales et le milieu extérieur,<br />
source d'agressions multiples telles que les irradiations diverses, l'oxydation et les toxiques<br />
présents dans l'environnement. Ce rôle, dans le cas des mammifères est dévolu à la peau.<br />
Toutefois, il ne faut pas se limiter à penser que cette dernière n'est qu'une cuirasse inactive.<br />
Elle est en elle-même un élément très actif pour isoler les compartiments et limiter les<br />
agressions extérieures. Parmi ces dernières, les processus d'oxydation par l'oxygène, l'ozone et<br />
les irradiations sont des éléments majeurs car ils contribuent de façon active à la formation de<br />
radicaux libres pouvant conduire à des réactions non réversibles entraînant des affections<br />
multiples. Dans ce rôle d'interface, la peau elle-même est la première soumise à toutes ces<br />
agressions, entraînant des modifications de l'élasticité, les rides, les affections cutanées<br />
directes et pouvant aller jusqu'à la cancérisation.<br />
Ces processus sont modulés et atténués par de nombreux composants présents dans les<br />
diverses couches de la peau. Une structure détaillée de ces différentes strates sera présentée<br />
dans la suite de ce mémoire. Parmi ces composés, la vitamine A et ses dérivés jouent un rôle<br />
essentiel en particulier dans la destruction des radicaux libres. Ces composés sont présents<br />
naturellement dans la peau mais il paraît utile d'en augmenter la teneur pour retarder les effets<br />
délétères des agressions extérieures. Cette amélioration de la teneur intrinsèque en vitamine A<br />
pose toutefois de nombreux problèmes :<br />
- La vitamine A et ses dérivés sont strictement insolubles dans l'eau<br />
- Ces composés sont très facilement oxydables et cette oxydation peut conduire à la<br />
formation d'acides rétinoïques très toxiques s'ils passent dans la circulation. La localisation de<br />
ces composés actifs dans les différentes strates de la peau n'est pas indifférente.<br />
8<br />
Afin d'améliorer les performances des dérivés de vitamine A trois objectifs sont<br />
essentiels sans pour autant rêver à un "élixir de jouvence". Les compagnies pharmaceutiques,<br />
para-pharmaceutiques et cosmétiques développent sans cesse de nouveaux produits mais qui
ne sont parfois que des composés destinés à formuler la vitamine A sous forme acceptable<br />
pour la peau. Nos objectifs sont différents :<br />
- Il faut que la vitamine A soit stabilisée vis à vis de la dégradation par l'oxygène, la<br />
température et surtout la lumière.<br />
- La formation d'un composé hydrosoluble permettrait de disposer de nouvelles<br />
formulations.<br />
- Il est essentiel que le principe actif soit dirigé et reste dans les strates de la peau où<br />
son action sera optimale.<br />
Certes, de nombreuses méthodes ont déjà été utilisées pour atteindre ces objectifs,<br />
comme nous le verrons plus loin dans ce mémoire, qu’elles soient mécaniques, chimiques ou<br />
galéniques. Mais les résultats en terme de stabilité et surtout de solubilité restent insuffisants.<br />
Dans le but de remplir les objectifs précédemment cités, plusieurs solutions seront<br />
envisagées et testées ici. Ces études feront appel à de très nombreuses et diverses approches<br />
scientifiques allant de la physico-chimie aux études sur peau humaine en passant par<br />
l’immunologie, pour assurer le suivi des espèces impliquées, et la galénique. Ne désespérons<br />
donc pas de voir un jour une nouvelle classe de dérivés destinés à nous protéger d'une partie<br />
des agressions qui ne feront sans doute que croître. La nature nous a fourni des pistes, à nous<br />
de les optimiser.<br />
Notre choix concernant l’outil à utiliser c’est porté sur les cyclodextrines (CD). Celles-ci<br />
sont déjà largement utilisées dans le milieu pharmaceutique, principalement comme adjuvant<br />
de solubilisation pour améliorer la biodisponibilité de la molécule active et elles sont<br />
considérées en cosmétologie comme des promoteurs d’absorption. Notre approche consiste à<br />
utiliser les propriétés des cyclodextrines afin d’obtenir une solution aqueuse contenant une<br />
forme chimiquement stable de vitamine A et permettant une évaluation biologique de la<br />
vectorisation de la vitamine A dans la peau. Il faut entendre propriétés au sens large, que ce<br />
soit leurs propriétés d’inclusions ou de formation de systèmes organisés.<br />
9<br />
Nous avions aussi le choix quant au dérivé de vitamine A à choisir. En effet la vitamine<br />
A pure, qui correspond au rétinol est trop instable pour permettre une utilisation courante à<br />
l’échelle du laboratoire. Ainsi, il est bien plus courant d’utiliser un des esters de la vitamine
A, dont l’activité est proche. Le propionate de vitamine A (PVA) fut choisit parmi plusieurs<br />
esters de la vitamine A sur la base d’une étude préalable destinée à évaluer leur efficacité en<br />
terme de croissance sur des cultures de fibroblastes (cellules dermiques) humains. Cette étude<br />
a été effectuée il y a plusieurs années par l’équipe du département de recherche et<br />
développement de LVMH Branche Parfums et Cosmétiques à Orléans.<br />
Ce travail de thèse débute par la présentation des acteurs - à savoir la vitamine A et les<br />
cyclodextrines – et par une étude bibliographique des moyens utilisés par le passé pour<br />
améliorer les propriétés physico-chimiques de la vitamine A, y compris les cyclodextrines.<br />
La suite est consacrée aux travaux personnels et se divise en deux chapitres décrivant<br />
chacun une approche différente et donc l’utilisation d’une cyclodextrine différente.<br />
Dans le premier chapitre sont décrits les résultats obtenus avec des cyclodextrines<br />
commerciales. Les premiers essais ont été faits au cours du stage de recherche de DEA qui a<br />
précédé cette thèse, avec les cyclodextrines naturelles αCD, βCD et γCD et l’étude des<br />
composés d’inclusion obtenus est présentée dans un premier article.<br />
Les trois autres publications de ce premier chapitre sont consacrées aux résultats obtenus<br />
avec la per(2,6-O-diméthyle)βCD commerciale (Rameb). Les caractéristiques de solubilité et<br />
stabilité du complexe d’inclusion Rameb/PVA ont permis la formation d’un gel aqueux à base<br />
de Rameb/PVA et l’étude de la pénétration de l’hôte et de son invité dans des échantillons de<br />
peau. Le PVA est facilement dosé par HPLC et pour la Rameb nous nous sommes tourné vers<br />
les dosages immunoenzymatiques.<br />
10<br />
Le second chapitre est consacré à des dérivés de cyclodextrines synthétisés au<br />
Laboratoire sur le modèle des cholestéryl-cyclodextrines [Auzély-Velty, 1999, 2000], c’est à<br />
dire des dérivés obtenus en greffant un cholestérol sur une cyclodextrine monofonctionnalisée.<br />
Dans un premier article, nous regarderons les remarquables propriétés d’insertion dans les<br />
membranes du dérivé Cholestéryl-per(2,6-O-diméthyle)βCD ou Chol-Dimeb, grâce à des<br />
films modèles de phospholipides : les films noirs.<br />
Nous avons ensuite choisi un dérivé insoluble dans l’eau et capable d’interactions avec<br />
les bicouches lipidiques et l’avons rendu encore plus hydrophobe en acétylant la partie<br />
cyclodextrine. Le but est d’obtenir un composé capable de former des nanoparticules afin
d’obtenir un nouveau type de vecteur pour le PVA et d’étudier la pénétration cutanée du PVA<br />
à partir de ce vecteur.<br />
Finalement, une comparaison pourra être faite entre les résultats de pénétration sur peau<br />
obtenus avec le PVA sous forme moléculaire dans le complexe Rameb/PVA et les résultats<br />
obtenus avec le PVA sous forme particulaire.<br />
Toutes les études de pénétration sur peau ont été effectuées dans le laboratoire de<br />
toxicologie de LVMH – R&D – Branche Parfums et Cosmétique, à Orléans.<br />
L’étude des films noirs par réflectivité des rayons X a été effectuée sous la direction de<br />
J.J Benattar au Service de Physique de l’Etat condensé du <strong>CEA</strong> Saclay.<br />
11<br />
Les dosages immunoenzymatiques par compétition de la Rameb ont été effectués sous la<br />
direction de C. Créminon au Service de Pharmacologie et d’Immunologie du <strong>CEA</strong> Saclay.
12<br />
1. PRESENTATION DES ACTEURS<br />
ET DU SUJET
PRESENTATION DES ACTEURS ET DU SUJET<br />
1.2 LE RETINOL<br />
1.2.1 Historique<br />
Dès l'antiquité, on a traité avec succès des malades atteints d'héméralopie (diminution<br />
importante de la vision crépusculaire) en leur faisant absorber du foie, sans avoir la moindre<br />
idée de l'existence de substances vitaminiques. Dans la seconde moitié du <strong>XI</strong>X ième siècle,<br />
apparaît la notion que certaines affections ophtalmologiques surviennent essentiellement chez<br />
des populations ou des individus malnutris, et peuvent donc être en rapport avec une<br />
insuffisance quantitative ou qualitative de la ration alimentaire. C'est en 1909 que F.G.<br />
Hopkins et W. Stepp s'aperçoivent que certaines substances liposolubles, présentes dans<br />
l'alimentation, sont indispensables à la croissance des rats et des souris. Ce facteur de<br />
croissance liposoluble, auquel on donne le nom de vitamine A, en reprenant le terme proposé<br />
par C. Funk à propos de la thiamine, est ensuite extrait du beurre et du jaune d'œuf par E.V.<br />
McCollum et M. Davis (1913). La structure chimique est définie par P. Karrer en 1931 et la<br />
synthèse réalisée en 1947 par O. Isler dans les laboratoires F. Hoffman-La Roche [LeGrusse,<br />
1993].<br />
1.2.2 Structure et origine<br />
13<br />
La vitamine A (rétinol) est présente dans les produits d'origine animale. Elle se trouve<br />
dans la fraction lipidique, matière grasse du lait et des fromages, et dans le foie des animaux<br />
qui est l'organe de stockage. On peut donc l'extraire de ces produits naturels (huile de foie de<br />
poisson par exemple), mais ceux ci contiennent plusieurs isomères [Lehninger, 1994] et donc<br />
on n'utilise pratiquement plus actuellement en thérapeutique que la vitamine A synthétique. La<br />
vitamine A peut aussi être synthétisée par le corps humain à partie de pro-vitamine A tels les<br />
caroténoïdes (ex : béta-carotène, lycopène) que l'on trouve surtout dans les végétaux : carottes,<br />
melons, abricots, mangues, épinards, tomates.. .
Figure 1. Structure de la béta-carotène<br />
Les rétinoïdes, quant à eux, ne sont pas des vitamines mais des substances naturelles ou<br />
synthétiques qui sont dérivées de la vitamine A ou qui lui sont apparentées structurellement.<br />
Ils ne doivent pas être confondus avec elle. Ils sont pharmacologiquement plus actifs mais<br />
tératogènes. De nombreux produits ont été synthétisés dans le but de développer certaines<br />
propriétés de la vitamine A tout en diminuant les signes d'hypervitaminose. Cette dissociation<br />
des propriétés de la vitamine A est mesurée par un index thérapeutique. Trois générations de<br />
rétinoïdes ont vu le jour avec un index thérapeutique toujours plus élevé :<br />
- Première génération : dérivés naturels de la vitamine A : trétinoïne (acide trans-<br />
rétinoïque), isotrétinoïne (acide 13-cis-rétinoïque), rétinol…<br />
- Deuxième génération : rétinoïdes monoaromatiques (étrétinate, acitrétine)<br />
- Troisième génération : rétinoïdes polyaromatiques (arotinoïdes)<br />
Ci-dessous quelques exemples de structures chimiques de rétinoïdes<br />
14<br />
Figure 2 . Rétinol R= CH2OH Rétinal R= CHO<br />
Trétinoïne ou ac. rétinoïque R=COOH<br />
Figure 3. Acide13-cis-rétinoïque ou isotrétinoïne R = COOH
Figure 4. Un arotinoïde<br />
Figure 5. Etrétinate R=OC2H5<br />
Le rétinol est un alcool primaire C20H30O composé d’un noyau à six atomes de carbone et<br />
d’une chaîne latérale possédant 5 doubles liaisons conjuguées [diméthyl-3,7 (triméthyl-2,6,6<br />
cyclohexène-1 yl)-9 nonatétraène-2,4,6,8ol-1]. La forme biologique la plus active est le rétinol<br />
tout-trans ou trans-rétinol (les 5 doubles liaisons de forme trans).<br />
1.2.3 Devenir dans l’organisme<br />
15<br />
L'alimentation nous apporte de la vitamine A sous différentes formes. Les produits<br />
d'origine animale contiennent des esters du rétinol, principalement du palmitate. Les végétaux<br />
contiennent des caroténoïdes. Dans l'estomac, tous sont libérés des protéines alimentaires pour<br />
être hydrolysés dans l'intestin grêle sous l'action conjuguée de la bile et des enzymes<br />
pancréatiques. Le rétinol et les caroténoïdes sont alors incorporés aux micelles présents et<br />
absorbés par un mécanisme de transport actif. Le rétinol et les caroténoïdes sont absorbés et<br />
métabolisés à l'intérieur de la cellule intestinale. La majorité du rétinol est réestérifiée en<br />
palmitate et incorporé aux chylomicrons (lipoprotéine plasmatique constituée d’un cœur de<br />
triacylglycérols stabilisé par une enveloppe protéique et phospholipidique et qui transporte les<br />
lipides de l’intestin vers les tissus). Les caroténoïdes sont partiellement hydrolysés en rétinal<br />
par une dioxygénase puis réduits en rétinol et également incorporés aux chylomicrons. Ceux<br />
ci sont excrétés dans la lymphe qui rejoint la circulation générale par le canal thoracique. Une<br />
petite partie de rétinol et de béta-catotène passe dans la circulation sans subir de<br />
modifications. Les esters du rétinol plasmatiques sont captés par les cellules hépatiques et le<br />
rétinol est libéré par une hydrolase. Il se lie alors à un transporteur spécifique cytoplasmique,
la Retinol Binding Protéine cytoplasmique (RBPc), qui le transporte vers le site de stockage :<br />
les globules lipidiques des hépatocytes et des lipocytes. A partir du foie, le rétinol peut être<br />
libéré dans le sang où il est transporté par la Retinol Binding Protéine plasmatique (RBPp). Le<br />
rétinol lié à la RBPp se fixe sur l"albumine et le complexe ainsi formé constitue la principale<br />
forme circulante de vitamine A. Au niveau des cellules, le rétinol est reconnu par un récepteur<br />
membranaire spécifique, capté par la cellule et repris en charge par la RBPc. Il est transformé<br />
dans la cellule cible car pour être actif le rétinol doit être oxydé. Il se forme alors du rétinal<br />
qui peut se transformer par une nouvelle oxydation en acide rétinoïque tout-trans. La première<br />
réaction est réversible, la seconde ne l'est pas. L'acide rétinoïque est transporté par la RABPc<br />
dans le noyau où il exerce son action.<br />
ALIMENTATION<br />
ESTOMAC<br />
INTESTIN<br />
CELLULE<br />
INTESTINALE<br />
LYMPHE<br />
SANG<br />
CELLULE<br />
HEPATIQUE<br />
protéines animales<br />
rétinyl esters<br />
rétinyl esters<br />
rétinol<br />
micelles<br />
protéines végétales<br />
caroténoïdes<br />
caroténoïdes<br />
caroténoïdes<br />
rétinol caroténoïdes<br />
rétinyl esters rétinal<br />
chylomicrons rétinol<br />
rétinyl esters<br />
rétinol-RBPc<br />
rétinol<br />
rétinyl<br />
palmitate<br />
chylomicrons<br />
16<br />
rétinyl esters rétinol - RBPp-préalbumine<br />
globule<br />
lipidique<br />
RBPc-rétinol<br />
RALBPc-rétinal<br />
RABPc-acide<br />
rétinoïque<br />
Figure 6 . Shéma de l’absorption et distribution de la vitamine A<br />
esters<br />
phosphate<br />
glucuronide<br />
base de<br />
Schiff<br />
glucuronide<br />
AUTRE<br />
CELLULE
1.2.4 Rôles physiologiques<br />
Lors de la découverte de la vitamine A au début du siècle, deux équipes (MacCollum et<br />
Davis, Osborne et Mendel) tentèrent chacun la même expérience : une hypovitaminose induite<br />
chez le rat jeune. Celle-ci entraîne une perturbation de la croissance, les os et le système<br />
nerveux ne peuvent se développer normalement. La peau devient sèche et épaisse. La vision<br />
est fortement altérée (surtout la vision nocturne). Enfin les sujets adultes deviennent stériles.<br />
Ces molécules possèdent aussi un fort pouvoir tératogène, des malformations importantes sont<br />
observables après administration de rétinoïdes à des animaux gravides. Au fil des études il est<br />
apparu que la vitamine A était impliquée dans plusieurs fonctions majeures de l’organisme<br />
[Sporn 1986].<br />
a ) Vision (Fig.7)<br />
La vision de nuit, ou l’adaptation à l'obscurité, est un phénomène physico-chimique lié à<br />
la présence, dans les cellules en bâtonnets de la rétine, d'un pigment photosensible : la<br />
rhodopsine dont la synthèse s'effectue à partir d'un dérivé de vitamine A, le 11-cis-rétinal, et<br />
d'une protéine, l'opsine. Lorsque la rhodopsine est exposée à une lumière de faible intensité, le<br />
11-cis-rétinal est isomérisé en trans-rétinal, ce qui entraîne une cascade de réactions dont la<br />
conséquence finale est la décomposition de la rhodopsine et la production d'un influx nerveux.<br />
La vision des formes et des couleurs fait appel au même mécanisme grâce à la présence dans<br />
les cellules en cônes de la rétine de trois pigments photosensibles également synthétisés à<br />
partir du 11-cis-rétinal. Il est important de savoir que la carence en vitamine A, qui est la<br />
première cause de mortalité infantile dans de nombreux pays en voie de développement, est<br />
aussi la première cause de cécité dans le monde [Head, 1999].<br />
influx nerveux<br />
rétinol plasmatique<br />
cis-rétinal<br />
+<br />
opsine<br />
trans-rétinal<br />
+<br />
opsine<br />
obscurité<br />
RHODOPSINE<br />
lumière<br />
de faible intensité<br />
17
Figure 7. Rôle du rétinol dans le processus de vision<br />
b) Différentiation cellulaire<br />
Si le rétinal est la molécule impliquée dans la vision, c'est par contre l'acide rétinoïque<br />
qui agit dans le noyau au niveau de la différentiation cellulaire. L’acide rétinoïque et ses<br />
isomères agissent comme des hormones pour réguler l’expression des gênes et ainsi influencer<br />
de nombreux processus physiologiques. L’acide rétinoïque tout-trans est transporté par une<br />
protéine (Cytoplasmic Retinoic Acid Binding Protein) vers le noyau de la cellule où il se lie a<br />
son récepteur, le Retinoic Acid Nuclear Receptor. Ce récepteur RAR appartient à la super<br />
famille des récepteurs nucléaires recevant les stéroïdes, les prostaglandines, les hormones<br />
thyroïdiennes, la vitamine D et certaines molécules intervenant dans la prolifération de<br />
cellules spécifiques. Les isomères de l’acide rétinoïque tout-trans se lient à un récepteur<br />
légèrement différent : le RXR. Une fois liés à un acide rétinoïque, RAR et RXR forment<br />
ensemble un hétérodimère RAR/RXR qui va se lier à une région spécifique d’un chromosome<br />
appelée RARE (retinoic acid response elements), stimulant ou inhibant la transcription de<br />
certains gênes. Ainsi, en jouant le rôle de facteur de transcription de gênes spécifiques,<br />
l ‘acide rétinoïque joue un rôle majeur dans la croissance, la différentiation et la mort des<br />
cellules [Lampen, 2000 ; Lotan, 1980 ; Hoffman, 1994]. La plupart des effets physiologiques<br />
attribués à la vitamine A résultent de ce rôle dans la différentiation cellulaire.<br />
c) Reproduction<br />
La vitamine A intervient dans le développement des spermatozoïdes, des ovaires et du<br />
placenta, la croissance de l’embryon, ainsi que dans la prolifération et la différentiation de<br />
l’épithélium. Un taux sérique faible en vitamine A chez la mère est associé à une mortalité et<br />
une morbidité infantile accentuée. Une déficience en vitamine A peut donner différentes<br />
malformations embryonnaires notamment au niveau des reins, de l’œil et des oreilles [Raz,<br />
1999]. De même, les enfants de faibles poids à la naissance, les retards de croissance et les<br />
infections respiratoires résultant d’immuno-déficience sont plus communs chez les enfants nés<br />
de mère déficiente en vitamine A.<br />
d) Système immunitaire<br />
18
A ses débuts, la vitamine A était connue comme «la vitamine anti-infection » car elle est<br />
essentielle au bon fonctionnement du système immunitaire. Elle joue un rôle important dans le<br />
développement et la différentiation des cellules sanguines blanches, l’activation des<br />
lymphocytes T passant par la liaison de l’acide rétinoïque tout-trans à son récepteur RAR.<br />
e) Oncologie<br />
Le rôle déterminant de la vitamine A (par l'intermédiaire de l'acide rétinoïque) dans le<br />
contrôle de la croissance et de la différentiation cellulaire lui confère un intérêt particulier en<br />
oncologie. La vitamine A et ses esters sont capables d’inhiber la carcinogénèse. En effet, ils<br />
se sont montrés efficaces dans un certain nombre d’expériences in vivo sur des cancers du<br />
poumon, du sein, du colon, de la prostate et de la peau [Niles, 2000 ; Lippman, 1994]. De<br />
nombreux rétinoïdes on été utilisés seuls ou en association pour le traitement de plusieurs<br />
cancers, tel le carcinome des cellules basales, le carcinome des cellules squameuses de la<br />
peau, les mélanomes, le lymphome des cellules T cutanées, la leucémie aigüe à<br />
promyélocytes, les carcinomes ovariens, les carcinomes du poumon, du sein, de la prostate, de<br />
la bouche, des cellules rénales et des cellules squameuses de la tête et du cou et le syndrôme<br />
nevus displasique [Hunter, 1994].<br />
Les récepteurs RAR et RXR (qui se divisent chacun en plusieurs sous classes) semblent<br />
être exprimés différemment en fonction du tissu et de son action biologique. La relation entre<br />
les variations observées dans l’expression des récepteurs par l’organe cible et la réponse aux<br />
agents anticancéreux est actuellement le sujet de nombreuses études. Les mécanismes par<br />
lesquels les rétinoïdes exercent leur action anticancéreuse pourraient comprendre un large<br />
éventail de voies. Par exemple, une étude in vitro a montré une activité limitée des dérivés de<br />
l’acide rétinoïque sur des lignées cellulaires issues de cancer ovarien. Toutefois, une<br />
inhibition significative de la prolifération a été obtenue en associant l’acide rétinoïque tout-<br />
trans avec le TGF-bêta (transforming growth factor-beta). Ce dernier étant produit par la<br />
surface épithéliale des ovaires sains, les dérivés de l’acide rétinoïque et les inducteur du TGF-<br />
bêta pourraient avoir une activité in vivo chimio-préventive [Dabal, 1995].<br />
Le béta-carotène, en dehors de son rôle de provitamine A, possède des propriétés propres<br />
d'agent anti-oxydant. Il possède la faculté de piéger les radicaux libres et de désactiver les<br />
molécules d'oxygène hautement réactives (oxygène singulet). Un grand nombre d'études<br />
épidémiologique a démontré que de faibles apports en béta-carotène sont associés à une<br />
augmentation du risque de développer certains cancers (poumon, col utérin, œsophage, sein,<br />
vessie…..) [Le Grusse, 1994].<br />
19
Le rétinol, ses esters et les isomères de l’acide rétinoïque (tout-trans, 9cis et 13cis) sont<br />
les rétinoïdes les plus utilisés dans les essais cliniques actuellement. Mais les traitements par<br />
voie systémique sont limités par la forte toxicité de ses produits qui résulte de l’activation de<br />
nombreuses voies. Cette toxicité concerne la peau et les muqueuses (sécheresse,<br />
desquamation, prurit, dermatoses, photosensibilité), le foie (élévation réversible des enzymes<br />
hépatiques), le squelette (calcification des ligaments), le système nerveux central (migraines)<br />
et le taux sérique des lipides [Smith, 1992 ].<br />
f) Dermatologie<br />
L’action de la vitamine A sur la prolifération et la différenciation des épithéliums en fait<br />
une molécule de grand intérêt en dermatologie. La première utilisation des rétinoïdes en<br />
dermatologie remonte à 1959 avec les travaux de Stüttgen [Stüttgen, 1959] qui compris que<br />
puisque le rétinol et ses esters étaient efficaces dans le traitement de plusieurs pathologies,<br />
lorsque donnés par voie cutanée mais pas par voie orale, la molécule efficace devait être un<br />
métabolite, par exemple la forme acide. Plus tard, il rapporta des résultats probants dans le<br />
traitement de kératoses actiniques et séborrhéiques, sur les verrues de type viral et le<br />
carcinome des cellules basales. Quelques années plus tard, Kligman et coll. [Kligman, 1969]<br />
rapportèrent des effets bénéfiques sur l’acné vulgaris, les ichtyoses, le psoriasis, le lichen et<br />
les lésions précancéreuses, ainsi que les mélanomes de la peau. Plus tard, ces effets sur le<br />
traitement du vieillissement de la peau induit par les rayons lumineux furent reportés.<br />
20<br />
Les mécanismes d’action des rétinoïdes sur la peau sont encore le sujet de nombreuses<br />
recherches, mais certains faits ont déjà été clairement établis.<br />
En ce qui concerne l’épiderme, ils jouent un rôle important dans la prolifération des<br />
cellules épidermiques, la kératinisation et les phénomènes de desquamation [Torras, 1996 ;<br />
Fisher, 1996]. Ils perturbent aussi la synthèse kératinique. Des études sur des kératinocytes en<br />
culture ont montré la formation d’une kératine spécifique d’épithélium non différentié après<br />
traitement des cellules avec de l’acide rétinoïque tout-trans. D’autres études in vitro ont<br />
montré que les rétinoïdes sont capables d’inhiber la prolifération des sébocytes et de modifier<br />
leur différentiation ainsi que la composition de la matrice extracellulaire. L‘effet des<br />
rétinoïdes sur ces cellules semble être dose-dépendant [Gendimenico, 1993], en effet une<br />
étude portant sur la morphogénèse d’épithélium reconstruit a montré qu’une faible dose<br />
d’acide rétinoïque tout-trans permet une formation optimale de l’épiderme, une dose plus<br />
importante produisant un effet inverse. Au niveau dermique, ils influencent la prolifération<br />
des fibroblastes et le métabolisme du collagène. Lors de la réaction inflammatoire, ils
montrent une activité immunomodulatrice et préviennent la croissance tumorale. La forme<br />
active dans la peau est l’acide retinoïque. Par voie topique, l’acide rétinoique tout-trans est<br />
converti dans l’épiderme (et probablement dans le derme) en acide 13-cis, 9-cis, et 4-<br />
hydroxyrétinoïque. Seule la moitié approximativement reste sous forme tout-trans.<br />
Paradoxalement, in vivo, les rétinoïdes donnent des effets inverses de ce que l’on peut<br />
observer sur cultures cellulaires : les rétinoïdes induisent une hyperprolifération des<br />
kératinocytes se traduisant par une hyperplasie de l’épiderme avec accumulation de matière<br />
intercellulaire, le stratum cornéum ainsi que l’épiderme apparaissent désorganisés. Cette<br />
différence semble être due au fait que la réponse des cellules aux rétinoïdes diffère en fonction<br />
du contexte des autres signaux. De plus les cellules en cultures expriment beaucoup moins de<br />
récepteurs aux rétinoïdes que des cellules in vivo. Malgré ces observations tendant à montrer<br />
un effet négatif des rétinoïdes in vivo, ils sont très efficaces dans de nombreuses indications<br />
cliniques : acide rétinoïque tout-trans et 13-cis (Roaccutane ® ), adapalène (Differine ® ) pour<br />
l’acné, l’étrétinate (Tigason ® ) pour le psoriasis…….<br />
g) Cosmétologie<br />
21<br />
Dans le domaine de la cosmétologie, les rétinoïdes sont utilisés depuis une vingtaine<br />
d’années. Le premier article sur l’utilisation topique d’acide rétinoïque pour le traitement du<br />
vieillissement cutané induit par la lumière date de 1983. Cordero et coll. [Cordero, 1983]<br />
observèrent une amélioration des rides faciales et un adoucissement de la peau après<br />
traitement par 0.001 à 0.05% d’acide rétinoïque pendant 6 mois.<br />
L’acide rétinoïque agit sur le vieillissement photo-induit en modulant le programme de<br />
différentiation cellulaire impliqué dans la pathologie concernée [Torras, 1996]. Le<br />
vieillissement photo-induit de la peau se traduit au niveau épidermique par d’importants<br />
dommages, à savoir une grande atypie cellulaire, la mort prématurée de certaines cellules avec<br />
contraction du cytoplasme et perte de la membrane cellulaire, enfin la perte de la polarité et<br />
l’apparition de modèles désorganisés (dysplasie). Ces changements se traduisent rapidement<br />
cliniquement par une atrophie avec diminution du nombre de couches cellulaires, par des<br />
cellules plus petites, rétractées, par l’aplatissement de la jonction dermo-épidermique et par<br />
l’apparition de gros granules de mélanines près du noyau des kératinocytes. Il est observé un<br />
épaississement irrégulier avec des infiltrats inflammatoires et une dégénérescence massive<br />
élastosique. Après traitement par l’acide rétinoïque on observe au microscope une disparition<br />
quasi-totale de la dysplasie et de l’atypie, il y a restauration de la polarité, élimination des
kératoses actiniques, l’épiderme rosit et la couche cornée devient plus fine. Les mélanocytes<br />
qui avaient tendance à emmagasiner des amas de grains de mélanine, donnant une apparence<br />
tachetée à la peau, reprennent leur aspect normal et leur contenu en mélanine devient plus<br />
uniforme. Les cellules de Langerhans sont plus actives, ce qui implique une plus grande<br />
immunocompétence. Macrocospiquement, les rides profondes et l’aspect râpeux au toucher<br />
sont significativement améliorés mais moins que les rides superficielles [Montassier, 1996].<br />
Au niveau du derme, la peau présentant un vieillissement photo-induit contient peu de<br />
fibrocytes, ceux ci sont déformés, peu actifs et dans certains cas la membrane est rompue. Le<br />
collagène présent sous la lame basale est tacheté, éparpillé, rompu et distribué au hasard.<br />
Après traitement par l'acide rétinoïque les fibroblastes deviennent hyperactifs, la lame basale<br />
est réparée et du collagène nouvellement formé et d'apparence normale est retrouvé sous<br />
forme de faisceaux orientés parallèlement à la basale, repoussant vers le derme plus profond le<br />
vieux matériel élastosique. Tout ceci explique l'amélioration des fines ridules et tendrait à<br />
prouver qu'un traitement prolongé pourrait améliorer les rides plus profondes.<br />
1.2.5 Pénétration et absorption percutanée<br />
Les rétinoïdes appliqués par voie cutanée sont thérapeutiquement actifs à faible<br />
concentration. Les études de pharmacocinétique cutanée se concentrent sur le shéma de<br />
distribution dans la peau, l’atteinte de la circulation sanguine et le mode d’excrétion. Deux<br />
voies de pénétration doivent être prises en compte (cf. Annexe 1 – La peau) : la voie<br />
transépidermale, qui donne lieu à une augmentation typique du gradient de concentration<br />
épiderme/derme et qui fait très certainement partie du mode d’action impliqué dans les<br />
désordres de la kératinisation ; et la voie transfolliculaire qui intervient dans les désordres<br />
folliculaires tels que l’acné. La partie cutanée de la pharmacocinétique des rétinoïdes dépend<br />
largemant de leur structure chimique et donc varie. Toutefois, on trouve des aspects communs<br />
comme de hautes concentrations cutanées, alors que le passage dans la circulation générale<br />
parait faible, donnant lieu à des concentrations difficilement mesurables. Pour la<br />
pharmacocinétique, l’application topique présente des intérêts majeurs par rapport à la voie<br />
systémique. Les rétinoïdes peuvent être ciblés vers le site voulu, avec une toxicité systémique<br />
supprimée.<br />
22
1.2.6 Inconvénients liés à ses propriétés physico-chimiques<br />
Outre la toxicité, la vitamine A pose d’autres problèmes : insolubilité totale dans l’eau<br />
et instabilité chimique. Le rétinol et ses esters se présente sous forme de cristaux ou de<br />
solutions huileuses insolubles dans l’eau, solubles dans les solvants organiques (alcool,<br />
acétone, éther, chloroforme..)<br />
⇒ Solubilité : le rétinol tout-trans est un composé hydrophobe et liposoluble : il est<br />
pratiquement insoluble dans l'eau mais facilement soluble dans les solvants organiques<br />
(éthanol, chloroforme, éther, éther de pétrole,.......).<br />
⇒ Stabilité : il est hautement instable en présence d'oxygène (ou d'oxydants) et se<br />
décompose en quelques jours à l'air libre. Il est aussi très sensible à la lumière et à la chaleur :<br />
la lumière catalyse l'isomérisation des doubles liaisons et lorqu'elle est très intense d'autres<br />
réactions photochimiques plus drastiques ont lieu, provoquant une dimérisation et amenant à<br />
la formation de kitol et autres dimères. En absence d'oxygène, la formation de kitol ou la<br />
dégradation de la vitamine A sera beaucoup plus rapide si les échantillons sont éclairés. Et<br />
même dans des conditions parfaitement inertes, la stabilité dans le noir de la vitamine A n'est<br />
pas infinie Ceci est du à la formation de kitol induite par la chaleur [Runge, 2000].<br />
La vitamine A est stable en milieu basique mais très sensible aux acides qui provoquent<br />
des réarrangements des doubles liaisons de la chaîne aliphatique. On obtient alors un mélange<br />
de produits déshydratés et réarrangés sous l'effet de l'oxydation [Blomhoff, 1994].<br />
Les esters du rétinol sont un peu plus stables à l'air mais en fait l'isomérisation n'est que<br />
ralentie. En effet, en solution en milieu acide, on aura toujours une évolution lente de la forme<br />
native tout-trans vers la forme cis (i.e., 13-cis rétinol, 9-cis rétinol et 9, 13-di-cis rétinol) pour<br />
aboutir à un mélange d'environ 66% de tout-trans et 33% de forme cis, qui est moins active<br />
[Sarama , 1995].<br />
23<br />
Les chercheurs ont donc du faire preuve d’ingéniosité pour trouver des formulations<br />
permettant d’améliorer la stabilité et la solubilité de la vitamine A afin de favoriser son<br />
incorporation dans les différentes formes galéniques actuellement utilisées, comme nous le<br />
verrons dans la section 2.1 (section Travaux antérieurs).
1.3 LES CYCLODEXTRINES<br />
1.3.1 Historique des cyclodextrines<br />
En 1891, Villiers [Villiers, 1891] isolait pour la première fois un groupe<br />
d’oligosaccharides non réducteurs provenant de la dégradation enzymatique de l’amidon par<br />
une amylase (cyclodextrine glucosyl transférase) produite par différents bacilles dont Bacillus<br />
macerans. Villiers a isolé 3 g d’une substance cristalline ((C6H10O5)2 3H2O) à partir de la<br />
digestion de 1 kg d’amidon par une souche de micro-organismes. Ces produits (Villiers met<br />
en évidence la présence de deux produits, probablement l’α- et la β-cyclodextrine) possèdent<br />
des particularités physico-chimiques proches de celles de la cellulose, il les baptise donc<br />
« cellulosines ».<br />
Schardinger [Schardinger, 1904 et 1905], 20 ans plus tard, isole la souche microbienne<br />
responsable de la formation de ces « cellulosines », qu’il dénomme Bacillus Macerans et,<br />
décrit le mode de purification et de préparation de ces oligosaccharides. Il met aussi en<br />
lumière la capacité de ces dextrines (appellation générale des produits de dégradation de<br />
l’amidon) à former des adduits particuliers avec les molécules de diiode. La distinction entre<br />
l’α-dextrine et la β-dextrine est due à leur différence quant aux complexes cristallins formés<br />
avec l’iode. Le complexe de l’α-dextrine est gris-vert alors que celui formé par la β-dextrine<br />
est rouge-brun.<br />
C’est en 1932 que Prigsheim [Prigsheim, 1932] et son équipe démontrent que ces<br />
produits ont la propriété de former des complexes avec des molécules organiques. D. French,<br />
F. Cramer et K. Freudenberg contribuèrent également grandement à la connaissance des<br />
cyclodextrines et à l’élucidation de leur structure durant les années 30-40. Freudenberg et son<br />
équipe démontrent alors que ces oligosaccharides sont constitués d’un enchaînement de n<br />
unités α-D-glucopyranosidiques, la fraction principale contenant<br />
l’alpha et la bêta-cyclodextrine (possédant respectivement 6 et 7 unités). De même le postulat<br />
en la capacité des cyclodextrines à former des composés d’inclusion [Freudenberg, 1938] est<br />
posé. C’est cette même équipe qui, en 1948, découvre la γ-cyclodextrine (constituée de 8<br />
unités glucose) et qui détermine entièrement sa structure [Freudenberg,1953].<br />
Au début des années 1950, les équipes de French et de Cramer étudièrent de façon<br />
intensive les productions enzymatiques de cyclodextrines, leurs purifications, et leurs<br />
caractérisations physico-chimiques.<br />
24
HO<br />
HO<br />
HO<br />
HO<br />
O<br />
O<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
OH<br />
O<br />
OH<br />
HO<br />
O<br />
HO<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
HO<br />
OH<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
γ cyclodextrine<br />
O<br />
HO<br />
HO<br />
HO<br />
O<br />
HO<br />
O<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
Forme spatiale<br />
HO<br />
4<br />
3<br />
Forme spatiale<br />
OH<br />
6 6 '<br />
5<br />
2<br />
O<br />
OH 1<br />
O<br />
1<br />
Unité glucose en C4 Figure 8. Formule générale des CDs et représentation schématique de leur structure<br />
tridimensionnelle.<br />
Cette propriété des cyclodextrines à former des complexes d’inclusion devient alors le<br />
sujet d’études intensives, notamment par l’équipe de Cramer [Cramer, 1954]. C’est ainsi que<br />
le tout premier brevet concernant l’application des cyclodextrines pour la mise en forme d’un<br />
composé à activité biologique est déposé en 1953 [Freudenberg, 1953]. A partir de ce<br />
moment, on observe une recrudescence de l’étude des cyclodextrines, tant du point de vue de<br />
leur fabrication industrielle, que de l’exploitation de leurs propriétés, de leurs modifications<br />
chimiques ou bien encore, de leurs domaines d’applications [Duchêne, 1991 ; Atwood, 1996 ;<br />
Wenz ,1994 ; Chem. review, 1998].<br />
1.3.2 Structure et propriétés des cyclodextrines<br />
Les cyclodextrines (CD) sont donc des oligosaccharides cycliques non-réducteurs<br />
obtenus industriellement par dégradation enzymatique de l’amylose (forme linéaire de<br />
l’amidon) à l’aide d’une enzyme, la cyclodextrine glucosyltranférase (CGTase). Les trois<br />
types de CD les plus couramment rencontrés sont l’α, la β et la γCD, qui sont constitués<br />
respectivement de 6, 7 et 8 unités D-glucopyranosiques, liées en α-1,4.<br />
Nomenclature.<br />
L’appellation IUPAC de la β-cyclodextrine, est : 5,10,15,20,25,30,35 -heptakis<br />
(hydroxymethyl)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29,32,34-tétradécaoxaoctacyclo<br />
25<br />
[31.2.2.2 3,6 .2 8,11 .2 13,16 .2 18,21 .2 23,26 .2 28,31 ] nonatétracontane-36,37,38,39, 40,41,42,43,44,45,46,
47,48,49-tétradécole. Dans un souci de clarté, on retrouve diverses appellations dans la<br />
littérature : β-dextrine de Schardinger, cyclomaltoheptaose, cycloheptaglucane,<br />
cycloheptaamylose, β-CD, ou bien encore C7A pour la β-cyclodextrine. Dans cette étude<br />
le terme βCD ou βcyclodextrine sera utilisé.<br />
Les structures tridimensionnelles des CD ont pu être obtenues à partir de l’étude de leurs<br />
monocristaux par diffraction des rayons X (et même, de quelques monocristaux de complexes<br />
CD-invitée) ce qui a permis de mettre en évidence la structure tronconique des CD ainsi que<br />
de déterminer les dimensions des cavités de chacune d’elles [Saenger, 1984].<br />
Figure 9. Structures tridimensionnelles des cyclodextrines naturelles (α, β, et γCD de gauche à droite),<br />
avec de haut en bas: une vue de la face des hydroxyles secondaires (« grand côté »), une vue latérale et, une<br />
vue de la face des hydroxyles primaires (« petit côté »). En bas, les dimensions respectives des CD obtenues<br />
d’après les données cristallographiques.<br />
26
Ces études ont permis de montrer que l’extérieur des CD est tapissé par les fonctions<br />
hydroxyles des unités glucose, tandis que les atomes de carbone et d’hydrogène tapissent<br />
l’intérieur de la cavité. La structure des cyclodextrines, alliée à l’orientation particulière<br />
adoptée par les diverses fonctions hydroxyles des unités glucopyrannose, donnent aux CD leur<br />
caractère amphiphile caractéristique, du à un extérieur relativement hydrophile (surface de<br />
contact avec le solvant) et à un cœur relativement hydrophobe (surface de contact avec la<br />
molécule invitée).<br />
Figure 10. Représentation d’un cycle α-D-glucose en conformation chaise 4 C1 et représentation<br />
schématique de la coupe transversale d’une cyclodextrine avec numérotation des atomes de carbones.<br />
Les cyclodextrines présentent donc une forme torique, le côté le plus étroit étant appelé<br />
face primaire (les hydroxyles primaires y étant situés) et le côté le plus large, face secondaire<br />
(les deux groupes hydroxyles secondaires de chaque unité y étant localisés).<br />
De plus, on entrevoit sur la figure, que les hydroxyles primaires et secondaires forment un<br />
réseau dense de liaisons hydrogène, contribuant ainsi à la rigidité du macrocycle, et stabilisant<br />
la forme tronc-conique des molécules. Cette structure spatiale des CD est aussi responsable de<br />
certaines de leurs caractéristiques physico-chimiques.<br />
La cavité interne du tore est relativement apolaire car tapissée de deux couronnes de<br />
groupes CH (protons H3 près de la face secondaire et protons H5 près de la face primaire),<br />
séparées par les oxygènes glucosidiques. On peut distinguer sur la figure ci-dessus que tous<br />
les protons H3 et H5 des différentes unités glucose pointent vers l’intérieur de la cavité des<br />
CD, particularité importante pour l’étude par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) des<br />
propriétés d’inclusion de ces molécules, comme cela sera explicité par la suite.<br />
27
Tableau 1. Caractéristiques physico-chimiques des principales cyclodextrines [Szjetli1988]<br />
αCD βCD γCD<br />
Nombre d’unités glucose 6 7 8<br />
M (g/mol) 972 1135 1297<br />
Formule brute C36H60O30 C42H70O35 C48H80O40<br />
Solubilité dans l’eau à 298K (g/L) 145 18,5 232<br />
[α] D 25°C 150 ±0,5 162,5 ± 0,5 177,4 ± 0,5<br />
Volume approximatif de la cavité (10 6 pm 3 ) 174 262 427<br />
Diamètre de la cavité (grand côté-petit côté)<br />
( )<br />
28<br />
4,7-5,3 6,0-6,5 7,5-8,3<br />
Il est à remarquer la faible solubilité de la βCD en comparaison de celles de l’α et de la<br />
γCD. Cette perte de solubilité, dont les causes n’ont pas été totalement éclaircies, semble due<br />
au réseau de liaisons hydrogène particulièrement fort dans le cas de CD à 7 unités. Lors de<br />
synthèses de βCD modifiées, mono- ou poly-modifications, les solubilités obtenues sont alors<br />
très largement augmentées par rapport à la CD naturelle, y compris après greffage de<br />
groupements relativement hydrophobes, renforçant l’hypothèse du réseau stabilisant. Dans le<br />
cas de l’αCD cette ceinture de liaisons H est incomplète, l’une des unités étant dans une<br />
position distordue, il n’y a donc que 4 liaisons formées (au lieu des 6 prévues). Pour ce qui est<br />
des CD de taille supérieure δ-, ε-… celles-ci se présentent sous forme de cylindre non
égulier, effondré en leur centre, de ce fait, leur cavité se trouve être plus petite que celle de la<br />
γCD.<br />
C’est le caractère amphiphile lié à leur structure tridimensionnelle qui donne aux<br />
cyclodextrines leur propriété la plus intéressante, celle de former des complexes<br />
supramoléculaires en solution aqueuse avec une (des) molécule(s) invitée(s).<br />
1.3.3 Inclusion – Complexation<br />
1.3.3.1 Inclusion<br />
Les CD sont, de ce fait, des composés de choix pour l’inclusion de molécules<br />
hydrophobes à la condition que la taille de ces invités s’accorde aux dimensions internes de la<br />
cavité. Les CD peuvent ainsi inclure partiellement ou en totalité un composé invité, ce qui<br />
donne alors lieu à la formation de complexes comportant éventuellement plusieurs molécules<br />
(1 ou 2) de CD ou de molécules invitées. De nombreux exemples de complexes CD-invité,<br />
avec divers arrangements structuraux, se trouvent ainsi décrits dans la littérature. Les<br />
structures des principaux complexes ayant fait l’objet de publications sont représentées sur la<br />
figure suivante.<br />
Figure 11. Diverses structures de complexes cyclodextrines-invités, en solution aqueuse, décrites dans la<br />
littérature a) inclusion complète ; b) inclusion « axiale » ; c) inclusion partielle ; d) complexe 2:1 ; e) complexe<br />
1:2 ; f) complexe 2:2 ; g) complexe « non-spécifique ».<br />
Ces structures peuvent être mises en évidence et caractérisées en employant diverses<br />
techniques d’analyses physico-chimiques, comme la spectroscopie UV-visible,<br />
la spectroscopie de fluorescence, l’analyse cristallographique, la spectroscopie RMN ou bien<br />
encore, à l’aide des méthodes d’analyses électrochimiques [Szente, 1996].<br />
29
La taille des CD peut être un facteur limitatif important quant à leur capacité à former des<br />
complexes d’inclusion et à leurs stabilités relatives. Ainsi, en relevant diverses valeurs de<br />
constantes de complexation (K de l’équilibre hôte-invité, dans des cas de complexes 1:1)<br />
parues dans la littérature, Connors a tracé la fréquence de distribution des constantes de<br />
complexation pour les complexes formés par l’α, la β et la γCD [Connors, 1997].<br />
Figure 12. Distribution des constantes de complexation des complexes 1:1 formés par les différentes<br />
cyclodextrines naturelles.<br />
Une distribution quasi-gaussienne de ces constantes de complexation est observée, quelle<br />
que soit la CD naturelle considérée. Une valeur moyenne de K a pu alors être extraite pour<br />
chacune de ces CD, dans le cas de complexes 1:1 (avec σ l’ecart type observé).<br />
Tableau II: Paramètres utilisés pour établir les courbes de distributions des constantes de complexation<br />
des différentes CDs dans le cas de complexes 1:1.<br />
30<br />
Molécule<br />
hôte<br />
Nombre de constantes de<br />
complexation prises en<br />
compte<br />
Nombre de systèmes<br />
hôte-invité 1:1 différents<br />
log (K)moy.<br />
(M-1 )<br />
σ<br />
(M-1 )<br />
αCD 960 663 2,11 0,90<br />
βCD 1142 721 2,69 0,89<br />
γCD 188 166 2,55 0,93<br />
Il apparaît alors que toutes les cyclodextrines naturelles présentent une valeur moyenne<br />
de constante de complexation relativement faible (Ka~10 3 M -1 ). Il est à noter que c’est grâce à<br />
la faible sélectivité du processus de complexation par les CD qu’il a été possible de multiplier<br />
le nombre et la diversité des molécules invitées.
