ECOLE DOCTORALE ABIES THESE

Institut National Agronomique Paris-Grignon 

ECOLE DOCTORALE ABIES 

THESE 

présentée par 

Christel LEYRONAS 

pour l'obtention du grade de Docteur 

de l' Institut National Agronomique Paris-Grignon 

Spécialité : Phytopathologie 

AVANCEES DANS LA COMPREHENSION 

DES NEOTYPHODIUM ET EPICHLOE, CLAVICIPITACEES ENDOPHYTES 

DES GRAMINEES FOURRAGERES ET À GAZON. 

METHODES DE LUTTE. 

Soutenue le 26 mai 2005 

Président B. TIVOLI Ingénieur de Recherche, INRA Rennes 

Rapporteurs J.L. NOTTEGHEM Professeur ENSA.M 

Y. BARRIERE Directeur de Recherches, INRA Lusignan 

Examinateurs G. RAYNAL Professeur INA-PG 

J.M. SENG Maître de Conférences Université Paris-Sud, 

Directeur Biotransfer 

G. SICARD Directeur Technique FNAMS 

INRA, UMR Epidémiologie végétale et écologie des populations, 78850 

Thiverval-Grignon

REMERCIEMENTS 

En Ardèche (où je suis née) on a une devise : "Mountaren tan que pourren" (Nous 

monterons tant que nous pourrons). Cette devise ne trahit pas une pensée carriériste mais une 

volonté de bien faire, autant que l'on peut. 

Parmi les ardéchois célèbres qui ont essayé de faire au mieux, on trouve d'illustres 

ancêtres, très doués en peintures rupestres, qui décoraient les grottes des gorges de l'Ardèche. 

A une autre époque, il y a eu aussi Olivier de Serres qui a participé à l'évolution de 

l'agronomie (non, non, cete thèse n'est pas sponsorisée par l'Ofice du tourisme…). 

Bien modeste est ma contribution comparée aux leurs. J'ai cependant essayé de faire 

au mieux avec ces drôles de bestioles répondant aux doux noms de Neotyphodium et 

d'Epichloe, qui cachent des trésors de complexité. Force est de constater que pour monter tant 

qu'on peut, il faut être bien entouré. J'ai l'occasion sur cette page de remercier les personnes 

qui m'ont accompagnée dans ce cheminement qu'est une thèse. 

L'idée de faire une thèse fut lancée au détour d'une conversation. J'avoue, au début je 

n'y ai pas cru. Aujourd'hui je mesure combien il était important d'aller au bout. Ainsi je veux 

témoigner mon immense gratitude au Professeur Guy Raynal qui m'a poussée à me lancer 

dans cette aventure, qui m'a guidée, conseillée et accompagnée jusqu'au bout. Je remercie 

aussi vivement la Professeur Claire Neema qui m'a accueillie dans son laboratoire, et avec 

Igor Pucheu, encadrée pour la biologie moléculaire. 

Je remercie également les membres du jury Mrs Y. Barrière, J.L. Notteghem, J.M. 

Seng, G. Sicard, et B. Tivoli, d'avoir accepté de consacrer un peu de leur temps pour me 

permettre de finaliser cette expérience professionnelle. 

A coté de l'INRA, j'ai une deuxième famille professionnelle que je veux 

chaleureusement remercier : Jean Paul Janson, Benoit Mériaux, François Deneufbourg, et 

Louis Marie Broucqsault de la FNAMS. Je dois leur dire à quel point j'ai apprécié leur 

gentillesse, leur disponibilité, les échanges que nous avons eus et les sorties sur le terrain. 

Enfin, je n'oublie pas le CETIOM qui m'a permis de réaliser des expériences de 

biologie moléculaire dans ses locaux. 

Les graminées et les légumineuses c'est sympa mais ça n'a pas beaucoup de 

conversation alors je remercie affectueusement mes amis pour leur présence et leur 

bienveillance et ainsi, bien que déracinée, je ne me suis pas complètement étiolée : Estelle, 

Christine, Corinne et Olivier, Alban et Isabelle, Delphine, Samuel, Christelle, Sandrine. 

Enfin, là bas, sous le mistral il y a ma famille et mes racines. Bien des fois les petits et 

les grands m'ont manqué et ils me manquent tous encore. Pouvoir les retrouver de temps en 

temps avec une cure de ciel bleu et de cigales est un remontant particulièrement efficace. 

Je remercie particulièrement Georges et Marie Rose qui ont été très importants sur le 

chemin vers la vie professionnelle. Je remercie mon frère pour avoir été le témoin bienveillant 

de mes grains de folie. Et enfin je voudrais dire à mes parents combien leurs encouragements 

et leur soutien ont toujours été mon moteur pour aller de l'avant. Voilà, j'espère que la fin de 

cette thèse s'accompagnera d'autres changements. Ceci étant accompli, construisons un autre 

chapitre de vie…. 

