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Thèse de doctorat de l’Université Paris 7 - Denis Diderot
UFR de Physique
Spécialité :
Interface Physique-Biologie
Présenté par :
Aurélien ROUX
pour obtenir le grade de DOCTEUR de l’UNIVERSITE PARIS 7
Sujet de la thèse :
Tubes de membrane dans le trafic
intracellulaire : aspects physiques et
biologiques
Jury composé de
M. François Gallet, Président
M. Bruno Antonny, Rapporteur
M. Laurent Bourdieu, Rapporteur
M. Bruno Goud, Directeur de thèse
Mme Patricia Bassereau, Co-directrice de thèse
M. Gerrit Van Meer, Examinateur
M. Owe Orwar, Membre invité

Remerciements :
Tous les manuscrits de thèse commencent par ce qui termine généralement le travail
de thèse, les remerciements. Et comme pour tous les remerciements, il me faut commencer
par les initiateurs de ce projet que j’ai creusé pendant presque quatre ans. Là s’arrêteront les
« comme tout le monde » car rien d’autre que l’encadrement que j’ai eu durant ces années n’a
été plus original. Patricia et Bruno m’ont permis d’évoluer entre leur deux laboratoires, et ont
su tisser un dialogue unique sans lequel rien de mon travail n’aurait été possible. J’ai pu ainsi
saisir les profondes différences entre l’approche scientifique des physiciens et celle des
biologistes, mais ils ont su eux, dépasser leur différences pour s’intéresser aux recherches de
l’autre, et forger une collaboration dont la force a porté le projet. Et il est peu de dire que cette
collaboration essentielle pour mon travail n’aurait été possible sans les qualités scientifiques
et surtout humaines de Patricia et Bruno. J’ai travaillé entre un laboratoire de physique et un
laboratoire de biologie, entre une jeune équipe en formation et une équipe déjà bien rodée, et
cela aurait pu être très déstabilisant sans leur soutien scientifique et humain. Cela a été au
contraire une expérience qui n’aurait pas pu être plus enrichissante, et je crois sincèrement
qu’ils ont tout autant appris que moi.
Je ne peux que remercier Jacques pour les discussions que nous avons eu où en quelques
minutes j’ai eu du boulot pour 20 ans ! L’essentiel de mon travail de thèse est souvent parti de
quelques points essentiels débattus avec Jacques. Et son enthousiasme venant à l’aide de sa
créativité, il ne me restait plus qu’à faire les manips.
L’institut Curie est un cadre merveilleux pour faire de la recherche, mais il ne le serait pas
sans les personnes qui y travaillent. Ils restent néanmoins séparés par leur discipline, et choisir
de commencer par les physiciens ou les biologistes qui m’ont tant apportés au cours de ces
années a été trop dur. Je les remercie tous sans avoir à choisir.
Giovanni a été un collègue avant qu’on ne se serre la main, deux minutes après s’être
rencontrés, et un ami depuis ! Sans lui, beaucoup des subtilités de la physique expérimentale
et de la Dolce Vita Italienne (croustillante !) me seraient encore inconnues. Ses explications
lumineuses l’ont rendu indispensable pour mon travail, et au travail de beaucoup.
Les explications non moins lumineuses de Clément et Franck en ont fait des partenaires horsnormes
pour comprendre la biologie moléculaire et cellulaire à la paillasse. Sans compter tous
les coups de main décisifs qu’ils m’ont apportés pour les purifications et expériences de
biochimie, et une vision large des problématiques cellulaires, ce qui est rare et précieux.
Un de mes premiers contacts directs avec les problèmes théoriques en physique a été en
compagnie d’Imre, qui a su m’expliquer simplement des formalisations qui me seraient
probablement restées opaques autrement. Avec sa gentillesse et sa patience, il a été l’artisan
du dialogue entre expériences et théorie pour mon projet.
D’autres ont participés à ma compréhension de la théorie, ici à Curie, et tout particulièrement
Jean-François dont la curiosité et la perspicacité ont été des atouts pour me faire comprendre
certains des aspects les plus abstraits de la physique. Cornélis, dont le travail a été directement
relié au mien, a, par ses simulations numériques, été d’un grand secours dans ma
compréhension des phénomènes physiques.
Enfin, Damien et Pierre pour leur aide quotidienne, et leur capacité à me supporter, doivent
recevoir de moi de chaleureux remerciements, et de nombreuses excuses, que je ne sais pas ou
mal dire. Ils forment un tandem d’une efficacité rare, et leur dynamisme y est pour beaucoup

plus qu’ils ne le croient dans la réalisation de mon travail. Toujours la bonne question,
toujours la bonne réponse, ils iront loin et leur amitié me manquera.
Je ne peux que remercier tous les gens des deux équipes qui m’ont accueilli d’avoir été d’une
aide constante et précieuse durant ces quatre années, merci à Aurélie pour son aide
enthousiaste, Cécile pour la recette des cookies, Jérôme pour les leçons d’histoire du foot,
Jacques pour son aide si nécessaire en informatique, Philippe pour la cuite mémorable au
Génépi et Otger (Viva Cataluña). Merci aussi à Florence (encore désolé pour les pipettes…),
Annick pour tous les produits qu’elle a toujours su trouver pour moi, Sandrine pour avoir
toujours LA solution, Solange pour tout l’intérêt qu’elle a porté à ce que je faisais, Arnaud
pour m’avoir initier aux joies de la paillasse (c’est déjà loin !), Valérie pour avoir supporter
d’être ma voisine durant un an et demi (pas facile !), Francesca pour son fabuleux Tiramisu,
Jean pour son aide précieuse et professionnelle sur tous les microscopes de l’institut,
Stéphanie pour toute la bonne humeur qu’elle diffuse, Elaine pour toute la joie sud-américaine
qu’elle communique et merci à Raphaëlle pour son aide quotidienne. Merci à Jean Baptiste
pour m’avoir permis d’utiliser sa thèse et bonne chance pour la suite ainsi qu’à tous les
nouveaux.
Merci aussi à Annie Rousselet pour la tubuline, Lucien et Ahmed pour les aides précieuses en
biochimie et culture cellulaire, et merci à Jean-Baptiste, Vincent et Jean pour la qualité du
service de microscopie.
La science m’a permis d’interagir avec de nombreuses personnes et groupes en France et en
Europe. Ca a été une aventure tellement enrichissante de discuter et travailler avec chacun
d’eux, que je ne peux que les remercier tous ensemble, avant de les remercier
individuellement.
Je voudrais remercier François et Thomas, à Heidelberg, Allemagne, qui les premiers m’ont
permis de faire avancer ce qui n’était alors qu’un projet de thèse, en nous donnant de la
kinésine et les moyens de la purifier. De même, je voudrais remercier Stefania et Alberto, à
Santa Maira Imbaro, Italie, pour les produits et les nombreux conseils qu’ils m’ont donnés.
Je voudrais remercier chaleureusement l’équipe de Marileen, AMOLF, Amsterdam, et en
particulier Gerbrand et Martijn, pour les heures passées à discuter de physique et de biologie,
et à manipuler ensemble. Nos deux projets étaient si proches que nous aurions pu être
concurrents directs, mais leur honnêteté scientifique et leur recherche d’interactions avec nous
nous ont poussés à la collaboration, qui reste un des meilleurs souvenirs de ma thèse.
Une autre équipe qui m’a beaucoup apporté pour mon travail de thèse est celle de Jean à
l’IJM, Paris, qui m’a accueilli dans la chaleureuse ambiance de son laboratoire pour y
apprendre les bases de la microscopie électronique. Je remercie en particulier Jean, Marie-
Aline et Michel qui m’ont particulièrement aidé pour les expériences, et tout le labo pour le
merveilleux accueil que j’y est reçu.
J’ai découvert la puissance de la chimie organique et le professionnalisme des chimistes
grâce à Pascale et Line, à l’IBL, Lille. Tant pour les questions scientifiques que pour les
problèmes techniques, leurs questions et leurs réponses ont permis de faire avancer à pas de
géant un projet qui serait probablement embryonnaire sans elles. C’est une collaboration qui,
je l’espère apportera beaucoup au reste de l’équipe de Patricia.
Je dois aussi remercier Bruno à Valbonne, ainsi que toute son équipe, pour son accueil et tout
le temps qu’il a passé avec moi au téléphone ou à la paillasse pour faire avancer un projet qui
n’a finalement pas marché. Quand il m’avait dit qu’on voyait le Mercantour et la Baie des
Anges depuis son bureau, je ne l’avais pas cru, mais je n’ai pu que constater la beauté du site
et la gentillesse des gens. Jean-Baptiste reprend ici le flambeau de cette collaboration, et j’ai
bon espoir de voir de beaux résultats en sortir, ainsi que de bons moments en perspective dans
l’équipe de Bruno. Je veux remercier Bruno aussi pour nous avoir aider pour notre article,
mais aussi pour être rapporteur de ma thèse.

De même, je dois remercier Laurent, à Strasbourg pour être le deuxième rapporteur de ma
thèse. Comme lui, je commence par étudier les membranes, et peut-être que l’avenir me
rapprochera de ses thématiques neuro-physiques.
Je voudrais remercier Gerrit qui me fait l’honneur de faire partie du jury de ma soutenance, et
que j’ai eu l’occasion de rencontrer dans l’un des congrès les plus enthousiasmant de ma très
jeune carrière dans la science.
C’est aussi un honneur d’avoir dans mon jury Owe, dont la maîtrise expérimentale des tubes
m’a toujours impressionnée : les quelques discussions animées et chaleureuses que nous
avons eu me laissent penser que ses questions ne seront pas des plus faciles.
Enfin, je voudrais remercier François que j’ai eu comme professeur, pour être membre de
mon jury, et j’apprécierai une fois de plus sa perspicacité et la finesse de ses questions le jour
de ma soutenance.
Je dois ici avoir une pensée pour ma famille, qui m’a soutenu et me soutiens jusque la dans
chacun de mes choix. Merci à tous mes frères et sœurs, Guillaume, Adrien, Manon, Julia et
Lucie, et merci à leur parents, maman, Marie-Lise, papa et Bernard.
Je ne pourrais terminer sans penser à Solène, qui m’a accompagné chaque jour dans
mon travail, chaque jour dans mon cœur. Elle m’a fait découvrir un autre façon de voir le
monde, ce qui est essentiel pour être un scientifique.
A tous merci,

Table des matières
TABLE DES MATIERES ....................................................................................................... 1
INTRODUCTION GENERALE ............................................................................................ 3
CHAPITRE 1 TRAFIC INTRACELLULAIRE ET MEMBRANES : PROTEINES
ET LIPIDES NECESSAIRES POUR DEFORMER, TRIER ET COUPER LES
MEMBRANES………………………………………………………………………………..9
I.1 DEFORMATION DE LA MEMBRANE ............................................................................. 11
I.1.1 Déformation par les manteaux............................................................................. 12
I.1.2 Déformation par les éléments du cytosquelette.................................................... 20
I.1.3 Déformation liée aux lipides et aux enzymes agissant sur les lipides.................. 27
I.1.4 Conclusion............................................................................................................ 31
I.2 TRI D’ELEMENTS MEMBRANAIRES ............................................................................. 32
I.2.1 Tri par interaction de cargos avec les manteaux................................................. 33
I.2.2 Tri par séparation de phase : Importance des radeaux lipidiques, ou « rafts ».. 37
I.3 COUPURE DE MEMBRANE OU FISSION ........................................................................ 46
I.3.1 La dynamine, ressort moléculaire........................................................................ 46
I.3.2 Rôle des lipides et des acyls transférases............................................................. 49
I.3.3 Conclusion............................................................................................................ 50
I.4 DEFORMATION, TRI ET FISSION : QUE CONCLURE ? ................................................... 51
CHAPITRE 2 PHYSIQUE DES BIOMEMBRANES : PARAMETRES
IMPORTANTS POUR DEFORMER, COUPER LES MEMBRANES LIPIDIQUES ET
TRIER LES LIPIDES............................................................................................................ 53
II.1 DESCRIPTION CLASSIQUE DE CANHAM-HELFRICH : LA MEMBRANE EST UN CHAMP DE
COURBURE............................................................................................................................. 56
II.1.1 Les trois déformations possibles d’une surface ............................................... 56
II.1.2 La représentation de Monge : la membrane faiblement fluctuante ................. 59
II.1.3 Vérification expérimentale du modèle de Canham-Helfrich............................ 65
II.2 TUBES DE MEMBRANE. .............................................................................................. 68
II.2.1 Expression d’Helfrich dans le cas des tubes de membrane ............................. 69
II.2.2 Forme précise des tubes................................................................................... 71
II.2.3 Une transition dans la forme correspond à une transition dans la force ........ 72
II.2.4 Faisceaux de tubes ou tubes uniques ? ............................................................ 74
II.3 EXEMPLES THEORIQUES ET EXPERIMENTAUX DE PHENOMENES PHYSIQUES
IMPORTANTS POUR DEFORMER, TRIER ET COUPER LES MEMBRANES...................................... 75
II.3.1 Déformations des membranes .......................................................................... 76
II.3.2 Séparation de phase induite par la courbure de la membrane : rôle potentiel
dans le tri et la fission. ..................................................................................................... 88
II.4 CONCLUSION............................................................................................................. 91
CHAPITRE 3 MISE EN PLACE D’UN SYSTEME MINIMAL REPRODUISANT
LA FORMATION DE TUBES DE MEMBRANES TIRES PAR DES MOTEURS
MOLECULAIRES. ................................................................................................................ 93
III.1 PROTOCOLES ET DETAILS TECHNIQUES...................................................................... 96
1

III.1.1 Description du système in vitro........................................................................ 96
III.1.2 Purifications de la kinésine et de la tubuline ................................................... 99
III.1.3 Vésicules Géantes et membranes Golgiennes ................................................ 101
III.1.4 Protocoles pour la formation de tubes de membrane par des moteurs
moléculaires ................................................................................................................... 104
III.2 RESUME DE L’ARTICLE N°1 : ROUX ET COLL . PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., 16
AVRIL 2002: 99 (8): 5394-9. A MINIMAL SYSTEM ALLOWING TUBULATION WITH MOLECULAR
MOTORS PULLING ON GIANT LIPOSOMES. ........................................................................... 113
III.3 ARTICLE N°1........................................................................................................... 117
III.4 DISCUSSIONS ET EXPERIENCES COMPLEMENTAIRES................................................. 125
III.4.1 Nombre de moteurs nécessaires et rôle des agrégâts de moteurs dans la
formation des tubes. ....................................................................................................... 125
III.4.2 Rôle des agrégats de moteurs dans l’extraction de tubes à partir de
membranes golgiennes ................................................................................................... 131
III.5 CONCLUSION........................................................................................................... 137
CHAPITRE 4 ETUDE DU TRI DE LIPIDES PAR COURBURE ET DE LA
COUPURE DE TUBES TIRES A PARTIR DE VESICULES A DEUX PHASES. ...... 139
IV.1 RESUME DE L’ARTICLE 2 : ROUX ET COLL. ROLE OF CURVATURE AND PHASE
SEPARATION IN LIPID SORTING AND FISSION OF MEMBRANE TUBULES. (SOUMIS)................. 142
IV.2 ARTICLE N°2........................................................................................................... 147
IV.3 EXPERIENCES COMPLEMENTAIRES ET DISCUSSION .................................................. 177
IV.3.1 Tri de lipides et courbure............................................................................... 177
IV.3.2 Séparation de phase et coupure ..................................................................... 182
IV.3.3 Couplage tri-coupure ..................................................................................... 186
IV.3.4 Conclusion...................................................................................................... 193
CONCLUSION GENERALE ............................................................................................. 195
BIBLIOGRAPHIE............................................................................................................... 199
ANNEXES............................................................................................................................. 209
ANNEXE 1 : PROTOCOLE DE PURIFICATION DE LA KINESINE BIOTINYLEE
................................................................................................................................................ 211
ANNEXE 2 :PURIFICATION DE LA TUBULINE......................................................... 217
2

Introduction générale
agrégats de membranes golgiennes biotinylées et marquées à la streptavidine fluorescente.
3

C’est au milieu du 19 ième siècle que la chimie particulière du monde vivant a été
révélée. Les constituants majoritaires en sont le carbone, l’oxygène, l’hydrogène et l’azote, et
depuis, toute une série de réactions et de propriétés chimiques particulières ont été
découvertes, fondant les bases de la chimie organique et de la biochimie. Louis Pasteur, après
avoir défini la chiralité (une même formule chimique peut dans certains cas correspondre à
deux composés, appelés énantiomères, images l’un de l’autre dans un miroir), montra que les
molécules du vivant étaient constituées d’éléments chiraux d’un seul type d’énantiomère.
La structure de la matière vivante fut découverte dans la première partie du 19 ième
siècle, grâce à l’amélioration des techniques de microscopie. La définition de l’unité vivante
minimale, ou cellule, fut donnée vers 1830, et reste à ce jour un des critères généraux pour
définir le vivant. La cellule est la plus petite partie de tout organisme vivant qui en possède
toutes les caractéristiques à savoir, une chimie particulière, la capacité de se reproduire à
l’identique, la capacité de s’auto entretenir et d’être un système thermodynamique ouvert.
Mais il a fallu attendre presque un siècle avant de tout juste commencer à entrapercevoir la
structure interne des cellules.
C’est le célèbre cytologiste italien Camillo Golgi qui le premier, grâce à un colorant
cellulaire à base de nitrate d’argent, découvrit la première structure subcellulaire qui porte
aujourd’hui son nom : l’appareil de Golgi. Il découvrit cette structure réticulée car elle fixait
particulièrement bien le colorant dans certaines cellules nerveuses [1,2]. Golgi ne chercha
jamais à étudier précisément les structures sub-cellulaires, et son travail fut centré sur l’étude
du réseau que forment les neurones. Il n’y attribua donc pas de rôle particulier à ce
compartiment sub-cellulaire, et ce fut un autre biologiste qui au cours de la même période
donna les premiers éléments qui montraient l’existence de compartiments intracellulaires
possédant une composition et une fonction particulière. Elie Metchnikoff, tout comme Golgi,
ne chercha pas à percer la structure des cellules : il eut le prix Nobel pour la découverte de
l’immunité cellulaire [3]. Mais il étudia la phagocytose, au cours de laquelle il remarqua que
les éléments phagocytés étaient exposés à un pH acide avant d’être digérés. Ce fut un premier
pas vers le concept de la compartimentalisation des cellules eucaryotes.
Il a fallu attendre le milieu du 20 ième siècle pour que la mise au point de la microscopie
électronique et des premières ultra-centrifugeuses permette l’étude approfondie des
compartiments cellulaires. De nombreux organites fut alors découverts et isolés, comme les
lysosomes, usines de recyclage des cellules, le réticulum endoplasmique, les vésicules de
sécrétions. Les tests biochimiques sur ces organites isolés par centrifugation permirent de
montrer que la composition de ces organites était différente du reste de la cellule et adaptée à
5

une fonction cellulaire comme la dégradation des protéines pour les lysosomes riches en
protéases. Le concept de compartimentalisation (la cellule est constituée d’organites délimités
par une membrane, ayant une composition et une fonction particulières dans la cellule)
émergea réellement à cette époque.
Mais ce fut l’étude de la biosynthèse des protéines qui permit de faire émerger ce qui
représente aujourd’hui un thème dominant de la recherche en biologie cellulaire : le trafic
vésiculaire. De nombreuses expériences, parmi lesquelles les plus décisives furent sans doute
celles du groupe de Christian de Duve et George Palade, montrèrent l’existence d’un trafic
intracellulaire. Grâce à un précurseur radioactif des protéines, ils montrèrent que les enzymes
sécrétées par les cellules acineuses du pancréas étaient d’abord synthétisées dans le réticulum
endoplasmique, puis passaient à l’appareil de Golgi, pour enfin se retrouver dans les grains de
sécrétion avant d’être sécrétées dans la lumière de l’acinus. Aujourd’hui, de nombreuses
autres voies ont été découvertes (voir figure 1), permettant de faire le lien entre tous les
organites de la cellule, mis-à-part les mitochondries, qui communiquent essentiellement par
transport transmembranaire. Les deux voies principales restent la voie dite antérograde (ou
sécrétion, découverte par de Duve et Palade), et la voie rétrograde (en sens inverse, passant de
la membrane plasmique aux endosomes, puis des endosomes au Golgi et enfin au réticulum
endoplasmique).
La mise en évidence de ce trafic intracellulaire posa immédiatement le problème de sa
réalisation : comment des protéines ne traversant pas les membranes biologiques pouvaient
voyager à travers plusieurs organites délimités par des membranes ? L’idée d’un trafic médié
par de petites vésicules de membrane, bourgeonnant d’un compartiment donneur, diffusant
jusqu’à un compartiment dit accepteur avec lequel elles fusionnent fut émise [4] et étayée par
la découverte en microscopie électronique de petites vésicules d’environ 50 nm attachées ou
proches de la membrane plasmique [5].
6

Mais ce trafic par petites vésicules, aussi appelées intermédiaires de transport, posa
plusieurs questions très simples mais dont les réponses prirent plusieurs décennies à être
découvertes : comment la membrane se déforme-t-elle en vésicule ? Comment la vésicule se
sépare-t-elle de la membrane donneuse ? Comment les éléments à exporter sont-ils triés dans
la vésicule en formation ? Comment la vésicule voyage-t-elle jusqu’au compartiment
accepteur ? Comment fusionne-t-elle avec ce compartiment ? Et enfin, comment la vésicule
qui bourgeonne à partir d’un compartiment donneur est spécifiquement adressée au
compartiment accepteur ? Nous verrons dans un premier chapitre les réponses que les
biologistes ont pu donner à ces questions depuis les années soixante.
Figure 1 : Principales voies du trafic intracellulaire impliquant ou non des manteaux protéiques. Endosome :
compartiment d’arrivée des vésicules d’endocytose. Lysosomes : organite de dégradation de certains
constituants cellulaires. Endoplasmic reticulum, organite où à lieu la biosynthèse des protéines non
cytosoliques. Appareil de Golgi, orienté, les protéines arrivant du réticulum entrant par la face cis et sortant
par la face trans (dans l’hypothèse classique). D’après [6].
Un aspect important de ce trafic est qu’il fait intervenir un élément aux propriétés
mécaniques particulières : la membrane lipidique. La nature lipidique de la membrane et son
organisation en deux feuillets d’épaisseur moléculaire est connue depuis très longtemps [7,8].
Mais sa nature fluide à 2D, qui est une caractéristique assez rare, ne fut découverte
qu’au début des années 70, lorsque l’on découvrit que les protéines membranaires provenant
7

de cellules ayant fusionnées pouvaient diffuser librement d’une cellule à l’autre. Le modèle
dit de Singer et Nicolson, ou modèle de la membrane mosaïque fluide à deux dimensions fut
proposé au début de l’année 1972 [9]. Les caractéristiques particulières de la membrane
cellulaire sont en partie liées à sa nature chimique : les phospholipides qui la composent
s’organisent spontanément en bicouche de quelques nanomètres d’épaisseur. Cette association
spontanée explique aussi une autre caractéristique des membranes lipidiques : elles sont auto-
cicatrisantes. Si un pore vient à apparaître, il se referme spontanément. De plus, la majorité
des phospholipides cellulaires ont des insaturations sur leurs chaînes carbonées, garantissant
la fluidité de la membrane à la température physiologique. Cette fluidité est aussi garantie par
un autre composant majeur des membranes cellulaires, le cholestérol.
Les membranes lipidiques ont très tôt intéressés les physiciens, à la fois pour leur
propriété d’auto organisation, mais aussi et surtout car leur fluidité bi-dimensionnelle leur
confère des propriétés mécano-élastiques particulières. Le premier modèle décrivant
quantitativement les propriétés de la membrane fut proposé par W. Helfrich en 1973, soit
juste après la description proposée par Singer et Nicolson [10]. Ce modèle ne tient compte
que des déformations possibles de la membrane et de sa fluidité, et ne tient pas compte de sa
structure moléculaire. Nous verrons dans un deuxième chapitre que ce modèle, avec quelques
modifications ajoutées par la suite, décrit qualitativement et quantitativement la quasi-
majorité des comportements mécaniques de la membrane.
L’objet de cette thèse a été d’essayer de comprendre quels paramètres physiques et
propriétés mécaniques étaient importants dans le cadre du trafic vésiculaire. Autrement dit,
quelles sont les propriétés physiques des membranes cellulaires qui sont exploitées par les
cellules pour mener à bien le trafic vésiculaire. Pour cela, nous avons mis en place un système
in vitro très simple, décrit dans le chapitre 3, permettant de mimer la formation d’un type
d’intermédiaire de transport, les tubules, ou tubes de membrane, dans des conditions
suffisamment maîtrisées pour en comprendre les propriétés physiques. Ce système n’est
constitué que de trois éléments, parmi lesquels des vésicules (liposomes) géants, dont la
composition est modifiable et maîtrisée. Dans le chapitre 4, nous montrerons qu’en modifiant
la composition pour s’approcher d’une composition plus proche de celle des membranes
cellulaires, nous avons pu obtenir un système ayant les trois caractéristiques nécessaires à la
formation des intermédiaires de transport : déformation de la membrane, tri des éléments
membranaires et coupure de l’intermédiaire de transport de sa membrane donneuse.
8

chapitre 1 Trafic Intracellulaire et
membranes : protéines et lipides
nécessaires pour déformer, trier et
couper les membranes.
vésicules géantes recouvertes de Sar1p marqué à l’Oregon Green.
9

La découverte du parcours des protéines néosynthétisées à travers les différents
organites cellulaires à permis d’émettre l’hypothèse d’un transport de ces protéines par
bourgeonnement/fusion de petites vésicules selon le schéma présenté sur la figure 2. Les
étapes de ce processus restent dans l’ensemble et dans certains détails vérifiées
expérimentalement sur de nombreuses voies intracellulaires [6]. Dans une première étape, la
membrane du compartiment donneur est déformée pour former un bourgeon. C’est l’étape de
déformation classiquement réalisée par des protéines dites de manteaux qui couvrent la
membrane et lui imposent une courbure. Ensuite, non représentée sur la figure 2, il y a une
étape de tri des éléments membranaire à exporter, qui se trouvent enrichis dans le bourgeon.
Puis le bourgeon (vésicule) est séparé de la membrane donneuse par « fission » du cou les
connectant. L’intermédiaire de transport est ensuite acheminé jusqu’à l’organite accepteur par
diffusion libre ou par interaction avec des éléments du cytosquelette. Enfin, il fusionne avec le
compartiment accepteur grâce à une machinerie complexe faisant intervenir les complexes
SNAREs que nous ne détaillerons pas ici. Les différentes familles de protéines intervenant
dans chacune de ces étapes (déformation, tri et fission) de la première phase du trafic
vésiculaire commencent à être bien décrites, mais une grande part des mécanismes mis en jeu
reste mal connue.
I.1 Déformation de la membrane
Au cours de la découverte des intermédiaires du transport membranaire est rapidement
apparue la question de leur formation. Le schéma classique du trafic intracellulaire qui reste
vrai dans la majorité des cas commence par une étape de bourgeonnement de la membrane,
créant ainsi une vésicule ou un tube encore connecté à la membrane donneuse (voir plus
haut). La découverte de la clathrine, puis la généralisation au principe de manteaux, ont
permis de donner les premières réponses. Récemment, de nouveaux modes de déformation
ont été mis en évidence impliquant des acteurs du cytosquelette et des lipides dont on ne
connaissait aucun rôle jusque là dans la déformation des membranes.
11

Figure 2 : Schéma simple d’une étape de transport vésiculaire : de 1 à 2 la membrane d’un compartiment
donneur est déformée par des protéines de bourgeonnement (ou manteaux), puis séparée du compartiment
par des protéines de fission. Après transport grâce à des éléments du cytosquelette (3), la vésicule fusionne
avec le compartiment accepteur (4 à 5) grâce à des protéines de fusion.
I.1.1 Déformation par les manteaux
I.1.1.1 Clathrine et complexes AP
La découverte de la formation de bourgeons recouverts d’un amas dense de protéines
[5] à la membrane plasmique d’ovocytes d’insectes a été le premier pas dans la découverte de
la clathrine. La visualisation dans le plan de la membrane de ces amas a révélé une structure
très simple, formant un quadrillage d’hexagones et de pentagones particulièrement régulier.
Comme pour un ballon de football, le pavage hexagone-pentagone s’adapte parfaitement à
une forme sphérique et beaucoup moins bien sur un plan. Cette découverte a tout de suite
suggéré que la formation de ce « manteau » sur la surface de la membrane imposait une
déformation sphérique, déformant la membrane en un bourgeon.
12

La clathrine fut isolée comme le composant majeur des vésicules d’endocytose
purifiées à partir de cerveau, à la fin des années 60, début des années 70. Cette protéine de
190 kDa possède une structure très particulière : elle s’associe en trimère ayant la structure
d’une étoile à trois branches appelée triskelion qui s’adapte parfaitement sur la structure d’une
vésicule sphérique en formant un quadrillage hexagone-pentagone (voir figure 3). Chaque
branche mesure environ 475 Å, et 20 Å de diamètre. Chaque branche est également associée à
une chaîne légère (25 kDa) dont le rôle pourrait être de réguler l’association en triskélions et
l’interaction de la clathrine avec différents partenaires.
Figure 3 : Positionnement des triskélions de clathrine sur une cage réalisée in vitro par association de
clathrine et de complexe AP-2. Les données ont été obtenues par cryomicroscopie avec une résolution de 21
Å. Trois triskélions sont représentés en B (rouge bleu et jaune) pour montrer leur insertion exacte dans le
pavage du réseau. Extrait de [11].
Ainsi, la structure de la molécule de clathrine explique directement la structure du réseau, et
par là même comment la membrane est déformée par le réseau de clathrine.
Cependant, il a été constaté que la clathrine seule, in vitro, formait principalement des
réseaux plans ne possédant que des hexagones. Ces réseaux plans, dont la maille est quelque
peu différente de celle observée sur les vésicules, sont également retrouvés in vivo sur la face
cytosolique de la membrane plasmique, laissant supposer que les associations plans de
clathrine seule peuvent avoir un rôle physiologique. Elles ont été depuis retrouvées sur les
endosomes où elles pourraient servir de plate-forme d’accostage et de tri de vésicules. Donc,
13

même si la clathrine est l’élément structurant la régularité de ce manteau, il ne semblait pas
qu’elle soit suffisante pour provoquer la déformation membranaire.
Un autre composant majeur des vésicules couvertes de clathrine purifiées à partir de
cerveaux est le complexe AP-2, pour Adaptor Protein complex 2 [12]. Ce complexe est
composé de 4 protéines : l’adaptine α ; l’adaptine β2, l’adaptine µ2 et l’adaptine σ2. On
connaît à l’heure actuelle 4 complexes AP ayant une structure similaire à AP-2, et intervenant
dans des voies de transport différentes: AP-1, qui intervient dans la formation de vésicules à
partir du Golgi en direction des lysosomes et/ou des endosomes, AP-2 qui forme toutes les
vésicules d’endocytoses (membrane plasmique) en direction des endosomes, et AP-3 qui
forme les vésicules à partir des endosomes en direction du Golgi et/ou des lysosomes. AP-4 a
été quant-à-lui localisé au TGN. Ils sont tous constitués de 4 sous unités [13] et ont
globalement la forme d’un pavé avec deux « oreilles », domaines d’interaction à la clathrine,
ainsi qu’à d’autres protéines (figure 4A). Ces deux oreilles sont des domaines globulaires des
protéines α et β. AP-2 a aussi la capacité de se lier à des récepteurs transmembranaires, ainsi
qu’à certains lipides régulateurs, les phosphoinositides. AP-2, comme son nom l’indique,
permet donc de lier les triskélions de clathrine à la membrane. Surtout, l’interaction clathrine-
AP-2 suffit in vitro à reformer une cage sphérique avec une alternance d’hexagones et de
pentagones. (Voir figure 3). C’est donc le recrutement à la membrane de la clathrine par AP-2
qui provoque la déformation. Deux points sur la structure de ces composants sont importants :
le fait que AP-2 se lie par deux endroits à la clathrine force la clathrine à se courber pour
épouser la forme du complexe et surtout, la flexibilité des bras du triskélion permet cette
courbure, qui engendre la déformation membranaire. Le schéma des différentes étapes de la
déformation par la clathrine est présenté en figure 4B.
14

Figure 4 : A-structures des triskélions de clathrines et des complexes AP. B- séquence de la déformation de
la membrane induite par le recrutement de la clathrine via le complexe AP-2. Les complexes AP (orange)
s’oligomérisent suite à l’interaction avec des récepteurs transmembranaires (bleu) ou/et des
phosphoinositides. Ils recrutent alors des triskélions de clathrine (jaune) qui doivent se courber et déforment
alors la membrane. Extrait de [12].
Même si la structure et les différents partenaires intervenant dans le bourgeonnement
des vésicules de clathrine commencent à être bien connus, il existe peu d’éléments sur la
séquence des évènements aboutissant à la déformation. Cependant, il a récemment été montré
que comme pour la plupart des manteaux, l’initiation du processus dépendait d’un interrupteur
GTPactif/GDPinactif. Ainsi, le recrutement des complexes AP-1 (voie Golgi
lysosome/endosome) et AP-3 (voie endosomes-Golgi/lysosomes) sur des liposomes est
dépendant de ARF1 (ADP-Ribosylation Factor 1), une petite protéine G intervenant
également dans la fixation des manteaux COPI [14,15]. De même, le recrutement des
protéines GGAs, qui ont une fonction et une structure analogues aux complexes AP
permettant la liaison de la clathrine à l’appareil de Golgi, dépend de ARF1 in vivo [16]. De
plus, la formation des vésicules de clathrine à la membrane plasmique dépend de la présence
15

de GTP. Cependant, une autre GTPase, la dynamine, qui intervient dans la fission des
bourgeons de clathrine pourrait expliquer ce résultat.
Bien que sa structure et celle du réseau qu’elle forme suggérait qu’elle fût responsable
de la déformation à elle seule, la clathrine apparaît aujourd’hui dépendante de protéines
« accessoires » [12] pour effectuer la déformation de la membrane.
I.1.1.2 COP I et COP II
C’est à la fin des années 80 que les complexes COPs (Coat Protein Complex ou
Coatomère) ont été découverts grâce en particulier au développement d’un système in vitro de
reconstitution d’étapes de transport entre Golgi et RE, et de mutants de la sécrétion chez la
levure. Il a rapidement été établi que COP II intervenait dans la formation des vésicules à
partir du RE en direction de l’appareil de Golgi (flux antérograde) et que COP I formait les
vésicules du Golgi vers RE (flux rétrograde). Le rôle de COP I dans les échanges entre
citernes dans le sens antérograde reste controversé. Quelques nuances ont cependant été
ajoutées : il existerait un compartiment intermédiaire (VTCs pour Vesiculo-Tubular Clusters)
entre RE et Golgi duquel bourgeonneraient les vésicules COP II [17]. D’autres part, d’autres
voies de transports entre Golgi et réticulum ont été mise en évidence et semblent
indépendantes des COPs [18,19].
De même que pour la formation des vésicules de clathrine, la séquence biochimique et
les détails de l’initiation de la formation des manteaux COPs est relativement bien connue [6].
Ceci est en partie du au fait que le nombre de protéines mises en jeu est ici moins important
que pour la clathrine. COP I est un gros complexe de 7 protéines qui s’associe en réseau sur la
membrane suite à l’activation d’une petite protéine G, ARF1. La forme liée au GDP de ARF1
peut s’associer transitoirement à la membrane, et une fois à la membrane, le GDP peut être
échangé par du GTP. La forme liée au GTP est alors durablement fixée à la membrane et peut
recruter COP I. COP II fonctionne sur un principe similaire, mais à trois étages : l’initiation
est provoquée par la liaison de Sar1p (une autre petite protéine G) au GTP, puis elle se lie à la
membrane, recrutant les deux complexes formant COP II, Sec23p/24p et Sec13p/31p (voir
figure 5). Contrairement à la clathrine, ce sont les complexes COPs qui se lient directement à
la membrane, et aux récepteurs transmembranaires. Il n’y a d’équivalent du complexe AP.
16