Des modifications chimiques du macrocycle ont été envisagées de façon à permettre<br />
l’accroissement des constantes de complexation des complexes supramoléculaires formés par<br />
les CD. Il est même possible de synthétiser des CD “sur mesure”, c’est à dire modifiées de<br />
façon à accroître leur affinité pour une molécule précise [Djedaïni-Pilard, 1993]<br />
1.3.3.2 Energies mises en cause.<br />
En solution aqueuse la cavité des CD est occupée par des molécules d’eau énergiquement<br />
non-favorables (interaction polaire-apolaire), ce qui permet une substitution aisée par des<br />
molécules invitées de moindre polarité que l’eau.<br />
Plusieurs contributions énergétiques ont été mises en évidence pour expliquer les<br />
interactions en jeu lors de la formation de complexes par des cyclodextrines.<br />
- Adaptation stérique : par des changements conformationnels de la molécule invitée<br />
et/ou de la cyclodextrine (conformation induite) lors du processus d’inclusion.<br />
- Formation de liaisons hydrogène.<br />
- Interactions de Van der Waals : forces de dispersion de London et interactions dipôle-<br />
dipôle induit.<br />
- Interactions hydrophobes, dipôle-dipôle, de transfert de charges et électrostatiques.<br />
- Relargage de molécules d’eau à «haute-enthalpie» de la cavité de la cyclodextrine.<br />
- Relargage de molécules de solvant de la cavité de la cyclodextrine avec un gain<br />
d’entropie.<br />
- Relâchement des tensions du macrocyle.<br />
C’est l’action simultanée de plusieurs de ces interactions qui rend effective l’inclusion<br />
spécifique, les phénomènes de reconnaissances moléculaires étant dus à la coopération de<br />
multiples interactions faibles. Ce phénomène d’inclusion-complexation ne fait intervenir<br />
aucune liaison covalente mais uniquement des forces telles que les liaisons hydrogène ou des<br />
interactions de Van der Waals, ce qui permet ainsi le relargage de la molécule invitée, ouvrant<br />
la voie à de multiples applications.<br />
1.3.3.3 Conséquences.<br />
31
L’inclusion d’invités dans la cavité des CD, influence nombres de propriétés de<br />
ceux-ci, ouvrant la voie à de nombreuses études tant théoriques qu’industrielles. Les<br />
propriétés physico-chimiques des invités se trouvent modifiées du fait de la formation de<br />
complexe d’inclusion :<br />
- Le déplacement chimique en RMN est modifié du fait de ce changement<br />
d’environnement anisotropique.<br />
- Lorsque des composés achiraux sont inclus dans une CD, le complexe formé est<br />
optiquement actif et montre un important effet de Cotton induit en dichroïsme circulaire.<br />
- Parfois le maximum en UV est déplacé de plusieurs nm.<br />
- La fluorescence est aussi très influencée car la molécule fluorescente passe d’un milieu<br />
aqueux à un milieu apolaire.<br />
La réactivité chimique des molécules incluses est aussi modifiée lors de l’inclusion. Le<br />
plus souvent elle est diminuée car l’invité se trouve stabilisé, mais la cyclodextrine peut aussi<br />
agir comme catalyseur. La diffusion et la volatilité sont modifiées, ainsi que les propriétés<br />
chromatographiques des molécules incluses, en particulier en chromatographie chirale.<br />
1.3.4 Applications des cyclodextrines.<br />
Le phénomène d’inclusion dans les molécules cages hydrophiles que sont les CD, fournit<br />
à la recherche fondamentale un modèle d’étude des réactions enzymatiques, catalytiques, ou<br />
de complexations. De nombreuses et diverses applications des CD sont décrites dans la<br />
littérature, ainsi que dans les registres de brevets. Toutes ces applications tirent parti des<br />
propriétés complexantes en milieu aqueux des CD avec un panel impressionnant de molécules<br />
invitées. De nombreuses applications technologiques découlent de l’observation faite que, par<br />
la formation du complexe d’inclusion, la stabilité, la solubilité, la bio-disponibilité, la durée<br />
de vie, la toxicité et l’odeur de la molécule invitée se trouvent favorablement modifiées.<br />
[ Loftsson, 1998b ; Duchêne, 1987 ; Chem. review, 1998]<br />
- Complexant<br />
32<br />
La formation de ces complexes d’inclusion est mise à profit, non seulement dans le<br />
domaine pharmaceutique (solubilisation, stabilisation, masquage d’effets secondaires)<br />
[Duchêne, 1987 ; Duchêne 1991], mais aussi dans les industries chimiques et agro-<br />
alimentaires [Hedges, 1998] (stabilisant d’arômes, protection des vitamines, extraction du
cholestérol). Citons aussi l’utilisation toute récente, dans des produits vaporisés sur tissus, de<br />
la CD pour masquer les odeurs désagréables [Noh, 1998].<br />
- Vectorisation<br />
Les cyclodextrines sont aussi employées comme vecteur [Uekama, 1998], pour le ciblage<br />
de médicaments. Quelques tentatives d’emploi des cyclodextrines dans un but de vectorisation<br />
de principes actifs ont été réalisées. Le schéma employé est identique dans toutes les<br />
approches relevées : on part de la structure de base des CD sur laquelle on greffe<br />
chimiquement une «antenne » destinée à assurer la fonction de ciblage. L’originalité des<br />
différentes approches réside essentiellement dans la pertinence du choix de cette antenne,<br />
ainsi que dans l’approche synthétique employée lors de la réalisation de ces conjugués [Péan,<br />
1998].<br />
- Catalyseurs - Modèles d’enzymes artificielles<br />
En plus de la sélectivité des complexes hôte-invité, les cyclodextrines possèdent des<br />
propriétés catalytiques à rapprocher de celles des enzymes (inhibitions compétitives, cinétique<br />
de Michaelis-Menten). Les CD ont été largement étudiées en tant que modèle enzymatique de<br />
l’α-chymotrypsine, de l’anhydrase carbonique et, des ribonucléases ainsi que comme<br />
inducteur de chiralité dans des réactions aussi diverses que la réduction de céto-acides,<br />
l’halogénation, l’oxydation de sulfures, l’époxidation, certains réarrangements<br />
sigmatropiques, l’addition de Michaël, les réactions de Diels-Alder et de Wittig, en utilisant<br />
un réactif achiral et un substrat prochiral [Takahashi, 1994 ; Breslow, 1992 ; Breslow, 1998].<br />
- Complexant chiral<br />
Les CD sont aussi utilisées en séparation énantiomérique par électrophorèse capillaire,<br />
chromatographie en phase gazeuse ou chromatographie liquide haute performance. Ce sont,<br />
cependant, les applications en séparation chirale (colonnes CLHP, CPG), dans le domaine de<br />
la formulation de médicaments (galénique) et de l’industrie<br />
agro-alimentaire qui ont donné lieu aux plus nombreuses applications des CD. Celles-ci ont<br />
eu pour conséquences les dépôts de nombreux brevets nationaux et internationaux couvrant<br />
l’exploitation de ces applications. Les cyclodextrines ont aussi été utilisées en RMN comme<br />
auxiliaires chiraux pour la détermination d’excès énantiomériques [Gosnat, 2000].<br />
33
1.3.5 Toxicité des cyclodextrines<br />
Le profil toxicologique des 3 cylodextrines naturelles les plus communes et de certains<br />
dérivés chimiquement modifiés a récemment été passé en revue [Loftsonn, 1998b ;<br />
Frömming, 1994]. En général, les cyclodextrines naturelles et leurs dérivés plus hydrophiles<br />
sont seulement capables de passer à travers les membranes biologiques lipophiles, telles la<br />
cornée, les muqueuses ou la peau, avec de grandes difficultés. Même la βCD méthylée qui est<br />
plus ou moins lipophile ne passe pas facilement les membranes biologiques lipophiles, bien<br />
qu’elle interagisse de manière plus efficace avec les membranes que les dérivés hydrophiles.<br />
Gerloczy et coll. [Gerloczy, 1988] ont ainsi montré que seule une très faible quantité de<br />
diméthyl-βcyclodextrine radiomarquée est absorbée transdermiquement. On peut supposer<br />
que le haut poids moléculaire des CD est une des causes limitant ce passage.<br />
Toutes les études de toxicité ont démontré que l’administration orale de cyclodextrines<br />
est non-toxique, ceci étant du à leur très faible absorption gastro-intestinale (0.1 à 3%). Le<br />
caractère hémolytique des cyclodextrines est bien connu mais n’apparaît en fait qu’à forte<br />
concentration : en effet à faible concentration (5mmol pour l’αCD et 10mmol pour la βCD)<br />
les cyclodextrines protègent les globules rouges contre l’hémolyse osmotique et l’hémolyse<br />
induite par la chaleur alors qu’à forte concentration elles provoquent l’hémolyse en<br />
complexant et relarguant le cholestérol des membranes cellulaires. Cette action hémolytique<br />
est faible avec la γCD mais plus forte avec l’αCD et la βCD et cette propriété conditionne les<br />
effets des CD par voie intraveineuse ou intramusculaire. Un certain nombre d’études<br />
toxicologiques ont montré que la γCD, la 2-hydroxypropyl-βCD, la sulfobutyléther-βCD et<br />
la maltosyl-βCD sont sans danger même pour l’administration parentérale. Par contre, l’αCD,<br />
la βCD et les βCD méthylées ne sont pas acceptables pour l’administration parentérale<br />
(irritation à l’injection pour les trois et très forte néphrotoxicité pour α et β).<br />
34<br />
Les cylodextrines ont longtemps été accusées de provoquer des irritations lors de leur<br />
application cutanée [Uekama, 1982], ceci étant lié directement à leur pouvoir hémolytique et<br />
donc à leur capacité à inclure les différents constituants des membranes biologiques. Mais une<br />
étude, consistant en l’application de quantités équivalentes à 2mg de CD sur 1 cm 2 de peau<br />
(volontaires sains avertis) et utilisant un vélocimètre laser Doppler afin de mesurer la
vasodilatation éventuelle de la peau, a démontré clairement l’absence d’effet irritant (après<br />
24h d’occlusion) des cyclodextrines naturelles, de la diméthyl-βcyclodextrine et des dérivés<br />
hydroxypropyl de la βCD et la γCD [Montassier, 1996]. Il a aussi été montré par cette même<br />
technique que l’utilisation du complexe d’inclusion βCD/acide rétinoïque permettait de<br />
réduire significativement l’irritation cutanée produite par le principe actif seul [Amdidouche,<br />
1994]. De plus il faut souligner le fait que cet effet irritant “supposé” est lié aux<br />
cyclodextrines vides et que dans leur utilisation habituelle celles-ci sont, pour un temps donné<br />
sous forme compléxée.<br />
Ainsi la per(2,6-O-diméthyle) βCD randomisée ou Rameb, qui sera largement utilisée<br />
dans notre étude semble ne présenter ancune irritation lorsqu’elle est administrée par voie<br />
nasale, cutanée ou oculaire [Loftsonn, 1998b]. Aucun effet tératogène ou embryotoxique n’a<br />
été relevé au cours des différentes études effectuées dans ce but chez le rat.<br />
1.3.6 Interaction avec les membranes biologiques<br />
Figure 13. Représentation shématique d’une bicouche membranaire<br />
35<br />
Les membranes biologiques telles la peau, la cornée ou les muqueuses forment une<br />
barrière lipophile vis à vis de la pénétration de principes actifs. Les principes actifs<br />
relativement lipophiles sont capables de passer à travers ces membranes par diffusion passive.<br />
La possibilité de passage des CD à travers les membranes biologiques a longtemps été<br />
considérée comme très improbable du fait de leur hydrophilie et de leur haut poids
moléculaire. Mais, comme nous l’avons brièvement mentionné dans le chapitre précédent,<br />
cette supposition a ensuite été démentie preuves à l’appui. Arima et coll. [Arima, 1990] ont<br />
mis en évidence la pénétration importante des cyclodextrines au travers de la peau dans les<br />
heures qui suivent leur application et dans l’ordre croissant suivant : βCD < diméthyl-βCD <<br />
hydroxypropyl-βCD. Plus tard, Vollmer et coll. [Vollmer, 1992] ont montré, en travaillant sur<br />
l’hydroxypropyl-βCD radio-marquée qu’elle pénétrait, en forte quantité dans le stratum<br />
cornéum, couche superficielle compacte et hydrophile, ainsi que dans les couches profondes<br />
hydrophiles tels le derme et l’épiderme.<br />
La diffusion passive des molécules lipophiles à travers les membranes biologiques est<br />
régie par la concentration en principe actif dans le milieu aqueux extérieur de la membrane<br />
(larmes, salives) ou dans le vecteur aqueux qui contient le principe actif (hydrogels, crèmes<br />
hydrophiles). Ainsi une plus grande perméabilité pourrait être obtenue avec des principes<br />
actifs qui soient à la fois lipophiles et très solubles dans le milieu aqueux extérieur. Cette<br />
réflexion a amené les chercheurs à utiliser les cyclodextrines comme un moyen d’améliorer la<br />
pénétration de certains principes actifs et donc de conférer aux cyclodextrines le rôle de<br />
promoteur d’absorption. Par exemple la solubilisation de la testostérone par la formation d’un<br />
complexe avec l’hydroxypropyl-βCD provoque une augmentation significative de son<br />
passage au travers de la peau de souris nue. Cette même expérience a montré qu’un excès d’<br />
hydroxypropyl-βCD provoquait à l’opposé une réduction de la distribution dermique et<br />
transdermique [Loftsson, 1998a]. Des résultats intéressants ont été obtenus avec les anti-<br />
inflammatoires. Des travaux réalisés chez le rat ont montré que le pouvoir anti-inflammatoire<br />
de ce produit était augmenté par inclusion dans une cyclodextrine dans l’ordre croissant<br />
suivant : βCD < diméthyl-βCD < hydroxypropyl-βCD. Bien que ces cyclodextrines soient<br />
capables de pénétrer dans la peau, la plus grande activité des produits n’est pas due à une<br />
altération de celle-ci car un simple prétraitement local par une solution de cyclodextrine n’a<br />
aucun effet sur l’absorption du principe actif. De plus les auteurs ont noté que la pénétration<br />
de la CD dans la peau augmente la résistance de celle-ci au principe actif. Cet effet négatif est<br />
donc plus que compensé par l’inclusion dans la CD qui augmente la quantité de principe actif<br />
soluble disponible en surface. D’autres auteurs ont mis en évidence l’augmentation du<br />
pouvoir anti-inflammatoire de l’indométacine lorsqu’elle est présente dans le gel aqueux sous<br />
forme de complexe avec la βCD ou l’hydroxypropyl-βCD [Duchêne, 1996].<br />
36
Mais comment les CD augmentent-elles la perméabilité d’un principe actif à travers les<br />
membranes biologiques ?<br />
Il est généralement reconnu que les CD se comportent comme de véritables vecteurs en<br />
gardant le principe actif en solution et en le distribuant dans les membranes biologiques. Les<br />
membranes lipophiles ayant peu d’affinité pour les cyclodextrines, la majeure partie de celles-<br />
ci reste dans le milieu aqueux extérieur. Les promoteurs d’absorption classiques, comme les<br />
alcools ou les acides gras, agissent en bouleversant les couches lipidiques de la membrane.<br />
Mais ce n’est pas le cas pour les cyclodextrines, malgré leur faculté à inclure dans leur cavité<br />
le cholestérol et les lipides, car on sait que le prétraitement de la peau par une solution de<br />
cylodextrines n’améliore pas le passage cutané d’un principe actif, de plus les cylodextrines<br />
présentes à la surface le sont sous forme déjà complexée et leur aptitude à capter les<br />
constituants membranaires dépend alors, en solution, des différentes constantes d’affinité<br />
mises en causes.<br />
Les cyclodextrines exercent leur rôle de promoteur d’absorption en augmentant la<br />
solubilité du principe actif et donc la quantité disponible à la surface de la barrière biologique.<br />
En effet, la dissolution du principe actif est indispensable pour son absorption. Pourtant il a<br />
été rapporté qu’un excès de cyclodextrines provoquait une moindre absorption au travers de la<br />
peau ou de la cornée. Le mécanisme d’action des CD semble donc complexe.<br />
37<br />
Loftsson et coll. [Loftsson, 1999] ont étudié ce mécanisme en utilisant une membrane<br />
de cellophane semi-perméable ou de la peau de souris comme membrane modèle dans des<br />
cellules de Franz. Le flux de principes actifs est déterminé par dosages (HPLC) répétés du<br />
liquide récepteur. La théorie veut que lorqu’un principe actif diffuse d’une phase aqueuse<br />
donneuse (ici gel ou solution) à travers une membrane lipophile vers une phase réceptrice, il<br />
rencontre 2 types de résistance. D’abord une résistance à sa diffusion dans la phase aqueuse<br />
donneuse (Raq) puis une résistance à sa diffusion à travers la membrane elle-même (Rm). Le<br />
premier terme dépend du coefficient de diffusion aqueux de la molécule en question et de<br />
l’épaisseur de la couche de diffusion aqueuse, et le second terme dépend du coefficient de<br />
partition de la molécule entre la phase aqueuse et la membrane, du coefficient de diffusion<br />
membranaire et de l’épaisseur de la membrane.<br />
En général, la diffusion à travers la peau est lente et requiert plusieurs heures avant que le<br />
principe actif ne puisse être détecté dans la phase réceptrice. On estime donc que la<br />
contribution de la résistance de la phase aqueuse donneuse est très faible. Ainsi, avec ce<br />
modèle, le flux de principe actif (R -1 × [p.a]) de la solution saturée n’est pas affecté par la<br />
concentration en CD dans la phase aqueuse donneuse. Mais les études citées précédemment
ont montré que le flux de principe actif à travers la peau augmente presque<br />
proportionnellement avec la concentration en CD, et des observations comparables ont été<br />
faites quand les effets des CD sur la perméabilité de principes actifs à travers la cornée ou les<br />
muqueuses nasales ont été étudiés. Considérant cela, les auteurs ont établi qu’il devait exister<br />
une couche de diffusion aqueuse en surface de la peau où le coefficient de diffusion et/ou la<br />
constante de complexation sont différents de ceux de la phase aqueuse donneuse. De<br />
nouvelles équations régissant le flux de passage du principe actif à travers les différentes<br />
phases ont donc été décrites et comparées aux résultats obtenus dans les expériences sur<br />
cellules de Franz.<br />
Il en découle que l’amélioration du transport percutané d’un principe actif par des CD<br />
peut s’expliquer par le modèle classique de double diffusion membranaire, aqueuse puis<br />
lipophile, et que les données expérimentales peuvent être ajustées pour obtenir les constantes<br />
qui décrivent ce système. La vitesse de diffusion dans la couche aqueuse doit être<br />
considérablement plus faible que dans la phase aqueuse donneuse. La cyclodextrine<br />
fonctionne donc comme un vecteur, amenant le principe actif de la phase aqueuse donneuse<br />
vers la barrière aqueuse à partir de laquelle il passe dans la couche lipophile de la peau en<br />
fonction de son coefficient de partition.<br />
La participation des follicules pileux et des glandes sébacées n’est pas oubliée mais ceux-<br />
ci ne couvrant que 0.1% de la surface de la peau, il est probable qu’ils ne jouent pas un rôle<br />
significatif dans la diffusion trandermique. Notons tout de même que certaines études ont mis<br />
en évidence que cette voie était la principale pour des molécules comme l’hydrocortisone<br />
[Masson, 1999].<br />
Les CD modifient le transport de principe actif au travers de la cornée et des muqueuses<br />
de la même façon que dans les expériences au travers de la peau. Par contre la participation<br />
annexe des follicules pileux et glandes sébacées n’existe pas. Ces membranes sont recouvertes<br />
par un mucus relativement visqueux et qui représente une barrière potentielle pour la diffusion<br />
de principe actif et peut donc être aussi une barrière aqueuse à la diffusion de principes actifs<br />
à partir de solutions de CD.<br />
38<br />
Une autre approche, beaucoup plus mécanistique a été développée par certaines équipes,<br />
en particulier Debouzy et coll. [Fauvelle, 1997]. Ils étudient essentiellement par 31 P RMN les<br />
interactions entre cyclodextrines naturelle et parfois modifiées et des bicouches obtenues à
partir de phospholipides modèles. Les résultats semblent démontrer une grande complexité<br />
dans les mécanismes.<br />
Toutefois, de nombreuses zones d’ombres existent dans la compréhension du mécanisme<br />
de pénétration membranaire des cyclodextrines, en particulier en l’absence de méthodes de<br />
dosages très fines. Dans la suite de ce travail, nous expliquerons comment les dosages<br />
immunologiques nous ont permis de doser, avec une haute sensibilité, des cyclodextrines dans<br />
la peau.<br />
39
2. TRAVAUX ANTERIEURS<br />
40
2. TRAVAUX ANTERIEURS<br />
2.1 MOYENS UTILISES POUR AMELIORER LA STABILITE ET LA SOLUBILITE<br />
DE LA VITAMINE A DANS LES FORMES PHARMACEUTIQUES<br />
Outre l'utilisation d'emballages protégeant les préparations de la lumière [Tagliaferri,<br />
1989] la première et la plus évidente des solutions proposées pour améliorer la stabilité du<br />
rétinol fut d'incorporer des antioxydants. On sait par exemple que l'ajout d'α-tocophérol,<br />
d'acide ascorbique, de butyl-hydroxyanisole (BHA) ou de butyl-hydroxytoluène (BHT) permet<br />
d'améliorer la stabilité d'une solution de rétinol ou d'esters de rétinol [Froix, 1996 ;<br />
Shkunkova, 1973].Toutefois l'ajout d'antioxydants seul n'est d'aucune utilité pour améliorer la<br />
solubilité du rétinol et la stabilité obtenue est très relative.<br />
2.1.1 Emulsions et antioxydants<br />
2.1.1.1 Emulsions eau-dans-huile (E/H)<br />
Plusieurs préparations cosmétologiques comprenant une émulsion E/H à base de rétinol<br />
ont été décrites et même commercialisées. Dans ce cas le but n'est pas d'incorporer le rétinol<br />
en phase aqueuse mais d'obtenir une crème applicable sur la peau et pour laquelle le rétinol<br />
conserve son activité au fil des mois.<br />
41<br />
Ainsi le brevet US 4826828 [Wilmott, 1989] décrit une émulsion E/H contenant le<br />
rétinol, une huile siliconée (la cyclométhicone), ainsi qu'un solvant du rétinol et de la<br />
silicone : l'éthanol. Or le rétinol se dégrade rapidement lorsqu'il est introduit dans l'émulsion.<br />
Celle-ci devra donc se faire extemporanément : il faut préparer une solution contenant le<br />
rétinol (mélange cyclométhicone, éthanol dénaturé, BHT, BHA, émulsifiant) et la mélanger au<br />
moment de l'emploi à une émulsion E/H contenant aussi, dans sa phase aqueuse, des<br />
antioxydants et des agents chélateurs des métaux lourds. La stabilité d'une telle composition,<br />
comme l'indique Avon, le détenteur du brevet, sur ses produits Bioadvance ® et Bioadvance<br />
2000 ® , n'excède pas un mois, ce qui est très insuffisant au regard d'une utilisation prolongée et<br />
nécessite un réapprovisionnement rapide, donc couteux.
Clum et coll [Clum, 1991] proposent une stabilisation du rétinol dans une émulsion E/H<br />
(rétinol en phase huileuse) par adjonction d'un complexe stabilisant, comprenant associés, un<br />
antioxydant liposoluble et un agent chélatant d'ions métalliques.<br />
Si, toutefois, la stabilité du rétinol semble améliorée dans de telles compositions (60% du<br />
rétinol étant encore présent après trois mois de conservation à 40°C), il n'en demeure pas<br />
moins que cette stabilité relative n'est due qu'à la présence dans la composition, d'une quantité<br />
importante d'antioxydants et d'agents chélatants stabilisants. En effet, il apparait évident que le<br />
rétinol se trouvant obligatoirement dans la phase externe de l'émulsion E/H il n'est en aucun<br />
cas protégé de la dégradation par l'air ambiant.<br />
2.1.1.2 Emulsions huile-dans-eau (H/E)<br />
Par contre la formulation d'émulsions type huile-dans-eau (H/E), contenant le rétinol en<br />
phase huileuse interne additioné d'antioxydants semble une solution plus efficace pour lutter<br />
contre la dégradation et surtout incorporer le rétinol en phase aqueuse.<br />
Cette solution s'est d'ailleurs montrée très efficace pour l'acide rétinoïque pour lequel de<br />
nombreux produits commercialisés (crème Retin A ® , Roc S.A) sont constitués d'émulsion<br />
H/E contenant l'acide rétinoïque et un antioxydant liposoluble dans la phase huileuse, voir<br />
même parfois avec un chélatant type EDTA [Clum, 1991 ; Felty Lanny, 1975]. Cependant les<br />
premiers essais de stabilité menés sur de telles émulsions H/E additionées d'antioxydants<br />
liposolubles se sont montrés décevant pour le rétinol et certains de ses esters (acétate et<br />
palmitate). On observe en effet que ces émulsions perdent rapidement leur activité en<br />
s'oxydant ou s'isomérisant pour donner des formes chimiques inactives [Clum, 1991].<br />
Il semblerait que les émulsions H/E facilitent la diffusion de l'oxygène vers le rétinol,<br />
contrebalançant ainsi l'action des antioxydants [Froix, 1996].<br />
Plus tard des émulsions H/E un peu plus stables ont pu être préparées obtenant des<br />
stabilités supérieures à 90% sur plusieurs mois (2 mois à 50°C et 6 mois à température<br />
ambiante) [Liu, 1996 ; Couval, 1994]. Mais ces résultats sont obtenus au prix de l'utilisation<br />
de quantités importantes de produits stabilisateurs (plusieurs antioxydants et/ou plusieurs<br />
chélatants dans chaque phase). Nous verrons dans les paragraphes suivants que de nombreuses<br />
recherches ont été menées afin de diminuer au maximum, voire d'éliminer, la présence de tels<br />
stabilisants dans les compositions cosmétiques et pharmaceutiques contenant du rétinol, tout<br />
en conservant à celui-ci une bonne stabilité dans la composition , acceptable au regard de ses<br />
effets et en relation avec une utilisation prolongée de la composition.<br />
42
2.1.2 Microparticules<br />
Les microparticules sont des structures supramoléculaires solides ultradispersées<br />
généralement à base de polymères et ayant une taille supérieure à un micron. Elles existent<br />
sous deux formes (Fig 14 et 15 ) :<br />
• Microsphères : systèmes pleins constitués par une trame polymère.<br />
• Microcapsules : systèmes dotés d'une cavité centrale huileuse, entourée d'une couche<br />
polymérique.<br />
Figure 14. Microsphère Figure 15. Microcapsule<br />
2.1.2.1 Microsphères<br />
Des microsphères de collagène ont été utilisées, à la surface desquelles était adsorbé du<br />
rétinol. La stabilité du rétinol à long terme a été étudiée sur deux hydrogels à base<br />
d'hydroxyéthylcellulose (témoin contre microsphères) qui ont montré que l'adsorption du<br />
rétinol en surface réduit les phénomènes de cristallisation mais n'empêche pas l'oxydation de<br />
la molécule [Roessler, 1994].<br />
L'adsorption simple en surface n'apporte donc qu'une faible amélioration mais d'autres<br />
techniques ont été étudiées.<br />
43<br />
Froix et coll. [Froix, 1996] ont utilisé des particules (ou suspensions de particules)<br />
constituées d'une matrice polymère poreuse, le rétinol étant situé à l'intérieur de ce réseau<br />
continu de pores. Ces particules microscopiques sont solides, insolubles dans l'eau et inertes<br />
par rapport au rétinol, aux antioxydants, aux chélatants, tensioactifs et autres ingrédients<br />
classiquement utilisés en galénique. Le rétinol y est déposé par contact physique
conventionnel après formation des particules et, de ce fait, il réside seulement dans les pores<br />
et non dans la matrice elle-même. Ces particules sont dispersées dans la phase aqueuse d'une<br />
émulsion qui contient aussi des antioxydants lipophiles et hydrophiles.<br />
Bigger et coll. [Bigger, 1996] ont utilisé un système similaire pour mettre des esters<br />
d'alpha-hydroxy-acides du rétinol en suspension dans des crèmes, lotions et autres milieux<br />
aqueux.<br />
On peut ainsi mettre en suspension le rétinol en milieu aqueux, propriété que la<br />
cosmétique a su exploiter puisque l'on trouve actuellement dans le commerce ce type de<br />
préparations à base de microsphères de rétinol ( gamme Retinol Actif Pur ® ROC ).<br />
2.1.2.2 Microcapsules<br />
C'est encore la cosmétique qui s'est intéressée au développement de microcapsules de<br />
rétinol [Noda, 1992]. Celles-ci, constituées d'un fin film polymérique qui casse facilement lors<br />
de l'étalement, sont idéales pour une application cutanée. Les microcapsules sont préparées<br />
par une méthode complexe de coacervation impliquant une séparation de phase dans un<br />
mélange gélatine-acacia, en phase aqueuse. Le glutaraldéhyde est utilisé comme agent de<br />
réticulation pour rendre le polymère de gélatine insoluble en milieu aqueux. La stabilité du<br />
rétinol ainsi préparé s'est révélée supérieure à celle du rétinol émulsifié. De plus les auteurs<br />
ont constaté que la stabilité augmentait avec l'épaisseur du film polymérique et avec l'ajout de<br />
polylysine. Ces deux constatations ont permis de montrer, grâce à des mesures de coefficient<br />
de perméabilité à l'oxygène, que la matrice gélatine / polylysine diminue la perméabilité à<br />
l'oxygène, améliorant ainsi la stabilité.<br />
44<br />
D'autres travaux ont montré que l'encapsulation par une enveloppe de nature variée<br />
(gélatine, pectine, éthyl-cellulose, gommes ou amidon) aide à protéger le rétinol de l'action<br />
des rayons ultra-violet, et de ce fait permet de diminuer la quantité d'antioxydants (tocophérol)<br />
utilisée. Toutefois, même si cette forme de vitamine A est plus stable (3 mois), il a été montré<br />
que l'oxydation au cours du temps a toujours lieu [Sarama, 1995].<br />
Dans un tout autre domaine, l'encapsulation de la vitamine A a été réalisée dans le but de<br />
diminuer sa dégradation au niveau de l'estomac, lors de l'administration par voie orale<br />
(nourriture pour ruminants supplémentée en vitamine A). Les essais in vitro ont montré que la<br />
meilleure protection contre la dégradation microbienne, enzymatique et hydrolytique est<br />
obtenue avec une double enveloppe de gélatine et d'acide palmitique. Il faut noter que
l'addition d'antioxydants s'est révélée nécessaire et que les études de stabilité menées ne<br />
concernaient que le passage du premier estomac des ruminants [Markus, 1989].<br />
⇒ Ces essais montrent que les microsphères et les microcapsules amènent dans certains<br />
cas une stabilité relative par un effet de protection physique et permettent surtout de suspendre<br />
le rétinol en milieu aqueux. Toutefois les méthodes de préparation sont complexes et passent<br />
par des phases critiques.<br />
2.1.3 Divers<br />
Certaines équipes ont réalisé l'association du rétinol avec des peptides amphiphiles<br />
naturels d'origine végétale ou animale tels les oléosines ou les β-lactoglobulines. Le but<br />
premier était de favoriser la vectorisation du rétinol à travers les couches de l'épiderme mais il<br />
a été montré que cela permettait aussi d'incorporer le rétinol dans un support non dissociant<br />
(non huileux et non tensio actif) c'est à dire un milieu aqueux. L'addition d'antioxydants n'a<br />
pas été évitée [Redziniak, 1996].<br />
D'autres travaux ont montré que par la sélection bien déterminée de certains solvants,<br />
comme véhicule du rétinol, on pouvait obtenir des compositions anhydres destinées à une<br />
application topique présentant une certaine stabilité dans le temps, et ceci, sans avoir recours à<br />
des antioxydants. Ces solvants organiques, liquides à température ambiante, sont choisis<br />
parmi plusieurs groupes parfaitement définis d'alcool gras, de diesters d'alcool isopropylique<br />
et d'acides dicarboxyliques, et de triglycérides d'acides gras [Segot, 1995]. Les essais de<br />
conservation réalisés ont permis de montrer, par une méthode HPLC, que par rapport à<br />
d'autres solvants couramment utilisés comme véhicule de substance active, ceux sélectionnés<br />
conduisaient à une amélioration de la stabilité. On retrouve ainsi, lors du dosage, 100% du<br />
produit de départ mais seulement sur une période limitée à 2 mois.<br />
Le détenteur du brevet, la firme L'Oréal, a ensuite cherché à améliorer son procédé par<br />
l'addition, à ce type de solvant, d'un gélifiant particulier (comprenant au moins un alkyléther<br />
de polysaccharide formé de motifs comportant au moins 2 cycles osidiques différents). Il s'agit<br />
d'une gomme non-ionique, par exemple la guar éthylée. Cette composition est dite stable pour<br />
le rétinol, l'acétate et le palmitate de rétinol mais aucun chiffre n'est avancé [Gagnebien,<br />
1997].<br />
45
⇒ Nous avons décrit plusieurs solutions, plus ou moins efficaces, proposées pour<br />
améliorer les propriétés physico-chimiques du rétinol et de ses esters. Dans le même ordre<br />
d'idée, les cyclodextrines ont été aussi beaucoup utilisées et le chapitre suivant leur sera<br />
entièrement consacré. Après avoir décrit les différentes méthodes utilisées dans la<br />
caractérisation physico-chimique des complexes d'inclusion cyclodextrines / molécule invitée,<br />
nous nous intéresserons aux travaux déjà décrits concernant le rétinol et ses esters.<br />
2.2 INCLUSION DU RETINOL DANS LES CYCLODEXTRINES<br />
2.2.1 Méthodes de caractérisation des complexes d'inclusion<br />
Il est important de souligner qu'une analyse complète et efficace d'un complexe<br />
d'inclusion potentiel doit fournir des réponses concernant la réalité de l'inclusion, sa<br />
stoechiométrie, sa constante d'association et devrait aussi proposer une structure<br />
tridimensionelle de la supramolécule. Or, parmi les techniques d'analyse couramment<br />
utilisées, peu peuvent répondre à ces questions. Ceci est dû le plus souvent à des limitations<br />
techniques ou théoriques mais dans un certain nombre de situations les incohérences relevées<br />
dans la littérature peuvent venir d'une mauvaise interprétation des données expérimentales<br />
[Perly, 1991].<br />
2.2.1.1 Diffractions des rayons X<br />
Parmi les nombreuses techniques utilisées pour mettre en évidence les complexes<br />
d'inclusion, la cristallographie est clairement la plus puissante [Perly, 1991]. Cependant, elle<br />
est rarement utilisée car elle nécessite d'avoir des monocristaux du complexe moléculaire en<br />
question ce qui n'est pas toujours le cas. De plus la géométrie des complexes d'inclusion et les<br />
interactions mises en jeu peuvent être différentes à l'état solide et en solution. On peut noter<br />
aussi que la cristallographie fait souvent appel à l'utilisation de cosolvants qui peuvent<br />
modifier la nature du complexe. Or de nombreuses applications des cyclodextrines suppose la<br />
mise en solution des complexes. Il est donc préférable d'avoir des techniques pouvant fournir<br />
des informations valables en solution.<br />
46
Cette technique permet cependant la comparaison des structures obtenues en solution et à<br />
l'état solide et apporte de nombreuses informations sur l'influence de la maille cristalline et du<br />
solvant sur la structure tridimensionelle du complexe d'inclusion.<br />
2.2.1.2 Diagrammes de solubilité de phase<br />
Cette approche, telle que développée par Higuchi et Connors [Higuchi, 1965], est très<br />
couramment utilisée pour l'évaluation de l'utilisation potentielle des cyclodextrines afin<br />
d'augmenter la solubilité de composés hydrophobes en milieu aqueux. Elle permet en effet<br />
d'obtenir le profil de la courbe de solubilité de la molécule invitée en fonction de la<br />
concentration en cyclodextrines et donc de prouver l'augmentation de la solubilité en présence<br />
de cyclodextrines. Le principe de cette méthode consiste à ajouter le composé invité en<br />
quantité excédentaire à des solutions de cyclodextrines de concentrations croissantes, puis à<br />
doser la quantité de composé invité dissous. Un diagramme de solubilité de l'invité en<br />
fonction des concentrations de cyclodextrines peut ainsi être établi. Deux types de<br />
diagrammes sont généralement observés : types A et B.<br />
Dans le diagramme de type A, la solubilité de l'invité augmente avec la concentration en<br />
cyclodextrines. Il y a formation d'un ou plusieurs complexes solubles. Dans le diagramme de<br />
type B, la solubilité du composé d'inclusion est inférieure à celle de la CD pure : la solubilité<br />
de l'invité augmente dans la première partie de la courbe à cause de la formation du composé<br />
d'inclusion, mais quand la limite de solubilité est atteinte, la formation accrue de composé<br />
d'inclusion provoque sa précipitation, représentée par un plateau. Lorsque l'excès de principe<br />
actif est consommé, on observe une décroissance qui serait liée à l'inclusion du principe actif<br />
dissout et à sa précipitation concomitante. La mesure de la constante d'équilibre par la<br />
méthode de solubilité de phase nécessite la connaissance de la stoechiométrie réelle du<br />
composé d'inclusion : lorsque le diagramme est de type B, le composé peut être isolé et sa<br />
stoechiométrie vérifiée; lorsque le diagramme est de type A, il est préférable de déterminer la<br />
stoechiométrie par une autre méthode. En effet si plusieurs complexes coexistent ou si le<br />
complexe n'est pas de stoechiométrie 1:1, la méthode de solubilité de phase fait appel à des<br />
hypothèses ou à des approximations qui ne permettent pas d'obtenir des constantes d'équilibre<br />
apparentes exactes.<br />
47<br />
Il faut savoir que cette technique ne donne en aucun cas une preuve directe de la réalité<br />
de l'inclusion. En effet un procédé d'interaction autre que l'inclusion peut provoquer<br />
l'augmentation de solubilité observée. Les stoechiométries et les constantes d'affinités<br />
obtenues à partir du diagramme de phase peuvent amener des erreurs non négligeables car le
processus théorique de solubilisation est très simplifié dans cette approche. De plus, lors de la<br />
détermination de la constante d'association, cette technique ne tient pas compte des éventuels<br />
phénomènes pouvant entrer en compétition avec l'inclusion (dimérisation, "solution solide").<br />
2.2.1.3 Techniques d'analyse de l'état solide<br />
Deux approches sont communément utilisées pour mettre en évidence le phénomène<br />
d'inclusion dans les cyclodextrines : l'analyse calorimétrique différentielle (Differential<br />
Scanning Calorimetry) et la diffraction sur poudre [Frömming, 1994].<br />
Elles reposent toutes deux sur l'observation des différences entre le mélange physique<br />
simple des deux composés et le complexe d'inclusion potentiel. Ces deux méthodes sont<br />
faciles à mettre en oeuvre, nécessitent de faibles quantités de composés et sont donc assez<br />
populaires. La diffraction des rayons X permet de déterminer les propriétés structurales des<br />
composés d'inclusion et de les comparer à celles des produits isolés. La DSC quant à elle<br />
permet de comparer les propriétés thermiques des produits isolés et des complexes présumés.<br />
L'observation de nouveaux pics ou la disparition d'un accident thermique de la molécule<br />
invité donne des indices sur la présence d'un éventuel complexe, sans apporter de preuve de sa<br />
réalité [Perly, 1991]. En effet ces méthodes ont pour but de montrer l'existence d'interactions<br />
existant au sein de la maille cristalline et tout phénomène provoquant le passage à l'état<br />
amorphe conduira à la modification du spectre de poudre et du thermogramme.<br />
Par exemple le fait de lyophiliser une solution contenant deux molécules n'interagissant<br />
pas entre elles donnera un composé amorphe. Ce composé qui est en fait une "solution-solide"<br />
ne présentera plus les caractéristiques individuelles de chaque composé mais cela ne signifie<br />
pas qu'il y ait des interactions spécifiques et encore moins une inclusion.<br />
2.2.1.4 Techniques spectrophotométriques<br />
48<br />
Presque toutes les méthodes optiques existantes ont été utilisées pour caractériser les<br />
phénomènes d'inclusion. Certaines comme la spectroscopie IR ne constituent pas une méthode<br />
de choix pour la détection des complexes d'inclusion [Saenger, 1980]. La spectrophotométrie<br />
d'absorption ou de fluorescence (lorsque la molécule le permet) et le dichroïsme circulaire<br />
sont les plus fréquemment utilisés [Song, 1992]. L'avantage majeur est leur très haute<br />
sensibilité intrinsèque. Cependant, les résultats obtenus peuvent conduire à des interprétations
erronées car seule la molécule invitée est observée. De plus ces techniques ne permettent pas<br />
de distinguer clairement l'inclusion d'une autre interaction.<br />
Le dichroïsme circulaire utilise la capacité qu'ont les molécules non symétriques<br />
d'absorber différement des photons polarisés et nécessite des conditions particulières :<br />
- existence d'un centre de symétrie ou centre chiral<br />
- présence d'un chromophore (ce que n'ont pas les CD)<br />
- absence de racémique<br />
C'est une méthode intéressante dans l'étude des phénomènes d'inclusion car en pénétrant<br />
dans la CD, la molécule invitée prend une conformation figée si elle vibrait lentement ou une<br />
conformation différente de celle qu'elle présentait à l'état libre [Jourdain, 1990].<br />
Par rapport au dichroïsme circulaire, la spectrophotométrie d'absorption ou de<br />
fluorescence présente l'avantage d'être quantitative puisque le signal observé peut être<br />
interprété en terme de pourcentage de complexe. De plus ces techniques sont très appréciées<br />
pour déterminer la stoechiométrie en utilisant la méthode de Job [Job, 1928] et celle de Benesi<br />
et Hildebrand [Hildebrand, 1949].<br />
2.2.1.5 Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)<br />
La RMN utilise le principe de l'aimantation de certains noyaux atomiques présentant une<br />
distribution anisotropique de charges, le spin. Placés dans un champ magnétique (B0), ils<br />
interagissent avec lui.<br />
Trois grands types d'interactions sont considérés entre les spins et les champs<br />
magnétiques qui conduisent aux trois principaux paramètres de RMN (Fig. 16 ) :<br />
- le couplage scalaire a lieu à travers les liaisons covalentes et est caractérisé par la<br />
constante de couplage,<br />
- le couplage dipolaire s'exprime à travers l'espace et donne des informations sur les<br />
proximités spatiales,<br />
- le déplacement chimique s'exprime en ppm et est caractéristique de<br />
l'environnement de chaque noyau.<br />
49<br />
En effet soumis à BO, les noyaux ne perçoivent pas tous le même champ magnétique. Le<br />
champ magnétique extérieur induit une circulation d'électrons autour du noyau considéré et en<br />
retour, cette circulation de charges produit un champ magnétique très faible. Il en résulte que<br />
le champ au voisinage de chaque noyau est différent. La RMN du proton permet d'identifier<br />
une molécule d'après le déplacement chimique de ses protons. Toute modification de
l'environnement du noyau, comme par exemple l'approche d'une autre molécule provoquera<br />
des modifications de son déplacement chimique. Ceci est particulièrement intéressant pour les<br />
cyclodextrines pour lesquelles il est possible de repérer les variations de déplacements<br />
chimiques des protons situés à l'intérieur de la cavité (H3, H5). Lorsqu'il y a inclusion, ceux-ci<br />
sont les plus affectés alors que les protons situés à l'extérieur sont peu affectés [Gunther, 1993<br />
; Duchêne, 1985].<br />
Figure 16 . Shéma de principe des interactions magnétiques en RMN<br />
Comparé aux techniques présentées ci-dessus, la RMN est la seule qui offre la possibilité<br />
d'observer les deux espèces en présence simultanément en solution. C'est un facteur<br />
décisif dans l'évaluation précise des procédés impliqués dans l'inclusion et des éventuels<br />
phénomènes en compétition avec celle-ci. Leur absence de prise en compte dans les calculs<br />
théoriques peut conduire à des résultats erronés tant sur le plan de la stoechiométrie que des<br />
constantes d'association. La RMN est intrinsèquement quantitative, puisque l'aire des pics est<br />
directement proportionnelle aux nombres de noyaux, mais elle est relativement peu sensible<br />
comparée aux techniques spectrophotométriques. Avec l'amélioration des techniques de<br />
détections, l'augmentation de la puissance des champs magnétiques (pour la RMN haute<br />
résolution jusqu'à 18 T) et l'arrivée de la RMN bidimensionnelle, cet écart de sensibilité s'est<br />
réduit mais reste significatif : la RMN travaille habituellement à des concentrations de l'ordre<br />
de 10 -3 -10 -4 M alors que la spectroscopie UV atteint sans problème 10 -6 M et la<br />
spectrophotométrie de fluorescence 10 -10 M.<br />
50<br />
La RMN, en plus d'amener une preuve de la réalité de l'inclusion, permet de déterminer<br />
les proximités spatiales entre les protons de l'hôte et ceux de la molécule invitée, et donne<br />
donc des informations concernant la structure tridimensionnelle du complexe [Perly, 1991].
La RMN permet de déterminer la stoechiométrie et la cinétique de l'inclusion dans tous<br />
les cas de figure :<br />
- complexe précipité<br />
- complexe soluble avec cinétique d'échange rapide ou lent en utilisant la méthode de Job<br />
et celle de Benesi et Hildebrand, bien que ces 2 méthodes, utilisables avec d'autres techniques<br />
de caractérisation dont les techniques spectrophotométriques, ne bénéficient pas avec la RMN<br />
de la même sensibilité.<br />
La RMN permet de montrer les changements de conformation de la cyclodextrine dûs à<br />
la formation du complexe, même en solution, ce que la cristallographie ne permet pas<br />
[Djedaïni-Pilard, 1990 ; Inoue, 1989]. Réciproquement on peut mettre en évidence les<br />
modifications chimiques ou conformationnelles de la molécule incluse [Wouessidjewe, 1989 ;<br />
Djedaïni-Pilard, 1990]<br />
La RMN apparaît donc comme la technique permettant la description la plus complète du<br />
phénomène d'inclusion, lorsqu'il a lieu. C'est ce qui a motivé notre choix en tant que<br />
principale technique de caractérisation dans notre étude.<br />
2.2.2 Essais d'inclusion du rétinol et/ou de ses esters dans les cyclodextrines naturelles<br />
ou modifiées<br />
2.2.2.1 Essais de complexation avec l'αCD<br />
Munoz-Botella et coll. [Munoz-Botella, 1996] rapportent, au cours d'une étude<br />
impliquant plusieurs types de CD, un essai de complexation du rétinol avec l'αCD ; aucun<br />
résultat positif n'a été obtenu.<br />
2.2.2.2 Essais de complexation avec la γCD<br />
La précédente étude n'a pas non plus montré de résultat positif avec la γCD.<br />
Par contre, plus récemment, un brevet concernant des complexes de γCD et de rétinol a<br />
été déposé [Moldenhauer, 1998]. Les auteurs y décrivent la préparation d'un éventuel<br />
complexe par mélange à chaud (55°C) du rétinol et d'une solution aqueuse de CD (β ou γ)<br />
sous atmosphère protégée. Puis agitation 72h, filtration et séchage. D'après les revendications<br />
posées dans ce texte, il semble que seule la γCD se soit montrée efficace.<br />
51
52<br />
2.2.2.3 Essais de complexation avec la βCD<br />
Le rétinol, l'acétate et le palmitate de rétinol sont les premiers exemples rapportés de<br />
stabilisation de vitamines par les cyclodextrines [Schlenk, 1958].<br />
Frömming et coll. [Fromming, 1988] ont étudié la complexation de l'acétate de rétinol<br />
avec la βCD. La préparation se fait en mélangeant la vitamine A dans l'éthanol à une solution<br />
aqueuse de βCD, le tout sous atmosphère azotée et à l'abri de la lumière. Cette méthode, par<br />
co-précipitation, fut retenue par les auteurs car c'est la seule qui se soit montrée reproductible.<br />
Les auteurs obtiennent un précipité qu'ils caractérisent par plusieurs méthodes : spectroscopie<br />
UV et IR, 1 H-RMN, diffraction des rayons X, DSC, chromatographie liquide et couche mince<br />
(CCM). Après lavages par l'éthanol et l'eau, pour éliminer les espèces libres, et après séchage<br />
la spectroscopie UV (dans l'éthanol à 326 nm) donne une concentration en acétate de rétinol<br />
qui correspondrait à une stochiométrie 5:2 (βCD: rétinol). Ce chiffre est confirmé par<br />
l'intégration des pics du spectre RMN (dans le d6-DMSO).<br />
La disparition des pics spécifiques de chaque espèce sur le diffractogramme montre<br />
l'existence d'une nouvelle structure cristalline dans le précipité. En DSC, la disparition du pic<br />
endothermique de l'acétate de rétinol dans le complexe lavé seul (et non dans le mélange<br />
physique témoin, ni dans le complexe non lavé) semble indiquer la possibilité d'un<br />
phénomène d'inclusion puisque la molécule est toujours présente lors du dosage (Fig. 17). De<br />
même en CCM, les taches caractéristiques de l'acétate de rétinol disparaissent seulement dans<br />
le cas du complexe lavé. Ce phénomène pourrait être dû à la dégradation de la vitamine A.<br />
Mais la présence d'acétate de rétinol sous forme inchangée dans le complexe fraîchement<br />
préparé est démontrée par spectroscopie IR et par CCM après extraction par le chloroforme.