Et si je commençais par trouver une grotte ardéchoise pour y peindre quelques 

mycéliums endophytes?

LISTE DES PUBLICATIONS EN RAPPORT AVEC LA THESE PRESENTEE 

REVUES SCIENTIFIQUES 

C. LEYRONAS, G. RAYNAL, 2002. Presence of Neotyphodium-like endophytes in 

European grasses, Annals of Applied Biology 139: 119-127 

C. LEYRONAS, B. MERIAUX, G. RAYNAL, 2005. Chemical control of Neotyphodium sp. 

endophytes in perennial ryegrass and tall fescue seeds. (accepté le 28/03/05, Crop Science) 

COMMUNICATIONS A CONGRES 

C. RAVEL, J.J. GUILLAUMIN, A. DURIX, G. RAYNAL, C. LEYRONAS, S. BONY, 

1999. Recherches effectuées à l'INRA sur les champignons endophytes des graminées 

fourragères. Rencontres des Microbiologistes de L'INRA , 7-9 avril 1999, Dourdan 

C. LEYRONAS, C. GEORGET, G. RAYNAL, 2000. Recherche du mode de transmission 

d'Epichloe typhina, agent de la maladie de la quenouille du dactyle (Dactylis glomerata). 

AFPP 6è Conf. Intern. Maladies des Plantes (Tours, 6,7,8, déc. 2000) 

C. LEYRONAS, G. RAYNAL, 2002. Artificial contamination of orchardgrass by Epichloe 

typhina, the agent of choke disease. Multi-function Grasslands Conference, EGF La Rochelle 

may 2002 

B. MERIAUX, C. LEYRONAS, F. DENEUFBOURG, 2002. Effect of fungicides and heat 

treatment on seed germination of endophyte infected perennial ryegrass. Multi-function 

Grasslands Conference, EGF La Rochelle May 2002 

C. LEYRONAS, G. RAYNAL, 2003. Les différents types de spores chez Epichloe typhina et 

leurs rôles respectifs. Journées du réseau mycologie. SFM Nancy janvier 2003 

C. LEYRONAS, C. NEEMA, G. RAYNAL, 2003. Mise au point d’une technique de 

détection biomoléculaire d'Epichloe typhina, champignon responsable de la quenouille du 

dactyle. AFPP 7 e Conf. Intern. Maladies des Plantes (Tours, déc. 2003). 

B. MERIAUX, C. LEYRONAS, F. DENEUFNOURG, 2003. Efficacité de traitements de 

semences et d'une thermothérapie contre le Neotyphodium du ray-grass. AFPP 7 e Conf. Intern. 

Maladies des Plantes (Tours, déc. 2003). 

C. LEYRONAS, 2004. Sur la piste du mode de pénétration d’Epichloe typhina dans le 

dactyle. Journées Jean Chevaugeon (Aussois, jan. 2004).

ABREVIATIONS 

FNAMS : Fédération Nationale des Agriculteurs multiplicateurs de Semences 

CTPS : Comité Technique Permanent de la Sélection 

PCR : Polymérase Chain Reaction 

E+ : plante ou organe végétal endophytés 

E- : plante ou organe végétal non endophytés 

TEi : teneur initiale en eau 

CREDIT PHOTOGRAPHIQUE : 

Toutes les photos réalisées par C. Leyronas sauf exceptions dûment mentionnées. 

Photos MEB : C. Leyronas et N. Wolff (UR 251 Sciences du Sol, INRA Versailles) 

DESSINS : 

page 142, tous les dessins réalisés par G. Raynal.