Figure 5 : Initiation et formation d’une vésicule par les manteaux COPs et leurs différents partenaires.
Extrait de [6].
Bien que la régulation biochimique des manteaux COPs soit bien connue, elle ne
donne que très peu d’informations sur les acteurs réels de la déformation membranaire. La
structure si belle des cages de clathrine ayant permis de disséquer le rôle de chacun des
17

acteurs de la déformation, les chercheurs ont essayé d’analyser la structure des manteaux
COPs. Cependant, la structure des manteaux COPs est longtemps restée un mystère, car
contrairement à la clathrine, aucun maillage polygonal n’était clairement visible. Récemment,
deux études menées en parallèle [20,21] ont permis de déterminer la structure des deux
complexes formant COP II, Sec23p/24p et Sec13p/31p, et de reconstituer leur assemblage sur
des vésicules COP II. En ajustant la forme du complexe Sec13p/31p sur des images de
vésicules COP II, les auteurs font apparaître un maillage hexagonal/pentagonal ressemblant à
celui de la clathrine (figure 6).
Figure 6 : En ajustant la forme du complexe Sec13p/31p sur des images de vésicules COP II, on fait
apparaître un maillage hexagonal/pentagonal. Extrait de [21].
Cependant, l’architecture de l’assemblage de COP II est loin d’être élucidée, et
l’acteur qui impose la courbure, difficile à isoler. Il est probable que comme pour la clathrine,
ce soit l’association de deux protéines qui génère le bourgeon. Une avancée technique a
cependant été réalisée avec la reconstitution in vitro de cages de COP II purifié [22]. Il est
probable que comme pour la clathrine, l’étude de cette structure purifiée permette une
compréhension plus complète de cette déformation.
I.1.1.3 Les caveolae
A part les manteaux COPs et clathrine, peu d’autres structures bien identifiées sont
connues pour avoir une action déformante en polymérisant sur la membrane. C’est cependant
le cas de la caveoline, une protéine nécessaire à la formation des caveolae. Découvertes dans
18

les années 50 par Palade et Yamada, les caveolae ont été repérées en microscopie électronique
dans les cellules endothéliales où elles abondent. Elles ont été impliquées dans le transit des
protéines du sérum sanguin vers les espaces interstitiels entourant les cellules des tissus. Elles
ont une forme ressemblant à une invagination de type clathrine avec cependant une forme
plus ovoïde que sphérique, et sont localisées à la membrane plasmique. Cependant, le
manteau qui les recouvre apparaît beaucoup moins dense en microscopie électronique que le
manteau clathrine. La structure fine du manteau est aussi très différente : elle est striée au lieu
d’un quadrillage hexagone/pentagone, ce qui laisse imaginer une organisation en bandelette
autour de la cage sphérique. Les caveolae sont dans certains tissus fermées par un diaphragme
protéique. Elles sont très stables, et la séparation de la membrane plasmique semble rare. Elles
ont cependant été cependant impliquées dans un voie d’endocytose [23]. Un des constituants
principaux des caveolae est une petite protéine de 21 kDa, la caveoline aux propriétés
particulières. Il existe 3 caveolines différentes chez les mammifères, dont la caveoline 1 qui
est ubiquitaire. Les souris dépourvues du gène de la caveoline 1 (souris knock-out pour la
caveoline 1) se portent très bien, mais sont dépourvues de caveolae dans les tissus où seule la
caveoline 1 est normalement présente [24]. La caveoline est une protéine qui s’insère dans le
feuillet cytosolique de la bicouche, mais dont les extrémités N et C-terminales sont
cytosoliques (Voir figure 7). Elle dimérise et est palmitoylée en C-terminal, augmentant sa
liaison à la membrane. De plus elle se lie par le domaine intra-membranaire au cholestérol, ce
qui pourrait expliquer que la composition lipidique et protéique des caveolae est proche de
celle des rafts (voir plus bas).
Figure 7 : Structure et composition simplifiées d’une caveolae. D’après [23].
Pour l’instant, les acteurs et le mécanisme par lesquels la déformation est produite
reste hypothétique : le plus probable est que la déformation est liée à l’insertion de la
19

caveoline dans le feuillet externe de la bicouche et à son organisation en bande autour de la
cage. Mais aucune expérience ne permet de confirmer cette hypothèse. Il est à noter
cependant que la caveoline constitue le seul manteau à s’insérer profondément dans la
membrane, et à ne pas avoir une structure en quadrillage hexagone-pentagone. En cela, ce
manteau est très différent des manteaux « classiques » de clathrine et de COPs.
I.1.1.4 conclusion
Les manteaux ont été les premiers acteurs dont le rôle dans la déformation
membranaire ait été élucidé. De nombreux points sont communs à tous les types de manteaux,
notamment le fait que les protéines des manteaux s’associent sur la membrane en une
structure adaptée à la forme sphérique. La régulation de la fixation de ces manteaux est
généralement due à des petites protéines G. Le fait que la quasi-totalité des voies de transport
intracellulaire soient régulées par de petites protéines G laisserait supposer que les manteaux
sont présents sur toutes les voies de transport. Mais aucun membre de la famille des protéines
Rabs, qui constitue la famille la plus importante de ces régulateurs, n’a été pour l’instant
impliqué dans la fixation des manteaux. Des intermédiaires de transport tubulaires sont
souvent observés dans les voies régulées par les protéines Rabs. La présence de ces tubules,
bien qu’ils puissent être artéfactuels [25], et le fait que nombre de protéines Rab interagissent
directement avec des moteurs moléculaires [26,27] laissent supposer un mode de formation de
ces intermédiaires dépendant du cytosquelette.
I.1.2 Déformation par les éléments du cytosquelette
Le cytosquelette est constitué de trois sortes de composants : premièrement, de
protéines capables de polymériser en long filaments avec une dynamique complexe de
croissance-décroissance. C’est le cas de l’actine et de la tubuline qui polymérisent
respectivement en filaments d’actine et en microtubules. Deuxièmement, de protéines
motrices qui se déplacent le long de ces filaments ou les déplacent. C’est le cas des myosines
qui interagissent avec l’actine, et c’est également le cas des kinésines et des dynéines qui
20

interagissent avec les microtubules. Enfin, il existe tout un ensemble de protéines
interagissant avec ces différents éléments et ayant des fonctions diverses, mais dont nous ne
parlerons pas ici.
Bien que ces différents acteurs aient été impliqués dans de nombreux phénomènes de
déformation membranaire, allant de la motilité cellulaire, à la fragmentation de l’enveloppe
nucléaire au cours de la division cellulaire [28], nous nous concentrerons sur leur rôle dans la
déformation membranaire au cours du trafic intracellulaire. La figure 8 donne une idée des
trois modes de déformation possibles générés par les protéines du cytosquelette.
Figure 8 : Les trois modes de déformation de la membrane par le cytosquelette. Soit la membrane est
attachée aux filaments et lorsque les filaments se déplacent, ils déforment la membrane, soit les moteurs
tirent sur la membrane, soit les filaments, en polymérisant invaginent la membrane.
I.1.2.1 déformation par les microtubules, les dynéines et les kinésines
La tubuline a été découverte pour son rôle dans la formation du fuseau mitotique il y a
une quarantaine d’année. C’est une protéine dimérique (tubuline α et tubuline β, ~60 kDa
chacune) qui polymérise en tubes rigides de 25 nm de diamètre appelés microtubules (MTs).
Ces tubes sont constitués de 13 protofilaments, chaînes de monomères α−β, arrangés en
hélice, et sont orientés avec une extrémité + où la tubuline polymérise activement et une
extrémité – où elle polymérise lentement. Pour polymériser, la tubuline doit être liée au GTP,
21

qu’elle est aussi capable d’hydrolyser. Classiquement, on considère que le bout croissant du
microtubule (+) est constitué de tubuline liée au GTP alors que la tubuline du corps du
microtubule a hydrolysé son GTP en GDP. Tant que la « coiffe » GTP est présente, le
microtubule croît. Si elle disparaît, le microtubule dépolymérise rapidement par une
« catastrophe ». Puis le cycle recommence, jusqu’à la catastrophe suivante.
Sur ces microtubules se déplacent deux types de moteurs, les kinésines se déplaçant
majoritairement vers les bouts +, et les dynéines vers les bouts - . Ce sont majoritairement des
moteurs processifs, c’est-à-dire capables de faire plusieurs pas sur le filament avant de se
décrocher, et qui utilisent l’ATP pour avancer et générer une force de propulsion. Leurs
structures sont similaires bien que leurs sous-unités soient très différentes. Les kinésines sont
des tétramères constitués de 2 chaînes légères (~ 25 kDa) et 2 chaînes lourdes (~ 100 kDa)
s’associant en dimère par des domaines coil-coiled sur la queue et ayant deux têtes globulaires
qui se lient alternativement au microtubule pour avancer (voir figure 9). Les dynéines sont
construites sur le même principe (voir figure 9), avec deux chaînes lourdes possédant les
domaines moteurs, et de nombreuses sous-unités (régulatrices) fixées sur la queue, qui
interagit avec le cargo. Elles utilisent également l’ATP pour se mouvoir. Dans les années 80,
il a été montré que ces moteurs étaient impliqués dans le trafic des vésicules de transport le
long des axones [29], ce qui a récemment été reproduit in vitro, permettant d’en étudier la
régulation [30,31]. Quantités d’études ont été réalisées sur ces moteurs pour en comprendre le
fonctionnement mécanique. Il est intéressant de noter que les vitesses in vitro (de l’ordre du 1
µm/s) sont généralement inférieures aux vitesses in vivo (de 0,5 à 3 µm/s). Les études des
propriétés physique de la kinésine ont été plus poussées car elle est plus simple à purifier que
la dynéine qui est un hétéro-complexe : on sait maintenant que sa force d’arrêt est d’environ 5
pico-Newton (pN). Sa processivité est d’environ 100 pas soit un temps de fonctionnement
d’environ 1 seconde pour parcourir 800 nm. Son pas est de 8 nm, soit la taille d’un dimère de
tubuline. Un ATP est hydrolysé par pas [32].
22

Figure 9 : Structure des deux principaux moteurs moléculaires interagissant avec les microtubules : la
kinésine conventionnelle et la dynéine cytoplasmique. Sont représentées en bleu les parties motrices, qui
sont aussi appelées têtes, en vert les sous-unités régulatrices, et en violet le domaine globulaire de la queue
de kinésine, qui peut interagir avec la tête pour l’inhiber lorsque aucun cargo n’est lié. D’après [33].
C’est à la fin des années 80 qu’il fut montré que ces moteurs étaient également
impliqués dans la formation de tubes de membrane (ou tubules) à partir de différents organites
[34,35]. En mélangeant in vitro, des membranes d’organite (Golgi ou RE), du cytosol et de
l’ATP sur un tapis de microtubules collés sur une surface de verre, la croissance de tubes de
membranes à partir de ces organites a pu être observé (voir figure 10). Le fait qu’il y ait
besoin d’ATP, que les tubes poussent le long des MTs en direction du bout + à une vitesse de
l’ordre de 1 µm/s et que sans cytosol (fournissant les moteurs) l’essai ne marche pas, permit
de conclure que ces tubes étaient tirés par des moteurs moléculaires de type kinésines.
L’hypothèse que des moteurs fixés sur une membrane et tirant dessus en un point précis
pouvaient la déformer en tube est apparue. Il a été montré que les moteurs étaient concentrés
en des points précis de la membrane [36], et que leur présence était dépendante du cycle
23

cellulaire [37]. Ce mécanisme est apparu important pour le maintien de la structure tubulo-
vésiculaire du réticulum endoplasmique [38] et la formation d’intermédiaires de transport à
partir de l’appareil de Golgi [39,40]. Ce n’est qu’une fois ce mécanisme observé in vitro, qu’il
fut observé in vivo [41].
Figure 10 : Réseau de tubes de membranes tirés à partir de microsomes (RE) après 1h d’incubation en
présence de cytosol et d’ATP. Barre 5 µm. D’après [36].
Par fusion avec la protéine fluorescente GFP (Green Fluorescent Protein), les protéines
intervenant dans le trafic intracellulaire purent être visualisées dans les cellules vivantes.
Ainsi, en plus des intermédiaires de transports classiques que sont les vésicules, toute une
série hétérogène de tubes, tubules, tubulo-vésicules fut observée [18,42-44]. La formation de
ces tubes fut montrée comme étant dépendante des microtubules et selon les cas, des dynéines
ou des kinésines. Si bien que la majorité des intermédiaires de transport semblèrent tubulaires
plus que sphériques [17]. Cependant, la forme de ces intermédiaires de transport dépend
énormément de l’expression des protéines transformer les vésicules normalement présentes
dans le trafic, en tubules.
Un des grands enjeux de l’interaction membrane-moteurs a été de comprendre par
quels intermédiaires les moteurs se fixaient aux membranes. La première protéine
membranaire à interagir avec un moteur et à être découverte fut Rab6a, qui interagit avec
rabkinésine 6 [26]. Depuis, on a trouvé d’autres protéines Rabs comme Rab5 et Rab11
interagissant avec des moteurs [27]. Surtout, il semble que les Rabs contrôlent l’assemblage
de gros complexes sur lesquels peuvent se fixer différents types de moteurs, dynéines [45],
kinésines et même myosines pour notamment déplacer les organites. Toute une variété de
24

écepteurs ont été découverts, allant du complexe AP-1 interagissant avec KIF13A [46], une
kinésine nécessaire au transport des vésicules du Golgi vers les lysosomes, à UNC104
interagissant avec PIP2, un phosphoinositide permettant de concentrer les moteurs dans les
rafts [47]. De même, des protéines transmembranaires comme la kinectine ou des protéines
impliquées dans la régulation de différentes fonctions cellulaires (« protéines scaffold ») ont
été trouvées comme récepteurs potentiels [48,49]. Il est probable que nous n’ayions pour
l’instant qu’une vue très partielle de la façon dont les moteurs se lient aux membranes, et les
grandes lignes des interactions déjà connues restent à éclaircir.
Un des points les plus intéressants est que la liaison de moteurs à leur récepteur
membranaire les active : ainsi la dynéine devient plus processive en présence de dynactine,
protéine permettant de fixer la dynéine cytoplasmique sur un cargo [50]. De même, la liaison
de la kinésine à la membrane permet son activation par un mécanisme simple [51,52].
Lorsque la kinésine n’est pas liée à la membrane, la queue interagit avec la tête, inhibant son
déplacement. Par contre la liaison de la kinésine à son cargo se faisant par la queue, elle
empêche cette dernière d’inhiber la tête, qui se déplace alors normalement.
I.1.2.2 Actine et myosine
L’actine et la myosine sont parmi les protéines les mieux connues, car leur découverte
fut précoce du fait de leur rôle dans le fonctionnement musculaire. L’actine est une petite
protéine (~ 50 kDa) qui polymérise en fibres appelées actine F (fibrillaire) composées de deux
chaînes d’actine G (globulaire) s’associant en hélice. Sa polymérisation dépend du GTP
comme les microtubules, avec une dynamique similaire. C’est également un polymère orienté,
avec une polymérisation rapide aux bouts dits « barbés » ou + et plus lente aux bouts - . Les
myosines sont extrêmement diverses en taille, en structure et en propriétés. Ce sont toutes des
moteurs puissants, globalement non-processifs (avec des exceptions comme la Myosine V)
qui ont des modes de fonctionnement diverses adaptés à leur fonction cellulaire. La direction
du déplacement est généralement vers le bout + avec des exceptions (Myosine VI). Les
vitesses sont plus grandes que pour les moteurs liés aux microtubules, et en moyenne de
plusieurs µm/s. Les fonctions du couple actine/myosine sont d’ailleurs extrêmement variées :
la plus connue est son rôle dans la contraction musculaire, mais il est nécessaire à beaucoup
25

d’autres fonctions cellulaires telles que les fibres de stress, qui ceinturent la cellule pour
l’ancrer sur un support, la motilité cellulaire en participant à la dynamique des lamellipodes et
des filopodes au cours de la migration cellulaire, mais aussi plus généralement à l’architecture
de la cellule en rigidifiant la membrane grâce à la présence du cortex d’actine. D’une façon
générale, le réseau actine/myosine gouverne l’état de motilité de la cellule : si la cellule est
immobile, elle organise son réseau d’actine en fibres de stress, et si elle se déplace, il devient
alors plus dynamique et forme des protrusions membranaires.
Ca n’est que très récemment que l’on a découvert que l’actine et les myosines sont
impliquées dans des évènements de déformation membranaire au cours du transport
intracellulaire. A la fin des années 90, une myosine particulière, la myosine non-musculaire
IIa a été isolée à partir de membranes golgiennes, et un rôle dans le transport de vésicules
sortant du Golgi a été proposé [53]. L’hypothèse première a été que cette myosine pouvait
transporter les vésicules le long des filaments d’actine. Mais un groupe a pu montrer qu’elle
était directement impliquée dans la formation des vésicules [54]. Bien que cela soit encore
controversé [55], l’hypothèse que le couple actine/myosine puisse participer à la déformation
de la membrane pour former des vésicules a été renforcée par des découvertes récentes
concernant la voie d’endocytose par la clathrine. La myosine VI se lie aux vésicules couvertes
de clathrine [56] et est essentielle pour le bon fonctionnement des premières étapes de
l’endocytose. En appliquant des forces sur le manteau de clathrine ou directement sur la
membrane, elle permettrait l’invagination de celle-ci, ce qui aiderait au bourgeonnement. De
plus, de nombreux acteurs de l’endocytose interagissent directement avec des régulateurs ou
des acteurs du réseau actinien [57], les recrutant à différents stades de l’endocytose. Les
forces générées par les filaments d’actine en croissance pourraient aider à l’invagination du
bourgeon, et à la fission [58]. La figure 11 résume les différents rôles hypothétiques du réseau
d’actine dans l’endocytose. Deux études très récentes ont permis de préciser ces rôles
potentiels dans la formation des vésicules d’endocytose [59,60], en étudiant la dynamique de
recrutement des différents partenaires [59], et en montrant que la dynamine pouvait recruter
les filaments d’actine pour aider à la déformation et/ou à la fission de la membrane.
26

Figure 11 : Les différents rôles potentiels du réseau d’actine dans l’endocytose. D’après [58].
C’est récemment qu’il a été montré que l’actine est un élément important intervenant
dans les premières phases de la formation des intermédiaires de transport. Il est probable que
le décryptage approfondi de ses rôles révèle son caractère essentiel dans le trafic
intracellulaire.
I.1.3 Déformation liée aux lipides et aux enzymes agissant sur
les lipides
La membrane est constituée de nombreux lipides différents aux propriétés multiples. Il existe
trois composants majeurs : les glycérolipides, qui ont un coeur de glycérol, une ou deux
chaînes acyls et une tête phosphatée (type phosphatidylcholine) – les sphingolipides, qui ont
globalement la même structure que les glycérolipides, mais avec un coeur céramide (type
sphingomyeline), et enfin les stérols qui sont un assemblage de quatre cycles plats de carbone
27

formant un ensemble rigide, et une queue plus ou moins hydrophile (type cholestérol). Selon
le type, la longueur et le nombre des chaînes carbonées et la taille de la tête, les lipides ont des
formes différentes (voir figure 12), qui jouent des rôles dans la courbure de la membrane. De
même, les différences de compositions et de nombre de lipides peuvent jouer un rôle, ainsi
que toutes les enzymes agissant sur cette composition.
I.1.3.1 Courbure liée aux lipides
Les différents lipides ont des formes que l’on peut classer en trois type : le type le plus
courant parmi les lipides membranaires est la forme cylindrique, qui s’associe spontanément
en bicouches (voir figure 12). Cependant, il existe 2 autres types, le type I qui a une forme
conique et préfère une association en micelle (fig. 12), principalement les lipides à une seule
chaîne carbonée (lyso-lipides), et le type II qui a une forme en cône inversé (fig. 12) qui
s’associe en phase hexagonale inversée de type II.
Figure 12 : Les trois formes possibles des lipides membranaires (voir texte) et structures d’autoassemblage
correspondantes. Extrait de [61].
28

Deux paramètres sont importants pour comprendre le lien entre lipides et courbures,
leur forme et leur nombre respectif sur chacun des feuillets de la bicouche. Si le nombre total
de lipides est différent d’un feuillet à l’autre, alors la membrane se courbera de manière à ce
que l’aire moyenne de chaque lipide soit la même sur les deux feuillets. Cela crée donc une
courbure positive par rapport au feuillet où les lipides sont les plus nombreux (figure 13a). De
même une asymétrie dans le nombre de lipides ayant une forme non cylindrique (de type I ou
II) crée une courbure (sans asymétrie du nombre total de lipides) (figure 13 b et c). On
remarque que selon la forme du lipide concentré dans un feuillet, on obtient une courbure
négative (type II) ou positive (type I) par rapport au feuillet enrichi. Inversement, si la
membrane a une courbure imposée par l ‘extérieur, les lipides de type I préfèreront les zones
de courbure positive et les lipides de type II de courbure négative.
Figure 13 : lipides et courbures : le rôle de la forme et des asymétries de compositions dans la courbure des
membranes par les lipides. a) si le nombre de lipides augmente sur un des feuillets, la membrane se courbera
spontanément b) l’insertion d’un intercalant de type stérol dans un des feuillet conduit au même résultat. c)
l’insertion de lipides de type I sur un feuillet provoque une courbure positive par rapport à ce feuillet, et de
lipides de type II, une courbure négative. Extrait de [62].
In vivo, peu d’éléments sur l’implication des lipides dans la déformation de la
membrane sont connus. Il a été montré que la modification de la concentration en cholestérol
29

inhibait fortement plusieurs voies de trafic, notamment celle de l’endocytose par la clathrine.
Par ailleurs, il a été récemment montré que les cellules de patients atteint du syndrome de
Niemann-Pick avaient un taux de cholestérol endosomal trop important qui inhibait la
tubulation et la formation d’intermédiaires de transport [63]. De même en modifiant
l’asymétrie du nombre de lipides des membranes plasmiques, on peut inhiber ou accélérer
l’endocytose [64], selon que l’on crée une courbure favorable ou défavorable à l’endocytose.
I.1.3.2 Courbure par les enzymes lipidiques
Compte-tenu du lien entre forme des lipides et courbure, il apparaît évident que des
enzymes modifiant les lipides et changeant leur forme peuvent avoir une action sur la
courbure, puisqu’en général, l’action de ces enzymes est asymétrique (d’un seul coté de la
membrane). Ceci a été montré pour la phospholipase cytosolique A2 (PLA2). Cette enzyme
catalyse la réaction de déacylation des phospholipides, passant d’un phospholipide à deux
chaînes carbonées (cylindrique) à un lipide à une seule chaîne (lysolipide, type I). Les
lysolipides préférant la courbure positive, ils sont favorables à la formation de structures
courbées comme les vésicules ou les tubules. Il a été montré que l’inhibition de cette
phospholipase A2 par des antagonistes chimique avait pour effet d’inhiber la formation de
tubules à partir des endosomes [65], bloquant dramatiquement les voies rétrogrades du trafic
intracellulaire [65,66]. De plus, dans des cellules transfectées avec la Phospholipase A2
active, il a été observé que les composants Golgiens sont redistribués dans le RE [67], effet
similaire à l’action de la Brefeldine A, qui provoque la tubularisation du Golgi, redistribuant
ses composants au RE. Pour aller dans le même sens, l’inhibition d’un complexe enzymatique
LysoPhospholipid Acyl-Transférase (PLAT), catalysant la réaction inverse de la PLA2
provoque la tubularisation du golgi, et sa redistribution au RE [68].
Dans ce cas précis, c’est réellement l’activité enzymatique qui est requise pour
tubulariser les membranes. C’est à ma connaissance, le seul cas connu où l’activité
enzymatique de la protéine est absolument requise pour déformer la membrane, preuve
indirecte de l’effet des lipides sur la courbure.
La plupart des autres déformations membranaires dues à des enzymes lipidiques,
généralement des tubes, sont indépendantes de leur activité enzymatique, et sont
probablement dues au fait que ces enzymes se lient fortement à la membrane en s’insérant
dans le feuillet externe de la bicouche (voir figure 14). C’est le cas de l’endophiline [69], une
30

enzyme ayant une activité LPAAT (Lyso-Phosphatidic Acid Acyl-Transferase) transformant
les lysolipides (Type I) en di-acyl-lipides (cylindriques). Elle tubularise des liposomes
purement lipidiques, indépendamment de son activité enzymatique. La liaison à la membrane
promeut son oligomérisation. Cependant, aucune structure organisée n’est visible le long des
tubes (voir figure 14). Nombre de protéines autres que des enzymes lipidiques intervenant
dans le trafic intracellulaire ont cette capacité de tubulariser des membranes biologiques ou
purement lipidiques. La plus connue est bien sûr la GTPase dynamine, sorte de ressort
moléculaire intervenant dans la fission. La dynamine purifiée à partir de cerveaux a la
capacité de former des tubules à partir de liposomes de compositions variées, et s’organise en
spirale autour de ces tubules (voir figure 14) [70,71]. Cette déformation est indépendante de la
liaison au GTP. Par contre, en présence de GTP, les tubules se vésicularisent [70]. Une autre
protéine dont le rôle n’est pas encore clairement défini possède cette capacité de
tubularisation de liposomes : l’amphiphysine (figure 14) [72]. Il est important de noter que
dynamine, amphiphysine et endophiline font ménage à trois, puisqu’elles interviennent toutes
dans la fission membranaire et se lient les unes aux autres (voir ci-après).
I.1.4 Conclusion
La diversité des modes de déformation des membranes biologiques découverts depuis une
quarantaine d’années est révélatrice de la complexité biologique. Un point important est que
pour réaliser ces déformations, la cellule utilise des architectures moléculaires complexes, car
les forces et les énergies mises en jeu dans ces processus sont importantes. Cependant, ces
assemblages apparaissent très divers, et il est parfois difficile de comprendre le point commun
à tous. Les concepts de la physique appliqués aux connaissances fondamentales faites par la
biologie cellulaire du transport permettront peut-être de comprendre les principes généraux de
ces assemblages déformateurs.
31

Figure 14 : Tubularisation de liposomes synthétiques par des protéines intervenant dans le trafic
intracellulaire : A- liposomes tubularisés par l’endophiline (voir texte). Encart : comparaison de la structure
des tubules générés par l’endophiline (gauche), l’amphiphysine (milieu) et la dynamine (droite). D’après
[69]. B- Ces protéines provoquent la courbure en s’insérant dans le feuillet externe de la membrane. D’après
[62].
I.2 Tri d’éléments membranaires
Une des autres nécessités du trafic intracellulaire est de trier les éléments à transporter,
de manière à conserver les spécificités de composition et donc de fonction, des différents
organites. Classiquement, les éléments solubles (non membranaires) sont triés par interaction
avec un récepteur membranaire lui-même trié. Tout repose alors sur le tri des éléments
32

membranaires. De nombreuses hypothèses ont été émises et vérifiées ou non
expérimentalement. La plus classique et la mieux documentée est le tri par interaction des
récepteurs avec les protéines des manteaux. Une hypothèse plus récente est celle du tri par
séparation de phase des lipides membranaires, l’hypothèse dite des « rafts ». Enfin, une
hypothèse très récente et très peu documentée est celle du tri par courbure, les molécules
préférant les membranes courbées se concentrant dans les intermédiaires de transport en
formation.
I.2.1 Tri par interaction de cargos avec les manteaux.
Ce mécanisme a été le premier à être postulé et élucidé, et concerne une majorité des
protéines qui voyagent à travers la cellule. Le mécanisme est simple dans le sens où toute
molécule transmembranaire peut interagir par sa partie cytoplasmique avec le manteau qui
formera la vésicule. Ce mécanisme a été mis en place dans le contexte des vésicules de
clathrine, et les différents points ont été partiellement retrouvés pour les manteaux COPs.
I.2.1.1 Tri dans les vésicules de clathrine
Le principe du tri par interaction récepteur/manteau a pu être vérifié sur plusieurs
récepteurs présents dans les différentes voies dépendantes de la clathrine : par interaction d’un
récepteur transmembranaire avec un ou plusieurs constituants du manteau, les ligands et leurs
récepteurs peuvent être concentrés dans les vésicules de clathrine en formation (voir figure
15). Il existe 3 cas de tri reposant sur ce principe [73] : 1- certains éléments sont en
permanence internalisés puis exposés à nouveau (ils « cyclent »), et se retrouvent donc en
permanence dans les vésicules en formation. C’est le cas pour la transferrine (Tfn) et son
récepteur (Tfn-R) qui permettent l’entrée du fer dans la cellule, et pour les LDLs (Low
Density Lipid particles) qui sont des micelles contenant une protéine dont le récepteur, LDL-
R, cycle en permanence. Les LDLs représentent un apport extérieur en lipides pour la cellule,
riche en cholestérol. Il s’agit généralement de substances présentes en continu dans le milieu
extracellulaire, et nécessaires au métabolisme cellulaire. 2- L’internalisation du récepteur
dépend de sa liaison au ligand, la fixation de celui-ci sur son récepteur entraînant un
changement de conformation provocant sa liaison au manteau de clathrine. C’est le cas pour
33

certaines hormones comme le système EGF/EGF-R (Facteur de croissance épithéliale) et les
récepteurs b2-adrénergiques (liant l’adrénaline). Ce sont généralement des substances à
présence de courte durée dans le milieu extracellulaire. 3-les récepteurs sont en permanence
exclus des vésicules de clathrine, même en présence de ligands, mais peuvent être rapidement
internalisés suite à un signal intra ou extracellulaire. C’est le cas du CD4, qui intervient dans
la signalisation inter-lymphocytaire.
En rentrant dans le détail moléculaire de l’interaction du manteau avec les récepteurs,
une séquence signal riche en tyrosine a été découverte pour les récepteurs cyclant en
permanence (type 1). C’est cette séquence présente sur les récepteurs qui se lie à la sous-unité
µ2 du complexe AP 2.
Figure 15 : Représentation schématique de la formation d’une vésicule de clathrine et du tri sélectif de la
transferrine et de son récepteur par interaction avec le complexe AP 2. Lors de la formation du manteau par
association de clathrine et de complexe AP2 à la membrane, les récepteurs à la transferrine ayant lié la
transferrine intéragissent spécifiquement par leur queue cytoplasmique avec le complexe AP2. Ainsi, les
récepteurs couplés à la transferrine sont concentrés dans le bourgeon en formation, qui peut sous l’action de
la dynamine être séparé de la membrane donneuse. Extrait de [23].
34

Un point important est qu’il ne semble pas y avoir de mécanismes spécifiques
d’exclusion des protéines non liées aux manteaux. Les récepteurs n’ayant pas de séquence
signal (liaison au manteau) cyclent via les vésicules de clathrine, sans toutefois y être enrichis.
Ces grandes propriétés ont été retrouvées pour un autre récepteur interagissant avec les
manteaux clathrine, les récepteurs Mannose 6 Phosphate (M6P-Rs, au nombre de deux) [74].
Ces récepteurs ont été découverts dans l’étude du tri et de l’export spécifiques des hydrolases
lysosomales (enzymes dégradant les protéines dans les lysosomes). Au cours de leur passage
à travers l’appareil de Golgi, ces hydrolases subissaient une modification de leurs
glycosylations (sucres covalemment fixés co- ou post-traductionnellement) faisant apparaître
un mannose phosphaté sur le carbone 6. De même que pour les cas vus précédemment, ce
mannose est une séquence d’adressage vers les lysosomes et se lie aux M6P-Rs. De plus, ces
récepteurs se lient au complexe AP-1, et plus précisément à sa sous-unité µ1. Cependant il
existe dans ce cas propre, un effecteur de plus que sont les GGAs, pour « Golgi-localised,
Gamma-ear containing, ARF-binding proteins ». Ce sont elles qui initieraient la formation des
vésicules de clathrine en se liant à ARF. Elles jouent aussi le même rôle que AP-1, en liant la
clathrine et les M6P-Rs. La redondance des rôles entre AP-1 et GGAs est encore mal
comprise. De même que pour les récepteurs d’endocytose cyclant en permanence, il existe des
séquences signal sur les M6P-Rs permettant la liaison aux GGAs et à AP-1.
La grande différence entre le tri par clathrine dans l’endocytose et au TGN est que les
ligands des récepteurs possèdent aussi des étiquettes d’adressage, comme le Mannose 6
Phosphate. Ainsi, au lieu d’avoir autant de récepteurs que d’éléments solubles à trier, un
récepteur se lie à toutes les protéines possédant l’étiquette. L’étiquette étant fonction de la
destination, un récepteur se lie à toutes les protéines ayant une même destination. De plus, ces
étiquettes d’adressage sont généralement des glycosylations modifiées au cours du passage
dans l’appareil de Golgi. L’étude approfondie des enzymes intervenant dans la glycosylation a
permi la compréhension du rôle de cet organite : les empilements de saccules étiquettent les
protéines en fonction de leur destination, puis au niveau du TGN, la formation des vésicules
d’export permet le tri et l’adressage correct de ces protéines.
I.2.1.2 Tri au cours de la Formation des vésicules de type COPs
Le tri réalisé dans les vésicules COPs semble très proche de celui décrit plus haut pour
les vésicules de clathrine [75]. Les protéines transmembranaires de la famille p24 se lient aux
35

manteaux COPs, et sont un composant majeur des vésicules COP (I et II) où elles se
concentrent. Elles cyclent rapidement entre réticulum et Golgi. Elles sont dites cargos putatifs,
car on ne leur connaît pas de ligands ni de rôle potentiel de récepteur. Elles possèdent des
séquences signal de type KKXX ou KXKXX (K pour lysine, X pour n’importe quel autre
acide aminé) dans leur partie cytoplasmique via lesquelles elles se lient à COP I et COP II.
Ces séquences sont retrouvées dans les protéines transmembranaires résidant au réticulum. La
seule réelle différence avec le système clathrine (bien que la découverte récente des GGAs
pourrait contredire cela) est que l’initiation de la fixation du manteau pourrait être directement
dépendante du cargo. En effet, ces protéines se lient à ARF1 et le stabilisent sur la membrane.
Surtout, certaines séquences signal relativement éloignées du consensus KKXX, empêchent
l’activation de l’hydrolyse du GTP par le Coatomère [76]. ARF1 restant sous la forme GTP, il
recrute alors plus durablement COP I pour former le bourgeon (voir figure 16). De plus, si la
séquence signal n’est pas la bonne, ou si il n’y a pas de liaison du tout, la liaison du coatomère
provoque l’hydrolyse du GTP et la dissociation immédiate du complexe, avant même d’avoir
former un bourgeon. C’est un mécanisme de sélection du manteau par les protéines à
exporter, inverse des mécanismes de sélection des récepteurs par le manteau clathrine. Le
même mécanisme semble vrai pour COP II aussi, car Sar1p peut être activée et stabilisée par
les cargos et ainsi promouvoir la formation du bourgeon COP II [75].
Figure 16 : Mécanisme de tri dans les vésicules COP I. La liaison du Coatomère à ARF1 et au cargo (B) est
suivie d’une étape sélective. k1, k2 et k3 sont les constantes d’association/dissociation des complexes à
différentes étapes de la formation du bourgeon. Si la séquence signal inhibe l’hydrolyse du GTP alors,
k2>k3, et le complexe stabilisé (C) promeut la formation d’un bourgeon (D). Sinon, k3>k2 et le complexe se
dissocie (E). Extrait de [76].
36

Les protéines solubles sont triées selon des principes proches de l’exemple du
Mannose 6 Phosphate vu précedemment. Les protéines solubles résidantes du RE et qui sont
exportées au Golgi ont une séquence d’adressage KDEL qui se lie à un récepteur dit KDEL.
De même, le récepteur KDEL a sur sa queue cytoplasmique une séquence KKXX qui lui
permet d’interagir avec COP I. La séquence signal KDEL permet donc aux protéines
résidante du RE de revenir au réticulum, grâce au récepteur KDEL et en empruntant la voie
COP I.
D’autre part, un autre phénomène de tri a été mis en évidence dans les vésicules COP
I : leur composition lipidique est fortement appauvrie en sphingolipides et en cholestérol [77],
deux composants majeurs des « rafts ». Or, ces microdomaines résultants d’une séparation de
phase ont été impliqués dans le tri et représentent en eux-mêmes une étape de tri. Il ne serait
pas impossible que les deux phénomènes (tri par récepteurs et tri par séparation de phase)
soient réalisés dans les même intermédiaires de transport et soient couplés, l’un favorisant
l’autre et vis-versa.
I.2.2 Tri par séparation de phase : Importance des radeaux
lipidiques, ou « rafts ».
L’hypothèse des rafts est relativement récente [78]. Elle a été émise pour expliquer
dans un premier temps comment les lipides pouvaient être triés et exportés spécifiquement :
basée sur le fait que les trois composants lipidiques majeurs des membranes biologiques
(sphingolipides, glycérolipides et stérols) ont des propriétés physico-chimiques différentes et
peuvent se séparer en au moins deux phases distinctes dans le plan de la membrane, cette
hypothèse postule que ce « pré-tri » des lipides pouvait avoir une importance dans le trafic
lipidique. Il avait été montré par plusieurs études biophysiques que les shingolipides ayant un
point de fusion élevé (entre 40 et 50°C), ils pouvaient s’associer en une phase liquide
ordonnée (Lo) à la température physiologique, contrairement aux glycérolipides qui restaient
sous forme liquide désordonnée Ld. Le cholestérol quant-à-lui, semblait promouvoir cette
séparation de phase. La première description des « rafts » fut donc celle de microdomaines
relativement rigides se déplaçant dans une phase liquide désordonnée. Il est rapidement
apparu que des protéines membranaires préféraient s’associer à l’une ou l’autre des phases,
37

permettant également un tri des protéines [79,80]. Mais si l’importance des rafts dans le trafic
intracellulaire n’est plus à démontrer, leur composition, leur taille et leur rôle exact ne sont
pas clairement déterminés.
I.2.2.1 Composition lipidique et protéique des rafts.
La structure des trois principaux types de lipides explique en partie leur propriétés
physico-chimiques différentes. Les glycérolipides et les sphingolipides sont tous des
phospholipides, c’est-à-dire ayant une ou deux chaînes acyls (carbonées) hydrophobes, et une
tête hydrophile possédant un groupe phosphate (voir figure 17). Deux différences expliquent
le fait que les sphingolipides naturels sont en phase Lo à 37°C, alors que les glycérolipides
sont majoritairement en phase Ld : premièrement, les sphingolipides naturel ont globalement
des chaînes plus longues et plus saturées que les glycérolipides, deux facteurs qui favorisent
un paquetage étroit des chaînes carbonées dans la bicouche. Deuxièmement, le groupement
faisant la liaison entre le phosphate et les chaînes acyls est différent. Il s’agit d’un glycérol
pour le glycérolipides, et d’un céramide pour les shingolipides qui a la capacité de réaliser une
liaison hydrogène entre son groupement N-H et le groupement –OH du céramide voisin,
favorisant la cristallisation des sphingolipides.
Le cholestérol a quant-à-lui une structure très différente : c’est essentiellement un
tétracycle de carbone plan ayant un groupement hydroxyde jouant le rôle de tête hydrophile,
et une courte queue carbonée. Le cholestérol peut interagir avec le groupement N-H du
céramide des sphingolipides via son groupement hydroxyde.
38

Figure 17 : Structures chimiques des trois composants majeurs des membranes cellulaires. Un glycérolipide
phosphatidylcholine (Palmitoyl-Oléyl PC ou POPC), un sphingolipide sphingomyeline (Di-Palmitoyl SM ou
DPSM) et le stérol cholestérol. Les chaînes carbonées apparaissent en noir. Structures obtenues sur
www.avantilipids.com.
C’est à la fin des années 80 que les premières analyses de la composition lipidique et
protéique des rafts ont été faites [81]. Pour isoler les rafts, un protocole a été mis au point basé
sur le fait que les sphingolipides s’associent en une phase Lo ; il consiste à utiliser un
détergent doux, le Triton X-100, à 4°C pour solubiliser partiellement les membranes. La
fraction insoluble, de faible densité, est riche en sphingolipides et en cholestérol (voir figure
39

17), ce qui était attendu. La composition lipidique moyenne est de un tiers de sphingolipides,
un tiers de stérol et un tiers de glycérolipides. De même une composition protéique
« moyenne » a été établie, bien que très loin d’être exhaustive. Le premier point marquant est
qu’à peu d’exceptions près, les protéines transmembranaires ne se retrouvent pas dans les
rafts. Un contre-exemple important est le récepteur à l’EGF (Epithelial Growth Factor) [82].
Des protéines membranaires non transmembranaires, comme la caveoline ou la flotilline,
préfèrent la fraction triton-insoluble. De nombreuses autres protéines ont été trouvées comme
étant associées aux rafts par cette technique [83]. Parmi elles, un groupe particulier se
détache, les protéines à ancre GlycosylPhosphatidylInositol (GPI), ou protéines GPI. Leur
seul point commun est qu’elles sont covalemment liées à un glycérolipide, le
phosphatidylinositol, via un oligomère de sucres (voir figure 18).
Figure 18 : Structure de l’ancre GPI arrimant les protéines GPI aux microdomaines. Man pour mannose,
GlcN pour Glucosamine. D’après [84].
Ces protéines ont des rôles très divers dans les cellules : de la protection contre le
système immunologique pour les protéines VSG (Variant Surface Glycoproteins) des
trypanosomes, à la transduction du signal à travers la membrane plasmique, ou au recrutement
de filaments d’actine [82]. Mais leur ancre commune les localise toutes préférentiellement
40

dans les rafts. En effet, des protéines GFPs normalement cytosoliques, mais modifiées pour
être liées à une ancre GPI sont adressées aux rafts [85]. Elles ont donc été beaucoup utilisées
comme marqueur spécifique pour étudier le rôle des rafts dans le trafic intracellulaire.
Cependant, même si quelques règles générales ont été trouvées grâce à la technique de
résistance aux détergents, elle a aussi apportée beaucoup de confusion. De nombreux résultats
obtenus avec cette technique sont soit peu reproductibles, soit contradictoires. Et pour ajouter
au débat en cours, une étude systématique récente, utilisant différents détergents et lignées
cellulaires a montré le caractère peu conservé des résultats d’un détergent à l’autre et d’une
lignée à une autre [86]. La communauté s’accorde donc à faire une distinction entre le produit
des extractions par détergent qui sont appelés DRMs pour Detergent Resistant Membranes et
dont la composition varie avec les protocoles, et les rafts, microdomaines présents dans la
membrane cellulaire intacte. Mais tout ceci soulève de nombreuses questions : y-a-t-il un seul
ou plusieurs types de rafts dans les membranes cellulaires ? La composition des (d’un ?) raft
varie-t-elle au cours du temps ?
Un autre problème est de connaître la taille des rafts, dans les membranes cellulaires.
En mélangeant des sphingolipides, du cholestérol et des glycérolipides purifiés, les
membranes artificielles ainsi préparées montrent généralement l’apparition de domaines
géants, de taille bien supérieure au micron en taille [87,88]. Mais aucun domaine de cette
taille n’existe dans les cellules non traitées. Différentes mesures de la taille des domaines in
vivo ont été essayé [81,83], mais les plus récentes qui sont aussi les plus sophistiquées,
s’accordent pour dire que leur taille serait nettement inférieure à 100 nm, et serait comprise
entre 1 et 20 nm. Ce débat est encore ouvert et la taille mesurée dépend beaucoup de la
technique utilisée.
I.2.2.2 Mise en évidence expérimentale d’un tri dépendant des rafts.
Le cholestérol et les précurseurs des sphingolipides, les sphingosines, sont synthétisés
dans le réticulum endoplasmique. Mais leur concentration y est très faible, de l’ordre de
quelques % des lipides du RE. Le cholestérol et les sphingolipides se concentrent tout le long
de la voie de sécrétion, de la dizaine de % dans l’appareil de Golgi à entre 20 et 50 % chacun
pour les membranes plasmiques (selon le type cellulaire) [89]. Ceci suggère un transport
sélectif de ces lipides dans le sens antérograde de la voie de sécrétion (RE – membrane
plasmique). De plus, l’appareil de Golgi est le lieu de synthèse de nombreux sphingolipides,
notamment des sphingomyelines et de nombreux gangliosides, sphingolipides sur la tête
41

desquels ont été greffées des glycosylations (polymères de sucres). Les membranes du
réticulum n’ont pas la capacité à former des DRMs, alors qu’ils sont présents en faible
quantité dans les membranes golgiennes. On comprend aisément avec ce qui a été exposé
précédemment que ce sont les membranes plasmiques qui donnent le plus de DRMs après
extraction au Triton, puisqu’elles contiennent plus de cholestérol et de sphingolipides.
L’hypothèse émise est la suivante : dés que la concentration en sphingolipides et cholestérol
est suffisamment importante (à priori au niveau de l’appareil de Golgi) , il y a apparition de
rafts qui sont sélectivement exporté dans la voie d’exocytose.
Comme il est difficile de suivre le devenir des lipides, les chercheurs se sont tournés
vers les protéines associées aux rafts pour essayer de vérifier cette hypothèse. Il a été montré
que le trafic des protéines GPI était directement lié à la présence de DRMs [90]. Ainsi, en
utilisant des drogues inhibant la synthèse des shingolipides ou du cholestérol dans les cellules
de mammifères, et des mutants pour les enzymes de synthèse de ces mêmes lipides chez la
levure, il a été possible de montrer qu’en présence de drogues ou chez les mutants, il n’y avait
plus de DRMs isolables, et que les protéines GPI n’étaient plus résistantes aux détergents. La
conséquence était un blocage des protéines GPI à certaines étapes du transport : dans le
réticulum chez la levure et dans l’appareil de Golgi dans les cellules de mammifères. La
différence observée entre mammifères et levures est encore mal comprise, mais, les données
accumulées sur les protéines GPI et d’autres sont toutes concordantes [90]. L’idée générale
est que dès la formation des rafts, les protéines qui y sont associées y ségrégent. Ces protéines
possédant des séquences d’adressages pour certains compartiments, elles permettent
également l’adressage des lipides qui leur sont associées et donc des rafts.
Les rafts sont aussi nécessaires à l’endocytose de certaines protéines [91,92],
notamment de composants pathogéniques tels que des toxines bactériennes (la toxine du
Choléra se liant à un ganglioside (sphingolipide) du nom de GM1, et la toxine de Shiga se
liant à un ganglioside du nom de Gb3 [93]. Certains virus comme le SV40 (Simian Virus 40)
empruntent la voie d’endocytose par les caveolaes [91]. Il semble que pour les toxines, qui se
lient à la membrane sous forme monomérique, le recrutement au sein des rafts provoque une
multimérisation nécessaire à leur endocytose [93].
Mais pour l’instant, aucune expérience décisive n’a pu montrer comment les rafts
étaient adressés dans les intermédiaires de transports. De nombreuses hypothèses sont
possibles, et sont résumées ci-après.
42