Figure 17 . Thermogramme DSC de (a) acétate de vitamine A (b) βCD (c) mélange physique (d) complexe<br />
d'inclusion non lavé (e) complexe d'inclusion lavé.<br />
Les auteurs ont utilisé la spectrophotométrie UV pour déterminer la quantité de vitamine<br />
A dégradée sur une période de plusieurs semaines. Ils affirment que la décomposition de la<br />
vitamine A est plus rapide dans le complexe qu'à l'état pur cristallisé (Fig. 18).<br />
Figure 18. Stabilité de l'acétate de vitamine A : ∗ acétate de vitamine A recristallisé, composé<br />
d'inclusion βCD/acétate de vitamine A non lavé, composé d'inclusion lavé. E326/E250 représente la<br />
proportion de produit intact.<br />
53<br />
Sans le démontrer, les auteurs ont pu montrer qu'il existait de fortes présomptions<br />
concernant la formation du complexe d'inclusion.<br />
Un autre ester de la vitamine A, le palmitate, a été étudié avec la βCD [Palmieri, 1992].<br />
L'étude du complexe potentiel est réalisée par 2 méthodes : diagramme de solubilité de phase<br />
et spectroscopie de fluorescence. Le diagramme de solubilité (Fig. 19) montre clairement que<br />
la solubilité du palmitate augmente avec la concentration en βCD jusqu'à atteindre un plateau<br />
(saturation de la cyclodextrine). Le spectre de fluorescence amène à la même conclusion en
montrant une augmentation de l'intensité du pic du palmitate avec la concentration en βCD.<br />
En utilisant ces méthodes les auteurs décrivent une stochiométrie 2:1 (βCD:palmitate) à forte<br />
concentration en βCD et 1:1 à faible concentration. On peut interpréter ce résultat en posant<br />
l'hypothèse suivante: formation d'un complexe 1:1 et après complexation de toute la vitamine<br />
A, addition d'une deuxième βCD sur chaque complexe.<br />
βCD + Hôte → complexe 1:1<br />
complexe 1:1 + βCD → complexe 2:1<br />
Figure 19. Diagramme de solubilité de phase du complexe palmitate de vitamine A/βCD<br />
Une étude a été menée par Wadstein et coll., [Wadstein, 1993] sur l'utilisation des βCD<br />
pour améliorer la pénétration cutanée de plusieurs esters de rétinol. Dans leur brevet les<br />
auteurs décrivent un complexe de stochiométrie 2:1 (βCD:ester) et déclarent améliorer<br />
significativement la pénétration cutanée de ces esters en les rendant artificiellement<br />
hydrosolubles.<br />
2.2.2.4 Essais de complexation avec les CD chimiquement modifiées<br />
54<br />
Guo et coll. [Guo, 1995] ont travaillé sur la complexation du rétinol avec la per-(2,6-O-<br />
diméthyl)-βcyclodectrine (Dimeb-CD). Cette dernière est synthétisée au sein de leur<br />
laboratoire. Le complexe potentiel est obtenu en introduisant le rétinol et la CD dans un<br />
mélange méthanol/eau (1/10). Les auteurs indiquent que d'après la littérature la présence de<br />
méthanol n'influence pas la constante d'association et ils posent comme hypothèse l'existence<br />
d'une stoechiométrie 1:1 pour calculer cette constante. Les constantes d'association calculées<br />
pour le rétinol, le rétinal et l'acide rétinoïque sont très proches. Une structure est alors
proposée pour ce complexe : la partie terminale de la chaîne aliphatique n'est pas impliquée<br />
dans le phénomène d'inclusion et celui-ci concerne plutôt la partie cyclique de la molécule.<br />
Les calculs de la constante d'association reposant sur de simples hypothèses, ces conclusions<br />
sont sujettes à caution. La caractérisation du complexe potentiel obtenu se fait par<br />
spectroscopie UV dans l'eau et celle-ci montre que le déplacement de la bande d'absorption<br />
caractéristique du rétinol correspond à celle observée dans la littérature dans le n-octanol et<br />
dans des micelles. L'intensité de la bande d'absorption augmente avec la concentration en CD<br />
indiquant une augmentation de la solubilité en milieu aqueux du rétinol en leur présence.<br />
Okada et coll. [Okada, 1990] ont utilisé la 6-O-α-D-glucopyranosyl -β-cyclodextrine (G-<br />
βCD) pour former un complexe avec le rétinol. Celle-ci, de par l'ajout d'une unité<br />
glucopyranose, possède une solubilité en milieu aqueux supérieure à celle de la molécule<br />
native et un pouvoir hémolytique plus faible. Ici les auteurs montrent bien par la construction<br />
du diagramme d'Higuchi que la solubilité du rétinol augmente avec la concentration en G-<br />
βCD ce qui est caractéristique d'un complexe de stoechiométrie supérieure à 1:1. Les auteurs<br />
ont comparé, en utilisant les diagrammes de solubilité de phases, le pouvoir solubilisant de la<br />
G-βCD avec celui de la Dimeb-CD et de la βCD. Les graphiques obtenus montrent que le<br />
pouvoir solubilisant de la βCD est le plus faible et qu'avec la Dimeb-CD, un phénomène de<br />
précipitation du composé formé à lieu lorsque la température augmente. Par contre avec la G-<br />
βCD le composé formé reste soluble même à haute température. La stabilité en solution<br />
aqueuse étudiée par HPLC indique que le rétinol se dégrade très rapidement (-50% en 4 jours)<br />
sous l'action de la lumière et légèrement moins vite dans le noir.<br />
Norwig et coll. [Norwig, 1988] ont utilisé la RMN du proton pour étudier la formation<br />
d'un complexe entre la Dimeb-CD et l'acétate de rétinol. Les auteurs indiquent que le système<br />
acétate de rétinol/Dimeb-CD présente des modifications des déplacements chimiques des<br />
protons portés par les trois groupements méthylés du cycle de la vitamine A, ce qui indiquerait<br />
que la partie cyclique de la vitamine A est incluse dans la CD. Mais ce spectre a été réalisé<br />
dans un mélange D2O/d6-DMSO alors que celui de l'acétate de rétinol seul a été réalisé dans le<br />
d6-DMSO. Ceci rend difficile l'interprétation des résultats car le fait de changer de solvant<br />
implique toujours des variations de déplacement chimique des signaux de RMN.<br />
Munoz-Botella et coll. [Munoz-Botella, 1996] ont étudié l'utilisation possible des<br />
cyclodextrines pour augmenter le signal du rétinol dans les méthodes spectroscopiques<br />
utilisant la fluorescence et l'absorption dans l'UV, à température ambiante. L'objectif est<br />
d'augmenter la sensibilité de la méthode en améliorant la solubilité en milieu aqueux.<br />
55
En spectroscopie UV, la bande caractéristique du rétinol dans les solvants organiques se<br />
situe autour de 300-400 nm. Or, avec plusieurs rétinoïdes dont l'acétate de rétinol, en présence<br />
d'HP-βCD et de βCD on obtient, en solution aqueuse, un spectre d'émission et d'exitation de<br />
fluorescence de meilleure résolution que celui obtenu avec l'acétate dans l'éthanol ou l'hexane.<br />
L'intensité de l'émission est même supérieure à celle obtenue seul dans l'éthanol (Fig. 20).<br />
Considérant l'insolubilité dans l'eau de ce composé, ce résultat indique une influence de la CD<br />
sur la solubilisation et donc sur la sensibilité de détection.<br />
Figure 20 . Spectre d'exitation et de fluorescence de l'acétate de rétinol sous différentes conditions : 1<br />
acetate de rétinol-βCD; 2 acetate de rétinol-HP-βCD; 3 acétate de rétinol dans l'éthanol.<br />
Avec le rétinol par contre les auteurs ont rencontré de nombreuses difficultés pour obtenir<br />
de bonnes intensités d'absorption et de fluorescence. L'intensité du spectre de fluorescence est<br />
en effet plus faible que celle du rétinol en solvant organique. Les auteurs expliquent ce<br />
phénomène par l'existence possible de liaisons hydrogènes avec les CD.<br />
56<br />
La stabilisation à long terme des vitamines complexées a été vérifiée : la diminution de<br />
l'intensité du fluorescence après 20 jours n'a pas dépassé 15%. Il semblerait que les forces<br />
mises en jeu entre CD et molécule invitée limitent les mouvements de cette dernière et donc<br />
réduisent le phénomène d'isomérisation des rétinoïdes. Les auteurs, observant que le<br />
comportement des composés obtenus avec le 13-cis-rétinal et le rétinal est identique,<br />
suggèrent que la partie cyclique de la molécule est incluse dans la cavité de la CD. Même si<br />
la réalité de l'inclusion n'a pas été démontrée, cette expérience démontre l'influence très<br />
positive des CD pour augmenter la sensibilité de techniques de détection en milieu aqueux.<br />
McCormack et coll. [McCormack, 1998] se sont intéressés à la formation de complexes<br />
HP-βCD/rétinol et à leur encapsulation dans des liposomes. L'objectif étant de modifier la<br />
pharmacocinétique, après administration intra-veineuse (IV), de complexes d'inclusion grâce
à leur encapsulation dans les liposomes. En effet, de manière générale, après injection IV les<br />
complexes CD/principe actif sont rapidement dissociés par des phenomènes de dilution et de<br />
compétition décrits dans la littérature [Mesens, 1993 ; Pitha, 1993]. Les CD sont totalement<br />
excrétées en 24h avec une partie du principe actif, le reste étant fortement métabolisé.<br />
L'inclusion du complexe dans la phase aqueuse d'un liposome permettrait d'éviter ces<br />
inconvénients puisque le complexe d'inclusion resterait intact et que les liposomes sont<br />
majoritairement captés par le foie et la rate [McCormack,1998]. Les auteurs ont utilisé pour<br />
cette expérience des radiomarqueurs ( 3 H pour le rétinol et 14 C pour les CD) et une technique<br />
de détection appropriée.<br />
Le rétinol est solubilisé dans un mélange chloroforme/éthanol et resolubilisé dans une<br />
solution aqueuse de CD après évaporation du solvant organique. Des mesures de<br />
radioactivités ont mis en évidence la présence du rétinol dans le surnageant obtenu après<br />
centrifugation, ce qui indique la formation potentielle d'un complexe d'inclusion. Le<br />
surnageant est utilisé pour la phase d'encapsulation dans les liposomes et les mesures de<br />
radioactivité sanguine, effectuées après injection intra-veineuse à des rats, montrent la<br />
présence de rétinol. Ceci confirme la présence d'une interaction forte entre la CD et le rétinol<br />
amenant l'inclusion de ce dernier dans les liposomes. Quant à l'étude pharmacocinétique<br />
même, elle a montré que l'encapsulation augmente la durée de circulation du complexe dans<br />
l'organisme et ralentit sa dissociation.<br />
⇒ Ces différents exemples montrent que les complexes rétinol (ou esters de rétinol)/<br />
cyclodextrine ont été étudiés à maintes reprises. Aucun résultat positif concernant l'αCD n'a<br />
été décrit, mais concernant la γCD, la βCD et les βCD chimiquement modifiées une<br />
amélioration de la solubilité a été mise en évidence et le phénomène d'inclusion est fortement<br />
soupçonné. Ceci ouvre des perspectives intéressantes. Cependant, aucune preuve catégorique<br />
concernant la stoechiométrie et la structure tridimensionnelle des différents composés obtenus<br />
n'a été apportée.<br />
Au vu des résultats exposés ci-dessus et de l'intérêt du rétinol dans les domaines<br />
pharmaceutiques et cosmétiques, nous souhaiterions préparer des complexes d'inclusion<br />
hydrosolubles et stables à long terme avec les cyclodextrines naturelles ou modifiées.<br />
57<br />
Il semble en effet que cette approche puisse non seulement apporter une solution au<br />
problème de solubilisation du rétinol dans les milieux aqueux, mais aussi, éventuellement,<br />
ralentir sa dégradation, ce qui serait un progrès majeur.
58<br />
3. TRAVAUX PERSONNELS
3. TRAVAUX PERSONNELS<br />
INTRODUCTION<br />
Nous avons choisi de diviser ce travail de thèse en deux grands chapitres.<br />
Le premier chapitre traite des résultats obtenus lors de l’inclusion du propionate de<br />
vitamine A (PVA) dans des cyclodextrines conventionnelles, c’est à dire commerciales. Le<br />
PVA est le dérivé de vitamine A que nous avons utilisé dans toutes les études car il est plus<br />
stable que la vitamine A pure et permet une utilisation plus facile à l’échelle du laboratoire.<br />
Nous avons tout d’abord utilisé les cyclodextrines naturelles αCD, βCD et γCD dont les<br />
résultats concernant la formation de complexes avec le PVA, la solubilisation et/ou la<br />
stabilisation du PVA sont présentés dans l’article n° 1. Ce premier article ne traite pas du<br />
travail de thèse à proprement dit mais de celui effectué lors du DEA précédent la thèse.<br />
Toutefois, ce travail étant essentiel pour aborder la suite et n’ayant pas encore été publié, il<br />
nous a semblé important de l’incorporer dans ce manuscrit.<br />
La solubilisation du PVA par ces 3 CD naturelles n’ayant pas été obtenue, nous nous<br />
sommes alors tourné vers une cyclodextrines modifiée possédant une solubilité accrue : la<br />
Rameb (heptakis-(2,6-di-O-methyl)cyclomaltoheptaose randomisée). La complexation du<br />
PVA par la Rameb nous a permis d’obtenir un complexe soluble dans l’eau et stable. A partir<br />
de là, nous nous sommes tournés vers une application biologique de ce complexe, ce qui nous<br />
a amené à étudier la pénétration du complexe dans des échantillons de peau humaine, après<br />
application cutanée. Ce travail a fait l’objet d’un brevet et de deux articles présentés ici :<br />
article n° 2 et article n° 3. Dans l’article n° 2 sont décrits uniquement les résultats de dosage<br />
du PVA, alors que l’article n° 3 contient en plus les résultats de dosage de la Rameb.<br />
59<br />
Une discussion reprenant l’ensemble des résultats de ce chapitre est présentée ensuite.<br />
Le deuxième chapitre est consacré à l’utilisation de cyclodextrines synthétisées au sein de<br />
notre laboratoire et caractérisées par le greffage, sur une et une seule fonction hydroxyle<br />
primaire, d’une molécule de cholestérol. Ces dérivés monofonctionnalisés possèdent<br />
d’étonnantes propriétés d’interactions avec les membranes biologiques, ce qui pourrait être un
avantage pour nous puisque nous cherchons un nouveau vecteur capable d’emmener le PVA<br />
dans la peau.<br />
Le premier article de ce chapitre, article n° 4, ne concerne pas directement le PVA mais<br />
est consacré à l’étude des interactions entre un film phospholipidique modèle et de la Dimeb-<br />
Chol qui est le dérivé obtenu en greffant un cholestérol sur la Dimeb (heptakis-(2,6-di-O-<br />
methyl)cyclomaltoheptaose) par l’intermédiaire d’un bras espaceur. Ce dernier permet de<br />
donner une certaine souplesse et est absolument nécessaire pour son insertion dans les<br />
bicouches. Nous montrerons que ce composé, tout en conservant ses propriétés d’inclusion,<br />
peut s’insérer dans un film modèle de phospholipides.<br />
Le second article de ce chapitre, article n° 5, concerne le dérivé βChol, obtenu en<br />
greffant un cholestérol sur la βCD, sans bras espaceur. Après une étape d’acétylation des<br />
hydroxyles libres de la partie cyclodextrine on obtient un composé hautement hydrophobe, la<br />
Chol-βCD acétylée ou Chol-βCD-Ac. Cette molécule possède des propriétés physico-<br />
chimiques permettant d’obtenir, par la technique adéquate, des nanosphères ou des<br />
nanocapsules. Nous montrerons qu’il est possible d’obtenir des nanoparticules chargées en<br />
PVA et, de la même façon que pour le complexe Rameb/PVA, d’étudier la pénétration de ce<br />
composé dans des échantillons de peau humaine.<br />
Nous terminerons par une discussion générale avant de conclure.<br />
Nous conseillons aux lecteurs qui ne seraient pas familiers avec la peau et les études de<br />
perméabilité cutanées de se rapporter d’abord à l’annexe 1. La même réflection s’applique<br />
pour les dosages immunoenzymatiques, que nous avons utilisés pour le dosage de la Rameb<br />
dans les échantillons biologiques et dont le principe est rappelé dans l’annexe 2.<br />
60
61<br />
CHAPITRE 1
3.2Chapitre 1<br />
3.2.2 Article n°1<br />
62<br />
Complexation of vitamin A propionate by natural cyclodextrins<br />
S. Weisse, B. Perly, J-P. Dalbiez, F. Djedaïni-Pilard<br />
Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry (soumis)<br />
Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry
COMPLEXATION OF VITAMIN A PROPIONATE BY<br />
NATURAL CYCLODEXTRINS<br />
SANDRINE WEISSE, BRUNO PERLY, JEAN-PIERRE DALBIEZ, and FLORENCE<br />
DJEDAÏNI-PILARD<br />
Key words: cyclodextrins β and γ - vitamin A - inclusion complex - chemical<br />
stabilization<br />
corresponding author:<br />
Florence Djedaïni-Pilard<br />
Laboratoire des Glucides<br />
<strong>Université</strong> de Picardie-Jules Verne<br />
33, rue Saint Leu<br />
80 039 Amiens, Cedex<br />
France<br />
tel/fax 00 33 (0)3 22 82 75 62<br />
mail: florence.pilard@sc.u-picardie.fr<br />
COMPLEXATION OF VITAMIN A PROPIONATE BY<br />
NATURAL CYCLODEXTRINS<br />
Sandrine Weisse a , Bruno Perly a , Jean-Pierre Dalbiez a and Florence Djedaïni-Pilard b*<br />
a Service de Chimie Moléculaire, <strong>CEA</strong> Saclay, F-91191 Gif sur Yvette, France<br />
b <strong>Université</strong> de Picardie Jules Verne, Laboratoire des Glucides, EA 2082, 33 rue S t Leu, F-<br />
80039 Amiens, France<br />
63<br />
Abstract. Vitamin A propionate (PVA) is a highly unstable and poorly water soluble<br />
molecule which has a real interest in therapeutic. In the presence of βCD or γCD, inclusion<br />
complex are formed. NMR study was performed to demonstrate the reality of inclusion and<br />
determine the stoichiometry of each complex: 1/1 for the γCD/PVA complex and 2/1 for the
βCD/PVA complex. A stability study using NMR and HPLC indicated that βCD induces an<br />
accelerated degradation of vitamin A propionate, but on the contrary, γCD can protect it very<br />
efficaciously for many months.<br />
Key words: cyclodextrins β and γ - vitamin A - inclusion complex.- chemical stabilization<br />
INTRODUCTION<br />
In the therapeutic field, the efficiency of a drug depends partially on its physical properties.<br />
Among those, two are essential : first, a good aqueous solubility and second, a long term<br />
chemical stability. When a molecule does not fit those criteria, its use becomes more<br />
complicated and thus its application are limited. Vitamin A (retinol) is an interesting example<br />
of such molecule. Indeed, it is highly unstable in the presence of oxygen, light or heat and<br />
shows a very low solubility in water. At the present time, vitamin A and derivatives have a<br />
real interest in therapeutic [1] : their main indications are irritant dermatitis, superficial burns<br />
and wounds, cornea traumas, as well as some cases of asthenia and emaciation. It is also used<br />
in cancer therapy, for its role in cellular growth and differentiation [2] and in cosmetology to<br />
regulate the cellular metabolism of skin and thus prevent wrinkles formation.<br />
Therefore, despite the fact that there is already many commercial forms available, researchers<br />
are still looking for new pharmaceutical tools to improve its stability and solubility.<br />
64<br />
For this purpose, many methods have been tried. Most of them deal with the use of anti-<br />
oxidizer in solutions or emulsions of micro-particles [3-8]. Those techniques gave very few<br />
satisfactory results in term of improvement of the stability of vitamin A and derivatives and<br />
no results concerning the water solubility improvement. A more efficient protection could be<br />
obtained by physically protecting the vitamin A from its environment. This could be achieved<br />
by using bio-compatible cyclo-oligosaccharides such as cyclodextrins to form supramolecular<br />
water soluble complexes. Indeed, some examples of attempts of inclusion of vitamin A or its<br />
esters in cyclodextrins have already been reported [9-14] but some discrepancies are found in<br />
the literature. For example, Munoz-Botella and coll. [14] established in their work that the<br />
αCD cannot complex retinol or its derivatives. For γCD, a patent based on the work of<br />
Moldenhauer and coll. [11] describes the preparation of a complex by mixing with retinol or<br />
some of its derivatives at 55°C. The authors claimed a good stabilizing effect on the retinol or<br />
its derivatives. The βCD has the longest history of complexation with retinoids as it was first<br />
tried by Shlenk and coll. (1958) [9] who reported the possible formation of βCD inclusion<br />
compounds with vitamin A alcohol, acetate and palmipate in a patent, by which they hoped to
achieve a stabilizing effect. Fromming and coll. [10], using vitamin A acetate and βCD,<br />
obtained a precipitate that they charaterized by UV and IR spectroscopy, 1 H- NMR, DSC,<br />
HPLC, CCM and SAXS. They clearly demonstrated that PVA remains intact in the<br />
precipitate, along with the CD after several washings with ethanol and water. It is also<br />
indicated a 5/2 βCD/PVA stoichiometry. Other authors [12,13] indicated a 2/1 stoichiometry.<br />
Two main raisons can be involved to rationalize theses differences: the mode of preparation<br />
and purification of the solid complex and the physical techniques used to derive the<br />
stoichiometry of the inclusion complexes and the chemical integrity of the guest molecule.<br />
We report here on the possible formation of inclusion complexes between vitamin A<br />
propionate and natural cyclodextrins (αCD, βCD and γCD). We had to replace vitamin A<br />
(retinol) by one of its ester since the alcohol is too unstable. The vitamin A propionate (PVA)<br />
(Figure 1) was chosen among several retinol esters after a preliminary study assessing their<br />
efficiency on human fibroblasts growth. For each cyclodextrin we will determine, by NMR,<br />
HPLC and Mass spectrometry, the existence of an inclusion complex, then characterize it in<br />
term of stoichiometry, and study its stability versus several parameters like presence or<br />
absence of light, temperature and oxygen.<br />
EXPERIMENTAL<br />
Material<br />
Vitamin A propionate (2.5 Mio I.E/g) was obtained from BASF (Germany). β-cyclodextrins<br />
and α,γ-cyclodextrins were gifts from Roquette (France) and Wacker (Germany), respectively.<br />
All chemicals were purchased from Fluka and used without further treatments, and deuterated<br />
solvents were from Euriso-Top (Saclay-France).<br />
Preparation of inclusion complexes<br />
65<br />
The potential for each cyclodextrin to form a complex in water with vitamin A propionate was<br />
assayed during preliminary studies. The CD/drug mixtures were prepared by mixing<br />
accurately weighted quantities in water, the final concentration of CDs and vitamin A<br />
propionate being 10 and 20 mM respectively. The mixtures were stirred during a few hours<br />
then centrifugated for 10 mn at 6000 rpm. The aqueous solutions were filtered on Millex-SG<br />
0.22µm then freeze-dried before redissolution of 10mg in 0.4 mL of D2O for NMR<br />
investigations. The precipitates, if present, were washed three times by centrifugation with
water and ether to eliminate the free species (host and guest), then dried slowly under a stream<br />
of nitrogen and freeze-dried before redissolution of 10mg in 0.4mL d6-dmso.<br />
For the long term stability studies, the complexes were prepared on a larger scale :<br />
100 mL of a 10mM βCD and 20mM vitamin A propionate solution in water.<br />
20 mL of a 50mM γCD and 100mM vitamin A propionate solution in water.<br />
Once the resulting complexes were washed and freeze-dried, each one was divided in 4<br />
batches to study the influence of light, temperature and oxygen on the vitamin A propionate<br />
(Table I). We did the same repartition for the drug alone. Each batch was studied periodically<br />
by 1 H-NMR and HPLC over a period of 24 months.<br />
STORAGE<br />
CONDITIONS<br />
Vitamin A<br />
propionate<br />
Complex<br />
βCD/PVA<br />
Complex<br />
γCD/PVA<br />
25°C, natural light<br />
alone<br />
VA βA γA<br />
25°C, dark VB βB γB<br />
4°C, dark VC βC γC<br />
4°C, dark , under<br />
Argon<br />
Table I. batches considered in the stability study<br />
NMR Techniques<br />
VD βD γD<br />
1 H-NMR experiments were performed at 500.13 MHz using a Bruker DRX500 spectrometer<br />
using the pulse programs available from the Bruker library. All measurements were performed<br />
at 25°C under careful temperature regulation (+/- 0.1K). Chemical shifts are given relative to<br />
external tetramethylsilane (TMS=0 ppm) and calibration was performed using the signal of<br />
the residual protons of the solvent as a secondary reference. All NMR data were processed<br />
and plotted using the UXNMR program and an INDY work station (Silicon graphics). Scalar<br />
correlations (COSY, Relay experiments) were processed in the absolute value mode after<br />
zero-filling resulting in a 1K×1K data matrix. For dipolar correlations (NOESY experiment),<br />
the phase sensitive (TPPI) sequence was used and processing resulted in a 1K × 1K matrix.<br />
The stoichiometry of solid complexes was obtained by digital integration of the signals of the<br />
1 H-NMR spectrum of the washed precipitates, performed in d6-dmso.<br />
66<br />
To determine the influence of the concentrations of the CD on the solubility of vitamin A<br />
propionate, we prepared solutions containing a fixed amount of vitamin A propionate (2mM
for the βCD/PVA complex and 20mM for the γCD/PVA complex) and increased<br />
concentrations of CDs up to their solubility limits (2, 5, 10 and 17mM for the of βCD and 50,<br />
20, 100 and 200mM for the γCD). (Tables II and III)<br />
The aqueous solutions obtained after 24h mixing were washed two times with 300µL ether to<br />
remove free vitamin A propionate. Since neither the complex nor the CD are soluble in ether,<br />
all the CD remains in the solution, either in free form or in complexed form. The solutions<br />
were freeze-dried and 10mg dissolved in 0.4mL d6-dmso for 1 H-NMR study: integration of<br />
the signals allowed to calculate [PVA]t/[CD]t where [PVA]t represents the initial<br />
concentration of vitamin A propionate and [CD]t the initial concentration of CD. Then the<br />
concentration of the complex which is estimate equal to that of [PVA]t as long as there is a<br />
large excess of CD (according to Benesi-Hildebrand hypothesis [15]).<br />
HPLC<br />
Analytical HPLC was carried out with a Waters Delta Prep 3000 chromatograph equipped<br />
with an LSED detector and a Nova-Pack ® C18 WATERS column, elution with methanol<br />
(Chromasolv ® filtered on Millicup PTFE 0,5μm ) at 1ml/mn. An UV detector was used<br />
(WATERS Lambda Max at 340 nm) in the case where the interesting peaks were overlapped<br />
by the peak of the CD with LSED, as CDs do not appear with UV detection.<br />
Mass Spectrometry<br />
Electrospray mass spectrometry analysis were performed in positive mode on a Micromass<br />
Quattro II. Samples were dissolved in a mixture of water-acetonitrile 1:1 (v:v) at a<br />
concentration of 0.01 mg.ml -1 and infused into the electrospray ion source. The capillary<br />
voltage was set to 4 Kv.<br />
RESULTS AND DISCUSSION<br />
67<br />
First of all, the aspect of the aqueous solutions obtained after 24h mixing with αCD, βCD and<br />
γCD respectively, is informative : the first one leads to a cloudy, homogeneous solution with a<br />
yellow oily upper layer whereas the use of βCD and γCD lead to a white suspension with a<br />
precipitate and a yellow oily upper layer. After centrifugation there were more precipitate in<br />
the last two but no precipitate with αCD. This observation alone suggests that an insoluble
complex is formed with βCD and γCD. However these preliminary results and the possible<br />
presence of a soluble complex in all supernatants have yet to be proved by the NMR studies.<br />
Determination of the inclusion phenomena by NMR study<br />
The first NMR experiments were dedicated to the complete assignment of the protons of pure<br />
vitamin A propionate in d6-dmso (Figure 1). The following bidimensional experiments were<br />
used to complete the 1 H-NMR spectrum: COSY, COSY relay and NOESY.<br />
The 1 H-NMR spectra in d6-dmso (Figure 2) of the precipitates obtained previously indicate<br />
that both the CD (βCD or γCD) and the vitamin A propionate are present. Comparison of the<br />
1 H-NMR spectra of the guest alone (Fig 1) and of the precipitates (Fig 2) shows also that the<br />
chemical integrity of vitamin A propionate is preserved. Since all the free drug has been<br />
eliminated by ether washings, as described in experimental section, it should be assessed that<br />
presence of vitamin A propionate was induced by inclusion process with βCD and γCD. But<br />
to prove it, experimental evidence of the reality of inclusion must be given. This is fully<br />
supported by the observation of the NMR spectra of the complexes in water at high dilution<br />
(Figure 3) : larger differences are observed upon inclusion of vitamin A propionate and most<br />
signals of the CD host are shifted upfield. Shifts are due mainly to the anisotropic effects of<br />
the double bonds and the carbonyl group. It is noteworthy that NMR allows clear distinction<br />
between inclusion and any other possible external interaction processes, with large effects<br />
observed on the proton located in the hydrophobic cavity (H3 and H5), clearly proving<br />
inclusion [16,17]. On the other hand, protons located on the outside experience no or very<br />
small shifts.<br />
Figure 1. 1 H-NMR spectrum of vitamin A propionate in d6-dmso at 298 K and 500 MHz<br />
(10mM)<br />
4<br />
3<br />
5<br />
2<br />
6<br />
1<br />
H7, H8, H12<br />
7 9 11 13 15<br />
8 10 12 14<br />
H15<br />
68<br />
OCOC 2 H 5<br />
d6-dmso<br />
CH2<br />
Methyls<br />
9 13 1<br />
Methyl 5<br />
CH3
H11<br />
H10 H14<br />
69<br />
HDO acetone<br />
6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 ppm<br />
H4<br />
H3H2<br />
1 1 3 1 2<br />
2 233<br />
3 2 2 9
(a)<br />
OH2 OH3<br />
PVA PVA<br />
PVA<br />
PVA<br />
OH6 H1<br />
H3<br />
H5<br />
H6 H6'<br />
betaCD<br />
H2 H4<br />
0.5 0.5 1.5 14 7 1 7 28 1 1 3X1.5 1 1 4.5<br />
(b)<br />
6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 ppm<br />
PVA<br />
PVA<br />
70<br />
gammaCD<br />
Figure 2. 1 1 1 H-NMR 3 16 spectra 1 of 8(a) 2the 8βCD/PVA and 32 (b) the γCD/PVA 2complexes 2 33 3<br />
in<br />
2 2<br />
d6-dmso<br />
9<br />
at 298 K and 500 MHz (10mg in 0.4cc)<br />
6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 ppm
Figure 3. partial 1 H-NMR spectra (in D2O at 298K and 500 MHz) of (a) γCD alone (b)<br />
γCD/PVA complex<br />
In the case of αCD, no precipitate is formed when vitamin A propionate is added which lead<br />
to two hypothesis : no inclusion complex is formed or there is a water soluble inclusion<br />
complex. The aqueous solution was freeze-dried and dissolved in D2O. The 1 H-NMR<br />
spectrum in D2O does not show any signals of the protons of vitamin A propionate, indicating<br />
that the first assumption is correct, and in accordance with results obtained by Munoz-Botella<br />
[14].<br />
(a)<br />
4.05 4.00 3.95 3.90 3.85 3.80 3.75 3.70 3.65 3.60 3.55 ppm<br />
(b)<br />
4.05 4.00 3.95 3.90 3.85 3.80 3.75 3.70 3.65 3.60 3.55 ppm<br />
Determination of the stoichiometry<br />
Since both complexes exhibit low solubility in water, a reliable determination cannot be<br />
71<br />
H3 H5 H2 H4<br />
obtained in aqueous media using the Job’s continuous variation method [18 ] due to the low<br />
signal-to-noise ratio. The spectra of the complexes, purified as described in the experimental<br />
section, were therefore recorded in d6-dmso to derive the molecular ratio, since vitamin A<br />
propionate and cyclodextrins exhibits high solubility in this solvent. It should be pointed out
that under these conditions, solvation of the cyclodextrin by dmso molecules induces<br />
dissociation of the inclusion complexes [19]. The present spectra allow, however, a very<br />
accurate determination of the stoichiometry in the original complex. Digital integration of<br />
relevant lines from the vitamin A propionate (H15, H10 or H11 for example) and from the<br />
cyclodextrin (OH2, H1 or H6) confirms the stoichiometry of the considered complex.<br />
Integration of the signals of the 1 H-NMR spectrum in d6-dmso of βCD/PVA and γCD/PVA<br />
complexes (Figure 2) allowed to determine easily and without any doubt the CD/PVA ratio<br />
in the complex. The results are : 1/1 complex for γCD/PVA and 2/1 complex for βCD/PVA.<br />
This 2/1 stoichiometry for the βCD/PVA complex has already been reported for other vitamin<br />
A esters such as palmitate and acetate [12, 13].<br />
These results are in adequacy with the size of the cavities of the CDs : since the βCD is<br />
smaller it is possible that the part of the vitamin A propionate molecule that remains outside<br />
can be included in a second βCD.<br />
Influence of the concentration of CD on the solubility of PVA in water<br />
In water, the formation of the complex follows this equilibrium : PVA + nCD ↔ X , where X<br />
represents the PVA/CD complex (with a 1/n stoichiometry). Therefore the association<br />
constant is equal to : k = [X] ([PVA] [CD] n ) -1 where [X], [PVA] and [CD] represent the<br />
concentration of inclusion complex and free species in solution respectively. If the total<br />
concentration of vitamin A propionate [PVA]t remains constant and always very low<br />
compared to that of the CD, [CD]t, then we can estimate that the concentration of the<br />
complexes is equal to the vitamin A propionate concentration as already demonstrate by<br />
Benesi and Hildebrand [15].<br />
[PVA]t = [X] + [PVA] and [CD]t = [X] + n [CD]<br />
if [CD]t >> [PVA]t then [PVA]t ≡ [X]<br />
The method described in the experimental section satisfied this condition ([CD]t >> [PVA]t)<br />
and led to the determination of the concentration of complexes for [γCD]t/[PVA]t ratio of<br />
2.5, 5 and 10 and [βCD]t/[PVA]t ratio of 2.5, 5 and 8.5. Several signals of the vitamin A<br />
propionate were digitally integrated on the 1 H-NMR spectrum performed in D2O, the<br />
calibration being made on the signal of anomeric proton (H1) of the CD for which the<br />
concentration [CD]t is known and equal to its initial concentration. The concentration of<br />
complexes in water is deduced to the mean value obtained from the integration of the vitamin<br />
A propionate signals. (Tables II and III)<br />
72
[PVA]t<br />
[γCD]t mM [X] mM [PVA]t mM [βCD]t/<br />
[X] mM<br />
mM<br />
[PVA]t<br />
200 1,1 17 0,13<br />
20 100 1,3 2 10 0,13<br />
50 0,58 5 0,12<br />
Table II and III: concentrations used to determine the influence of the concentration of CD on<br />
the concentration of the resulting complex (X). The concentration of PVA is constant and<br />
fixed to 2mM for the βCD/PVA complex and to 20mM for the γCD/PVA.<br />
These results indicate that, in both case, once the [CD]t/[PVA]t ratio reaches 5, the<br />
concentration of complexes does not increase anymore. This allowed us to determine the best<br />
conditions to prepare the complexes. It should be noticed that the concentration of the<br />
γCD/PVA complex is ten times higher that of the βCD/ PVA complex and reaches a<br />
maximum of 1mM in the presence of 5 equivalents of γCD. It should be stressed here that the<br />
solubility of PVA alone in water is absolutely null.<br />
Stability studies<br />
NMR and HPLC were found to be very appropriate to show any chemical modifications of the<br />
vitamin A propionate alone and in presence of βCD and γCD. A careful NMR analysis has<br />
been performed in d6-dmso in all cases as described in the experimental section (storage in<br />
natural light or in the dark, both at 25°C and at 4°C) to check the molecular integrity of the<br />
host and the guest molecules, even if desincluding solvent such as dmso was used. The main<br />
interest of NMR in this case is that any new signal on the spectrum indicates chemical<br />
modification of the guest. Morever, since the assignment of the molecule is clear, it is possible<br />
to know which moiety of vitamin A propionate was affected. We performed this analysis after<br />
10 days, 30 days, 60 days, 6 months and 24 months. Also the HPLC survey was added. This<br />
method could complete the NMR study since each new peaks to appear stands for a molecule<br />
with a different polarity, though giving us possible information on the number and the nature<br />
of the degradation products.<br />
73<br />
We have summarized the main results in table IV.<br />
VA VB VC VD βA βB βC βD γA γB γC γD<br />
J+10 + - - - + + - - - - - -<br />
J+30 ++ - - - ++ + + - -/+ - - -
J+60 ++ + - - ++ ++ + + -/+ - - -<br />
J+180 +++ + + - +++ +++ ++ ++ -/+ -/+ -/+ -<br />
J+730 +++ ++ + + +++ +++ +++ +++ + -/+ -/+ -/+<br />
Table IV. Batches degradation: (-) no degradation (-/+) specific chemical modification of the<br />
ester group, (+) light degradation, (++) intense degradation , (+++) complete degradation.<br />
This table shows only the rate of the degradation process for each batches, but we must<br />
underlined here that the degradation profile of vitamin A propionate in the βCD/ PVA<br />
complex is very different from that of vitamin A propionate in the γCD/PVA complex, and<br />
none of them matches the degradation profile of vitamin A propionate alone (for HPLC and<br />
NMR).<br />
For the drug alone, batch VA (25°C and light), the modifications of the 1 H-NMR spectrum<br />
indicated that chemical modifications first appeared on the side chain and quickly gained the<br />
complete skeleton of the molecule. After 60 days, only the terminal CH2 was preserved, and<br />
by 6 months the degradation was complete (Figure 4 b). Batches VB, VC, and VD exhibited<br />
no observable modifications at all until 60 days. It seems that natural light is the main factor<br />
of degradation process of vitamin A propionate alone. For the vitamin A propionate in the<br />
βCD/ PVA complex, the first signs of degradation appeared after 30 days on the ring and on<br />
the terminal ester in the form of secondary signals at the basis of the signals of the protons of<br />
vitamin A propionate. As those secondary peaks get bigger, those of vitamin A propionate are<br />
reduced until all the specific signals of the molecule disappeared (6 months) (Figure 4 c). It<br />
happened faster on the batches βA and βB (at 25°C) than on the batches βC and βD (at 4°C),<br />
but the result was the same: there was no vitamin A propionate left after 6 months. For the<br />
vitamin A propionate in the γCD/PVA complex, NMR spectra indicate that the only part of<br />
the molecule affected by chemical modifications was the terminal ester group: secondary<br />
signals could be seen after 30 days on batch γA and after 180 days for γB, γC and γD. The<br />
chemical modification increased slightly (Figure 4 a) with time but no other signs of<br />
degradation appeared, even after 24 months : the major part of the molecule remains<br />
74<br />
unaffected in the presence of γCD and the guest molecule must keep its biological properties.<br />
The HPLC survey (data not shown) also shows different degradation profiles for PVA alone,<br />
in the βCD/ PVA complex and in the γCD/PVA complex in agreement with NMR studies.<br />
The reference chromatogram of vitamin A propionate shows a single peak with a retention
time (Tr) of 3.6 mn but the same chromatogram after 60 days storage under light and air at<br />
25°C (batch VA) shows many new peaks induced by possible degradation products : peak <br />
Tr 0.8 mn, peak Tr 1.45 mn, peak Tr 2,4 mn, peak Tr 6.2 mn, peak Tr 16.8 mn,<br />
peak Tr 19.2, peak Tr 22 mn, peak Tr 24.2 mn, peak Tr 29.6mn. Some peaks (,<br />
, ) exhibiting smaller retention times than the peak of PVA can be attributed to more polar<br />
molecules and conversely, peaks exhibiting longer retention times (, , , , , )<br />
correspond to less polar products. For VB (same recording and injection parameters) those<br />
peaks are less important and they are barely present for VC and VD. By sixth months there is<br />
no more vitamin A propionate in VA but VC and VD are well conserved. For βA, the same<br />
peaks as those present for VA appeared after 60 days, but one of them (peak 5) is much more<br />
higher. βB, βC and βD are absolutely similar to βA and after 6 months vitamin A propionate<br />
disappeared from the chromatograms of the four batches indicating complete degradation of<br />
the molecule, like previously observed with NMR. Finally for γCD/PVA, after 60 days the<br />
four batches (γΑ, γB, γc, γD) are similar : smaller peaks and are present but the less<br />
polar degradation products observed with VA batches are absent. After 6 months, there is no<br />
noticeable changes on the chromatogram. Since the inclusion phenomena with βCD has a<br />
great impact on peak 5, we attempted to determine the nature of this specific derivative. It was<br />
isolated by semi-preparative HPLC and studied by Mass Spectrometry : the product has a high<br />
Molecular Weight, 1121 g/Mol, which means its not a derivative of the molecule but some<br />
kind of aggregate, the nature and structure of which remain unknown.<br />
All those results, NMR and HPLC provide us with valuable information. First of all, when<br />
regarding the vitamin A propionate alone, the comparison between the spectra of VA, VB,<br />
VC, VD shows that protecting vitamin A propionate from light decreases the degradation<br />
rates and almost stopped it. This is quite a surprise since oxygen and temperature are<br />
supposed to play a more active role, but it must be reminded that the product we use is<br />
commercial and contains a conservative agent (antioxidant). However, the major effect of<br />
light on degradation is confirmed by data from the literature which states that the double<br />
bonds rearrangements are induced by light [20, 21]. The effect of temperature is less<br />
important but still relevant as batches at 4°C (dark) show slight amelioration compared to<br />
those at 25°C (dark).<br />
75<br />
The most interesting point of this study is the effects of the inclusion in cyclodextrins. It must<br />
be emphasized here that the degradation profile of vitamin A propionate in the βCD/ PVA<br />
propionate is different from that of vitamin A propionate alone. Inclusion in the βCD lead to a
faster degradation which does not match the natural degradation profile of the molecule. This<br />
phenomenon occurs in all the storage conditions, indicating it is not caused by exterior factors<br />
but by the inclusion in βCD it-self. This was already suspected with another ester of vitamin<br />
A like the acetate [9,10]. On the contrary, it is clear the inclusion in γCD allows to slow down<br />
the degradation process and keep a major part of the guest unaffected for at least 6 month,<br />
even in the presence of light or oxygen. This is in accordance with the stabilizing effect of<br />
γCD observed by Moldenhauer et al. [11] on retinol and its derivatives.<br />
76<br />
Figure 4. Partial 1 H-NMR spectra of (a) γCD/PVA complex (b) vitamin A propionate (c)<br />
βCD/PVA complex, after 6 months storage at 25°C under light ( d6-dmso, 298K , 500 MHz)
Figure 5. Estimated structure of (a) the γCD/PVA complex (b) the βCD/PVA complex<br />
(a)<br />
(a)<br />
2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 ppm<br />
(b)<br />
2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 ppm<br />
(c)<br />
2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 ppm<br />
77
(b)<br />
78<br />
To explain the different behaviour of the vitamin A propionate in the 2 complexes, it should<br />
be reminded that the stoichiometry of the βCD/PVA complex is 2/1 while that of the<br />
γCD/PVA complex is 1/1. If a vitamin A propionate molecule is included in 2 βCD<br />
simultaneously, we can suppose that each one comes to one of the extremity , the secondary<br />
face looking at each other (as the inclusion must start by the secondary and larger face) (Fig<br />
5b). Therefore, the specific and very important degradation process of the vitamin A<br />
propionate in the βCD/PVA complex can be explained by the action of the two secondary<br />
hydroxyl rings. Indeed, chemical modifications of the guest molecule induced by the CD have<br />
already been described in the literature, especially for βCD. Thus, it was clearly demonstrated<br />
in the βCD /spironolactone complex that the secondary hydroxyls of βCD lead to the thiol
analog of spiranolactone [22]. A 1/2 complex was indeed obtained with spironolactone and<br />
βCD and it was shown by NMR that this steroid is s-desacetylated quantitatively in the<br />
inclusion process. Evidence has been given showing that this chemical modifications is<br />
directly related to the inclusion. Attempt to explain this phenomenon involve the possible<br />
catalytic effect of the secondary hydroxyls of the cyclodextrins. A very strong hydrogen bond<br />
(OH2-OH3) would explain the high acidity of OH groups of βCD [23].<br />
In the γCD/PVA complex, it is reasonable to think that the bigger part of the molecule is<br />
included in the CD, as the inner cavity is large enough, and so protected from exterior factors.<br />
As the NMR spectra show that only the terminal ester is affected by degradation, we can<br />
suppose that this part of the molecule remains outside the cavity and is not protected or is<br />
attacked by the secondary hydroxyls of the γCD (Figure 5a).<br />
CONCLUSION<br />
We were able to demonstrate that vitamin A propionate can be included in both βCD and<br />
γCD, resulting in solid complexes with 2/1 and 1/1 stoichiometriy respectively .<br />
Then, the HPLC and NMR studies showed that inclusion in βCD not only accelerate the<br />
degradation process of vitamin A propionate but also modify it since the derivatives obtained<br />
are different from those that appeared in the case of vitamin A propionate alone. On the other<br />
hand , inclusion in γCD allows to slow down the degradation process really significantly and<br />
to keep the major part of the molecule unmodified for several months, even in the worse<br />
storage conditions.<br />
ACKNOWLEDGMENT<br />
We gratefully acknowledge LVMH-GIE, Branche Parfums et Cosmetiques (C. DIOR, St Jean<br />
de Braye, France) for the financial support and especially J. C. Archambault, P. André and<br />
Professor P. Rollin (ICOA, Orléans, France) for helpful discussions.<br />
REFERENCES<br />
[1.] M. H. Zile and M. E. Cullum: Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 172, 139 (1983).<br />
79<br />
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[22.] D. Wouessidjewe, A. Crassous, D. Duchêne, A.W. Coleman, N. Rysaneck, G.<br />
Tsoucaris , B. Perly, F. Djedaïni: Carbohydr. Res. 192,. 313 (1989).<br />
80<br />
[23.] R. Breslow, S. D. Dong : Chem. Rev. 98, 1997 (1998).