SOMMAIRE 

AVANT PROPOS 1 

PARTIE I : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE 

I- LES GRAMINEES FOURRAGERES ET A GAZON 

I.1 IMPORTANCE DES GRAMINEES FOURRAGERES ET A GAZON 3 

I.2 MORPHOLOGIE 4 

I.3 LES TYPES DE CONDUITE 4 

I.4 LES MALADIES DES GRAMINEES FOURRAGERES ET A GAZON 6 

II- LES EPICHLOE ET LES NEOTYPHODIUM 

II.1 HISTORIQUE 7 

II.2 DISTRIBUTION 8 

II.3 TAXONOMIE 8 

II.3.1 Les genres Epichloe et Neotyphodium 9 

II.3.2 Le continuum Epichloe-Neotyphodium, du parasitisme au mutualisme 10 

II.4 LA DETECTION DES ENDOPHYTES DES GRAMINEES 

II.4.1 Techniques histologiques 11 

II.4.2 Immunologie 12 

II.4.3 Biologie moléculaire 13 

III- LA QUENOUILLE DU DACTYLE 

III.1 SYMPTOMES ET DISSEMINATION DU CHAMPIGNON 13 

III.2 LA MALADIE AU CHAMP 

III.2.1 L'évolution au cours du temps 18 

III.2.2 Incidence de la maladie en culture de dactyle porte-graine 19 

III.2.3 Essais de lutte 

a) Lutte chimique 19 

b) Lutte prophylactique 20 

III.3 LA PENETRATION D'E. TYPHINA DANS LES PLANTES 

III.3.1 Pénétration par les plaies de coupe 21 

III.3.2 Pénétration par les inflorescences 21 

IV- LA SYMBIOSE NEOTYPHODIUM/GRAMINEES 

IV.1 PRESENTATION DE L'ASSOCIATION MUTUALISTE GRAMINEES-NEOTYPHODIUM 23 

IV.2 LES MYCOTOXINES 25 

IV.2.1 Avantages des mycotoxines –Action sur les Invertébrés 25 

IV.2.2 Inconvénients des mycotoxines pour les élevages- Action sur les Vertébrés 26 

IV.3 EFFETS DES ENDOPHYTES SUR LA CULTURE 27 

IV.4 REGLEMENTATION 28 

IV.5 ESSAIS DE LUTTE CONTRE LES NEOTYPHODIUM SPP. 

IV.5.1 Lutte chimique 28 

a) Traitements en végétation 29 

b) Traitements de semences 29 

IV.5.2 Thermothérapie 29 

V- RECAPITULATIF 30 

VI- OBJECTIFS DE L'ETUDE 31

PARTIE II : ELEMENTS DE LA BIOLOGIE 

ET DE L'EPIDEMIOLOGIE D'E. TYPHINA 

INTRODUCTION 32 

CHAPITRE 1 : BIOLOGIE DES SPORES D'E.TYPHINA 

I. MATERIEL ET METHODES 

I.1 OBTENTION DES SUSPENSIONS DE SPORES 

I.1.1 Conidies de culture pure 33 

I.1.2 Spermaties de quenouilles blanches 33 

I.1.3 Ascospores 33 

I.1.4 Conidies isues d’ascospores 33 

I.2 COMPORTEMENT DES SPORES SUR MILIEUX ARTIFICIELS 

1.2.1 Cinétique de germination 34 

a) conidies de culture pure et spermaties 34 

b) ascospores 34 

1.2.2 Influence de la nutrition sur la germination des spores 34 

I.3 COMPORTEMENT DES SPORES DANS ET A LA SURFACE DES TISSUS VEGETAUX 

I.3.1 Spermaties 35 

I.3.2 Ascospores 

a) Injection dans des tissus 35 

b) Dépôt sur organes végétaux 35 

I.3.3 Conidies 36 

I.4 RESISTANCE ET CONSERVATION DES SPORES ET DU MYCELIUM 

I.4.1 Spermaties 36 

I.4.2 Ascospores 36 

I.4.3 Mycélium 36 

II. RESULTATS ET DISCUSSION 

II.1 COMPORTEMENT DES SPORES SUR DES MILIEUX ARTIFICIELS 

II.1.1 Comportement des conidies de culture pure et des spermaties 

a) Cinétique de germination 37 

b) Influence de la nutrition sur la germination des conidies et des spermaties 37 