I.2.2.3 Rafts et tri dans le trafic intracellulaire : les principales hypothèses.
Les hypothèses les plus simples sont présentées sur la figure 19. La première et la plus
simple (figure 19A) est que si la membrane est pré ségrégée en domaines de composition
différente, les intermédiaires de transport qui se forment à partir de chacun des domaines sont
de composition différentes. Dans cette hypothèse, le tri est réalisé avant la formation du
bourgeon par séparation de phase, et cela implique deux points importants : -il faut que les
intermédiaires de transports dirigés vers le même compartiment soient produits toujours à
partir du même sous-domaine, et deuxièmement, il faut que la surface des domaines soit
supérieure à la surface des intermédiaires de transport. Ce dernier point est difficile à vérifier,
puisque les tailles connues des intermédiaires de transport sont du même ordre, voire un peu
plus grandes que celles des rafts (voir plus haut).
Figure 19 : Hypothèses sur l’adressage sélectif des rafts dans le trafic intracellulaire. A- la membrane est
divisée en différents domaines de compositions différentes (a, b et c) et les intermédiaires de transport
formés à partir de chacun de ces domaines n’ont pas la même composition et ont des destinations
différentes. B- C’est au cours de la formation de l’intermédiaire de transport qu’il y a recrutement de
certains composants membranaires changeant la composition de la membrane spécifiquement à l’endroit de
formation du bourgeon. D’après [89].
La deuxième hypothèse correspond à une vision plus dynamique du processus (figure
19B). Au cours de la formation de l’intermédiaire de transport, certains éléments des rafts
sont sélectivement piégés dans le bourgeon, recrutant par là même les autres éléments des
43

afts. Les raisons de ce piégeage peuvent être multiples : une interaction directe de certains
éléments avec les manteaux ou les protéines provoquant la déformation, ou bien par un effet
simple de courbure (voir ci-après), les constituants préférant la courbure étant sélectivement
enrichis dans le bourgeon en formation. Cette hypothèse a été récemment détaillée pour le cas
de l’endocytose par les caveolae [94]. Dans ce cas précis, il est postulé que la liaison des
caveolines au cholestérol (voir plus haut) favorise la concentration de lipides et de protéines
qu’on retrouve dans les rafts. Surtout, c’est la première fois que l’hypothèse d’une séparation
de phase au sein du bourgeon en formation est émise : les caveolae seraient des rafts géants
auxquels fusionneraient de petits rafts entourant les protéines à endocyter. Le bord de la
caveolae, en plus d’être la zone de liaison entre la caveolae et la membrane, serait aussi la
frontière entre le raft géant et le reste de la membrane, frontière infranchissable pour les
protéines piégées par la composition des caveolae.
Une autre hypothèse qui pourrait s’appliquer aux rafts est celle du tri par épaisseur de
la bicouche : il a été montré que les protéines transmembranaires avaient des parties
hydrophobes de longueur adaptée à leur membrane de résidence [95]. L’épaisseur des
membranes est croissante du réticulum, jusqu’à la membrane plasmique. Les différences sont
petites (de 3-4 Å à 6-7 Å), mais significatives. Or, les protéines transmembranaires de la
membrane plasmique ont des segments transmembranaires hydrophobes plus longs que celles
de l’appareil de Golgi, eux-mêmes plus longs que ceux des protéines du réticulum. Là aussi
les différences sont petites mais significatives (de 16 acides aminés au RE en moyenne, à 18
a.a dans la membrane plasmique). Surtout, il a été montré qu’une protéine transmembranaire
réside mieux dans une bicouche trop fine pour son segment transmembranaire que dans une
bicouche trop grande. Donc toutes les protéines ayant des destinations à bicouche épaisses
pourraient cependant être produites au réticulum (bicouche la plus fine) et exportées au bon
endroit, ne pouvant accéder aux bicouches trop épaisses pour leur segment transmembranaire.
Une des raisons pour lesquelles les bicouches épaississent le long de la voie d’exocytose est
justement parce qu’elles contiennent plus de cholestérol et de sphingolipides, dont la longueur
et la rigidité des chaînes carbonées expliquent l’épaississement. On peut donc proposer que
les protéines en direction de la membrane plasmique s’associent rapidement avec les rafts
lorqu’ils apparaissent car ils correspondent mieux à la taille de leur segment trans-
membranaire, ceux-ci les dirigeant vers la destination voulue. Cependant, du fait de la
complexité des expériences qu’il faudrait mettre en oeuvre pour montrer à coup sûr ce
phénomène, et également de la faiblesse des effets observés, cette hypothèse n’a jamais pu
44

être vérifiée jusqu’à présent et paraît donc être un mécanisme, s’il est réel, peu efficace pour
trier les protéines membranaires.
Une dernière hypothèse postule le rôle de la courbure dans le tri des lipides
préférentiellement ségrégés dans les rafts et donc des protéines qui y sont associées. Une
équipe a pu montrer que des lipides fluorescent artificiels (et non métabolisés par la cellule)
pouvaient être triés dans les endosomes seulement en fonction de la longueur et de la rigidité
de leurs chaînes carbonées [96]. Il a été montré par ailleurs que la fluidité des phases Lo était
réduite par rapport aux phases Ld [97] et que leur rigidité était plus importante (voir chapitre
4). L’hypothèse proposée par ce groupe [98] est que les domaines les plus fluides et les moins
rigides de la membrane sont utilisés pour former les intermédiaires de transport, et que les
moins fluides et les plus rigides le sont moins. Les lipides ségrégeant préférentiellement dans
la phase Ld seraient par conséquent sélectivement enrichis dans les intermédiaires de transport
alors que les lipides de la phase Lo seraient sélectivement exclus de ces structures très
courbées. Cette hypothèse est basée sur le présupposé que pour faire un intermédiaire de
transport, il faut une membrane assez fluide et peu rigide. Mais la distinction entre fluidité et
rigidité n’est pas claire dans l’étude précédemment citée : une membrane plus rigide n’est pas
forcément moins fluide, bien que pour dans le cas des cellules, les domaines « rafts » soient à
la fois plus rigide et moins fluide (voir chapitre 4).
I.2.2.4 Conclusion
Même si le tri des protéines et des lipides au cours des étapes du trafic intracellulaire
est aujourd’hui un fait indiscutable, les modalités que la cellule utilise pour séparer ses
différents composants membranaires restent pour certaines très spéculatives. Le rôle exact de
la séparation de phase des lipides dans le tri reste, même si son importance est
indiscutablement prouvée, à découvrir.
Une autre nécessité du transport vésiculaire qui est probablement l’étape la moins bien
comprise est la séparation du bourgeon de la membrane donneuse. Si de nombreux partenaires
protéiques et lipidiques ont été montrés comme essentiels pour la fission, aucun n’est suffisant
à lui seul, compliquant la compréhension du mécanisme.
45

I.3 Coupure de membrane ou fission
La séparation du bourgeon de la membrane est la dernière étape du processus de
formation des intermédiaires de transport. De petites vésicules de transport peuvent être
visualisées dans les cellules et purifiées, ce qui nécessite qu’elles soient à un moment séparées
de la membrane dont elles bourgeonnent. De plus, la compartimentalisation cellulaire (le fait
que chaque organite ait une composition propre et adaptée à sa fonction) impose également
que les compartiments soient clos, et donc que toute vésicule bourgeonnante en soit séparée.
On a longtemps pensé que les manteaux à eux seuls pouvaient, en se refermant sur eux-
mêmes, provoquer la fission, et bien que de nombreux autres partenaires nécessaires à la
fission aient été découvert, cette hypothèse reste plausible pour les manteaux de type COPs
notamment. Mais la compréhension de la fission a beaucoup avancé avec la découverte de la
dynamine et de ses partenaires. Cependant, bien que la fission soit un processus dynamique et
très limité dans le temps (ce qui rend son étude particulièrement difficile), les données que
nous avons proviennent essentiellement d’études de microscopie électronique, donc d’images
figées.
I.3.1 La dynamine, ressort moléculaire
La première découverte de la dynamine a été fortuite. Elle a été co-purifiée avec les
protéines MAPs (Microtubule Associated Proteins) au cours des purifications de tubuline,
dans les années 70 [99]. Le gène montre la présence d’un domaine GTPasique. Mais c’est
l’étude d’un mutant de Drosophila melanogaster qui donna les premières explications sur son
rôle dans la fission. Le mutant Shibire est un mutant thermosensible qui a une paralysie
réversible et rapide à température non permissive. Il a été montré que ce mutant avait un
défaut d’endocytose avec une accumulation de vésicules clathrine non séparées de la
membrane au niveau des synapses. D’où l’idée d’un défaut de fission, entraînant un défaut de
communication synaptique. Lorsque le gène fut séquencé, il s’avéra être un homologue de la
dynamine des mammifères. Plus tard, cette protéine fut localisée au cou des vésicules
d’endocytose, confirmant son rôle dans la fission.
La dynamine est une GTPase de 100 kDa, dont l’activité est amplifiée par son
oligomérisation en spirale [100] et la liaison à un phospholipide particulier le PhosphoInositol
46

(4,5) di-Phosphate ou PIP2 [101]. Surtout, comme dans le cas des enzymes lipidiques vu
précédemment, il a été montré que son oligomérisation pouvait déformer les membranes en
tubules entourés d’une spirale de protéines [70]. Cette association hélicoïdale ne nécessite pas
de nucléotide ; mais si du GTP est ajouté aux tubules formés, ils se fissionnent alors en petites
vésicules. Grâce à un protocole original, une autre équipe a pu décrypter le changement de
conformation associé à l’hydrolyse du GTP [102]. La spirale s’allonge, le pas de l’hélice
passant de 11 nm à 20 nm, suggérant aussi la possibilité d’un rétrécissement du diamètre,
mais qui n’est pas observé dans ces expériences, probablement pour des raisons techniques.
Ces données et d’autres, ont permis l’élaboration de cinq mécanismes potentiels d’action pour
la dynamine (voir figure 20) et sont expliqués en détails dans une revue récente [103]. Le
premier mécanisme et le plus ancien proposé, est celui du garrot moléculaire, où la dynamine,
serrant le cou des vésicules peut conduire à la fission. Proposé à une période où la structure de
la dynamine n’était pas connue, elle reste d’actualité au vu de la structure fine des spirales
[71]. Le deuxième est le ressort moléculaire, issu de l’étude [102]. Il propose que
l’éloignement provoqué par l’allongement de la spirale de dynamine après hydrolyse du GTP
soit suffisant pour couper la membrane. Cependant, l’allongement étant probablement couplé
à un rétrécissement du diamètre de la spirale, ces deux premiers mécanismes ne s’excluent pas
l’un l’autre. Le troisième mécanisme, basé sur les même données que les deux précédents
explique cependant la fission d’une manière différente [104]. La spirale en s’allongeant doit
tourner autour du cou de la vésicule, le tordant en provoquant un pincement qui conduit à la
rupture. Ce serait les différences entre l’élasticité de la membrane et la spirale, ainsi que la
profonde insertion de la dynamine dans la spirale [71], qui expliquerait ce mécanisme. Le
quatrième mécanisme, préciserait plutôt les trois précédents que ne les infirmerait : basé sur
une étude des interactions entre les différents domaines de la dynamine, ce modèle propose
que la dynamine soit capable de marcher sur elle-même, c’est à dire qu’un anneau de la
spirale pourrait se déplacer le long de l’anneau suivant, comme un moteur moléculaire sur un
filament. Cela tient au fait que certaines interactions entre domaines sont plus fortes en
présence de GDP qu’en présence de GTP, comme pour les moteurs moléculaires. Comme un
serpent montant dans un arbre, en présence de GTP, la dynamine pourrait se déplacer sur le
cou de la vésicule. Ce modèle suppose, pour effectuer son action rétrécissante que l’une des
extrémités de la spirale soit fixé : cet ancrage pourrait être réalisé par l’amphiphysine qui fait
le lien entre la clathrine et la dynamine.
47

Figure 20 : Les cinq mécanismes potentiels d’action de la dynamine sur la membrane. 1- le garrot
moléculaire, étranglant le cou jusqu’à rupture, 2- le ressort moléculaire, éjectant la vésicule jusqu’à rupture
du cou, 3- la torsion moléculaire, qui ferait tourner la vésicule sur elle-même, provocant un pincement, puis
la rupture de la membrane, 4- Le serpent moléculaire, qui expliquerait en fait les trois modèles précédents,
en proposant que la dynamine s’enroule sur elle-même avec des interactions entre spirales qui se déplacerait
les unes par rapport aux autres comme un moteur moléculaire sur un microtubule. 5- le régulateur
moléculaire, permettant le recrutement, sous forme GTP, d’effecteurs qui réalisent la fission.
Enfin, le dernier mécanisme qui est également le moins bien décrit est celui où la
dynamine en tant que GTPase joue un rôle de régulateur, recrutant à la membrane les
effecteurs réel de la fission [105]. Ceci tient à deux points importants, qui sont que la
dynamine, comme beaucoup de GTPase régulatrices interagit avec de nombreux partenaires
[12], et que un de ses partenaires, que nous allons décrire maintenant est directement impliqué
dans la fission membranaire : l’endophiline.
48

I.3.2 Rôle des lipides et des acyls transférases
Le rôle des lipides dans la fission est postulé depuis longtemps. La forme des lipides,
qui peut favoriser la courbure des éléments dans un sens ou dans un autre (voir 2.1.3.1) peut
avoir un rôle sur la capacité du cou des vésicules à rétrécir, et peut-être à se couper. Ainsi, des
lipides de type II (voir 2.1.3.1) ont une forme qui préfère la courbure négative (en selle de
cheval) et donc vont préférer se localiser au niveau du cou des vésicules, participant à son
rétrécissement [61].
Cette idée a pris une dimension importante depuis quelques années avec la découverte
que des enzymes de type LPAT (LysoPhospholipid Acyl Transferase) étaient impliquées dans
la fission membranaire [106]. Ces enzymes catalysent une réaction du type acyl-CoA +
LysoLipide donne diacyl-lipide, transformant un lipide à une seule chaîne carbonée en un
lipide à deux chaînes carbonées. Dans deux études et sur deux protéines différentes,
l’endophiline I [107] et CtBP/BARS [108], il a été montré que cette activité était nécessaire à
la fission de vésicules d’endocytose dans un cas [107] et de tubules émanant du Golgi dans
l’autre [108]. Le point important est que dans ces deux cas, le lysolipide accepteur était
l’acide phosphatidique, qui a une forme conique de type I sous la forme mono-acylée, et une
forme de cône inversé (type II) sous la forme di-acylée. Le réactif et le produit de cette
réaction ayant des courbures préférentielles opposées, et la courbure du produit était adaptée à
la courbure du cou des vésicules, il apparaît évident que cette réaction puisse favoriser la
fission.
Dans le cas de l’endophiline, des points importants ont pu être montrés : cette enzyme se lie à
la dynamine sous forme oligomérisée, et si cette interaction est empêchée par la délétion du
domaine d’interaction à la dynamine, alors la formation de vésicules est inhibée [107]. Le
principe proposé est présenté sur la figure 21.
49

Figure 21 : Rôle de l’endophiline I dans la fission. L’anneau de dynamine se formant, il recrute
l’endophiline qui transforme les Lyso Acide Phosphatidique (LPA) en Acide Phosphatidique (PA) dont la
courbure inverse est favorable à la courbure du cou, facilitant l’action de constriction de la dynamine. Le
feuillet cytoplasmique est en gris. D’après [107].
I.3.3 Conclusion
La fission reste pour une grande part incomprise, et de façon surprenante, nous n’en
connaissons qu’un très petit nombre d’acteurs, alors qu’il est possible que comme pour la
déformation ou le tri, ce soit les assemblages qui permettent la fonction de coupure et non pas
les molécules individuelles. Il faut alors connaître tous les acteurs participant à un complexe,
fonctionnel, ce qui semble loin d’être le cas dans la fission. En schématisant, les deux seules
protéines interagissant et ayant une fonction liée à la fission sont à ce jour la dynamine et
l’endophiline. Or, dans tous les autres processus (tri, courbure), ce sont des assemblages de
cinq à dix protéines qui sont mis-en jeu, comme dans les complexes COPs ou clathrine. Il est
donc probable que notre vision actuelle de la fission soit très parcellaire, et que nombreux
acteurs lipidiques ou protéiques restent à découvrir.
50

I.4 Déformation, tri et fission : que conclure ?
Après 40 ans d’études approfondies des acteurs permettant la formation des petites
vésicules nécessaires au trafic intracellulaire, on commence à avoir une vue un peu plus claire
des centaines d’acteurs qui sont nécessaires à cette importante fonction cellulaire. Cependant,
en même temps que l’on trouvait de nouveaux acteurs, leurs fonctions (déformation pour la
clathrine, fission pour la dynamine) sont apparues moins spécifiques, et plus multiples. Il est
même souvent difficile d’attribuer une fonction à un seul partenaire, et surtout, de rendre
compte d’assemblage de plusieurs centaines de protéines uniquement par des interactions
molécule/molécule à courte distance. La physique statistique s’est beaucoup intéressée à
décrire le comportement d’une collectivité de molécules dont le détail des interactions
moléculaires était difficile à analyser. Cette physique a développé un ensemble d’outils
expérimentaux et théoriques qui ont permis de comprendre certains de ces phénomènes
collectifs. Cette approche, bien loin de s’opposer à l’approche moléculariste, peut permettre
dans certains cas de dégager les quelques propriétés essentielles d’un système complexe
d’éléments qui rendent compte de son comportement à l’échelle supramoléculaire. Elle a
ainsi pu permettre une description simple du comportement mécanique des membranes
lipidiques, qui est encore souvent négligée dans les études du trafic intracellulaire. Cette
description est très simple et très générale, mais rend parfaitement compte de nombreux
comportements des membranes (forme et propriétés élastiques).
Dans le chapitre suivant, c’est de cette description purement physique des membranes
dont il sera question. Nous verrons la généralité de la description, mais aussi quelques
exemples importants dans le cadre de notre étude et plus généralement dans le cadre du trafic
intracellulaire.
51

chapitre 2 Physique des
biomembranes : paramètres
importants pour déformer, couper les
membranes lipidiques et trier les
lipides.
vésicules géantes dans leur chambre de pousse.
53

Très tôt, les membranes lipidiques ont intéressé les physiciens. D’abord par leurs propriétés
d’auto-organisation, puisque les lipides de type phospholipide ont la capacité de s’associer
spontanément en bicouche quand ils sont mis en solution aqueuse. Mais rapidement, il est
apparu que d’autres propriétés physiques très particulières pouvaient être très intéressantes
pour les cellules. Une conséquence de l’auto-assemblage est l’autocicatrisation de la
membrane. Cette propriété explique que la membrane soit très difficile à couper. Par exemple,
une force d’au moins 200 pN est nécessaire pour casser un tube de membrane,et notons que
ceci est très supérieur aux forces générées par les protéines (de l’ordre du pN ou de la dizaine
de pN). Une autre propriété très particulière est que les membranes sont des fluides à 2D aux
températures physiologiques, ce qui explique leur propriétés mécaniques et élastiques.
Il y a une trentaine d’années s’est mise en place une description simple de la
membrane, qui ne tient compte que des propriétés géométriques des surfaces, et des propriétés
physiques des fluides élastiques. L’énergie élastique est décrite à partir des différents modes
de déformation de la membrane qui sont limités à l’extension et la courbure. Ceci peut
permettre de déterminer la forme de la membrane sous une contrainte particulière, et
également de prévoir le comportement des composants membranaires sous une contrainte.
55

II.1 Description classique de Canham-Helfrich : la
membrane est un champ de courbure.
Nous allons voir ici une description classique des bicouches lipidiques qui a été proposée par
Helfrich [10] et qui est à la base de la physique des membranes.
II.1.1 Les trois déformations possibles d’une surface
Il existe trois déformations possibles d’une surface (voir figure 22)
Figure 22 : Les trois déformations possibles : a) compression, extension, b) cisaillement et c) courbure.
D’après [109].
Le premier type de déformation est l’extension-compression, et correspond à une
déformation identique dans toutes les directions du plan de la membrane (figure 22a). C’est
56

une déformation élastique ; et l’énergie Hext par unité de surface correspondante dépend donc
quadratiquement de la variation de la surface. Elle est donnée par l’équation suivante :
1
Hext χ
2
∆Α ⎛ ⎞
= ⎜ ⎟
⎝ Α ⎠
χ est le module de compressibilité (en J/m 2 ). A est l’aire totale de la membrane, et ∆A la
variation d’aire au cours de l’extension-compression.
2
(2.1)
Le deuxième mode de déformation est le cisaillement (figure 22b), c’est-à-dire une
déformation principale dans une direction du plan de la membrane. Dans le cas des
membranes fluides, l’énergie associée au cisaillement est négligeable. Elle n’intervient que
dans le cas des membranes polymérisées ou à structure cristalline. Il n’en sera donc plus
question dans la suite.
Le troisième mode de déformation regroupe sous le nom de courbure toutes les
déformations qui ne sont pas dans le plan de la membrane, mais se font à surface constante.
L’énergie élastique de courbure associée est :
1 2
Hcourb = κ( c− c0)
+ κGcc
1 2
(2.2)
2
c est la courbure moyenne de la membrane, avec c = c1 + c2 = 1/R1 +1/R2, où R1 et R2 sont les
deux rayons des courbures principaux (aussi appelées c1 et c2, voir figure 23), c0 est la
courbure spontanée, c’est-à-dire la courbure de la membrane sans contraintes mécaniques, et
égale à zéro pour les membranes planes. Enfin, c1c2 (= 1/ R1R2) est la courbure gaussienne,
dont le signe varie avec la forme de la déformation (voir figure 2). En général, on définit le
signe d’un rayon de courbure par rapport au référentiel. Les rayons sont de même signe s’ils
sont du même coté de la membrane, et de signes opposés s’ils sont de part et d’autre de la
membrane. Le signe de la courbure gaussienne est donc négatif si les deux plus grands rayons
de courbure sont de part et d’autre de la membrane, et permet donc de discriminer entre une
structure bombée (Figure 2A) ou en selle de cheval (figure 23B).
57

Figure 23 : Deux cas de déformations illustrant les notions de courbures moyenne et gaussienne. A- les
deux rayons de courbures étant du même côté de la membrane, ils sont positifs. La courbure moyenne
(somme) et la courbure gaussienne (produit) sont donc positives. B- les deux rayons sont de part et d’autre
de la membrane, l’un est positif et l’autre est négatif. S’ils sont du même ordre de grandeur, la courbure
moyenne est alors proche de 0, et la courbure gaussienne est négative.
Les deux constantes κ et κG sont appelées module de rigidité de courbure et module de
courbure gaussienne respectivement, et sont exprimées en Joule. En ne tenant compte que des
énergies mise en jeu au cours des déformations de la membrane, il est possible d’écrire que H,
l’énergie élastique par unité de surface est telle que :
1 ∆A
2 1
2
H = Hext + Hcourb = χ( ) + κ( c− c0) + κGcc 1 2
(2.3)
2 A 2
L’énergie élastique totale de la membrane est donc HA. La tension σ est définie par :
δ ( HA)
= σ
δ ( ∆A)
58
(2.4)

Autrement dit, l’énergie élastique HA de la membrane augmente de σ∆A quand sa surface
augmente de ∆A. Son calcul est simple dans le cas où la membrane est plane (c1 = c2 = c0 =
0). σ est alors égal à :
A
σ χ
A
∆
= (2.5)
La variation de la tension est alors linéaire avec l’augmentation de surface de la membrane.
C’est le régime d’extension où l’aire moyenne de chaque lipide augmente avec la tension : la
tension tend à écarter les lipides.
Ainsi, modules de courbures et tension suffisent à caractériser une membrane. Il est
important de noter que la courbure gaussienne est généralement négligée, car on peut montrer
pour les membranes closes (type liposome) que sa contribution est une constante qui ne
dépend que de la topologie (théorème de Gauss-Bonnet). Sa contribution sera importante pour
la fission membranaire, qui implique un changement de topologie.
II.1.2 La représentation de Monge : la membrane
faiblement fluctuante
Pour remonter aux paramètres caractérisant la membrane tels que les modules de
rigidité, et le module d’extension, il a fallu décrire le modèle précedent dans une
représentation pouvant être confrontée à des mesures expérimentales. La représentation de
Monge est une paramétrisation simple de la surface membranaire qui cependant permet de
bien décrire les membranes planes dans les cas peu tendu et/ou faiblement fluctuant. La
courbure spontanée sera supposée nulle, et la courbure gaussienne n’ayant aucun rôle, sera
négligée.
II.1.2.1 Paramétrisation de la membrane
Une membrane d’aire A = L 2 présente des fluctuations à toutes les échelles comprises
entre la taille a des molécules qui la composent et sa taille L (voir figure 24).
59

Figure 24 : Une membrane fluctuante présente des déformations à toutes les échelles. En pointillés est
représentée la position moyenne à l’échelle considérée. Extrait de [110].
La description de Monge consiste à représenter chaque fluctuation par rapport au plan
moyen de la membrane. Elle est adaptée aux membranes quasi-planes. On définit l’amplitude
de la fluctuation au point r = ( x,
y ) et à l’instant t par un scalaire u( x , , ) orthogonal au plan
yt
moyen XY de la membrane à cet instant (voir figure 25). En partant de l’équation 1.3, il faut
maintenant exprimer l’énergie de la membrane en fonction de u. C’est-à-dire trouver une
relation entre u et ∆A, et entre u et c, la courbure.
⊥
60

Figure 25 : Représentation de Monge d’une membrane fluctuante. u( r, t)
représente l’amplitude de la
fluctuation au point r ( x,
y)
par rapport au plan moyen XY de la membrane, et définit la position de la
membrane au point
⊥ =
r⊥
et à l’instant t. n est le vecteur normal à la membrane au point r⊥ et à l’instant t. λ
est la longueur d’onde de la fluctuation considérée.
II.1.2.2 Expression de l’énergie élastique dans la description de Monge
Figure 26 : Relation géométrique entre l’aire A de la membrane et l’aire AP projetée sur le plan moyen XY.
D’après[110].
En se basant sur la figure 26, on peut écrire la relation suivante entre A l’aire totale de
la membrane et Ap l’aire projetée de A sur le plan moyen XY : Ap = Acosφ. ∇u est le
61
⊥

vecteur dérivée de u par rapport à x et y. Il est tangent à la membrane. Il est possible d’écrire
la relation suivante entre ∆A et ∇ u :
∆A A−
Ap φ ( ∇u)
= = 1− cosφ=
=
A A
2 2
2 2
(2.6)
2
De même, ∇ u est la dérivée seconde de u. Avec des arguments géométriques [10], il est
2 2 2 2
possible de montrer que ∇ un . = −c.
n,
où c est la courbure moyenne. On a donc ( ∇ u) = c .
2
Ayant une relation entre ∇ u et la courbure, ainsi qu’entre
∇u et ∆A, et en utilisant la
relation 1.5, on peut réécrire l’énergie H de la relation 1.3 comme une intégrale sur le plan
XY en fonction de u [10,111]:
⎡1
2 2 1 2⎤
H = ∫∫ κ( u) σ(
u)
.
XY ⎢
∇ + ∇ dxdy
⎣2 2 ⎥
⎦
La courbure spontanée a été négligée (c0 = 0), ainsi que l’effet de la courbure gaussienne, dont
la part énergétique reste constante au cours du temps pour les membranes fluctuantes.
II.1.2.3 Excès de surface dû aux fluctuations.
(2.7)
Dans la représentation de Monge, il est simple de calculer l’amplitude des fluctuations.
Nous verrons que ces fluctuations correspondent à un excés d’aire (membrane froissée) et que
le dépliement de ces fluctuations provoque une augmentation de la tension. Ainsi, il y a une
contribution entropique à la tension en plus de la contribution élastique.
Amplitude maximale des fluctuations :
Il est notamment simple de calculer l’amplitude maximale Umax des fluctuations d’une
membrane sans tension (σ = 0) de taille L. κ ne dépendant pas de ∆A, et en utilisant le
théorème de l’équipartition de l’énergie, qui dit qu’à chaque longueur d’onde de fluctuation
est associée une énergie de kT/2, et donc que l’énergie associée aux fluctuations d’amplitude
Umax est kT/2. Dans ce cas, on peut utiliser l’équation 2.7 pour calculer Umax, en prenant H
62

= kT/2. L’équation se simplifie, et la relation dimensionnelle suivante est possible (Frank
Jülicher, cours de DEA IPB):
1 2 2
( ) .
⎡ ⎤
H = ∫∫ κ ∇ u dx dy
XY ⎢
⎣2⎥ ⎦
kT κ U max ∝ ( ) L 2
2 2 L
2 2
(2.8)
2
∇ u est dimensionnellement une longueur, dérivée deux fois selon le plan moyen de la
membrane. Comme on s’intéresse dans ce cas aux fluctuations de plus grande amplitude
(Umax) observées sur la totalité de la membrane (taille L), 2 ∇ u est dimensionnellement
équivalent à Umax/L 2 . On trouve alors que Umax croit linéairement avec la taille de la
membrane L, dans le cas de membrane sans tension :
kT
Umax ∝ L
(2.9)
κ
Il est de même possible de calculer l’amplitude maximale Umax des fluctuations pour une
membrane sous tension, mais la tension ayant un effet sur toutes les fluctuations, de la taille
moléculaire a à la plus grande L, la relation fait intervenir ces deux dimensions :
U
kT L
∝ (2.10)
σ a
max ln
Il est intéressant de comparer la taille maximale des fluctuations en absence et en présence de
tension. Avec l’équation 2.9, et en prenant κ = 10 kT = 4.10 -20 J et L = 10 µm, on trouve Umax
= 3µm, pour une membrane sans tension. Avec l’équation 2.10, et kT = 4.10 -21 J, σ = 4.10 -6
N/m, L = 10 µm et a = 0.5 nm, on trouve que Umax est environ de 100 nm pour une membrane
de faible tension. On retrouve ici le premier effet de la tension qui est de réduire fortement
l’amplitude des fluctuations.
63

Excès de surface :
Il est également possible de calculer, grâce à l’équation 2.7, l’expression liant l’excès
de surface α = ∆A/A à κ et à σ. On trouve [112,113] :
∆A
kT a +
α = =
A 8 L +
2 2
π σκ
ln 2 2
πκ π σκ
(2.11)
Pour une membrane sans tension (σ = 0), on trouve, avec κ = 10 kT, a = 0,5 nm et L = 10 µm,
un excès de surface de 8%. Ceci correspond à l’excès de surface maximal dû au froissage de
la membrane par les fluctuations. En pratique, l’excès de surface associé aux fluctuations est
plus faible. Dans la gamme des tensions courantes (10 -5 à 10 -6 N/m), on a toujours
2 2 2 2
κπ L σκπ a . Ceci permet de simplifier beaucoup l’expression 2.11 et de donner :
2
∆A
kT κπ
α = = ln
(2.12)
2
A 8πκ
σ a
Cette équation traduit le fait que la variation de l’aire évolue logarithmiquement avec la
tension dans le cas de membranes peu tendues (donc fluctuantes). On trouve, pour les mêmes
valeurs de κ, a et L que plus haut, et avec σ = 10 -5 N/m, α = 5%, donc un excès de surface
plus faible que sans tension. Cet excès de surface provient des déformations dûes aux
fluctuations, qui ne sont souvent pas visibles optiquement dans le cas des membranes peu
tendues. Cependant, il représente une fraction non négligeable de l’aire totale, même pour des
tensions moyennes.
Cependant, il manque dans l’expression 2.11, la part de l’augmentation de l’aire due à
l’extension de la membrane (voir équation 2.1). D’après l’équation 2.5, cette augmentation
liée à l’extension est αext = σ/χ, qui vient s’additionner à l’expression 2.12, pour donner
l’expression :
2
∆A
kT κπ σ
α = = ln + (2.13)
2
A 8πκ
σ a χ
On retrouve bien une dépendance logarithmique de α avec σ pour les faibles tensions (car le
terme σ/χ est alors négligeable devant le terme logarithmique) et une dépendance linéaire
64

pour les fortes tensions (le terme logarithmique devenant négligeable). Le terme
logarithmique traduit le « défroissage » des fluctuations et le terme linéaire, l’augmentation
d’aire liée à l’extension de la membrane. Il a récemment été montré que cette expression
(2.13) restait vraie pour toutes les tensions, de la tension nulle à la tension de rupture de la
membrane et en particulier dans le régime intermédiaire [114].
II.1.3 Vérification expérimentale du modèle de Canham-
Helfrich.
Nous allons voir maintenant une technique permettant de vérifier expérimentalement
ce calcul, et de mesurer κ. Il s’agit de la technique développée par Evan Evans dans les
années 80 [115] et qui consiste à mesurer l’excès d’aire α et la tension σ en aspirant des
vésicules avec une micropipette. Nous discuterons également l’importance de la tension, du
module de courbure et de la courbure gaussienne pour les aspects biologiques liés au trafic
membranaire.
De nombreuses techniques ont été utilisées pour vérifier le modèle d’Helfrich
qualitativement et quantitativement. Parmi elles, la technique d’aspiration de vésicules
fluctuantes à l’aide de micropipettes est une des plus fiables. Elle présente l’avantage de
pouvoir directement mesurer la courbe ∆A en fonction de σ, et retrouver ainsi les
comportements logarithmique à faible tension et linéaire à plus forte tension. Elle est de plus
très sensible par rapport à des techniques d’analyse de contours utilisant la vidéo-microscopie
et limitées par la résolution optique.
La technique est simple (voir figure 27). Elle consiste à créer une différence de
pression entre la chambre d’observation où se trouvent les vésicules et l’intérieur de la pipette
maintenant la vésicule au moyen de deux cuves remplies d’eau et dont la position verticale
peut être finement réglée. Pour cela, les deux cuves sont au préalable mises à la même
pression par équilibration des niveaux d’eau, et à la pression de la chambre (∆P = 0). En
bougeant verticalement la cuve reliée à la micropipette, l’autre cuve servant de référence, on
applique une différence de pression ∆P sur la vésicule proportionnelle à une différence de
hauteur h des cuves : ∆P = ρgh, où ρ est la densité de l’eau, g la gravité. ∆P peut être
directement mesuré par un capteur de pression (voir figure 27).
65

Figure 27 : Principe de l’aspiration de vésicules géantes à l’aide de micropipettes. A- Schéma de principe et
mesure de ∆P. D’après [110]. B-grandeurs mesurables par microscopie à Contraste Différentiel
Interférentiel (DIC) pour un ∆P fixé. Barre 10 µm.
La vésicule peut être partiellement défroissée en étant aspirée dans la pipette, et une
langue apparaît (voir figure 27B). La taille ∆L de cette langue augmente avec ∆P, et en
considérant que l’aire totale de la membrane et le volume de la vésicule sont constants, il est
possible de retrouver la surface défroissée α0−α, et récupérée dans la langue, à partir de ∆L:
3 2
Aasp− A0( Rpip Rves) −(
Rpip Rves)
α0− α = = ∆ L
(2.14)
A 2R
0
α0 est l’excès de surface de la vésicule sans aspiration, et α celui de la vésicule aspirée (plus
faible), A0 l’aire de la vésicule sans aspiration et Aasp, l’aire récupéré dans la pipette après
aspiration. Les rayons Rpip de la pipette et Rves de la vésicule sont facilement mesurables (voir
figure 27B). La mesure de la tension fait appel à la loi de Laplace, qui relie tension de surface
et différence de pression. Pour une vésicule de rayon R, il existe une différence de pression
entre intérieur et extérieur qui est telle que ∆ P = 2σ
R.
En appliquant cette loi entre la
vésicule et l’extérieur et au sein de la pipette, et en tenant compte du fait que la tension est
égale en tout point de la vésicule, on obtient la relation suivante entre ∆P et σ :
pip
Rpip
σ = ∆P
2(1 − R R )
66
pip ves
(2.15)

Il est donc facile d’obtenir la tension et l’excès d’aire en mesurant simplement les rayons des
pipettes, des vésicules et la différence de pression. En reprenant l’équation 2.13, il est possible
de calculer la variation relative d’excès de surface α0 - α en fonction de la tension [115]:
kT σ σ
α0− α = ln + (2.16)
8πκ
σ χ
En pratique, σ0 correspond à la pression la plus faible appliquée à la vésicule (prise
comme référence) et ∆L est mesurée par rapport à la position de la langue pour l’aspiration
minimale. On retrouve bien directement le comportement logarithmique à faible tension et
linéaire à forte tension. En traçant la courbe Tension en fonction de l’excès d’aire (figure 28),
on voit une première partie exponentielle pour les tensions faibles (7B) puis linéaire pour les
tensions fortes (7A).
Figure 28 : Courbes tension/excès d’aire pour deux types de lipides aux caractéristiques (κ et χ) différentes.
Deux représentations différentes sont données. A- On retrouve bien le comportement linéaire aux fortes
tensions dans la représentation tension/excés d’aire. B - la représentation log(tension) en fonction de l’excès
d’aire permet de mettre en évidence le régime exponentiel aux faibles tensions. Les courbes pleines sont les
fits obtenus avec l’équation 2.16 et permettent d’obtenir des modules de courbures (κ) de 22,5 kT et 10 kT
pour C18 :0/1 et diC18 :3 respectivement, et un module d’extensibilité (χ) de 230 mN/m pour les deux
vésicules. D’après [116].
67
0