Chapitre 1<br />
3.2.3 Brevet FR0201241<br />
81<br />
Utilisation cosmétique ou dermatologique de la vitamine A ou de ses esters, en<br />
association avec une β-cyclodextrine diméthylée<br />
J-C. Archambault, F. Djedaïni-Pilard, F. Ouvrard-Baraton, S. Weisse
1H19103 Cas 82 FR0<br />
FG/187<br />
BREVET D'INVENTION<br />
__________________<br />
Utilisation cosmétique ou dermatologique de la vitamine A ou de ses esters, en<br />
association avec une β-cyclodextrine diméthylée.<br />
Inventeurs :<br />
Déposants : LVMH RECHERCHE<br />
__________________<br />
COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE<br />
Jean-Christophe ARCHAMBAULT<br />
Florence DJEDAINI-PILARD<br />
Françoise OUVRARD-BARATON<br />
Sandrine WEISSE<br />
__________________<br />
La présente invention concerne l'utilisation dans le domaine de la cosmétique<br />
et de la dermatologie d'associations de β-cyclodextrines partiellement méthylées et<br />
de vitamine A ou d'esters de vitamine A.<br />
82
Depuis de nombreuses années, la vitamine A et ses esters, notamment<br />
l’acétate et le palmitate, sont très largement utilisés en cosmétique et en<br />
dermatologie pour améliorer l’état général de la peau. Les actions de la vitamine A<br />
sont bien connues dans ces domaines d’application. Elle régule notamment le<br />
métabolisme cellulaire de la peau et, de ce fait, préserve ou restaure un bon état<br />
physiologique cutané. La vitamine A permet ainsi d’améliorer le tonus, la fermeté et<br />
l’élasticité de la peau qui tendent à diminuer avec l’âge ou par des effets de stress.<br />
En particulier, la vitamine A ou ses esters sont couramment utilisés pour retarder<br />
l’apparition des rides ou pour en atténuer leur profondeur. La vitamine A est<br />
également utilisée avantageusement pour le soin des peaux dites grasses. En<br />
dermatologie, la vitamine A agit efficacement pour favoriser la cicatrisation de la<br />
peau, ainsi que dans le traitement des peaux à tendance acnéique.<br />
Cependant l’utilisation de tels composés est limitée en pratique par des<br />
problèmes de stabilité, de solubilité en milieu aqueux mais aussi de pénétration dans<br />
la peau. En effet, l’utilisation de la vitamine A ou de ses esters n’a d’intérêt en<br />
cosmétique et en dermatologie que si ces actifs sont biodisponibles au niveau du<br />
derme et/ou de l’épiderme.<br />
Les problèmes techniques rencontrés pour réaliser leur solubilisation, leur<br />
stabilisation et leur pénétration dans la peau ont donc fait l’objet de nombreux<br />
développements. Des méthodes ont été décrites pour solubiliser en milieux aqueux<br />
et stabiliser la vitamine A ou ses esters. Mais les résultats obtenus ne sont pas<br />
satisfaisants en terme de pénétration dans les couches plus profondes de l’épiderme<br />
réduisant d’autant la biodisponibilité des actifs incorporés dans les compositions<br />
cosmétiques et dermatologiques antérieures.<br />
Les cyclodextrines α, β et γ, ci-après désignées par α-CD, β-CD et γ-CD,<br />
sont décrites depuis longtemps en tant que vecteur d’actifs de toutes sortes,<br />
capables de piéger certaines petites molécules de nature hydrophobe. En particulier,<br />
les cyclodextrines sont décrites pour capter et protéger les vitamines lipophiles, les<br />
arômes.<br />
Il est connu de l’art antérieur, dans le document WO 9421225, des<br />
compositions cosmétiques utilisant comme agent de pénétration une ß-cyclodextrine<br />
afin de former des complexes d’inclusion d’esters de vitamine A, en particulier de<br />
palmitate.<br />
83<br />
Cependant, l’utilisation de laβ-cyclodextrine pour réaliser cette inclusion<br />
présente un inconvénient majeur. En effet, il s’avère que la vitamine A incluse dans<br />
la β-cyclodextrine n’est pas protégée et se dégrade même plus rapidement que la<br />
vitamine A non incluse. Ce phénomène a été prouvé par Karl-Heinz Frömming et al.<br />
(Acta Pharm. Technol. (1988) 34 (3) 152-155) au moyen de différentes techniques :
spectrophotométrie UV, spectroscopie RMN, etc… Ainsi l’utilisation de la β-<br />
cyclodextrine ne semble pas pouvoir résoudre tous les problèmes techniques<br />
évoqués ci-dessus pour une utilisation cosmétique ou dermatologique de la vitamine<br />
A ou de ses esters.<br />
Pour améliorer la stabilité de la vitamine A ou de ses esters, il a été<br />
proposé d’utiliser la γ-cyclodextrine comme molécule hôte (US 5985296). Toutefois le<br />
complexe d’inclusion de la vitamine A dans la γ-cyclodextrine présente une solubilité<br />
en milieu aqueux très médiocre, ce qui en limite sérieusement son intérêt pour une<br />
application cosmétique ou dermatologique.<br />
Il est également connu du document EP 0649653 A1 l’utilisation de β-CD<br />
partiellement méthylées comme promoteur d’absorption dans des compositions<br />
pharmaceutiques pour l’administration transcutanée de principes actifs.<br />
Ce document n’incite manifestement pas l’homme du métier à utiliser une<br />
β-cyclodextrine partiellement méthylée comme vecteur de pénétration de principes<br />
actifs dans la peau sans passage transcutané, en vue d’applications cosmétiques.<br />
Par ailleurs, la demande de brevet FR 2484252 décrit un procédé de<br />
préparation de solutions aqueuses de composés organiques biologiquement actifs<br />
insolubles ou peu solubles dans l’eau, tels que la vitamine A (ou rétinol) et ses<br />
esters, par inclusion dans des β-cyclodextrines partiellement méthylées, en particulier<br />
diméthylées. Il y est précisé que ces solutions aqueuses sont stables. A titre<br />
d’exemple, un procédé est décrit pour inclure l’acétate de vitamine A dans l’heptakis-<br />
(2,6-di-O-méthyl)-β-cyclodextrine. Toutefois le complexe d’inclusion ainsi formé est<br />
ensuite incorporé dans une préparation pharmaceutique administrable par voie orale.<br />
Ce document incite l’homme du métier à administrer les vitamines liposolubles<br />
comme la vitamine A par voie orale sous forme de solutions aqueuses, le détournant<br />
ainsi d’une utilisation topique.<br />
D’autres auteurs ont préparé des complexes d’inclusion de différents<br />
rétinoïdes et de leurs esters dans des cyclodextrines en particulier dans la 2,6-di-O-<br />
méthyl-β-cyclodextrine ou « DM-β-CD », pour réaliser des études de solubilité dans<br />
l’eau et de stabilité (S. Muňoz Botella, et al., Analyst (1996) 121, 1557-1560). Des<br />
complexes d’inclusion avec le rétinol et le rétinyl acétate dans la DM-β-CD ont été<br />
préparés et étudiés. Les observations par la technique de fluorescence ont montré<br />
que ces complexes présentaient une excellente stabilité sur le long terme<br />
84
Enfin, le document US 5484816 décrit la préparation d’une composition<br />
pour le traitement de la peau, dans laquelle la stabilité de la vitamine A est<br />
grandement améliorée. Cet effet positif sur la stabilité est obtenu notamment par<br />
l’inclusion de la vitamine A ou de son ester dans différentes cyclodextrines, modifiées<br />
ou non, en particulier dans une méthyle β-cyclodextrine.<br />
Les inventeurs de la présente invention ont maintenant découvert de<br />
manière tout à fait surprenante que l'utilisation de β-cyclodextrines diméthylées et,<br />
en particulier de produits commerciaux tels que les DIMEB ou les RAMEB définis ci-<br />
après, en association avec de la vitamine A ou un de ses esters classiquement utilisés<br />
en cosmétique et en dermatologie, permettait de préparer des compositions<br />
cosmétiques ou dermatologiques dans lesquelles la vitamine A ou son ester se<br />
trouvait sous une forme particulièrement stable et soluble, caractérisées après leur<br />
application par une remarquable rétention de la vitamine A ou de ses esters dans la<br />
peau, tout en évitant leur passage transdermique.<br />
Ainsi donc, la présente invention fournit des compositions cosmétiques ou<br />
dermatologiques à base de vitamine A ou d'un de ses esters cosmétiquement ou<br />
dermatologiquement acceptables qui permettent une excellente rétention de cet actif<br />
dans la peau. La constatation particulièrement surprenante de ce qu'aucun passage<br />
transdermique de vitamine A ou de son ester n'avait lieu présente un avantage<br />
considérable puisqu'il permet de focaliser toute l'activité biologique de la composition<br />
sur la libération de l'agent actif au niveau de la peau qui est la zone visée selon la<br />
présente invention.<br />
Avant d'aborder la description proprement dite détaillée de l'invention, il<br />
semble bon de donner un certain nombre de définitions de termes employés tout au<br />
long de la présente description.<br />
Les cyclodextrines (CD) sont des composés cycliques encore désignés par<br />
cycloamyloses ou cycloglucanes constitués d'un enchaînement de motifs glucose (6<br />
motifs glucose pour l'α-cyclodextrine, 7 pour la β-cyclodextrine et 8 pour la γ-<br />
cyclodextrine).<br />
85<br />
Par "β-cyclodextrine diméthylée", au sens de l'invention, on entend les<br />
dérivés méthylés de la β-cyclodextrine possédant un groupe méthoxy sur, en<br />
moyenne, deux des trois positions 2, 3 et 6 de chacun des 7 motifs glucose.<br />
Statistiquement, les « β-cyclodextrines diméthylées » selon l’invention présentent un<br />
degré de substitution des protons des groupes hydroxy des motifs glucose par des<br />
radicaux méthyle compris entre 10 et 16, et de préférence compris entre 11 et 15.<br />
Dans cette famille de β-cyclodextrines diméthylées, on distinguera en<br />
particulier le dérivé diméthylé dont tous les motifs glucose possèdent un groupe
méthoxy sur chacune des positions 2 et 6, désigné sous le nom d’heptakis-(2,6-di-O-<br />
méthyl)-β-cyclodextrine ou encore DIMEB, qui présente donc un degré de<br />
substitution défini ci-dessus égal à 14, et parmi les produits commerciaux existant<br />
dans la famille des β-cyclodextrines diméthylées, le RAMEB qui est un mélange de<br />
plusieurs β-cyclodextrines dont chaque unité glucose est statistiquement<br />
diméthylée.Le degré de substitution moyen du RAMEB par les radicaux méthyle est<br />
d'environ 12,6, ainsi que cela est notamment indiqué dans le document WO<br />
0145615.<br />
Selon l'une de ses caractéristiques essentielles, la présente invention<br />
concerne l'utilisation d’au moins une β-cyclodextrine diméthylée dans laquelle chaque<br />
molécule de β-cyclodextrine est substituée par 10 à 16 groupements méthyles, en<br />
tant qu’un agent favorisant la pénétration dans l’épiderme et la rétention dans la<br />
peau de la vitamine A ou de ses esters cosmétiquement ou dermatologiquement<br />
acceptables, pour la préparation d’une composition cosmétique ou dermatologique<br />
renfermant de la vitamine A ou au moins un de ses esters cosmétiquement ou<br />
dermatologiquement acceptables.<br />
En effet, la présente invention résulte, comme exposé précédemment du<br />
fait que ses inventeurs ont mis en évidence, notamment comme cela ressort des<br />
exemples qui suivent, que le recours à une β-cyclodextrine diméthylée telle que<br />
définie précédemment permettait d'améliorer grandement l’absorption de la vitamine<br />
A ou de ses esters par la peau tout en évitant un passage transdermique et<br />
d'augmenter ainsi sa biodisponibilité.<br />
Les β-cyclodextrines diméthylées utilisables selon l'invention en<br />
combinaison avec de la vitamine A ou un de ses esters peuvent être toutes les β-<br />
cyclodextrines diméthylées telles que définies ci-dessus.<br />
Toutefois, on recourra de préférence à des β-cyclodextrines présentant un<br />
degré de substitution compris entre 11 et 15, c'est-à-dire à des β-cyclodextrines<br />
substituées par 11 à 15 radicaux méthyle.<br />
86<br />
Selon une caractéristique particulièrement avantageuse, on recourra à<br />
l'heptakis-(2,6-di-O-méthyl)-β-cyclodextrine ou DIMEB.
Selon une autre variante avantageuse de l'invention, on utilisera, à titre de<br />
β-cyclodextrines diméthylées, des β-cyclodextrines statistiquement diméthylées sur<br />
chaque glucose, couramment commercialisées sous le nom de RAMEBtelles que<br />
définies ci-dessus. L'invention pourra être mise en oeuvre avec de la vitamine A<br />
sous sa forme alcool (rétinol). Toutefois, on choisira de préférence d'utiliser ses<br />
esters. Tous les esters de la vitamine A classiquement utilisés en cosmétique et en<br />
dermatologie pourront être utilisés selon la présente invention. On choisira de<br />
préférence l'acétate, le palmitate ou le propionate de vitamine A.<br />
Comme cela est déjà connu dans la littérature, la vitamine A et ses esters<br />
forment aisément des complexes d'inclusion avec les β-cyclodextrines, en particulier<br />
avec les β-cyclodextrines alkylées telles que la DIMEB et la RAMEB.<br />
Ainsi, pour préparer les complexes d'inclusion pour la mise en œuvre de<br />
l'invention, on peut utiliser l'un des procédés décrits, en particulier celui décrit dans<br />
le document FR 2484252. Selon ce procédé, on dissout d'une façon générale la βcyclodextrine<br />
diméthylée dans de l'eau puis on ajoute à la solution obtenue la<br />
vitamine A ou son ester, soit directement, soit sous forme d'une solution organique<br />
miscible à l'eau, et on évapore ensuite le solvant, de façon à récupérer le complexe<br />
d'inclusion sous forme solide.<br />
Selon une autre variante, on peut également récupérer le complexe<br />
d'inclusion en solution avant toute évaporation, ou bien le complexe d'inclusion sous<br />
forme solide obtenu à l'étape précédente peut être solubilisé à nouveau en milieu<br />
aqueux pour son utilisation ultérieure dans le cadre de la présente invention.<br />
Il est également possible d'utiliser les procédés de préparation décrits par S.<br />
Muňoz Botella, et al. (Analyst (1996) 121, 1557-1560). Par exemple, selon le principe<br />
du premier de ces procédés on introduit dans un ballon rotatif le rétinol dissout dans<br />
l'hexane, puis on évapore de solvant de façon à former une fine pellicule de rétinol<br />
sur les parois du ballon. On introduit alors dans le ballon une solution aqueuse de βcyclodextrine<br />
diméthylée, puis on agite cette solution pendant 24 à 48 heures par<br />
des moyens magnétiques.<br />
De tels procédés de préparation s'avèrent particulièrement intéressants<br />
puisqu'ils permettent d'obtenir des solutions aqueuses, le cas échéant sous forme de<br />
gels, de la vitamine A et de ses esters.<br />
Selon un aspect de l'invention, les complexes d'inclusion définis ci-dessus<br />
peuvent être utilisés aussi bien sous forme de solutions aqueuses, de gels aqueux ou<br />
encore sous forme de poudre sèche pour être incorporés dans des compositions<br />
cosmétiques ou dermatologiques.<br />
87<br />
Il est également apparu que la composition cosmétique ou dermatologique<br />
préparée selon l'invention peut être préparée sous différentes formes, en particulier<br />
sous forme de gel aqueux, de lotion, d'émulsion et de poudre. Il s'agira en particulier
de produits cosmétiques de soin ou de maquillage traitant, destinés en particulier à<br />
lutter contre l'apparition des effets du vieillissement actinique ou chronologique, tels<br />
que les rides, la perte de l'élasticité et de la tonicité de la peau, ou encore destinés<br />
au soin des peaux grasses. Il s'agira également de préparations dermatologiques,<br />
notamment destinés à favoriser la cicatrisation cutanée ou au traitement des peaux à<br />
tendance acnéique.<br />
Selon une autre de ses caractéristiques essentielles, la présente invention<br />
concerne un procédé de soin cosmétique destiné à améliorer la pénétration dans<br />
l’épiderme et la rétention dans la peau de la vitamine A ou de ses esters<br />
cosmétiquement acceptables, caractérisé en ce qu’il comprend l’application sur la<br />
peau d’une composition cosmétique contenant une association de β-cyclodextrines<br />
diméthylées et de vitamine A ou d’au moins un de ses esters cosmétiquement<br />
acceptables, les composants de ladite association étant tels que définis<br />
précédemment.<br />
EXEMPLES<br />
Exemple 1 : Préparation d'un gel aqueux contenant un complexe<br />
d'inclusion du propionate de vitamine A dans la RAMEB (ou diméthyl β-<br />
cyclodextrine commerciale):<br />
désigné par PVA<br />
L'ester de vitamine A utilisé est le propionate de vitamine A, ci-après<br />
A 10 ml d'une solution 50 mM de RAMEB, on ajoute 200 μl d’une solution<br />
acétonique 1M de PVA, pour obtenir une concentration finale 20 mM en PVA.<br />
On laisse sous hotte ventilée et sous agitation pendant 24 heures.<br />
On centrifuge ensuite pendant 6 minutes à 6000 tours/minutes les<br />
solutions obtenues. La solution obtenue après cette opération est limpide, de couleur<br />
jaune pâle et ne contient pas de précipité.<br />
lyophilisée.<br />
La phase aqueuse est filtrée sur Millex-SG 0,22 μm, congelée et<br />
On obtient ainsi une poudre. Celle-ci peut être utilisée sous cette forme<br />
dans la préparation d'une composition cosmétique ou dermatologique, ou bien, selon<br />
les besoins, être facilement remise en solution en milieu aqueux.<br />
88<br />
Le milieu aqueux précité peut être un gel aqueux, comme par exemple un<br />
gel d'hydroxyéthylcellulose (Natrosol ® , Hercules Inc. Etats-Unis) à 1,8% dans l'eau.
Selon le présent exemple, on ajoute à 10 g (75%) de gel aqueux<br />
d'hydroxyéthylcellulose défini ci-dessus, 3,3 g (25%) de solution aqueuse du<br />
complexe d'inclusion préparé ci-dessus sous forme de poudre, soit une quantité de<br />
24 mg de PVA (soit environ 0,72% de PVA final).<br />
Exemple 2 : Pénétration du PVA dans l’épiderme<br />
Le but de cette étude est de comparer la pénétration et la répartition du<br />
PVA dans de l'épiderme humain frais, selon qu'il se présente sous forme d'un<br />
complexe d'inclusion avec une diméthyl β-cyclodextrine ou avec une γ-cyclodextrine,<br />
ainsi qu'incorposé dans un gel en l'absence de toute cyclodextrine.<br />
1. Préparation des gels<br />
On prépare les gels suivants.<br />
a) Gel de base<br />
Ce gel est constitué d'hydroxyéthylcellulose (Natrosol ® , Hercules Inc.<br />
Etats-Unis) à 1,8% en poids dans l'eau..<br />
b) Gel selon l'invention à base de RAMEB et de PVA (gel RAMEB)<br />
Le gel RAMEB est le gel préparé à l'exemple 1 ci-dessus.<br />
c) Gel comparatif à base de PVA et de γ-cyclodextrine (gel gamma)<br />
Le gel gamma est constitué à partir de 10 g (75 %) de gel base auxquels on<br />
ajoute 3 ml (25 %) d’une suspension aqueuse à 32 mg/ml de complexe d’inclusion γ-<br />
CD/PVA préparé suivant le même procédé que celui exposé à l'exemple 1 ci-dessus<br />
soit 24 mg de PVA théorique (soit environ 0,72 % de PVA final).<br />
d) Gel témoin<br />
Le gel témoin est constitué de 25 g de gel base (75 %) auxquels on<br />
ajoute d'abord un mélange de 60 mg de PVA (soit environ 0,72 % de PVA final) et de<br />
0,83 g de Tween 60 (polyéthylène (20) sorbitan monostéarate : Uniqema) (soit<br />
2,5 % de Tween 60 final) et ensuite 7,5 g d’eau.<br />
L’étude de pénétration dans l'épiderme s’effectue à l’aide de cellules de<br />
Frantz modifiées d’une surface de 2 cm 2 et d’un volume de 4,2 ml. Le liquide<br />
récepteur est constitué de tampon phosphate du commerce (Sigma) (10 nM, NaCl<br />
120 mM, KCI 2,7 mM, pH 7,4), d’azoture de sodium 0,1 % du commerce (Sigma)<br />
d’éthanol à 20 % et de solubilisant LRI (polyoxyéthylène polyoxypropylène butyl<br />
éther, huile de ricin hydrogénée polyéthylénée, eau purifiée : Wackherr colorants) à<br />
4 %.<br />
Au cours d’une même expérience, les 3 gels (RAMEB, gamma et témoin)<br />
sont appliqués respectivement sur 5 fragments de peau (cellules de Frantz modifiée)<br />
de façon occlusive.<br />
89
Après 24 heures de contact, l’excédent de gel à la surface cutanée est lavé<br />
à l’aide de coton-tiges. Les coton-tiges ainsi que la partie supérieure de la cellule<br />
sont immergés dans 10 ml d’isopropanol et soumis aux ultrasons pendant 15 min<br />
puis agités durant 2 heures. Les solutions sont diluées au 1/10 et filtrées sur 0,2 μm<br />
avant dosage. Le stratum corneum est recueilli par 7 strippings (D’Squam, Eviderm<br />
corporation, Dallas) successifs (pression 300 g.cm -2 , durée 12 s). Le PVA est extrait<br />
par solubilisation dans 2 ml de méthanol pendant 1 nuit à 4°C puis agitation 2 heures<br />
et enfin filtration sur filtre de 0,2μm avant dosage. Le PVA est extrait de l’épiderme<br />
par solubilisation de ce dernier dans 1 ml de méthanol pendant 1 nuit à 4°C puis<br />
agitation 2 heures et enfin filtration 0,2 μm avant dosage. Les dosages du PVA sont<br />
effectués par HPLC. Les chromatogrammes sont réalisés sur un chromatographe<br />
BECKMAN système Gold avec une colonne Lichrosher 125-4 RP18 (5μM) de chez<br />
MERCK. On utilise un détecteur à barrettes d’iode BECKMAN. La phase mobile utilisée<br />
est acétonitrile/eau 90/10 avec un débit de 1ml.min -1 .<br />
Les résultats de dosage en PVA dans les différents compartiments de la<br />
peau, obtenus avec les trois gels décrits dans l’exemple 3, sont regroupés sur la<br />
figure 3.<br />
On constate que le pourcentage de PVA ayant pénétré la peau est<br />
beaucoup plus élevé pour le gel de RAMEB/PVA et, ce, quelque soit le compartiment<br />
considéré. Le gel obtenu à partir du complexe γ-CD/PVA est moins efficace que le gel<br />
témoin. Pour le gel de RAMEB/PVA, on constate également que le pourcentage de<br />
PVA dans l’épiderme est du même ordre de grandeur que celui dans le stratum<br />
corneum, ce qui traduit une grande efficacité en terme de pénétration. Par contre,<br />
pour les deux autres gels le pourcentage de PVA dans l’épiderme est beaucoup plus<br />
faible.<br />
Exemple 3 : Influence du témoin<br />
Une étude, identique à celle décrite dans l’exemple 5, est effectuée avec<br />
le gel RAMEB/PVA, tel que décrit dans l’exemple 4, et le PVA seul en milieu huileux.<br />
Le milieu huileux est une huile de carnation (Witco-Rewo) contenant 0,75 % de PVA.<br />
Les résultats de dosage en PVA dans les différents compartiments de la peau<br />
montrent que l’on dose dix fois plus de PVA dans le liquide récepteur lorsque celui-ci<br />
est sous forme de complexe d’inclusion RAMEB/PVA. On peut donc en conclure que<br />
le gel de RAMEB/PVA permet une excellente pénétration du PVA dans l’épiderme<br />
comparativement au PVA seul, quelque soit la formulation de ce dernier.<br />
90<br />
Exemple 4 : Pénétration du PVA dans la peau humaine : passage transdermique
Cette étude, réalisée sur peau humaine fraîche, est destinée à comparer la<br />
pénétration et la répartition du PVA au travers du revêtement cutané humain<br />
(stratum corneum, épiderme et derme) et en fonction du gel.<br />
dans l’exemple 4.<br />
Les gels utilisés sont le gel témoin et le gel de RAMEB/PVA tels décrits<br />
L’étude s’effectue à l’aide de cellules de Frantz modifiées d’une surface de<br />
2 cm 2 et d’un volume de 4,2 ml.<br />
Le liquide récepteur est constitué de tampon phosphate 10mM, NaCl 120<br />
mM, KCl 2,7 mM, pH 7,4 (Sigma), d’azoture de sodium 0,1 % (Sigma), d’éthanol à<br />
20 % et de LRI (polyoxyéthylène polyoxypropylène butyl éther, huile de ricin<br />
hydrogénée polyéthylénée, eau purifiée : Wackherr colorants) à 4%.<br />
Au cours d’une même expérience, les 2 gels sont appliqués<br />
respectivement sur 8 fragments de peau (cellules de Frantz modifiée) de façon<br />
occlusive.<br />
Après 24 heures de contact, l’excédent de gel à la surface cutanée est lavé<br />
à l’aide de coton-tiges.<br />
Les coton-tiges ainsi que la partie supérieure de la cellule sont immergés<br />
dans 10 ml d’isopropanol et soumis aux ultrasons pendant 15 minutes puis agités<br />
durant 2 heures.<br />
dosage.<br />
Les solutions sont diluées au 1/10 et filtrées sur filtre de 0,2 μm avant<br />
Le stratum corneum est recueilli par 7 strippings successifs (pression<br />
300 g.cm -2 , durée 12 s). Le PVA est extrait par solubilisation dans 2 ml de méthanol<br />
pendant 1 nuit à 4°C puis agitation 2 heures et enfin filtration sur filtre de 0,2 μm<br />
avant dosage.<br />
l’aide d’un scalpel.<br />
Une fois le stratum corneum retiré, on sépare l’épiderme du derme à<br />
Le PVA est extrait de l’épiderme par solubilisation de ce dernier dans 1 ml<br />
de méthanol pendant 1 nuit à 4°C puis agitation 2 heures et enfin filtration sur filtre<br />
de 0,2 μm avant dosage.<br />
Les dosages du PVA sont effectués par HPLC. Les chromatogrammes sont<br />
réalisés sur un chromatographe BECKMAN système Gold avec une colonne Lichrosher<br />
125-4 RP18 (5 μM) de chez Merck. On utilise un détecteur à barrettes d’iode<br />
BECKMAN. La phase mobile utilisée est acétonitrile/eau 90/10 avec un débit de<br />
1ml.min -1 .<br />
91
Les dosages en PVA dans les différents compartiments de la peau ont été<br />
effectués. Aucune trace de PVA n’a été détectée dans le liquide récepteur<br />
contrairement aux résultats obtenus dans l’exemple 5.<br />
On peut donc conclure que la présence du derme inhibe le passage du<br />
PVA dans le liquide récepteur.<br />
Le gel RAMEB/PVA ne favorise pas le passage transdermique du PVA.<br />
REVENDICATIONS<br />
1. Utilisation de dérivés méthylés de la β-cyclodextrine dits β-<br />
cyclodextrines diméthylées, possédant un groupe méthoxy sur, en moyenne, deux<br />
des trois positions 2, 3 et 6 de chacun des 7 motifs glucose et présentant<br />
statistiquement un degré de substitution des protons des groupes hydroxy des motifs<br />
glucose par des radicaux méthyle compris entre 10 et 16, et de préférence compris<br />
entre 11 et 15, en tant qu’agent favorisant la pénétration et la rétention de la<br />
vitamine A ou de ses esters cosmétiquement ou dermatologiquement acceptables<br />
dans la peau.<br />
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdites β-<br />
cyclodextrines diméthylées sont essentiellement constituées d’heptakis-(2,6-di-O-<br />
méthyl)-β-cyclodextrine, encore connue sous le nom de DIMEB.<br />
3. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdites β-<br />
cyclodextrines diméthylées comprennent essentiellement des β-cyclodextrines<br />
statistiquement diméthylées sur chaque motif glucose, communément dénommées<br />
RAMEB, ayant un degré de substitution de l’ordre de 12,6.<br />
4. Utilisation selon l’une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que<br />
la vitamine A ou au moins l'un de ses esters et la β-cyclodextrine diméthylée sont<br />
introduits dans la composition cosmétique ou dermatologique sous la forme de<br />
complexes d’inclusion de ladite vitamine A ou de son ester avec lesdites β-<br />
cyclodextrines diméthylées, telles que décrites dans l'une des revendications 1 à 3.<br />
5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que<br />
la composition contient à titre d’agent actif de la vitamine A et/ou au moins un ester<br />
de vitamine A, ledit agent actif étant au moins partiellement inclus dans une β-<br />
cyclodextrine diméthylée telle que définie dans l'une des revendications 1 à 3.<br />
6. Utilisation selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que<br />
la composition est sous la forme d’un gel, d’une lotion, d’une émulsion ou d’une<br />
poudre.<br />
92
7. Utilisation selon l’une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que<br />
la composition est une composition cosmétique contenant de … à … % en poids de<br />
vitamine A ou d’ester de vitamine A par rapport au poids total de ladite composition.<br />
8. Utilisation selon l’une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que<br />
la composition est une composition dermatologique contenant de … à … UI de<br />
vitamine A pour 100 g de ladite composition.<br />
9. Utilisation selon l’une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que<br />
ledit ester de vitamine A est choisi dans le groupe constitué de l’acétate, du<br />
propionate et du palmitate de vitamine A.<br />
10. Composition cosmétique ou dermatologique destinée à une application<br />
topique sur la peau, caractérisée en ce qu’elle est sous la forme d’un gel, d’une<br />
lotion, d’une émulsion ou d’une poudre et en ce qu’elle contient à titre d’agent actif<br />
une association de β-cyclodextrines diméthylées et de vitamine A ou d’au moins un<br />
de ses esters cosmétiquement ou dermatologiquement acceptables, les composants<br />
de ladite association étant tels que définis dans l'une des revendications 1 à 4.<br />
11. Procédé de soin cosmétique, notamment destiné à réguler le<br />
métabolisme cellulaire de la peau et/ou à préserver ou restaurer un bon état<br />
physiologique cutané et/ou à améliorer le tonus, la fermeté et l’élasticité de la peau<br />
et/ou à retarder l’apparition des rides ou en atténuer la profondeur et/ou à réaliser le<br />
soin des peaux grasses, , caractérisé en ce qu’il comprend l’application sur la peau<br />
d’une composition cosmétique contenant une association de β-cyclodextrines<br />
diméthylées et de vitamine A ou d’au moins un de ses esters cosmétiquement<br />
acceptables, les composants de ladite association étant tels que définis dans l’une<br />
des revendications 1 à 4.<br />
93<br />
Utilisation d’une association de vitamine A ou d’au moins un de ses esters<br />
dermatologiquement acceptables et d’une β-cyclodextrine diméthylée, les<br />
composants de ladite association étant tels que définis dans l’une des revendications<br />
1 à 4, pour la fabrication d’une composition dermatologique à activité cicatrisante ou<br />
pour le traitement des peaux à tendance acnéique.
Chapitre 1<br />
3.2.4 Article n° 2<br />
94<br />
New aqueous gel based on soluble cyclodextrin/vitamin A inclusion complex<br />
S. Weisse, B. Perly, J-P. Dalbiez, F. Ouvrard-Baraton<br />
J-C. Archambault, P. André, P. Rollin, F. Djedaïni-Pilard .<br />
Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry<br />
Special Issue 11 th International Symposium on Cyclodextrins (sous presse)
Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry<br />
Special issue<br />
New aqueous gel based on soluble cyclodextrin/vitamin A inclusion complex<br />
Key Words : Rameb-CD, vitamin A propionate, skin absorption.<br />
Corresponding author :<br />
WEISSE Sandrine<br />
Bat 125 SCM/DRECAM<br />
<strong>CEA</strong> SACLAY<br />
91191 Gif sur Yvette<br />
France<br />
tel 00 (0)1 69 08 32 70<br />
95<br />
fax 00 (0)1 69 08 98 06<br />
mail : weisse@scm.saclay.cea.fr<br />
New aqueous gel based on soluble cyclodextrin/vitamin A inclusion<br />
complex<br />
S. Weisse *1 , B. Perly 1 , J-P. Dalbiez 1 , F. Ouvrard-Baraton 3 ,<br />
J-C. Archambault 3 , P. André 3 , P. Rollin 4 , F. Djedaïni-Pilard 2 .<br />
* corresponding author : weisse @scm.saclay.cea.fr tel 00 33 (0)1 69 08 32 70 fax - 98 06
1 Service de Chimie Moléculaire, Bat 125, <strong>CEA</strong> Saclay, F-91191<br />
Gif sur Yvette Cedex, France<br />
2 University of Picardie Jules Verne, Laboratoire des Glucides,<br />
33 rue S t Leu, F-80039 Amiens, France<br />
3 LVMH – Laboratoire de recherche et développement – Branche Parfums et Cosmétiques,<br />
45800 St jean de Braye, France<br />
4 ICOA – University of Orléans, 45065 Orléans, France<br />
ABSTRACT: Rameb (randomized dimethyl β-cyclodextrin ) was mixed up with vitamin A<br />
propionate (PVA) (molar ratio 10/1 in water) and a water soluble complex was formed and<br />
studied by HPLC and NMR (structure, concentration and stability of PVA). Then solution<br />
was used to form an aqueous gel. The skin absorption of PVA through stratum corneum,<br />
epidermis and dermis of human skin (on modified Franz cells) was assayed by HPLC and was<br />
compared to that of a reference gel (or oil) without cyclodextrin. The solution obtained<br />
contain a maximum of 10mg/mL PVA (if saturated with Rameb) and the PVA can remain<br />
stable up to 90 days in solution, and up to 1 year if freeze-dried (storage at 4°C, in the dark).<br />
The results of the different experiences of skin distribution were statistically analyzed and<br />
show that when complexed with Rameb, the amount of PVA that penetrate each skin layers<br />
is significantly higher compared to pure PVA. The results also show that PVA can not pass<br />
through the dermis and reach the circulation.<br />
KEY WORDS: Rameb, cyclodextrin, vitamin A propionate, skin absorption.<br />
INTRODUCTION<br />
Retinol (vitamin A) has important functions related to vision, reproduction, growth and<br />
epithelium proliferation [1] and therefore represents a high interest for pharmaceutical and<br />
cosmetic industries, but it is not water soluble and very unstable in the presence of light and<br />
oxygen, which limit its use.<br />
We propose here to use cyclodextrins and in this case randomized heptakis-(2,6-di-O-methyl)<br />
cyclomaltoheptaose (Rameb) to improve the stability, the aqueous solubility and the dermal<br />
bioavailability of an ester of vitamin A and form an aqueous gel containing vitamin A<br />
propionate (PVA) to be tested on human skin.<br />
EXPERIMENTAL<br />
Materials<br />
96
Vitamin A propionate A or PVA (2.5 Mio I.E/g) was obtained from BASF (Germany) and<br />
randomized heptakis-(2,6-di-O-methyl)cyclomaltoheptaose (Rameb) from WACKER<br />
(Germany). It is randomized dimethyl-β-cyclodextrin, but for the NMR experiments we used<br />
highly purified homogeneous randomized heptakis-(2,6-di-O-methyl)cyclomaltoheptaose [2]<br />
in order to visualize precisely the different protons of the CD. All chemicals were purchased<br />
from Fluka and used without further treatments. Deuterated solvents were purchased from<br />
Euriso-Top (Saclay-France).<br />
Preparation of inclusion complexes<br />
The CD/drug mixtures were prepared by mixing accurately weighted quantities in water. The<br />
mixtures were stirred during a few hours then centrifugated for 10 min. at 6000 rpm. The<br />
aqueous solutions were filtered on Millex-SG 0.22 µm then freeze-dried before redissolution<br />
of 10 mg in 0.4 mL D2O for NMR study. The precipitates, if present, were washed many times<br />
by centrifugation with water and ether to eliminate the free species, then dried slowly under a<br />
stream of nitrogen and freeze-dried before redissolution of 10 mg in 0.4 mL d6-dmso.<br />
NMR Studies<br />
1 H-NMR experiments were performed at 500.13 MHz using a Bruker DRX500 spectrometer<br />
using the pulse programs available from the Bruker library. All measurements were performed<br />
at 25°C under careful temperature regulation (+/- 0.1K). Chemical shifts are given relative to<br />
external tetramethylsilane (TMS=0 ppm) and calibration was performed using the signal of<br />
the residual protons of the solvent as a secondary reference. All NMR data were processed<br />
and plotted using the UXNMR program and an INDY work station (Silicon graphics). Scalar<br />
correlation (COSY, Relay experiments) were processed in the absolute value mode after zero-<br />
filling resulting in a 1K×1K data matrix. For dipolar correlation (ROESY experiment), the<br />
phase sensitive (TPPI) sequence was used and processing resulted in a 1K × 1K matrix.<br />
HPLC<br />
97
For the stability study of the Rameb/PVA solution, analytical HPLC was carried out with a<br />
Waters Delta Prep 3000 chromatograph equipped with an LSED detector and a Nova-Pack ®<br />
C18 WATERS column, by elution of methanol (Chromasolv ® filtered on Millicup PTFE<br />
0,5μm ) at 1mL/mn. An UV detector was used (WATERS Lambda Max at 340 nm) in the<br />
case where the interesting peaks were covered by those of the CD with LSED (since CD is not<br />
detectable by UV). For the assays following the skin absorption experiments, we used a<br />
BECKMAN system Gold chromatograph with a Merck Lichrosher 125-4 RP18 (5 µM)<br />
column and a Beckman led array detector, mobile phase was acetonitrile/water 90/10 v/v at<br />
1mL/mn -1 .<br />
Mass Spectrometry<br />
The integrity of molecular structure was confirmed by Mass Spectrometry (MS) using<br />
electrospray infusion mode performed in positive mode on a Q-TOF Spectrometer(Micromass<br />
UK).<br />
Preparation of aqueous gels<br />
We prepared an aqueous solution of the complex, with initial concentrations of PVA and<br />
Rameb being respectively 40 mM and 400 mM, then 1.8% w/w Natrosol ®<br />
(hydroxyethylcellulose, Hercules. Inc. USA) was added to form the gel. A reference aqueous<br />
gel without CD was prepared with water, Natrosol ® (1.8 % w/w) , PVA and polysorbate 60<br />
(2.5% w/w). The final concentration of PVA and Rameb in both gels was determined<br />
precisely for each experiment (Table I). In one case (S5) we used as reference an oil (carnation<br />
oil, Witco-Rewo) containing 0.75% PVA. In one case (S7) we used all the skin layers<br />
including the dermis, to check if the CD or the PVA can pass in the blood.<br />
%PVA w/w<br />
% Rameb w/w<br />
Rameb/PVA gel<br />
% PVA w/w<br />
% Rameb w/w<br />
reference<br />
S2 S4 S5 S7 S8<br />
0.72 0.76 0.96 0.86 0.45<br />
47.3<br />
0.72<br />
no<br />
aqueous gel<br />
50<br />
0.72<br />
no<br />
aqueous gel<br />
53.3<br />
0.75<br />
no<br />
oil<br />
48<br />
0.81<br />
no<br />
aqueous gel<br />
Table I: composition of the batches for each skin penetration experiment<br />
Skin penetration study<br />
98<br />
25<br />
0.45<br />
30<br />
aqueous gel
This study was performed on fresh human skin pieces. It is well known that the main barrier<br />
function of the skin is played by the upper epidermis called stratum corneum (or horny layer<br />
made of layers of dead keratinocytes surrounded by lipidic sheets) and, on a smaller scale, by<br />
the epidermis (alternate lipophilic and hydrophilic layers). Therefore we chose to remove the<br />
hypodermis (fat) and dermis because those thick layers would stored the PVA and prevent us<br />
from having detectable amount in the receptor liquid. The purpose of this study must<br />
determine the amount of vitamin A propionate which penetrate into the different layers of the<br />
skin, from our CD made aqueous gel and a reference gel or oil. We used a device containing<br />
15 Franz-type cells (surface 2 cm 2 , receptor liquid volume 4.2mL) in a 37°C thermostatic<br />
bath. For each experiment a different skin batch was used. The receptor liquid contains<br />
phosphate buffer 10 mM, NaCl 120 mM, KCL 2.7 mM, pH 7.4 (Sigma) sodium azide 0.1%<br />
w/w, ethanol (20% v/v) and a surfactant (polyoxyethylene polyoxypropylene butyl ether,<br />
polyethylated hydrogenated castor oil, purified water : Wackherr colorants) 4% v/v. On each<br />
cell, exactly 1g of gel was deposited (always 8 cells for the Rameb/PVA gel and 7 cells for the<br />
reference) and covered with Parafilm ® . After 24 hours, the cells were dismantled, the excess<br />
gel on the surface was removed and the skins were treated as follows: the stratum corneum<br />
was collected by the stripping method (7 strippings, pression 300 g/cm 2 , time 12 sec.,<br />
D’Squam ® , Eviderm corporation, Dallas) and the PVA extracted by solubilization in 2 mL<br />
methanol and after 2 hours stirring, filtered (0.22µm) then assayed by HPLC. For the<br />
epidermis, the PVA was extracted by solubilization in 2 mL methanol and after 2 hours<br />
stirring, filtered ( 0.22 µm) then assayed by HPLC. The receptor liquid was assayed directly<br />
by HPLC. The gels were submitted to the following treatments before PVA assays: 250 µL<br />
were sampled and sonicated in 25 mL isopropanol to release PVA from the cellulose matrix,<br />
then filtered on 0.22µm filter. A sample of each gel was kept to be assayed in time and<br />
determine long term stability of PVA in the gels. The percentage of initial amount of PVA<br />
that has penetrated is calculated from the concentration found in each layer. The results of the<br />
PVA assays were statistically analyzed using the StatAdvisor Software. This procedure uses a<br />
multifactor analysis of variance. The F-Test in the Anova table allows to identify the<br />
significant factors and for each one, the Multiple Range Test determine which means are<br />
significantly different from which other and which Confidence Interval must be applied to this<br />
conclusion.<br />
RESULTS AND DISCUSSION<br />
99
Determination of the inclusion phenomena by NMR study<br />
The solution obtained after 24h mixing is clear, yellow and no precipitate can be seen. After<br />
centrifugation there is no change. Therefore two assumptions can be proposed : there is no<br />
inclusion complex, or there is a water soluble inclusion complex. The 1 H-NMR study of the<br />
aqueous phase in D2O (after filtration and freeze-drying) shows that vitamin A propionate,<br />
like Rameb is present in the aqueous phase. When comparing this spectrum with that of<br />
Rameb alone, registered in the same conditions, we noticed that the inner protons of the CD<br />
(H3 and H5) experience a chemical shift (0.04 ppm) which is significant of the inclusion<br />
phenomenon [3] (data not shown).<br />
100<br />
The Rameb/PVA complex being water soluble, it is possible to perform a bidimensional<br />
NMR experiment (T-Roesy) to identify the protons of the vitamin A propionate molecule<br />
which are implicated in the inclusion phenomenon i.e those who show cross-peaks with the<br />
inner protons of the CD. Indeed, the cross-peaks indicate a spatial proximity (
Figure I: T-Roesy (spin lock 300ms, attenuation 22dB) of the Rameb/PVA complex in D2O at<br />
500 MHz (20mM)<br />
We also noticed that the 1 H-NMR spectrum of vitamin A propionate in the complex (in D2O)<br />
is different from that of vitamin A propionate alone (in d6-dmso). The different solvents and<br />
the interactions with the CD explain those differences (chemical shift, shape) at some point<br />
but not entirely. First of all, it is necessary to check that vitamin A propionate does not<br />
experience any major chemical modification due to its inclusion in the CD. In order to do so<br />
we performed a HPLC analysis : the chromatogram confirmed the chemical integrity of the<br />
molecule in the complex.<br />
Then, the following assumption can be made: the complexation process follow the equation :<br />
[Rameb] + [PVA] ↔ [C] with binding constant K = [C]/([PVA] [Rameb] n ) -1<br />
where [Rameb] et [PVA] represent the concentrations of the free forms and [C] the<br />
concentration of the complex. In solution there is always a part of free vitamin A propionate,<br />
the amount of which depends on the initial concentrations of [PVA]t and [Rameb]t. And this<br />
free vitamin A propionate is not protected by the cavity of the CD and therefore experiences a<br />
quick degradation process in aqueous solution, which might explain the differences on the 1 H-<br />
NMR spectrum. So it is important to determine the optimized conditions for the preparation<br />
of the complex i.e the [Rameb]t/[PVA]t ratio where the amount of free [PVA] is as small as<br />
possible. As the result, information is provided about batches studied previously and whether<br />
or not they contain a certain amount of free PVA that would be unstable and would explain<br />
the difference between the NMR spectra of free PVA and complexed PVA. Therefore, the<br />
influence of the concentration of Rameb on the final concentration of complex was studied.<br />
Determination of the influence of the concentration of Rameb<br />
When K is known or can be estimated, it is possible, for any mixing with known initial<br />
concentrations, to determine [C], and then the free amount of [PVA] and [Rameb] in solution<br />
by resolving the following:<br />
K = [C]/([PVA] [Rameb] n ) -1 with [PVA] = [PVA]t - [C] and [Rameb] = [Rameb]t - [C]<br />
The solution is written : [C] = (D - (D 2 - 4.K 2 .[PVA]t.[Rameb]t) 0,5 ).2K -1<br />
with D = K.[PVA]t + K.[Rameb]t + 1<br />
Based on previous studies concerning water soluble complexes poorly stable in solution, it is<br />
possible to estimate that: 500
For [Rameb]t = [PVA]t = 20 mM and K = 500, we have in solution 27% free vitamin A<br />
propionate, which then experienced oxidation in the aqueous middle and as a consequence<br />
signs of degradation appear on the 1 H-NMR spectrum. On the other side when [Rameb]t > 10<br />
[PVA]t, only less than 1% free Vitamin A propionate are found, whatever value we use for K.<br />
The complexes which correspond to the following concentrations have been prepared and<br />
studied by HPLC and 1 H-NMR: [PVA]t = 0.02M and [Rameb]t = 0.02M, 0.05M, 0.1M, 0.2M,<br />
0.3M, 0.4M. The results (data not shown) clearly show that for [Rameb]t = [PVA]t = 20mM<br />
the complex is highly degraded whereas it is not for [Rameb]t = 10 [PVA]t : we can conclude<br />
that the whole vitamin A propionate is, at any given time, protected in the inclusion complex.<br />
In those conditions, using a solution saturated with Rameb, the maximal solubility reached for<br />
PVA is 10mg/mL.<br />
Determination of the stoichiometry<br />
The determination of the stoichiometry in the case of a water soluble complex can be done<br />
using the method of Job [6] which is based on the measurement of the chemical shifts of the<br />
protons of the CD and those of the guest molecule for a ratio r = [Rameb]/([Rameb]+[PVA])<br />
going from 0 to 1. In our case, this method cannot be used because it is necessary to maintain<br />
r close to 1 to obtain a stable complex. Hence, two other methods were used : Mass<br />
Spectrometry and the Higuchi and Connors method [7].<br />
Mass Spectrometry was carried out in Electrospray mode (ESI-MS), because it is the most<br />
accurate technique for non covalent associations. This technique detects complexes according<br />
to their molecular weight which allows the stoichiometry to be found simultaneously. The<br />
sample we used for this analysis is the same as the one used for the 1 H-NMR in D20. The 1/1<br />
stoichiomietry of the complex is clearly established by the presence of peaks m/z = 1665 for<br />
[Rameb + PVA + Na] + and m/z = 845 for [Rameb + PVA + 2Na] 2 (data not shown). The<br />
Higuchi and Connors method uses solubility phase diagrams and in this case we can see that<br />
the concentration of solubilized vitamin A propionate grow almost with a linear way (water<br />
soluble complex) with a slope close to 1 (0.98 for the last three points) which indicates a 1/1<br />
stoichiometry. This results are in accordance with those obtained by Mass Spectrometry and<br />
with the geometry of the complex described by the T-Roesy experiment.<br />
We have established in a previous paper [9] that βCD form a 2/1 (βCD/PVA) complex with<br />
PVA.<br />
102
The result obtained for the Rameb/PVA complex can be justified by the larger cavity of the<br />
Rameb, due to its methyl groups on each face, which allow a bigger part of the vitamin A<br />
propionate to be included. Furthermore, it has been showed that in a 2/1 inclusion complex<br />
with βCD, the dimer were most of the time stabilized by hydrogen bonds between the<br />
secondary hydroxyls, which is no longer possible with Rameb.<br />
Stability Study<br />
We have previously demonstrated that the mass action law requires the presence of 10<br />
equivalents of Rameb as initial concentration to obtain a stable complex. Once this is<br />
established, all complexes were prepared according to this law and the influence of the<br />
environment (light, heat, oxygen) was studied on several batches by HPLC and 1 H-NMR.<br />
The results show that in aqueous solution the vitamin A propionate remains stable for 60 days<br />
if protected from light and at 4°C, but only 15 days if kept at 25°C under natural light. We<br />
also studied the complex in its freeze-dried form : the vitamin A propionate can remain stable<br />
6 months even without any protection (kept at 25°C under natural light) and more than a year<br />
when protected from light, at 4°C (Figure II). As post freeze-drying solubilization is very easy,<br />
this results can provide a new way for vitamin A propionate storage. It should be noted that<br />
the vitamin A propionate alone is stable less than 10 days at 25°C under natural light.<br />
The results of PVA assays in the different gels show a loss of 10 to 20% in 2 months and over<br />
80% in six months in the Rameb/PVA gel. The homogeneity of the gel stays unchanged. In<br />
the reference gel, there is a phase separation and complete degradation of the PVA in less than<br />
15 days.<br />
Rameb/pva D2O 298k<br />
To<br />
103<br />
pva<br />
6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 ppm<br />
T+7 months<br />
Figure II: 1 H-NMR spectra (500MHz, 298K, D2O) of the Rameb/PVA complex (20mM) in<br />
solution at T0 and after 7 months (freeze-dried form stored at 4°C in the dark).<br />
6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 ppm
Skin penetration study<br />
The results of PVA assays for each experiment are presented in Table II .<br />
It must be emphasized here that the different experiments can not be compared directly since<br />
each concerns a different skin batch and the diversity of human skin precludes comparison.<br />
So, the later can only be made within the results of one experiment.<br />
Experiment Stratum Corneum Epidermis Receptor Liquid<br />
S2 Reference mean<br />
0.378 0.139<br />
0<br />
S2 Rameb/PVA<br />
S4 Reference<br />
S4 Rameb/PVA<br />
S5 Reference<br />
S5 Rameb/PVA<br />
S7 Reference<br />
S7 Rameb/PVA<br />
standard deviation<br />
mean<br />
standard deviation<br />
mean<br />
standard deviation<br />
mean<br />
standard deviation<br />
mean<br />
standard deviation<br />
mean<br />
standard deviation<br />
mean<br />
standard deviation<br />
mean<br />
standard deviation<br />
0.086<br />
0.612<br />
0.427<br />
0.618<br />
0.41<br />
0.864<br />
0.317<br />
0.034<br />
0.037<br />
0.36<br />
0.224<br />
0.174<br />
0.189<br />
0.221<br />
0.118<br />
0.154<br />
0.516<br />
0.374<br />
0.051<br />
0.025<br />
0.145<br />
0.181<br />
0.113<br />
0.151<br />
0.132<br />
0.235<br />
0.112<br />
0.052<br />
0.062<br />
0.044<br />
0<br />
0.003<br />
0.004<br />
0.017<br />
0.032<br />
0.066<br />
0.08<br />
0.003<br />
0.009<br />
0.019<br />
0.022<br />
0<br />
Table II: Amount of PVA found in the stratum corneum, the epidermis and the receptor phase<br />
(as % of initial amount of PVA and using 8 values for the Rameb/PVA gel and 7 values for<br />
the reference gel for each experiment)<br />
104<br />
Some fairly outstanding observations can be made from those results. A statistical<br />
multifactors analysis of variance was performed on each experiments (all cells) and shows<br />
0<br />
0<br />
0
that in each case, except the S7 experiment, the amount of vitamin A propionate that<br />
penetrates in the skin (all layers considered) is significantly higher when the molecule is<br />
included in the Rameb/PVA complex (Confidence Interval 95%). If the different<br />
compartments are analyzed individually the 95% Confidence Interval cannot always be<br />
maintained and sometimes drops to 86 % (for significant difference between the reference and<br />
the Rameb/PVA gel) as the number of data is smaller and therefore the Confidence Interval is<br />
higher. However, there is no doubt concerning the effects on inclusion in the Rameb : it leads<br />
to higher skin penetration.<br />
In the case of the S7 experiment, no meaningful difference was noticed between the reference<br />
gel and the Rameb/PVA gel in term of quantitative penetration of vitamin A propionate. The<br />
reason is we kept the dermis but could not find a way to extract the PVA from this very thick<br />
layer. Therefore the dermis was not assayed and the only conclusion that can be drawn is that<br />
the PVA do not penetrate farther than dermis, since no PVA was recovered in the receptor<br />
liquid. Most of the PVA is probably stuck in the dermis where, like in epidermis, it is<br />
converted in active retinoids i.e the form that will bind with the cellular receptor [8]. The<br />
important point of this experiment is that PVA cannot reach the circulation after topical<br />
application of the gel.<br />
CONCLUSION<br />
A very stable and soluble complex can be formed between Rameb-CD and the vitamin A<br />
propionate. An aqueous gel based on this solution significantly improves the amount of<br />
vitamin A that penetrates the different layers of human skin and it was proven not to reach the<br />
circulation.<br />
References<br />
105<br />
[1] M. H. Zile and M. E. Cullum: Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 172, 139 (1983).<br />
[2] C.M. Spencer, J.F. Stoddart, R. Zarzycki: J Chem. Soc. Perkin Trans II, 1323-1330 (1987).