II.1.2 Comportement des ascospores 

a) Cinétique de germination des ascospores 38 

b) Influence des sources nutritionnelles sur la germination des ascospores 38 

I.1.3 Comportement des conidies isues d’ascospores en milieux artificiels 39 

II.2 COMPORTEMENT DES SPORES DANS ET SUR LES TISSUS VEGETAUX 

II.2.1 Spermaties 39 

II.2.2 Ascospores 

a) Injection dans la moelle de tige 40 

b) Dépôt sur organes végétaux 40 

I.2.3 Conidies isues d’ascospores 41 

II.3 RESISTANCE ET CONSERVATION DES SPORES ET DU MYCELIUM 

II.3.1 Spermaties 51 

II.3.2 Ascospores 51 

II.3.3 Mycélium endophyte 51 

III. DISCUSSION SUR LA BIOLOGIE DES SPORES 52 

CHAPITRE 2 : CONTRIBUTION A LA CONNAISSANCE DE L’EPIDEMIOLOGIE 

D’E.TYPHINA 

I. OBSERVATIONS DE TERRAIN 54 

I-1TRANSMISSION D'E. TYPHINA PAR LES SEMENCES? 54 

I-2 INFLUENCE DU PARCOURS CULTURAL SUR L'EXTENSION DE LA QUENOUILLE? 55 

I-3 INFECTION A PARTIR DES PARCELLES VOISINES? 55

II. LES EPIS PARTIELLEMENT QUENOUILLES 56 

II.1 MATERIEL ET METHODES 

II.1.1 Récolte des épis 56 

II.1.2 Détermination de la faculté germinative 56 

II.1.3 Mise en évidence d'E. typhina dans les semences et les plantes 57 

II.1.4 Détermination de la viabilité du mycélium endophyte 58 

II.2 RESULTATS 

II.2.1 Facultés germinatives 58 

II.2.2 Présence d'Epichloe dans les semences et les plantes 59 

II.2.3 Viabilité du mycélium endophyte 61 

II.3 DISCUSSION 61 

II.4 CONCLUSION 62 

PARTIE III : MISE AU POINT D'UNE TECHNIQUE DE DETECTION BIOMOLECULAIRE 


I- MATERIEL ET METHODES 

I.1 OBTENTION DE MYCELIUM 

64 

I.2 EXTRACTION D'ADN 

I.2.1 Extraction au CTAB 64 

I.2.2 Extraction au SDS 64 

I.3 AMPLIFICATION DE MICROSATELLITES 

I.3.1 Amorces MS 65 

I.3.2 Amorces B4 65 

I.3.3 Mélanges réactionnels et cycles PCR 

a) Mélanges réactionnels 65 

b) Cycles PCR 66 

I.3.4 Optimisation de la PCR sur ADN issu de mycélium de culture pure 

I.3.5 Optimisation de la PCR sur extraits végétaux 66 

a) Additifs 66 

b) Dilution des extraits 67 

I.4 ECHANTILLONS VEGETAUX 

I.4.1 Echantillons de dactyle 67 

I.4.2 Echantillons de ray-grass anglais et de fétuque élevée 68 

I.5 QUANTIFICATION ET VISUALISATION DE L'ADN 68 

II- RESULTATS 

II.1 EXTRACTION SUR MYCELIUM ISSU DE CULTURE PURE ET TISSUS VEGETAUX 

II.1.1 A partir de mycélium 68 

II.1.2 A partir de tissus végétaux 68 

II.2 SPECIFICITE DES AMORCES 

II.2.1 Amorces MS 

a) Températures d'hybridation 69 

b) Quantité d'ADN matrice 69 

c) Concentration en MgCl2 69 

II.2.2 Amorces B4 

a) Températures d'hybridation 70 

b) Seuil de détection 70 

II.3 DETECTION SUR TISSUS VEGETAUX 

II.3.1 Effet des additifs sur l'amplification 70 

II.3.2 Efficacité de la détection sur moelle de dactyle 72 

II.3.3 Efficacité de la détection sur tissus de ray-grass anglais et fétuque élevée 73