Il est alors possible de fitter les données expérimentales avec l’équation 2.16 et
d’obtenir directement les deux paramètres importants, κ et χ. Les valeurs obtenues sont de
l’ordre d’une à quelques dizaines de kT (environ 10 -19 J) pour κ (pour les lipides en phase
liquide) et quelques centaines de mN/m pour χ.
Le plus important est que l’énergie élastique de la membrane, en reliant énergie et
déformation, permet de très bien décrire quantitativement et qualitativement les membranes
dans leur généralité. Le modèle dit de Canham-Helfrich est suffisamment général pour décrire
la majorité des comportements membranaires. Il décrit très bien notamment la forme en tube
prise par la membrane lorsqu’une contrainte ponctuelle et normale à son plan lui est
appliquée.
II.2 Tubes de membrane.
Il est connu depuis longtemps que l’application d’une force sur une membrane
perpendiculairement à son plan conduit à la formation d’un tube très fin. Ce phénomène a été
étudié par différentes techniques, notamment en fixant une vésicule géante sur une surface et
en tirant sur cette vésicule à l’aide d’une pipette [117,118] ou en la plaçant dans un flux [119].
C’est un moyen simple d’étudier les propriétés des membranes, mais aussi de construire des
réseaux de tubes pour des applications à but technologique [120,121]. Le tube, généralement
très fin (quelques centaines de nm au maximum), est composé de trois parties, le cou, zone de
liaison à la vésicule, le corps, qui est un cylindre parfait de membrane, et le bout du tube (voir
figure 29). Cette déformation est différente de celle observée quand on tire sur des surfaces
solides et élastique, type ballon de baudruche (voir figure 29A). Dans ce cas, la déformation
est conique. La capacité à former un tube est reliée au caractère fluide 2D des bicouches
lipidiques. C’est la compétition entre courbure et tension qui explique la déformation en
tube. Lorsque l’on tire sur une membrane, sa tension augmente car sa surface augmente (voir
précédemment). Pour diminuer sa tension, la membrane adopte une surface dite minimale car
minimisant la tension, tout en passant par le point où s’applique la contrainte (voir figure 29).
La forme qui minimise le plus la tension est une droite, de surface nulle, orthogonale au plan
de la membrane et passant par le pont d’application de la force. Mais elle maximise la
courbure (infinie). Donc, un équilibre s’établit entre courbure et tension, et conduit à la
68

formation d’un tube, la tension tendant à réduire le diamètre du tube, et la rigidité de courbure
à l’augmenter.
Figure 29 : A- Type déformation observée selon que la surface élastique est solide ou fluide. En rouge, le
point d’application de la force.B- Exemple de tube tiré à partir d’une vésicule tendue, maintenue par
aspiration dans une micropipette. La bille permettant d’exercer la force est maintenue avec une pince
optique. Barre 10 µm.
Nous allons voir que l’équation d’Helfrich explique parfaitement ce mode de
déformation, et qu’elle permet également de trouver la forme exacte du tube, ainsi que la
force nécessaire pour le créer et/ou le maintenir.
II.2.1 Expression d’Helfrich dans le cas des tubes de
membrane
Nous nous baserons sur l’étude théorique d’Imre Dérényi [122], bien que les
expressions de la force et du rayon aient été trouvées par d’autres avant [117,123-125]. Pour
calculer l’énergie d’un tube, il faut ajouter à l’énergie élastique l’énergie liée à l’extension L
de la membrane suite à l’application d’une force f. Pour un tube de longueur L, on a donc:
κ
= ∫ + −
(2.17)
2
2
H ( (2 c) σ ) dA fL
69

Comme précédemment, on a négligé la courbure spontanée, et la courbure gaussienne. A est
l’aire de la membrane et c, la courbure moyenne en un point de la membrane. Pour un tube de
longueur L, et en supposant que le tube est parfaitement cylindrique, on a :
⎡ κ ⎤
Htub = 2πRL
⎢
+ σ − fL
2
⎣2R⎥ ⎦
(2.18)
En minimisant Htub, c’est-à-dire en écrivant ∂H ∂ R = 0 et ∂H ∂ L = 0 , on obtient un
système de 2 équations à deux inconnues, R0 et f0 qui sont respectivement le rayon du tube et
la force statique du tube (force de rappel du tube). La force statique f0 est la force nécessaire
pour maintenir un tube à l’extension L, sans mouvement. On trouve :
R
0
tub
κ
= et fo = 2π2σκ . (2.19)
2σ
Il est important de noter que le rayon et la force ne dépendent pas de L, et que quelle que soit
la longueur du tube, la force est la même si la tension reste constante. Mais comme nous
l’avons vu, le fait de tirer sur une membrane augmente son aire et donc sa tension. Par contre,
si la vésicule est aspirée dans une pipette, la tension est fixée puisqu’elle ne dépend que de la
différence de pression ∆P (voir équation 2.15). Nous verrons qu’il est possible de vérifier les
expressions trouvées pour le rayon et la force expérimentalement en tirant un tube sur une
vésicule aspirée dans une pipette, et controlant ainsi sa tension. Si on prend ici pour valeur de
κ = 4.10 -20 J et σ = 5.10 -5 mN/m, on obtient un rayon R0 de 20 nm et une force f0 de 12,6 pN.
Le rayon est très petit, preuve que même à une tension faible, elle domine. Un autre point
important est que l’on retrouve bien la tendance de la tension à faire diminuer le rayon, et la
rigidité à l’augmenter (voir équation 2.19). La force quant-à-elle dépent de la racine carrée du
produit de la tension et de la rigidité de courbure. Donc une tension forte ou une rigidité forte
sont défavorables à l’extraction de tubes.
70
tub

II.2.2 Forme précise des tubes.
Comme nous l’avons vu précédemment, pour exprimer l’énergie de la membrane en
fonction de sa forme, il faut paramétriser chaque point de la membrane. On n’utilise pas ici la
représentation de Monge, qui n’est pas adaptée pour décrire les structures trop courbées, mais
une paramétrisation différente (voir figure 30) qui permet de tirer profit de l’axisymétrie du
tube. Sans entrer dans les détails des calculs, on peut, connaissant l’expression de l’équation
d’Helfrich pour un tube, remonter à la forme exacte du tube (voir figure 30) [122].
Figure 30 : Forme des tubes de membrane A-paramétrisation de la membrane : comme la membrane est
axisymétrique d’axe Z (axe du tube), on peut se ramener au plan RZ. On définit trois paramètres en fonction
de l’abscisse curviligne S, R(S), Ψ(S) et Z(S). R et Z sont les coordonnées du point d’abscisse curviligne S
et Ψ est l’angle que fait la tangente à la membrane au point S avec la verticale. B- forme 3D du tube, on
remarque un léger pincement à sa base ainsi qu’un peu en arrière de l’extrémité. L’extrémité n’est pas
sphérique. D’après [122].
La forme calculée présente des caractéristiques inattendues. Elle n’est pas parfaitement
cylindrique car deux pincements, de quelques pour cents plus faibles que le rayon moyen,
sont prévus à la base et un peu en arrière de l’extrémité (voir figure 30B et 31). Surtout,
l’extrémité n’est pas sphérique, mais relativement plus longue sur l’axe Z que sur l’axe R. Les
deux pincements sont localement des zones de courbure gaussienne négative. Cela pourrait
avoir une importance in vivo dans la bonne localisation de certaines protéines (celles qui ont
une affinité pour la courbure gaussienne négative), mais aussi dans la fission, car la courbure
gaussienne est négative au cours d’un évènement de fission.
Il est également possible de calculer la densité d’énergie le long du tube (c’est-à-dire
la quantité d’énergie par unité de surface en chaque point du tube). La figure 31 montre la
variation de la densité d’énergie le long du tube.
71

Figure 31 : Profil de la densité d’énergie (en vert) le long du tube (profil rouge). D’après [122].
La densité d’énergie diverge à l’extrémité du tube, car la courbure présente une singularité au
bout du tube. En effet, la tension étant un paramètre global, la variation de densité d’énergie
n’est liée qu’à la courbure. La divergence est peu rapide lorsqu’on approche du bout du tube
(logarithmique). Mais cette divergence signifie que le bout du tube est un endroit
particulièrement favorable pour la rupture de la membrane, ce qui n’est pas sans conséquence
pour l’extraction de tubes. Pour éviter cette divergence, il suffit de tirer sur un élément plus
large, formant alors un chapeau sur le bout du tube et l’empêchant de se rompre. En pratique,
les forces exercées sur les membranes au cours de la formation de tube ne sont pas
ponctuelles, et se répartissent sur la zone d’adhésion entre la membrane et l’objet utilisé pour
exercer la force (bille, pipette, etc..). Dans les cellules, le rôle de certains manteaux
protéiques, sur lesquels les moteurs moléculaires tireraient pour former les tubes visibles dans
le trafic intracellulaire, pourrait être de répartir les forces de traction afin d’éviter la rupture du
tube.
II.2.3 Une transition dans la forme correspond à une
transition dans la force
Il est possible de calculer la relation force/extension, pour une force ponctuelle. Ceci a
également été réalisé par I.Derenyi au laboratoire [122]. Nous avons vu que ni la force, ni le
rayon du tube ne dépendait de la longueur du tube (voir équation 1.19), lorsque le tube était
72

déjà formé. Cependant, pour des L petits, le tube n’est pas encore formé, et les déformations
que l’on observe ont la forme d’une caténoïde, comme pour une surface solide (voir figure
32). Pour ces faibles longueurs, la force augmente linéairement avec la longueur, avec f = σL
(voir figure 32) [126]. Pour une certaine longueur, d’environ 7,5 fois le rayon du tube, la force
passe par un maximum, de 13% plus important que f0, puis redescend brutalement pour des
longueurs de tube supérieures, et reste constante et égale à f0 (voir figure 32), si la tension
reste constante. Cette transition dans la force correspond à une transition dans la forme, la
déformation étant conique avant le maximum de force, et tubulaire après le maximum de
force (figure 32).
Figure 32 : Transition de forme, et transition de force. En haut, profil de la membrane (normalisé par le
rayon du tube R0) en fonction de la déformation en Z normalisée par R0. En bas, force normalisée par la
force statique f0 en fonction de la longueur du tube, normalisée par R0. Une transition de forme de caténoïde
à tube est visible (entre la courbe verte et la courbe bleu foncé), et correspond à une transition de force entre
un régime linéaire et un régime indépendant de L, longueur du tube (courbe rouge du bas). Plus la taille de
la membrane est grande devant le rayon (courbes verte et marron en pointillé, le chiffre indique le rapport
Lmem/R où Lmem est la taille de la membrane), plus la transition dans la force est brutale, jusqu’à devenir une
transition du premier ordre (courbe marron).
73

Un point important est que plus la taille de la membrane est grande devant le rayon du
tube, plus la décroissance du maximum à f0 est abrupte. Pour des rapport de Lmem/R
importants, la transition est du premier ordre, c’est-à-dire que le maximum de force devient
instable, et la transition de force de fmax vers f0 et (de forme caténoïde vers tube) devient
discontinue (voir figure 32).
La première conséquence de la forme de cette courbe de force est que du fait d’un
maximum de force à la transition cône/tube, il faut plus de force pour former le tube que pour
l’allonger. Autrement dit, il faudra, dans le cadre des tubes de membranes dans le trafic
intracellulaire, plus de moteurs moléculaires tirant sur une membrane pour former le tube que
pour l’allonger. La force, à tension faible, a été estimée à environ 10 pN (voir plus haut,
équation 1.19), ce qui correspond à la force exercée par environ 2-3 moteurs moléculaires
(type kinésine) [127].
La deuxième conséquence de cette transition de force est qu’elle est couplée à une
transition de forme (cône/tube) facilement observable, car elle correspond à une rétraction de
la membrane par rapport au point d’application de la force (voir figure 32). Nous verrons
qu’expérimentalement, nous retrouvons bien cette transition de forme, et qu’elle est couplée à
une transition de force.
II.2.4 Faisceaux de tubes ou tubes uniques ?
Expérimentalement, il a été montré que deux tubes émanant d’une même vésicule
tendaient à collapser spontanément par leur base [118], et à former des structures à trois
branches avec des angles de 120°. Les grandeurs mise en jeu peuvent être estimées grâce au
modèle présenté plus haut [122]. Pour cela, il est possible de calculer la forme d’énergie
minimale quand deux tubes sont tirés (voir figure 33) à partir d’une membrane plane. Pour
éviter que les deux tubes ne collapsent, on fait une expérience virtuelle en plaçant une tige très
fine (taille

Figure 33 : Collapse des tubes : A-Formes d’énergie minimale prises par deux tubes dont la réorganisation
est empéchée par une tige (non visible) placée à différentes hauteurs h. Ces différentes images donnent une
idée de la dynamique de collapse. B- évolution de la force en fonction de la hauteur h de la tige.
Surtout, aucune barrière de force (force nulle ou inférieure à zéro), n’est observée, ce
qui veut dire que le phénomène est spontané : dès que deux tubes sont tirés, leur bases
subissent une attraction qui les conduit à collapser.
II.3 Exemples théoriques et expérimentaux de phénomènes
physiques importants pour déformer, trier et couper les
membranes
Une grande variété de comportements prédits théoriquement ou découverts
expérimentalement pourraient avoir des implications importantes dans les trois aspects les
plus importants du trafic intracellulaire que sont la déformation, le tri et la fission. Nous
donnerons ici quelques exemples particulièrement saisissants de l’intérêt potentiel de certains
phénomènes pour le trafic vésiculaire. Le point le plus important est que tous ces exemples
sont basés sur la théorie de Canham-Helfrich, et s’expliquent généralement très simplement à
partir des différents paramètres que sont la tension, la courbure moyenne et la courbure
75

gaussienne. Nous pourrons ainsi dégager l’importance relative de chacun de ces paramètres
pour la formation d’un intermédiaire de transport.
II.3.1 Déformations des membranes
II.3.1.1 Modèle ADE (Area-Difference-Elasticity) et prédiction de la
forme des vésicules.
Le modèle de Canham-Helfrich considère la membrane comme infiniment fine et ne
tient pas compte de la structure en bicouche. Il s’est avéré que certaines formes prises par des
vésicules n’étaient pas prédites par la description d’Helfrich, et que certains éléments
microscopiques devaient être intégrés au modèle pour rendre compte de ces formes. Le
premier est que la membrane est organisée en deux couches d’épaisseur D/2 (D est l’épaisseur
de la membrane, entre 30 et 60 Å). Le deuxième est que le nombre de lipides de chaque
couche est constant pour des membranes purement lipidiques, et qu’il n’est pas forcément le
même dans les deux monocouches de la membrane. Lorsque la membrane est courbée, une
des couches voit son aire diminuer et l’autre son aire augmenter. Il en résulte une différence
d’aire entre les deux monocouches lorsque la membrane est courbée de la forme
∆ = −
ext int
A A A
reste constante avec
, qui contribue à l’énergie élastique de la membrane. L’aire A de la membrane
A A A
ext int
= ( + ) 2. La différence d’aire globale ∆A est reliée à la
courbure locale de la membrane par l’équation [128]:
∫ ( 1 2)
(2.20)
∆ A= D c + c dA
où c1 et c2 sont les deux courbures principales au point considéré. En utilisant cette
expression liant ∆A à la courbure locale, il est possible de trouver d’exprimer l’énergie totale
de la membrane pour une membrane sans tension [129]:
κ 2 κ π
2
E = ( c c0) dA ( A A
2
2∫− + ∆ −∆ 0 ) (2.21)
2 AD
76

où κ et κ sont respectivement les modules de rigidité de courbure locale (énergie de courbure
vue précédemment) et globale (liée à la différence d’aire entre les monocouches induite par la
déformation de la membrane). A est l’aire de la membrane, et ∆A0 est la différence d’aire
entre les deux monocouches lorsque la membrane ne subit aucune contrainte. Sans contrainte,
cette différence d’aire n’est due qu’à une différence du nombre de lipides entre les deux
couches, celle ayant le plus grand nombre de lipides ayant aussi l’aire la plus grande. Donc
∆ = −
ext ext int int
A0a N a N
ext int
, où a et a sont les aires moyennes occupées respectivement par un
lipide de la couche externe et de la couche interne de la membrane. De même, N ext et N int sont
respectivement le nombre de lipides de la couche externe et de la couche interne de la
membrane. On voit que l’énergie totale tient compte ici de la différence d’aire induite par une
déformation sous contrainte et de la différence d’aire induite par une différence de nombre de
lipides entre les deux feuillets. A partir de cette énergie, il est possible d’obtenir la forme
d’une vésicule d’aire A. Pour calculer l’énergie minimale et trouver la forme, il faut
caractériser l’état de la vésicule selon trois paramètres :
Son volume V, le plus important pour une aire donnée étant obtenu pour une sphère.
Pour une vésicule sphérique d’aire A et de rayon R A 4π
A = , le volume VA est égal à
3
π R . Toutes les autres formes (non-sphériques) prises par une vésicule ont un volume
(4 3) A
inférieur. Il est donc possible de définir pour une vésicule d’aire A et de volume V, un
volume réduit sans dimension v ramené au volume de la sphère d’aire A. On a :
et v est compris entre 0 et 1, égal à 1 si la vésicule est sphérique.
V
v = (2.22)
3
(4π 3) RA
Un autre paramètre important est le rapport des rigidités de courbure locale et globale
α = κ κ . Si α est nul, il n’y a aucune résistance à la déformation due à une différence d’aire
entre les deux couches. Si α est infini, les déformations sont possibles tant que ∆ A∆A . Les
estimations et mesures expérimentales [130] montre que α est de l’ordre de 1. Ceci signifie
que la contribution de la courbure locale et de la différence d’aire (ou courbure globale) sont
du même ordre de grandeur, et donc non négligeables l’une par rapport à l’autre.
Enfin, le troisième paramètre important est la différence d’aire effective, qui tient
compte de l’effet de la différence du nombre de lipides entre les deux couches, et de la
77
0

courbure spontanée de la membrane. Il est important de voir que la courbure spontanée de la
membrane provoque une différence d’aire compensée ou non par la différence de nombre de
lipides. Il faut donc tenir compte de la courbure spontanée c0 dans la différence d’aire
effective 0 a
où 0 0
∆ , qui prend la forme :
a a
∆ 0 =∆ 0+
0
1
C (2.23)
2πα
∆ a =∆A (8 π DR ) et C = c R sont des paramètres sans dimensions, et représentent
A
0 0 A
respectivement la contribution de la différence du nombre de lipides et de la courbure
spontanée à la différence d’aire effective.
Avec ces trois paramètres, il est possible de définir la forme de toute vésicule d’aire A,
et de tracer un diagramme de phase théorique [129], vérifié expérimentalement [130]. Ce
diagramme de phase est complexe, les vésicules pouvant adopter des formes mutiples en
fonction de la différence d’aire effective 0 a ∆ et du volume réduit v (voir figure 34).
78

Figure 34 : Diagramme de formes des vésicules obtenu avec le modèle ADE pour α = 1,4 et pour différentes
valeurs de différence d’aire effective 0 a ∆ et de volume réduit v. Sto pour stomatocytes, Obl pour Oblates,
Pro pour prolates, Pear pour poire et Nas pour Non-Assymetric Shape. Les lignes joignent les points de
transition entre une forme et une autre. D pour transition de premier ordre, C pour transition de deuxième
ordre et L pour ligne Limitante, séparant les formes à une vésicule des formes à deux vésicules connectées
par un cou de rayon infinitésimal. A pour les transitions où les intéractions adhésives des membranes
doivent être prises en compte pour décrire la forme. D’après [131].
79

A l’heure actuelle, les formes d’ellipsoïdes prolates ont été les plus étudiées, et
notamment la transition prolate/poire, ainsi que la transition poire/bourgeonnement.
Cependant toutes les formes présentées sur ce diagramme de phase ont été observées sur des
vésicules géantes, confirmant la généralité de ce modèle pour la description dess membranes.
Il faut noter que certaines formes sont présentes dans la nature, le meilleur exemple étant le
globule rouge qui est un oblate avec un rapport surface/volume important (v faible). Le plus
intéressant est de constater qu’il est possible de faire bourgeonner une vésicule simplement en
augmentant 0 a ∆ . Et pour augmenter 0 a
∆ , il est possible d’augmenter la différence du
nombre de lipides de part et d’autre de la membrane. Cette transition est appelée transition de
bourgeonnement. Il est intéressant de constater qu’en changeant simplement la différence
d’aire, sur une vésicule unilamellaire et à composé unique, il est possible de provoquer un
bourgeonnement. Un autre point important est que le diagramme ne dépend pas de α.
II.3.1.2 Le perlage ou comment faire des vésicules à partir d’un tube
Le perlage est un processus bien décrit dans les instabilités dites de « Rayleigh ». Le
phénomène de perlage le plus courant est le filet d’eau du robinet se transformant en gouttes
avant de toucher le fond de l’évier (voir figure 35A). Ce phénomène peut également être
observé sur des vésicules tubulaires (voir figure 35B), la différence majeure venant du fait que
la membrane ne se coupe pas spontanément, il résulte de ce perlage une série de vésicules
rattachées entre elles par des tubes très fins. La description classique des instabilités de
Rayleigh est liée à une compétition entre tension de surface (air/eau dans le cas du filet d’eau)
et viscosité. Ainsi, la tension de surface tend à faire des gouttes pour minimiser la surface de
contact air/eau d’un rayon R maximal. La viscosité, elle, tend à limiter le rayon R des gouttes,
car pour les grandes gouttes, le déplacement de liquide nécessaire à leur formation est freiné
par la viscosité. On peut montrer qu’il y a sélection d’un rayon R0 optimal, minimisant
l’énergie de surface et de la viscosité.
80

Figure 35 : Phénomènes de perlage. A- représentation schématique du perlage d’un filet d’eau sortant du
robinet, la taille des gouttes obtenues est constante d’un diamètre R0. B- Phénomène de perlage dans des
tubes de membranes. Ici le perlage est provoqué par l’insertion d’un polymère dans le feuillet externe de la
bicouche : a, b et c sont trois vues du même tube à t = 0s, t = 70 sec et t = 150 sec. d montre un autre tube à t
= 900 sec (t = 0 sec est le début du perlage) pour une concentration de polymère supérieure à a,b et c. On
voit que le tube est en deux parties, une partie où les perles sont petites, et une partie où les perles sont
grandes. D’après [132].
Dans le cas des tubes de membranes, le perlage peut être dû à deux phénomènes différents.
1) augmentation de la tension.
Le premier phénomène mis en évidence est expliqué par la théorie des instabilités de
Rayleigh [119]. Sur des tubes de membranes peu tendus et formés dans un flux, la tension
peut être brutalement augmentée par application locale d’une pince optique qui piège une
partie de la membrane, la fripant pour la concentrer au centre de la pince [133]. Cette
réduction brutale de surface entraîne, sur les tubes clos (pas de pores ou de réservoirs de
lipides) une augmentation rapide de la tension (voir figure 36). Une instabilité de perlage se
propage alors du point d’application de la pince optique vers les extrémités du tube. La forme
du tube relaxe vers une forme cylindrique dès l’arrêt de l’application du laser, et le temps de
relaxation dépend du temps d’application de la pince [119]. Plus la pince a été appliquée
longtemps, plus de membrane a été piégée, et plus la relaxation est longue.
L’explication du phénomène est liée à une compétition entre courbure et tension
[119,134], analogue à une instabilité de Rayleigh. La tension augmentant, elle réduit l’excès
de surface, défroissant en premier lieu les fluctuations de grande longueur d’onde.
L’augmentation de la tension « favorise » donc les fluctuations de petite longueur d’onde. La
81

courbure elle, limite les fluctuations de petite longueur d’onde, puisque très courbées. De
même que pour l’instabilité de perlage du filet d’eau, il y a une longueur d’onde optimale. Si
l’on exprime l’énergie de la membrane à partir de l’équation d’Helfrich (1.3) par rapport au
rapport s sans dimension entre la tension et le module de courbure avec
fonction de k le nombre d’onde tel que k R0Rperl
s = σ R κ , et en
= où R0 est le rayon du tube avant perlage,
Rperl, le rayon des perles, on peut calculer la forme la plus stable du tube pour un s et k
donnés, et faire un diagramme de stabilité (voir figure 36). On constate que plus le rapport s
est grand, plus la forme est perlée, avec une forme intermédiaire sinusoïdale, et surtout que
l’on passe d’une forme à l’autre (non-perlée à sinusoïdale, puis sinusoïdale à perlée) par des
transitions discontinues (de premier ordre). Cette transition de forme apparaît donc seulement
pour les tensions supérieures à une tension seuil donnée par:
3κ6κσ σ perl = = = 3σ
(2.24)
2R2κ 2
0
en utilisant R0 = κ 2σ
. On peut de même calculer le nombre d’onde k optimal (minimisant
énergie de courbure et tension) grâce à la théorie, et le mesurer expérimentalement. On
trouve kopt = R0Rperl ≈ 0, 7 , ce qui confirme la théorie.
Figure 36 : A-Perlage de tubes par augmentation de la tension. La tension augmente suite au piègeage de la
membrane dans une pince optique (point lumineux sur la droite des images). L’instabilité de perlage se
propage alors à partir de ce point. B-Diagramme de stabilité de forme en fonction de s, rapport normalisé de
la tension sur la rigidité de courbure, et k, nombre d’onde. Le modèle n’étant pas valable pour les grands s,
les valeurs de s ne dépassent pas 10. Il y a trois formes stables, cylindrique (en bas), sinusoïdale (au milieu)
et perlée (en haut). Chaque domaine de stabilité est séparé des autres par une zone de métastabilité (lignes).
D’après [119].
82
2
0

2) perlage par induction de courbure spontanée.
L’autre perlage observé expérimentalement et prévu théoriquement sur des tubes de
membranes est induit par une modification de la courbure spontanée [132] (voir figure 35).
Expérimentalement, l’insertion d’un polymère amphiphile dans la couche externe d’une
membrane provoque une augmentation de la courbure spontanée. Ce mécanisme pourrait
s’appliquer aux nombreuses protéines s’insérant dans la membrane, modifiant sa forme. En
effet, ce polymère (Dextran fonctionnalisé avec des chaînes palmitoyles) ayant une tête de
gros volume et une queue petite, provoque une courbure spontanée due à la répulsion stérique
des têtes dextran. De plus, l’insertion d’un composant supplémentaire dans la couche externe
provoque une différence d’aire entre les deux monocouches qui crée également de la courbure
spontanée. D’une façon générale, la courbure générée est proportionnelle à la quantité de
polymère intégré, et il est donc possible d’exprimer cind la courbure spontanée telle que :
c = ρc
(2.25)
ind
où c0 est la courbure induite par la concentration maximale de polymère, et ρ le taux
d’insertion de polymère avec Cpol CpolMAX
ρ = ⎡
⎣
⎤
⎦
⎡
⎣
0
⎤
⎦ , où cpol et cpolMAX sont respectivement les
concentrations membranaires de polymères de l’expérience et maximale.
Ici, il ne s’agit pas de perlage de type Rayleigh, car il n’y a pas de compétition
courbure/tension. D’ailleurs, expérimentalement et théoriquement, le kopt est de l’ordre de 1,
ce qui est différent du cas où la tension augmente (voir plus haut). Le perlage est provoqué
par la courbure générée par l’insertion du polymère, et la forme obtenue est une forme
d’énergie minimale permettant de minimiser l’énergie de courbure et de maximiser l’entropie
liée à la diffusion du polymère dans la membrane. Les formes obtenues sont dites de
« Delaunay » [132]. L’énergie E de la membrane est alors donnée par:
⎧ kT
⎫
E = c− c + [ + − −
⎩ a
⎭
2
∫ ⎨2 κ( ρ 0) ρln ρ (1 ρ)ln(1 ρ)
2
] ⎬dA
(2.26)
La tension n’est pas prise en compte car elle n’intervient pas dans le phénomène, et a est une
distance moléculaire de répulsion stérique. Le premier terme de l’intégrale est l’énergie liée à
la courbure, et le second liée à l’entropie de mélange des polymères dans la membrane. Le
point le plus intéressant est que l’on peut montrer que pour des concentrations membranaires
83

élevées de polymères, la forme de Delaunay la plus stable est une grande perle de taux
d’incorporation du polymère ρ1, connectée à une série de toutes petites perles de taux
d’incorporation du polymère ρ2. Aux concentrations élevées, la dispersion du polymère (gain
entropique) ne compense plus l’augmentation énergétique liée à la courbure, et le système se
ségrège en deux parties, avec une grande sphère peu concentrée en polymère, et un collier de
toutes petites perles fortement concentrées en polymères, la grande sphère permettant
d’absorber l’excès de polymère, et/ou de courbure. Ceci permet d’expliquer l’observation
expérimentale (voir figure 35B, d) où quelques grandes vésicules sont connectées à un
chapelet de très petites vésicules à temps long (900 s) et pour de fortes concentration de
polymères. Expérimentalement et théoriquement, on trouve que le rapport des diamètres est
supérieur à 10.
Il est intéressant de voir que dans une géométrie cylindrique, l’insertion d’un élément
supplémentaire dans la couche externe de la bicouche provoque la formation de vésicules
connectées, mais surtout que le même phénomène sur des vésicules provoque la tubulation
des vésicules [135]. Les auteurs montrent que le même polymère mis en présence de vésicules
provoque l’émergence de tubes. L’effet de la géométrie de départ sur l’état final est donc
considérable, puisque le même effet permet de passer de tubes à sphères et de sphères à tubes.
C’est aussi un phénomène très simple qui pourrait expliquer parfaitement toutes les
tubulations de liposomes générées par des protéines telles que l’amphiphysine, la dynamine
ou l’endophiline, qui s’insèrent toutes dans le feuillet externe de la membrane (voir 2.1.3.2),
même si les tubes pour ces protéines sont plus fins.
Ici, le passage de tubes à vésicules est provoqué par la modification de différents
paramètres (tension, courbure spontanée), qui pourrait tous jouer un rôle dans la cellule. Il
sera important de comprendre si par exemple les manteaux agissent en modifiant localement
la courbure spontanée, ou en modifiant la tension.
II.3.1.3 Bourgeonnement par séparation de phase
Un autre aspect important est que le changement de forme est couplé dans certains cas
à une séparation des éléments membranaires, ce qui pourraient être important dans le tri. Nous
allons voir un exemple de déformation liée à une séparation de phase, et nous verrons que le
tri membranaire peut être couplé à la déformation de la membrane.
84

Les lipides des membranes cellulaires sont capables in vitro et probablement in vivo,
de s’organiser en domaines de compositions différentes. En effet, il est possible d’observer
des domaines circulaires, donc fluides, de composition différentes dans des bicouches
artificielles, ainsi que dans des monocouches [87,88,97,136-139]. Ceci est une des bases de
l’hypothèse des rafts, vue plus haut.
Une hypothèse simple a été formulée théoriquement, qui propose que si deux
domaines de compositions différentes coexistent sur une membrane, alors, il existe une
tension de ligne entre ces deux domaines, c’est à dire une énergie associée à l’interface entre
les domaines ne se mélangeant pas, et proportionnelle à la longueur de cette interface. Etant
proportionnelle à la longueur de la frontière entre les deux domaines, le système peut se
réorganiser en faisant bourgeonner l’un des deux domaines, réduisant le périmètre de
l’interface entre les deux domaines [140]. Mais pour cela, il faut courber la membrane, il y a
donc une compétition entre courbure, tension de ligne et tension de la membrane.
Comme toujours, il est possible d’exprimer l’énergie d’une membrane comportant
deux domaines de composition respective α et β à partir de l’équation d’Helfrich, et en
minimisant l’énergie, d’en déduire la forme. Dans un premier temps, la tension est négligée (σ
= 0), et l’énergie ne contient donc que les termes de courbures et de tension de ligne. Pour les
membranes à deux composants, la forme de l’énergie est
E = E + E + E
( α ) ( β)
( αβ )
courb courb ligne , où Ecourb
est l’énergie de courbure associée à chacun des deux domaines, et Eligne l’énergie associée à la
frontière entre les deux domaines. Plus précisément, on a :
() i
() i κ 2
Ecourb = ∫ ( c ) dA
2
E = λdl
( αβ )
ligne
∫
(2.27)
κ(i) est la rigidité de courbure du domaine de composition i, et λ est la tension de ligne,
intégrée sur la longueur L du périmètre de l’interface (αβ). En utilisant la même
paramétrisation que pour la forme des tubes (voir 3.2), et en calculant la forme en fonction de
β α
x = A ( A + A )
β
, fraction de la surface de la membrane couverte par β, on obtient le
diagramme de phase présenté sur la figure 37A. Les rigidités de courbures des deux phases
ont été supposées égales, et les rigidités de courbure gaussienne égales à 0. En se déplacant
sur la ligne en pointillés de droite à gauche, on observe les changements de forme présentés
sur la figure 37B.
85

Figure 37 : A -Diagramme de forme en fonction de la tension de ligne λ et de la fraction surfacique x de β.
Le diagramme est symétrique par rapport à x car les deux types de domaines sont supposés avoir les même
caractéristiques. Dbud est la ligne de transition cloque/bourgeon et Lcb est la limite de déformation maximale,
où le rayon du cou du bourgeon tend vers 0. B- évolution de la forme d’une vésicule le long de la ligne
pointillés sur le diagramme A. Les chiffres représentent la fraction x de β. On voit que Dbud correspond à
une transition brutale dans la forme, pour une très faible variation de x (transition du 1 ier ordre). Le trait
plein correspond au domaine de composition β et le trait en pointillé dau domaine de composition α.
D’après [140,141].
L’augmentation de x revient à faire croître le domaine. Ainsi, plus le domaine grandit,
plus il déforme la membrane, puisque étant grand, il peut se courber sur un rayon important
n’augmentant pas trop son énergie de courbure. De plus, plus le domaine est grand, plus sa
frontière avec l’autre domaine est longue et favorise le bourgeonnement. Pour une certaine
fraction Dbud, à λ fixé, le domaine bourgeonne, formant une jonction de courbure gaussienne
négative entre lui et l’autre domaine. Cette transition de forme est du premier ordre, donc
brutale. Le point important est que la ligne de séparation entre les deux domaines se retrouve
sur le cou de la vésicule, réduisant fortement sa longueur, minimisant ainsi l’énergie associée
à la tension de ligne. Ceci ne reste vrai que si aucun couplage entre courbure gaussienne et
86

composition existe, c’est-à-dire si aucune des deux phases ne préfère les zones de courbure
gaussienne négative. Dans le cas contraire, la ligne de séparation est alors déplacée par
rapport au cou du côté du domaine qui aime le moins la courbure gaussienne négative.
Une première tentative de vérification de cette théorie a été réalisée peu après, mais
l’absence de visualisation directe des domaines, et donc de leur frontière, associée à un
manque de données quantitatives ne rend pas l’étude très convaincante [142]. Une étude très
récente de microscopie à deux photons [143], permet de retrouver les différents cas proposés
par le modèle, et de remonter ainsi à des grandeurs physiques telles que λ. Cette étude utilise
des vésicules géantes formées à partir d’un mélange de phosphatidylcholine, sphingomyeline
et cholestérol, mimant la composition des membranes cellulaires. Ce mélange est connu pour
former deux phases dans certaines proportions de chacun des lipides, une phase Liquide
Ordonnée (Lo) riche en sphingomyeline et cholestérol, et une phase Liquide Désordonnée
(Ld), riche en phosphatidylcholine. Les auteurs observent que les domaines peuvent
bourgeonner, et que la frontière est souvent au cou des bourgeon (voir figure 38).
Figure 38 : Une vésicule géante dont un domaine a bourgeonné : on voit que le cou correspond à la frontière
entre les deux domaines, même si le domaine rouge semble recouvrir en partie le cou (voir agrandissement).
Rouge, phase Ld et bleu Phase Lo. Barre 5 µm, d’après [143].
Grâce à une analyse précise des formes, les auteurs mesurent une tension de ligne λ de
9+0,3 10 -13 N, ce qui est un ordre de grandeur plus faible que ce qui a été prédit
théoriquement [141]. De même, ils estiment le rapport des rigidités de courbures κ Lo /κ Ld de
l’ordre de 1,25. Ce qui est plus également plus faible que ce qui a été mesuré par ailleurs
87

[116,144-146]. Ceci pourrait être du au fait que la phase Ld, de rigidité de courbure plus faible
que la phase Lo, a tendance à envahir le cou des bourgeon car de courbure importante (voir
figure 38), faussant les mesures. Les auteurs montrent par ailleurs que cette phase se retrouve
majoritairement dans les zones les plus courbées. Ces expériences reste la première
démonstration quantitative de la théorie du bourgeonnement par séparation de phase.
Dans la cellule, de nombreux bourgeons et vésicules ont des compositions lipidiques
différentes de celle de la membrane donneuse (voir chapitre 2.2.2). Il est probable que la
différence de composition soit en partie liée à une séparation de phase, qui pourrait de fait
aider au bourgeonnement des vésicules, tout en réalisant un tri.
Nous allons voir maintenant que la formation d’un bourgeon peut elle-même
provoquer une séparation de phase et ainsi réaliser un tri, et également favoriser la fission.
II.3.2 Séparation de phase induite par la courbure de la
membrane : rôle potentiel dans le tri et la fission.
Nous allons voir ici deux études théoriques qui, couplant la composition locale à la
courbure spontanée ou à la courbure gaussienne, montrent que la formation d’un bourgeon
peut provoquer des séparations de phases, ce qui pourrait avoir de l’importance pour
comprendre le tri et la coupure de la membrane.
II.3.2.1 Tri par séparation de phase liée à un couplage entre la
composition et la courbure spontanée
Une étude théorique [147] montre que s’il existe un couplage entre la courbure
spontanée et la composition de la membrane, la composition d’un bourgeon peut être
différente de la membrane donneuse. Sur une vésicule à deux composants α et β (voir plus
haut), on appelle φ(s) la fraction du composé α au point d’abscisse curviligne s. La fraction du
composé β est donc 1-φ(s). Si le composé α augmente la courbure spontanée
proportionnellement à sa concentration, il est alors possible d’introduire un couplage entre la
composition en α et la courbure spontanée sous la forme de :
c () s () s λφ = (2.28)
0
où c0(s) est la courbure spontanée au point d’abscisse curviligne s. λ est appelée constante de
couplage. On peut alors ajouter cette quantité dans l’expression de l’énergie de la membrane.
88