[3] F. Djedaïni-Pilard and B. Perly: New trends in cyclodextrins and derivatives, Ed. D.<br />
Duchêne, <strong>Paris</strong> (1991) p.215<br />
[4] Q-X. Guo, T. Ren, Y-P. Fang, Y-C. Liu: J. Incl. Phenom. Mol. Recognit. Chem 22, 251<br />
(1995).<br />
[5] K.A Connors: Chem. Rev. 97, 1325-1357 (1997).<br />
[6] P. Job: Ann. Chim. 9, 113 (1928).<br />
106<br />
[7] T. Higuchi, K.A. Connors: Adv. Anal. Chem. Instr. 4, 117-211 (1965).<br />
[8] G.J. Fisher and J.J. Voorhees: The FASEB J. 10,1004 (1996)<br />
[9] S. Weisse, B.Perly, J-P. Dalbiez, F. Djedaïni-Pilard: J. Incl. Phenom. Macrocycl. Chem.
Chapitre 1<br />
3.2.5 Article n° 3<br />
107<br />
Comparative assay of Rameb-CD and vitamin A propionate in skin layers following<br />
topical application of the Rameb/PVA inclusion complex<br />
S. Weisse, F. Djedaïni-Pilard, F. Ouvrard-Baraton, B. Perly and C. Créminon<br />
STP Pharma (soumis)
Comparative assay of Rameb-CD and vitamin A propionate in skin layers following<br />
topical application of the inclusion complex<br />
S. Weisse 1 , F. Djedaïni-Pilard 2 , F. Ouvrard-Baraton 3 , B. Perly 1 and C. Créminon 4<br />
1 Service de Chimie Moléculaire, DSM/DRECAM, <strong>CEA</strong> Saclay, F-91191<br />
Gif sur Yvette Cedex, France<br />
2 <strong>Université</strong> de Picardie Jules Verne, Laboratoire des Glucides, EA 2082<br />
33 rue S t Leu, F-80039 Amiens, France<br />
3 LVMH – Laboratoire de recherche et développement – Branche Parfums et<br />
Cosmétiques, 45800 St Jean de Braye, France<br />
4 Service de Pharmacologie et d’Immunologie, DSV/DRM, <strong>CEA</strong> Saclay, F-91191<br />
Gif sur Yvette Cedex, France<br />
INTRODUCTION<br />
Retinol or vitamin A is a molecule of vital importance for the human body since it is<br />
required in many physiological functions [1-3]. Vitamin A plays a key role in cellular<br />
differentiation and therefore influences many processes like reproduction (for the growth of<br />
the embryo as well as the development of placenta and sexual cells), immunity (for the<br />
differentiation of white cells) and also epitheliums development. Vitamin A is also required to<br />
form retinal pigments which are essential to night vision. Its role in cellular differentiation<br />
also gives vitamin A a great importance in oncology [4-5] as it has been shown that it can be<br />
used to inhibit carcinogenesis, and in dermatology (against acne, photo-aging, psoriasis,<br />
melanoma…).<br />
108<br />
As such, this molecule represents a high interest for pharmaceutical and cosmetic<br />
industries, but there are drawbacks : it is not water soluble and very unstable in the presence<br />
of light and oxygen, which limit its use. We described in previous papers [6-7] the use of<br />
randomized heptakis-(2,6-di-O-methyl)cyclomaltoheptaose (also named per-(2,6-O-dimethyl)-<br />
β-cyclodextrin or Rameb) to form a water soluble 1/1 complex with vitamin A propionate<br />
(vitamin A alcohol or retinol is to unstable to be used here) and therefore improve the<br />
stability, the aqueous solubility and the dermal bioavailability of this ester of vitamin A.<br />
We report here on further experiments and especially on the Rameb enzyme<br />
immunoassay used to investigate the penetration of this CD in the different layers of the skin<br />
using the same biological samples as for the HPLC assay of the ester of vitamin A. This
comparative assay of both vitamin A and Rameb will hopefully bring new data for a better<br />
understanding the behaviour of this type of complex following cutaneous application.<br />
EXPERIMENTAL<br />
Material<br />
Vitamin A propionate A or PVA (2.5 Mio I.E/g) was obtained from BASF (Germany)<br />
and randomized heptakis-(2,6-di-O-methyl)cyclomaltoheptaose (Rameb) from WACKER<br />
(Germany). All chemicals were purchased from Fluka and used without further treatments.<br />
Purification of acetylcholinesterase (AchE), for the enzyme immunoassay, from electric<br />
organs of the electric eel Electrotrophorus electricus, preparation of the G4 form used, and<br />
measurements of its activity were performed as previously described [8-9]. Solid-phase EIA<br />
was performed on 96-well microtiter plates (Immunoplate Maxisorp, Nunc, Denmark) using<br />
automatic Titertek microtitration equipment (washer, dispenser, and reader) from Labsystems<br />
(Les Ulis, France). All reagents used for immunoassays were diluted in the following buffer<br />
(EIA buffer): 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.4) containing 0.9% NaCl, 1 mM<br />
EDTA, 0.1% bovine serum albumine (BSA) and 0.01% sodium azide. A 10mM phosphate<br />
buffer containing 0.05% Tween 20 was used for all washing steps.<br />
Fig 1. Vitamin A propionate<br />
109<br />
OCOC 2 H 5
3<br />
O H<br />
7<br />
Fig 2. heptakis-(2,6-di-O-methyl)cyclomaltoheptaose (Rameb)<br />
Preparation of inclusion complexes<br />
The CD/drug mixtures were prepared by mixing accurately weighted quantities in<br />
water. As already described [6], the mixtures were stirred during a few hours then<br />
centrifugated for 10 min. at 6000 rpm. The aqueous solutions were filtered on Millex-SG 0.22<br />
µm. The initial ratio of [CD] to [PVA] in the solution (before filtration) is always equal to 10<br />
to ensure good long term stability of the complex,<br />
Preparation of aqueous gels<br />
We prepared an aqueous solution of the complex, with initial concentrations being 40<br />
mM and 400 mM for PVA and Rameb respectively, then 1.8% w/w Natrosol ®<br />
(hydroxyethylcellulose, Hercules. Inc. USA) was added to form the gel. A reference aqueous<br />
gel without CD was prepared with water, Natrosol ® (1.8 % w/w) , PVA and polysorbate 60<br />
(2.5% w/w). The final concentration of PVA in both gels was determined precisely for each<br />
experiment (Table I). A total of 6 experiment are presented here under the name S2, S4, S5,<br />
S6, S7 and S8. Rameb was only assayed for 3 experiments (S5, S6, S7) due to time<br />
restriction. In one case (S5) we used an oil as reference (carnation oil, Witco-Rewo)<br />
containing 0.75% PVA. In one case (S8) we used a physical mixture of PVA and Rameb in an<br />
aqueous gel (no complex) as reference.<br />
Gel<br />
Rameb/PVA<br />
6<br />
β - C D<br />
2<br />
( O M e )<br />
7<br />
( O M e )<br />
7<br />
% PVA w/w<br />
% Rameb w/w<br />
S2 S4 S5 S6 S7 S8<br />
0.72 0.76 0.96 0.70 0.86 0.45<br />
47.3<br />
110<br />
50<br />
53.3<br />
45.45<br />
48<br />
25
eference<br />
gel (or oil)<br />
% PVA w/w<br />
% Rameb w/w<br />
form<br />
0.72<br />
no<br />
aqueous<br />
gel<br />
0.72<br />
no<br />
aqueous<br />
gel<br />
0.75<br />
no<br />
oil<br />
0<br />
46.87<br />
aqueous<br />
Table I : composition of the batches for each skin penetration experiment<br />
Skin penetration study<br />
111<br />
gel<br />
0.81<br />
no<br />
aqueous<br />
This study was performed on fresh human skin pieces. It is well known that the main<br />
barrier function of the skin is played by the upper epidermis called stratum corneum (or horny<br />
layer made of layers of dead keratinocytes surrounded by lipidic sheets) and, on a smaller<br />
scale, by the epidermis (alternate lipophilic and hydrophilic layers). Therefore, as described in<br />
the litterature [10] we chose to remove the hypodermis (fat) and dermis because those thick<br />
layers would stored the PVA and prevent us from having detectable amount in the receptor<br />
liquid. The purpose of this work is to determine the amount of vitamin A propionate and<br />
Rameb which penetrates into the different layers of the skin, from our CD made aqueous gel<br />
and a reference gel or oil. In one case (S7) we used all the skin layers including the dermis, to<br />
check whether the CD or the PVA can pass in the blood. We used a device containing 15<br />
Franz-type cells (surface 2 cm 2 , receptor liquid volume 4.2mL) in a 37°C thermostatic bath.<br />
For each experiment a different skin batch was used. The receptor liquid contains phosphate<br />
buffer 10 mM, NaCl 120 mM, KCL 2.7 mM, pH 7.4 (Sigma) sodium azide 0.1% w/w, ethanol<br />
(20% v/v) and a surfactant (polyoxyethylene polyoxypropylene butyl ether, polyethylated<br />
hydrogenated castor oil, purified water : Wackherr colorants) 4% v/v. On each cell, exactly 1g<br />
of gel was deposited (always 8 cells for the Rameb/PVA gel and 7 cells for the reference) and<br />
covered with Parafilm ® . After 24 hours, the cells were dismantled, the excess gel on the<br />
surface was removed and the skins were treated as follows: the stratum corneum was collected<br />
by the stripping method (7 strippings, pression 300 g/cm 2 , time 12 sec., D’Squam ® , Eviderm<br />
corporation, Dallas) and the PVA extracted by solubilization in 2 mL methanol and after 2<br />
hours stirring, filtered (0.22µm) then assayed by HPLC. For the epidermis, the PVA was<br />
extracted by solubilization in 2 mL methanol and after 2 hours stirring, filtered ( 0.22 µm)<br />
then assayed by HPLC. The receptor liquid was assayed directly by HPLC. The gels were<br />
submitted to the following treatments before PVA assays: 250 µL were sampled and sonicated<br />
in 25 mL isopropanol to release PVA from the cellulose matrix, then filtered on 0.22µm filter.<br />
A sample of each gel was kept to be assayed in time and determine long term stability of PVA<br />
gel<br />
0.45<br />
30<br />
aqueous<br />
gel
in the gels. The percentage of initial amount of PVA that has penetrated is calculated from the<br />
concentration found in each layer. The results of the PVA assays were statistically analyzed<br />
using the StatAdvisor Software. This procedure uses a multifactor analysis of variance. The<br />
F-Test in the Anova table allows to identify the significant factors and for each one, the<br />
Multiple Range Test determine which means are significantly different from which other and<br />
which Confidence Interval must be applied to this conclusion.<br />
HPLC<br />
For the vitamin A propionate assays following the skin absorption experiments, we<br />
used a BECKMAN system Gold chromatograph with a Merck Lichrosher 125-4 RP18 (5 µM)<br />
column and a Beckman led array detector, mobile phase was acetonitrile/water 90/10 v/v at<br />
1mL/mn -1 . Detection of PVA at 325 nm, retention time is 9 mn.<br />
Competitive enzyme immunoassays (EIA)<br />
βCD and γCD enzyme immunoassays have been previously described [11-12]. The<br />
protocol for heptakis-(2,6-di-O-methyl)cyclomaltoheptaose (Dimeb) is the same. For the<br />
production of antibodies, heptakis-(2-O-methyl)hexakis-(6-O-methyl)6-mono-amino-6-deoxy-<br />
cyclomaltoheptaose (Dimeb mono-amine, see [13]) was covalently linked to bovine serum<br />
albumine (BSA) using a glutaraldehyde as linker, as previously described [11].<br />
For the preparation of the enzymatic tracer, heptakis-(2-O-methyl)hexakis-(6-O-<br />
methyl)6-mono-amino-6-deoxycyclomaltoheptaose was covalently coupled to AchE using the<br />
heterobifunctional reagent N-succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-<br />
carboxylate (SMCC) as previously described [11]. This method involved the reaction of the<br />
thiol groups previously introduced into heptakis-(2-O-methyl)hexakis-(6-O-methyl)6-mono-<br />
amino-6deoxy cyclomaltoheptaose (by reaction of its primary amino group with N-<br />
succinimidyl-S-acetylthioacetate (SATA) in alkaline medium) with maleimido groups<br />
incorporated into the enzyme.<br />
112<br />
Competitive EIA was performed as described elsewhere for various molecules [14-15].<br />
Microtiter plates were coated with mouse monoclonal anti-rabbit IgG antibodies in order to<br />
ensure separation of bound and free moieties of the enzymatic tracer during the<br />
immunological reaction. Before use, the plates were washed with 0.01 M phosphate buffer<br />
(pH 7.4) containing 0.05% Tween 20. The total volume of immunological reaction was<br />
150µL, each component (enzymatic tracer, diluted rabbit polyclonal antisera and CD<br />
standards) being added in a 50 µL volume diluted in EIA buffer. Dimeb mono-amine-AchE
enzyme conjugates was used at a concentration of 1 Ellman units/mL (for Ellman unit<br />
definition see [12]). The working dilution for the rabbit antiserum was determined by<br />
performing serial dilution experiments. After 18h incubation at 4°C, the plates were washed<br />
and the enzyme activity of the bound immunological complex was revealed by addition of<br />
200µL/well of Ellman reagent. After 2h of gentle shaking in the dark at room temperature, the<br />
absorbance at 414 nm in each plate was measured automatically. Results are given in terms of<br />
(B/B0)*100 as a function of the dose (logarithmic scale), B and B0 representing the bound<br />
enzyme activity in the presence or absence of competitor, respectively. A linear log-logit<br />
transformation was used to fit the standard curve [16]. All experiments were done in duplicate<br />
and quadruplicate for B0. The limit of detection for the Rameb was established at 0.1ng/mL.<br />
The EIA was performed on the same biological samples as used for PVA assays so that<br />
comparison of the results would be possible.<br />
RESULTS AND DISCUSSION<br />
As preliminary study, we performed a skin penetration study comparing the<br />
penetration of PVA in different aqueous gels : one containing the Rameb/PVA complex,<br />
another containing the γCD/PVA complex (not soluble in water see [17]) and one with the<br />
PVA alone. The results (Fig. 3) indicate that the concentration of PVA in the skin layers<br />
increases in the order Rameb/PVA >PVA alone > γCD/PVA. It indicates that the inclusion in<br />
the Rameb enhances the penetration of PVA in the skin but that the γCD decrease this<br />
phenomenon. These preliminary results, lead us to focus the skin penetration study on the<br />
Rameb/PVA complex, since the assays on guest and host could be performed by HPLC and<br />
immunoassays respectively.<br />
113<br />
Fig 3 . Amount of PVA found in the stratum corneum, the epidermis and the receptor<br />
liquid (as % of initial amount of PVA and using 5 values for the Rameb/PVA gel, 5 values for<br />
the γCD/PVA gel and 5 values for the reference gel without CD)
% of PVA<br />
1,200%<br />
1,000%<br />
0,800%<br />
0,600%<br />
0,400%<br />
0,200%<br />
0,000%<br />
Before presenting the results, one point must be clarified. Heptakis-(2,6-di-O-methyl)<br />
cyclomaltoheptaose or Dimeb is a very pure compound whereas the randomized form, Rameb,<br />
is a mixture of several compounds exhibiting different degrees of methylation (between 11<br />
and 16) as demonstrated by Mass spectrometry studies [18, 19]. (Fig 4)<br />
Electrospray ionisation of RAMEB (infusion at 5 μl.min -1 of a 0.01 mg.ml -1 solution in<br />
water/acetonitrile 50:50 containing 0.1 % trifluoroacetic acid) with positive ion detection<br />
leads to a series of protonated molecules, [M+H] + , at m/z values depending on the number of<br />
methyl groups in each of the individual sugar unit of the β-cyclodextrin. The mass spectra<br />
reflect the average distribution of the methyl groups in all of the individual sugar unit of the<br />
RAMEB molecule and consequently if the components having 9 (m/z 1261) to 14 (m/z 1331)<br />
methoxy groups (0-Me) are included in the calculation (the relative intensities of components<br />
outside this group are too low to be reliable) the degree of substitution per sugar unit (DS) can<br />
be calculated [18, 19].<br />
114<br />
DISTRIBUTION OF PVA AFTER 24H CONTACT<br />
reference Rameb Gamma<br />
strat.corneum<br />
epidermis<br />
receptor liquid<br />
total skin
100 %<br />
95<br />
90<br />
85<br />
80<br />
75<br />
70<br />
65<br />
60<br />
55<br />
50<br />
45<br />
40<br />
35<br />
30<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0<br />
1247<br />
11 O-Me<br />
1261<br />
1276<br />
1283<br />
1289<br />
1297<br />
115<br />
1220 1240 1260 1280 1300 1320 1340 1360 m/z<br />
1303<br />
12 0-Me<br />
1311<br />
1317<br />
13 0-Me<br />
Fig 4 . Electrospray (ESI) ionisation mass spectra of RAMEB<br />
1331<br />
1345<br />
([M+H] + ions region)<br />
It has already been proven during the settings of the first CD immunoassays that no<br />
cross reaction occured between the different CD [11]. The specific immunoassay we used<br />
here was developed for Dimeb, using heptakis-(2-O-methyl)hexakis-(6-O-methyl)6-mono-<br />
amino-6deoxy cyclomaltoheptaose to create the hapten. Therefore, we had to check the<br />
hability of the antiDimeb-antibodies to recognize Rameb as well. We used series of known<br />
concentrations of Rameb and Dimeb and compared the results and sensibility of the assay. Fig<br />
5 shows the calibration curves obtained for Rameb and Dimeb It appeared the antiDimeb-<br />
antibodies also recognized Rameb. However, the 100*B/B0= f(C) curve indicated that the<br />
assay is 10 times less sensitive with Rameb than with Dimeb (B/B0 50%, which represents the<br />
zone where the assay gives maximum precision is 1.5ng/mL for Rameb and 0.15ng/mL for
Dimeb). The limit of detection was established at 0.1ng/mL for Rameb. The cause of this loss<br />
of sensibility is the heterogeneous composition of Rameb, which only contains a small<br />
amount of pure Dimeb, mixed up with many other under or over methylated species. Those<br />
methylated species are not recognized by the antiDimeb-antibodies with the same sensibility<br />
as Dimeb and therefore, the sensibility towards Rameb is the mean of all the sensibility<br />
towards those different methylated species.<br />
B/B0 (%)<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
0.01 0.1 1 10 100<br />
Fig 5 . Calibration curve for Rameb and Dimeb (2-Me-β-CD) – B/B0 = 50% indicates<br />
Skin penetration study<br />
the zone of maximum precision<br />
The results of PVA assays performed by HPLC for each experiment are presented in<br />
Table II. They are expressed as percentage recovered from the initial amount of PVA<br />
deposited on the cell (since we know the exact amount of PVA in each gel).<br />
It must be emphasized here that the different experiments can not be compared directly<br />
since each concerns a different skin batch and the diversity of human skin precludes<br />
comparison. So, the later can only be made within the results of one experiment. We will first<br />
discuss the results of the PVA assays.<br />
116<br />
100 RAM EB<br />
Competitor (ng/ml)<br />
2-M e -β -CD<br />
Some fairly outstanding observations can be made from those results. A statistical<br />
multifactors analysis of variance was performed on each experiments (all cells) and shows
that in each case, except the S7 experiment, the amount of vitamin A propionate that<br />
penetrates in the skin (all layers considered) is significantly higher when the molecule is<br />
included in the Rameb/PVA complex (Confidence Interval 95%). If the different<br />
compartments are analyzed individually the 95% Confidence Interval cannot always be<br />
maintained and sometimes drops to 86 % (for significant difference between the reference and<br />
the Rameb/PVA gel) as the number of data is smaller and therefore the Confidence Interval is<br />
higher. However, there is no doubt concerning the effects on inclusion in the Rameb : it leads<br />
to higher skin penetration.<br />
Experiment Stratum Corneum Epidermis Receptor Liquid<br />
S2 Reference mean<br />
0.378 0.139<br />
0<br />
S2 Rameb/PVA<br />
S4 Reference<br />
S4 Rameb/PVA<br />
S5 Reference<br />
S5 Rameb/PVA<br />
standard deviation<br />
mean<br />
standard deviation<br />
mean<br />
standard deviation<br />
mean<br />
standard deviation<br />
mean<br />
standard deviation<br />
mean<br />
standard deviation<br />
117<br />
0.086<br />
0.612<br />
0.427<br />
0.618<br />
0.41<br />
0.864<br />
0.317<br />
0.034<br />
0.037<br />
0.36<br />
0.224<br />
0.154<br />
0.516<br />
0.374<br />
0.051<br />
0.025<br />
0.145<br />
0.181<br />
0.113<br />
0.151<br />
0.132<br />
0.235<br />
0<br />
0.003<br />
0.004<br />
0.017<br />
0.032<br />
0.066<br />
0.08<br />
0.003<br />
0.009<br />
0.019<br />
0.022
S7 Reference<br />
S7 Rameb/PVA<br />
S8 Rameb +PVA<br />
S8 Rameb/PVA<br />
mean<br />
standard deviation<br />
mean<br />
standard deviation<br />
mean<br />
standard deviation<br />
mean<br />
standard deviation<br />
0.174<br />
0.189<br />
0.221<br />
0.118<br />
0.34<br />
0.28<br />
1.01<br />
0.95<br />
0.112<br />
0.052<br />
0.062<br />
0.044<br />
0.134<br />
0.11<br />
0.36<br />
0.46<br />
0<br />
0<br />
0<br />
0<br />
0.006<br />
0.01<br />
0.034<br />
0.051<br />
Table II . percentage of initial amount of PVA recovered in each skin layer for<br />
experiments S2, S4, S5, S7, S8.<br />
118<br />
In the case of the S7 experiment - PVA alone versus Rameb/PVA on epidermis and<br />
dermis - no meaningful difference was noticed between the reference PVA gel and the<br />
Rameb/PVA gel in term of quantitative penetration of vitamin A propionate. The reason is<br />
that we kept the dermis but could not find a way to extract efficiently the PVA from this very<br />
thick layer. Therefore the dermis was not assayed and the only conclusion that can be drawn is<br />
that the PVA do not penetrate farther than dermis, since no PVA was recovered in the receptor<br />
liquid. Most of the PVA is probably stored in the dermis where, like in epidermis, it is<br />
converted in active retinoids i.e the form that will bind with the cellular receptor [20]. The<br />
important point of this experiment is that PVA doesn’t reach the circulation after topical<br />
application of the gel, at least after 24h. This doesn’t mean that PVA can not pass in the<br />
circulation since some small blood vessels are present in the dermis. But the dermis acts as a<br />
reservoir by keeping the PVA and it is very likely that the majority of the drug will be<br />
metabolized before reaching the small vessels. Furthermore, we have no indication concerning<br />
the ability of PVA to pass through the vessels membranes.<br />
In experiment S8 we compared the results of the Rameb/PVA complex with those of a<br />
physical mixture containing the same amount of Rameb and PVA, but both in the free forms.<br />
These results suggest that the total amount of PVA recovered in the stratum corneum,<br />
epidermis and receptor liquid is greater when the 2 compounds are in the form of inclusion<br />
complex. This result is important because it gives us some clue about the role of the<br />
cyclodextrin. As seen in the literature, the CD are often use, in topical application, as a<br />
penetration enhancer [21-24]. First, it was believed that this property was due to their ability<br />
to complex cholesterol and lipids and therefore disorganize biological membranes. But since a
few years, researchers have established, using pretreatment of skin with CD, that in order to<br />
have an increasing effect on the amount of drug penetrating the skin, the CD must be used as<br />
an inclusion complex with the drug. The results of experiment S8 corroborate this<br />
conclusion : the physical mixture of CD and PVA gives statistically significantly lower<br />
penetration in the skin, in comparison with the CD/PVA complex. The mechanism of<br />
penetration enhancing of the CD as been studied by Loftsson et al. [22] : the CD act as true<br />
carriers by keeping lipophilic drugs, such as PVA, in aqueous solution and then deliver them<br />
to the skin surface where they partition from the CD cavity into the skin. This can be<br />
explained by the classical model of double diffusion membrane i.e aqueous then lipophilic.<br />
So, the penetration enhancer effect of the CD comes from its ability to solubilise the drug and<br />
make it available at the surface of the skin. This explains why we did not observed such an<br />
effect in the preliminary study, with the γ-CD/PVA complex which is absolutely not soluble in<br />
water. It also would means that the penetration of the PVA probably occurs after its release<br />
from the cyclodextrin.<br />
But we can now wonder what happens to the CD?<br />
The main results of the Rameb immunoassays are presented in Table III and Fig 6.<br />
S5 Rameb/PVA mean<br />
S6 Reference<br />
S6 Rameb/PVA<br />
standard deviation<br />
mean<br />
standard deviation<br />
mean<br />
standard deviation<br />
S7 Rameb/PVA mean<br />
standard deviation<br />
119<br />
Stratum Corneum Epidermis Receptor Liquid<br />
0.262 0.349 0.053<br />
0.186<br />
0.302<br />
0.08<br />
0.236<br />
0.132<br />
0.096<br />
0.068<br />
0.758<br />
0.1<br />
0.055<br />
0.035<br />
0.02<br />
0.02<br />
0.014<br />
0.037<br />
0.061<br />
0.116<br />
0.033<br />
0.071<br />
0.001<br />
0.001<br />
Table III : Amount of Rameb found in the stratum corneum, the epidermis and the<br />
receptor liquid (as % of initial amount of PVA and using 8 values for the Rameb/PVA gel and<br />
7 values for the reference gel for each experiment). In the S6 experiment, Rameb is present<br />
both in the reference gel and the Rameb/PVA gel.
0,7<br />
0,6<br />
0,5<br />
0,4<br />
0,3<br />
0,2<br />
0,1<br />
0<br />
Fig 6 . Graphical representation of the amount of Rameb found in the stratum<br />
corneum, the epidermis and the receptor liquid (as % of initial amount of PVA and using 8<br />
values for the Rameb/PVA gel and 7 values for the reference gel for each experiment). In the<br />
S6 experiment, Rameb is present both in the reference gel and the Rameb/PVA gel.<br />
These results shows us that, like vitamin A propionate, a significant amount of Rameb<br />
penetrates in every skin layers and reach the receptor liquid (S5, S6, S7). However, in the S7<br />
experiment, the amount of Rameb recovered is obviously much lower than in the two other<br />
experiments and even though a real comparison cannot be made between the batches because<br />
of human variability, it is clear that the presence of the dermis (S7) induced a loss in all<br />
compartments. Since it was not possible to extract correctly the CD from the dermis, this layer<br />
was not assayed but from the results of the other compartments, we can suppose that the<br />
majority of the CD is stored in the dermis. This experiment also teaches us that a very small<br />
amount of Rameb can diffuse in the dermis and reach the blood within 24h, as shown by the<br />
presence of Rameb in the receptor liquid. This is in accordance with previous published<br />
results [25] indicating that Dimeb is capable of transdermal absorption in small quantities, and<br />
rapidly excreted by urine.<br />
120<br />
Distribution of RAMEB in skin layers<br />
Percentages recovered (%)<br />
Receptor Liquid<br />
um<br />
Epidermis<br />
Total skin<br />
S6 RAMEB S6 RAMEB/PVA S5 S7
121<br />
With the S6 experiment, using a gel containing Rameb only as reference, we have the<br />
opportunity to compare the influence of the complexation with PVA on the penetration of the<br />
Rameb: a statistical multifactors analysis of variance was performed and demonstrated that<br />
there is no significant difference between the results of the Rameb gel and the results of the<br />
Rameb/PVA gel (Confidence interval 91%), when regarding all skin layers together. This<br />
result supports the theory that the CD is a vehicule used to take the drug from the aqueous<br />
phase to the lipophilic barrier where it should release it. However, it should be reminded that<br />
the ratio Rameb/PVA in the complx is 10 and a large majority of CD is under free state.<br />
Hence, this study indicates that both PVA and Dimeb can penetrate in the skin. The<br />
amount is significant but only represents a small part of the amount applied. The important<br />
point is that in this case, Rameb acts as a penetration enhancer by significantly increasing the<br />
amount of PVA penetrating the different layers of skin. The question that arises is whether or<br />
not the PVA and Dimeb penetrate as a inclusion complex and if not, when does the separation<br />
happens. To try to answer this question we calculated the ratio [Rameb]/[PVA] for each layers<br />
(after 24h contact) and for the three experiments where Rameb was assayed. Since this ratio is<br />
initially equal to 10 in the solution and in the gel, any significant variation of the ratio in the<br />
skin layers would indicate that one species penetrates more rapidly and that the complex is<br />
therefore separated. Of course, since the Rameb is present in the gel in the free form for 9/10<br />
and in the complexed form for 1/10, this assumption can only be made if the behaviour of<br />
Rameb in the skin is the same whether its free or complexed. This was proven with the results<br />
of the S6 experiment. The values we obtained for the [CD]/[PVA] ratio in the different<br />
experiment shows very important variations (data not shown), ranging from 5 to 50.<br />
Unfortunately, no major tendency can be obtained from those data that would indicate where<br />
the separation happens and which species permeates more quickly. We can only conclude that<br />
the complex is broken in the skin, probably in the stratum corneum since this is the layer<br />
where the ratio is closer to 10. This supports the previous hypothesis about the role of the<br />
cyclodextrin : it acts as a carrier to facilitate the permeation from the aqueous media on the<br />
skin to the stratum corneum, which is responsible for the barrier function of the skin. Once in<br />
the epidermis, the complex is in a medium containing alternate lipophilic and hydrophilic<br />
layers, and it is very likely that the complex is broken and the PVA diffuses according to its<br />
partition coefficient. The dermis which contains cells, fibers and nerves in an aqueous<br />
mucopolysaccharidic medium, is an ideal environment for the diffusion of the very<br />
hydrophilic Rameb, but not for the highly lipophilic PVA which might explain why no traces
of PVA were found beyond the dermis whereas a small amount of Rameb can pass in the<br />
blood.<br />
CONCLUSION<br />
This work demonstrated that complexation of vitamin A propionate with Dimeb<br />
enhances its penetration through the different compartments of skin and should allow to<br />
decrease the quantity of PVA in the final formulation. The other advantage of this form is that<br />
the complex is stable in aqueous media. It shows also that the Rameb, which act as a<br />
penetration enhancer, penetrate in the skin as well and, for a very small amount, reach the<br />
blood vessels. It appeared from those results that PVA and CD are separated at some level in<br />
the skin, however no conclusion could be made regarding the location of the dissociation.<br />
Acknowledgments<br />
The expert technical assistance of M.-C. Nevers on immunoassays trough out this<br />
work was essential and particularly appreciated.<br />
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Commun. Mass Spectrom., Vol. 14, pp. 68-70.<br />
20- Fisher, G. J. & Voorhees, J. J. (1996). Molecular mechanisms of retinoid actions in skin.<br />
The FASEB journal 10, 1002-1013.<br />
21- Loftsson, T., Masson, M., Sigurdsson, H. H., Magnusson, P. & Goffic, F. L. (1998a).<br />
Cyclodextrins as co-enhancers in dermal and transdermal drug delivery. Pharmazie 53, 137.<br />
22- Màsson, M., Loftsson, T., Màsson, G. & Stefànsson, E. (1999). Cyclodextrins as<br />
permeation enhancer: some theoretical evaluations and in vitro testing. Journal of controlled<br />
release 59, 107-118.<br />
23- Marttin, E., Verhoef, J. C., Romeijn, S. G. & Merkus, F. W. H. M. (1996). Eighth<br />
International Symposium on Cyclodextrins.<br />
24- Vollmer, U., Müller, B. W., Peeters, J., Mesens, J., Wilfert, B. & Peters, T. (1994). A<br />
study of the percutaneous absorption-enhancing effects of cyclodextrin derivatives in rats. J.<br />
Pharm. Pharmacol. 46, 19-22.<br />
124<br />
25- Gerlocsy, A., Antal, S. & Szejtli, J. (1988). Int. Symp. on cyclodextrins, Munich.<br />
3.1.5 DISCUSSION
3.2.6 DISCUSSION<br />
Nous allons reprendre au cours de cette discussion, l’ensemble des informations<br />
recueillies dans les articles de ce premier chapitre.<br />
Commençons tout d’abord par les études de complexation du propionate de vitamine A<br />
par les cyclodextrines. Le but était de trouver un moyen de stabiliser et solubiliser le PVA<br />
dans les formes pharmaceutiques, et à cet égard, seule la Rameb s’est montrée efficace. En<br />
effet, l’αCD ne forme aucun complexe, comme cela a été prouvé par la comparaison des<br />
spectres RMN 1 H dans D2O de l’αCD seule et en présence de PVA. En revanche, βCD et γCD<br />
donnent un complexe insoluble dans l’eau, mis en évidence par l’analyse RMN 1 H dans le d6-<br />
dmso du solide obtenu après centrifugation du mélange aqueux CD/PVA. Ces deux<br />
complexes, bien que d’apparence similaire, sont en fait très différents. L’intégration des<br />
signaux RMN de la CD et du PVA montre que le complexe γCD/PVA est de stoechiométrie<br />
1/1 alors que le complexe βCD /PVA est de stoechiométrie 2/1.<br />
Cette différence de structure a des conséquences sur la stabilité des 2 complexes. En<br />
effet, on observe, par RMN et par HPLC, une dégradation très rapide du PVA dans le<br />
complexe βCD /PVA. Le phénomène est plus rapide que dans le cas du PVA seul et ne touche<br />
pas les mêmes sites de la molécule. A l’opposé, le PVA dans le complexe γCD/PVA reste<br />
stable à très long terme. Ceci s’explique par le fait que la géométrie du complexe 2/1 de<br />
βCD/PVA est très différente de celle du complexe 1/1 de γCD/PVA. Les 2 βCD qui<br />
complexent le PVA sont vraisemblablement situées à chaque extrémités en se faisant face par<br />
le coté des hydroxyles secondaires (car l’inclusion se fait en général par la face secondaire) et<br />
ce grand nombre de fonctions hydroxyle crée une zone de haute réactivité chimique qui<br />
pourrait être responsable d’une dégradation accélérée du PVA. La CD jouerait le rôle d’une<br />
enzyme.<br />
125<br />
Devant l’échec de l’utilisation des 3 CD naturelles pour améliorer la solubilité du PVA,<br />
nous nous sommes tournés vers des CD fonctionnalisées possédant une plus grande solubilité<br />
aqueuse. Notre choix s’est porté sur la per-(2,6-O-dimethyl)-β-cyclodextrin (Dimeb) dont la<br />
solubilité est plus de 25 fois supérieure à celle de la CD parente, soit 400 mM et qui possède<br />
l’avantage d’exister dans le commerce (sous forme d’un mélange contenant de nombreux sous<br />
produits plus ou moins méthylés, la Rameb). De plus, nous possédons une méthode de dosage
sensible de la Dimeb (dosage immunoenzymatique par compétition), ce qui nous permet<br />
d’envisager des dosages après absorption dans les milieux biologiques.<br />
Avec la Dimeb, il se forme un complexe 1/1 parfaitement soluble dans l’eau et stable à<br />
long terme. Ces résultats très positifs nous ont permis de préparer un gel aqueux contenant le<br />
complexe Rameb/PVA et d’étudier la pénétration cutanée des 2 espèces et l’influence de la<br />
complexation (on utilise la Rameb pour ces études car elles demandent une grande quantité de<br />
CD et la Dimeb, composé pur, est très difficile à obtenir). Ceci est possible grâce au « double<br />
outil » de dosage dont nous disposons, HPLC et dosage immunoenzymatique.<br />
Après avoir vérifié la stabilité du PVA après la mise en gel, nous avons mené une série<br />
d’études au cours desquelles le gel est déposé sur des échantillons de peau, disposées sur des<br />
cellules de Franz. Comme cela a été décrit dans la littérature [voir Annexe1 ou Schaefer,<br />
1982] on peut utiliser dans les études in vitro de diffusion à travers la peau, une ou plusieurs<br />
ou l’ensemble des couches cutanées (stratum cornéum ou couche cornée, épiderme, derme).<br />
Etant donné que le rôle de barrière de la peau est assuré principalement par le stratum<br />
cornéum (couche la plus superficielle de l’épiderme) et à moindre mesure par l’épiderme,<br />
nous avons choisi, en règle générale, de ne tenir compte que de ces 2 couches et de retirer le<br />
derme, couche très épaisse, afin d’être sur d’avoir des quantités mesurables dans le liquide<br />
recepteur. Après 24 heures de contact, on dose le PVA (HPLC) et la CD (dosage<br />
immunoenzymatique) dans le stratum cornéum, l’épiderme et le liquide récepteur situé sous la<br />
peau dans la cellule de Franz.<br />
126<br />
La première étude, décisive pour la suite des opérations, comparait 3 gels aqueux : le<br />
premier contenant le complexe γCD/PVA (stable mais insoluble dans l’eau et solubilisé par<br />
du Tween 80), le second contenant le complexe Rameb/PVA et le troisième le PVA seul,<br />
solubilisé par du Tween 80. Le dosage du PVA dans le stratum cornéum, l’épiderme et le<br />
liquide récepteur a montré que la complexation par la Rameb provoquait une augmentation<br />
très significative de la quantité de PVA dans la peau alors que la complexation par la γCD n’a<br />
pas cet effet. Ces résultats s’accordent avec l’hypothèse émise par l’équipe de T. Loftsson<br />
[Màsson, 1999] dans leurs efforts pour expliquer le rôle de promoteur d’absorption des CD, et<br />
qui montre la CD comme un vecteur qui agit en solubilisant les principes actifs lipophiles et<br />
permet leur diffusion du milieu aqueux extérieur vers la couche cornée puis l’épiderme. Avec<br />
le complexe γCD/PVA, insoluble dans l’eau, on n’observe pas d’effet promoteur d’absorption<br />
de la CD. Toutes les études suivantes ont été réalisées avec le gel de Rameb/PVA et un gel de<br />
référence (PVA sans CD). Dans un souci de variété nous avons aussi testé une solution
huileuse de PVA comme référence. Les résultats ont confirmé une nette augmentation de la<br />
pénétration du PVA avec le gel contenant le complexe Rameb/PVA par rapport au PVA libre,<br />
qu’il soit sous forme de gel aqueux ou de solution huileuse.<br />
Dans une expérience, et une seule, nous avons utilisé les 3 couches cutanées c’est à dire<br />
stratum cornéum, épiderme et derme. Les résultats ont montré alors qu’après 24 heures<br />
aucune trace de PVA n’est retrouvé dans le liquide récepteur. Cela ne signifie pas que celui-ci<br />
ne pourrait pas éventuellement passer dans le sang puisqu’in vivo le derme est traversé par de<br />
très petits vaisseaux sanguins. Cela signifie que le PVA ayant atteint le derme y est stocké ou<br />
y diffuse très lentement. Théoriquement donc le PVA pourrait se trouver en contact avec ces<br />
petits vaisseaux sanguins, mais là encore il reste à prouver qu’il pourrait passer la membrane<br />
constituant les vaisseaux.<br />
127<br />
Nous avons aussi pu en apprendre plus sur le comportement de la cyclodextrine dans la<br />
peau. Tout d’abord la CD pénètre en quantité très significative, mais faible par rapport à la<br />
quantité initiale déposée car, comme le PVA, elle est confrontée à la barrière du stratum<br />
cornéum. Les résultats de dosage d’une étude comparant le gel Rameb/PVA à un gel<br />
contenant la CD seule indiquent que celle-ci a le même comportement qu’elle soit appliquée<br />
sous forme complexée ou sous forme libre. En effet, les quantités retrouvées dans la peau ne<br />
sont pas significativement différentes. Ceci signifie soit que le complexe a les mêmes<br />
propriétés physico-chimiques que la CD seule, ou bien que le complexe se dissocie très tôt,<br />
dans les premières couches de l’épiderme. Pour comprendre de quelle façon la CD influence<br />
la pénétration du PVA, nous avons réalisé une étude opposant le gel contenant le complexe<br />
Rameb/PVA à un gel contenant un mélange physique de Rameb et PVA, sous formes libres. Il<br />
en résulte une pénétration significativement plus importante avec le complexe. La<br />
solubilisation du PVA par la CD est donc essentielle pour améliorer l’absorption du PVA. Ce<br />
résultat était attendu puisque l’on sait déjà qu’un complexe insoluble n’est pas efficace.<br />
Il a longtemps été décrit que le pouvoir de promoteur d’absorption des CD était dû, tout<br />
comme leur pouvoir hémolytique, à leur aptitude à capter le cholestérol des membranes<br />
biologiques. Ceci est vrai mais ne concerne que les CD vides et non les complexes.<br />
Toutefois si la constante d’association du complexe est plus faible que l’affinité du<br />
cholestérol pour la cavité de la cyclodextrine, alors il y aura dissociation du complexe, et la<br />
CD et le principe actif diffusent dans la peau en fonction de leur propriétés respectives. Afin<br />
de déterminer plus précisément à quel stade se fait la dissociation du complexe, nous avons<br />
utilisé le rapport [Rameb]/[PVA], [Rameb] et [PVA] correspondant aux concentrations
molaires, calculé pour les 3 expériences où la CD est dosée. Ce rapport est initialement de 10<br />
dans la solution et donc dans le gel, puisque l’obtention d’un complexe stable nécessite la<br />
présence de 10 équivalents de Rameb pour un équivalent de PVA. En solution il y a un<br />
échange rapide entre la PVA libre et complexé, mais après la mise en gel ce n’est plus le cas<br />
et donc 9/10 de la CD se trouve sous forme libre. Si l’on admet que la CD a le même<br />
comportement dans la peau qu’elle soit sous forme libre ou complexée au PVA, ce qui a été<br />
démontré en comparant la pénétration de la Rameb après application du complexe et d’un gel<br />
de CD libres, alors toute variation du rapport [Rameb]/[PVA] dans la peau indique que l’une<br />
des deux espèces passe plus vite et donc qu’il y a eu dissociation. Ce rapport reste proche de<br />
10 dans le stratum corneum mais subit d’importantes variations dans l’épiderme et le liquide<br />
récepteur.<br />
Malheureusement, les chiffres dans les 3 expériences sont très disparates, leurs écart-<br />
types importants et aucune tendance majeure ne ressort. On ne peut donc pas savoir quelle<br />
espèce pénètre plus rapidement. La seule vraie conclusion qui en ressort est que le complexe a<br />
effectivement été dissocié. Dans l’étude de pénétration sur peau totale, c’est à dire en présence<br />
du derme, aucune trace de PVA n’est retrouvé dans le liquide récepteur, alors qu’une faible<br />
fraction de la quantité de CD passe le derme et est donc susceptible d’atteindre les vaisseaux<br />
sanguins. Le derme est constitué d’un ensemble de cellules, nerfs, fibres noyés dans une phase<br />
mucopolysaccharidique aqueuse. La Rameb, hydrosoluble et amphiphile, peut donc<br />
facilement diffuser au travers alors que le PVA, lipophile, ne traverse pas cette couche épaisse<br />
et y est stocké comme dans un réservoir ou métabolisé.<br />
L’ensemble de ces résultats n’amène pas une preuve formelle de la dissociation du<br />
complexe dans la peau mais fournit assez de raisons pour le soupçonner fortement. La limite<br />
nous est imposée par les techniques disponibles à l’heure actuelle. En effet, il n’existe pas de<br />
technique de dosage permettant de différencier la forme libre de la CD du complexe.<br />
L’immunologie ne nous permet que de doser la CD libre car la liaison de l’anticorps sur la CD<br />
provoque la dissociation du complexe. En effet les constantes de complexation (de l’ordre de<br />
10 3 ) sont largement inférieures aux constantes d’association anticorps-antigène (jusqu’à 10 12 ).<br />
[Créminon, 1994]<br />
128<br />
En regardant le comportement de la Rameb dans la peau et son influence sur la<br />
pénétration du PVA, on peut se demander ce que l’on observerait avec une CD encore plus<br />
amphiphile et donc ayant plus d’affinité pour les membranes biologiques. Notre choix s’est<br />
porté sur un dérivé de cholestéryl-cyclodextrine (une CD monofonctionnalisée par une
molécule de cholestérol). En effet il a été montré que les cholestéryl-cyclodextrines (CD-chol)<br />
possédaient de remarquables propriétés d’interaction avec les membranes biologiques. Nous<br />
espérons, en utilisant une βCD-cholestéryl modifiée de façon à augmenter son hydrophobicité,<br />
pouvoir préparer des nanoparticules capables d’être chargées en PVA, et étudier leur<br />
pénétration dans la peau.<br />
129
130<br />
CHAPITRE 2
3.3 CHAPITRE 2<br />
INTRODUCTION<br />
Un grand nombre de CD chimiquement modifiées ont été synthétisés afin d’améliorer<br />
ou modifier certaines propriétés de ces molécules hôtes [Wenz, 1994].<br />
Notre attention s’est portée sur les CD amphiphiles, qui sont obtenues en ajoutant un<br />
ou plusieurs groupements hydrophobes. De tels composés peuvent s’insérer dans des systèmes<br />
lipidiques tels que les membranes naturelles ou artificielles grâce à leur partie hydrophobe.<br />
Les CD modifiées appelées « bouquets » (Fig. 21a), portant plusieurs chaînes polyoxyéthylène<br />
ou polyméthylène sur la face primaire et la face secondaire de la CD, ont montré qu’elles<br />
s’incorporaient en grande quantité dans différents types de vésicules lipidiques de DMPC ou<br />
de lécithine d’œuf. Il apparaît que leur mode d’incorporation dans les bicouches n’est pas<br />
unique et rassemble différentes positions allant de transmembranaire à hémimembranaire<br />
[Jullien, 1993]. De nombreux exemples d’auto organisation de CD amphiphiles portant des<br />
chaînes hydrophobes sur une ou deux faces ont été rapportés, que ce soit une organisation en<br />
multicouches ou monocouches stables à l’interface air/eau ou des films de Langmuir-Blodgett<br />
[Parrot-Lopez, 1992 ; Tchoreloff, 1995].<br />
131<br />
a b c<br />
Figure 21. Représentation shématique de a) CD « bouquet » b) CD « bilboquet »<br />
c) insertion de la βChol dans une bicouche lipidique<br />
Kawabata et coll. [Kawabata, 1988] ont utilisé la per(6-dodecylamino-6-deoxy)-βCD<br />
et la per(6-alkylsulfonyl-6-deoxy)-βCD pour former des films de Langmuir-Blodgett stables.