III- DISCUSSION 73 

IV- CONCLUSION 75 

PARTIE IV : INOCULATION ARTIFICIELLE DU DACTYLE PAR E. TYPHINA 


MATERIEL ET MeTHODES GENERAUX 

I MATERIEL VEGETAL 

I.1 PLANTES 76 

I.2 SEMENCES 77 

II SUIVI DES INOCULATIONS 

II.1 OBSERVATION MICROSCOPIQUE 77 

II.2 ISOLEMENTS 77 


CHAPITRE 1 : INOCULATION AVEC DES SPERMATIES 

I.1 CONSTITUTION DE L'INOCULUM 78 

I.2 INOCULATION AU NIVEAU DES PLAIES DE COUPE. 78 

I.2.1 Préparation des plantes 78 

I.2.2 Pulvérisation de l'inoculum 79 

I.2.3 Apport de l'inoculum en goutte 79 

II. RESULTATS 

II.1 PULVERISATION DE L'INOCULUM SUR LES PLAIES DE COUPE 79 

II.2 APPORT DE L'INOCULUM EN GOUTTES SUR LES PLAIES DE COUPE 80 

III. DISCUSSION 80 


CHAPITRE 2 : INOCULATION AVEC DES ASCOSPORES 

I.1 CONSTITUTION DE L'INOCULUM 81 

I.2 INOCULATION PAR LES PLAIES DE COUPE 


I.2.2 Pulvérisation de l'inoculum 81 

I.2.3 Apport de l'inoculum en gouttes 82 

I.2.4 Apport de l’inoculum par implants 82 

I.3 INOCULATION DANS L'ESPACE ENTRE LES TIGES ET LES GAINES FOLIAIRES 

I.3.1 Choix des plantes 82

I.3.2 Inoculation 82 

I.4 INOCULATION DES JEUNES TALLES DANS LES ZONES PROCHES DES MERISTEMES 83 

I.5 INOCULATION PAR LES INFLORESCENCES 

I.5.1 Inoculation 83 

I.5.2 Devenir des semences 83 

I.6 INOCULATION DIRECTE DE SEMENCES 83 

I.6.1 Trempage des semences dans une suspension d'ascospores 84 

I.6.2 Mise en contact des semences avec les ascospores sur eau gélosée. 84 

I.6.3 Mise en contact des semences avec les ascospores sur support inerte. 84 

II. Resultats 

II.1 INOCULATION PAR LES PLAIES DE COUPE 

II.1.1 Pulvérisation de l'inoculum 85 

II.1.2 Apport de l'inoculum en goutte 85 

II.1.3 Apport des ascospores sur pastilles gélosées 85 

II.2 INOCULATION ENTRE LES TIGES ET LES GAINES FOLIAIRES 85 

II.3 INOCULATION DES JEUNES TALLES DANS DES ZONES PROCHES DES MERISTEMES 86 

II.4 ENTREE DES ASCOSPORES PAR LES INFLORESCENCES, EN COURS DE FECONDATION 86 

II.5 INFECTION DES SEMENCES PAR LES ASCOSPORES 

II.5.1 Trempage 86 

II.5.2 Mise en contact direct 

a) Semences et ascospores sur support en verre 87 

b) Semences et ascospores sur gélose 87 

III. Discussion sur les inoculations avec ascospores 

III.1 PENETRATION DES ASCOSPORES PAR LES PLAIES DE COUPE 87 

III.2 PENETRATION DES ASCOSPORES PAR LES GAINES FOLIAIRES 88 

III.3 INFECTION DES JEUNES TALLES PAR LES ASCOSPORES 89 

III.4 INFECTION DES SEMENCES PAR LES ASCOSPORES 89 

CHAPITRE 3 : INOCULATION AVEC DES CONIDIES ISSUES D'ASCOSPORES 

I. matériel et méthodes 

I.1 OBTENTION DES CONIDIES 91 

I.2 INOCULATION PAR LES PLAIES DE COUPE 


I.2.2 Apport de l'inoculum en gouttes 91 

I.2 INOCULATION DES JEUNES TALLES DANS LES ZONES PROCHES DES MERISTEMES 91

II. résultats 

II.1 INOCULATION PAR LES PLAIES DE COUPE 92 

II.2 INOCULATION DES JEUNES TALLES DANS DES ZONES PROCHES DES MERISTEMES 92 

III. DISCUSSION 92 

CHAPITRE 4 : INOCULATION AVEC DU CHAMPIGNON DE CULTURE PURE 

I. matériel et méthodes 

I.1 SOUCHE D'EPICHLOE UTILISEE 93 

I.2 INOCULATION DE PLANTULES AGEES DE 7 JOURS 

I.2.1 Inoculation au niveau du coléoptile 93 

I.2.2 Inoculation au niveau de la racine 93 

I.3 SEMENCES GERMEES SUR COLONIE 93 

I.4 INOCULATION DE LIMBES FOLIAIRES 

94 

I.5 MISE EN CONTACT D’IMPLANTS MYCELIENS SUR TIGES COUPEES 94 

II. résultats 

II.1 INOCULATION DE PLANTULES AGEES DE 7 JOURS 

II.1.1 Inoculation au niveau du coléoptile 94 

II.1.2 Inoculation au niveau de la racine 95 

II.2 JEUNES PLANTES ISSUES DE SEMENCES GERMEES SUR DES COLONIES 95 

II.3 ENTREE PAR LES LIMBES FOLIAIRES 96 

II.4 IMPLANTS MYCELIENS PLACES SUR LES TIGES COUPEES 96 

III. Discussion sur les inoculations avec du mycélium 

III.1 INOCULATION DE PLANTULES DE 7 JOURS 

99 

III.2 SEMENCES GERMEES SUR COLONIE D'E. TYPHINA 99 

III.3 INOCULATION DE LIMBES FOLIAIRES 99 

III.4 IMPLANTS MYCELIENS PLACES SUR LES TIGES COUPEES 100 

DISCUSSION GENERALE –CONCLUSION 101 

PARTIE V : ESSAIS DE LUTTE CONTRE E. TYPHINA ET NEOTYPHODIUM SPP. 