On suppose que les composants sont miscibles, et on étudie les éventuelles séparations de
phase induites par changement de la forme. Comme les composés sont miscibles, il existe un
terme énergétique lié à l’entropie favorisant le mélange des deux composants. Cette énergie F
est donnée par :
2
F = ( κ 2) ε∫ φ dA
(2.29)
où ε est une énergie moléculaire divisée par la rigidité de courbure κ. De même que pour le
terme de couplage, ce terme entropique est ajouté à l’expression de l’énergie de la membrane.
Pour obtenir une déformation type bourgeonnement, il suffit de faire varier la différence
d’aire entre les monocouches et le rapport surface sur volume d’une vésicule, en utilisant le
modèle ADE vu précédemment. Il est donc possible d’induire le bourgeonnement d’une
vésicule (voir transition de bourgeonnement 2.3.1.1), et de calculer la composition en chaque
point de la membrane en tenant compte du couplage composition/courbure et du terme
entropique. Ceci est représenté en figure 39.
Figure 39 : Evolution de la composition locale φ (courbe fine) en composé α, en fonction de la forme de la
vésicule. Il est clair que le bourgeon est enrichi au cours de sa formation en composé α, ce composé ayant
une affinité pour la courbure. D’après [147].
On voit qu’il est possible de provoquer une réelle séparation de phase, avec deux
compositions réellement différentes dans le bourgeon et dans la vésicule. De même, on voit
89

que la composition est homogène en absence de déformation, et que la séparation de phase est
induite par la déformation. Le couplage composition/courbure permet un couplage
déformation/tri. Cette étude montre qu’il est théoriquement possible de trier des éléments sur
leur affinité pour la courbure spontanée. De nombreuses hypothèses en biologie postulent que
cette sensibilité à la courbure pourrait avoir une importance pour le tri des éléments
membranaires, et notamment il est admis que la forme des lipides pourrait leur conférer une
sensibilité à la courbure (voir 2.1.3.1). Il serait intéressant d’étudier à quel paramètre physique
(courbure spontanée, courbure gaussienne) sont couplées chacune des formes de lipides, car
les effets sur la composition et la forme générale de la membrane peuvent être très différents
selon le couplage.
II.3.2.2 Séparation de phase par couplage à la courbure gaussienne
induisant la fission du bourgeon
De même que pour l’étude précédente, il est possible [148], dans des vésicules à deux
composants, d’introduire un terme de couplage entre φ, la composition locale du composant
minoritaire, et c1c2, la courbure gaussienne sous la forme suivante:
couplage
∫ 1() 2()()
(2.30)
E = λ c r c r φ r dA
où λ est la constante de couplage. Si λ < 0, le composé minoritaire a une affinité plus forte
pour les zones de courbure gaussienne positive. Il faut également ajouter un terme entropique,
car la vésicule est homogène au départ. Il a une forme proche de celle vue pour l’étude
précédente :
1 )
t
E φ
2
2
entropie = ∫ () r dA
(2.31)
où t est la température. Il est alors possible de calculer comme précédemment, l’énergie
associée aux deux formes Ω1 et Ω2 (voir figure 40). La différence d’énergie libre
∆ E = E( Ω ) −E( Ω
fission.
2
est alors l’énergie gagnée (ou perdue) au cours d’un évènement de
90

Figure 40 : Les deux formes, avant et après fission du cou. D’après [148].
Il est possible de montrer que ∆E reste négatif sur une large gamme de paramètres, signifiant
que la fission est, dans ce cas, thermodynamiquement favorable. De plus, il est possible de
calculer la composition de la membrane en chaque point, et montrer que le composé
minoritaire est absent du cou. Il est aussi possible de montrer qu’il y a bien séparation de
phase et que c’est cette séparation de phase qui provoque l’instabilité du cou.
Il est important de voir ici, qu’un couplage entre la composition et la courbure
gaussienne provoque la déstabilisation de la vésicule, conduisant à la fission. Une des
questions importante sera de savoir si ce principe physique est utilisé par la cellule pour
couper la membrane, et si les acteurs de la fission tel que l’endophiline ou la dynamine ont
une affinité pour les structures de courbure gaussienne négative, pour ainsi faciliter la fission
membranaire.
II.4 Conclusion
Dans ce chapitre, nous avons vu qu’une description simple ne tenant compte que des
propriétés de déformation des membranes permettait de rendre compte de très nombreux
phénomènes et comportements observés. Cette description ne fait intervenir que quatre
paramètres importants, la tension, la rigidité de courbure, le module de courbure gaussienne et
la courbure spontanée. Avec quelques phénomènes physiques supplémentaires tels que la
séparation de phase ou le couplage entre courbure et composition, il est possible de reproduire
théoriquement les trois comportements importants du trafic intracellulaire, à savoir, la
déformation, le tri et la fission. La description de Canham-Helfrich offre un cadre général qui
91

permet de comprendre les bases physiques des propriétés des membranes. Une des voies de
recherche pour l’avenir sera probablement de découvrir sur quel(s) paramètres de ce modèle
agit chacun des éléments membranaires (lipide, protéine).
C’est dans le but d’explorer le rôle des différents paramètres physiques dans le trafic
intracellulaire que nous avons voulu bâtir un système très simple mimant la formation de
tubes à partir de membranes modèles. Pour cela, nous avons utilisé des kinésines purifiées,
des microtubules et des vésicules géantes. Nous avons ainsi pu reproduire certaines des
déformations observées dans les cellules, et en utilisant une membrane à plusieurs
composants, nous avons pu réaliser un système minimal pouvant déformer, trier et couper la
membrane.
92

chapitre 3 Mise en place d’un
système minimal reproduisant la
formation de tubes de membranes
tirés par des moteurs moléculaires.
Tubes de membranes tirés par des moteurs moléculaires à partir d’une vésicule géante.
93

L’objectif de cette thèse a été de construire un système simple, mais proche des
conditions biologiques, qui permette de comprendre et éventuellement de mesurer quels sont
les paramètres physiques (rigidités de courbures, tension, etc...) importants dans le cadre du
trafic vésiculaire. Dans un premier temps, nous avons voulu reproduire in vitro l’étape de
déformation de la membrane. Dans les cellules, comme nous l’avons vu dans le chapitre 1, la
formation des intermédiaires de transports par déformation de la membrane peut se faire selon
plusieurs modalités. Une de ces modalités est la déformation des membranes en tubes par des
moteurs moléculaires appliquant une force ponctuelle sur ces membranes losqu’ils se
déplacent sur les filaments du cytosquelette. Cette hypothèse nous est apparue la plus simple à
tester in vitro pour plusieurs raisons :
- Il n’avait jamais été montré que l’action seule de moteurs moléculaires tirant sur une
membrane suffisait à former un tube, alors que l’action seule des manteaux par
exemple avait été montrée comme suffisante pour former des bourgeons.
- Un système facilement étudiable par des approches physiques nécessite de travailler
avec des constituants purifiés pour que le maximum de paramètres soient maitrisés. Or
cette hypothèse ne faisant intervenir que trois éléments, les moteurs, le cytosquelette et
les membranes, est l’une des plus simples en nombre de composants, et donc en
nombre de paramètres à maîtriser.
- La plupart des intermédiaires de transports sont sphériques et d’un rayon compris
entre 25 et 50 nm, donc très difficiles à visualiser in vivo et in vitro par des méthodes
de microscopie photonique. Or l’étude des phénomènes de transport nécessite une
étude de la dynamique de formation des intermédiaires de transports, ainsi que de
leurs déplacements, et seule la microscopie photonique peut à l’heure actuelle
permettre cette étude dynamique. Bien que le diamètre des tubes soit à priori très petit
et du même ordre de grandeur que celui des vésicules, leur longueur peut être très
supérieure au micromètre et ils sont donc aisément visualisables in vivo et in vitro en
microscopie photonique.
- C’est une hypothèse intéressante car elle permet de combiner formation et
déplacement des intermédiaires de transports en un seul mécanisme.
- La petite protéine G Rab6a qui est étudiée au laboratoire, est observée in vivo le long
de ces tubes en formation, et en se basant sur l’hypothèse que Rab6a est le récepteur
de Rabkinésine6 à la membrane, on peut supposer que Rabkinésine6 serait impliquée
dans la formation et le déplacement de ces tubes. Encore faut-il montrer que les
moteurs sont capables de former seuls des tubes.
95

III.1 Protocoles et détails techniques
III.1.1 Description du système in vitro
Notre hypothèse était que l’action de moteurs moléculaires fixés à une membrane et
marchant le long de filaments pouvait suffire à étirer des tubes (voir figure 41).
Figure 41 : Hypothèse de fonctionnement d’un système minimal d’extraction de tubes par des kinésines.
Pour réaliser ce système, il nous fallait disposer de membranes dont la composition
soit controlable, de moteurs moléculaires et de filaments. Pour les membranes, nous avons
choisi d’utiliser des vésicules géantes unilamellaires (GUVs), dont la composition est
modifiable, et qui présentent l’avantage d’être énormes (entre 5 et 100 µm de diamètre), donc
facilement observables en microscopie photonique. De plus, elles constituent un réservoir
important de surface membranaire à partir duquel de nombreux tubes peuvent être extraits.
Enfin, ce sont des objets mous dont la physique est bien connue (voir chapitre 2).
Il convenait de trouver également un système simple pour lier les moteurs à la
membrane. Comme la plupart des tubes de membranes observés in vivo dépendent du système
kinésine/microtubule (voir chapitre 1), nous avons cherché un moyen simple de purifier et
fixer un moteur de type kinésine sur les membranes. La tubuline, qui constitue les
microtubules, est aisément purifiable à partir de cerveaux. Pour purifier et fixer la kinésine
aux membranes, nous avons utilisé une kinésine biotinylée, qui peut être fixée sur des lipides
biotinylés par l’intermédiaire de la streptavidine (voir figure 42).
L’équipe de Jeff Gelles au cours des années 90 a développé une construction génétique
particulière de la kinésine conventionnelle de Drosophila Melanogaster [149,150]: une forme
96

tronquée sur la queue (~ 50 kDa) (ne possédant que la partie motrice et un bout du coiled-coil
permettant la dimérisation, et ne possédant pas la partie inhibitrice de la tête (voir 2.1.2.1) a
été fusionnée à la protéine BCCP pour Biotin Carboxyl Carrier Protein (un peu moins de 17
kDa). La protéine BCCP fait partie du complexe de la carboxylase du Coenzyme A
(activation des acides gras en vue de leur dégradation), chez la bacterie Escherichia Coli.
BCCP est une protéine qui lie covalemment et transitoirement un acide gras, qui va être lié au
Coenzyme A. La réaction de liaison est catalysée par la vitamine H ou biotine (244 g/mol),
qui est également covalemment liée à BCCP sur la Lysine (K) 122. Ainsi, la kinésine (~
65kDa) construite par Jeff Gelles est intrinsèquement active en présence d’ATP, car la partie
inhibitrice a été enlevée, et elle est biotinylée grâce à sa fusion avec la protéine BCCP.
La streptavidine est une protéine tétramérique qui possède 4 sites de liaison à la
biotine, orientés deux-à-deux de manière opposée (voir figure 42). Son affinité est de 10 -13
Mol -1 pour la biotine en solution, et à ce jour le couple biotine/streptavidine reste le complexe
ayant la plus haute constante d’association.
Figure 42 : A-Structure de la biotine (à gauche) (D’après www.sigmaaldrich.com) et de la streptavidine (à
droite) complexée à 4 biotines (D’après http://faculty.washington.edu/stenkamp/stefanieweb/abstract.html).
B- Principe de la liaison des kinésines biotinylées à la membrane contenant des lipides biotinylés. Soit des
billes recouvertes de streptavidine, soit de la streptavidine libre peuvent être utilisées pour faire le lien.
97

La kinésine construite par Jeff Gelles peut ainsi être fixée sur tout type de supports
biotinylés, via la streptavidine. François Nédélec et Thomas Surrey, actuellement à l’EMBL,
ont modifié légérement cette kinésine en lui ajoutant une étiquette d’une vingtaine d’acides
aminés spécifiquement reconnue par un anticorps [151,152]. Cette étiquette provenant
l’Hémaglutinine, elle est appelée HA. François Nédélec et Thomas Surrey nous ont fourni
cette nouvelle construction ainsi que le protocole de purification de cette kinésine (voir sous-
chapitre suivant et annexes). De plus, il existe commercialement des
phosphatidyléthanolamines covalemment liées par la tête à la biotine (voir
http://www.avantilipids.com/ProductData.asp?n=870273). En conjuguant la kinésine
biotinylée, la streptavidine et les lipides biotinylés, les constructions présentées sur la figure
42B sont possibles et permettent de lier les kinésines à la membrane. L’utilisation de billes
recouvertes de streptavidine est possible, et à la diférence de la streptavidine libre va
permettre de concentrer ponctuellement les moteurs sur la membrane.
Le principe du protocole est simple. Des microtubules stabilisés au taxol sont fixés sur
une lamelle de verre. Ils forment un réseau 2D aléatoire. La surface est ensuite passivée avec
de la caséine. Un mélange billes streptavidine/kinésines ou streptavidine/kinésines est ensuite
injecté avec de l’ATP, et enfin, des GUVs possédant des lipides biotinylés sont injectées dans
la chambre. Les complexes streptavidine/kinésine ou les billes recouvertes de kinésines se
fixent alors sur les GUVs. En jouant sur la densité du milieu interne des GUVs, il est possible
de les faire sédimenter sur la surface couverte de microtubules. Lorsque les GUVs couvertes
de kinésines touchent les microtubules, les kinésines se mettent en mouvement le long des
microtubules et tirent sur la vésicule jusqu’à former des tubes.
Dans la suite, nous allons donner les principes des protocoles utilisés pour la mise en
place du système minimal. Pour les protocoles établis par d’autres équipes, nous donnerons
seulement le principe et ils seront détaillés en annexe. Nous détaillerons ici seulement les
protocoles développés au laboratoire.
98

III.1.2 Purifications de la kinésine et de la tubuline
III.1.2.1 Principe de la purification de la Kinésine biotinylée.
La construction génétique permettant l’expression de la kinésine conventionnelle de
Drosophila Melanogaster fusionnée à la BCCP a été insérée dans un plasmide permettant son
expression dans la bactérie Escherichia Coli.
La souche d’E. Coli utilisée pour l’expression est la souche BL21, qui a été
génétiquement modifiée pour exprimer l’ARN polymérase du phage T7 (virus des bactéries).
Cette polymérase se lie à une séquence spécifique appelée promoteur T7 en amont du gène, et
permet la production rapide de très nombreux ARNm (on parle de promoteur fort). Le gène de
la kinésine est sous dépendance du promoteur T7 une fois inséré dans le plasmide, ce qui
permet la production en grande quantité de la protéine. Cependant, une autre séquence a été
insérée entre le promoteur T7 et le gène, il s’agit de l’opérateur de l’opéron Lactose (groupe
de gènes intervenant dans le métabolisme du lactose, et subissant les mêmes régulations
génétiques). Cette séquence permet la fixation, en absence de lactose, d’une protéine
inhibitrice de la transcription appelée Répresseur. En absence de lactose, le gène de la
kinésine n’est donc pas transcrit, et la bactérie ne produit pas de kinésine. En présence de
lactose, le lactose se lie au répresseur et empêche sa fixation sur l’opérateur, permettant à la
polymérase T7 de transcrire le gène de la kinésine. Il est donc possible d’induire la production
de la protéine à l’instant voulu en ajoutant du lactose dans le milieu. Au lieu d’utiliser le
lactose pour induire le système d’expression, on utilise l’IPTG (Iso-Propyl-Thio-Galactoside)
qui est un inducteur plus puissant que le lactose et non dégradable par la bactérie. Dans notre
cas, l’induction se fait à une concentration faible en IPTG (0,1 mM), et à une température
faible (27°C), permettant une faible expression de la kinésine. La kinésine est mal acceptée
par les bactéries, et une surexpression tue les bactéries ou les forcent à agglomérer la kinésine
en amas semi-cristallin (corps d’inclusions), la rendant non-fonctionnelle. Au cours de la
production de la kinésine, les enzymes bactériennes vont fixer la biotine sur la partie BCCP
de la protéine chimère, rendant la kinésine biotinylée. Il a été estimé que 60 à 80 % des
kinésines produites étaient biotinylées.
Une fois la protéine produite par les bactéries, les bactéries sont lysées et le lysat
cellulaire (liquide débarrassé des fragments cellulaires par centrifugation) contenant toutes les
protéines solubles dont la kinésine est récupéré. Trois colonnes sont nécessaires pour purifier
99

la protéine. Le premier type de colonne sert à changer la solution saline contenant les
protéines du lysat. Le principe est l’exclusion de taille, la colonne retenant les grosses
molécules (protéines), les sels sont éliminés et remplacés par une solution adéquate pour la
deuxième colonne.
La deuxième colonne est une colonne d’affinité. Elle lie spécifiquement la protéine à
purifier. Les autres protéines sont éliminées par lavages successifs. Ici, la colonne est
constituée de billes recouvertes d’avidine, liant les protéines biotinylées, donc principalement
la kinésine. En fait, ce n’est pas l’avidine (équivalente à la streptavidine) qui est utilisée, car
sa haute affinité pour la biotine ne permet pas l’élution de la protéine biotinylée par
compétition par de la biotine libre. C’est un mutant d’affinité réduite, qui peut être
compétitionné par 5 mM de biotine libre. C’est l’étape limitante, car la colonne lie peu de
protéines, et l’élution nécessite un grand volume, diluant beaucoup la protéine.
Une fois la kinésine biotinylée purifiée sur cette colonne, il faut la reconcentrer. Une
colonne échangeuse d’ions est utilisée, qui lie les protéines en fonction de leur charge. La
colonne est éluée avec un gradient croissant de sels qui compétitionnent l’interaction
protéine/colonne, décrochant la protéine pour une certaine concentration saline. Toute la
kinésine se décroche à la fois, se concentrant dans un volume environ 10 fois plus petit que le
volume d’élution.
La protéine est alors dialysée dans un tampon nécessaire à sa conservation, puis
congelée et conservée dans l’azote liquide. Pour deux litres de culture bactérienne, environ
300 µg de protéines sont obtenus, à une concentration typique de 100 à 200 µg/mL (environ 1
µM).
III.1.2.2 Purification de la tubuline
Le principe de la purification de la tubuline est simple. Cette protéine polymérisant en
microtubules qui sont séparables du reste de la solution par centrifugation, des cycles de
polymérisation/dépolymérisation permettent d’enrichir la solution en tubuline.
Des cerveaux de porcs fraichement prélevés sont utilisés car très riches en tubuline
(composant majeur des axones). Après broyage et centrifugation, le lysat subit des cycles de
polymérisation (présence de GTP, 35°C), dépolymérisation (absence de GTP, 4°C). Après
polymérisation et centrifugation, le culot de microtubules est conservé, le surnageant éliminé.
Après dépolymérisation et centrifugation, c’est l’inverse, le culot est éliminé et le surnageant
100

conservé. Ainsi, après trois à quatre cycles, la solution est très fortement enrichie en tubuline.
Mais la solution contient également toutes les protéines se liant aux microtubules (MAPs
pour Microtubules Associated Proteins). Pour les éliminer et avoir de la tubuline pure, on tire
avantage du fait que la tubuline est fortement chargée négativement. La solution contenant la
tubuline et les MAPs est passée sur une colonne échangeuse d’anions (chargée négativement)
et la seule protéine à ne pas se fixer est la tubuline. En sortie de colonne, on récupère de la
tubuline pure. A partir de 6 cerveaux de porcs, il est possible de purifier 60 mg de tubuline, à
plusieurs mg/mL. Il est également possible d’éluer la colonne (après passage de la tubuline)
par un gradient de sels et de récupérer ainsi les MAPs, environ 10 mg à 1 mg/mL.
III.1.3 Vésicules Géantes et membranes Golgiennes
III.1.3.1 Electroformation de vésicules géantes
La technique utilisée au laboratoire pour former des vésicules géantes unilamellaires
(GUVs) est la technique d’electroformation. Développée dans les années 90 par Miglena
Angelova [153], cette technique consiste à étaler une solution de lipides en chloroforme sur
une lame de verre ITO (Indium Titane Oxide), et assécher le dépôt dans une enceinte à vide
au moins 2 heures. Le verre ITO est du verre recouvert d’une fine couche (100 nm) d’Oxide
d’Indium Titane (ITO) conductrice. En déposant les lipides sur cette couche, et une fois le
dépôt sec, il est possible de construire une chambre en mettant face à face deux lames ITO
couvertes de lipides, séparées par deux espaceurs de téflon autocollant (environ 1 mm) et
deux électrodes de cuivre autocollant (Radiospare) en contact avec l’ITO. En scellant la
chambre avec de la pâte à sceller, et en placant une solution de sucrose entre les deux lames,
maintenues par la pâte à sceller, il est possible d’appliquer un champ électrique entre les deux
surfaces couvertes de lipides, par l’intermédiaire des électrodes. Le champ électrique déforme
le film hydraté de lipides en « voiles » puis en vésicules géantes de 5 à 100 µm. On utilise en
fait une rampe de tension sinusoïdale, commençant à 20 mV de tension efficace, et finissant à
1,1 V. La rampe fonctionne par paliers de 5 minutes (voir figure 43), puis le champs est laissé
à 1,1 volts pendant 2h30. C’est l’étape de formation des vésicules. Enfin, on applique une
tension carrée de 1,5 V pendant 30 minutes permettant de séparer les vésicules formées du
reste du dépôt lipidique.
101

Figure 43 : Rampe de tension permettant la croissance puis le décollement de vésicules géantes.
La solution dans laquelle poussent les vésicules ne doit pas être saline, car les ions écrantent
le champ électrique et diminue l’efficacité de pousse des vésicules. Les vésicules sont donc
électroformées dans une solution de sucrose (non ionique) dont la pression osmotique est
ajustée à celle de la solution saline dans laquelle les vésicules seront transférées pour
observation (mesures effectuées avec un osmomètre). Typiquement, les solutions salines
utilisées sont de l’ordre de 190 mOsm, ce qui correspond à environ 150 mM de sucrose.
Le fait d’augmenter la concentration en sucrose nécessite de réduire la fréquence de
pousse du champs électrique sinusoïdal, car la viscosité du milieu augmente légèrement.
Normalement de 20 Hz pour les vésicules poussant dans des solutions peu concentrées (voir
figure 43), nous avons utilisé une fréquence de 10 Hz pour des pressions osmotiques de
l’ordre de 190 mOsm. Pour la tension carrée, la fréquence reste de 4 Hz quelque soit la
concentration en sucrose de la solution de pousse.
Les protocoles détaillés par la suite seront donnés en anglais, de façon à être accessibles à
tous.
III.1.3.2 Purification et biotinylation de membranes Golgiennes.
Les membranes golgiennes sont purifiées selon une méthode classique par gradient discontinu
de sucrose ([154], voir annexe). Une fraction fortement enrichie en membranes de l’appareil
de Golgi peut-être obtenue à partir de foies de rat, car les hépatocytes ont un Golgi abondant.
102

Pour cela, les foies fraîchement prélevés sont écrasés sur un tamis fin (160 µm de
maille), puis le lysat est déposé sur un gradient discontinu de Sucrose. Après ultra-
centrifugation, les organites ayant des densités différentes se répartissent à des interfaces
différentes. L’une d’elle est fortement enrichie en membranes de l’appareil de Golgi.
L’interface est prélevée, et les membranes sont lavées plusieurs fois par centrifugation. On
obtient typiquement des membranes de Golgi enrichies 120 fois, à la concentration protéique
de 1,5 mg/mL.
Pour fixer nos moteurs moléculaires sur les membranes Golgiennes, il a fallu les
biotinyler. Pour cela, nous avons établi un protocole proche des biotinylations de membranes
plasmiques, mais aboutissant à une biotinylation plus ménagée, conservant mieux les
structures. Voir ci-après :
BIOTINYLATION OF PURIFIED GOLGI MEMBRANES
For 50 µL of Rat Golgi membranes (1.55 mg/mL)
1) Add 950 µL PBS to the 50 µL of RG
2) Make a cushion by dribbling 10 µL of a 1,3 M sucrose PBS solution down
the side of the tube
3) Spin 30’ at 4°C 15300 rpm in an eppendorf centrifuge
4) Resuspend the pellet in 600 µL of 0,1 mg/mL Biotin-NHS in PBS.
5) Incubate on ice from 5’ to 30’
6) Stop the reaction with 720 µL of 20 mM Glycine in PBS (44 mg for 30
mL)
7) Spin on a sucrose cushion as before.
8) Wash two times the pellet with IMI sucrose buffer
9) Resuspend the pellet in 50 µL of IMI sucrose buffer
IMI Sucrose Buffer:
For 50 mL
Sucrose 2.56 g
Imidazole 1M 2,5 mL
NaCl 5M 500 µL
MgCl2 1M 50 µL
EGTA 0,5M 200 µL
Water qsp 50 mL
103

III.1.4 Protocoles pour la formation de tubes de membrane
par des moteurs moléculaires
III.1.4.1 Protocoles avec billes pour l’extraction de tubes à partir de
GUVs ou de membranes biotinylées de Golgi.
Ce protocole à d’abord été établi pour des GUVs, puis adapté pour les membranes de Golgi.
C’est un protocole qui utilise des billes de 100 nm en polystyrène et recouvertes de
streptavidine (Bangs Lab, USA), pour fixer les kinésines sur la membrane. Il permet la
formation de tubes à partir de tout type de membranes biotinylées que nous avons testés. La
densité moyenne des moteurs dans nos conditions est d’environ 1500 moteurs par bille.
MAKING TUBES WITH GUVs AND BIOTINYLATED KINESIN
Washing process of coverslipes
1) Put coverslips in Decon 90 (detergent), 2% in distilled water. Heat until boiling.
2) Sonicate in a coverslip sonicator for 5 min.
3) Rince 5 times in distilled water. Heat until boiling in the last wash.
4) Sonicate for 5 min.
5) Rince the coverslips 2 times in 95-96 % ethanol.
6) Store the coverslips at 4°C in 95-96% ethanol.
Building the chamber
7) Dry a coverslip under a N2 flux.
8) Incubated the coverslip on a drop of 10 times diluted poly-L-lysin (0,1% w/v,
SIGMA) for 5’-10’ on a piece of parafilm in a wet chamber.
9) Rince the coverslip with Milli-Q water. Dry it with N2 flux.
10) Build the chamber as described.
104

Ethanol/water washed
slide
Coverslip
parafilm
11) Heat the chamber on a heater (temperature between 100-150°C) until the parafilm
melts and sticks the coverglass to the slide (press the coverslip onto the parafilm using
metal tweezers). Take the chamber off the heater and let the temperature decrease until
the parafilm starts to solidify again. Then cut with a scalpel the non-used parafilm.
12) Dilute the Microtubules 6 to 10 times in MB buffer. Final volume needed ~ 35 µL.
Then inject the MTs into the chamber. 5’ incubation.
13) Rince the chamber with 50 µL of IMI buffer (inject at one side, suck out by the other
using filter paper).
14) Inject 50 µL of 5-10 mg/mL Casein (purified from bovine milk, SIGMA) diluted in
IMI buffer. Incubation 10’.
Streptavidin Beads preparation (Streptavidin coated Microspheres 100 nm
diameter, Bangs laboratories, Inc.)
1) Mix 5 µL of Strep Beads with 2.5 µL of 5-10 mg/mL Casein diluted in IMI in a 0.5
mL eppendorf to passivate the beads.
2) Sonicate the tube for 5’ in ice in a slide-sonicator to break bead aggregates.
3) Add 30 µL of IMI buffer.
4) Mix 1 µL of the diluted beads with 5 µL of 1µM Biotinated Kinesin.
5) Incubate the tube for 10’ in ice.
Tube Assay
IMI Buffer:
1) Rince the chamber with 50 µL of MB buffer.
2) Dilute the prepared beads with 44 µL of MB buffer and inject them into the
chamber
3) Inject 2-5 µL of vesicles from the preparation chamber using a capillary mounted
on a cone. Let the vesicles go through the chamber by gravity flow.
50 mM IMIDAZOLE pH 6.7
50 mM NaCl
1 mM MgCl2
2 mM EGTA
105

MB Buffer:
Same as IMI Buffer plus 1 mM ATP, 10 µM TAXOL.
Le protocole pour tirer des tubes de membranes à partir de membranes Golgiennes a été
légèrement modifié par rapport aux GUVs. Il a fallu notamment ajouter du sucrose dans le
tampon IMI pour équilibrer les pressions osmotiques à l’intérieur et à l’extérieur des
membranes Golgiennes. Il a fallu aussi réduire l’épaisseur de la chambre car les membranes
étaient plus longues à sédimenter. Enfin, il a fallu multiplier par deux la quantité de kinésines
par billes, pour obtenir un nombre de tubes équivalent aux expériences avec les GUVs.
MAKING TUBES WITH GOLGI PURIFIED MEMBRANES AND BIOTINATED
KINESIN
Wash coverslips as described previously
Building the chamber
1) Dry a coverslip under a N2 flux.
2) Incubated the coverslip on a drop of 10 times diluted poly-L-lysin for 5’-10’ in a wet
chamber.
3) Rince the coverslip with Milli-Q water. Dry it with N2 flux.
4) Build the chamber as describe.
Ethanol/water washed
slide
Coverslip
parafilm
5) Heat the chamber on a heater (temperature between 100-150°C) until the parafilm
melts and sticks the coverslip to the slide (press the coverslip onto the parafilm using
106

metal pliers). Take the chamber off the heater and let the temperature decrease until
the parafilm starts to solidify again. Then cut with a scalpel the non-used parafilm.
6) Dilute the Microtubules 5 to 10 times in MB buffer. Final volume needed ~ 10 µL.
Then inject the MTs into the chamber. 5’ incubation.
7) Rince the chamber with 20 uL of IMI Sucrose buffer (inject at one side, suck out by
the other using filter paper).
8) Inject 20 µL of 5-10 mg/mL Casein diluted in IMI buffer. Incubation 15’.
Streptavidin Beads preparation (Streptavidin coated Microspheres 100 nm
diameter, Bangs laboratories, Inc.)
1) Mix 5 µL of Strep Beads with 2.5 µL of 5-10 mg/mL Casein diluted in IMI in a 0.5
mL eppendorf.
2) Sonicate the tube for 5’ in ice in a slide-sonicator.
3) Add 30 µL of IMI Sucrose buffer.
4) Mix 1 µL of the diluted beads with 10 µL of 1µM Biotinated Kinesin.
5) Incubate the tube for 10’ on ice (while casein is incubating in the chamber).
Tube Assay
6) Mix 1 µL of enriched Golgi Biotinylated membranes (~ 1 mg/mL prot) with kinesin
coated beads. Wait for a few minutes.
7) Rince the chamber with 25 µL of MB buffer.
8) Dilute the prepared beads with 25 µL of MB buffer and inject them into the chamber
IMI Sucrose Buffer:
50 mM IMIDAZOLE pH 6.7
150 mM Sucrose
50 mM NaCl
1 mM MgCl2
2 mM EGTA
MB Buffer:
Same as IMI Sucrose Buffer plus 1 mM ATP, 10 µM TAXOL.
Nous avons ensuite développé un protocole permettant de fixer les kinésines aux membranes
grâce à la streptavidine seule. La difficulté a été de faire en sorte de réaliser un complexe lié à
la membrane d’un côté, et lié aux kinésines de l’autre. En mélangeant simplement la kinésine
et la streptavidine, la majorité des complexes formés auraient été de type kinésine-
streptavidine-kinésine. Pour éviter cela, nous avons utilisé le fait qu’en absence d’ATP, les
kinésines restent fortement liées aux Microtubules. Ainsi, en injectant les moteurs après
fixation des microtubules, puis en lavant la chambre et en injectant de la streptavidine
107

fluorescente, il est possible de visualiser les microtubules fluorescents (voir article 1). En
injectant de l’ATP et des vésicules, on constate que la fluorescence passe progressivement en
solution (les moteurs se détachent des microtubules) puis aux membranes. En suivant le
transfert de la fluorescence, on suit le transfert des moteurs des microtubules vers les
membranes, et on est sûr d’avoir réaliser le complexe membrane-streptavidine-kinésines. Ce
protocole a été aussi utilisé avec des membranes d’appareil de Golgi biotinylées, en respectant
les même différences qu’entre le protocole avec billes pour GUVs et pour Golgi.
COATING VESICLES WITH KINESINS USING STREPTAVIDIN
Washing process of coverslips
1) Put coverslips in Decon 90 (detergent), 2% in distilled water. Heat until boiling.
2) Sonicate in a coverslips sonicator for 5 min.
3) Rince 5 times in distilled water. Heat until boiling in the last wash.
4) Sonicate for 5 min.
5) Rince the coverslipes 2 times in 95-96 % ethanol.
6) Store the coverslipes at 4°C in 95-96% ethanol.
Building the chamber
1) Dry a coverslip under a N2 flux.
2) Incubated the coverglass on a drop of 10 times diluted poly-L-lysin for 5’-10’ in a wet
chamber.
3) Rince the coverslip with Mq water. Dry it with N2 flux.
4) Build the chamber as describe.
Ethanol/water washed
slide
Coverslip
parafilm
5) Heat the chamber on a becher heater (temperature between 100-150°C) until the
parafilm melts and stucks the coverslip to the slide (press the coverslip onto the
parafilm using metal tweezers). Take the chamber off the heater and let the
temperature decrease until the parafilm starts to solidify again. Then cut with a scalpel
the non-used parafilm.
6) Dilute the Microtubules 5 to 10 times in MB buffer. Final volume needed ~ 35 µL.
Then inject the MTs into the chamber. 5’ incubation.
108

7) Rince the chamber with 50 uL of IMI buffer (inject at one side, suck out by the other
using filter paper).
8) Inject 50 µL of 5-10 mg/mL Casein diluted in IMI buffer. Incubation 10’.
Coating the vesicles with kinesins
1) Wash the chamber with 50 µL of 1 µM biotinated Kinesin diluted 5 times in 10
mg/mL Casein (10 µL of kinesin mixed with 40 µL of Casein in IMI buffer).
2) Incubate the chamber 5-10’ RT.
3) Wash the chamber once with 50 µL IMI buffer.
4) Wash the chamber once with 50 µL 0,1 mg/mL Streptavidin in 5 mg/mL Casein. Wait
for 1 min.
5) Quickly wash the chamber 3 times with 10 µM Taxol IMI buffer
6) Wash the chamber once with 20 µl of MB buffer.
7) Inject 2 to 5 µL of vesicles
8) Wait until the vesicles bind to the surface (10-15’)
III.1.4.2 Protocole adapté pour la microscopie électronique.
Pour pouvoir faire une étude de la taille des tubes et de la structure du réseau en microscopie
électronique, il a fallu procéder à un grand nombre de changements dans la conception de la
chambre d’observation, pour permettre notamment d’y introduire les grilles de microscopie et
réaliser l’expérience sur le collodion recouvrant les grilles de microscopie. La méthode de
coloration retenue a été la coloration négative par acétate d’uranyle 1%. Il a fallu remplacer la
caséine, qui permet d’éviter l’adsorption non spécifique, par de la bacitracine (petit peptide
antibiotique) car la coloration était de mauvaise qualité en présence de caséine. Voici ce
protocole.
109

TRANSMISSION ELECTRONIC MICROSCOPY PREP FOR TUBE ASSAY
1) wash coverslips as described in the tube assay protocol
2) prepare a setup as represented below
Whatman filter
Bunzen grid
Water evacuation system
water
3) prepare under water one coverslip and 4 TEM grids (Copper/Nickel mesh size 300
µm) as described below using TEM tweezers:
Whatman filter
Cover slide
TEM grid
4) Deposit 2 drops of collodion solution on the water surface and let it polymerise
(1min). Then flush the water out using the water evacuation system until the collodion
film covers the grids/coverslip/whatman.
5) Gently move the grids/cover slide/whatman/collodion to a glass petridish and dry it in
an oven at 60°C (apprx. 10 min).
6) Treat the dried cover slide with poly-L-lysine (SIGMA) as described for the tube assay
above (treat just the side covered with grids & collodion). Carefully (the collodion
film sometimes torns up !) wash with MQ water and dry under N2 flux.
110

7) Build the following chamber:
Spacers of parafilm : 1-2mm
wide, 2 layers thick, separated
by 5 mm. Stick the spacers onto
the slide by melting them on a
heater. Wait until it solidifies
Parafilm spacers
Vacuum grease : note that the grease is there
for maintaining everything together, but still
the chamber can be buit down after the assay.
8) perform the assay as described in the tube assay protocol.
9) Check under microscope that the assay works.
Coverslip with collodion
coated grids. Be careful
of placing the grids inside
the chamber
Vacuum grease
Press carefully until the coverslip
touches the spacers
10) Wash the chamber once with 1% w/v uranyl acetate in water, aspirate the remaining
solution out the chamber (dry out the chamber) with a Whatman filter.
11) Disassemble the chamber by removing carefully the cover slide, and remove the grids
one by one, eliminating the remaining uranyl acetate with a whatman filter.
12) Carbonise the grids before observation under the electron microscope.
111

III.2 Résumé de l’article N°1 : ROUX et coll . Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., 16 avril 2002: 99 (8): 5394-9. A
minimal system allowing tubulation with Molecular
Motors pulling on Giant Liposomes.
Le but principal de cet article a été de montrer qu’il était possible, en fixant des moteurs
moléculaires sur une vésicule géante, de permettre la formation de tubes de membranes tirés
le long de microtubules. Ainsi, la simple force exercée sur la membrane par des moteurs
moléculaires est suffisante pour la déformer en tube.
En utilisant le protocole avec billes précédemment présenté, nous avons pu observé la
formation de réseaux de tubes à partir de vésicules géantes (voir figure 44). Ce processus se
divise en deux phases : durant les premières minutes de croissance, de nombreux tubes
poussent en même temps, et à une vitesse équivalente à celle des billes libres. Pour des temps
longs, les tubes poussent plus lentement, et sont moins nombreux à pousser. Surtout, leur
croissance est beaucoup plus fluctuante que dans la première phase, avec des fluctuations
importantes de la vitesse instantanée, et de nombreux temps d’arrêts. L’hypothèse pour
expliquer ces observations est que l’extraction de nombreux tubes provoque l’augmentation
de la tension de la membrane, ce qui augmente alors la force nécessaire pour tirer les tubes. A
partir d’une force seuil, le réseau ne croît plus (voir figure 44).
La simplicité de ce système nous a aussi permis de dégager quelques explications
physiques et la structure du réseau formé. En utilisant le protocole sans billes, nous n’avons
pas obtenu de tubes, tout en vérifiant que les moteurs étaient bien fixés sur la membrane.
Nous en avons conclu qu’il était nécessaire de concentrer (via les billes) les forces exercées
par plusieurs moteurs en un point précis de la membrane pour pouvoir former des tubes. En
effet, comme nous l’avons vu dans le chapitre précédent, la force nécessaire pour tirer un tube
est de l’ordre d’une à plusieurs dizaines de pN et nécessite donc plusieurs moteurs. Nous
reviendrons sur ce point dans la discussion.
113

Figure 44 : Croissance d’un réseau de tube à partir d’une vésicule géante. Durée 15 min, une photo par
minute. Le plan d’observation correspond à la surface de la lamelle de verre où sont collés les microtubules.
La vésicule apparaît sphérique, hors du plan focal. Dès qu’elle entre en contact avec la surface de
microtubules, une multitude de tubes se mettent à pousser sur la surface le long des microtubules. Au bout
de 6 à 7 minutes, le réseau atteint son extension maximale, même si quelques tubes continuent à pousser
durant les minutes suivantes. Barre 10 µm.
La structure du réseau formé est quant-à-elle surprenante : nous avons pu montrer par
microscopie électronique et par analyse en fluorescence que le réseau était composé de tubes
uniques mais également de faisceaux de tubes, tous de même diamètre. Or comme nous
l’avons vu au chapitre précédent, les tubes extraits de la même vésicule devraient collapser
par leur base pour des raisons énergétiques. Nous ne pouvons pas à l’heure actuelle avancer
des explications certaines expliquant que dans le cas des réseaux formés par des moteurs, il
puisse y avoir des faisceaux de tubes, mais nous avons cependant émis plusieurs hypothèses.
La première est que des tubes émanant d’endroits différents de la vésicule peuvent se
rejoindre sur le réseau à des distances lointaines de la vésicule, empêchant leur collapse, car
leur bases sont trop éloignées. La deuxième est que deux tubes émanant du même endroit et
poussant sur le même microtubule, mais qui y sont attachés en des points différents ne
pourront pas collapser (voir figure 5b de l’article). Ceci nécessite des interactions entre les
tubes et soit la surface, soit les microtubules.
114