Ils ont montré que la couronne de la cyclodextrine se place parallèlement au film alors que les<br />
chaines alkyles lui sont perpendiculaires. Les auteurs se sont ensuite intéressés à la formation<br />
de ces mêmes films avec des complexes d’inclusion composés de la per(6-dodecylamino-6-<br />
deoxy)-βCD et d’azobenzène (hôte). Ils ont rapporté des observations corroborant le fait que<br />
l’azobenzène retrouvé dans le film de Langmuir-Blodgett est inclus dans la cavité de la CD et<br />
peut même dans ces conditions subir une isomérisation cis-trans parfaitement réversible, ce<br />
qui n’est pas le cas lorsque la molécule s’insère seule dans le film [Tanaka, 1987 ; Yabe,<br />
1988]. Dans le même esprit, Taneva et coll. [Taneva, 1988] ont utilisé les dérivés (6-déoxy-6-<br />
hexadecylamino) de l’αCD, la βCD et la γCD et étudié leur association avec le cholestérol<br />
lors de la formation de monocouches mixtes (à l’interface air/eau) montrant que dans un cas,<br />
le dérivé γCD, le cholestérol entrait dans la cavité de la CD alors qu’avec les dérivés βCD et<br />
αCD le cholestérol ne s’inclue pas et se place, dans la monocouche, entre les chaînes alkyles<br />
greffées sur la CD.<br />
Plus récemment, il a été démontré que l’incorporation dans les membranes peut se<br />
faire aussi avec des dérivés amphiphiles monosubstitués. Les molécules « cup and ball » ou<br />
« bilboquet » (Fig. 21b) obtenues par substitution nucléophile, sur la face primaire de la βCD,<br />
avec une diamine alcane N-protégée par un groupement volumineux (tert-butyloxycarbonyl) à<br />
l’extrémité, pour éviter l’auto-inclusion de la chaîne, peuvent s’incorporer dans des systèmes<br />
organisés tels des vésicules phospholipidiques et garder leur propriétés d’inclusion [Lin,<br />
1998]<br />
132
D’un autre côté, la substitution linéaire par un cholestérol donne des molécules<br />
possédant de très bonnes propriétés d’incorporation dans les membranes phopholipidiques.<br />
Ceci a été obtenu avec le dérivé 6-(cholest-5-en-3β-ylamido)succinyl-amino-6-<br />
deoxycyclomaltoheptaose, ou Chol-βCD (Fig. 22b), et pour lequel la présence du bras<br />
espaceur (succinyl) entre la CD et le cholestérol est essentielle pour donner de la souplesse au<br />
composé et éviter la désagrégation de la membrane. L’incorporation des Chol-βCD dans une<br />
membrane modèle de DMPC se fait préférentiellement les unes près des autres créant ainsi<br />
deux phases séparées et thermodynamiquement stables au sein de la bicouche (Fig. 21c). Par<br />
la suite, la méthylation en position 2 et 6 de la partie cyclodextrine de ces composés a permis<br />
d’obtenir des dérivés solubles dans l’eau (Chol-Dimeb, Fig. 22a) car ils ont la propriété de<br />
s’auto-organiser spontanément en milieu aqueux pour donner des micelles composés de 24<br />
unités. Ces micelles parfaitement sphériques, sont tapissés à la surface par les CD et<br />
conservent les propriétés d’inclusion de la cavité de la CD. [Auzély-Velty, 1999 ;2000 ;2001]<br />
Me<br />
a) Me<br />
CHM e2 b)<br />
C ONH<br />
NHCO<br />
O<br />
HO<br />
O M e<br />
MeO O O<br />
HO<br />
MeO<br />
O<br />
6<br />
c)<br />
HO<br />
133<br />
NHCOO<br />
O<br />
OH<br />
HO O O<br />
HO<br />
HO<br />
O<br />
6<br />
Figure 22. Structures de a) Chol-Dimeb b) Chol-βCD “avec bras”<br />
Me<br />
Me<br />
c) Chol-βCD “sans bras”<br />
C ON<br />
H<br />
N HC<br />
O<br />
O<br />
H O<br />
O H<br />
HO O O<br />
H O<br />
HO<br />
O<br />
6<br />
CHMe2<br />
Me<br />
Me<br />
C H M e2
Par la suite, de nombreuses études ont montré que des cyclodextrines amphiphiles<br />
pouvaient former des nanoparticules (nanosphères et nanoparticules) stables. Ainsi, les CD<br />
appelées “CD à jupes” (ou “skirt-shaped CD”) sont préparées à partir d’αCD, de βCD et de<br />
γCD en greffant sur les hydroxyles de la face secondaire des chaines carbonées de longueurs<br />
variables (C2-C14). Insolubles dans l’eau, elles possèdent des propriétés de tensio-actifs et<br />
peuvent facilement donner naissance à des nanoparticules, comme cela a été montré avec la<br />
βCD-C6, la βCD-C12, la βCD-C14 et la γCD-C6 par Skiba et coll. [Skiba,1993 ; Skiba,<br />
1996 ; Duchêne, 1996]. En fonction de la technique de préparation, on peut obtenir au choix<br />
des nanosphères ou des nanoparticules. Pour les nanosphères on utilise le plus souvent la<br />
nanoprécipitation qui consiste à dissoudre la CD dans un solvant miscible à l’eau (éthanol,<br />
acétone), à injecter la solution dans l’eau puis à retirer le solvant par évaporation sous vide, ce<br />
qui donne spontanément des agrégats. Dans ces conditions, on obtient avec les 3 CD citées<br />
précédemment des nanosphères dites blanches (car non chargées en principe actif)<br />
parfaitement stables et donc ne nécessitant pas l’ajout d’un tensioactif supplémentaire<br />
(stabilisant). Notons que l’on utilise une technique légèrement différente lorsque l’on est<br />
obligé d’utiliser un solvant non miscible à l’eau pour dissoudre la CD, comme ce fut le cas<br />
avec la γCD-C6. La méthode reste la même mais, dans ce cas précis, il n’a pas été possible de<br />
se passer de tensioactif (Pluronic ® F68) pour obtenir des nanosphères stables. Dans le cas des<br />
nanocapsules, la phase lipophile constituée de la CD amphiphile et d’une huile (Myglyol 812<br />
ou benzyl benzoate) est dissoute dans l’acétone et ajoutée sous agitation à la phase aqueuse.<br />
Les nanocapsules se forment spontanément et l’acétone est retirée par évaporation sous vide.<br />
Il est possible de charger ces nanoparticules en principe actif (p.a), qu’il soit lipophile<br />
ou hydrophile en le dissolvant dans la phase organique ou aqueuse, respectivement. Dans le<br />
cas des nanosphères, le p.a peut se situer dans la matrice de CD, adsorbé en surface ou encore<br />
dans la cavité de la CD. Pour les nanocapsules, la CD joue le rôle de barrière extérieure et le<br />
p.a est dissout dans l’huile contenue à l’intérieur. Ainsi, plusieurs p.a, hydrophiles ou<br />
lipophiles, ont été encapsulés avec succès dans les CD-jupes : dans des nanosphères, la<br />
doxorubicine (chlorydrate hydrophile), jusqu’à 40% w/w en présence d’un tensioactif [Lechat-<br />
Leroy,1995] et la progestérone (lipophile) jusqu’à 80% w/w en présence de Pluronic ® F68<br />
[Lemos-Senna, 1998b]. Dans des nanocapsules, en présence de Pluronic ® F68,<br />
l’indométhacine, la progestérone et l’amphotéricine B ont été encapsulés avec à l’arrivée un<br />
contenu en principe actif de 21.6 % w/w, 7.5 % w/w et 11 % w/w respectivement [Skiba,<br />
1996].<br />
134
Citons aussi les travaux de Ravoo, Darcy et Mazzaglia concernant des βCD<br />
substituées par des groupements aminos et carboxyméthyls sur les faces primaires et<br />
secondaires respectivement (donc une charge positive sur la face primaire et une charge<br />
négative sur la face secondaire) et aboutissant à la formation d’agrégats supramoléculaire dans<br />
l’eau, d’un diamètre inférieur à 300nm et d’environ 20µm de long [Ravoo, 2001].<br />
Nous allons tout d’abord présenter, dans ce deuxième chapitre, de nouveaux résultats<br />
obtenus avec la Chol-Dimeb (Fig. 22a) et concernant son inclusion dans des membranes<br />
modèles de films noirs. Nous avons en effet préparé des films mixtes phopholipides/CD<br />
amphiphiles afin d’étudier leur structure par la technique de réflectivité des rayons X. Ce<br />
travail, basé sur la technique des films noirs [Bélorgey, 1991 ; Benattar, 1992], a été effectué<br />
en collaboration avec le Dr Jean-Jacques Bennatar et son équipe au Service de Physique de<br />
l’Etat Condensé du <strong>CEA</strong> Saclay.<br />
Les films noirs sont des bicouches particulières puisque les têtes polaires des<br />
phospholipides ou tensio-actifs qui le constituent sont face à face, séparées par une mince<br />
couche d’eau. Ces films sont formés en remontant lentement un cadre métallique plongé dans<br />
une solution de tensio-actifs. Le film se forme entre les extrémités du cadre et s’amincit au fur<br />
et à mesure que l’eau présente à l’intérieur s’écoule (Fig. 23). En dessous de 500 Å, le film est<br />
dit « noir », bien que tout à fait transparent, car il ne réfléchit plus la lumière. La technique de<br />
réflectivité des rayons X consiste à mesurer l’intensité du faisceau de rayon X réfléchie par le<br />
film en fonction de l’angle d’incidence du faisceau par rapport au film, et permet de<br />
déterminer pour chaque constituant du film la densité électronique, l’épaisseur et la rugosité<br />
interfaciale. Grâce à cette technique, nous avons montré qu’il est possible de former un film<br />
noir de Chol-Dimeb. Ce film est très peu stable mais en ajoutant un phospholipide (DMPC) à<br />
la solution nous avons obtenu un film très stable et dont l’épaisseur est maximale pour un<br />
rapport DMPC/CD de 3. Nous avons montré que la Chol-Dimeb conserve ses propriétés<br />
d’inclusion dans le film et permet de rendre celui-ci accessible à un principe actif. On obtient<br />
donc un film modèle pouvant inclure des molécules hydrophobes et mimant une interaction<br />
possible des CD avec des membranes.<br />
135
Figure 23. Formation d’un film noir<br />
136<br />
écoulement de l ’eau<br />
Le second article de ce chapitre est consacré aux dérivés acétylés et donc insolubles<br />
dans l’eau, de la Chol-βCD “sans bras” (Fig. 22c), que nous avons synthétisés dans le but<br />
espéré de former des nanoparticules capables d’être chargées en vitamine A. Pour cela, nous<br />
sommes partis d’une Chol-βCD ne possédant pas de bras espaceur entre le cholestérol et la<br />
cyclodextrine et donc plus rigide. Cette Chol-βCD « sans bras », insoluble dans l’eau et les<br />
solvants organiques, a été décrite par Auzely-Velty et coll. et provoque une désorganisation<br />
des bicouches lipidiques. L’acétylation de ces composés permet de les rendre solubles dans les<br />
solvants organiques. Tout d’abord nous présenterons succinctement la synthèse de ces<br />
composés acétylés et la préparation des nanoparticules recherchées. Nous présenterons les<br />
caractéristiques physico-chimiques de ces nanoparticules, seules puis en présence de vitamine<br />
A. Enfin, seront présentés les premiers résultats d’étude de pénétration sur peau obtenus par<br />
application cutanée d’un gel contenant des nanoparticules chargées en PVA.<br />
C<br />
H 3<br />
C<br />
H 3<br />
C O O<br />
C O O<br />
O<br />
O P<br />
O -<br />
O<br />
+<br />
N (C3 ) 3H<br />
Dimyristoyl<br />
phosphatidyl<br />
choline<br />
(DMPC)
Chapitre 2<br />
3.3.1 Article n°4<br />
137<br />
Direct investigation of the vectorisation of amphiphilic cyclodextrins in<br />
phospholipidic films<br />
I. Javierre, M. Nedyalkov, V. Petrova, J.J Benattar,<br />
S. Weisse, R. Auzély-Velty, F. Djedaïni-Pilard, B. Perly.<br />
J. Colloids and Interface Science (sous presse)
Direct investigation of the vectorisation properties of amphiphilic<br />
cyclodextrins in phospholipid films<br />
Isabelle Javierre, Mickael Nedyalkov 0 , Vera Petkova and Jean-Jacques Benattar 0<br />
<strong>CEA</strong>/Saclay, DSM/DRECAM, Service de Physique de l'Etat Condensé, F-91191 Gif sur Yvette Cedex, France<br />
Sandrine Weisse, Rachel Auzély-Velty 0 , Florence Djedaïni-Pilard 0 and Bruno Perly<br />
<strong>CEA</strong>/Saclay, DSM/DRECAM, Service de Chimie Moléculaire, F-91191 Gif sur Yvette Cedex, France<br />
Abstract<br />
Recently, new cyclodextrin derivatives have been synthesized and were shown to<br />
exhibit strong amphiphilic properties. In this paper, we study the action of these new<br />
amphiphilic cyclodextrins on phospholipids. Mixed phospholipids / cyclodextrin derivatives<br />
films were prepared and studied using X-ray reflectivity for various phospholipids /<br />
cyclodextrins ratios. A molar ratio of 3 provides a highly stable film which molecular<br />
structure has been investigated in detail. The cholesterol tail of the cyclodextrin molecule was<br />
found to be anchored into the phospholipid film. The cyclodextrin moieties exposed to the<br />
aqueous medium are prone to the addition of the guest molecule Dosulepin, making them of<br />
high interest for drug delivery. For this purpose and as an example of potential application,<br />
this cyclodextrin molecular carrier property is also addressed to this complex film<br />
architecture.<br />
Key Words: black films; X-ray reflectivity; cyclodextrins; phospholipids; drug delivery<br />
0 Permanent address: Department of Physical Chemistry of the University of Sofia, 1, bull. "James<br />
Bourchier", 1126 Sofia, Bulgaria.<br />
0 Author to whom correspondence should be addressed. Fax : (33) 169 088 786 Phone : (33) 169 087<br />
516 Email : benattar@drecam.saclay.cea.fr<br />
0 Present address: Centre de Recherche sur les Macromolécules Végétales, BP53, 38041 Grenoble<br />
Cedex 9, France.<br />
138<br />
0 t Present address: <strong>Université</strong> de Picardie-Jules Verne, Laboratoire des Glucides, 33, rue S Leu, F-80039<br />
Amiens, France.<br />
Running title: Black films of phospholipids and cyclodextrins
Introduction<br />
Newton Black Films (NBF) consist of two walls of surfactant molecules surrounding<br />
an hydration water core. In contrast to the biological membrane structure, the hydrophilic part<br />
of the molecules face in the center of the film. Since this structure was determined by X-ray<br />
reflectivity 1 , many experiments have been made with different types of molecules 2, 3, 4, 5, 6, 7<br />
The NBF is an appropriate model system for studying the interactions between different<br />
molecules and to build more and more complex mixed structures. With biological compounds<br />
one can successfully model liposome/liposome interaction, inter-membrane interactions and<br />
more specific processes. The present experimental approach uses NBF stabilized by<br />
phospholipids as an artificial target to simulate the action of modified amphiphilic<br />
cyclodextrins.<br />
Recently, using X-ray reflectivity, the internal substructure of various phospholipids<br />
black films has been elucidated with a molecular scale resolution 8 : the density profile and the<br />
thickness of the zone occupied either by the aliphatic chains or by the hydrophilic groups were<br />
determined. In particularly, DMPC (dimyristoylphosphatidylcholine) or DOPC<br />
(dioleoylphosphatidylcholine) were found to form very stable films whose lifetime was more<br />
than two days with a well-defined structure.<br />
One challenging problem was then to be able to obtain stable mixed film including a<br />
host biological molecule, i.e. a protein, and to understand its structure. Recently, mixed stable<br />
protein/surfactant (BSA 9 , bovine serum albumin and C12E6, hexaethylene glycol<br />
monodecylether) films were obtained. A general insertion process was found to form a single<br />
protein layer embedded in the free-standing surfactant bilayers by adjusting the protein<br />
chemical potential in bulk. The use of DMPC instead of C12E6 and Lysozyme instead of BSA<br />
led to the same result, but with a larger variety of behaviors 10 . In this case, the complexity of<br />
the film structure is magnified by the use of biological molecules for both the film and the<br />
host. Nevertheless, the complexity of these mixed films is now controlled and quite well<br />
understood.<br />
139<br />
Within the context of this study, we use a DMPC free-standing film as a target for a<br />
cyclodextrin molecule. This cyclodextrin is new and is hydrophobically modified 11 : namely 6 I -<br />
(cholest-5-en-3α-ylamido)succinylamido-6 I -deoxy-per(2,6-di-O-methyl)-cyclomaltoheptaose<br />
(chol-DIMEB). An analysis 12 of its behavior in aqueous solution using surface tension<br />
measurements and light, small-angle X-ray, and neutron scattering techniques proved that it<br />
self-assembles into monodisperse spherical micelles with an average aggregation number of
24. These highly water -soluble micelles have been shown to be two-shell objects, the<br />
cyclodextrin moieties being exposed towards the aqueous medium making them prone to the<br />
inclusion of guest molecules in the cavities.<br />
The association of guest molecules in the aggregates of chol-DIMEB has also been<br />
investigated for different water-soluble molecules 13 . NMR (Nuclear Overhauser Effect<br />
pumping) demonstrated the binding and spatial proximity for these different guests. Using<br />
small angle X-ray and neutron scattering (SAXS and SANS, respectively) the microstructure<br />
at the supramolecular scale of the modified cyclodextrin (chol-DIMEB) micelle – i.e.<br />
aggregation number, charge and volume- in the presence of guest molecules could be defined.<br />
One of the guests, i.e. the neurotropic molecule Dosulepin, is known to interact<br />
with chol-DIMEB micelles13. This molecule forms inclusion complexes with the native 14 and<br />
modified 15 β-cyclodextrin and is extensively used as a guest model. The selective interaction<br />
of Dosulepin with cyclodextrin cavities of chol-DIMEB micelles has been clearly evidenced<br />
by Diffusion-assisted NOE-pumping experiments. It has been shown that the aggregation<br />
number of the micelle does not change noticeably upon inclusion of this guest. These results<br />
imply that the packing of the chol-DIMEB into spherical micelles is exceptionally robust.<br />
These studies have clearly demonstrated that the inclusion properties of the CD cavities of<br />
chol-DIMEB aggregated into micelles objects are retained. The stability and specificity of the<br />
mixed micelle involving target molecules, such as Dosulepin, make these hydrophobically<br />
modified cyclodextrins good candidates for molecular carriers. Chol-DIMEB can therefore be<br />
of high interest for the targeting of biologically important molecules and especially for the<br />
delivery of drugs.<br />
Up to now, the mixed cyclodextrin/DMPC system has only been investigated on a<br />
macroscopic scale11, using small-angle X-ray scattering, differential scanning calorimetry and<br />
31 P nuclear magnetic resonance. The mixed system obtained was a lamellar phase, stable and<br />
monophasic only for specific cyclodextrin/DMPC ratios. There is no model membrane<br />
incorporating native cyclodextrin.<br />
In this study, we have used the freestanding film technique to mimic the cyclodextrin<br />
action on a phospholipid bilayer target. Initially, our aim was to check the feasibility of the<br />
formation of a stable mixed cyclodextrin/DMPC film and to determine its structure at a<br />
molecular scale: namely how cyclodextrin is incorporated into the film and what is the<br />
prevalent interaction. Then we took advantage of the cyclodextrin carrier molecule property<br />
to follow in situ the behavior of an active guest molecule, Dosulepin, trapped in the<br />
cyclodextrin cavities.<br />
140
Materials and methods<br />
Materials<br />
141<br />
Chol-DIMEB (Fig. 1a) has been synthesized in the laboratory as described<br />
previously12. This molecule is composed of a hydrophobic cholesterol tail grafted onto a<br />
methylated cyclodextrin through a succinyl spacer arm. It looks like a white amorphous<br />
powder, is highly water-soluble, and has a critical micelle concentration12 of (5±2)×10 -6 M.<br />
The chol-DIMEB concentration was 0.438 mg/ml. BASF Pharma (Valenciennes, France)<br />
kindly provided Dosulepin (Fig. 1b), a water-soluble neurotropic substance. It is a tricyclic<br />
molecule with a positively charged aliphatic tail.<br />
The DMPC lipid, whose chemical formula is given in Fig. 1c, has a zwitterionnic<br />
phosphatidylcholine head and 14 carbons hydrophobic tails. It was purchased from SIGMA<br />
and used without further purification. DMPC dispersions in ultra pure water (Millipore Alpha-<br />
Q) were obtained by sonication with ultrasound (VibraCell 72412, Bioblock Scientific) for 15<br />
minutes at 30°C, which is a higher temperature than the transition temperature of DMPC 16<br />
(23°C). From the literature 17 , it is known that such a procedure leads to suspensions of small<br />
unilamellar vesicles (SUV). In all experiments reported here, the concentration of DMPC in<br />
the film forming solution was 0.5 mg/ml. The suspension was stored at 25 °C and used as<br />
soon as possible (maximum conservation time: 3 days). For the mixed solutions, the DMPC<br />
suspension was poured on the appropriate weighted amount of cyclodextrins and stirred for 30<br />
minutes. For the experiments with Dosulepin, we use the same procedure. A large excess of<br />
guest molecule (0.3mg/ml) was used in order to be sure all the cyclodextrin cavities are<br />
occupied by one Dosulepin molecule 0 . All the experiments were performed at 25±1°C.<br />
The formation of stable films requires dense packed monolayers of amphiphiles at the<br />
film surfaces 18 . Phospholipids have very low solubility and the kinetics of monolayer<br />
formation is very slow. In order to estimate the time necessary to form a dense molecule<br />
monolayer, surface tension measurements were performed for pure DMPC and pure chol-<br />
DIMEB solutions, and for DMPC/chol-DIMEB mixtures. Surface tension was measured at<br />
0 The DIMEB/Dosulepin complex formation constant is Kc=4610M -1 . If [DIMEB]=1mM and<br />
[Dosulepin]=5mM then [DIMEB/Dosulepin complex]=0.94mM. 94% of the cyclodextrin<br />
cavities should theoretically contain one Dosulepin molecule. See Djedaïni, F., Zhao Lin S.,<br />
Perly, B., Wouessidjewe, D., J. Pharm. Sci., 79, 643 (1990).
25°C using the Wilhelmy plate method with a Cahn 1000 balance (Ankersmit, U.S.A.). As<br />
shown in Fig. 2, the surface of the solution is saturated with amphiphilic molecules after<br />
approximately 15 h for dispersions of DMPC and 25 h for chol-DIMEB solutions. Then,<br />
surface tension reaches a constant value, 40 mN/m for chol-DIMEB and 30 mN/m for DMPC.<br />
These values are in agreement with previous reports12 , 19 . For the DMPC/chol-DIMEB<br />
mixture, we observe two steps in the adsorption process. After 15h, a first plateau occurs at 30<br />
mN/m, then the surface tension continues to decrease to a second constant value, 24 mN/m,<br />
which is reached after 25h saturation. However, whereas the value of the first plateau of this<br />
curve corresponds to the value obtained for pure DMPC, the kinetics strongly differs during<br />
the first 6 hours: with pure DMPC, the initial value of surface tension is 60 mN/m when with<br />
the mixture, this initial value is equal to that for pure chol-DIMEB. This change could be<br />
linked to the higher hydrophobicity of the cyclodextrins: at the beginning of the experiment,<br />
the cyclodextrins will partially diffuse to the surface first, then DMPC molecules, which are<br />
more hydrophilic, will reach the surface. The lower value obtained for the surface tension of<br />
the mixed solution indicates that the monolayer is mixed ,i.e., DMPC/chol-DIMEB<br />
monolayer.<br />
Because of the long saturation times, all the experiments were undertaken inside a<br />
sealed box to maintain water vapour saturation. First, we study the pure DMPC and pure chol-<br />
DIMEB films separately, and then mixed films with various DMPC/chol-DIMEB molar<br />
ratios. The (3 : 1) molar ratio of DMPC/chol-DIMEB film experiments will be described in<br />
detail.<br />
X-ray reflectivity technique<br />
The macroscopic vertical films are withdrawn from the cyclodextrin/DMPC mixtures<br />
by lifting a rectangular metallic frame at a slow constant rate. The geometry of the frame is<br />
described elsewhere6 and enables reflectivity measurements to be made at extreme grazing<br />
incidence in the range 7-60 mrad. The minimum incident angle (7 mrad) is only limited by the<br />
size of the meniscus.<br />
142<br />
The experiments were performed using a high-resolution diffractometer (Nonius,<br />
Optix) described elsewhere 20, 21 . A copper tube is used as an X-ray source (λ = 1.5405 Å,<br />
(CuKα1 line)). A reflectivity experiment enabled us to measure the ratio R(θ) = Ι(θ)/I0 at
various incidence angles θ, between the intensity I0 of the incident beam 0 and that Ι(θ)<br />
reflected by the film.<br />
The specular reflectivity is recorded and provides access to the electron density<br />
profile1 along the film normal. As described elsewhere 22 and because it is not possible to<br />
directly invert the reflectivity data, we consider the film as a succession of homogeneous<br />
chemical slabs and fit the data with a least-square procedure. Each slab corresponds to a<br />
specific part of the film8 assuming that the molecules stay side-by-side and form a bilayer. For<br />
example, two external slabs would represent the hydrophobic tails, two other slabs would<br />
stand for the polar heads and a fifth slab would correspond to the hydration central layer. Each<br />
slab is characterized by its specific thickness and electron density (noted δ hereafter). In the<br />
real film, the discontinuities between the different part of the bilayer are not so abrupt but are<br />
smoothed using another parameter, the interfacial roughness (variable but identical for each<br />
interface). This roughness accounts for the thermal fluctuations but it is not likely to exclude<br />
the possible influence of additional intrinsic molecular disorder. As it is not easy to<br />
distinguish the two possibilities, a good approximation is to consider the roughness identical<br />
for each interface.<br />
For each slab, the interfacial film roughness, the thickness and density can be derived<br />
from the experimental reflectivity profile through the use of an optical formalism 23 . The fits of<br />
the experimental reflectivity curves are made using “Parratt 32” software 0 .<br />
It should be point out that the accuracy of the reconstructed density profile strongly<br />
depends on the homogeneity of the film and on the agreement between the slab model and the<br />
chemical structure of the film. In the present case, it is not be possible to obtain perfect fits<br />
since all the reflectivity profiles are slightly modified by a weak thickness distortion.<br />
We attempt to describe the mixed film using the symmetrical five-slab model.<br />
However, when the experimental accuracy is lower (i.e. short lifetime of the film or disorder<br />
in the film), we use a simpler model, 1- or 3- box model.<br />
NMR Techniques<br />
143<br />
1 H-NMR experiments were performed at 500.13 MHz using a Bruker DRX500<br />
spectrometer with a 5 mm reverse broad-band z-axis gradient probe. In all cases, the sample<br />
(10mM of DIMEB and Dosulepin) was prepared in deuterium oxide and measurements were<br />
0 I0 is measured by placing the detector directly at zero incidence, in absence of the frame. A<br />
calibrated aluminum absorber intercalated in the beam path protects the detector.<br />
0 ©1997-2001 Christian Braun, Hahn-Meitner-Institut
performed at 25 °C under careful temperature regulation. NMR spectra were collected using<br />
16 K data points. Chemical shifts are given relative to external tetramethylsilane (TMS = 0<br />
ppm) and calibration was performed using the signal of the residual protons of the solvent as a<br />
secondary reference. 2D experiments were obtained using modified pulse programs available<br />
from the Bruker library. These experiments were run using 2K data points and 512 time<br />
increments. The phase-sensitive (TTPI) sequence was used and processing resulted in a<br />
1K*1K (real-real) matrix. All NMR data was further processed and plotted using the<br />
XWINNMR program (Bruker Analytische Messtechnik) on an INDY workstation (Silicon<br />
graphics).<br />
Results<br />
Pure DMPC films<br />
A DMPC Newton Black Film was formed after one night surface saturation and was<br />
stable for over two days. The reflectivity curve was recorded when the film reached its<br />
equilibrium thickness. As described in a previous paper8, the data were analyzed using a least-<br />
squares fitting procedure with a five-layer model: this model was partly imposed by the shape<br />
of the curve and also took into account the chemical constraint of the DMPC molecule. The<br />
calculated density profile, shown in the inset of Fig. 3, presents large contrasts between the<br />
different part of the film, and originates in the specific DMPC interference fringes. The<br />
overall thickness of the film is 58 ± 1 Å. Similarly as obtained in ref. 8, the first slab whose<br />
thickness is 13.1 Å (δ=2.3×10 -6 ) is allocated to the hydrophobic tails. The intermediate layer<br />
corresponding to the hydrophilic part of the molecules has an extension of 11.5 Å<br />
(δ=3.8×10 -6 ). The thickness of the central core is 8.8 Å (δ=2.7×10 -6 ). The high value of the<br />
electron density of intermediate layers evidences the presence of water hydration molecules<br />
whereas the low value of δ in the central core indicates that only the choline group occupies it.<br />
The value of the interface roughness between these sublayers is 3 Å.<br />
Pure chol-DIMEB films<br />
144<br />
In spite of the chol-DIMEB amphiphile properties, it was extremely difficult to<br />
form stable film made of these molecules, even if the concentration in the bulk (0.438 mg/ml)<br />
was fifty times the cmc. After 25 hours waiting time for surface saturation, the chol-DIMEB<br />
film drainage is instantaneous and the film reaches its equilibrium thickness. The lifetime of
the film was unfortunately less than 1 h. The low accuracy of the reflectivity data recorded for<br />
this film (see Fig. 4) does not allow any detailed structural information. Nevertheless, the<br />
position of the first minimum of the reflectivity curve enables us to determine the wide<br />
thickness of the film (solid line in Fig. 4) through the use of a 1-layer model. The total<br />
thickness is 54 ± 1 Å. In this film, the interface roughness is 3.6 Å.<br />
Mixed DMPC/chol-DIMEB films<br />
Mixed DMPC/chol-DIMEB films were studied with various DMPC/chol-DIMEB<br />
molar ratios R varying from R=∞ to R=0 (R=∞: pure DMPC dispersion, R=0: pure chol-<br />
DIMEB solution). The different thickness of the film extracted from the reflectivity curves<br />
collected for various ratios are reported on Fig. 5. This curve has a bell shape and exhibits a<br />
maximum of thickness (75 ± 1 Å) for the molar ratio 3. From R=∞ (pure DMPC film) up to<br />
R=3, the thickness film rises from 58 ± 1 Å to 75 ± 1 Å as the chol-DIMEB proportion in the<br />
film increases. This rise coincides also with a high stability of the mixed film (more than two<br />
days). If we continue to add chol-DIMEB (from R=3 to R=0), the thickness decreases to 56 ±<br />
1 Å and the film becomes more and more unstable. For the different ratios (R3)<br />
(results not shown in this paper), the shape of the reflectivity curves are quite similar with the<br />
same level of intensity. In contrast, for R=3, the reflectivity curve exhibits a maximum of<br />
intensity and a specific modulation of the Kiessig fringes. This clearly indicates that for this<br />
particular ratio, there are some molecular rearrangements within the film that yields a specific<br />
film structure.<br />
145<br />
The solid line in Fig. 6 represents the best fit obtained for the film of maximum<br />
swelling. As for DMPC data, a five-layer model was used to fit the experimental data. The<br />
validity of this model will be discussed in the next section. We found an overall thickness of<br />
75 ± 1 Å. A highly modulated electron density within the film (inset of Fig. 6) could be<br />
detected, with, in particular, a very low electron density (δ=2×10 -6 ) in the central core, which<br />
may evidence the absence of any water molecule in this layer of the film. In comparison with<br />
a pure DMPC film, the 15 Å thickness increase observed should therefore be only due to the<br />
mixed structure of the film. A thickness of 13.4 Å was measured for the external layer and of<br />
11.4 Å for the intermediate layer. The central core is 25.5 Å thick. However, the low value of<br />
roughness (3 Å) may support the hypothesis of a homogeneous structure.<br />
Mixed DMPC/chol-DIMEB films including Dosulepin guest molecule
Another component (Dosulepin) was added to the previous mixed DMPC/chol-<br />
DIMEB film (ratio R=3). After at least 30h surface saturation, a black film was formed and it<br />
remained stable over 1 day. Fig. 7 shows the corresponding reflectivity profiles of mixed films<br />
with and without Dosulepin. The spectacular shift of the position of the first minimum<br />
towards small angle wave vectors indicates that Dosulepin is included into the film since the<br />
film thickness is changed and thus its internal structure is modified. It was difficult to interpret<br />
the reflectivity data in terms of layer model, because of the film inhomogeneity as well as the<br />
complexity of the system. However, using a single-layer model, the overall thickness of the<br />
film could be obtained: 100 ± 1 Å. To verify that the thickening observed was only due to<br />
Dosulepin/chol-DIMEB complex formation, a test experiment was carried out. A mixed<br />
Dosulepin/DMPC film was formed with the concentrations 0.3 mg.ml -1 / 0.5 mg.ml -1 vs/vs<br />
Dosulepin/DMPC keeping constant the molar ratio (R = 3). The reflectivity curve is presented<br />
in the inset of Fig. 7. The position of its first minimum coincides with the first minimum of<br />
the pure DMPC curve. Consequently, the Dosulepin molecule should not disturb the DMPC<br />
bilayer arrangement. This qualitatively confirms that the thickening of the DMPC/chol-<br />
DIMEB/Dosulepin mixed film mainly originates in Dosulepin/chol-DIMEB interactions<br />
which probably lead to complexes formation.<br />
Discussion<br />
146<br />
For the pure chol-DIMEB black film, only one order of the Kiessig fringe is visible in<br />
the reflectivity curve. We were not able to obtain the film structure from the electron density<br />
profile extracted from the low quality reflectivity profile. However, using the knowledge of<br />
the chemical structure of the film-forming molecules and bearing in mind the surfactant<br />
properties of this molecule12, a molecular bilayer arrangement within the film can be<br />
logically suggested (see Fig. 8). The chol-DIMEB molecules have their cavities facing each<br />
other in a central layer of the film whereas the cholesterol moieties are oriented towards the<br />
air. Moreover, the whole thickness found for the inverted black film (54 Å) is in agreement<br />
with the radius of the chol-DIMEB direct micelle (25 Å) observed by Auzély-Velty et al.12<br />
Because of the rather low accuracy of the reflectivity data, it is difficult to estimate a number<br />
of water hydration molecules per chol-DIMEB head group.
147<br />
In another respect, it should be pointed out that a β-cyclodextrin derivative film<br />
structure has already been investigated 24 for β-cyclodextrins deposited on silicon wafers. The<br />
β-cyclodextrins film exhibited poor in-plane ordering, mostly due to the corona 7-fold<br />
symmetry, which created holes within the whole surface. Even if, in our case, the β-<br />
cyclodextrin molecule is oppositely grafted and chemically modified, the 7-fold symmetry<br />
molecule remains. Therefore, the presence of intrinsic holes within the bilayer could be<br />
expected and could explain the poor stability of the film over a long period of time.<br />
However, we observed that the stability is considerably increased by addition of<br />
DMPC molecules to the chol-DIMEB film, particularly when the film is composed of 3<br />
DMPC molecules for 1 chol-DIMEB molecule. Furthermore, the thickness of the film is<br />
maximum for this ratio. This striking stability should be linked to a specific molecular<br />
arrangement within the film interfaces. To reproduce the experimental reflectivity data of the<br />
mixed film, a symmetrical five-box model was necessary and, as for the DMPC experiments8,<br />
was imposed by the shape of the curve. The third fringe of the reflectivity curve is intensively<br />
reduced compared with the second fringe (see Fig. 6) but their widths and intensities are<br />
strongly correlated, as demonstrated during the fitting tests. Parameters combining very low<br />
electron density for the central layer and rather high density for the intermediate layers gave<br />
better agreement between the experimental recording and fitting curves. For pure DMPC, the<br />
use of the five-layer model8 was one of the best way to account for the specific shape of the<br />
DMPC reflectivity curve, and in particular the strong reduction of the intensity of the second<br />
fringe. To fit the mixed film, we first supposed that the structure of the DMPC film was only<br />
partially perturbed by the presence of cyclodextrins and we started the fitting procedure with a<br />
five-layer model. (We also tested 1- and 3-box models, but they did not correspond to the<br />
observed data: the simulated reflectivity curves are too regular.) However, the main difficulty<br />
was to reproduce both the very low intensity of the third fringe and the high intensity of the<br />
first fringe. During the fitting process, we attempted to use different five-layer models or even<br />
a seven-layer model in order to correlate the chemically possible constraint of this mixed film<br />
with the experimental reflective intensity. The fitting curve presented in Fig. 6 does not<br />
perfectly reproduce the experimental data. Nevertheless, it corresponds to the best<br />
compromise between a fit which correctly describes the third fringe correlated with the two<br />
first ones (see Fig. 6) and a fit which correctly describes the two first fringes but not the third.<br />
The unique differences between these two fitting curves were not in the thickness of the<br />
different slabs but in the density values of the third layer. This fit quality is reduced due to<br />
weak thickness inhomogeneity over the whole film: the two surfaces of the film are not
strictly parallel. This should affect the structure of the film so that it seems likely that no<br />
plausible model could account for this disagreement. Nevertheless, in the microscopic scale,<br />
the structure of the film could quite self-reliantly be determined. The electron density value of<br />
2×10 -6 evaluated for the central layer of the mixed DMPC/chol-DIMEB film is in the same<br />
range as that extracted from the pure cyclodextrin film. The central thickness (25.5 Å) is<br />
comparable to the size of the cyclodextrin cavity ( 2 × 11 Å)13. Hence, in the mixed film, the<br />
central core should consist of the cyclodextrin cavities facing each other (see Fig. 9). We keep<br />
for the intermediate and external layers a structure similar to that of DMPC : the electron<br />
density profile acquired for the mixed film has the same shape and is in the same range as that<br />
obtained for the pure DMPC. Moreover, the ratio of the electron density of the intermediate<br />
layer to that of the external layer is quite similar in each case (respectively 1.35 for the mixed<br />
film and 1.43 for the pure DMPC). In the mixed case, the values may be lower because we<br />
have to take into account the steric arrangement of 6 DMPC tails (3 DMPC molecules) around<br />
the grafted cholesterol and the covalent succinyl bond. The surface12 covered by 1<br />
cyclodextrin cavity ring (295 Å 2 ) roughly corresponds to the additional surface of a<br />
cholesterol tail (120 Å 2 ) and 3 DMPC molecules (55 Å 2 /molecule). Additional experiments 0<br />
show that the presence of a cholesterol molecule in pure DMPC film, in the same molar ratio,<br />
did not provoke significant changes in the film thickness or in the density profile. Therefore,<br />
in the mixed film the head of chol-DIMEB provides a specific molecular architecture<br />
responsible of the very high stability. Indeed, owing to the film structure shown in Fig. 9<br />
derived from the electron density profile, it appears the chol-DIMEB insertion process in the<br />
DMPC bilayers can be reduced to a DMPC/cholesterol interaction. The condensing effects of<br />
cholesterol on the physical properties of lipid bilayers have been studied extensively by a<br />
variety of experimental methods 25, 26, 27 . The cholesterol is known to be a regulator of<br />
membrane ordering 28 and to increase the rigidity of lipid bilayers 29 . However, up to now, what<br />
remains unexplained is the specific molar ratio that leads to the stability in our film. As<br />
previously observed11 : a DMPC/chol-DIMEB lamellar phase was found to be stable for a<br />
molar ratio of 3.6, which remains in the same range as those observed with our black film.<br />
0 Reflectivity curves of pure DMPC and of DMPC/cholesterol mixture were recorded in the<br />
same conditions as for the other experiments. The position of first minimum is the same for<br />
both curves; this suggests that the cholesterol molecule does not significantly disturb the<br />
DMPC film structure.<br />
148
Even if the mixed film structure described above seems to correctly reproduce the real<br />
molecular arrangement within the film, one may wonder if the hydrophobic DMPC tail could<br />
not be short enough to penetrate the hydrophobic cyclodextrin cavity. On the basis of an NMR<br />
analysis upon α-cyclodextrin(α-CD)/phospholipids complexes, it was shown 30 that the main<br />
factor governing any interaction between α-CD and lipids was the electrostatic properties of<br />
the lipid headgroup. Fortunately, the interaction was less efficient for the PC headgroup and<br />
the chain inclusion was mostly favored in the bulk phase (aqueous lipid suspension) than in<br />
planar bilayer geometry. One may suppose that these properties remain valid in our case (i.e.<br />
the chain inclusion should be sterically unfavorable). Moreover, it has been already<br />
demonstrated that formation of inclusion complexes between cyclodextrins and phospholipids<br />
can occur 31 .<br />
The evolution of the reflectivity data (see Fig. 7) upon addition of an active drug<br />
(Dosulepin) suggests another specific molecular arrangement within the film, mostly through<br />
Dosulepin/chol-DIMEB complexes formation as previously mentioned in the Results section.<br />
Assuming the above described mixed DMPC/chol-DIMEB film structure (Fig. 9) is reliable,<br />
we can imagine this four-component-film schematically as being formed by a central layer<br />
gathering the cyclodextrin cavities, each of them holding a Dosulepin molecule, embedded<br />
between two external walls composed of cholesterol/DMPC mixtures, standing for the<br />
“biological” membrane 0 . Hence, the overall thickness increase should be mostly related to<br />
partial Dosulepin inclusion inside the cyclodextrin hydrophobic cavity. The charged aliphatic<br />
chain remains outside the cavity.<br />
149<br />
In order to better understand the behavior of the model guest towards the chol-DIMEB<br />
in the mixed DMPC/chol-DIMEB film, we have investigated by 1 H-NMR the conformation of<br />
the inclusion of the Dosulepin in DIMEB in aqueous solution. Inclusion in DIMEB is<br />
evidenced by modification of the spectrum of the host molecule as already described13 but no<br />
conformational analysis of Dosulepin/DIMEB inclusion complex has been reported. Further<br />
NMR experiments were performed to investigate the geometry in solution of this inclusion<br />
complex. The T-ROESY sequence is used to prove the interaction of protons of the host and<br />
guest molecules 32 . As found in many other situations regarding inclusion complexes in water,<br />
0 The DIMEB/Dosulepin complex formation constant is Kc=4610M -1 . If [DIMEB]=1mM and<br />
[Dosulepin]=5mM then [DIMEB/Dosulepin complex]=0.94mM. 94% of the cyclodextrin<br />
cavities should theoretically contain one Dosulepin molecule. See Djedaïni, F., Zhao Lin S.,<br />
Perly, B., Wouessidjewe, D., J. Pharm. Sci., 79, 643 (1990).
a 300ms spin lock was selected. All non-diagonal peaks are indicative of spatial proximity<br />
between protons. Complex formation was demonstrated by the presence of strong dipolar<br />
cross peaks between protons located in the cavity (H3 and H5) of DIMEB and aromatic<br />
protons of Dosulepin. No other cross peak was observed between protons of Dosulepin and<br />
DIMEB, thus precluding interaction of aliphatic chain with the DIMEB cavity.<br />
Nevertheless, this peculiar Dosulepin/chol-DIMEB complexion is not able to explain<br />
the 25 Å thickness increase (the largest theoretical 0 size of the molecule is not more than 9 Å).<br />
The presence of charged molecules and counter-ions in black films modifies the electrostatic<br />
double-layer and entropy confinement forces which results in an increase of the aqueous<br />
interstitial core thickness. Dosulepin is a charged molecule and its presence within the film<br />
could entail this increase. Moreover, this electrostatic repulsion combined with a steric<br />
interaction could be involved in the thickness increase. Besides, neither a five-box model nor<br />
a seven box-model was able to correctly reproduce the experimental reflectivity profile since<br />
very complex interactions could occur in the center of the film.<br />
Conclusion<br />
The present study emphasizes that the X-ray reflectivity technique is sensitive enough<br />
to detect slight molecular changes in Newton Black Film. The effect promoted by inclusion of<br />
cyclodextrins in a DMPC biological membrane model does not entail homogeneous mixed<br />
films at a macroscopic scale but results in a well-defined and organized structure at a<br />
microscopic scale, which remains a five-layer model. The cyclodextrins are anchored in the<br />
membrane through the cholesterol arm making the cavity available for the inclusion of<br />
Dosulepin. Even if some effort is still needed to elucidate the structure of the analogue film<br />
with Dosulepin, the molecular carrier cyclodextrin property is clearly evidenced at molecular<br />
scale. The strategy developed herein should now be extended so as to be able to control the<br />
selective release of the active guest through the aqueous medium.<br />
Acknowledgements: The authors would like to thank C. Braun for the fitting procedure and<br />
Roquette-Frères (Lestrem, France) for the kind gift of the cyclodextrin.<br />
0 The theoretical lengths of the molecule were calculated using chem3D.pro software<br />
simulations.<br />
150
References<br />
151
Figures Captions<br />
152<br />
152<br />
Fig. 1 Chemical formulae of the different molecules studied by X-ray reflectivity a:<br />
chol-DIMEB (6 I -(cholest-5-en-3α-ylamido) succinylamido-6 I -deoxy-per (2,6-di-o-methyl)cyclomaltoheptaose).<br />
The cavity is hydrophobic and may trap non-soluble guest molecules. b<br />
: Dosulepin, neurotropic commercial drug c: DMPC (dimyristoylphosphatidylcholine)<br />
phospholipid composed of two aliphatic chains of 14 carbons and a zwitterionic head.<br />
Fig. 2 Surface tension measurement at 25°C for various solutions () 0.5mg/ml<br />
DMPC () 0.438mg/ml chol-DIMEB (ο) 0.5mg/ml DMPC + 0.438 mg/ml chol-DIMEB,<br />
versus time.<br />
Fig. 3 X-ray reflectivity intensity collected for DMPC films. In inset, we present the<br />
electron density profile normalized to the electron density of the water, extracted from the<br />
data analysis, versus the film thickness. The high electron density gradient within the film and<br />
at the air/film interface implies an important modulation of the reflected intensity with, in<br />
particular, the weak intensity of the second fringe characteristic of the structure of these<br />
lipids8.<br />
Fig. 4 X-ray reflectivity intensity collected from a pure chol-DIMEB film. The lack of<br />
accuracy of these experimental data originates from the short lifetime of this film.<br />
Nevertheless the overall thickness could be determined without ambiguity. In inset, we<br />
present the electron density profile normalized to the electron density of the water, extracted<br />
from the data analysis, versus the thickness of the film. There is no modulation as we use a 1box<br />
model.<br />
Fig. 5 Thickness extracted from experimental reflectivity curves of mixed<br />
DMPC/chol-DIMEB film at various molar ratios R (R=DMPC/chol-DIMEB) versus this<br />
molar ratio R. The bell shape evidences a swelling when more and more cyclodextrin<br />
penetrate the DMPC bilayer with a maximum swelling for R=3.<br />
Fig. 6 Five-layer model fit to the experimental X-ray reflectivity data from a<br />
DMPC/chol-DIMEB mixed film (R=3). In inset, we present the electron density profile<br />
normalized to the electron density of the water, extracted from the data analysis, versus the<br />
thickness of the film. The peculiar modulation of the electron density observed is specific to<br />
the structure of the film.<br />
Fig. 7 Qualitative effect of Dosulepin on the mixed DMPC/chol-DIMEB film (R=3)<br />
measured by X-ray reflectivity : (—) 0.5 mg/ml DMPC + 0.438 mg/ml chol-DIMEB + 0.3<br />
mg/ml Dosulepin (----) 0.5 mg/ml DMPC + 0.438 mg/ml chol-DIMEB. The swelling of the<br />
film is obvious and is mainly ascribed to the Dosulepin/chol-DIMEB complexes occurrence<br />
as Dosulepin alone does not perturb the DMPC bilayer thickness : in inset are presented<br />
reflectivity curves obtained for a pure DMPC film (0.5 mg/ml) and for a DMPC/Dosulepin<br />
film (0.5 mg/ml DMPC and 0.3 mg/ml Dosulepin); the position of the first minimum of these<br />
two curves is rather the same.<br />
Fig. 8 Scheme of a pure amphiphilic cyclodextrin film according to the electron<br />
density profile extracted from reflectivity experiments. The hydrophilic cyclodextrin cavities<br />
occupy the central core of the film with the cholesterol moieties facing the air.<br />
Fig. 9 Proposed structure of a mixed DMPC/chol-DIMEB film with a molar ratio of 3.<br />
The cyclodextrin cavities are embedded between two biological membrane-like walls<br />
composed of cholesterol and DMPC.