CHAPITRE 1 - ESSAI DE LUTTE FONGICIDE CONTRE EPICHLOE TYPHINA 


I.1 PREPARATION DES MILIEUX 

I.1 Milieux de culture 104

I.2 Matières actives utilisées 104 

I.2 PREPARATION DES SUSPENSIONS DE SPORES 

I.2.1 Suspension de spermaties 104 

I.2.2 Suspension d’ascospores 105 

I.2.3 Suspension de conidies isues d’ascospores 105 

I.3 TESTS DE CROISSANCE MYCELIENNE 105 

I.4 CONDITIONS DE CULTURE ET ANALYSES 105 

I.5 TESTS SUR QUENOUILLES ET TISSUS VEGETAUX 

I.5.1 Tests fongicides sur des quenouilles blanches 106 

I.5.2 Tests fongicides sur des quenouilles oranges 106 

I.5.3 Tests fongicides sur la végétation 107 


II.1 EFFET DES FONGICIDES SUR LES SPORES D’E. TYPHINA 

II.1.1 Effet des fongicides sur les spermaties 

a) Essais effectués sur PDA en 2003 107 

b) Essais effectués sur eau gélosée en 2004 107 

II.1.2 Effet des fongicides sur les ascospores 

a) Essais effectués sur PDA en 2003 108 

b) Essais effectués sur eau gélosée en 2004 109 

I.1.3 Efet des fongicides sur les conidies isues d’ascospores 110 

II.1.4 Discussion : action des fongicides sur les spores d’E. typhina 112 

II.2 EFFET DES FONGICIDES SUR LA CROISSANCE MYCELIENNE 113 

II.3 TRAITEMENT DES QUENOUILLES ET DES TISSUS VEGETAUX 

II.3.1 Traitements de quenouilles blanches 116 

II.3.2 Traitements de quenouilles oranges 117 

II.3.3 Traitements de la végétation 117 

II.3.4 Conclusion 118 

III. CONCLUSION DES ESSAIS DE LUTTE CONTRE E. TYPHINA 118 

CHAPITRE 2- ESSAI DE LUTTE FONGICIDE CONTRE NEOTYPHODIUM LOLII ET N. 

COENOPHIALUM 


I.1 MATERIEL VEGETAL 119 

I.2 APPLICATION DES TRAITEMENTS DE SEMENCES 119 

I.3 DETERMINATION DE L’EFFICACITE 

I.3.1 Essai en serre 119 

I.3.2 Essai au champ 119 

I.3.3 Détection des Neotyphodium 119 

I.4 DETERMINATION DE LA PHYTOTOXICITE 120 

I.5 ANALYSES STATISTIQUES 121 


II.1 RESULTATS OBTENUS EN 2001 SUR TRITICONAZOLE A 2.5G/KG ET 5G/KG 121 

II.2 RESULTATS OBTENUS EN 2002 (TRITICONAZOLE, BITERTANOL, FLUQUINCONAZOLE, 

PROCHLORAZE) 122 

II.3 RESULTATS OBTENUS EN 2003 (BITERTANOL, FLUQUINCONAZOLE, PROCHLORAZE) 124 

II.4 RESULTATS OBTENUS EN 2004 (PROCHLORAZE, FLUDIOXONIL) 125 

II.4.1 Effet sur la germination 125 

II.4.2 Effet sur l'endophyte 126 


III. CONCLUSION DES ESSAIS DE LUTTE FONGICIDE CONTRE NEOTYPHODIUM SPP. 

127

CHAPITRE 3 - ESSAI DE THERMOTHERAPIE CONTRE NEOTYPHODIUM LOLII ET N. 

COENOPHIALUM 


I.1 MATERIEL VEGETAL 128 

I.2 MISE EN ŒUVRE DELA THERMOTHERAPIE 128 

I.3 DETERMINATION DE L’EFFICACITE 129 

I.4 DETERMINATION DE LA PHYTOTOXICITE 129 


II.1 RESULTATS OBTENUS SUR RAY-GRASS EN 2002 A 60°C ET 80°C 130 

II.2 RESULTATS OBTENUS SUR RAY-GRASS EN 2003 A 70°C ET 80°C 131 

II.3 RESULTATS OBTENUS SUR RAY-GRASS ET FETUQUE EN 2004 A 80°C 132 


III. CONCLUSION SUR LA THERMOTHERAPIE 133 

CONCLUSION GENERALE SUR LES POSSIBILITES DE LUTTE CONTRE EPICHLOE ET 

NEOTYPHODIUM 134 

PARTIE VI : DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES 

PARTIE VII : CONCLUSION GENERALE 

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 

ANNEXES 

136 

145 

146 

161

LISTE DES TABLEAUX, FIGURES ET PLANCHES PHOTOS 

PARTIE I : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE. 

Tableau I.1 : Espèces de graminées et surfaces (ha) en multiplication en 2003. 