En conclusion, cet article montre qu’il est possible de reproduire in vitro l’étape de
formation et déplacement de tubes de membranes avec des éléments purifiés. Cette démarche,
qui consiste à reproduire in vitro un phénomène observé in vivo, permet une étude plus
approfondie des caractéristiques physiques de systèmes sub-cellulaires. D’autres exemples de
systèmes biomimétiques plus avancés au laboratoire ont déjà permis de modéliser et
d’expliquer le déplacement des bactéries dans les cellules [155]. Le but étant à terme de
montrer qu’une pression de sélection s’est exercée sur ces systèmes pour leur conférer des
propriétés physiques particulières adaptées à leur fonction.
115

III.3 Article N°1
117

A minimal system allowing tubulation with molecular
motors pulling on giant liposomes
Aurélien Roux* † , Giovanni Cappello † , Jean Cartaud ‡ , Jacques Prost † , Bruno Goud* § , and Patricia Bassereau †§
*Laboratoire Mécanismes Moléculaires du Transport Intracellulaire, Unité Mixte de Recherche 144 Centre National de la Recherche ScientifiqueInstitut
Curie, 26 Rue d’Ulm, 75248 Paris Cedex 05, France; † Laboratoire Physico-Chimie Curie, Unité Mixte de Recherche 168 Centre National de la Recherche
ScientifiqueInstitut Curie, 26 Rue d’Ulm, 75248 Paris Cedex 05, France; and ‡ Laboratoire de Biologie Cellulaire des Membranes, Institut Jacques Monod,
Unité Mixte de Recherche 7592 Centre National de la Recherche ScientifiqueUniversités Paris 6 et 7, 2 Place Jussieu, 75251 Paris Cedex 05, France
Communicated by Pierre-Gilles de Gennes, Ecole Superiéure de Physique et Chimie Industrielles, Paris, France, February 22, 2002 (received for review
November 6, 2001)
The elucidation of physical and molecular mechanisms by which a
membrane tube is generated from a membrane reservoir is central
to the understanding of the structure and dynamics of intracellular
organelles and of transport intermediates in eukaryotic cells.
Compelling evidence exists that molecular motors of the dynein
and kinesin families are involved in the tubulation of organelles.
Here, we show that lipid giant unilamellar vesicles (GUVs), to which
kinesin molecules have been attached by means of small polystyrene
beads, give rise to membrane tubes and to complex tubular
networks when incubated in vitro with microtubules and ATP.
Similar tubes and networks are obtained with GUVs made of
purified Golgi lipids, as well as with Golgi membranes. No tube
formation was observed when kinesins were directly bound to the
GUV membrane, suggesting that it is critical to distribute the load
on both lipids and motors by means of beads. A kinetic analysis
shows that network growth occurs in two phases: a phase in which
membrane-bound beads move at the same velocity than free
beads, followed by a phase in which the tube growth rate decreases
and strongly fluctuates. Our work demonstrates that the
action of motors bound to a lipid bilayer is sufficient to generate
membrane tubes and opens the way to well controlled experiments
aimed at the understanding of basic mechanisms in intracellular
transport.
Biological membranes, such as the endoplasmic reticulum
(ER), the Golgi apparatus, and endosomes, form elaborate
and highly dynamic tubular networks (1, 2). Recently, microscopy
of living cells has illustrated that membrane tubes also
participate in transport events between cellular compartments.
For instance, long-range tubular transport intermediates have
been observed between Golgi and ER and between Golgi and
the plasma membrane, challenging the classical notion of small
spherical vesicles as the sole transport intermediates (3–8).
The formation and movement of membrane tubes in animal
cells is thought to involve an interaction of the membranes with
the cytoskeleton, especially the microtubule network (9). Numerous
experiments, in vitro and in vivo, suggest a direct role of
microtubules in the formation of the endoplasmic reticulum and
Golgi membrane networks (9–11). Microtubule-dependent tubulation
of Golgi and endosomal membranes is amplified after
the treatment of cultured cells with the fungal metabolite
brefeldin A (BFA) (12, 13). The interactions of membranes with
microtubules are mediated by several classes of proteins, notably
motor proteins of the dynein and kinesin families (14). The
involvement of these motors in the movement of various organelles,
including transport intermediates and cellular structures,
along microtubules is now well established. Their role in
the formation of membrane tubes is less clear, but it has been
reported that BFA-induced tubulation of Golgi membranes
requires both in vivo and in vitro microtubule-based motor
activity (11, 15). It should be pointed out that several proteins
involved in membrane fission events, such as endophilin, amphiphysin,
and the GTPase dynamin, have been shown to induce
the formation of tubules from liposomes in vitro (16–18). These
proteins can directly bind to membranes by means of lipid
binding domains. Whether these proteins are necessary for
allowing motors to pull tubes in vivo is however still unclear.
Membrane tubes can also be pulled out from membranes of
controlled lipid composition by hydrodynamic flow (19) and by
direct manipulation, using either micropipettes (20, 21) or
optical tweezers (22). These systems have been useful in understanding
the physics of membrane tube formation (19, 20, 23,
24). However, the growth rates of the membrane tubes in these
systems are in the range of a few tens to a few hundred
micrometers per second, values that are significantly higher than
the growth rates of tubes generated by motor proteins pulling on
biological membranes in vivo [in the range of 1–2 ms (5–8)].
This rate of in vivo membrane movement corresponds well to the
rates of in vitro motility of kinesin motors (the fastest—
Neurospora kinesin—has a velocity value of about 2.6 ms; see
ref. 25).
The goal of this study was to determine whether binding a
motor protein to a lipid bilayer would be sufficient to generate
membrane tubes. We show that a lipid reservoir, kinesin-coated
beads, microtubules, and ATP provide a minimal system for
generating tubular structures that resemble tubes observed in
vitro with complex biological membranes (9–11).
Materials and Methods
Reagents. Egg phosphatidylcholine (EPC), cholesterol, and
N-biotinyl-dioleyl-phosphoethanolamine (Biot-DOPE) were
purchased from Avanti Polar Lipids. -BODIPY 530550
C5-hexadecanoyl phosphatidylcholine, -BODIPY 581591 C5hexadecanoyl
phosphatidylcholine, cholesteryl BODIPY 542563
C11, and cholesteryl BODIPY Fl C12 were obtained from Molecular
Probes. All chemicals were purchased from Sigma Aldrich except
ATP, GTP, and adenosine 5[,-imido]triphosphate (AMP-PNP),
which were purchased from Roche Molecular Biochemicals.
Streptavidin beads (100 nm) were purchased from Bangs Laboratories
(Carmel, IN). Biotinylated hemagglutinin-kinesin (a gift of F.
Nédélec, European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg)
was purified as described (26). By dividing the number of kinesins
by the number of beads, the number of kinesin molecules per bead
was estimated at approximately 1,500.
Giant Unilamellar Vesicles (GUVs). GUVs were prepared by the
electroformation technique (27). Rat liver Golgi membranes
were purified according to a standard procedure (28). Golgi
lipids were then prepared as described (29).
Abbreviations: GUV, giant unilamellar vesicle; EPC, egg phosphatidylcholine; IMI, imidazole;
DIC, differential interference contrast.
§ B.G. and P.B. contributed equally to this work.
To whom reprint requests should be addressed. E-mail: bruno.goud@curie.fr or
patricia.bassereau@curie.fr.
The publication costs of this article were defrayed in part by page charge payment. This
article must therefore be hereby marked “advertisement” in accordance with 18 U.S.C.
§1734 solely to indicate this fact.
5394–5399 PNAS April 16, 2002 vol. 99 no. 8 www.pnas.orgcgidoi10.1073pnas.082107299

Assay for Tube Formation. Coverslips were washed for 5 min in
sulfochromic acid, rinsed 4–6 times in milliQ water, once in 95%
ethanol, and stored at 4°C in ethanol. A coverslip was then dried
under a nitrogen flux and incubated for 1 to 2 min in a
poly(L-lysine) solution (0.01% wtvol). A flow chamber was
built by intercalating two sheets of parafilm between this poly(Llysine)-coated
coverslip and a clean slide. The chamber was
finalized by heating the stack for a few seconds at 100–150°C on
a heater plate. Its volume was approximately 25 l. Diluted
microtubules in IMI buffer (50 mM imidazole, pH 6.750 mM
NaCl2 mM EGTA1 mM MgCl2) were injected into the
chamber and incubated for a few minutes. The chamber was
rinsed with 50 l of IMI buffer and rinsed with 50 lof5mgml
casein diluted in IMI buffer. After a 15-min incubation, the
chamber was rinsed with 50 l of MB buffer (IMI buffer plus 1
mM ATP and 10 M Taxol). Streptavidin beads (5 l) mixed
with 2.5 l of5mgml casein were sonicated for 15 min on ice.
IMI buffer (30 l) was added to the beads, and 1 l of this
mixture was mixed and incubated for a few minutes with 5 l of
1 M biotinylated kinesins. Then, 44 l of MB buffer was added
to the kinesin-coated beads, and the chamber was filled with this
mixture. GUVs (1–5 l) were injected into the chamber and
allowed to sediment on the coated coverslip.
A similar assay was used for biotinylated Golgi membranes
except that a smaller chamber volume (12 l) and twice as many
kinesins per bead were used for pulling out tubes.
Tube Imaging. Tubes were visualized by fluorescence confocal
microscopy, differential interference contrast (DIC) microscopy,
and reflection interference contrast microscopy (RICM) (30).
The fluorescence intensity profiles of tubes were measured on
digital confocal images. The maximum was taken as the value of
the fluorescence intensity of one tube. To avoid any saturation
or nonlinear effect, highly fluorescent tubes were omitted. On
each network of tubes, all intensity values were normalized by
dividing by the smallest intensity value. This operation was
repeated on many images to obtain an accurate estimation of the
fluorescence distribution.
Electron Microscopy. We built a chamber made of four 300-m
mesh grids aligned in the middle of a coverslip, covered with a
collodion film, and dried at 60°C. The coverslip was incubated
for 1 min with poly(L-lysine), washed in water, and dried under
a nitrogen flux. A slide was then prepared with 2 spacers made
of 2 parafilm layers each and fixed by melting with a heater. After
solidification of the spacers, the coverslip was assembled on
them, keeping the grids aligned between the spacers and fixed
with vacuum grease. The assay was then performed as described
above. To avoid nonspecific adsorption onto the glass, 10 gml
of bacitracin in IMI buffer was used instead of casein. Negative
staining was achieved by rinsing the chamber with 100 l of1%
(wtvol) uranyl acetate in water and drying with a Whatman
filter paper. The chamber was opened, and the grids were
removed from the coverslip. Carbon was then evaporated onto
the grids. Grids were observed in a Philips (Eindhoven, The
Netherlands) EM 12 electron microscope fitted with a LaB 6
filament and operating at 80 kV. Micrographs were taken on
Kodak electron microscope films.
Results
Biotinylated kinesins (consisting of the motor domain of Drosophila
melanogaster kinesin) were attached to the membrane of
biotinylated GUVs (diameter ranging from 5 to 50 m) by means
of 100-nm polystyrene beads coated with streptavidin. The assay
was first developed by using lipid bilayers consisting of 95% EPC
and 5% biotinylated dioleyl-phosphoethanolamine (Biot-
DOPE). GUVs and the kinesin-coated beads were injected into
a chamber coated with Taxol-polymerized microtubules, and the
chamber was filled with a buffer containing 1 mM ATP. Approximately
10 min after injection, membrane tubes started to
form (Fig. 1 a and b). Once generated, tubes continued to grow
along the microtubules. Side branching events at the intersections
of the underlying microtubule network were subsequently
observed (Fig. 1 a and b), leading to the formation of a network
of membrane tubes (Fig. 2a) often extending over 50 m from
the GUVs. No tubes were observed in the absence of either
kinesin molecules or ATP (data not shown), indicating that tubes
form through the action of kinesin. Fig. 1c illustrates a tube with
two beads at its tip, with additional beads distributed along the
tube. The beads are in fact required for tube formation, as
demonstrated in the following way. To allow direct binding of
kinesin to the membrane, we exploited the fact that kinesins are
not released from microtubules in the absence of ATP (Fig. 1d
Left). Kinesins and fluorescent Cy3-labeled streptavidin were
sequentially injected into the chamber in the absence of ATP,
leading to the formation of streptavidinkinesin complexes
bound to microtubules. After injection of GUVs and ATP,
kinesins detached from microtubules and bound to the lipid
bilayer, as demonstrated by the transfer of fluorescence from
microtubules to the GUVs (Fig. 1d Center). Under these conditions,
no tubes were observed up to 1hafterinjection (Fig. 1d
Right). By reducing 100-fold the amount of biotinylated lipids
incorporated in the bilayer, we were able to show that the
absence of tube formation was not because of a high membrane
rigidity resulting from dense streptavidin grafting. On the other
hand, tubes could be formed from these GUVs when kinesincoated
beads were added (data not shown).
Membrane tubes can be readily observed by confocal fluorescence
microscopy if fluorescent lipids are incorporated into
the vesicles. As shown in Fig. 2 a and b, the membrane tubes
showed a broad distribution in fluorescence intensity. The
histogram of the normalized intensities is discontinuous, and
only multiples of a unitary value are seen (Fig. 2d). Such a
distribution implies that some tubes are either multilamellar or
composed of bundles of unitary tubes. To define the precise
structure of the network, we analyzed it by transmission electron
microscopy (Fig. 2 e–g). Single tubes had a constant diameter
(40 10 nm), a value close to that estimated for membrane tubes
in vivo. Interestingly, two or more tubes were frequently observed
aligned along a single microtubule (Fig. 2g), suggesting
that tubes of high fluorescent intensity (see Fig. 2 a and b) in fact
represent bundles of several tubes. This hypothesis is supported
by the fact that the tubes with the highest fluorescence intensity
often split into several tubes of lower intensity (Fig. 2b). In
addition, growth or retraction of a tube along another tube was
frequently observed (Fig. 2c).
Based on growth velocity measurements, we were able to
distinguish two phases in the formation of a tubular network. At
the first phase (I), the average growth velocity was 340 40
nms, a value close to that measured for kinesin-coated beads
moving along microtubules in the absence of membranes (Fig.
3a). During this phase, the length of a tube increases essentially
linearly with time (Fig. 3c). Phase I corresponds to the time
following the emergence of tubes from a given vesicle, up to the
beginning of network formation (see Fig. 1a). Network growth
then enters gradually in a second phase (phase II) in which the
average velocity decreased by a factor of two as compared with
phase I (Fig. 3g, EPC I and II). The observation of single tubes
shows a slowing of growth, and even a complete stop, after a
growth period at constant velocity (data not shown). Moreover,
the instantaneous velocity of the tip of the tube (Fig. 3f)
fluctuated to a much greater extent than in phase I (Fig. 3d),
where the fluctuations were similar to those of a kinesin-coated
bead not bound to GUVs moving along a microtubule (Fig. 3b).
Phase II corresponds to a progressive densification of the
network, and the number of growing tubes gradually decreased.
Roux et al. PNAS April 16, 2002 vol. 99 no. 8 5395
CELL BIOLOGY

Fig. 1. Formation of tubes and networks from EPC GUVs. (a) DIC images recorded with a charge-coupled device camera (time lapse, 12 s) showing several tubes
growing simultaneously from GUVs (bright spherical objects visible at the bottom of the image). Branching events occur on images 1, 4, and 5, leading to the
formation of a network (images 6–9). (b) DIC images (time lapse, 7 s) showing a tube growing along a microtubule that splits into 2 tubes at the intersection
of 2 microtubules (image 7). A retraction event is visible on images 12 and 13, followed by further growth (images 14–18). Black arrows point to microtubules.
(c) Tube growth observed by reflection interference contrast microscopy. Beads appear black or white depending on their distance to the substrate. Two beads
(gray arrow) are visible at the tip of a growing tube. Beads are also present along the tube (white arrow) growing on a microtubule (black arrow). (d) Tubes do
not form in the absence of beads. From Left to Right: without ATP, biotinylated kinesins-fluorescent Cy3 streptavidin complexes were fixed on the microtubule
network. In the presence of 1 mM ATP, the complexes were transferred onto the GUV (Center). Absence of tubes growing from a GUV as shown by DIC microscopy
(Right). [Bar 5 m.]
No significant, further growth activity was detected 30–60 min
after the beginning of the experiment, which was not a result of
ATP exhaustion (data not shown).
We next tested the influence of the lipid composition of the
membrane on the generation of tubes. The addition of cholesterol
(from 16 to 50% no.no., in the initial lipid solution) to the
EPC bilayer did not significantly change either the growth
velocity (Fig. 3g, Chl) or the diameter of the fluorescent tubes
(data not shown). To obtain a more complex lipid composition,
GUVs were made of lipids prepared from purified rat liver Golgi
membranes (GPL, Golgi-purified lipid). Golgi lipids are composed
of 50% (no.no.) phosphatidylcholine, 20% phosphoethanolamine,
6% phosphatidylserine, 12% phosphatidylinositol,
8% sphingomyelin, and cholesterol (lipid ratio 0.16) (29, 31).
Kinetic parameters comparable to the ones found with EPC
GUVs were obtained, in particular for velocity values during
phases I and II (Fig. 3g, GPL I and II). In addition, Golgi lipid
GUVs also gave rise to networks consisting of bundles of
membrane tubes.
Finally, we wished to determine whether tubes could be
obtained by binding the kinesin-coated beads to membrane
proteins instead of lipids. For this purpose, purified rat liver
Golgi membranes were incubated with N-hydroxysuccinimidebiotin,
a reagent that biotinylates amino groups in proteins. The
addition of kinesin-coated beads led to the formation of tube
networks resembling those described above (Fig. 4). However, a
phase I dynamic was not observable. Rather, the growth velocity
of the tubes resembled that of phase II in GUVs (Fig. 3g, Gol).
Bundles of tubes were also present in the preparations. In control
experiments, tube formation was not observed when biotinylated
Golgi membranes were incubated in buffer alone.
Discussion
The minimal system described above has two dynamic regimes.
When the growth velocity of tubes is nearly identical to the
velocity of a free bead (phase I in our assay), this implies that
the force experienced by individual motors is smaller than 1 pN
(32). In our assay, the velocity is such that the force necessary
5396 www.pnas.orgcgidoi10.1073pnas.082107299 Roux et al.

Fig. 2. Tube networks. (a and b) Fluorescence confocal microscopy of EPC
tubes containing 1% (no.no.) fluorescent BODIPY 530550 C5-HPC. A single
representative confocal section is shown in a (the GUV appears out of focus).
(c) Sequence showing the growth of a fluorescent tube along another tube
(time lapse, 30 s). (d) Histogram of the normalized fluorescence intensities (NI),
showing the discrete distribution of the fluorescence intensities of approximately
150 tubes. (e–g) Transmission electron microscopy images of EPC tubes
(N); (e) Network of membrane tubes (white arrow) growing on a microtubule
network (black arrow). The GUVs are no longer visible, probably because of
washing out during the staining process. (f) A single tube aligned along a
microtubule. The estimated diameter of this tube is 47 nm. (g) Bundles of 2
tubes on a microtubule. [Bars 5 m (for a, b, and e) and 0.5 m (f and g)].
for pulling a tube can be estimated from static arguments (20):
f r 2r, in which is the membrane tension, and
r (2) 1/2 is the tube radius ( is the membrane-bending
rigidity modulus). Based on values of 4 10 20 J for pure
Fig. 3. Kinetics of tube growth. Typical length (L) vs. time (t) and corresponding
instantaneous velocity (V) vs. time (t) plots, for, respectively: (a and b) a
free bead in a standard motility assay performed under the same conditions
(L corresponding to the distance covered by the bead); (c and d) an EPC tube
in phase I; (e and f) an EPC tube in phase II. (g) Average velocities: free bead
(Bd), EPC lipid tubes in phases I and II (EPC), Golgi-purified lipid tubes (GPL) in
phases I and II, biotinylated purified Golgi membranes in phase II (Gol), and
EPC lipids with the addition of 50% (no.no.) cholesterol (Chl) in phase II.
phospholipids and r 20 nm from electron microscopy measurement,
we obtain f 12 pN. From geometrical arguments
based on motor steric exclusion, bead curvature, and microtubule
diameter (33), the number of motors likely to interact
simultaneously with a microtubule at any given time can be
estimated to be between 10 to 20. Therefore, the load per motor,
assuming that pulling is carried out by a single bead, is of the
order of or smaller than 1 pN. After a few minutes, the growth
regime gradually reaches a second stage, in which tube growth
velocity is reduced by a factor of two. This observation indicates
that each individual motor experiences a force about half stall
force (2–3 pN) (32). Such an increase in force may result from
an increase in membrane tension, likely caused by membrane
extraction from GUVs (34). A high initial tension of the purified
Golgi membrane could explain why phase I is not observed in
this system. The velocity fluctuations in phase II (Fig. 3f) could
reflect either fluctuations in tension (35, 36) or fluctuations in
Roux et al. PNAS April 16, 2002 vol. 99 no. 8 5397
CELL BIOLOGY

Fig. 4. DIC microscopy images of the network extracted from biotinylated rat
liver Golgi stacks. [Bar 5 m.]
the number of motors working at a given time in a high-tension
condition.
A striking finding is that beads linking motor proteins to the
membrane bilayer seem to be a key element in our assay. Under
a load of a few pN, single phospholipid molecules are extracted
from a membrane in a few seconds (36), and motors detach from
the microtubule at even higher rates (37). On the other hand, it
takes more than a minute to pull out a 30-m-long tube (36).
Therefore, the role of beads could be to distribute the load
among a large number of lipids and motors, thus avoiding lipid
extraction or motor detachment. It is also important to emphasize
that the binding of several motors to a bead increases its
processivity. How motors bind to biological membranes is still
poorly understood, but it has been reported that a kinesin
(KIF13A) directly interacts with coat proteins (38), large cytosolic
complexes that are recruited onto membranes and play an
essential role in the formation of transport intermediates in cells
(39, 40). A tentative extrapolation of our results is that coat
protein complexes, by forming patches on the membranes, fulfil
a role similar to that of the beads in our assay. Lipid subdomains,
such as detergent-resistant membranes (rafts), could also have
the same function, if motors can directly bind to them. Interestingly,
a kinesin (KIFC3) that associates with triton-insoluble
membranes has been recently characterized (41).
Another interesting observation is the existence of bundles of
tubes in the network, in apparent contradiction with elastic
energy minimization, which predicts that tubes elongated from
the same GUV should coalesce once generated [I. Derényi,
personal communication (21)]. One possible explanation is that
tubes originating from different points on the GUV membrane
form bundles because of the topology of the underlying microtubules
network, allowing bundles to form far enough from the
base of the vesicle (Fig. 5a). However, most of the bundles that
we observed are localized very close to the GUV (see Fig. 2a).
In this case, bundles of tubes could be formed if tubes connect
at different points to the same microtubule (Fig. 5b). Attractive
interactions between tubes and microtubules should then stabilize
the first points of contact, preventing tube coalescence.
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Fig. 5. Possible mechanisms for the formation of bundles in the network. (a)
Single tubes, originating from different points of the same vesicle and moving
along different microtubules, converge at a distance from the vesicle on a
single microtubule and form bundles. (b) Single tubes can also grow along the
same microtubule and form bundles near the GUV membrane if weak interactions
exist between tubes and microtubules. The contact points (gray arrows)
of the two tubes with the microtubule should be distant enough to
prevent tubes from coalescence.
In conclusion, our work demonstrates that the action of motor
proteins is sufficient to produce membrane tubules from a lipid
bilayer. That tubes have been obtained with GUVs of complex
lipid composition, as well as with purified Golgi membranes,
indicates that this assay will be worthwhile for determining the
pertinent biophysical parameters and for addressing the role of
lipid domains and protein coats in the events underlying the
tubulation of biological membranes. It will be also interesting to
investigate how growing tubules can detach (fission event) from
the membrane reservoir.
We thank F. Nédélec for kindly providing the kinesin plasmid; F.
Jülicher, I. Derényi, and M. Dogterom for stimulating discussions; J.
Pécréaux and L. Legoff for their assistance in data processing; and B.
Antonny, M. Bornens, D. Cassel, D. Chatenay, P. Chavrier, B. Hoflack,
L. Johannes, R. McDermott, F. Nédélec, F. Perez, and T. Surrey for
critical reading of the manuscript. This work was supported by grants
from the Centre National de la Recherche Scientifique (Program
Physique et Chimie du Vivant), the Institut Curie, and the Association
pour la Recherche Contre le Cancer.
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CELL BIOLOGY

III.4 Discussions et expériences complémentaires.
III.4.1 Nombre de moteurs nécessaires et rôle des agrégâts
de moteurs dans la formation des tubes.
III.4.1.1 Nombre de moteurs dans le cas des expériences avec billes
Connaître le nombre de moteurs qui tirent en même temps est une donnée importante,
car elle permet d’estimer la force nécessaire pour tirer le tube. Cela peut permettre aussi de
connaître la raison de l’apparition des fortes fluctuations dans la vitesse instantanée, au cours
de la deuxième phase de croissance des tubes.
Par un calcul simple, il est possible de montrer que dans le cas des expériences
réalisées avec les billes de 100 nm recouvertes de streptavidine, la densité de streptavidine
étant de 3000 sites par bille, 1000 à 2000 moteurs au maximum se fixent par bille. Il suffit
pour cela de diviser le nombre de moteurs par le nombre de billes présentes dans la solution.
Tous les moteurs ne se fixant pas, on obtient une valeur maximale. Il est difficile de vérifier
que tous les moteurs sont bien fixés, mais le fait que le nombre total de sites présents sur les
billes soit deux fois plus important que le nombre de moteurs montre que les moteurs ne
peuvent pas saturer les sites d’une bille, lui permettant de se lier aussi aux biotines de la
membrane lipidiques.
Par un calcul géométrique plus complexe, Imre Derenyi et Jacques Prost ont estimé le
nombre de moteurs liés à une bille et marchant en même temps sur un microtubule à un
maximum de 20. Une expérience simple permet de vérifier si l’ordre de grandeur de ce chiffre
est correct. il suffit de diviser la densité de moteurs par billes jusqu’à trouver une densité ne
permettant pas la formation de tubes. Le tableau 1 donne les résultats obtenus.
On observe une absence de réseau pour une densité 10 fois inférieure à la densité
normale. Ce qui laisse imaginer, comme la force nécessaire pour former un tube est d’au
moins 3 moteurs (voir chapitre précédent), que le nombre de moteurs travaillant en même
temps pour cette densité est inférieur ou égal à trois. Ce qui donne un nombre de moteurs
travaillant en même temps inférieur ou égal à 30, qui est très proche de l’estimation
précédente.
125

densité
estimée de
moteurs n/bille
nombre estimé de
moteurs travaillant
en même temps
n/bille
Observations sur la croissance des tubes
1500 20 apparition des tubes en moins de 5 minutes.
Nombreux réseaux très développés.
300 4 retard à l’apparition des tubes : il faut environ une
20aine de minutes pour voir les premiers tubes.
Réseaux cependant bien développés.
150 2 Un tube a poussé à partir de quelques vésicules
après 30 minutes. Pas de réseaux
75 1 Pas de croissance
Tableau 1 Effet de la densité de moteurs sur la croissance des tubes
Il est important de constater que dans les conditions standards de l’expérience, le
nombre de moteurs est bien supérieur à celui nécessaire pour former et allonger un tube (20
comparé à 3). Ce qui explique la profusion de tubes. Cependant, dans la deuxième phase de
croissance, la vitesse instantanée varie beaucoup. Ces fluctuations de la vitesse instantanée
pourraient être le reflet de fluctuations de la force nécessaire pour tirer le tube (liées aux
fluctuations de la tension de la membrane), ou du nombre de moteurs tirant à un instant donné
le tube. Une étude plus quantitative en cours et réalisée par Cécile Leduc au laboratoire
permet de répondre à la question de la fluctuation du nombre de moteurs. Les fluctuations de
la tension pourrait être liées à l’ouverture transitoire de pores permettant de relaxer la tension
lorsque celle-ci dépasse une tension critique [156].
III.4.1.2 Rôle des agrégâts de moteurs dans la formation des tubes de
membranes
Nous avons montré dans cet article que sans billes il nous était impossible de former
des tubes. Nous en avions conclu sur la nécessité de concentrer les moteurs en un point de la
membrane via les billes pour former les tubes. Cependant, Gerbrand Koster et Martijn Van
126

Duijn dans le laboratoire de Marileen Dogterom à Amsterdam, ont montré qu’il était possible,
avec exactement les mêmes éléments, mais un protocole différent, de former des tubes de
membranes sans les billes, simplement en fixant les moteurs avec de la streptavidine [157].
La différence principale entre leur protocole et le notre est qu’ils mélangent tous les élements
séquentiellement dans un tube eppendorf avant injection dans la chambre. Cependant, ils
proposent, puisqu’il est nécessaire d’avoir plusieurs moteurs pour former un tube, que les
agrégats de moteurs puissent se former dynamiquement au bout du tube et expliquent grâce à
un modèle simple (voir plus bas) qu’au dessus d’une certaine densité membranaire seuil de
moteurs, il y a toujours formation de tubes. L’hypothèse de base est que les moteurs qui sont
en bout de tube sont freinés par la force de traction du tube, alors que les moteurs en aval sur
le tube se déplacent librement vers le bout du tube, et rattrapent les moteurs de tête, formant
un agrégat (voir figure 45). Dans ce modèle, les moteurs ne restent pas en permanence
attachés au microtubule, et la probabilité de décrochement dépend de la force appliquée sur
chaque moteur. Il est également supposé que la force est également répartie sur chaque
moteur. Pour comprendre les différences entre les protocoles, nous avons réalisé une série
d’expériences croisées (produits et protocoles) avec l’équipe de Marileen Dogteröm qui a
abouti à la conclusion que la différence entre nos expériences et les leurs est qu’ils obtiennent
des densités de moteurs supérieures à celle obtenues avec notre protocole. Les faibles densités
de moteurs dans nos expériences sont probablement liées à l’étape de fixation des moteurs sur
les microtubules, qui fixent un très petit nombre de moteurs. Ce qui explique que dans leur
expériences sans billes, ils puissent avoir des tubes (puisqu’ils sont au-dessus de la densité
seuil) et que nous n’en ayons pas (en-dessous de la densité seuil). Cependant, ils ne nous a pas
été possible de mesurer la densité de moteurs dans les deux cas.
127

Figure 45 : Hypothèse de formation des agrégats en bout de tube. Les moteurs marchant le long du
microtubule dans le tube rejoignent les moteurs du bout du tube qui vont moins vite.
Cécile Leduc a pu reproduire la croissance de tubes sans billes au laboratoire [158]. Un point
important est que la fixation des moteurs à la membrane s’est faite grâce à un lipide
fluorescent et biotinylé synthétisé dans le groupe de Line Bourrel par Pascale Jolimaitre à
Lille (voir figure 45 et figure 46). C’est la seule technique parmi celles essayées pour
visualiser les moteurs qui ait donné des résultats fiables. De plus, comme un seul fluorophore
est présent sur chaque lipide, cette technique permettra peut-être de remonter au nombre réel
de moteurs au bout du tube à chaque instant. Grâce à ce lipide fluorescent, elle a pu montrer
qu’il y avait bien une accumulation de moteurs en bout de tubes, et que l’intensité de
fluorescence était corrélée à la vitesse du tube. Pendant les phases d’arrêt ou de
ralentissement, l’accumulation devient plus importante (plus de moteurs) et du même coup la
vitesse augmente fortement.
128

Figure 46 : A-Structure du lipide biotinylé et fluorescent (rhodamine) synthétisé par Pascale Jolimaitre. B
Croissance d’un tube grâce à des kinésines fixées sur le lipide fluorescent et biotinylé. On distingue
nettement une concentration de lipides plus importante en bout de tube, indiquant une concentration plus
importante des moteurs. Une image mesure environ 15 µm de long, et chaque image a été prise toutes les 5s.
Otger Campàs sous la direction de Jean-Francois Joanny au laboratoire a repris le
modèle simple proposé par l’équipe de Marileen Dogterom, et en a fait une étude plus
complète [159]. Il a pu calculer le flux entrant de lipides au bout du tube, et le flux sortant, en
tenant compte du taux d’accrochage et de décrochage des moteurs, et de leur vitesse selon
qu’ils sont au bout ou au milieu du tube (voir figure 47). Ce modèle permet d’estimer un
nombre nB de moteurs au bout du tube, et de prévoir la répartition des moteurs le long du
tube. Le nombre de moteurs décroît exponentiellement en retrait du bout du tube, avec une
longueur caractéristique estimée théoriquement de 3 µm. Cécile Leduc a pu retrouver cette
décroissance exponentielle du nombre de moteur (intensité décroissante de fluorescence) et
mesurer une longueur de décroissance de 1,8 µm.
Il est important de noter que ces deux études, théorique et expérimentale, sont un bon
exemple de l’auto-organisation de moteurs sous contraintes. Elles expliquent parfaitement que
la formation de tubes soit spontanée dès qu’une certaine densité de moteurs liés à la
membrane est dépassée.
129

Figure 47 : Différents paramètres intervenant dans le modèle de O. Campàs, d’après [159]. Les possibilités
O
d’accrochage et de décrochage des moteurs le long du tube. voir texte. k : taux de décrochage des moteurs
kB 0 vitesse des moteurs sans contrainte, nB nombre
dans le tube, taux d’accrochage des moteurs du tube, V
de moteurs en bout de tube, V vitesse du tube (et des moteurs en bout de tube) V

tubes de membranes ne sont visibles dans les cellules que si le récepteur des moteurs ou la
protéine transportée est surexprimée [25,43]. De plus, la présence de domaines dans les
membranes cellulaires qui pourraient concentrer sélectivement les moteurs, pourraient aussi
expliquer la formation de tubes comme nous allons le voir maintenant.
III.4.2 Rôle des agrégats de moteurs dans l’extraction de
tubes à partir de membranes golgiennes
De même que pour les GUVs, il est possible de réaliser des expériences sur des
membranes de Golgi biotinylées, avec ou sans billes (voir protocoles 3.1.4). Le protocole sans
billes que nous avons mis au point ne marche pas avec les GUVs car la densité de moteurs est
probablement trop faible, mais marche cependant avec les membranes biotinylées de Golgi.
(voir 48). Cette expérience nous a amenés à étudier les élèments qui étaient biotinylés au
cours de la biotinylation des membranes golgiennes, pour comprendre ce qui permettaient aux
membranes golgiennes de former des tubes sans utiliser de billes.
Figure 48 : Expériences de formation de tubes à partir de membranes biotinylées d’appareil de Golgi. Les
membranes golgiennes, contrairement aux GUVs, sont capables de former des tubes avec notre protocole de
fixation des moteurs directement avec de la streptavidine (Biot Golgi). Si les membranes biotinylées sont
préalablement lavées à un pH basique (Biot Golgi + Na2Co3), il n’y a plus formation de tubes. Suite à un
lavage à haute force ionique (Biot Golgi + NaCl), la formation des tubes a toujours lieu. Barre 10 µm.
Nous avons trouvé que le fait de laver les membranes biotinylées avec 0,1 M de
Na2Co3 (pH environ de 9) à 4°C pendant 30 minutes inhibait le processus de formation de
tubes par les moteurs fixés sans billes (voir figure 48). Ce lavage est couramment utilisé pour
131

décrocher des protéines faiblement liées à la membrane golgienne. Un autre type de lavage, à
haute force ionique (1 M de NaCl pendant 30 minutes à 4°C), n’inhibe pas la formation de
tubes (voir figure 48).
Sur un gel de protéines en bleu de Coomassie, une bande migrant à 200 kDa est
spécifiquement enrichie dans la fraction membrane golgienne après purification, et est absente
de la fraction cytosolique, et faiblement visible dans la fraction membranes totales et dans
l’extrait total (voir figure 49A). On a montré par Spectrométrie de Masse (MALDI-TOF) que
cette protéine était la Myosine IIa non-musculaire, s’associant spécifiquement aux membranes
golgiennes [53]. Bien que cela reste controversé, cette myosine pourrait être impliquée dans la
formation des vésicules d’exocytose à partir du TGN (Trans Golgi Network) [54,55,160]. Par
Western Blot, nous avons pu montrer que cette protéine était fortement biotinylée au cours de
la biotinylation de membranes Golgiennes (voir figure 49B). De plus, un lavage des
membranes biotinylées par le Na2Co3 permet de décrocher sélectivement de nombreuses
protéines dont la Myosine IIa. Le lavage NaCl ne décrochant pas cette myosine, nous avons
conclu que la myosine IIa étant une protéine abondante de la fraction membranes golgiennes
et fortement biotinylée, nos moteurs se fixaient préférentiellement sur cette protéine. Ainsi, le
lavage Na2Co3 éliminant cette protéine, la formation de tubes par les moteurs n’était plus
possible.
Pour comprendre pourquoi la fixation des moteurs sur cette myosine permettait la
formation de tubes, nous avons étudié la localisation des protéines biotinylées sur les
membranes de Golgi. Grâce à de la streptavidine Cy3, nous avons mis en évidence que la
biotinylation était inhomogène, avec de gros points de très forte biotinylation, et un fonds de
biotinylation presque homogène et assez important (voir figure 49C). Après lavage au NaCl,
aucun changement dans le marquage n’a été observé, alors qu’un lavage au Na2Co3 faisait
disparaître les points intenses de biotinylation. Nous avons fait l’hypothèse que ces points de
forte biotinylation étaient majoritairement composés de Myosine IIa biotinylée, puisque les
conditions de décrochement de la Myosine IIa font également disparaître ces points d’intense
biotinylation. Cette myosine, concentrée en des points sur les membranes, permettrait de
concentrer les moteurs en des points précis de la membrane, facilitant la formation de tubes.
132

Figure 49 : A-Gel SDS-PAGE d’extraits de
foie de rat , coloration bleu de Coomassie.
Gol : membranes Golgiennes enrichies après
purification, Mb : fraction de membrane totales
(culot d’un extrait total centrifugé une heure à
133
100 000g), Cyt : fraction cytosolique
(surnageant d’un extrait total centrifugé une
heure à 100 000g), Tot :extrait total, ou broyat
de foie de rat. La flêche montre la bande qui
migre à 200 kDa, spécifiquement enrichie dans
la fraction Membranes Golgiennes, et qui
correspond à la Myosine IIa non-musculaire.
B-Western Blot de membranes Golgiennes
biotinylées (voir protocole 4.1.3), sans lavage
(colonne Biot), après un lavage Na2Co3
(colonne Na2Co3), et après un lavage au NaCl
(colonne NaCl). Une bande fortement
biotinylée à 200 kDa visible dans la colonne
Biot et la colonne NaCl est sélectivement
décrochée des membranes Golgiennes par un
lavage Na2Co3. Révélation Streptavidine. C-
Membranes Golgiennes biotinylées incubées en
présence de streptavidine Cy3 0,5 µg/mL et
observées par microscopie de fluorescence.
Dans le cas des membranes non lavées (Biot
Golgi) ou lavées avec du NaCl (Biot Golgi +
NaCl), des points de très forte biotinylation
sont visibles. Ces points ont disparus après
lavage au Na2Co3. Barre 10 µm