153<br />
153
154<br />
154<br />
Fig. 1<br />
I. Javierre et al.
155<br />
155<br />
Fig. 2<br />
I. Javierre et al.
156<br />
156<br />
Fig. 3<br />
I. Javierre et al.
R e f l e c t i v i t y ( I / I 0 )<br />
1 0<br />
1 0<br />
1 0<br />
1 0<br />
1 0<br />
1 0<br />
1 0<br />
- 1<br />
- 2<br />
- 3<br />
- 4<br />
- 5<br />
- 6<br />
- 7<br />
- 8<br />
157<br />
157<br />
w a t e r<br />
E l e c t r o n d e n s i t y ρ / ρ<br />
1 0<br />
0 . 0 5 0 . 1 0 . 1 5 0 . 2 0 . 2 5 0 . 3<br />
S c a t t e r i n g w a v e v e c t o r Q z ( Å - 1 )<br />
Fig. 4<br />
I. Javierre et al.<br />
0 . 4<br />
0 . 3 5<br />
0 . 3<br />
0 . 2 5<br />
0 . 2<br />
0 . 1 5<br />
0 . 1<br />
0 . 0 5<br />
0<br />
0 2 0 4 0 6 0<br />
z ( Å )<br />
B
Thickness (Å)<br />
80<br />
75<br />
70<br />
65<br />
60<br />
55<br />
50<br />
158<br />
158<br />
0 2 4 6 8 10<br />
Molar ratio R=DMPC/Chol-DIMEB<br />
Fig. 5<br />
I. Javierre et al.
Reflectivity (I/I 0 )<br />
10 -1<br />
10 -2<br />
10 -3<br />
10 -4<br />
10 -5<br />
10 -6<br />
10 -7<br />
159<br />
159<br />
Electron density ρ/ρ water<br />
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5<br />
0.8<br />
0.7<br />
0.6<br />
0.5<br />
0.4<br />
0.3<br />
0.2<br />
0.1<br />
Scattering wave vector Q z (Å -1 )<br />
Fig. 6<br />
I. Javierre et al.<br />
0<br />
-20 0 20 40 60 80 100<br />
z (Å)
-2<br />
10 0.5 m g/ml DMPC + 0.438 m g/ml Chol- DIMEB<br />
10 -3 0.5 m g/ml DMPC + 0.438 m g/ml Chol- 10-3 DIMEB+ 0. 3 mg/ml Dosulepin<br />
-4<br />
-510-4 pure DMPC<br />
10<br />
10-610<br />
10 -5<br />
10-7<br />
10-8 0DMPC 0.10.2 + D 0.3 osulepi 0.40. n 5<br />
10 -6<br />
10 -7<br />
0 0.1 Scate 0.2 ring wave 0. vecto 3r Q(Å 0.4 -1) 0.5<br />
z<br />
Ref lectivity (I/I0)<br />
160<br />
160<br />
Fig. 7<br />
I. Javierre et al.
electron density<br />
(ρ/ρwater )<br />
0.4<br />
0.2<br />
0<br />
161<br />
161<br />
0 10 20 30 40 50 60<br />
Fig. 8<br />
I. Javierre et al.<br />
Z (Å)
electron density<br />
(ρ/ρwater) 0.8<br />
0.6<br />
0.4<br />
0.2<br />
0<br />
0<br />
162<br />
162<br />
10 20 30 40 50 60 70 80<br />
Fig. 9<br />
I. Javierre et al.<br />
Z (Å)
Chapitre 2<br />
3.3.2 Article n° 5<br />
163<br />
163<br />
Investigations on vitamin A -loaded amphiphilic cyclodextrin nanocapsules :<br />
characterization and topical application<br />
S. Weisse, M. Skiba, F. Djedaïni-Pilard, B. Perly<br />
International Journal of Pharmaceutics (soumis)
Investigations on vitamin A-loaded amphiphilic cyclodextrin<br />
nanocapsules :<br />
characterization and topical application<br />
S. Weisse 1 , M. Skiba 2 , P. André 4 , B. Perly 1 , F. Djedaïni-Pilard 3<br />
1 Service de Chimie Moléculaire, DSM/DRECAM, <strong>CEA</strong> Saclay, 91191<br />
Gif sur Yvette Cedex, France<br />
2 <strong>Université</strong> de Rouen, UFR médecine-pharmacie, Lab. de pharmacie galénique, 22 bvd<br />
Gambetta, 76000 Rouen, France<br />
3 <strong>Université</strong> de Picardie Jules Verne, Laboratoire des Glucides,<br />
33 rue S t Leu, F-80039 Amiens, France<br />
4 LVMH – Laboratoire de recherche et développement – Branche Parfums et Cosmétiques<br />
45800 St Jean de Braye, France.<br />
INTRODUCTION<br />
Since a number of years, a special attention has been paid to the preparation of amphiphilic<br />
cyclodextrins (CD) in order to use them as new compounds for the preparation of carriers<br />
(like nanoparticles [1]) or to insert them in a preformed lipidic matrix such as liposomes.<br />
Among these, the cholesteryl-CD (obtained by grafting a single cholesterol on a CD) have<br />
already proven their interest : it has been shown that cholesteryl-βCD induces a high disorder<br />
into phopholipid bilayers and that cholesteryl-Dimeb forms highly soluble micelles in water,<br />
and still retains its inclusion properties [2,3,4]. We focus here on a new cholesteryl-CD<br />
derivative designed to obtain nanoparticles to be loaded with a lipophilic drug i.e vitamin A<br />
propionate (PVA). The vitamin A loaded particles are then to be used to form a aqueous gel<br />
and study the penetration of the vitamin A propionate after topical application on human skin.<br />
EXPERIMENTAL<br />
Materials<br />
164<br />
164
Vitamin A propionate A or PVA (2.5 Mio I.E/g) was obtained from BASF (Germany) and<br />
randomized per-(2,6-O-dimethyl)-β-cyclodextrin (Rameb) from WACKER (Germany). All<br />
chemicals were purchased from Fluka and used without further treatments. Deuterated<br />
solvents were purchased from Euriso-Top (Saclay-France). Pluronic ® PEF68, a poly(ethylene<br />
oxide)-poly(propylene oxide) block copolymer was chosen as nonionic surfactant.<br />
Synthesis of Heptakis (2,3-di-O-acetyl)-hexakis (6-o-acetyl)-6 I -5cholest-5-en-3β-<br />
yloxycarbonyl) amino-6 I -deoxycyclomaltoheptaose (Chol-βCD-Ac) (Fig 1)<br />
Synthetic pathway to final compound of Chol-βCD-Ac involved the preparation of 6I-<br />
(cholest-5-en-3b-yloxycarbonyl) amino-6I-deoxy cyclomaltoheptaose () synthetized in four<br />
steps from the parent cyclodextrin as described in [2].<br />
The reaction of 80 equivalents of acetic anhydride in pyridine under standard conditions<br />
offered Chol-βCD-Ac quantitatively : acetic anhydride (985µL, 80 eq.) was added to a<br />
solution of freeze-dried (243.6 mg, 0.157 mmol) in dry pyridine (5 mL). The reaction<br />
mixture was stirred for the dedicated time at room temperature under nitrogen. The reaction<br />
was stopped by addition of methanol (2 mL). The reaction mixture was washed with HCl 1N<br />
(2*20 mL), satured aqueous solution of Na2CO3 (2*20 mL) and water (2*5 mL). After<br />
evaporation of most of the solvant, the crude residual sirup was precipitated by addition of<br />
water. The crude product was isolated by filtration, washed with water and dried.<br />
The chemical structure of Chol-βCD-Ac was assessed using high resolution 1 H-NMR and<br />
Mass spectrometry.<br />
Fig 1. Chemical structure of Chol-βCD-Ac<br />
165<br />
165
Fig 2. Chemical structure of vitamin A propionate<br />
NMR study<br />
H 3 COCO<br />
NHCOO<br />
O<br />
H 3 COCO O<br />
O<br />
H 3 COCO<br />
Me<br />
166<br />
166<br />
OCOCH 3<br />
O<br />
Me<br />
OCOCH 3<br />
6<br />
OCOC 2 H 5<br />
CHMe2
1 H-NMR experiments were performed at 500.13 MHz using a Bruker DRX500 spectrometer<br />
using the pulse programs available from the Bruker library. All measurements were performed<br />
at 25°C under careful temperature regulation (+/- 0.1K). Chemical shifts are given relative to<br />
external tetramethylsilane (TMS=0 ppm) and calibration was performed using the signal of<br />
the residual protons of the solvent as a secondary reference. All NMR data were processed<br />
and plotted using the UXNMR program and an INDY work station (Silicon graphics). Scalar<br />
correlation (COSY, Relay experiments) were processed in the absolute value mode after zero-<br />
filling resulting in a 1K×1K data matrix. For dipolar correlation (ROESY experiment), the<br />
phase sensitive (TPPI) sequence was used and processing resulted in a 1K × 1K matrix.<br />
HPLC measurement<br />
For all PVA assays we used a BECKMAN system Gold chromatograph with a Merck<br />
Lichrosher 125-4 RP18 (5 µM) column and a Beckman led array detector, mobile phase was<br />
acetonitrile/water 90/10 v/v at 1mL/mn -1 . Detection of PVA at 325 nm, retention time is 9<br />
min.<br />
Mass Spectrometry study<br />
High Resolution Mass Spectrometry was performed at the CRMPO at University of Rennes,<br />
France, on a ZabSpec TOF (MicroMass). Electrospray ionisation of Chol-βCD-Ac (infusion<br />
at 5µL/min of a 0.01 mg/mL solution in water-acetonitril 1/1 (v/v)) with positive ion detection<br />
leads to a series of protonated molecules, [M+H] + , at m/z values depending on the number of<br />
acetyl groups in each of the individual sugar unit of the β-cyclodextrin derivative.<br />
Microscopy<br />
Transmission electronic microscopy was performed with a Philips CM2000 with 80kV<br />
tension.<br />
Preparation of the nanoparticles<br />
167<br />
167<br />
Nanospheres and nanocapsules of Chol-βCD-Ac were prepared according to the method<br />
developped by Skiba et al [5,6]. Briefly, to obtain nanocapsules loaded with PVA, a lipophilic<br />
phase, constituted by vitamin A propionate and Chol-βCD-Ac is dissolved in acetone and<br />
added under mechanical stirring to an aqeous phase with surfactant (Pluronic ® PEF 68). The<br />
nanocapsules are formed immediatly, and acetone is removed by evaporation under vacuum
together with part of the water to obtain a suspension of the desired concentration. Unloaded<br />
nanospheres can be obtained exactly in the same way by using a lipophilic phase containing<br />
only the CD dissolved in acetone.<br />
Particles size distribution<br />
The mean nanoparticle size and size distribution were determined by photon correlation<br />
spectroscopy using a Nanosizer instrument N4MD (Beckman Coultronics, Roissy, France)<br />
which analyses the fluctuation in scattered light intensity generated by diffusion of the<br />
nanoparticles in suspension. Experimental conditions were : temperature, 25°C ; reference<br />
index 90° ; viscosity, 0.899 10 -3 Pa ; refractive index, 1.33.<br />
Long-term stability study<br />
Fifteen mL aliquots of the nanocapsules suspension prepared as described above were<br />
transferred into ampules which were sealed and stored at 4, 25 and 40°C. Every week, an<br />
ampule was opened and the sample pipetted, diluted to the appropriate concentration with<br />
water and the mean size and size distribution were determined.<br />
Zeta potential<br />
The charge of nanocapsules were obtained from the measurement of electrophoretic mobility<br />
by laser Doppler velocimetry with a Coulter Zetameter Delsa 440 SX. The operating principle<br />
is based on the Doppler shift induced by the movement of particles across interference fringes<br />
which are produced by the intersection of two laser beam. The nanocapsules were suspended<br />
in 10 -3 M KCl and measurements were made at 25°C.<br />
Vitamin A content<br />
The vitamin A content of the nanocapsules was analyzed using HPLC as described above,<br />
after dissolution of the nanoparticles in acetonitrile. Encapsulation efficiency (percent) was<br />
estimated from the drug content found in the nanocapsules and the initial drug content added<br />
in the formulations.<br />
Preparation of aqueous gels<br />
168<br />
168<br />
For the Rameb/PVA gel, we prepared an aqueous solution of the Rameb/PVA complex as<br />
previously described [7], with initial concentrations of 40 mM and 400 mM for PVA and<br />
Rameb respectively, reaching up to 9 mg/mL PVA. The solution was then diluted to obtain
1mg/mL PVA and 1.8% w/w Natrosol ® (hydroxyethylcellulose, Hercules. Inc. USA) was<br />
added to form the gel. For the nanocapsules gel, 1.8% w/w Natrosol ® was added to a solution<br />
containing 0.97 mg/mL PVA.<br />
Skin penetration study<br />
169<br />
169<br />
This study was performed on fresh human skin pieces. It is well known that the main barrier<br />
function of the skin is played by the upper epidermis called stratum corneum (or horny layer,<br />
made of layers of dead keratinocytes surrounded by lipidic sheets) and, on a smaller scale, by<br />
the epidermis (alternate lipophilic and hydrophilic layers). Therefore, as described in the<br />
litterature we chose to remove the hypodermis (fat) and dermis because those thick layers<br />
would stored the PVA and prevent us from having detectable amount in the receptor liquid.<br />
The purpose of this work is to determine the amount of vitamin A propionate which<br />
penetrates into the different layers of the skin, from our PVA-loaded nanospheres aqueous gel<br />
and a reference gel. We used a device containing 15 Franz-type cells (surface 2 cm 2 , receptor<br />
liquid volume 4.2mL) in a 37°C thermostatic bath. The receptor liquid contains phosphate<br />
buffer 10 mM, NaCl 120 mM, KCL 2.7 mM, pH 7.4 (Sigma) sodium azide 0.1% w/w, ethanol<br />
(20%v/v) and a surfactant (polyoxyethylene polyoxypropylene butyl ether, polyethylated<br />
hydrogenated castor oil, purified water : Wackherr colorants) 4% v/v. On each cell, exactly 1g<br />
of gel was deposited (8 cells for the Rameb/PVA gel and 7 cells for the nanocapsules gel) and<br />
covered with Parafilm ® . After 24 hours, the cells were dismantled, the excess gel on the<br />
surface was removed and the skins were treated as such: the stratum corneum was collected<br />
by the stripping method (7 strippings, pression 300 g/cm 2 , time 12 sec., D’Squam ® , Eviderm<br />
corporation, Dallas) and the PVA extracted by solubilization in 2 mL methanol and after 2<br />
hours agitation, filtered (0.22µm) then assayed by HPLC. For the epidermis, the PVA was<br />
extracted by solubilization in 2 mL methanol and after 2 hours agitation, filtered ( 0.22 µm)<br />
then assayed by HPLC. The receptor liquid was assayed directly by HPLC. The gels were<br />
submitted to the following treatments before PVA assays: 250 µL were sampled and sonicated<br />
in 25 mL isopropanol to release PVA from the cellulose matrix, then filtered on 0.22µm filter.<br />
A sample of each gel was kept to be assayed in time and determine long term stability of PVA<br />
in the gels. The percentage of initial amount of PVA that has passed is calculated from the<br />
concentration found in each layer. The results of the PVA assays were statistically analyzed<br />
using the StatAdvisor Software. This procedure uses a multifactor analysis of variance. The<br />
F-Test in the Anova table allows to identify the significant factors and for each one, the
Multiple Range Test determine which means are significantly different from which other and<br />
which Confidence Interval must be applied to this conclusion.<br />
Results and discussion<br />
Characterization of Chol-βCD-Ac<br />
During the development of the synthesis of Chol-βCD-Ac, it was noticed that the percentage<br />
of acetylation depends on the duration time of the acetylation reaction. Since each<br />
cyclodextrin contains 20 hydroxyls (one is taken by the liaison with cholesterol) susceptible to<br />
be acetylated, Mass Spectrometry can indicate exactly how many acetyls are present on each<br />
species and the percentage of each species in the mixture (Fig. 3). The mass spectra reflect the<br />
average distribution of the acetyl groups in all individual units of the Chol-βCD-Ac molecule.<br />
With a reaction time of 8 h, no peracylated compound is formed and the three major<br />
compound are the 14, 15 and 16 acetyls compounds. With 24 h reaction time, a few<br />
peracetylated compounds is formed and the three major compounds are the 16, 17 and 18<br />
acetyls compounds. Finally, with a reaction time of 72 h, the majority of the species formed<br />
are peracetylated (72 %), 19-acetylaed (18%) and 18-acetylated (9%). The different batches<br />
were used to determine the feasibility of nanoparticles. In all cases it was possible to form<br />
blank nanospheres without surfactant. The nanospheres obtained showed a large distribution<br />
of size (50-500nm).Their stability seemed to depend upon the percentage of acetylation and<br />
the presence of some free hydroxyls seemed to be required to stabilize the nanoparticles. This<br />
phenomenon has already been observed with “skirt-shaped” cyclodextrins [8,9]. The more<br />
rapid sedimentation was observed when peracetylated Chol-βCD-Ac was used. Therefore it<br />
was<br />
170<br />
170
a)<br />
Fig 3. Mass spectrograms of acetylated species obtained by acetylation of Chol-βCD<br />
after a) 8h reactin time b) 72 h reaction time.<br />
decided that all following experiments would use only batches containing no peracetylated<br />
species i.e with acetylation time reaction of 8 h.<br />
NMR analysis was performed in d6-dmso since Chol-βCD-Ac is insoluble in water and<br />
demonstrated that the purified final samples were free of any included by-product of reagent.<br />
The monosubstitution by cholesteryl derivative and the yield of acetylation have been<br />
confirmed by digital integration of the NMR spectra arising from cholesterol, cyclodextrin and<br />
acetyl moieties. The identification of most of the proton signal was derivated from<br />
comparison of the proton signals of , already characterized [2]<br />
Chol-βCD-Ac is highly soluble in acetone, dmso, ether but completely insoluble in water.<br />
Loaded nanocapsules<br />
The general preparation procedure described above allowed us to produce nanoparticles with<br />
high reproducibility from batch to batch. Before choosing the more suitable formulation for<br />
the loaded nanocapsules, many were tested, regarding the size of the formed particles. A few<br />
examples are presented in Table I.<br />
171<br />
171<br />
Formulation surfactant (mg) Chol-βCD-Ac<br />
PVA size (nm)<br />
A 10<br />
(mg)<br />
0 7.5 146 ± 78<br />
b)
B 10 15 0 105 ± 34<br />
C 10 15 7.5 117 ± 43<br />
D 10 15 30 145 ± 55<br />
E 10 30 30 121 ± 33<br />
F 10 30 26.25 131 ± 41<br />
G 15 15 7.5 131 ± 34<br />
H 15 15 15 121 ± 59<br />
I 15 15 30 131 ± 39<br />
Table I : composition and size measurement of preliminary formulations<br />
Since the determination of the feasibility of nanoparticles with Chol-βCD-Ac proved that<br />
nanoparticles without surfactants exhibit a poor stability, 10 or 15 mg surfactants were used<br />
for the preparation of loaded nanocapsules. With the stabilizing effect of the surfactant, we<br />
were able to form 100 nm diameter nanocapsules with low degree of polydispersity. A-D<br />
formulations showed rapid sedimentation (inf. 4 days) and size increased due to the<br />
aggregation of the particles. Formulations E-I exhibited a mean diameter of around 130 nm, a<br />
low degree of polydispersity and a spherical shape of nanocapsules visualized by transmission<br />
electronic microscopy. We chose to use formulations similar to G, H and I (15 mg CD and 15<br />
mg surfactant) to investigate the drug loading ability of our carrier. Results are presented in<br />
Table II.<br />
Formulation Initial drug<br />
content* (mg)<br />
Chol-βCD-<br />
Ac content<br />
(mg)<br />
172<br />
172<br />
drug loading<br />
(µg/mg CD)<br />
encapsulation<br />
%<br />
mean<br />
diameter<br />
(nm) ± SD<br />
F0 7.33 0 2.45 132 ± 36<br />
F1 7.33 15 150 30 102 ± 37<br />
F2 14.66 15 168 17 107 ± 42<br />
F3 18.3 15 270 22 112 ± 27<br />
F4 22 15 306 20.8 159 ± 83<br />
F5 25.6 15 300 17.5 109 ± 23<br />
F6 29.3 15 480 24.5 124 ± 49<br />
F7 33 15 564 25.6 129 ± 56<br />
F8 36.6 15 600 24.6 141 ± 61
*always for 15 mg surfactant<br />
Table II : Chol-βCD-Ac nanocapsules loaded with vitamin A propionate<br />
Table II shows the influence of the initial content of PVA added in the organic phase. As the<br />
initial amount of PVA increases, the drug loading increase as well, indicating high loading<br />
possibilities for this type of carrier. However, the encapsulation efficiency of the cyclodextrin<br />
does not increase with the concentration of PVA. This phenomenon has already been observed<br />
for nanospheres [10]. The authors indicated that the encapsulation efficiency increase with the<br />
concentration of the drug , reaches a maximum then decreases. In the case of PVA the<br />
maximum encapsulation is obtained with a small quantity, 7.5 mg, and further increase in the<br />
concentration of PVA With respect to particle size measured by the photon correlation<br />
spectroscopy, no significant differences were observed for the above mentioned formulations.<br />
The mean diameter of around 130 nm, the low degree of polydispersity and the spherical<br />
shape of the cyclodextrins nanocapsules were also visualized by transmission electron<br />
microscopy (Fig. 4). The mean diameter of the nanocapsules is very close for all formulations<br />
and therefore independent of the concentration of PVA.<br />
Fig 4. Electron microscopy of a water dropplet containing PVA-loaded nanocapsules<br />
of βCholAc.<br />
173<br />
173
These results suggest that the external layer of Chol-βCD-Ac is very rigid and do not allow<br />
any swelling of the PVA core. This is probably a consequence of the rigidity of the Chol-<br />
βCD-Ac which was synthetized without a spacer between the cholesterol and the CD.<br />
In the F0 formulation, no CD was used and the nanoparticles formed are made only of PVA<br />
and surfactant. The formation of nanoparticles of PVA alone can also be achieved very easily,<br />
but the nanoparticles tend to aggregates and a water/oil phase separation rapidly occurs. When<br />
using surfactant, the stability of the suspension can be improved by the formation of mixed<br />
micelles but the chemical stability of the PVA is rapidly lost and degradation is caused by<br />
light and oxydation.<br />
The chemical integrity of the PVA in the nanocapsules could not be followed by 1 H NMR<br />
since the signals of the PVA are mostly covered by those of the cyclodextrin. Hence, we used<br />
HPLC, and chromatograms obtain by dilution of 7 days old nanocapsules in acetonitril<br />
showed the same peaks as the chromatogram of fresh PVA alone in acetonitril. Some smaller<br />
peaks precede that of PVA and represent vitamin A alcohol and by-products present in the<br />
commercial form we used (data not shown).<br />
The zeta potential is related to the charge on the surface of the particles, and so influences the<br />
properties of the particles, like aggregation or distribution in biological media. The zeta<br />
potential of the nanocapsules without surfactant approches zero. Such dispersions are not<br />
electronically stable and tend to aggregate, as reported above. All loaded nanocapsules<br />
formulations, containing the same concentration of surfactant, exhibit quite the same zeta<br />
potential (- 25 ± 5 mV) indicating that it is most probably located at the surface of the<br />
nanocapsule and must interact with the CD molecules. The negative charge at the surface of<br />
the nanocapsules results in strong repulsion one to another and therefore a stable suspension is<br />
obtained.<br />
Since the cholesterol moiety is the more hydrophobic part of the Chol-βCD-Ac, it is probably<br />
oriented towards the oil that constitutes the inner part of the nanocapsules, while the CD<br />
moiety interacted with the external aqueous phase. The Chol-βCD-Ac molecules must<br />
constitute a single layer around the oil dropplet, like a wall, since no swelling of the<br />
nanocapsules was observed when the concentration of CD was increased.<br />
Stability<br />
174<br />
174<br />
Long term stability study indicated that nanocapsules could be conserved for 4 months at 25<br />
and 37°C without any change in their diameter or polydispersity index.
Skin penetration studies<br />
We described in previous papers [7,11] the use of the Rameb/PVA complex to form an<br />
aqueous gel and the resulting concentration of PVA and Rameb in the skin following 24h<br />
contact. Since we know the Rameb/PVA gel allow higher penetration of PVA in the skin,<br />
compared to a reference aqueous gel of PVA alone, we choose to use it as reference in this<br />
particular experiment. Batch F8 was chosen to form an aqueous gel because of its high drug<br />
loading. The concentration of PVA in the F8 solution being 0.97 mg/mL, and that of the<br />
Rameb/PVA solution being 9 mg/mL, the latter was diluted to obtain the same concentration<br />
of PVA in the two gels.<br />
Results of the PVA assays in stratum corneum, epidermis and receptor liquid are presented in<br />
Table III, and expressed as % of initial amount of PVA recovered in each layer.<br />
cell number SC Epiderme LR<br />
1 0,278 ND 0,007<br />
3 1,222 0,091 0,051<br />
5 0,407 0,022 0,006<br />
Rameb/PVA 7 0,356 0,028 0,007<br />
gel 9 0,333 0,026 0,079<br />
11 0,444 0,063 ND<br />
13 0,422 0,036 0,047<br />
15 0,444 0,089 0,009<br />
mean 0,488 0,051 0,029<br />
deviation 0,302 0,030 0,029<br />
2 0,240 0,130 0,021<br />
4 0,560 0,130 ND<br />
nanocapsule 6 0,234 0,098 0,021<br />
gel 8 0,204 0,085 0,029<br />
10 0,270 0,090 0,055<br />
12 0,200 0,070 0,034<br />
14 0,190 0,066 0,025<br />
ND = not determined<br />
175<br />
175<br />
mean 0,271 0,096 0,031<br />
deviation 0,130 0,026 0,013<br />
Table III : Results of the PVA assays in stratum corneum, epidermis and receptor expressed<br />
as % of initial amount of PVA recovered in each layer.
The results, after statistical analysis indicate that there is no meaningful difference between<br />
the two gels, when regarding all compartments together. However, statistically different<br />
results appear when regarding the stratum corneum alone and the epidermis alone. In the<br />
stratum corneum (upper layer), the amount of PVA is significantly higher when using the<br />
Rameb/PVA gel whereas in the epidermis the amount of PVA is significantly higher when<br />
using the PVA-loaded nanocapsules. As a consequence, and based on one experiment only, it<br />
is not possible to determine if one gel induce a greater penetration. But, since we found<br />
different amount of PVA in different layers after 24 h, we can suppose that the difference in<br />
the nature itself of the interaction between PVA and cyclodextrins in the two gels induce a<br />
different rate of permeation in the skin. Indeed, in the Rameb /PVA complex, we are dealing<br />
with direct inclusion and a molecular carrier but in the case of the nanocapsules, the PVA is<br />
stored in the core of the nanocapsules wich represents a particle-like carrier.<br />
Conclusion<br />
Chol-βCD-Ac were proved suitable for the manufacture of nanospheres and nanocapsules.<br />
The oily nature of vitamin A propionate leads to the formation of nanocapsules where PVA<br />
represents the core and Chol-βCD-Ac is located at the surface of the dropplet and represents<br />
an external monolayer which interacts with the surfactant to improve the stability of the<br />
nanocapsules. A reproductible size distribution was obtained, along with long term stability.<br />
The aqueous suspension can be used to form a gel which allow to achieve good penetration, in<br />
the skin, of the PVA encapsulated. Since we know CD in general are able to penetrate in the<br />
skin, investigations should be performed regarding the amount of Chol-βCD-Ac that reach<br />
the different skin layers. Production of specific antibodies directed against this particular<br />
cyclodextrin is presently underways and will allow us to perform enzymatic immunoassays on<br />
skin samples.<br />
176<br />
176
References<br />
177<br />
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diméthylée. FR 02.01241.
178<br />
178<br />
3.2.3 DISCUSSION
3.3.3 DISCUSSION<br />
179<br />
179<br />
Il semble nécessaire de resituer le premier article de ce chapitre par rapport à la ligne<br />
directrice de ce travail de thèse. Le travail effectué avec la Chol-Dimeb s’intègre dans une<br />
démarche plus fondamentale visant à mieux comprendre les mécanismes d’interactions des<br />
cholestéryl-CD avec des membranes biologiques modèles à l’aide de méthodes physiques.<br />
Cette étude nous a paru nécessaire afin d’essayer de mieux comprendre les différentes<br />
interactions impliquant le trio hôte/invité/membrane. Même si les résultats obtenus sont<br />
encore préliminaires, ils nous permettent de mieux appréhender la structure chimique des CD<br />
capables de s’insérer dans des systèmes organisés (en particulier du point de vue de la balance<br />
hydrophile/hydrophibe). Le travail effectué en utilisant les films noirs nous apprend qu’une<br />
cyclodextrine particulière, la Chol-Dimeb, peut s’insérer dans des films phopholipidiques par<br />
sa partie cholestérol. Cette propriété doit être reliée à la présence du bras espaceur succinique<br />
entre le cholestérol et la Dimeb. En effet, il en résulte une certaine souplesse de la molécule<br />
qui permet d’adapter la position du cholestérol (rotation, fermeture ou ouverture de l’angle de<br />
liaison) à son environnement. Dans ce cas précis, on note que l’épaisseur d’un film de DMPC<br />
augmente avec l’ajout de Chol-Dimeb, en passant par un maximum pour un rapport<br />
DMPC/Chol-Dimeb de 3. Cela signifie qu’il y a réarrangement moléculaire au fur et à mesure<br />
de l’ajout de Chol-Dimeb. Les molécules de DMPC s’arrangent autour du cholestérol de<br />
façon différente en fonction de la quantité de Chol-Dimeb et profitent donc de la souplesse de<br />
ce dernier. La partie cyclodextrine de la Chol-Dimeb est exposée au milieu aqueux, d’abord<br />
dans la solution puis dans le film noir, et reste ouverte à l’inclusion d’une molécule hôte. Le<br />
PVA n’a pas été utilisé dans ces essais car son inclusion dans la Chol-Dimeb n’a pu être<br />
démontré, à cause de son insolubilité dans l’eau.<br />
Ces résultats ne sont bien sur pas transposables à la Chol-βCD-Ac dont les propriétés<br />
physico-chimiques sont très différentes. Toutefois ils permettent de supposer que la partie CD<br />
de la molécule gardera une préférence pour le milieux aqueux et qu’à l’interface phase<br />
hydrophile/phase hydrophobe ces molécules s’orienteront de manière à présenter le<br />
cholestérol à la phase hydrophe. Il s’agit d’un résultat bien connu avec les CD amphiphiles
mais que l’on peut effectivement visualiser et mettre à profit dans le cas des films noirs de<br />
Chol-Dimeb.<br />
180<br />
180<br />
La Chol-βCD-Ac est une molécule rigide, car ne possédant pas de bras espaceur, et<br />
absolument insoluble dans l’eau. Comme beaucoup de molécules possédant une partie<br />
hydrophobe et une partie hydrophile, elle s’est révélée parfaitement apte à former des<br />
nanosphères et des nanocapsules. Ces agrégats sont toutefois peu stables en solution et<br />
sédimentent rapidement. Cela est du au fait qu’ils ont une charge de surface quasiment nulle<br />
et ne provoquent donc pas de répulsion électrostatique. Il a donc été nécessaire d’ajouter un<br />
tensioactif afin d’obtenir une bonne stabilité en solution. Par la suite, c’est la nature huileuse<br />
du PVA qui a imposé le choix du vecteur à utiliser. En effet, les premiers essais ont révélé<br />
qu’il était impossible de former des nanosphères chargées en PVA. Par contre, des<br />
nanocapsules remplies de PVA sont obtenues facilement et présentent un diamètre moyen<br />
d’environ 130 nm avec une faible polydispersité. Connaissant les affinités respectives de la<br />
partie cyclodextrine et de la partie cholestérol, il semble raisonnable de penser que la Chol-<br />
βCD-Ac se situe à l’interface eau/huile avec les têtes-cholestérol dirigées à l’intérieur de la<br />
gouttelette d’huile. Le tensio-actif se situe aussi à l’interface eau/huile, comme indiqué par la<br />
chute de potentiel zéta qu’il provoque. Grâce à la formation de ces nanocapsules chargées, on<br />
obtient une suspension aqueuse de PVA dont la concentration peut atteindre 1mg/mL. Ce<br />
chiffre est inférieur à la quantité de PVA que l’on peut solubiliser avec le complexe<br />
Rameb/PVA, mais il est possible que nous n’ayons pas encore atteint la limite en terme de<br />
formulation des nanosphères et une concentration de 1mg/mL permet néanmoins de passer à<br />
l’application biologique. En effet, la limite de détection du dosage par HPLC du PVA (0.1<br />
ppm) impose de faire des essais avec une concentration initiale suffisante. Le dosage du PVA<br />
dans les couches cutanées, après application d’un gel aqueux contenant la suspension de<br />
nanocapsules, démontre que ce vecteur est au moins aussi efficace que le gel à base de<br />
Rameb/PVA pour améliorer la pénétration du PVA dans la peau. Ces deux vecteurs sont<br />
pourtant fondamentalement différents quant à leur nature puisque l’un présente le PVA sous<br />
une forme moléculaire alors que le second amène le PVA sous forme particulaire. Bien<br />
qu’une seule expérience de pénétration sur peau aie été effectuée avec les nanocapsules et ne<br />
nous permette pas d’être catégorique, il semble que ces 2 vecteurs aient néanmoins des<br />
cinétiques de pénétration différentes. En effet, bien que la quantité de PVA totale retrouvée<br />
dans la peau ne soit pas significativement différente dans les 2 cas, il existe des différences<br />
significatives lorsque l’on regarde chaque compartiment séparément. La nature du vecteur<br />
influe donc sur la pénétration du PVA, probablement à la fois sur la vitesse de diffusion dans
la couche aqueuse de surface, et au niveau du passage des couches lipophiles et hydrophiles<br />
alternées de l’épiderme.<br />
Un certain nombre d’investigations restent à mener sur ces nanocapsules chargées en<br />
PVA. Tout d’abord concernant la reproductibilité des résultats de pénétration sur peau<br />
obtenus, d’autres expériences sont nécessaires afin de déterminer clairement les différences de<br />
cinétique pouvant exister par rapport au complexe Rameb/PVA et afin d’établir le profil de<br />
pénétration du PVA.<br />
La stabilité à long terme et l’intégrité chimique du PVA dans les nanocapsules doivent<br />
être confirmées, soit en séparant par chromatographie liquide le PVA de la Rameb avant<br />
analyse RMN pour pouvoir visualiser les signaux du PVA, soit par spectrométrie de masse.<br />
Le dosage des Chol-βCD-Ac dans les échantillons biologiques, dont le principe sera plus<br />
longuement détaillé dans la conclusion, permettrait de connaître le comportement de ce<br />
vecteur par rapport aux membranes biologiques. D’autres principes actifs doivent aussi être<br />
testés pour évaluer l’intérêt général des nanoparticules de Chol-βCD-Ac dans le domaine de la<br />
vectorisation.<br />
181<br />
181
182<br />
182<br />
CONCLUSION GENERALE
CONCLUSION GENERALE<br />
Au cours de cette étude, de nombreuses techniques ont été utilisées, de nouvelles formes<br />
galéniques de vitamine A mises au point, de nouvelles molécules créées et certaines questions<br />
ont pu trouver leur réponse.<br />
L’objectif de ce travail était de se servir des cyclodextrines, molécules cages dont les<br />
propriétés ne se limitent pas à l’inclusion de molécules hôtes, afin de :<br />
- stabiliser la vitamine A vis à vis de la dégradation par l'oxygène, la température et<br />
surtout la lumière.<br />
- de former un composé hydrosoluble permettant de disposer de nouvelles formulations.<br />
- de s’assurer que le principe actif soit dirigé et reste dans les strates de la peau où<br />
son action sera optimale.<br />
En ce sens, nous pouvons affirmer que l’objectif principal a été atteint.<br />
Après avoir essayer les cyclodextrines naturelles sans obtenir d’augmentation de la<br />
solubilité aqueuse du PVA, l’utilisation de la Rameb nous a permis d’obtenir un complexe<br />
hydrosoluble, de stoechiométrie 1/1 et parfaitement caractérisé par RMN et HPLC. En<br />
déterminant les conditions optimales de préparation, nous avons pu obtenir une solution<br />
aqueuse contenant jusqu’à 9 mg/mL de propionate de vitamine A. La stabilité du PVA dans<br />
cette formulation a été établie sous forme aqueuse et lyophilisée et si elle n’atteint que 15<br />
jours dans le premier cas, elle peut atteindre 6 mois dans le second et ceci dans les pires<br />
conditions de stockage (à la lumière, à 25 °C).<br />
183<br />
183<br />
L’obtention de cette solution de propionate de vitamine A a permis de développer un<br />
gel aqueux contenant en moyenne 0.8% de PVA et 50% de Rameb. Ce pourcentage de PVA<br />
semble ridiculement faible par rapport à celui de la Rameb mais c’est dans cette zone de<br />
concentration que la vitamine A est thérapeutiquement active au niveau cutané. Afin de<br />
déterminer si cette nouvelle formulation aqueuse pouvait améliorer la pénétration du PVA<br />
dans la peau, nous avons testé notre gel contre des formulations de référence sur des<br />
échantillons de peau, en utilisant des cellules de Franz.<br />
Les résultats ont montré que la formulation contenant le PVA sous forme de complexe<br />
permettait une augmentation significative de la quantité de PVA retrouvée dans la peau par
apport aux formulations de référence. La peau étant l’organe cible, nous avons donc amélioré<br />
la biodisponibilité du PVA, et ceci grâce à un procédé de préparation simple et économique.<br />
Mais le PVA n’est pas la seule espèce dont nous avons pu suivre le cheminement au<br />
travers de la peau. Grâce à des anticorps dirigés spécifiquement contre la Dimeb, nous avons<br />
pu déterminer la quantité de Rameb dans les différentes couches cutanées par dosage<br />
immuno-enzymatique. Les études de pénétration sur peau présentent donc un double intérêt<br />
puisque le comportement des CD dans la peau est encore loin d’être parfaitement décrit et<br />
expliqué. On savait déjà que les CD pénétraient de façon non négligeable dans la peau, malgré<br />
leur haut poids moléculaire. Pour certaines CD cela se fait grâce à leur propriété à inclure<br />
certains constituants des membranes phospholipidiques et pour d’autres c’est leur nature<br />
amphiphile qui favorise la pénétration.<br />
De nombreux éléments recueillis au cours de cette étude nous permettent de penser<br />
que le complexe d’inclusion formé permet de faciliter la diffusion du PVA dans la couche<br />
aqueuse en surface de la peau et d’amener une plus grande quantité en contact avec les<br />
couches superficielles de l’épiderme. En effet, nous avons montré que l’effet promoteur<br />
d’absorption de la Rameb n’existe que si le complexe se forme avec le PVA et n’est pas du à<br />
la seule présence de la Rameb dans la forme galénique. De plus, il faut impérativement que le<br />
complexe soit soluble. Une fois dans les couches superficielles de l’épiderme, il semblerait<br />
que la Rameb et le PVA se séparent. En effet, le rapport des concentrations de Rameb et de<br />
PVA, fixe dans le gel, subit d’importantes variations dans l’épiderme et les couches plus<br />
profondes. La Rameb semble ensuite diffuser facilement dans le derme, couche hydrophile, et<br />
au-delà, alors que celui-ci représente un organe de stockage et de métabolisation pour le PVA.<br />
Malheureusement, les outils nous manquent à l’heure actuelle pour déterminer plus<br />
précisément le comportement exact du complexe dans la peau. Cela nécessiterait en effet de<br />
trouver une méthode de dosage différenciant le complexe entier de la Rameb, une fois dans la<br />
peau.<br />
184<br />
184<br />
Dans le but d’explorer d’autres propriétés des cyclodextrines en général, nous avons<br />
synthétisé un dérivé de cholestéryl-cyclodextrine, la Chol-βCD-Ac, aux propriétés très<br />
différentes de celles de la Rameb, et à partir duquel il est possible de former des<br />
nanoparticules. L’incorporation de PVA dans des nanocapsules à base de Chol-βCD-Ac s’est<br />
avérée efficace grâce à la nature huileuse du PVA et a ensuite permis de préparer une<br />
suspension aqueuse pouvant contenir jusqu’à 1 mg/mL de PVA. L’étude de la stabilité de la
suspension ne montre aucun signe de sédimentation après 4 mois à température ambiante. Il<br />
est à noter que la présence de quelques hydroxyles libres semble favoriser la stabilité de la<br />
suspension suggérant de possibles interactions des têtes cyclodextrines entre elles.<br />
Nous avons alors pu formuler un gel aqueux à partir de cette suspension de nanocapsules et<br />
tester son efficacité en terme de pénétration de PVA, par rapport au gel contenant le complexe<br />
Rameb/PVA.<br />
Deux objectifs étaient attachés à cette étude.<br />
Tout d’abord évaluer l’intérêt des nanocapsules de Chol-βCD-Ac par rapport au complexe<br />
Rameb/PVA. A ce niveau, une seule expérience n’offre aucune réponse définitive mais nous<br />
permet d’observer que si la quantité totale de PVA retrouvée est très proche, la cinétique de<br />
pénétration impliquée est probablement différente.<br />
Le second objectif était de déterminer le comportement de la Chol-βCD-Ac dans la peau. En<br />
effet, elle possède des propriétés différentes de celles de la Rameb et il est intéressant de<br />
savoir si ses possibles interactions avec les membranes lui confèrent un passage transcutané<br />
différent.<br />
Toutefois, les outils nécessaires pour doser la Chol-βCD-Ac dans nos échantillons<br />
biologiques n’existent pas encore. En effet, les anticorps anti-Chol-βCD-Ac sont actuellement<br />
en cours de production au Service de Pharmacologie et d’Immunologie au <strong>CEA</strong> Saclay. Pour<br />
cela, nous avons synthétisé et caractérisé l’haptène destiné à être injecté chez le lapin pour<br />
produire la synthèse des anticorps. Cet haptène est l’heptakis(2,3-O-diacétyl)hexakis(6-O-<br />
acétyl)6-monoamino-6-desoxycyclomaltoheptaose.<br />
La suite de ce travail consiste donc à répéter les études de pénétration sur peau effectuées avec<br />
les nanoparticules de Chol-βCD-Ac chargées en PVA afin de doser la Chol-βCD-Ac dans les<br />
échantillons biologiques et d ‘établir le rôle de la modification chimique de la cyclodextrine et<br />
de la forme particulaire sur le comportement de la Chol-βCD-Ac dans la peau.<br />
Par la suite, nous pouvons envisager d’appliquer les résultats obtenus à l’amélioration de<br />
l’utilisation par voie topique d’autres principes actifs à visée thérapeutique cutanée.<br />
185<br />
185
186<br />
186<br />
ANNEXES
ANNEXE 1 : LA PEAU<br />
La peau, organe complexe, le plus étendu (2 m 2 ) du corps humain et le plus important en<br />
contact avec le milieu extérieur, est une enveloppe de recouvrement qui protège l’individu et<br />
permet sa survie. Anatomiquement, elle est constituée de différentes couches superposées les<br />
unes sur les autres, l’épiderme et le derme reposant sur une couche graisseuse, l’hypoderme.<br />
Les recherches effectuées durant les 20 dernières années dans les domaines de la dermatologie<br />
et de la biologie cutanée ont profondément enrichi les connaissances sur ses mécanismes<br />
physiologiques et modifié la perception de cet organe. La peau est la première ligne de<br />
défense vis-à-vis du monde extérieur mais permet en même temps d’entretenir des relations<br />
avec celui-ci. Son intégrité est nécessaire à la vie tant pour son incidence sur la santé de<br />
l’individu que pour son bien-être. Outre sa fonction barrière, la peau est aussi le siège du<br />
toucher et possède un rôle de synthèse (vitamine D2), d’élimination (principalement fer et<br />
cholestérol par la sueur, le sébum, les poils et les cellules desquamantes) et d’échanges<br />
thermiques et gazeux.<br />
La fonction barrière de la peau est assurée par l’épiderme, continu, souple, fin mais<br />
imperméable et plus particulièrement par la couche cornée ou stratum cornéum qui est la<br />
couche la plus externe. Cette dernière est un « parapluie » qui limite l’entrée des agents<br />
extérieurs tout en participant à l’homéostasie générale de l’organisme en régulant la perte en<br />
eau. C’est aussi une « ombrelle » protégeant du soleil et se modifiant à son contact. Cette<br />
barrière toutefois n’est pas absolue, elle est perméable à pratiquement toutes les substances,<br />
seul le degré de perméabilité varie. Il est lié à l’état physiologique de la peau et aux propriétés<br />
physico-chimique du composé qu’elle est censée restreindre. Notons que la peau protège aussi<br />
contre les traumatismes, mais dans cette fonction « bouclier » l’épiderme intervient peu. En<br />
revanche, l’hypoderme amortit les chocs grâce à l’élasticité de son tissu graisseux et le derme<br />
assure la solidité grâce à ses fibres.<br />
Formation de la peau pendant la grossesse<br />
L’œuf, dès sa fécondation évolue très vite. Rapidement le fœtus est constitué de trois<br />
couches – ou feuillets – plus ou moins concentriques : l’ectoderme qui donnera l’épiderme et<br />
le système nerveux ; le mésoderme qui formera le derme, l’hypoderme et tout le tissu<br />
conjonctif, les os, les articulations, les muscles et la plupart des viscères ; et l’endoderme,<br />
futur tube digestif.<br />
187<br />
187
L’épiderme n’est constitué au début que d’une couche de cellules mais très vite d’autres<br />
surviennent qui forment autant de strates. Par ailleurs, sur sa face profonde des bourgeons<br />
apparaissent ; ils s’enfoncent dans la profondeur dermique et sont à l’origine des glandes<br />
sudorales, des poils, des cheveux ainsi que des glandes sébacées et des ongles. Le derme se<br />
développe sous l’épiderme avec l’apparition de nombreuses cellules, fibres, vaisseaux et nerfs<br />
qui lui donneront ses caractéristiques ultérieures. L’hypoderme se constitue au-dessous ; il est<br />
surtout formé de cellules adipeuses<br />
1. Structure de la peau<br />
188<br />
188<br />
Figure 24 : représentation d’une coupe de peau
Figure 25 : coupe histologique de la peau humaine (coloration hématoxyline éosine)<br />
(×200)<br />
1.1 L’épiderme<br />
L’épiderme ne comporte pas de vaisseaux, éventuellement quelques petites fibres<br />
nerveuses, mais il est essentiellement constitué de cellules qui sont de trois natures<br />
principales : les kératinocytes, les mélanocytes et les cellules de Langerhans. Son épaisseur<br />
varie largement en fonction du site anatomique ; la moyenne est de 40-50 µm mais elle<br />
augmente jusqu’à 80µm sur le poignet et le dos de la main et jusqu’à 400µm au bout des<br />
doigts.<br />
1.1.1 Les kératinocytes<br />
189<br />
189
Les kératinocytes représente 90% des cellules de l’épiderme. Ils existent dans toutes les<br />
couches superposées de l’épiderme mais selon les strates sont sensiblement différents. Dans la<br />
couche inférieure, dite assise basale ou stratum basale, ils ont un grand axe vertical. C’est<br />
dans cette couche, et dans cette couche seulement à l’état normal, qu’ils se divisent. Le<br />
nombre de cellules dans cette couche s’accroissant, certaines sont expulsées vers la couche<br />
supérieure comme peut l’être le noyau d’une cerise pressée entre les doigts. Mais lorsqu’une<br />
cellule monte d’un cran, une autre doit être expulsée vers la troisième couche, etc. Ainsi<br />
progressivement les cellules montent vers la surface et au fur et à mesure de leur progression<br />
elles se modifient. De verticales, elles tendent à devenir horizontales et leur constitution<br />
change fortement : une protéine apparaît progressivement ; d’abord amorphe et appelée<br />
kératohyaline, elle devient rapidement fibreuse et forme donc des brins allongés. Ceux-ci<br />
passent d’une cellule à l’autre : c’est la kératine – ici kératine molle - protéine qui est très<br />
riche en acides aminés soufrés (cystine, cystéine, méthionine). Mais parallèlement le noyau<br />
des cellules s’altère puis disparaît. Les strates supérieures, ou couche cornée ou stratum<br />
corneum, sont donc constituées de cellules mortes, entièrement kératinisées et dénuées de<br />
noyaux, séparées les unes des autres par des lipides : les membranes cellulaires. De ce fait, on<br />
compare souvent la structure de la couche cornée à celle d’un mur dont les briques sont<br />
séparées par le mortier. Plus en surface encore les cellules perdent leur adhérence les unes aux<br />
autres ; elles deviennent ainsi écailleuses puis se séparent et tombent à l’extérieur : c’est la<br />
desquamation. Ces couches desquamantes superficielles joue évidemment un rôle moins<br />
important dans la fonction barrière.<br />
190<br />
190<br />
Nous allons nous attarder plus longuement sur la couche cornée ou stratum cornéum<br />