Tableau I.2: Comparaison des caractéristiques des Epichloe pathogènes et des Neotyphodium 

endophytes stricts. 

Figure I.1 : Morphologie des 3 graminées les plus cultivées en France. 

Figure I.2 : Position taxonomique des Epichloe et Neotyphodium 

Figure I.3 : Relations phylogénétiques entre espèces d'Epichloe et de Neotyphodium. 

Figure I.4 : Captures journalières moyennes par quenouille et par tranche de trois heures, en 

conditions naturelles de la mi-juin au début juillet (d'après Raynal, 1991b). 

Figure I.5 : Progression de la quenouille sur dactyle en parcelle d'essai 

Figure I.6 : Cycle hypothétique d'E. festucae selon Schardl et al. (1997). 

Planche I.1 : A : mycélium endophyte de type Neotytphodium dans une gaine foliaire de dactyle. B : 

quenouille blanche avec Diptère. C : spermatie réniforme typique d'E. typhina. 

D : quenouilles orange. E : périthèces, asques et ascospores. 

Planche I.2 : A : larves de Diptère sous leur coque de protection, portant le reste de l'enveloppe de 

l'œuf initial, ayant ingéré une partie de périthèces en formation. B : pupes de Diptères obtenues à partir 

des larves situées sur des stromas d'E. typhina de dactyle. C : épis de dactyle partiellement 

quenouillés. 

Planche I.3 : A : N. lolii dans une gaine foliaire de ray-grass anglais. B : N. lolii dans une semence de 

ray-grass anglais. 

A 

PARTIE II : ELEMENTS DE LA BIOLOGIE ET DE L'EPIDEMIOLOGIE D'E. TYPHINA. 

Tableau II.1 : Caractéristiques résumées des 4 types de spores rencontrés chez E. typhina. 

Tableau II.2 : Etat de germination des ascospores après 48h en atmosphère humide à 24°C selon leur 

durée de conservation, de -20°C à +80°C. 

Tableau II.3 : Facultés germinatives de semences d'épis sains et partiellement quenouillés. 

Figure II.1 : Germination des conidies de culture pure au bout de 24 heures sur PDA, à la lumière à 

24°C. 

Figure II.2 : Germination de conidies de culture pure sur différents milieux, après 48 heures. 

Figure II.3 : Germination de spermaties sur différents milieux, au bout de 48 heures à 24°C. 

Figure II.4 : Germination des ascospores sur différents milieux, au bout de 48 h à 24°C. 

Figure II.5 : Germination de conidies isues d’ascospores sur diférents milieux, après 48 heures. 

Planche II.1 : A et B : Germination bipolaire des spermaties à différents stades. C : Spermatie portant 

un conidiophore (Cp). D : Spermatie avec un tube germinatif (Tb) et un conidiophore formant une 

nouvelle spore (S). 

Planche II.2 : A : Production de conidies par deux ascospores sur PDA. B : Production de 

ramifications par des ascospores dans de l'eau. C : Germination d’ascospores sur lame de vere en 

conditions humides. Présence de début de ramifications (Tb) et de conidiophores (Cp) produisant des 

conidies (Co). Germination itérative des conidies. D : Lyse de l'eau gélosée par les ascospores et les 

conidies. 

Planche II.3 : A et B : Conidies (Co) isues d’ascospores formant de nouveles conidies (Cn). (Cp: 

conidiophore ; Tb : tube germinatif). C et D : Ascospores (As) germant dans la moele d’une tige de 

dactyle après injection. E : Colonisation des tissus de la moelle après injection d'ascospores. 

Planche II.4 : A : Conidies (Co) formées dans la moelle par les ascospores injectées (As) (Cp : 

conidiophore). B et C: Conidies (Co) isues d’ascospores germant dans la moele d’une tige de dactyle 

et formant un mycélium tortueux (My) typique des Neotyphodium. 

Planche II.5 : A : Trame formée par le dépôt d’ascospores sur feuile de dactyle au bout de 24h. B : 

Formation de conidies par la trame d'ascospores. C : Accolement d’ascospores sporulantes. 

Planche II.6 : Trame non sporulante formée par des ascospores éjectées sur un limbe de dactyle, après 

24 heures en atmosphère sèche (Microscopie électronique à balayage). 

Planche II.7: Trame produisant des conidies, formée par des ascospores déposées depuis 24 heures 

sur un limbe de dactyle en atmosphère humide (MEB). 

Planche II.8 : Trame formée sur une étamine par des ascospores produisant des conidies (MEB).

Planche II.9 : A : Détail d'un maillon de la trame. B : Ascospores (faible densité) sur une moelle de 

tige de dactyle (MEB). 