Un premier pas dans la vérification de cette hypothèse a été que ces points de
biotinylation intense étaient retrouvés au bout des tubes lorsque de la streptavidine
fluorescente (Cy3) était utilisée pour fixer les kinésines sur les membranes biotinylées (voir
figure 50). Ceci permet de conclure que les points de forte biotinylation fixent probablement
plus de moteurs et permettent donc la formation de tube.
Figure 50 : Formation de tubes par fixation de kinésines biotinylées sur des membranes de Golgi biotinylées
grâce à de la streptavidine Cy3. On oberve au bout des tubes une fluorescence plus intense reflétant
probablement une concentration plus intense de moteurs. Barre 10 µm. Le reste des agrégats visibles le long
des microtubules sont des moteurs non fixés à la membrane.
Pour cela, il nous a fallu montrer que la myosine IIa était colocalisée dans les points de
forte biotinylation observés sur la membrane de Golgi. Nous avons pu utiliser un anticorps
134

sélectionné au laboratoire par Clément Nizak et Franck Perez. Dans un crible visant à
sélectionner des anticorps recombinants contre des protéines de la matrice protéique entourant
l’appareil de Golgi, Clément et Franck ont isolé un anticorps appelé SF9 reconnaissant la
Myosine IIa des membranes golgiennes [161]. Cet anticorps a été sélectionné plusieurs fois,
indiquant que cette protéine était relativement accessible aux anticorps lors du crible. On peut
donc conclure qu’il s’agit probablement d’une protéine très périphique des membranes
golgiennes. Cet anticorps en immunofluorescence sur une fraction de membranes golgiennes
présente un marquage par points très concentré, similaire au marquage observé pour la
biotinylation, avec toutefois un bruit de fond de marquage beaucoup plus faible.
Figure 51 : Membranes golgiennes marquées avec des billes d’or couvertes de streptavidine (5 nm) et
d’anticorps SF9 anti-Myosine IIa (10 nm). Une zone plus dense aux électrons est riche en filaments et en
marquage par les deux types de billes d’or (haut à gauche). Au contraire la zone moins dense aux électrons
ne possède pas de filaments ni de marquage. La flèche indique un filament décoré d’une bille. Barre 100 nm.
135

En microscopie électronique, réalisée dans l’équipe de Jean Cartaud à l’Institut
Jacques Monod, nous avons pu montré que cet anticorps reconnaissait une cible colocalisée
avec des zones d’intense biotinylation (voir figure 51). Ces zones, ne comportant pas de
membranes sous forme de saccules empilées comme dans le reste de l’échantillon (structure
classique des membranes golgiennes), étaient constituées de petites vésicules, parfois
couvertes de manteaux contenant TGN38, une protéine résidante du TGN, et de filaments
courts (flèche figure 51). En général, les filaments formaient un agglomérat entouré des
vésicules et de membranes de formes peu définies. De plus, les billes d’or couvertes de SF9
décoraient fréquemment ces filaments (probablement de l’actine, voir flêche figure 51).
Pour vérifier définitivement notre hypothèse, l’expérience la plus directe fut de
biotinyler l’anticorps SF9, et fixer les moteurs sur SF9 biotinylé lui-même adsorbé au
préalable sur des membranes de Golgi non biotinylées. Ainsi, la spécificité de l’anticorps
garantissant que les moteurs ne tiraient que sur la Myosine IIa, cette expérience aurait pu
montrer que la fixation des moteurs sur cette myosine (et sur aucune autre protéine) suffisait à
former des tubes. Malheureusement, le résultat s’avéra négatif, puisqu’aucun tube ne put être
formé de cette façon. Cependant, nous avons pu vérifier avec de la streptavidine fluorescente
que les moteurs étaient bien fixés sur l’anticorps de manière spécifique, et que le marquage
obtenu était similaire à celui de l’anticorps seul. Pour expliquer ce résultat négatif, il est
probable que le nombre de moteurs fixés par les anticorps était inférieur au nombre de
moteurs fixés par la myosine biotinylée. Nous avons utilisé un anticorps secondaire anti-MYC
biotinylé permettant d’amplifier le nombre de moteurs fixés par SF9 (étiqueté MYC). Mais
aucun tube n’a pu être obtenu non plus.
Il est probable que l’affinité de l’anticorps soit un paramètre important pour expliquer
ce résultat négatif. Il est probable que la technique utilisée pour sélectionner SF9 permette de
sélectionner des anticorps de faible affinité [161], difficiles à isoler par d’autres méthodes.
Mais dans notre système, le fait d’exercer une force sur un anticorps de faible affinité peut
probablement conduire à la rupture du lien kinésine/membrane. Même si aucune mesure de
l’affinité n’a été réalisée, nous supposons que la plus faible affinité d’un couple
anticorps/antigène par rapport au couple streptavidine/biotine peut expliquer l’incapacité du
système à former des tubes en tirant sur des anticorps.
136

III.5 Conclusion
Dans ce chapitre, nous avons vu comment un système simple pouvait reproduire la
formation de tubes dans le trafic intracellulaire. Ce système simple doit permettre
d’appréhender les rôles des paramètres physiques importants pour la formation des
intermédiaires de transport, tels que la courbure, ou la tension. Il reproduit une étape de
déformation de la membrane et un étape de transport (au sens déplacement). En ajoutant des
éléments dont on connait le rôle dans le transport intracellulaire à ce système minimal, il sera
peut-être plus facile de comprendre plus précisément leur fonctionnement. L’ajout de
protéines impliquées dans la fission telle que la dynamine, l’endophiline et d’autres pourrait
ainsi permettre de mieux comprendre le phénomène de fission, et le fonctionnement de ces
protéines. Ce système très simple se révèlera, je l’espère, très utile pour la compréhension de
quelques mécanismes physiques importants pour le trafic.
137

chapitre 4 Etude du tri de lipides
par courbure et de la coupure de
tubes tirés à partir de vésicules à
deux phases.
vésicules géantes de différentes compositions présentant des domaines.
139

Le système minimal présenté au chapitre 2 permet de former des intermédiaires
tubulaires de transport. Cependant, ce système simple ne permet de reproduire que l’aspect
déformation de la membrane, sans pouvoir réaliser ni tri d’éléments membranaires, ni coupure
de la membrane. Comme ce système présente l’avantage d’avoir une composition
parfaitement maîtrisée, il est possible d’inclure des éléments connus pour permettre le tri ou la
fission des membranes, comme par exemple, une composition lipidique proche de celle de la
membrane cellulaire et permettant la formation de rafts. Ou encore, d’ajouter des protéines
connues pour leur rôle dans la fission telle que la dynamine ou l’endophiline.
De nombreuses études récentes ont montré qu’il était possible d’obtenir une séparation
de phase dans des vésicules géantes à plusieurs composants. Avec un mélange de trois lipides
contenant un tiers de sphingomyéline, un tiers de phosphatidylcholine, un tiers de cholestérol,
des domaines géants sont observés [88]. Les sphingomyélines sont généralement à
température ambiante sous forme cristalline (phase solide). L’ajout de cholestérol à cette
phase provoque sa fluidification tout en gardant un certain ordre, la transformant en phase
liquide-ordonnée (Lo). Dans un mélange ternaire (sphingomyéline, phosphatidylcholine,
cholestérol) présentant des domaines, la phase enrichie en sphingomyéline est aussi en phase
Lo. Ceci confère aux domaines sphingomyélines des propriétés particulières : ils sont moins
fluides que les domaines en phase liquide-désordonnée (Ld) [87,97]. De plus, leur fluidité
augmente avec la concentration de cholestérol [97]. La rigidité de courbure des phases Lo est
de 2 à 1000 fois plus grande que pour les phases Ld :les valeurs dépendent de la technique
employée et de la proximité à la température de transition Ld/Lo [116,144,145]. Ce point peut
être important car il permet de proposer que les membranes en phase Lo puissent être plus
difficilement courbées que les phases Ld, et que les lipides constituant la phase Lo puissent
être exclus de structures très courbées.
Puisque des domaines possédant certaines propriétés des rafts des membranes
cellulaires sont facilement reproduits dans des vésicules géantes, et vu l’importance
grandissante que l’hypothèse des radeaux lipidiques a prise pour expliquer le tri membranaire
au cours d’étapes de transport, nous avons décidé de voir s’il était possible d’effectuer un tri
lipidique dans des tubules tirés par des moteurs à partir de vésicules à deux phases (une Lo et
une Ld).
141

IV.1 Résumé de l’article 2 : Roux et coll. Role of curvature
and phase separation in lipid sorting and fission of
membrane tubules. (soumis)
En utilisant un protocole déjà publié [88], nous avons pu reproduire la formation de
domaines géants dans des GUVs. Nous avons alors pu faire un diagramme de phase succinct
en modifiant les rapports des trois lipides mélangés : sphingomyéline de cerveau (BSM), di-
oleyl-phosphatidylcholine (DOPC) et cholestérol (Chol). Nous avons pu montrer qu’une
gamme étendue de compositions présentait une séparation de phase visualisable grâce à une
phosphatidylcholine fluorescente ségrégée dans la phase Ld. Ces compositions correspondent
à des concentrations relativement faibles de cholestérol (inférieures à 30%) et élevées en
sphingomyéline. Surtout, certaines compositions proches de la frontière (transition) entre la
zone où les vésicules sont ségrégées et la zone où les vésicules sont homogènes (en
fluorescence) ont des propriétés particulières. La destruction de la sonde fluorescente par
illumination intense provoque l’oxydation d’une faible proportion de cholestérol (quelques
%). Cette modification faible de la composition de la membrane suffit cependant à provoquer
une séparation de phase : les compositions homogènes proches de la transition peuvent
traverser la frontière suite à la transformation d’une faible quantité de cholestérol et passent
alors dans l’état ségrégé. Cette induction de séparation de phase n’est pas observée pour les
compositions loin de la limite de phase, et la quantité de cholestérol oxydé est dépendante de
l’intensité lumineuse utilisée pour exciter le lipide fluorescent. Dans la suite, nous avons
utilisé deux intensités lumineuses, une de 3,5 mW et une de 10 µW, pour induire la séparation
de phase. La quantité de cholestérol oxydé générée par les deux illuminations est différente
d’un facteur au moins 10, pour la même quantité de fluorophore.
Nous avons ensuite pu tirer des tubes à partir de vésicules de différentes compositions
grâce au système minimal présenté dans le chapitre précédent. La première observation que
nous avons faite est qu’il est possible de tirer des tubes à partir d’une vésicule en phase Lo
(BSM et Chol uniquement, pas de DOPC) et qu’ils sont plus gros que les tubes tirés à partir
d’une vésicule Ld (DOPC et Chol uniquement). Il faut noter qu’en fluorescence, le diamètre
apparent mesuré des tubes Ld est de 260nm. Or nous savons d’après l’étude de microscopie
électronique (présentée au chapitre précédent) que leur diamètre réel est de l’ordre de 40 nm,
bien inférieure à la résolution optique d’un microscope photonique. La mesure obtenue par
142

fluorescence nous donne donc la résolution de notre microscope. Pour des tubes tirés à partir
de vésicules Lo, nous obtenons un diamètre moyen d’environ 420 nm sur les images de
fluorescence. Cette mesure étant supérieure à la résolution optique du microscope, elle a donc
un sens. Nous avons donc un diamètre d’environ 10 fois plus grand pour des tubes Lo que
pour des tubes Ld. Ce qui correspond à une rigidité de courbure au maximum 100 fois plus
grande, puisque le diamètre dépend de la racine carrée de la rigidité de courbure (voir
équation 2.19). Ceci est en bon accord avec des mesures antérieures ayant montré que la
rigidité de courbure de la phase Lo était de 10 à 100 fois plus grande que la rigidité de phase
Ld. Si cette rigidité est effectivement plus grande, alors la force nécessaire pour extraire le
tube est aussi plus grande, car elle dépend également de la racine carrée de la rigidité de
courbure. Ceci peut donc profondément modifier la capacité des moteurs à tirer un tube à
partir d’une phase ou de l’autre.
Lorsque des tubes sont extraits de vésicules à deux phases, pour la grande majorité des
compositions diphasiques, 100% des tubes sont connectés à la phase fluorescente qui est la
phase Ld. Pour ces compositions, on s’attendrait, si la force nécessaire pour tirer un tube et la
densité de moteurs sont les mêmes pour les deux phases, à obtenir un pourcentage de tubes
connectés à une phase égal à la proportion surfacique que cette phase couvre sur la vésicule.
Or dans tous les cas, la proportion de tubes connectés à la phase fluorescente est plus
importante que la fraction de la surface couverte par cette phase. Pour expliquer cela, il y a
deux possibilités : soit la densité de moteurs n’est pas la même sur les deux phases, soit la
force pour tirer les tubes à partir de chacune des phases n’est pas la même. Nous avons vu que
la force devait être différente sur les deux phases. La localisation du lipide biotinylé (qui sert
d’ancrage aux moteurs) a été révélée grâce à de la streptavidine fluorescente ; nous avons pu
ainsi montrer que sa concentration est identique dans les deux phases et que donc la densité de
moteurs était la même sur les deux phases. Donc la différence de capacité à se courber des
deux phases induit une croissance préférentielle des tubes à partir de la phase de rigidité la
plus faible, qui ont donc une composition différente de la vésicule de départ.
Une des questions essentielles est de savoir si la forte courbure des tubes ne peut pas
induire un tri dynamique des lipides, les lipides ségrégeant préférentiellement dans une phase
de rigidité de courbure importante étant moins facilement incorporés dans les tubes. Pour
montrer cela, nous avons tiré parti de la composition 1:1:1, dont la séparation de phase est
photo-inductible. En tirant des tubes à partir de vésicules homogènes inductibles, puis en
induisant la séparation de phase par photoactivation faible, on constate qu’environ 100% des
tubes sont connectés à la phase fluorescente après 75s d’observation. Dans la plupart des cas,
143

les domaines fluorescents qui apparaissent fusionnent sur la GUV rapidement (dès les 15
premières secondes) avec les bases des tubes. Aucune séparation de phase n’est observable le
long des tubes. Pour expliquer ce résultat, nous avons émis l’hypothèse que l’extraction de
tubes très courbés triait les lipides ségrégeant préférentiellement dans la phase Ld. En effet, si
aucun pré-tri n’est réalisé, on s’attendrait à ce que 50% des tubes soient connectés à la phase
fluorescente, et 50% à la phase non-fluorescente, reflétant le rapport de surface entre les deux
phases. De plus, on s’attendrait à ce que la photoactivation provoque une séparation de phase
le long du tube. Par contre, si le tube est fortement enrichi en lipides ségrégeant dans la phase
Ld, il s’éloigne de la transition ségrégé/non-ségrégé, et n’est plus inductible. De plus, il
constitue un domaine de composition proche de celle des domaines Ld une fois la séparation
de phase induite. Ainsi, les domaines Ld induits par la photoactivation sur la GUV vont-ils
venir fusionner avec la base du tube, expliquant que près de 100% des tubes soient connectés
à la phase fluorescente.
Pour confirmer cette hypothèse, nous avons essayé d’induire la séparation de phase le
long des tubes par photoactivation forte. Sous forte excitation, la quantité de cholestérol
oxydé est plus importante, et l’on arrive quand même à induire une séparation de phase le
long des tubes tirés à partir de vésicules de composition 1:1:1, même si le temps nécessaire est
plus long (quelques secondes) que pour la vésicule (inférieur à la seconde). Surtout, la taille
des domaines Lo qui apparaissent permet d’estimer que ces domaines couvrent environ 10%
de la surface des tubes, et que donc 90% de la surface est couverte par une phase Ld. Ceci est
à comparer aux 50/50 observés si l’on induit la séparation de phase sur des vésicules, et va
dans le sens d’un appauvrissement des tubes en lipides ségrégeant préférentiellement dans la
phase Lo.
Un résultat important est que l’induction de séparation de phase le long des tubes
provoque la fission des tubes, à l’endroit précis où apparaissent les domaines Lo. Environ 80%
des tubes tirés à partir de compositions proches de la limite de phase (3:4:1 et 1:1:1)
présentent au moins un évènement de fission sous photoactivation. Ce phénomène est
dépendant de l’induction de la séparation de phase dans le tube, puisque aucune coupure n’est
observée pour les compositions éloignées de la limite de phase. De plus, il est spontané à
partir du moment où la séparation de phase est apparue, et ne requiert donc pas d’énergie.
Enfin, les même résultats sont obtenus en induisant la séparation de phase grâce à une drogue,
la methyl-β-cyclodextrine, qui retire le cholestérol des membranes, ce qui confirme que la
séparation de phase est bien le moteur de la fission, et non pas la photoactivation elle-même.
144

Comme la fission n’est observée que sur des tubes de compositions proches de la transition, il
est tentant de postuler que les membranes biologiques sont proches de la transition,
permettant leur coupure. Nous avons vu au cours de chapitre précédent qu’il était possible de
tirer des tubes à partir de membranes de Golgi purifiées. En utilisant la cyclodextrine sur des
réseaux de tubes tirés à partir de Golgi, nous avons pu observer au moins une coupure sur
50% des réseaux. Ceci laisse supposer que les membranes biologiques sont proches de la
limite de phase.
145

IV.2 Article N°2
147

Role of curvature and phase transition in lipid sorting and fission of membrane
tubules
Aurélien Roux ❊ , Jacques Prost ✝ , Patricia Bassereau ✝§ and Bruno Goud ❊§
❊ Laboratoire Mécanismes moléculaires du transport intracellulaire, UMR 144
CNRS/Institut Curie, 26 Rue d'Ulm, 75248 Paris Cedex 05, France
✝ Laboratoire Physico-Chimie Curie, UMR 168 CNRS/Institut Curie, 26 Rue d'Ulm,
75248 Paris Cedex 05, France
Abstract
§ These authors contributed equally to this work
Sphingolipids and part of the cholesterol segregate in vitro into “liquid-ordered” (Lo)
domains whereas the majority of other lipids are present in a “liquid-disordered” phase
(Ld). It is also likely that lipids of biological membranes are organised into
microdomains known as rafts. Here we show that membrane tubes pulled out of giant
vesicles made of sphingomyelin, phosphatidylcholine and cholesterol have a
composition different from the vesicle. Sorting of lipids appeared to be critically
dependent on their respective affinities for very curved structures. We also show that
the induction of a phase separation destabilized the tubes and led to their fission. For
membrane compositions very close to a phase transition, the sorting and fission
mechanisms may be intimately coupled. More generally, biological membranes may use
a similar mechanism based on phase separation to efficiently sort proteins and lipids
during intracellular transport.
1

Similar to proteins, most membrane lipids are transported by vesicular carriers
that bud off from one compartment and fuse to another along the secretory and
endocytic pathways 1 . During budding, sorting occurs, with some lipids being
incorporated into vesicles or tubules while others are excluded 1,2 . Transport
intermediates may form from a preexisting lipid domain on the donor membrane 1 .
Thus, the ability of Lo (liquid-ordered) versus Ld (liquid-disordered) phase to form
transport intermediates could be a critical parameter in sorting. Another possibility is
that sorting is a dynamic event concomitant with vesicle or tubule formation itself 3 . A
common view is that lipids having distinct shapes, being either cylindrical or conical,
display a range in curvature sensitivity that could play an important role in sorting 3,4 .
Depending on the physical state of lipids (Lo versus Ld), membranes display different
capabilities to curve 5-7 . On theoretical basis, membrane curvature is expected to induce
phase separation in multi-component membranes 8,9 , which can be an important process
for sorting. Finally, tubes and vesicles separate from donor membrane upon budding.
Evidence exists that fission is directly linked to changes in composition of the lipid
bilayer, suggesting that physical properties of lipids play a direct role in the fission
process 10,11 .
We have recently developed an experimental system which allows the formation
of 40 nm diameter membrane tubes growing along microtubules, by the action of
molecular motors (kinesins) pulling on Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) or on
biological membranes 12 . We used this assay to test the ability of Lo and Ld phase to
form membrane tubes and to investigate whether a dynamic sorting of lipids occurs
during tube formation. For sake of clarity, we will name in the following "L0 lipids"
2

(resp. "Ld lipids") the lipids preferentially segregated in Lo phase (resp. in Ld phase) as
if it was a two-component system.
GUVs were prepared from mixtures of brain sphingomyelin (BSM), cholesterol
(Chol) and dioleylphosphatidylcholine (DOPC) and were fluorescently labeled by
incorporation of a fluorescent lipid (BODIPY 530-550 C5 HexadecanoylPC, or Bodipy
C5 HPC) at a concentration of 0.5 % n/n. Eleven different compositions of
BSM/Chol/DOPC mix were tested for the preparation of GUVs. As shown in Fig. S1A
(supplementary Information), the vesicles displayed segregation of lipids to various
degrees by changing the relative ratio of BSM, Chol and DOPC. Vesicles with a
homogeneous fluorescence, reflecting an absence of lipid segregation, were observed at
molar ratios of 1:1:0, 0:1:1, 1:2:1 and 1:2:3 of BSM.Chol.DOPC, respectively. These
values correspond to high cholesterol contents (over 30%). Vesicles with highly
fluorescent and weakly fluorescent domains of various sizes were observed at lower
cholesterol concentrations (molar ratios of 3:2:1 and 3:1:3). In absence of cholesterol
(3:0:1, 1:0:1 and 1:0:3) respectively), coexistence between a solid-ordered phase and a
Ld phase was observed, as previously reported 13 . Since the fluorescent lipid partionned
preferentially in the DOPC-rich phase, it is very likely that the fluorescent phase
corresponded to Ld phase, whereas the non-fluorescent one represented Lo phase 14
enriched in sphingomyelin. The fluorescence ratio between fluorescent and non-
fluorescent phases on equatorial confocal planes of vesicles of various lipid
compositions was found to be inversely proportional to the concentration of cholesterol
(Fig. S1B). This indicates that increased concentration of cholesterol favors lipid
mixing. In agreement with previous reports 15,16 , the cholesterol concentration thus
appeared critical for the formation of lipid domains. We then constructed a schematic
3

phase diagram compiling our data (Fig. 1A). The gray area corresponds to lipid
compositions for which the GUVs exhibit phase separation. The 1:1:1 vesicles represent
a frontier situation in which lipids can be segregated or not depending on small changes
of the cholesterol concentration. This phase diagram is in good agreement with results
obtained with various techniques 13,15,17,18 .
GUVs made of the 1:1:1 lipid mix showed particular properties. The majority
exhibited a uniform fluorescence phase, but 10 to 30% (depending on the samples)
showed a fluorescent domain covering only one hemisphere (Fig. S1A). Interestingly,
fluorescence excitation of homogeneous vesicles led to the progressive appearance of
small non-fluorescent domains that rapidly fused together (Fig. 1B and Fig. S1A).
Similar observations were made with 3:4:1 mix. As the kinetics of domain formation
was dependent on light intensity, two conditions (described in material and methods)
were used to generate domains, one leading to their appearance within 1 s ("strong"
induction) and the other within 10 s ("weak" induction). Homogeneous vesicles of other
lipid compositions did not form domains under the same conditions (Fig. 1B). This
suggests that for compositions very close to the phase transition (such as 1:1:1 and 3:4:1
lipid mixtures), very small changes in concentration can induce phase separation.
Indeed, photoactivation of 1:1:1 vesicles, as shown by thin layer chromatography,
generated small amount of oxidized cholesterol (Fig. S2A). About 10 times more
oxidized cholesterol were generated after strong induction as compared to weak
induction (data not shown). In addition, incorporation of cholesterol (6% n/n) to
photoactivated lipid mixtures led to the formation of homogeneous GUVs, these
vesicles being again sensitive to photoactivation (Fig. S2B).
4

The above results suggest that photoactivation results in depletion of cholesterol
and that a small decrease in cholesterol content of 1:1:1 GUVs was sufficient to
promote phase separation. To directly test this hypothesis, 1:1:1 GUVs were incubated
with the cholesterol-sequestering agent methyl-β-cyclodextrin (MβCD) 19 . As illustrated
in Fig. 1B, 10mM MβCD induced the appearance of domains on all homogeneous 1:1:1
vesicles. On the other hand, MβCD did not induce phase separation on homogeneous
vesicles of other lipid composition (1:1:0, 0:1:1 and 1:2:3), with the exception of the
1:2:1 mix (data not shown). Likely, MβCD removes more cholesterol from membranes
(around 20%, as estimated using the phase diagram described above) than
photoactivation, explaining why 1:2:1 vesicles do not form domains upon
photoactivation (data not shown).
Membrane tubes were then pulled out of GUVs prepared from various lipid
mixtures and observed by fast 3D videomicroscopy 20 . We first noticed (Fig. 2A) that
tubes grown from GUVs in the Lo phase (1:1:0) had a diameter 5-10 times larger (see
methods for details) than the ones originating from GUVs made of Ld phase (0:1:1).
Tube radius directly depends on the bending rigidity (κ) of the membrane 21
(R = κ 2σ , where σ is the membrane tension). Assuming that σ is constant, an
increase in tube radius of 5-10 times corresponds to an increase of κ of 25-100 times.
As the bending rigidity of Lo phase has been measured to be 10 to 100 higher than Ld
phase 5-7 , this suggests that large tubes correspond to tubes essentially made of Lo lipids,
whereas small tubes are enriched in Ld lipids. The force required to pull tubes is also
proportional to κ 21 , which implies that pulling tubes out of Lo phase membranes
requires a force 5 to 10 times higher than out of the Ld phase. In our experimental assay,
5

the biotinylated lipid used to anchor kinesins to membrane was equally distributed
within the Ld and Lo phases (illustrated in Fig. 2E for 3:1:3 GUVs), suggesting that
motors were able to pull on both phases. However, one expects that tubes should be
predominantly pulled out of the Ld phase since the force required is lower. This was
indeed the case since the majority of the tubes (90-100%) formed from segregated
vesicles of various composition (3:1:3, 1:0:3, 1:0:1 and 1:1:1 segregated sub-
population) were not only fluorescent, but also connected to the fluorescent phase (Figs.
2B and 2D), indicating that tubes were essentially made of Ld lipids. Even in the case of
3:2:1 GUVs highly enriched in Lo phase (representing between 2/3 and 3/4 of the
surface, see Fig. S1), the percentage of tubes grown from the fluorescent phase still
represented 50% of the total (Fig. 2D). Taken together, these data indicate that the
bending rigidity of Lo phase do not favor the formation of highly curved structures such
as membrane tubes. Thus, differences in ability to form curved structures can lead to
sorting.
We next investigated whether a sorting between Lo and Ld lipids occurred in
tubes grown from non-segregated vesicles. 1:1:1 GUVs were used from which tubes
were pulled out before inducing phase separation by photoactivation. If lipid sorting
does not occur upon pulling tubes, one expects that photoactivation should induce phase
separation within the tube in a way similar to that taking place on the vesicle.
Furthermore, if tube pulling was equally likely in both phases, about 50% of tubes
should also be connected to the fluorescent phase, according to surface ratio between
both phases on the vesicle. Instead, we found that 93% of the tubes observed after 75 s
under conditions of weak induction were still connected to the fluorescent phase (Fig.
2C, Fig. S3). In addition, tubes were already connected to the fluorescent domains after
6

15 s and no phase separation was observable along the tubes. It is thus likely that tubes
were enriched in Ld lipids. To further establish this point, we used conditions of strong
induction. In contrast to weak induction, we observed a phase separation along the tube
leading to fission events (see below). However, the non-fluorescent phase only
represented about 10% of the surface of the tube (Fig. 3A), indicating that Lo lipids
were depleted within the tube. Thus, the above data indicate that sorting of Ld and Lo
lipids can take place in growing tubes, most likely resulting from their sensitivity to
curvature and differences in bending rigidity of the two phases.
Interestingly, the induction of phase separation on tubes pulled out of 1:1:1 and
3:4:1 homogeneous GUVs provoked numerous fission events (Fig. 3A). More than 80%
of the networks showed at least one fission event for these two compositions. Strong
photoactivation led to a phase separation along these tubes, as shown by the appearance
of small non-fluorescent domains (Fig. 3A, small arrows). Fission events precisely
occurred on these non-fluorescent domains (Fig. 3A). In some cases, the fission process
led to the complete disappearance of tubes and to formation of small vesicles (movie
S1). No fission events were observed in tubes on which photoactivation does not induce
the formation of domains. This was the case for tubes grown from GUVs having a non-
segregated lipid composition (illustrated in Fig. 3B for 1:1:0 GUVs), or a segregated
composition containing cholesterol (3:2:1 and 3:1:3). The above data thus suggest a
direct link between phase separation along membrane tubes and fission. The fact that
tubes pulled out of 1:1:1 vesicles pre-incubated with MβCD prior to tube extraction in
order to induce phase separation (Fig. 1B) never exhibited fission events (Fig. 3C)
supports this hypothesis.
7

In good agreement with photoactivation experiments, fission events were also
observed when phase separation was induced within tubes by MβCD. Fig. 4A illustrates
an experiment showing that the addition of MβCD to tubes grown out of homogeneous
1:1:1 GUVs induced both phase separation and fission. As expected, no fission events
were observed when MβCD was added to tubes growing from non-segregated vesicles
(0:1:1, Fig. 4B, and 1:1:0, data not shown), or from segregated vesicles of 1:0:1 lipid
composition.
As depletion of cholesterol by photoactivation was of the order of a few %, it is
likely that there was no solid-ordered phase after induction of phase separation (Fig.
1A), as confirmed by the circular shape of the domains (Fig. S1A). Thus fission can
occur by phase separation between two liquid phases.
An important result of our experiments is that, when donor membranes have a
lipid composition near the frontier between segregated and non-segregated state, phase
separation occurring on membrane tubes lead to fission. A tentative hypothesis is that
this may be also true for biological membranes. As previously shown, our assay can be
used to generate tube networks after binding of kinesins to biotinylated Golgi
membranes 12 . Under control conditions, no obvious fission events can be observed. On
the other hand, the addition of MβCD induced fission on a significant proportion of
networks, as illustrated in Fig. 4C and 4D. Likely, as observed for model membranes,
the decrease in cholesterol favors phase separation of lipids present in Golgi-derived
membrane tubes, leading to their fission.
It has recently been shown that sorting of lipids by phase separation could
promote budding of domains on giant liposomes 22 . We show here that high
deformation of membrane into tubes can promote sorting of Lo and Ld lipids due to their
8

different sensitivity to curvature. Our data also show that fission of membrane can be
promoted by induction of phase separation within the tubes. Interestingly, this induction
requires the lipid membrane composition to be close to the phase transition. It is a
characteristic of many systems in biology to work at a limit of a phase transition to
increase their sensitivity. One can speculate that biological membranes competent for
intracellular transport behave in the same way. One of the main role of the numerous
proteins shown to be involved in sorting and fission events 23 could be then to favor
phase separation of membrane lipids.
METHODS
Reagents
Lipids (brain sphingomyelin, DOPC, cholesterol, and N-biotinyl-dioleyl-
phosphoethanolamine (Biot-DOPE) were purchased from Avanti Polar Lipids. BODIPY
530/550 C5-hexadecanoyl phosphatidylcholine, BODIPY-FL C5-hexadecanoyl
phosphatidyl-choline and NBD-C5-hexadecanoyl phosphatidylcholine were obtained
from Molecular Probes. All chemicals were purchased from Sigma Aldrich, except ATP
and GTP obtained from Roche Molecular Biochemicals. Streptavidin beads (100 nm)
were purchased from Bangs Laboratories (Carmel, IN). Biotinylated hemagglutinin-
kinesin (a gift of F. Nédélec, European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg) was
purified as previously described 24 .
9

GUVs
Giant unilamellar vesicles were grown using the electroformation technique 25 at
50°C to be over the melting temperature of sphingomyelins, which insures a good
mixing of lipids during the growth process. To make lipid mixes, BSM (M.W. 731 g)
and DOPC (M.W. 786 g) were considered to have the same molecular weight and
cholesterol (M.W. 387 g) half of it.
Assay for tube formation
Membrane tubes were pulled out of GUVs and Golgi membranes as previously
described 12 . All the experiments were performed at room temperature, typically 22°C.
Enriched rat liver Golgi membranes were purified according to standard procedure 26 .
3D fast microscopy
A set-up developed at the Curie Institute was used and previously described in
20 . No deconvolution process was used. For each tube network, 6 stacks of 80 to 100
images were acquired every 15 s, each image taken every 0.3 µm by a CoolSNAP HQ
camera (Princeton Instruments). Each image was acquired for 50 ms to 70 ms.
Photoactivation of phase separation
Two illumination conditions were used: Fast phase separation was obtained
using a HBO 100 Watt mercury lamp mounted on a Zeiss Axiovert 200 microscope, on
vesicles containing only 0.5% of the BODIPY-HPC probe. The lamp was used at 50%
of its maximal intensity with an excitation filter at 525 nm, generating a light intensity
of 3.5 mW (exit of the objective), and 100 images were acquired, 100 ms each, leading
10

to 10 s of intense photoactivation. Under these conditions, phase separation occurred
within a second and led to fission of tubes after several seconds (strong
photoactivation). Under the 3D fast microscope, a low light intensity (10 µW, exit of
the objective) at rhodamine excitation wavelength (545 nm) and 1% of fluorescent
marker (because 0,5% did not led to phase separation, as less oxidized cholesterol was
generated under these illumination conditions) allowed phase separation to occur within
10 s (weak photoactivation).
Photoactivation of lipids and thin layer chromatography (TLC) analysis
1 mg of 1:1:1 BSM-chol-DOPC containing 1% of BODIPY-lipid was
resuspended in 0.5 mL of water by vortexing for several min. Small Unilamellar
Vesicles (SUVs) were formed by continuous sonication for 3-4 min. SUVs were then
photoactivated by placing the eppendorf tube under a laser beam (250 mW, 25 mW or
0.6 mW) at 514 nm for 2 h. The intensity of laser used in figure S2 was 250 mW
(maximum). The suspension was dried in a speedvac after transfer to a glass tube, and
traces of water were removed by placing the tube overnight in a vacuum oven. Then,
lipids were resuspended in CHCL3, and analyzed on thin layer chromatography silica
plates (WHATMAN AL SIL G/UV, cat N°4420 222). To separate properly different
sterols, a mix of 95% CHCL3, 5% acetone was used. With this eluent, glycerolipids and
sphingolipids do not migrate. Sterols were revealed by 10% phosphotungstic acid in
90% ethanol and heating the plate at 90°C in an oven for 15 min. Quantities could not
be accurately measured with this chemical reaction, but about twice less oxidized
cholesterol was found for 25 mW, and more then 10 times less for 0.6 mW.
11

Estimation of tube diameter
We knew from previous electronic microscopy data that tubes made of Ld phase (Egg
Phosphatidylcholine) were typically 40 nm wide 12 , thus far below optical resolution of
photonic microscopes. From fluorescence images, 0:1:1 tubes (in Ld phase) were
estimated to be 260±4 nm wide. This value gives the minimal size measurable with this
technique, and thus the optical resolution. Any tube smaller than that would appear to
be 260 nm wide. We measured Lo phase tubes (1:1:0 composition) diameter to be
424±36 nm, above the optical resolution and thus reliable. Taken electronic microscopy
and fluorescence data together, we estimated the diameter ratio between a Lo and Ld
phase to be between 5 to 10 times.
Note: Supplementary Information is available on the Nature Cell Biology website.
Divx codec (dowloadable from www.divx.com) is needed to visualize .avi movies.
Acknowledgements
We thank the microscopy platform team of the Curie Institute, J.B. Sibarita, V. Fraisier,
J. de Mey and J. Salamero, for their valuable technical support. We thank J.F. Joanny,
I. Dérényi, for illuminating discussions. We also thank F. Perez, B. Antonny,
J.B. Manneville , O. Owar and K. Simons for critical reading of this paper.
This work was supported by CNRS grants (ACI "Dynamique et réactivité des
assemblages biologiques" et ACI "Nanosciences et nanotechnologies") and by the Curie
Institute (PIC "La Physique à l'Echelle de la Cellule").
12

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14

Figure legends:
Figure 1: A: Schematic phase diagram deduced from data obtained with 11 different
compositions of lipid mix. The gray area represents the predicted region where vesicles
show domains without photoactivation or treatment with MβCD. The white area
corresponds to homogeneous vesicles. Black dots: compositions showing phase
separation, white dots compositions that were homogeneous and not sensitive to
photoactivation and half-white, half-black dots: compositions at the frontier between
segregated and non-segregated states.
B: Induction of phase separation of lipids by strong photoactivation. Vesicles made of
only DOPC and cholesterol (0:1:1) do not exhibit formation of domains under
fluorescence excitation. In contrast, photoactivation of GUVs made of Brain
Sphingomyelin (BSM), cholesterol and DOPC (1:1:1) induces the apparition of small
domains that rapidly fuse together (see also movie S1 in online supp. Material).
Photoactivation had no effect when lipids were segregated by incubating GUVs in the
presence of 10 mM M CD. Time is in seconds. The scale bars represent 10 µm.
:
Figure 2: Sorting of lipids within membrane tubes. A: Tube grown from GUVs made
of only Lo phase (1:1:0) has a bigger diameter than the one originating from 0:1:1
GUVs Bar, 1 µm. B: Tubes pulled out of 1:1:1 segregated vesicle. The big arrow points
to a non-fluorescent domain and the thin arrow shows the connection of a tube with a
15

fluorescent domain. Bar, 10 µm. C: Tubes pulled out of 1:1:1 during phase separation
by weak photoactivation. Each photo is a projection of 6 images taken every 0.3 µm (all
photos are presented in Fig. S3). At time 0, the vesicle is homogeneous; highly
fluorescent dots (white) are streptavidin beads aggregated on membranes membranes.
Fluorescent domains appear at 15 s (less fluorescent than beads aggregates) and
increase in size (time 30 s and 45 s) and fuse (compare time 45 s and 60 s). Tubes are
connected to fluorescent domains as soon as they appear on the vesicle, leading to tubes
connected to large fluorescent domains at time 75 s. Bar 10 µm. D: Percentage of tubes
connected to the fluorescent phase versus lipid composition: 1:1:1 ind are homogeneous
1:1:1 GUVs on which phase separation was induced by weak photoactivation after tube
extraction (see Fig. 2C). 1:1:1 seg are segregated sub-population of 1:1:1 GUVs (see
Fig. 2B). For each lipid composition, between 60 and 120 tubes were examined. Of note
no measurements were performed on 3:0:1 vesicles as the two phases were intimately
interlaced, making difficult to determine to which phase tubes were connected.
Furthermore, tubes pulled out of these vesicles showed extensive spontaneous fission.
E: Segregation of fluorescent and biotinylated lipids on 3:1:3 GUVs: BOD-FL-HPC is
the fluorescent probe segregating in the Ld phase; biotinylated Cap-DOPE was detected
using Cy3-Streptavidin. Bar 10 µm.
Figure 3: Phase separation induces fission of tubes. A: Strong photoactivation of tubes
growing from 1:1:1 vesicles leads to tube fission. Fission events (big arrows)
predominantly occurred at the sites of formation of small non-fluorescent domains
resulting from phase separation (small arrows) (see also movie S2 in online supp. Inf.).
16

B and C: Fission events were not observed on tubes from 0:1:1 vesicles (B) or from
1:1:1 vesicles treated with 10 mM MβCD prior to tube extraction (C). Bars 10 µm.
Figure 4: A and B: The addition of 10 mM MβCD after tube extraction leads to fission
of tubes (big arrows) growing from 1:1:1 vesicles (A, see also movie in online supp.
Mat.), but not from homogeneous 0:1:1 vesicles (B). Time 0 corresponds to the
injection of MβCD. C: Injection of 10 mM MβCD on membrane tubes grown from
purified Golgi membranes leads to fission of tubes. Time is in seconds and 0
corresponds to the injection of MβCD. Golgi membranes visible at time 0 have been
flushed out the field of camera by MβCD flux. Arrow shows a fission event. D:
Percentage of networks grown from GUVs of various compositions and from Golgi
membranes showing at least one fission event after injection of MβCD. Bars 10 µm.
17