(SC) car son rôle de barrière mais aussi de réservoir est essentiel.<br />
Le mur de brique, cette représentation shématique et statique de la couche cornée, bien<br />
que toujours pertinente, a été quelque peu enrichie. En effet, Rawling [Rawling, 1994] et ses<br />
collaborateurs ont proposé l’existence de molécules actives du point de vue osmotique au<br />
niveau des cornéocytes (kératinocytes de la couche cornée), permettant aux « briques » d’agir<br />
en fait comme des éponges et de gonfler. La structure apparaîtrait donc plus souple, moins<br />
figée. Comme nous le verrons ensuite, le stratum corneum fonctionne aussi comme un<br />
réservoir vis à vis des molécules qui traversent la peau. Morphologiquement, il comprend un<br />
nombre variable de couches en fonction des individus et du site anatomique. Par exemple, on<br />
trouve environ 15 couches au niveau du dos et de l’abdomen (soit environ 10µm d’épaisseur)<br />
mais presque une centaine au niveau du talon de la plante des pieds. Le fait que le SC soit<br />
constitué de multiples couches est un facteur fondamental en ce qui concerne l’inhibition de
la pénétration de la plupart des substances. En effet, ces couches multiples sont<br />
alternativement lipophiles (membranes et kératine sèche) et hydrophiles (contenu des cellules<br />
i.e « natural moisturizing factors », acides aminés et sucres).<br />
La composition biochimique du SC est très hétérogène avec environ 40% de protéines,<br />
15 à 20%, 20 à 25% de substances hydrosolubles et environ 5 à 10% d’eau.<br />
les protéines : les cornéocytes contiennent une quantité importante de kératines<br />
organisées de façon à donner une structure stable extrêmement résistante et relativement<br />
élastique à la cellule. L’ensemble des kératines constitue 80% de la masse totale sèche des<br />
cornéocytes. De nombreuses autres protéines ont été identifiées comme formant une<br />
enveloppe cornifiée très résistante chimiquement et mécaniquement autour des cornéocytes<br />
(filaggrine, involucrine, cornifine, locirine). Le SC comprend également de nombreuses<br />
enzymes catalytiques responsables des nombreuses modifications biochimique de cette<br />
couche épidermique.<br />
191<br />
191<br />
les lipides : il existe au moins deux systèmes lipidiques différents dans le SC. Le<br />
premier est responsable de la cohésion et constitué principalement d’acylglycosylcéramides<br />
rattachés aux protéines de la membrane cornifiée des cornéocytes. Le second est responsable<br />
de la fonction barrière et constitue l’espace intercellulaire du SC, i.e un domaine continu ou<br />
baignent les cornéocytes. Cet espace est composé principalement d’un mélange équimolaire<br />
d’acides gras libres, de céramides et de cholestérol organisés en feuillet parallèle à la surface.<br />
Cette composition peut varier avec les individus, l’âge, l’alimentation, les saisons de l’année<br />
et les paramètres de l’environnement. La quantité lipidique intercellulaire varie également en<br />
fonction de la profondeur ; le volume des cornéocytes occupant de moins en moins d’espace<br />
en migrant vers la surface, la surface lipidique devient plus importante mais aussi plus<br />
désordonnée. Le cholestérol qui représente environ 30% des lipides du SC humain pourrait<br />
créer des liaisons covalentes avec l’enveloppe des cornéocytes et induire une certaine<br />
cohésion intercellulaire ; cependant son activité reste très controversée.<br />
l’eau : le SC contient en moyenne 15 à 35% d’eau par rapport à sa masse totale.<br />
Celle-ci serait présente sous forme libre ou plus ou moins liée à des groupements chimiques<br />
pouvant participer à des ponts hydrogènes et donc, logiquement, les propriétés de rétention de<br />
l’eau varie en fonction du type de lipide. Cette eau n’est pas répartie de façon homogène<br />
puisqu’il existe un gradient de concentration de part et d’autre du SC, tant que l’humidité<br />
relative de l’air est inférieure à 100%. L’hydratation des couches cellulaire est plus importante
dans les couches profondes qu’en surface et si le SC contient moins de 10% d’eau, le terme de<br />
déshydratation est employé pour désigner la barrière.<br />
les « natural moisturizing factors » (NMF) : ils représentent 10% du poids sec des<br />
cornéocytes et sont en partie responsables du phénomène complexe et facilement perturbable<br />
qui permet la rétention de l’eau. Le rôle des NMF provient des propriétés physico-chimiques<br />
de ces constituants qui sont hygroscopiques (ac. aminés et dérivés, ac. lactique, urée, sels et<br />
une protéine, la profilaggrine). Ils peuvent donc absorber l’eau atmosphérique et la solubiliser<br />
dans les cornéocytes en jouant le rôle d’humectant. Ainsi ce système permet au SC de<br />
maintenir un niveau d’eau constant au sein des cellules même lorsque les couches<br />
superficielles sont exposées à un environnement sec.<br />
1.1.2 Les mélanocytes<br />
Les mélanocytes sont situés seulement dans la couche basale. Elles sont<br />
particulièrement abondantes sur le visage et les régions génitales mais diminuent avec l’âge<br />
(environ 10% tout les 10 ans). Ces cellules ont une forme étoilée grâce à des prolongements -<br />
les dendrites – qui sont dirigés vers les kératinocytes environnants. Elles fabriquent un<br />
pigment brun ou roux : la mélanine. Ce pigment est à l’état de petits grains – les mélanosomes<br />
– qui se déplacent vers l’extrémité des prolongements cellulaires. Or ces prolongements ont<br />
tendance à pénétrer dans les kératinocytes, et effectivement leur extrémité est absorbée avec<br />
son contenu par les kératinocytes. Ainsi les mélanocytes et les kératinocytes qui lui sont liés –<br />
en général 36 – constituent un ensemble fonctionnel : l’unité épidermique de mélanisation.<br />
1.1.3 Les cellules de Langerhans<br />
Les cellules de Langerhans ont une origine différente : elles proviennent en effet de la<br />
moelle osseuse. Décrites initialement par Langerhans, qui les avait parfaitement dessinées au<br />
siècle dernier, elles sont très difficiles à voir. Leur existence fut donc contestée et même niée<br />
jusqu’à ce qu’elles soient retrouvées de façon indiscutable au microscope électronique dans<br />
les années 1950. Ces cellules constituent environ 7 % des cellules de l’épiderme et sont<br />
situées à tous les niveaux, particulièrement sous la couche cornée, et sont anastomosées entre<br />
elles par des prolongement, d’où leur aspect étoilé. Elles forment donc un réseau situé dans<br />
toute l’épaisseur de l’épiderme et ont la capacité de capter une substance étrangère qui aurait<br />
pénétré : elles sont donc placées aux aguets pour attendre leur proie.<br />
1.2 Le derme et l’hypoderme<br />
192<br />
192
1.2.1 Le derme<br />
Il est placé sous l’épiderme. Sa surface, à la jonction de l’épiderme, est hérissée de<br />
saillies fibreuses, vasculaires et nerveuses en forme de cône à sommet arrondi : les papilles<br />
dermiques. Entre elles, dans les dépressions, l’épiderme envoie des projections qui<br />
s’engrènent au derme. Noyés dans une phase aqueuse amorphe de mucopolysaccharides, le<br />
derme contient divers constituants : fibres, cellules et nerfs.<br />
les fibres : très entremêlées, elles sont bien visibles dans les cuirs animaux mais<br />
donnent aussi sa solidité à la peau humaine. Les plus nombreuses, les fibres collagènes, sont<br />
regroupées en faisceaux onduleux, allongés en tout sens et entrecroisés. D’autres, les fibres<br />
élastiques, sont sinueuses et anastamosées entre elles, constituant ainsi un réseau d’orientation<br />
verticale.<br />
les cellules : elles peuvent être très diverses mais les fibroblastes ou cellules<br />
conjonctives sont presque les seules que l’on retrouve dans le derme normal. Ils ont une forme<br />
étoilée grâce à des prolongements qui les réunissent et servent à laisser sortir leurs sécrétions :<br />
les fibres. Les histiocytes, cellules mobiles, participent quant à eux à la défense de<br />
l’organisme.<br />
les vaisseaux : nombreux mais de petit diamètre, artères, veines et lymphatiques sont<br />
situés sur toute la hauteur du derme mais ne pénètrent pas dans l’épiderme.<br />
les nerfs : ils comportent des filets sensitifs qui sont à l’origine des sensations<br />
provenant de la peau, et des filets sympathiques qui jouent un rôle vasomoteur.<br />
1.2.2 L’hypoderme<br />
L’hypoderme est une couche graisseuse plus ou moins découpée en petits amas, les<br />
lobules graisseux, entre lesquels cheminent les vaisseaux et les nerfs. Elle est destinée à<br />
séparer la peau du muscle<br />
1.3 Les annexes épidermiques<br />
Les annexes épidermiques proviennent de prolongement de l’épiderme qui se sont<br />
enfoncés dans le derme, parfois même dans l’hypoderme.<br />
1.3.1 Les glandes sudoripares<br />
193<br />
193<br />
On distingue 2 types de glandes sudorales : eccrines et apocrines. Les glandes sudorales<br />
eccrines, de beaucoup les plus nombreuses, se trouvent sur l’ensemble du tégument et sont<br />
beaucoup plus abondantes aux paumes, aux plantes, aux aisselles et à la poitrine. Elles
forment un tube dont la paroi est constituée de cellules épithéliales et qui s’enfonce jusque<br />
dans l’hypoderme. Là, il se recroqueville pour former un peloton qui est la zone sécrétrice de<br />
la sueur. Les glandes sudorales apocrines siègent dans des territoires plus restreints (périnée,<br />
régions inguinales, axillaires et mamellonaires). Leur diamètre est beaucoup plus grand que<br />
celui des glandes eccrines et surtout elles n’atteignent pas la surface mais se jettent dans le<br />
follicule pileux, juste au dessus du canal drainant les glandes sébacées dans l’espace situé<br />
autour du poil.<br />
1.3.2 Les follicules pilo-sébacés<br />
Ils comportent les follicules pileux proprement dits, qui fabriquent les poils, et les<br />
glandes sébacées, qui forment le sébum. Au niveau de la racine du poil, celui-ci est adhérent<br />
au follicule alors que plus en surface, le poil tend à s‘isoler et se libère de ses attaches ; un<br />
espace est crée entre lui et la paroi du follicule - l’espace péripilaire – dans lequel se jettent les<br />
canaux excréteurs des glandes sébacées et apocrines. Le poil lui-même est constitué de<br />
kératine, mais une kératine dure - différente de celle de la couche cornée – car sans graisse.<br />
Les glandes sébacées sont placées au milieu du derme et ne comporte aucun canal : il n’y<br />
existe en effet que des cellules qui fabriquent de la graisse dont elles se bourrent en se<br />
déplaçant vers le canal excréteur qui les emmène dans l’espace péripilaire. Ce sont les cellules<br />
sébacées elles même qui sont excrétées et pas seulement leur contenu.<br />
2. Méthodes de mesure de l’absorption cutanée<br />
Définitions préalables<br />
Absorption : prise de substances par un organisme, au sens large.<br />
Pénétration : entrée d’une substance dans un organe ou une couche précise.<br />
Perméation : pénétration à travers une couche et vers une autre couche<br />
différente fonctionnellement et structurellement.<br />
La voie cutanée est très largement utilisée pour l’administration de médicaments. En<br />
effet, elle offre la possibilité de pouvoir cibler les différentes couches de la peau<br />
(administration percutanée) ou bien la voie sanguine pour une administration systémique du<br />
principe actif (voie transcutanée). Le devenir du principe actif dans la peau dépend des<br />
propriétés de celle-ci mais aussi des caractéristiques physico-chimiques du principe actif, de la<br />
forme galénique choisie et des excipients. Il est donc essentiel de pouvoir étudier le devenir<br />
d’une molécule après son application sur la peau. Il existe pour cela plusieurs approches :<br />
194<br />
194
- méthode in vivo chez l’homme<br />
- méthode in vitro chez l’homme<br />
- méthode in vivo chez l’animal<br />
- méthode in vitro chez l’animal<br />
Bien sur, l’approche la plus attractive consiste à faire des expériences in vivo chez<br />
l’homme. Mais le coût, le facteur temps, les connaissances parfois limitées du produit et<br />
surtout les considérations éthiques rendent cette approche très rare. Les études in vitro chez<br />
l’homme sont aussi difficiles à conduire du fait de la rareté de la peau humaine et des<br />
différences que l’on peut observer entre genre, race, âge, site, etc.. Chez l’animal les<br />
expériences in vivo sont tout aussi coûteuses et longues que chez l’homme, ce qui explique<br />
que, au final, la grande majorité des études de perméation sont faîtes in vitro chez l’animal.<br />
Toutefois, les variations de structure et de pilosité de la peau animale, quel que soit l ‘espèce,<br />
font que l’on ne peut espérer les même résultats, en terme de perméabilité, que ceux obtenus<br />
sur peau humaine. Ainsi, aucune conclusion quant à la perméabilité de la peau humaine ne<br />
peut être déduite des résultats obtenus en laboratoire sur l’animal. Bien sur chez certaines<br />
espèces la différence est moins grande et l’on pourra observer des similarités en terme<br />
d’absorption pour certaines substances mais des différences pour d’autres. Avant d’être utilisé<br />
un modèle animal doit donc être validé pour la substance précise à doser.<br />
Une autre voie s’offre aux chercheurs depuis peu : celle des membranes artificielles.<br />
Leur utilisation pour comprendre les aspects mécaniques du processus de capture par la peau<br />
se développe et on retrouve par exemple dans la littérature : Silastic ® (polydimethyl siloxane),<br />
cellulose acétate et polyuréthane. Mais la peau est un organe complexe, multicouches et<br />
hétérogène et les membranes synthétiques utilisées jusqu’à maintenant sont des systèmes<br />
homogènes monocouche. De ce fait toute comparaison doit être prise avec prudence. Une des<br />
utilisations intéressante des membranes artificielles est de différencier les paramètres physico-<br />
chimiques influants la perméation des paramètres biologiques qui eux dépendent de la peau.<br />
Par exemple on peut étudier l’influence de la solubilité du p.a, du coefficient de partition, du<br />
pH…<br />
195<br />
195<br />
Dans la suite de ce chapitre nous nous concentrerons sur les méthodes de mesure pour<br />
les expériences in vitro sur peau humaine, puisque c’est la technique que nous avons<br />
utilisée pour nos gels à base de vitamine A. Le shéma des cellules de Franz, telles que nous<br />
les avons utilisées est présenté à la fin de ce chapitre (Fig. 26).<br />
Les études sur la peau excisée peuvent être conduites pour n’importe quelle substance<br />
pour déterminer sa pénétration, à partir du moment où la méthode de dosage utilisée est assez
sensible. Précisons qu’à ce jour, aucune substance chimiquement définissable ne s’est<br />
montrée absolument incapable de pénétrer dans la peau. Les résultats obtenus sont des<br />
concentrations dans telle ou telle couche mais en aucun cas ne donnent d’information sur la<br />
perméabilité. L’un des grands avantages de cette technique utilisant des morceaux de peau<br />
excisés est que plusieurs expériences peuvent être faite sur le même spécimen (donc même<br />
espèce, genre, âge et site anatomique) et ainsi permettre une comparaison fiable. Ces<br />
expériences sont particulièrement indiquées pour la mesure des paramètres secondaires telle<br />
que l’influence de la forme galénique, de la température, de l’humidité…<br />
Lorsque l’on souhaite étudier la pénétration d’une substance par une technique in vitro,<br />
on peut choisir de mesurer sa concentration dans la peau ou bien la différence entre la<br />
concentration initiale déposée avant et après l’expérience. Toutefois cette dernière approche<br />
concerne de très faibles différences de concentration puisque la peau n’absorbe que de faibles<br />
quantités. La sensibilité de la méthode de dosage doit donc être particulièrement haute ce qui<br />
signifie que la mesure de radioactivité est la méthode de choix pour ces études. La solution la<br />
plus utilisée reste donc de mesurer la concentration dans la peau. La question se pose alors de<br />
choisir sur quelle « peau » faire l’expérience : peau totale (couche cornée + épiderme +<br />
derme), couche cornée seule , couche cornée + épiderme, etc…Il est en effet possible de<br />
séparer chaque couche et d’adapter le support aux résultats attendus. Comme nous l’avons vu<br />
précédemment, c’est l’épiderme qui représente la barrière importante de la peau, tout d’abord<br />
grâce à la barrière que représente la couche cornée et grâce à l’alternance de zones hydrophiles<br />
et lipophiles.<br />
3. Les compartiments de la peau<br />
196<br />
196<br />
Les principes de base de pharmacocinétique furent élaborés par Dost et ses collègues<br />
dans les années 1970. Une tentative a été faite pour appliquer certains de ses principes à la<br />
perméabilité cutanée bien que cela soit très difficile de par la nature complexe de la peau. Le<br />
transport de chaleur, le stockage d’énergie, les fonctions nerveuses, etc. sont autant de<br />
fonctions de la peau qui ne sont pas directement liées à la pénétration de molécules étrangères.<br />
Le cheminement d’un principe actif, appliqué à la surface de la peau, jusqu’à la circulation<br />
sanguine puis son excrétion finale peut être décrit comme un système à plus de 10
compartiments, qui est autrement plus compliqué que celui gérant l’absorption intestinale.<br />
Toutefois, toutes les couches n’ont pas la même importance dans ce processus.<br />
La surface de la peau, ainsi que la substance qui y est appliquée représente le premier<br />
compartiment. Si le principe actif est appliqué seul plutôt que dans un véhicule, alors au<br />
moins une petite partie sera dissoute dans l’eau ou le gras de la peau. Le transfert vers les<br />
couches suivantes, à partir de cette forme solide est un phénomène physico-chimique<br />
mesurable, avec des constantes d’équilibration mesurables et un flux opposé constant. Le<br />
second compartiment représente l’effet de premier passage, caractérisé par l’altération de la<br />
majeure partie du principe actif allant ou sortant de la couche cornée, que ce soit par<br />
décomposition chimique ou par réaction enzymatique ou microbiologique.<br />
La couche cornée, le troisième compartiment, est à la fois une membrane par sa<br />
fonction barrière et un volume par sa fonction réservoir. Dans la peau saine, les constantes de<br />
transfert à partir de ce compartiment (vers l’épiderme, la surface, les glandes sudoripares et les<br />
follicules pileux) sont décisives pour la perméabilité totale. En comparaison, les transferts à<br />
partir de l’épiderme sont rapides. La vitesse de libération à partir du véhicule est souvent bien<br />
plus rapide que la perméation de la couche cornée vers l’épiderme, qui représente donc le<br />
facteur limitant.<br />
Toutes les autres étapes, de l’épiderme vers le derme puis le sang ou l’hypoderme et<br />
finalement les urines se font plus rapidement et toujours avec un flux opposé simultané. A<br />
partie de l’épiderme il y a aussi métabolisation (radiolyse, décomposition chimique ou<br />
microbienne, métabolisme actif ou passif) et liaison dans la peau. Par exemple, pour les<br />
substances lipophiles, le gras de l’hypoderme et des glandes sébacées constitue un large<br />
volume de stockage.<br />
4. Aspects qualitatifs et quantitatifs de l’absorption cutanée<br />
La couche cornée, faite de cornéocytes non-vivants fermement lié et de voies de<br />
transport non perceptibles telles les glandes sébacées et sudoripares, peut être envisagée<br />
comme une membrane passive. La plupart des substances la traverseront proportionnellement<br />
au gradient de concentration entre le coté supérieur et inférieur de la membrane. Ainsi on peut<br />
appliquer la loi de Fick, du moins tant que la concentration en surface est grande et la<br />
concentration dans l’épiderme faible. D’après certains auteurs [Garcia, 2001] les relations<br />
concernant la diffusion à travers la couche cornée peuvent être décrites par la formule<br />
simplifiée : J = (Dm*Km)/Th<br />
197<br />
197
où J est la quantité de substance pénétrant dans la couche cornée<br />
Dm est la vitesse de diffusion à travers la couche cornée<br />
Km est le coefficient de solubilité véhicule-membrane<br />
Th est l’épaisseur de la couche cornée<br />
La plupart des substances peuvent pénétrer très rapidement dans la couche cornée. La<br />
distribution dans cette couche suit une ligne droite sur une courbe semi-logarithmique<br />
exprimant la concentration en fonction de la profondeur, ce qui signifie qu’initialement de<br />
faibles quantités atteignent les couches profondes, alors qu’un excès considérable reste à la<br />
surface et dans les feuillets les plus externes. Il existe donc un gradient de concentration dans<br />
la couche cornée. On considère qu’il existe un réservoir de principe actif tant que la quantité<br />
de principe actif sur ou dans les couches superficielles et intermédiaires du stratum corneum<br />
est supérieure à celle qui est déjà dans les couches profondes du stratum corneum ou dans<br />
l’épiderme. Il faut savoir que la plus grande partie de ce qui a été appliqué sur la peau ne<br />
pénètre pas dans les cellules vivantes de la peau (75% à 99.5%), mais ce surplus est nécessaire<br />
au gradient de concentration.<br />
Pour parvenir à l’épiderme vivant, c’est à dire traverser le SC, une molécule a trois<br />
possibilités. Elle peut diffuser entre les cellules, à travers les cellules ou à travers les follicules<br />
pilo-sébacés ou les glandes sudoripares. L’importance relative de chacune des voies paraît être<br />
influencée par les caractéristiques du produit appliqué et celles de la surface cutanée.<br />
diffusion intracellulaire : autrefois considérée comme la voie majeur, désormais<br />
controversée<br />
diffusion intercellulaire (espaces lipidiques) : voie préférentielle pour de<br />
nombreuses molécules, même polaires comme l’eau. Les modalités de pénétration<br />
restent encore obscures<br />
diffusion à travers les annexes cutanées : bien que la surface couverte par les annexes<br />
cutanées soit inférieur à 1% de la surface cutanée, l’absence de barrière cornée au niveau de<br />
ces annexes favorise l’absorption des molécules. Cette voie interviendrait au cours des<br />
premières minutes de diffusion des molécules plus ou moins polaires. En fait, elle bénéficie<br />
surtout aux molécules de grande taille et de faible polarité pour lesquelles elle est la seule<br />
issue possible.<br />
198<br />
198<br />
Dans l’épiderme, le principe actif se retrouve dans un volume de distribution 10 fois<br />
plus grand (que la couche cornée) dans lequel on ne trouve plus cette alternance de zones<br />
hydrophiles et lipophiles étroitement collées. La résistance à la perméation y est largement<br />
plus faible car le principe actif peut être transporté par les fluides intercellulaires. L’état
d’équilibre est atteint très rapidement. La pénétration plus en profondeur vers le derme est<br />
souvent un phénomène continu car il n’a pas de « barrière » à l’interface épiderme-derme. A<br />
ce niveau, les flux sanguin et lymphatique doit jouer un rôle important sur le transport des<br />
substances, puis qu’ils passent dans le derme.<br />
Figure 26. Représentation shématique<br />
des cellules de Franz utilisées<br />
dans ce travail de thèse.<br />
199<br />
199
200<br />
200
ANNEXE 2 : DOSAGES IMMUNOENZYMATIQUES<br />
1. Le système immunitaire : présentation des anticorps.<br />
Les anticorps sont des protéines produites par le système immunitaire pour protéger un<br />
organisme des agressions extérieures comme l’intrusion d’organismes pathogènes par<br />
exemple. Ces molécules sont produites par les lymphocytes B en réponse à l’intrusion d’une<br />
molécule étrangère à l’organisme hôte. Ces substances étrangères capables de déclencher une<br />
réponse immunitaire sont dénommées antigènes, et ce sont en générale des composés<br />
possédant des molécules de masse supérieure à 5000 Da. Les molécules plus petites (M
Figure 27. Représentation schématique d'un anticorps (ici, une molécule<br />
d’immunoglobuline G, encore notée IgG).<br />
202<br />
202<br />
Du point de vue structural, les anticorps sont des glycoprotéines constituées d’un<br />
arrangement quaternaire de plusieurs sous-unités peptidiques. On distingue quatre chaînes<br />
protéiques : deux chaînes dites lourdes (nommées VH, H pour Heavy, et dont la masse est<br />
proche de 50 kDa), et deux chaînes légères (nommées VL, L pour Light, de masse moléculaire<br />
environ 25 kDa). Ces quatre polypeptides sont arrangés de manière symétrique, chacune des<br />
chaînes légères étant associée à une chaîne lourde, et l’assemblage global étant assuré par<br />
plusieurs ponts disulfures intra- et inter-catennaires.<br />
On distingue dans les immunoglobulines deux grandes régions : une partie est dite<br />
constante, et l’autre variable. Ce sont les parties constantes, constituées par les parties C-<br />
terminales des polypeptides qui permettent de distinguer les différentes classes<br />
d’immunoglobulines. Ainsi, il existe 5 classes d’immunoglobulines chez les mammifères,<br />
dénommées IgA, IgD, IgE, IgG et IgM, qui se distinguent chacune par la partie constante de<br />
leurs chaînes lourdes, α, β, ε, γ, et µ, respectivement. Ce sont les IgG les plus fréquentes, et ce<br />
sont elles que nous avons utilisées pour les expériences de reconnaissance immunologique.<br />
Les parties variables sont, elles, responsables de la reconnaissance pour un antigène<br />
donné. Elles sont constituées d’une partie des chaînes lourdes, et d’une partie des chaînes
légères (les extrémités N-terminales) qui créent ainsi 2 sites de liaisons par anticorps (voir<br />
schéma de l’IgG). On distingue dans ces parties variables un sous-motif qualifié<br />
«d’hypervariable», et qui est directement impliqué dans l’interaction avec l’antigène. Ces<br />
régions hypervariables sont constituées d’un arrangement conformationel et fonctionnel (le<br />
paratope) spécifique à la liaison avec une partie de l’antigène (l’épitope). Le phénomène pur<br />
de reconnaissance ne met cependant en jeu que quelques uns des acides aminés de ces régions<br />
hypervariables.<br />
2. Obtention des anticorps.<br />
Nous décrirons ici une méthode générale d’obtention d’anticorps dirigés contre des<br />
haptènes, en étudiant plus particulièrement la production d’anticorps anti-cyclodextrines.<br />
Les haptènes sont de petites molécules (M < 5000Da) qui ne suffisent pas à elles seules<br />
à induire une réponse immunitaire chez un mammifère. On fabrique donc un immunogène en<br />
greffant de façon covalente l’haptène sur une protéine étrangère à l’hôte auquel on veut faire<br />
produire des anticorps (typiquement, un lapin). Le système immunitaire va produire des<br />
anticorps dirigés contre l’ensemble des épitopes portés par cette protéine étrangère (KLH +<br />
haptène ou BSA + haptène), et dans cet ensemble d’anticorps, certains seront dirigés contre<br />
l’haptène préalablement greffé.<br />
Pour les cyclodextrines, on utilise les dérivés mono-6-désoxy-6-amino-cyclodextrines<br />
(CD-NH2). Cet haptène est couplé de façon covalente à la Sérum Albumine Bovine (BSA),<br />
protéine étrangère à l’organisme du lapin, en utilisant le glutaraldéhyde comme bras espaceur<br />
(la façon dont le glutaraldéhyde lie les deux molécules n’est pas bien connue, mais le<br />
glutaraldéhyde réagit probablement sous sa forme polymérique). L'agent de couplage réagit en<br />
créant des fonctions imines à partir des fonctions amines primaires de la CD et de la BSA.<br />
NH2<br />
CD +<br />
BSA<br />
203<br />
203<br />
OHC CHO<br />
CD<br />
H 2<br />
Figure 28: Préparation de l'immunogène.<br />
N N<br />
IMMUNOGENE<br />
CH 3<br />
BSA
Pour réaliser ceci, 900 nmol d'haptène et 30 mg de BSA sont dissouts dans 2 ml de<br />
tampon phosphate (0.1 M, pH 7.4). On ajoute à cette solution 8 µL de solution aqueuse de<br />
glutaraldéhyde (25 % (v/v)). La solution est agitée durant 16 H à Tamb, puis dialysée contre<br />
deux litres de tampon phosphate 10 -1 M. L'immunogène est stocké à - 30 °C jusqu'à<br />
utilisation. Les lapins sont immunisés par injection intradermique de l’immunogène. Afin<br />
d’accroître la réponse immunitaire du lapin, l’immunogène est émulsionné dans de l’adjuvant<br />
de Freund complet [Hoogenraad, 1986]. 1 mg d’immunogène est injecté au lapin. Six<br />
semaines après la première injection, les animaux reçoivent une injection de rappel. Cette<br />
opération est ensuite répétée tous les mois, tandis que l’on vérifie la présence et le titre des<br />
anticorps spécifiques dans les saignées effectuées avant et après chaque rappel.<br />
Ce sont ces protéines générées par le système immunitaire qui sont la base des dosages<br />
immunologiques.<br />
3. Les dosages immunologiques<br />
3.1 Principe<br />
Sous le terme de dosages immunologiques sont regroupées différentes méthodes<br />
d’analyse qui on toutes en commun d’utiliser à la fois des anticorps (Ac) et des molécules<br />
marquées. Les anticorps ont la propriété de former des complexes spécifiques de haute affinité<br />
avec les antigènes (Ag) contre lesquels ils ont été produits. Les dosages immunologiques<br />
exploitent les propriétés de base de l’interaction Ag-Ac. Dans sa forme la plus simple, celle-ci<br />
peut être décrite par l’équilibre suivant :<br />
Ag + Ac → AgAc<br />
Il est admis que cet équilibre obéit à la loi d’action de masse et donc que les<br />
concentrations de ces constituants sont reliées entre elles par la relation :<br />
Kd = [Ag] [Ac] × [AgAc] –1 où Kd est la constante de dissociation du complexe Ag-Ac<br />
De cet équilibre on peut déduire que la concentration des complexes AgAc formés<br />
dépend des concentrations en Ag et en Ac introduites dans la réaction. Si l’on suppose<br />
constante la concentration totale en Ac, on peut montrer qu’il existe une relation<br />
mathématique simple reliant [Ag] à [Ag-Ac]. Cette relation va permettre de mesurer la<br />
concentration en Ag si l’on est capable de mesurer la concentration du complexe formé.<br />
204<br />
204<br />
On pourrait alors penser qu’il est possible de mesurer la concentration d’un Ag au<br />
moyen d’un seul équilibre réalisé avec une quantité connue d‘Ac. Ceci serait possible si on
pouvait connaître avec précision la concentration totale en Ac, le Kd et la concentration du<br />
complexe formé. En pratique, ces trois conditions ne sont jamais réalisées en même temps et<br />
tous les dosages immunologiques sont, en fait, des méthodes d’analyses relatives faisant appel<br />
à des courbes d’étalonnage. Celles-ci sont établies en réalisant plusieurs équilibres avec des<br />
concentrations connues et variables d’Ag. En mesurant pour chaque équilibre la quantité de<br />
complexe formé, on va établir une relation expérimentale entre la concentration de l’Ag et<br />
celle du complexe AgAc. C’est à partir de cette relation que l’on va mesurer la concentration<br />
de l’Ag dans un échantillon inconnu traité dans les mêmes conditions expérimentales que les<br />
solutions étalons. Dans ces conditions, il n’est pas nécessaire de travailler dans des conditions<br />
d’équilibre.<br />
Pour effectuer un dosage immunologique, il faut donc pouvoir mesurer la concentration<br />
du complexe AgAc formé. C’est pour rendre plus facile cette mesure que l’on a recours à<br />
l’utilisation de molécules marquées. Il s’agit d’Ag ou d’Ac auxquels on associe un signal les<br />
rendant facilement mesurables au moyen d’une méthode physico-chimique quelconque. De<br />
très nombreux marqueurs ont été décrits mais les plus utilisés sont les marqueurs radioactifs<br />
(dosage radioimmunologiques), les marqueurs fluorescents (dosages fluoroimmunologiques)<br />
et les enzymes (dosages immunoenzymatiques). Nous nous concentrerons sur ce dernier cas<br />
qui est la méthode que nous avons utilisée.<br />
Pour permettre des dosages sensibles, un bon traceur doit pouvoir être détecté à des<br />
concentrations très faibles, c’est à dira posséder une activité spécifique la plus élevée possible.<br />
Il faut aussi que l’opération de marquage respecte les structures essentielles de l’Ac afin que<br />
la stabilité du complexe ne soit pas affectée.<br />
Les enzymes les plus utilisées restent la phosphatase alcaline et la peroxydase de<br />
Raifort. Au laboratoire, nous utilisons plutôt l’acétylcholinesterase ou AchE (E.C 3.1.1.7) en<br />
raison de sa très grande activité catalytique qui confère aux traceurs synthétisés à partir de<br />
cette enzyme des activités spécifiques très élevées souvent comparables à celles des traceurs<br />
radioactifs. La fonction principale de cette enzyme est l’hydrolyse de l’acétylcholine dans la<br />
synapse cholinergique. Pour détecter cette enzyme on utilise le réactif d’Ellman [Ellman,<br />
1961] (Fig.3) qui est un mélange d’acétylthiocholine, un pseudo-substrat de l’AchE, et le<br />
DTNB. L’hydrolyse de l’ acétylthiocholine aboutit à la production de thiocholine qui réagit<br />
avec le DTNB ox., réactif classiquement utilisé pour mesurer les groupements thiols, et<br />
entraîne la formation de DTNB réduit. Ce dernier est un chromophore (λmax 414 nm, εM<br />
13600cm -1 .M -1 ) qui absorbe fortement dans le visible en produisant une couleur jaune.<br />
205<br />
205
CH3COS-CH2CH2N(CH3)3 + + H2O<br />
Acétylthiocholine<br />
- S-CH2 -CH 2 -N + (CH 3 ) 3 +<br />
O 2 N<br />
-OOC<br />
S<br />
DTNB<br />
206<br />
206<br />
AChE<br />
S NO 2<br />
CH3COO - + - S-CH2CH2N(CH3)3 + + 2H +<br />
Thiocholine<br />
COO-<br />
COO- HS NO2 C<br />
H 3<br />
C<br />
H 3<br />
Figure 29. Principe de la méthode colorimétrique d’Ellman.<br />
N +<br />
CH3 +<br />
S<br />
DTNB<br />
Réduit (coloré)<br />
COO-<br />
S NO 2<br />
Il est courant d’exprimer les concentrations d’AchE en fonction des mesures effectuées<br />
avec la méthode d’Ellman. Une unité Ellman correspond à la quantité d’enzyme produisant un<br />
accroissement d’absorbance d’une unité à 414 nm pendant une minute, dans un volume de 1<br />
mL de milieu Ellman, pour 1 cm de trajet optique à 25°C.<br />
Dans certains cas, la formation de complexe s’accompagne d’une modification du signal<br />
porté par le traceur. Les dosages de ce type sont appelés homogène car la mesure est effectuée<br />
directement sur l’ensemble des constituants de l’équilibre immunologique. A l’opposé on<br />
distingue les dosages hétérogènes, pour lesquels la formation des complexes Ag-Ac ne<br />
modifie pas le signal porté par le traceur. Dans ce cas, pour accéder à la mesure des complexe<br />
Ag-Ac, il faut procéder à une séparation des différents constituants de l’équilibre et<br />
notamment séparer le traceur non complexé de celui engagé dans les complexes Ag-Ac. Cette<br />
séparation, qui doit être effectuée avant la mesure finale, fait presque toujours appel à une<br />
séparation de phase (liquide/solide). Dans la suite de cet exposé nous envisagerons seulement<br />
le cas des dosages hétérogènes que nous avons utilisé.<br />
Nous venons d’examiner les principes de base sur lesquels reposent les dosages<br />
immunologiques et nous avons vu comment la formation de complexes Ag-Ac et l’utilisation<br />
de molécules marquées permettait de mesurer des concentrations d’Ag ou d’Ac. Ces principes<br />
ne sont pas propres aux dosages immunologiques et on pourrait les appliquer, par exemple,<br />
aux dosages faisant intervenir des récepteurs. Si les dosages immunologiques ont connu un<br />
développement si spectaculaire ces trente dernières années, c’est parce qu’ils sont dotés<br />
d’autres propriétés remarquables. Ce sont d’abord des méthodes très générales dans la mesure<br />
où il est possible d’obtenir des Ac contre à peu près n’importe quelle molécule. Le succès des<br />
dosages immunologiques est aussi dû à deux propriétés essentielles de l’interaction Ag-Ac :<br />
spécificité et affinité. C’est grâce à la spécificité des Ac, c’est à dire à leur aptitude à ne<br />
former des complexes qu’avec le seul Ag contre lequel ils ont été produit, que les dosages
immunologiques pourront être effectués dans des milieux biologiques complexes (plasma,<br />
urines, extraits de tissus) sans purification préalable. Et c’est grâce à la grande stabilité des<br />
complexes que les dosages immunologiques pourront être très sensibles. Or ces complexes ne<br />
se formeront de façon mesurable, à de très faibles concentrations, que si la constante de<br />
dissociation de ces complexes le permet. Avec des Kd de l’ordre de 10 -9 M et pouvant aller<br />
jusqu’à 10 -12 M, les Ac permettent de mesurer de très faibles concentrations d’Ag. Ainsi, que<br />
ce soit en termes de spécificité ou d’affinité, les Ac sont les réactifs les plus performants<br />
actuellement accessibles aux biologistes avec les sondes nucléotides.<br />
Il ne saurait être question ici de décrire les très nombreuses méthodes faisant intervenir<br />
la relation Ag-Ac. Nous nous bornerons à décrire succinctement le type de dosage hétérogène<br />
que nous avons utilisé : le dosage par compétition.<br />
3.2 Dosage par compétition<br />
Les dosages par compétition mettent en jeu 3 composants: un anticorps (poly ou<br />
monoclonal), un antigène marqué (le traceur) et le même antigène non marqué. Le fait<br />
d’utiliser comme traceur l’antigène marqué est l’une des caractéristiques essentielles des<br />
dosages par compétition. Le traceur (Ag * ) et l’antigène (Ag) non marqué sont aptes à se lier<br />
tous les deux aux mêmes anticorps (Ac), et de ce fait, à établir une compétition si la<br />
concentration des sites anticorps est limitante. Le principe de compétition met donc en œuvre<br />
deux équilibres :<br />
Ag * + Ac Ag * Ac Kd * = [Ac][Ag * ]/[Ag * Ac]<br />
Ag + Ac AgAc Kd= [Ac][Ag]/[AgAc]<br />
On peut montrer que si la concentration en anticorps et en traceurs est constante, la<br />
concentration en complexe Ag * Ac diminue quand la concentration d’antigènes non marqués<br />
introduite dans l’équilibre augmente, et ceci pour toutes valeurs de Kd et Kd * .<br />
207<br />
207<br />
3.2.1 Préparation du traceur pour le dosage par compétition.<br />
Comme indiqué précédemment, un traceur pour dosage par compétition est obtenu en<br />
couplant de façon covalente l’haptène étudié à l’acétylcholinestérase. Il existe de nombreuses
façons de coupler l’haptène sur l’enzyme. La méthode employée dépend uniquement des<br />
fonctions chimiques réactives disponibles sur l’haptène. Dans le cas des cyclodextrines, le<br />
traceur est préparé en exploitant la fonction amine du dérivé mono-6-désoxy-6-amino-<br />
cyclodextrines (CD-NH2), en utilisant le protocole précédemment décrit pour les haptènes<br />
[McLaughlin, 1987] ou pour les protéines [Grassi, 1989].<br />
CD<br />
A C<br />
h E<br />
NH 2<br />
NH 2<br />
SMCC<br />
SATA<br />
NH 2 OH<br />
A C<br />
h E<br />
O<br />
NH<br />
CD<br />
AChE-G4-SMCC<br />
NHCOCH 2 SH<br />
A C<br />
h E<br />
O<br />
NH<br />
Traceur CD-G4<br />
Figure 30. Synthèse du traceur enzymatique CD-AChE-G4.<br />
N<br />
O<br />
O<br />
Le dérivé mono-6-désoxy-6-amino-cyclodextrine (CD-NH2) est d’abord thiolé en faisant<br />
réagir le groupe amine de la CD-NH2 avec le N-succinimidyl-S-acétylthioacétate (SATA) en<br />
milieu alcalin. A une solution de CD-NH2 (1µmol) en tampon borate (1 ml de tampon borate<br />
0.1 M, pH 8.5) on ajoute 50 µl d'une solution de SATA dans le DMF anhydre (2.13 mg, 9.2<br />
µmol). La réaction a lieu à température ambiante durant 30 mn avant purification de la CD-<br />
SATA sur cartouche de SEP-PAK C18. Le dérivé thiolé est élué avec du méthanol, lyophilisé<br />
et repris dans 1.6 ml de tampon phosphate préalablement dégazé (tampon phosphate 0.1 M,<br />
pH 6). On ajoute alors 400 µL d'une solution de chlorure d'hydroxylamine (pH 7). Après 30<br />
mn de réaction, le nombre de fonctions thiols est estimé par colorimétrie, en faisant réagir le<br />
milieu réactionnel avec 0.5 mM de 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoique acide) (DTNB) selon la<br />
procédure décrite par Ellman [Ellman, 1959].<br />
L'acétylcholinestérase (sous sa forme globulaire G4, préalablement extraite à partir des<br />
organes électriques de Gymnote et purifiée par chromatographie d'affinité [Massoulié, 1976])<br />
est de son côté fonctionnalisée par réaction avec le N-succinimidyl-4-(N-maléimidométhyl)<br />
cyclohexane-1-carboxylate (SMCC, un agent bifonctionnel), puis purifiée comme<br />
précédement décrit [Grassi, 1989]. Le couplage de la cyclodextrine thiolée (3 nmol) avec<br />
l'AChE fonctionnalisée (0.3 nmol AChE-G4-SMCC) est réalisé en milieu tampon phosphate<br />
(0.1 M, pH 6, 275 µL) durant 3 h à 30°C. Le traceur CD-AChE est alors purifié par filtration<br />
sur gel de sépharose (Biogel A, colonne de 90 x 1.5 cm, éluant tampon EIA).<br />
208<br />
208<br />
N<br />
O<br />
O<br />
S<br />
O<br />
NH<br />
CD
3.2.2 Mise en œuvre; interprétations.<br />
209<br />
209<br />
La mise en œuvre d’un dosage immunoenzymatique par compétition nécessite la<br />
préparation d'un traceur (antigène étudié lié de façon covalente à l’acétylcholinestérase), et<br />
d’avoir à notre disposition un anticorps spécifique de l’antigène étudié (voir le chapitre<br />
concernant la préparation de l’immunogène à partir d’un haptène).<br />
Les dosages immunologiques sont réalisés dans des plaques de microtitration<br />
comprenant 96 puits. Un prétraitement nécessaire à la bonne réalisation du dosage (schéma 1,<br />
fig 30), consiste à recouvrir les puits avec un anticorps monoclonal de souris dirigé contre la<br />
partie constante des immunoglobulines de lapin. La première étape du dosage consiste à<br />
mélanger dans un même puits, une quantité constante de ces anticorps spécifiques de lapin<br />
avec une quantité constante de traceur (antigène-AChE), et une quantité variable de l’antigène<br />
étudié (schéma 2, fig 30). Après l’étape de réaction immunologique (typiquement 18 h à 4 °C)<br />
et après une étape de lavage soigné, on se retrouve dans la situation du schéma 3, où certains<br />
sites sont occupés par une molécule de traceur, ou bien, par une molécule d’antigène,<br />
l’excédant ayant été éliminé par l’étape de lavage.<br />
Figure 31. Principe du dosage immunoenzymatique par compétition.<br />
La quantité d’AChE fixée sur la phase solide est alors détectée par la méthode<br />
colorimétrique d’Ellman en ajoutant dans chacun des puits un mélange d’acétylthiocholine et
de DTNB (schéma 4, fig 30). Après une à deux heures de réaction enzymatique, l’absorbance<br />
(λ= 414 nm) de chaque puits est mesurée à l’aide d’un lecteur approprié.<br />
La réalisation de ces mesures sur une gamme de concentration de l’antigène étudié<br />
conduit à l’obtention de courbe de type B = f([concentration]), B étant l’absorbance du milieu<br />
à 414 nm, pour une concentration donnée d’antigène. Il est cependant plus pratique de<br />
représenter ces courbes sous une forme semi-logarithmique, en traçant 100*B/B0 = f<br />
([concentration]), B0 étant l’absorbance mesurée en absence d’antigène non marqué (figure<br />
31).<br />
Figure 32. Courbe dose-réponse obtenue lors d'un dosage immunologique par<br />
compétition.<br />
210<br />
210<br />
Il est à noter que des mesures de liaison non spécifique (absorbance mesurée en absence<br />
d’anticorps spécifiques) sont effectuées à chaque dosage.<br />
On peut estimer grossièrement la sensibilité d’un dosage par la valeur de la<br />
concentration en antigène qui correspond à une valeur de B*100/B0 de 50 % de B0. Cette<br />
valeur caractérise la zone de concentration dans laquelle le dosage présente la précision<br />
maximale. Lors du dosage, on doit donc trouver les dilutions de l’échantillons permettant<br />
d’obtenir des valeurs de concentration compris dans cette zone. (La sensibilité d’un dosage<br />
par compétition est définie de façon plus rigoureuse par la « concentration minimale<br />
détectable », c’est à dire la plus petite concentration d’antigène capable d’induire une
diminution statistiquement significative de la valeur de B0. Expérimentalement, elle est<br />
déterminée en calculant la concentration d’antigène correspondant à B0-3σ, σ étant l’écart<br />
type estimé sur la mesure de B0).<br />
La spécificité d’un dosage peut être évaluée en réalisant des courbes d’étalonnage avec<br />
des substances structuralement et fonctionnellement apparentées. On définit alors le<br />
pourcentage de réaction croisée RC (%) (critère d’Abraham, Abraham, 1974):<br />
RC (%) =<br />
[Ag]50%<br />
[analogue]<br />
50%<br />
Figure 33. Formule du critère d'Abraham (Abraham, 1974).<br />
x 100<br />
[Ag]50% et [analogue]50% représentant respectivement les concentrations d’antigène et<br />
d’analogue qui engendrent un signal de 50 % de B0. La comparaison des valeurs de B/B0 à<br />
50% mesurées pour une série de produits testés dans les mêmes conditions permet d’estimer<br />
l’affinité relative de chacun de ces produits pour les anticorps étudiés.<br />
Dans le cas du dosage de la Rameb, notre limite de détection est de 0.1 ng/mL et le<br />
B/B0 50% correspond à environ 1.5 ng/mL.<br />
La sensibilité d’un dosage dépend de nombreux paramètres et notamment de la<br />
concentration du traceur et de l’Ac. La règle générale est que le dosage sera d’autant plus<br />
sensible que l’anticorps et le traceur sont plus dilués. Cette règle découle du principe de la<br />
compétition, celle-ci s’exerçant plus facilement à l’avantage de l’antigène non marqué, si le<br />
traceur est peu concentré et si la concentration en Ac est limitante. En conséquence, si l’on<br />
veut utiliser un traceur à de très faibles concentrations, il faut que celui-ci possède une activité<br />
spécifique telle qu’à ces concentrations il fournisse encore un signal mesurable. C’est le cas<br />
de l’AchE dont la limite théorique de détection, dans les conditions d’utilisation habituelles<br />
(200µL d’Ellman, trajet optique de 0.44 cm, 1 heure de réaction) est de 1.85 10 -18 mole.<br />
211<br />
211<br />
Avec des traceurs aussi performants, c’est presque toujours la stabilité du complexe qui<br />
limite les dilutions que l’on peut faire subir à l’Ac. Même s’il est possible dans certains cas<br />
d’influencer la réponse immunitaire, il faut considérer que l’affinité des Ac produits par un<br />
animal échappe en grande partie à l’expérimentateur. Bien entendu, il n’est pas possible de<br />
diluer indéfiniment traceurs et anticorps et il existe, en théorie pour chaque dosage (un traceur<br />
et un Ac donné) une combinaison idéale qu’il conviendrait de déterminer à chaque fois. En<br />
pratique, on opère souvent de façon plus empirique en fixant arbitrairement la concentration
du traceur et en déterminant ensuite par dilutions successives, la concentration minimale<br />
d’anticorps utilisable. C’est la technique que nous avons utilisée.<br />
Pour chaque échantillon, nous avons évalué la qualité du dosage grâce au critère de<br />
répétabilité ou précision intra-essai, qui exprime la variation des résultats au cours d’une<br />
même analyse et est évaluée en dosant systématiquement sur une même plaque chaque<br />
échantillon à 4 concentrations différentes. Pour être pris en compte les résultats doivent bien<br />
sur se situer dans la zone proche du B/B0 50% (généralement 30% < B/B0 < 70%).<br />
212<br />
212
213<br />
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