ROUX_NCB_figure1.jpg
18

ROUX_NCB_figure2.jpg
19

ROUX_NCB_figure3.jpg
20

ROUX_NCB_figure4.jpg
21

Supporting Online Information
Supporting online Figures legends:
Figure S1: Effect of composition on phase separation in GUVs.
A: Numbers correspond to the molar ratios of Brain Sphingomyelin, Cholesterol and
DOPC (BSM:Chol:DOPC), respectively. 1:1:1 S illustrates the segregated sub-fraction
of vesicles made with the 1:1:1 composition. Pre: homogenous sub-fraction of vesicles
made of 1:1:1, prior to photoactivation. Post: same vesicle as Pre, after 2 min. of weak
photoactivation. Large domains of several µm of diameter, are visible. B: Fluorescence
intensity ratio of fluorescent phase over non-fluorescent phase versus lipid composition.
Measurements were performed on 10-15 equatorial confocal planes of vesicles for each
lipid mix.
Figure S2: Effect of photoactivation on lipids. A: Thin layer chromatography (see
materials & methods) of 1:1:1 composition, without (NPA) and with (PA)
photoactivation, and cholesterol (Chol) as a marker. B: NPA lipids were used to grow
vesicles that are homogenous and photoactivable (sequence 1:1:1 NPA lipids). In
contrast, GUVs grown from PA lipids were segregated and not photoactivable
(sequence 1:1:1 PA lipids). Adding 6% cholesterol to the photoactivated mix, restores
homogeneity and photo-induction of phase separation (sequence 1:1:1 P.A. lipids +
cholesterol); Bars 10 µm.
Figure S3: Weak photoactivation of homogenous 1:1:1 GUV after tube extraction
22

Sections of the projected stacks from Fig. 2C (horizontal axis) and evolution with time
(vertical axis). Thin arrows show the apparition of small domains that grow and merge.
Large arrows show 2 connection points of tubes with the vesicle. These points were
connected to the fluorescent phase. See materials and methods for details about
acquisition.
Additional details on the phase separation induced by photoactivation:
The effect of photo-activation on lipids was tested using TLC for the 1:1:1 composition.
The BODIPY-C5-HPC probe was previously 1 shown to generate superoxide ions
during photoactivation that could oxidize surrounding molecules. TLC analysis showed
that a small amount of cholesterol was oxidized after strong photoactivation of 1:1:1
Small Unilamellar vesicles (SUVs) (Fig. S2 A). Oxidized cholesterol amount was
decreasing with light intensity, and was estimated to be more than 10 times less while
light intensity decreased by a factor 400 (data not shown). GUVs made of this strongly
photoactivated mix were segregated and not further photoactivable (figure S2 B). As
expected, lipids extracted from non-photoactivated SUVs produced homogenous and
photoactivable GUVs (Fig. S2 B). Oxidized forms of cholesterol probably interact with
sphingolipids in a different way than cholesterol itself, which interacts strongly with
sphingolipids via its hydroxide group. The induction of phase separation by photo-
activation was not observable with NBD-C5-HPC, a probe that do not generate
23

superoxide ions (data not shown). We further tested if phase separation was due to
cholesterol depletion, or to apparition of new species (i.e. oxidized cholesterol). To
discriminate between the two hypotheses, cholesterol was added to photoactivated lipid
mix. The addition of 2% cholesterol to the photoactivated lipid mix did not restore
homogeneity, whereas 6% cholesterol did. Photoactivation of these GUVs induced
phase separation with a small delay compared to non-photoactivated 1:1:1 mix,
probably due to a slightly higher concentration of cholesterol (Fig. S2 B). We
concluded that oxidized cholesterol did not prevent the membrane from being
homogenous and that the global effect of photoactivation was a depletion of cholesterol.
This depletion could be compensated by adding cholesterol and thus, we can estimate to
a few percent the amount of cholesterol being oxidized by strong photoactivation.
Movie Legends:
Divx codec (downloadable from www.divx.com) is needed to read these movies.
Movie S1: Fission induced by photoactivation on a 1:1:1 tube network. Numerous
fission events are observable, resulting in only small vesicles at the end.
Movies Fig 3A, Fig 4A and Fig 4C correspond to figures.
24

Supporting Online Information References
1. Solon, J. & Bassereau, P. (in preparation).
25

ROUX_NCB_figureS1.jpg
26

ROUX_NCB_figureS2.jpg
27

ROUX_NCB_figureS3.jpg
28

IV.3 Expériences complémentaires et discussion
Nous avons réalisé quelques expériences supplémentaires qui permettent de mieux
comprendre les lois physiques qui sont à l’origine du tri et de la coupure observés dans notre
système.
IV.3.1 Tri de lipides et courbure
IV.3.1.1 Mesures des rigidités de courbures par extraction de tubes
Nous avons vu au chapitre 2.2 que la force d’extraction et le rayon du tube ne
dépendaient que de la tension de la membrane et de sa rigidité de courbure, avec
R = κ 2σ
et f = 2π2κσ , où R et f sont respectivement le rayon et la force statique, et σ
et κ la tension et la rigidité de courbure. Comme nous l’avons vu au chapitre 2.1, la technique
de micropipette permet de fixer (et de mesurer) la tension de la membrane. De plus, il est
possible d’utiliser une bille piégée dans une pince optique pour extraire un tube, et de mesurer
par le déplacement de la bille, la force nécessaire pour extraire le tube (par exemple [157]). Le
principe de la pince optique est simple : un faisceau laser focalisé par un objectif peut tenir un
objet de l’ordre du micron et d’indice optique différent de celui du milieu. La pince peut être
décrite comme un ressort, et le déplacement d de la bille dépend de la force f qui lui est
appliquée avec f = Kd, où K est la constante de raideur de la pince, qui dépend linéairement
de l’intensité du laser qui piège la bille et donc K = KpP, où Kp est la rigidité par unité de
puissance laser, et P la puissance du laser.
177

Figure 52 : Formation d’un tube à partir d’une vésicule aspirée dans une micropipette et traction par une
bille piégée dans une pince optique. 1- la vésicule est aspirée dans la micropipette. 2- une bille est piégée
dans la pince optique et est collée sur la vésicule. On éloigne ensuite la pipette ce qui déforme la vésicule. 3-
après une transition brutale de la forme, on voit un tube très fin qui connecte la bille à la vésicule. Barre 10
µm.
Damien Cuvelier et Pierre Nassoy au laboratoire ont réalisé un montage alliant
technique de micropipette et pince optique, permettant l’extraction de tube en fixant la tension
178

de la vésicule. Ceci permet de mesurer directement à la rigidité de courbure, connaissant la
force et la tension avec
2 2
κ = f 8σ
π . Dans une série d’expériences préliminaires, et sans
mesurer précisément la tension (le dispositif de mesure étant encore en cours d’installation),
nous avons pu extraire des tubes à partir de vésicules en phase Ld ou Lo et montrer que pour
une tension du même ordre, la force était plus importante pour les vésicules en phase Lo. Pour
extraire un tube, on aspire d’abord une vésicule dans une pipette (n°1, figure 52). Puis on
piège une bille streptavidine de 3,5 µm dans la pince optique et on la colle sur vésicule qui
contient des lipides biotinylés (n°2 figure 52). Enfin, en déplaçant longitudinalement et
délicatement la pipette grâce à un micromanipulateur, on exerce une force localement sur la
membrane qui déforme la vésicule (n°2 figure 52), puis on observe une transition brutale de
forme qui conduit à la formation d’un tube (n°3 figure 52).
Pour pouvoir remonter à la rigidité de courbure, il faut pouvoir estimer la force
statique du tube, c’est-à-dire la force appliquée sur la bille une fois le tube formé. Grâce à un
programme développé à l’institut Curie par Konstantin Zeldovitch, nous avons pu suivre la
position de la bille et calculer son déplacement au cours de la formation du tube, et ainsi
remonter à la force appliquée sur la bille au cours du temps. De ces données, on peut tracer
deux types de courbes : la force en fonction du temps (figure 53A) au cours du déplacement
de la pipette et la force en fonction de la longueur du tube (figure 53B). On voit dans les deux
cas, que la force passe par un maximum, puis diminue brutalement pour atteindre une valeur
plateau, qui est la force statique du tube. En comparant les images (voir figure 52) et les
données sur la force (figure 53), on constate que la transition brutale de la force correspond à
la transition brutale dans la forme (formation du tube, voir figure 52). Ceci était prévu par la
théorie (voir chapitre 2.2.2) et déjà montré par le groupe de Marileen Dogterom [157]. Ici,
nous avons utilisé deux types de vésicules différentes. Pour des vésicules en phase Ld
(50%DOPC, 50% cholestérol, 0:1:1) et pour une tension de l’ordre de 10 -4 - 10 -5 N/m, on
mesure une force statique de l’ordre de 10 à 20 pN (voir figure 53A). Ce qui donne une
rigidité de courbure d’environ 5 à 10.10 -20 J, qui est la valeur mesurée par d’autres techniques.
Dans le cas de vésicules en phase Lo (50% sphingomyélines de cerveau, 50% cholestérol,
1:1:0), la force statique mesurée, pour le même ordre de grandeur de tension, est comprise
entre 50 et 100 pN. Ce qui donne une rigidité de courbure 25 à 100 fois plus grande que pour
la phase Ld. Ceci correspond bien au fait que nous avons également observé des tubes 5 à 10
fois plus larges pour la phase Lo que pour la phase Ld (voir article), ce qui donne également un
facteur 25 à 100 dans les rigidités de courbure.
179

Une analyse plus quantitative, avec une mesure précise de la tension est en cours, ce qui
permettra d’estimer plus précisément les rigidités de courbures pour des vésicules de
différentes compositions, et de tester entièrement expérimentalement la relation théorique
liant la force, la rigidité de courbure et la tension.
Figure 53 : Analyse de la force au cours de la formation d’un tube. A-diagramme Force en fonction du
temps au cours du déplacement de la pipette (vitesse non-constante) pour une vésicule en phase Lo (50%
DOPC, 50% cholestérol). Le plateau de force obtenu après le maximum donne une force statique d’environ
15 pN. B- diagramme Force en fonction de la longueur du tube pour une vésicule en phase Lo (50%
sphingomyélines, 50% cholestérol). Le plateau donne une force statique d’environ 50 pN (-20 pN est la
force appliquée sur la bille lorsque la vésicule est mise au contact de la bille).
Il est intéressant de noter que dans les expériences, le maximum de force est en
général de 50 à 250 % plus important que la force statique. Théoriquement, ce maximum de
force avait été calculé comme étant de 13% plus important que la force statique (voir chapitre
2.2.2, contact ponctuel). Dans nos expériences comme dans celles de l’équipe de Marileen
Dogterom [157], il semble que la valeur de ce maximum soit corrélée à la taille de la surface
d’adhésion entre bille et vésicule qui varie de quelques dizaines de nm 2 à quelques µm 2 . Plus
la surface d’adhésion est grande, plus le maximum est important. Ceci est probablement dû au
180

fait que si le rayon moyen de la surface d’adhésion est nettement supérieur au rayon du tube
final, il faudra passer pour former le tube par un intermédiaire de rayon au moins égal au
rayon de la surface d’adhésion. Or, comme la force est proportionnelle au rayon, plus le rayon
de la surface d’adhésion est grand, plus l’intermédiaire nécessitera une force importante pour
être franchi. D’où un overshoot plus important.
IV.3.1.2 Expériences avec la composition 3:4:1
Avec une composition proche de la transition non-ségrégé/ségrégé autre que la
composition 1:1:1 (sphingomyéline, cholestérol, DOPC), il est possible d’avoir des effets
intéressants. La composition 3:4:1 est très riche en sphingomyéline, et correspond à une
membrane homogène, et la séparation de phase est inductible par photoactivation comme pour
la composition 1:1:1. Cette composition se trouve dans une région du diagramme de phase où
la concentration en sphingomyéline est suffisamment importante pour que les vésicules
forment des gros tubes lorsqu’ils sont tirés à partir de la phase Lo. Nous avons raisonné
comme ceci : les vésicules 3:4:1 étant homogènes et riches en sphingomyéline, les tubes qui
poussent à partir de ces vésicules doivent être gros, si toutefois, la composition des tubes est
la même que celle des vésicules. Si au contraire, la formation des tubes enrichit la membrane
en lipides ségrégeant préférentiellement dans la phase Ld, alors les tubes seront petits.
Effectivement, les tubes qui poussent à partir des vésicules 3 :4 :1 sont petits au début,
mais grossissent avec le temps (voir figure 54).
Figure 54 : Les tubes tirés à partir de vésicules 3 :4 :1 grossissent au cours du temps. Le temps est en
minutes, La flèche montre un événement de coupure spontanée. De nombreuses rétractions sont observées.
Barre : 10 µm.
181

Leur diamètre augmente avec le temps jusqu’à devenir de l’ordre du demi-micron après
quelques minutes. L’explication que nous donnons à ce phénomène est que les tubes
lorsqu’ils sont en cours ou juste formés sont enrichis en lipides ségrégeant dans la phase Ld.
Puis, progressivement le tube s’enrichit en lipides constituant la phase Lo, ce qui tend à
augmenter dans le rayon du tube, puisque la rigidité de courbure augmente. Ceci est à relier
au fait que de nombreuses rétractions sont observées lors de l’épaississement des tubes. Si le
diamètre augmente, la rigidité de courbure augmente probablement, et donc la force exercée
sur le bout du tube aussi, expliquant les rétractions. Cependant, il est difficile de comprendre
pourquoi les lipides ségrégeant dans la phase Lo finissent par diffuser dans le tube, alors qu’ils
en ont été exclus lors de sa formation. Une expérience qui pourrait aider à répondre à cette
question serait de tirer des tubes avec la pince optique sur des vésicules 3 :4 :1 pour analyser
l’évolution de la force à tension fixée. Si les lipides Lo investissent le tube, alors la force
augmentera au cours du temps et sera un reflet de la dynamique de diffusion de ces lipides
dans le tube.
IV.3.2 Séparation de phase et coupure
Nous avons vu que l’induction d’une séparation de phase le long du tube pouvait
provoquer la coupure de ce tube au point précis d’apparition des domaines de phase Lo. Ceci
ne nécessite aucun apport d’énergie à partir du moment où la séparation de phase a été
provoquée. Alors que dans le cas de membrane à un composant il faut des énergies très
grandes pour couper la membrane, la fission semble spontanée sur des membranes pouvant
ségréger. C’est donc un mécanisme peu coûteux en terme d’énergie, et donc bien approprié
aux conditions cellulaires. Il est donc important de comprendre quels phénomènes physiques,
et quelles énergies sont mises en jeu dans le mode de fission que nous observons.
IV.3.2.1 La fission a lieu à la frontière entre les domaines.
Une des questions importantes est de savoir où précisément a lieu la coupure sur le
tube. Avec la composition 1:1:1, les domaines Lo qui apparaissent sont trop petits pour
pouvoir distinguer si la coupure a lieu dans le domaine Lo ou à la frontière entre les domaines
Lo et Ld. Comme nous l’avons vu dans le paragraphe précédent, les tubes qui poussent à partir
182

de vésicules de composition 3:4:1 sont petits au début, puis grossissent après plusieurs
minutes. Cependant, les vésicules restent « inductibles », et il est donc possible à tout moment
d’induire la séparation de phase le long de ces tubes par photoactivation forte. Si on induit la
séparation de phase sur les tubes fins (c’est-à-dire qui viennent juste de se former), ce qu’on
observe n’est pas différent de ce que l’on observe avec la composition 1:1:1. Les domaines
induits sont petits, et la zone de coupure est difficile à déterminer. Si l’on induit la séparation
de phase sur des tubes qui ont fortement grossi, on peut alors observer la zone de fission avec
plus de précision (voir figure 55): l’induction de la séparation de phase provoque l’apparition
d’un tube fin très fluorescent (Phase Ld) au bout du tube. Ce tube est connecté au gros tube
par une zone en forme d’épaule (voir figure 55). C’est à cette jonction qu’a précisément lieu
la fission. Ceci suggère que la jonction entre les deux domaines est une zone de fragilité
importante. Les deux phénomènes qui pourraient expliquer que cette zone soit un endroit de
rupture sont l’existence d’une tension de ligne entre les deux domaines (voir 2.3.1.3), et/ou
que l’une des deux phases soient exclue des zones de courbure gaussienne négative
(2.3.1.4.2).
Figure 55 : Induction de séparation de phase par photoactivation sur des gros tubes tirés à partir d’une
vésicule de composition 3:4:1. Un petit tube apparaît à son bout, et la coupure a lieu à la jonction entre le
petit et le gros tube (flèche). Barre 5 µm. 1 photo/2s.
183

IV.3.2.2 Fission par séparation de phase : mécanismes possibles
Deux paramètres importants peuvent expliquer la fission dans une zone proche de la
connection entre un tube de composition A et un tube de composition B : s’il existe une
tension de ligne entre les deux types de domaines, elle va avoir tendance à resserrer le tube au
niveau de la connection, provoquant un pincement fort conduisant à la fission. L’autre
paramètre important est la courbure gaussienne. Nous avons vu au 2.1 que le théorème de
Gauss-Bonnet permettait de calculer que l’énergie associée à la courbure gaussienne d’une
membrane à un composant et fermée (comme les vésicules) était une constante qui dépendait
de sa topologie. Dans le cas des vésicules à domaines, cette énergie n’est plus une constante et
dépend fortement de la forme de la vésicule, mais aussi, comme pour la tension de ligne, de la
longueur de l’interface entre les domaines. Cornélis Storm, Jean-François Joanny et Jacques
Prost au laboratoire en collaboration avec Jean-Marc Allain et Martine Ben-Amar à l’ENS ont
pu simuler la forme prise par l’interface entre les deux parties d’un tube constitué de deux
phases en tenant compte de ces deux paramètres. On considére dans un premier temps que les
modules de rigidité sont identiques dans les deux phases. Il faut donc ajouter dans
l’expression de l’énergie d’un tube donnée par l’équation 2.17, deux termes : un qui dépend
de la tension de ligne τ, et un qui dépend de la différence de module de rigidité de courbure
gaussienne ∆κ
. On obtient :
G
κ
H = c + dA− fL+ r +∆
2
2
∫ ( (2 ) σ) 2 π( τ 0 κGcos(
0))
ψ (4.1)
où r0 est le rayon de l’interface entre les deux domaines et ψ0 l’angle que fait à la normale la
tangente à la membrane au niveau de l’interface (voir figure 56). Il est relativement simple de
calculer la forme prise par le tube dans le cas où la différence de module de courbure
gaussienne est nulle ( ∆ κ = 0 ), et le cas où la tension de ligne est nulle (τ = 0). La figure 56
G
montre les formes prises par le tube dans ces deux cas. Dans les cas, le tube présente un
pincement.
184

Figure 56 : Formes prises par la zone de connection entre deux tubes de compositions différentes A (rouge
ou jaune) et B (bleu ou violet) de même rigidité de courbure. A- La différence de module de courbure
gaussienne est nulle ( ∆ κ = 0 ) et la tension de ligne domine. L’interface est située exactement au
G
pincement (r0
= rneck, le rayon minimal) entre les deux tubes. B- La tension de ligne est nulle, et l’interface
n’est pas située au pincement le plus fort, mais un peu en retrait. Merci à Cornélis Storm.
Cependant, dans les deux cas, la zone de coupure n’est pas située au même endroit :
lorsque la tension de ligne domine, l’interface située entre les deux domaines est exactement
située à l’endroit du pincement le plus fort de la membrane (figure 56A). Dans le cas du
pincement par courbure gaussienne, l’interface n’est pas située exactement à l’endroit de
rayon le plus faible, mais en retrait du coté où se trouve le domaine de rigidité de courbure
(gaussienne) la plus grande. Mais la différence de localisation entre les deux cas est inférieure
au diamètre du tube, qui est lui-même de l’ordre de la cinquantaine de nm, soit bien inférieure
185

à la résolution optique, et nous n’avons pu, pour l’instant déterminer quel était le paramètre
dominant (tension de ligne ou différence de module de courbure gaussienne) dans nos
expériences. Néanmoins, ces calculs permettent déjà d’expliqer théoriquement que si une
séparation de phase intervient dans un tube, elle va induire la déstabilisation par l’un ou
l’autre (ou les deux à la fois) de ces mécanismes.
IV.3.3 Couplage tri-coupure
Nous avons vu que pour les compositions qui sont proches de la transition, une
induction de la séparation de phase provoquait une fission du tube. De plus, le fait de former
un tube exclut certains lipides de la membrane qui constitut le tube. Il est possible d’envisager
qu’il existe des points du diagramme de phase où la modification de la composition
membranaire due à la courbure puisse entraîner le passage d’un état homogène à un état
ségrégé dans le tube, si la composition est proche de la transition. La déformation de la
membrane pouvant alors induire un tri provoquant la fission par induction de séparation de
phase.
Inversement, comme nous l’avons vu précédemment, l’induction de la séparation de
phase sur une vésicule peut provoquer le bourgeonnement des domaines (voir 2.3.1.3). Dans
ce cas, la séparation de phase induit la déformation. De même, une fois formé, le bourgeon
peut se couper de la membrane, pour les mêmes raisons que pour les tubes.
Nous allons voir que pour une composition proche de la transition bien choisie, nous
avons observé ces deux phénomènes, déformation qui induit le tri et la coupure, ou tri qui
induit déformation et coupure.
IV.3.3.1 La composition 3:4:1 couple déformation, tri et coupure
Nous avons vu que la composition 3:4:1 a été utile pour comprendre les mécanismes
de tri par courbure. Au cours de cette étude, de nombreux évènements de coupure spontanée
ont été observés (voir figure 54). Souvent, ces coupures ont eu lieu à la jonction entre un gros
tube et un petit tube qui résultait probablement d’une séparation de phase spontanée (aucune
photoactivation n’ayant été utilisée) (voir figure 57A).
186

Figure 57 : Induction de séparation de phase associée au tri par courbure. A-Tube tiré à partir d’une
vésicule 3:4:1 et présentant un gros tube connecté à un petit. Le renflement se déplace jusqu’au bout du
tube, puis un événement de coupure apparaît à la jonction entre gros et petit tube. Le temps est en secondes,
barre 1 µm. B-Le tube tiré à partir d’une composition 3:4:1 s’enrichit progressivement en lipides ségrégeant
dans la phase Ld, (DOPC augmente) ; la composition du tube varie à partir de 3 :4 :1 selon la flêche rouge, et
permet le passage de la limite de phase.
Au vu de la position particulière dans le diagramme de phase de la composition 3:4:1,
il est facile de comprendre que l’enrichissement en lipides ségrégeant dans la phase Ld
(principalement du DOPC) peut déplacer la composition 3:4:1 du tube vers la droite du
diagramme selon la flèche rouge (figure 57B), et ainsi provoquer une séparation de phase
conduisant à la fission. Ainsi, pour la composition 3:4:1, nous avons un système
automatique : dès que un tube se forme, une sélection des lipides pouvant entrer dans le tube
s’opère, et du fait de la composition de la membrane, une séparation de phase apparaît, qui
provoque la fission. C’est un système qui, sans intervention extérieure possède les trois
propriétés nécessaires à la formation des intermédiaires de transport, à savoir déformation, tri
et fission. Du fait de la position particulière de la composition membranaire dans le
diagramme de phase, ces propriétés sont couplées les unes aux autres, ce qui pourrait se
révéler très avantageux dans un cadre cellulaire.
187

La deuxième observation que nous avons faite est que l’induction de la séparation de
phase par photoactivation sur ces vésicules provoquait (si la vésicule était relativement petite)
un bourgeonnement des domaines Ld suivi de fission (voir figure 58). Comme vu au 2.3.1.3,
la séparation de phase provoque l’apparition d’une tension de ligne qui fait bourgeonner les
domaines. Ici, si la vésicule est suffisamment petite, le bourgeonnement provoque
l’augmentation de la tension de la membrane. Un pore transitoire se forme alors [156] et
permet une chute de la tension de la membrane, suite à la perte de volume (on voit une
réduction du diamètre de la vésicule entre les temps 0 et 0,2 seconde sur la figure 58).
Figure 58 : Bourgeonnement et fission des bourgeons par induction de la séparation de phase sur une
vésicule 3:4:1. Après 10s de photoactivation forte (temps 0s), les domaines Ld apparus bourgeonnent (temps
0,2s), probablement suite à la rupture de la membrane entraînant une chute brutale de la tension. Ce
bourgeonnement est suivi par la fission des bourgeons, qui diffusent alors librement dans la solution. Le
temps est en secondes, Barre 10 µm
Cette chute de la tension permet au bourgeon de se refermer pour minimiser la tension
de ligne. L’interface entre les domaines se retrouvant au cou de la vésicule, le cou se coupe,
permettant aux bourgeons de diffuser librement dans la solution. Ceci est le même phénomène
que celui reporté par [143]. Mais la fission est plus évidente sur nos images.
188

IV.3.3.2 Implications pour la biologie
Il est bien sûr tentant d’imaginer que la composition des membranes biologiques est
proche d’une transition, ce qui permettrait de coupler tri, courbure et déformation. Comme
nous l’avons vu au 4.1, le fait que la cyclodextrine puisse couper des tubes tirés à partir de
membranes golgiennes laisse supposer que la cyclodextrine provoque la séparation de phase
sur les membranes golgiennes et que ces membranes sont donc proches de la transition. De
plus, une étude a montré que l’utilisation de cyclodextrine sur des cellules provoquait
l’apparition de domaines géants (Ld et Lo) de plusieurs microns de diamètre [162], (voir figure
59). Ceci pourrait signifier que la membrane des cellules est proche de la transition.
Surtout, la plupart des voies de transport sont bloquées par une modification très fine
de la concentration en cholestérol : c’est le cas pour l’endocytose par clathrine, mais aussi
pour l’endocytose indépendante de la clathrine [92]. De plus, l’accumulation de cholestérol
dans les endosomes des cellules de patient atteint du syndrome de Niemann-Pick empêche la
formation d’intermédiaires de transport [63,163]. De même, des données récentes ont montré
que l’export des protéines dans des vésicules COP était très sensible à la variation de la
concentration membranaire en cholestérol [164]. Tous les éléments actuels permettent de
soutenir l’idée qu’une régulation très fine de la quantité de cholestérol dans les membranes
cellulaires est nécessaire pour toutes les voies de transport connues à l’heure actuelle. Une
possibilité est que ceci soit lié à la nécessité de maintenir la membrane dans un état proche de
la limite de phase.
189

Figure 59 : Un marqueur de phase ordonnée (DiIC16) et un marqueur de phase fluide (DiIC12) sont utilisés
sur des fibroblastes. A à C : Le marquage membranaire des cellules non-traitées à la cyclodextrine apparaît
uniforme. D à F : les cellules traitées à la cyclodextrine présentent des domaines supérieurs au micron en
taille et les deux marqueurs ségrégent dans des phases différentes. D’après [162].
Un autre argument important est que comme nous l’avons vu, la taille des domaines
dans les cellules est difficile à déterminer, et sans doute très variable. De nombreux
phénomènes de signalisation nécessitent le regroupement de protéines d’adhésion par fusion
de rafts dans des domaines de la taille du micron [165]. Or, une membrane proche de la
transition (de composition 1:1:1) présente des domaines très petits mais stables, observables
par microscopie de force atomique [166]. La taille des domaines dépend donc fortement de la
concentration en cholestérol : loin de la transition, les domaines sont plus grands et la taille
relativement conservée sur une grande gamme de composition si la composition est ségrégée,
et si la composition est non ségrégée, aucun domaine n’est visible. On peut probablement
attribuer la présence de domaines petits et de taille modulable (les rafts) dans les membranes
cellulaires au fait que les membranes soient proches de la transition.
190

Une hypothèse très générale pour le fonctionnement du trafic intracellulaire et basée
sur le fait que les membranes sont proches de la transition entre un état ségrégé et non-ségrégé
pourrait être la suivante : toutes les membranes des différents organites organites, de
compositions différentes, sont dans un état homogène (petits (quelques dizaines de nm)
domaines ou pas de domaines du tout), mais proches de la transition. Tous les composants de
la membrane sont ainsi mélangés. Lors de la formation d’un bourgeon, la courbure de la
membrane et/ou l’action de protéines intervenant dans le trafic intracellulaire provoque
localement une séparation de phase qui permet le tri des éléments à exporter, et la fission du
bourgeon (voir figure 60). Cette séparation de phase provoque l’apparition d’un « raft » de
composition 1 dans une membrane de composition différente (A, figure 60).
A
RAFT DE
COMPOSITION 1
RAFT DE
COMPOSITION 2
B C
Figure 60 : Pour passer de A à C, le composé violet peut s’associer à un raft de composition 1 (rouge) formé
transitoirement pour le transport de A à B, et un raft de composition 2 (jaune) aussi formé transitoirement
pour le transport de B à C.
Lorsque le bourgeon fusionne avec le compartiment B, les composants du
bourgeon/raft de composition 1 peuvent se mélanger à la membrane de B car sa composition
est adaptée pour que les lipides de la vésicule 1 ne ségrégent pas. L’élément violet (voir figure
60), qui avait été enrichi dans le bourgeon 1 car ségrégeant préférentiellement dans les rafts
de composition 1 peut alors diffuser dans la membrane B. La formation d’un bourgeon à
partir de B en direction du compartiment C provoque une séparation de phase et la formation
d’une vésicule/raft de composition 2, différente de 1. L’élément violet peut s’associer à ce raft
191

et peut donc être acheminer jusqu’au compartiment C. Le point important est que la formation
transitoire de domaines au cours de la formation des intermédiaires de transport, permet de
trier rapidement et efficacement des protéines et des lipides ayant la même destination. De
plus, cela permet la formation de domaines de compositions différentes et adaptées à chaque
étape de transport. Les cargos qui transitent par plusieurs voies doivent avoir une affinité pour
chacun des domaines par lesquels ils voyagent. C’est cette affinité qui garantit la destination.
Les protéines intervenant dans le trafic intracellulaire pourraient induire la séparation de
phase par plusieurs mécanismes. Le plus simple est celui décrit pour les caveolae, où la
caveoline se liant au cholestérol et formant un manteau, provoquerait la séparation de phase
en changeant localement la concentration en cholestérol [94]. Un autre mécanisme
fonctionnant sur le même principe, pourrait être que la fixation de manteau à la membrane
concentre localement des protéines transmembranaires qui préfèrent une certaine composition
lipidique, induisant la séparation de phase. Ce pourrait être le cas des cargos KKXX se liant à
COP I, et qui pourraient préférer les membranes de phase Ld, expliquant l’appauvrissement
des vésicules COP I en sphingolipides et cholestérol [77]. De nombreuses protéines
intervenant dans les étapes du trafic intracellulaire se lient à des protéines transmembranaires
et/ou à des lipides. C’est le cas par exemple pour les complexes APs, la dynamine, les
protéines Rabs.
Un autre mécanisme pourrait être une modification enzymatique locale de la
composition de la membrane au cours de la formation de l’intermédiaire de transport, qui
induirait la séparation de phase. Les enzymes modifiant les lipides telles que la
PhosphoLipase A2 ou les LysoPhospholipides Acyl Transférases (comme l’endophiline)
pourraient aider respectivement la tubulation et la fission en provoquant une séparation de
phase.
Le point le plus délicat de cette hypothèse est comment réguler la composition des
membranes pour qu’elle reste proche d’une transition. Le fait d’être proche d’une transition
rend le système instable, car il peut à tout moment passer de ségrégé à non ségrégé. Il est
probable qu’une régulation puissante a lieu en permanence dans les membranes des cellules
puisque les domaines géants induits par cyclodextrine sur des fibroblastes disparaissent en
quelques minutes après retrait de la drogue [162]. Le point que je considère comme important
est que les membranes des cellules étant hors d’équilibre, avec un apport constant de matériel
et également un flux sortant constant, il est possible que leur composition moyenne change
très peu. Mais cela implique que la régulation fine de la composition des membranes dépend
de la régulation fine des voies de transport, ce qui ne fait que déplacer le problème.
192

IV.3.4 Conclusion
Nous avons vu qu’en choisissant judicieusement la composition des membranes que
nous utilisions pour notre système minimal, il était possible de trier les lipides et de couper les
tubes de membranes, sans autre composant supplémentaire. Ainsi, ce système très simple a les
trois caractéristiques essentielles nécessaires aux premières étapes du trafic intracellulaire,
déformation, tri et coupure des membranes.
Nous avons vu que certaines compositions proches de la transition de phase pouvaient
coupler déformation, tri et coupure, et ainsi constituer des compositions particulièrement
favorables à la formation d’intermédiaires de transport. Certains faits expérimentaux laissent
supposer que les membranes cellulaires auraient des compositions proches de la transition.
Cependant, une étude précise permettant de montrer que la composition de la membrane est
proche de la transition et de comprendre la régulation de cette composition reste à
entreprendre.
193

Conclusion générale
tubes de membranes tirés à partir de membranes golgiennes par des moteurs moléculaires fixés par de la
streptavidine fluorescente (rouge).
195

Nous avons vu que les membranes lipidiques ont été intensément étudiées par les
biologistes et par les physiciens, mais leurs descriptions des membranes sont encore très
différentes. Les biologistes se sont attelés à identifier précisément les composants
membranaires ainsi que les protéines modifiant la forme et la composition de la membrane.
Les physiciens se sont quant-à eux intéressés à comprendre et à mesurer les différents
paramètres mécaniques et élastiques des membranes en général, avec une approche
mésoscopique et non moléculaire. Ces deux approches sont extrêmement complémentaires et
leur confrontation se révèlera (je l’espère) très enrichissante.
Au cours de mon travail de thèse, je me suis intéressé à reproduire in vitro certaines
étapes du trafic intracellulaire, dans le but de dégager les paramètres physiques importants
dans le cadre du trafic intracellulaire. Une première partie du travail a été l’établissement d’un
système in vitro reproduisant la formation de tubes à partir de membranes par l’action de
moteurs moléculaires greffés sur la membrane. Puis, en choisissant judicieusement la
composition de la membrane, nous avons pu montrer qu’il était possible de trier certains
lipides dans les tubes en formation, en fonction de leur affinité pour les structures courbées.
Nous avons également montré que l’induction de la séparation de phase dans les tubes pouvait
provoquer la coupure des tubes. Ainsi, nous avons réalisé un système in vitro capable de
reproduire les trois phénomènes importants aboutissant à la formation d’un intermédiaire de
transport : déformation de la membrane, tri des éléments membranaires et coupure de la
membrane.
Nous avons vu qu’un point critique de notre système est la composition lipique. Pour
certaines compositions, on a pu observer un couplage entre les trois phénomènes : la
déformation de la membrane par les moteurs entraine un changement de composition qui
entraine lui-même la séparation de phase et la coupure. Ce couplage nécessite que la
composition de la membrane soit proche de la transition de phase, mais peut être très utile
dans un cadre cellulaire car c’est un système auto-régulé.
Pour aller plus loin, il faudrait revenir aux cellules, et montrer que les membranes
biologiques sont proches d’une transition passant d’un état homogène à un état ségrégé par
petites variations de sa composition. Il faudrait également montrer qu’il y a induction de
séparation de phase au cours de la fission des bourgeons. Une étude approfondie de l’état des
membranes biologiques in vivo au cours de la formation des intermédiaires de transport
pourrait permettre de mieux comprendre le rôle de la séparation de phase dans la coupure,
mais également le rôle de la courbure dans le tri in vivo.
197

D’une manière générale, le sujet de cette thèse s’est particulièrement bien prêté à
l’interaction entre biologie et physique, et entre biologistes et physiciens. Ce fut une grande
aventure de pouvoir faire discuter autour d’une même table des biologistes, des physiciens
expérimentateurs et des théoriciens. J’ai pu mesurer parfois l’écart qu’il existe entre
l’approche « physicienne » et l’approche « biologiste » d’un même sujet, mais aussi combien
le dialogue qui a pu se nouer entre ces deux communautés a été enrichissant pour moi.
J’espère qu’il l’aura été également pour tous les gens qui m’ont entouré durant ces quatre ans
à l’Institut Curie.
198

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Annexes
tubes tirés par des moteurs moléculaires à partir de membranes golgiennes. MET grossissement environ 200 000
fois.
209

annexe 1 : protocole de
purification de la kinésine
biotinylée
211

annexe 2 :purification de la
tubuline
217

Abstract :
In the fifties, the discovery of internal membranous structures in eucaryotic cells with
the improvement of electron microscopy led to the question of how this organelles could
exchange material one with another. In the following years, small spherical vesicles that were
about 80 nm wide were shown to bud from a donor compartment before being transported to
and fusing with acceptor one. More recently, using fluorescence techniques on living cells,
membrane tubes or tubules that are cylinders of several microns long and as wide as small
vesicles have been observed, defining a new type of transport intermediates.
Three fundamental questions linked to the formation of these intermediates have been
studied during the last three decades: i- how can the membrane be deformed into sphere or
tubes ? ii- how can the membrane components that have to be exported are sorted and
enriched within the bud ? iii- how can the bud be separated from the donor membrane ?
To understand which physical properties of membranes are important for the
formation of these transport intermediates, we reproduced in vitro the formation of membrane
tubes with purified elements. Formation and elongation of tubules are dependant in vivo on
molecular motors that walk on cytoskeleton filaments. By fixing kinesins on giant liposomes
and by allowing them to walk on a microtubule network, we observed the formation of
membrane tube, and studied their dynamics and the shape of the membrane tube network.
This very simple system allowed us to understand how physical parameters can influence tube
growth.
This system mimicking the first step of membrane tube formation, we then studied the
sorting and the membrane fission process. By changing the membrane composition to be
closer to the one of cellular membranes, we could reproduce a lipid phase separation that had
already been observed. We then showed that differences in bending rigidity between the two
phases could explain a selective enrichment within the tube of lipids belonging to the less
rigid phase. We also observed that induction of a phase separation within the tube led to
fission t the boundaries between domains.
This system is a very simple system that reproduces the three elementary steps of any
transport intermediate formation, which are deformation, sorting and fission of membrane. It
allows us to understand qualitatively and quantitatively the rules of physics that are useful for
transport intermediate formation.

Résumé :
La découverte de structures membranaires internes dans les cellules eucaryotes dans
les années cinquante grâce à l’avènement de la microscopie électronique, a posé
immédiatement la question des échanges entre ces différents compartiments. Rapidement, il a
été montré que de petites vésicules sphériques d’environ 80 nm de diamètre bourgeonnant du
compartiment donneur pouvaient être acheminées et fusionner avec un compartiment
accepteur. Plus récemment, grâce à des techniques de fluorescence sur cellules vivantes, il a
été observé un autre type d’intermédiaires de transport : des tubes ou tubules de membranes,
qui sont des cylindres de plusieurs microns de long et d’un diamètre équivalent aux petites
vésicules.
Trois questions fondamentales attachées à la formation de ces intermédiaires de
transport ont été étudiées durant les 30 dernières années : i- comment la membrane peut-elle
se déformée en sphère ou en cylindre ? ii- comment les éléments à exporter sont-ils triés et
concentrés dans le bourgeon ? iii- comment le bourgeon est-il séparé de la membrane
donneuse ?
Pour comprendre quelles propriétés physiques de la membrane sont importantes pour
la formation de ces intermédiaires de transport, nous avons reproduit in vitro la formation de
tubes de membrane avec des éléments purifiés. La formation et l’allongement de tubules sont
dépendants in vivo de moteurs moléculaires se déplaçant sur des filaments de cytosquelette.
En fixant des moteurs moléculaires de type kinésine sur des liposomes artificiels géants et en
leur permettant de se déplacer sur un réseau de microtubules, nous avons observé la formation
de tubes de membranes, et avons étudié leur dynamique et la structure du réseau obtenu. Ce
système très simple permet de comprendre dans quelle mesure les paramètres physiques de la
membrane peuvent influencer la croissance des tubes.
Ce système mimant la première étape de la formation des tubules de membrane, nous
sommes par la suite attaché à reproduire les étapes de tri et de coupure. En changeant la
composition membranaire pour approcher la composition des membranes cellulaires, nous
avons pu reproduire une séparation de phase lipidique déjà observée précédemment. Nous
avons alors pu montré que les différences de rigidité de courbure mesurées entre les deux
phases permettent d’expliquer l’enrichissement sélectif des tubes en lipides de la phase la
moins rigide. Nous avons également observé que si une séparation de phase était induite dans
le tube, alors le tube se coupait spontanément à la limite entre les domaines apparus.
Ce système est un système très simple qui reproduit les trois étapes élémentaires de la
formation d’un intermédiaire de transport, à savoir, déformation, tri et coupure de la
membrane. Il permet une compréhension qualitative et quantitative de la physique utile à la
formation des intermédiaires de transports.