Planche II.10: Mycélium d'E.typhina dans le tégument d'une semence d'un épi partiellement 

quenouillé de dactyle. 

PARTIE III : MISE AU POINT D'UNE TECHNIQUE DE DETECTION BIOMOLECULAIRE. 

Tableau III.1 : Caractéristiques des deux couples d'amorces de microsatellites. 

Tableau III.2 : Comparaison des mélanges réactionnels de PCR pour deux couples d'amorces. 

Tableau III.3 : Cycles PCR pour deux couples d'amorces testés. 

Tableau III.4 : Résultats obtenus sur des échantillons végétaux après amplification par PCR. 

Figure III.1 : Seuil de détection de la PCR à 62°C avec le couple d'amorce B4. 

Figure III.2 : Effets des additifs de PCR sur l'amplification. Tests sur des ADN obtenus après 

extraction au SDS avec ou sans phénol sur tissus de moelle, aux concentrations de 10-5-1 et 0.1ηg. 

Figure III.3 : Visualisation des produits de PCR obtenus avec les amorces B4, sur des extraits de 

tissus de moelle de dactyle fortement infectés et sains, plus ou moins dilués. 

PARTIE IV : INOCULATION ARTIFICIELLE DU DACTYLE PAR E. TYPHINA 

Tableau IV.1 : Résultats des inoculations avec spermaties de quenouilles blanches. 

Tableau IV.2 : Récapitulatif des inoculations avec ascospores. 

Tableau IV.3 : Récapitulatif des résultats des inoculations avec ascospores des organes aériens du 

dactyle. 

Tableau IV.4 : Récapitulatif des inoculations d'inflorescences et de semences avec des ascospores : 

analyse sur les plantes issues des semences mises en contact avec l'inoculum. 

Tableau IV.5 : Récapitulatif des inoculations avec conidies isues d’ascospores. 

Tableau IV.6 : Récapitulatif des inoculations avec du mycélium de culture pure. 

Figure IV.4 : Pourcentage de limbes donnant des isolements positifs dans la zone inoculée 15, 22 et 

29 jours après mise en contact avec le mycélium d'E. typhina. 

Tableau IV.7 : Récapitulatif des résultats des inoculations avec du mycélium de culture pure. 

Figure IV.1 : Schéma des parties d’une tige de dactyle. 

Figure IV.2 : Récolte d’ascospores dans de l’eau stérile. 

Figure IV. 3 : Inoculation et localisation des fragments analysés par isolement sur le limbe foliaire. 

Planche IV.1 : Mycélium externe d'E. typhina sur un dactyle de 8 semaines suite à l'inoculation de 

plantules de 7 jours au niveau du coléoptile. 

Planche IV.2 : Mycélium externe après inoculation de plantules de 7 jours au niveau du coléoptile vu 

en microscopie électronique à balayage. 

PARTIE V : ESSAI DE LUTTE CONTRE E. TYPHINA ET NEOTYPHODIUM SPP. 

Tableau V.1 : Effet des fongicides sur la germination des ascospores sur PDA en 2003. 

Tableau V.2 : Effet des matières actives sur la croissance mycélienne. 

Tableau V.3 : Matières actives et doses testées en serre et au champ (en g par kg de semences). 

Figure V.1 : Moyennes des pourcentages de germination de spermaties après 24 h sur PDA contenant 

des fongicides en 2003. 

Figure V.2 : Moyennes des pourcentages de germination des spermaties après 48h sur eau gélosée 

contenant des fongicides en 2004. 

Figure V.3 : Moyennes des pourcentages de germination des ascospores après 48h sur eau gélosée et 

fongicides, en 2004. 

Figure V.4 : Moyennes des pourcentages de germination des conidies issues d'ascospores après 48h 

sur eau gélosée contenant des fongicides 

Figure V.5 : Moyennes des diamètres des colonies mycéliennes (mm) sur PDA contenant des 

fongicides. 

Figure V.6 : Incidence des endophytes, après traitement de semences, mesurée sur 50 plantes de raygrass 

âgées de 3 mois, pour chaque lot en 2002. Germination évaluée à 14 jours. 

Figure V.7 : Incidence des endophytes dans les plantes issues de semences de ray-grass récoltées en 

2002 à Troyes et à Brain (50 semences sont analysées par répétition).

Figure V.9 : Incidence des endophytes dans les semences de ray-grass récoltées en 2003 à Troyes et à 

Brain (50 semences sont analysées par répétition). 

Figure V.8 : Incidence des endophytes après traitement de semences mesurée sur 50 plantes âgées de 

3 mois, pour chaque lot en 2003. Germination évaluée à 14 jours. 

Figure V.10 : Facultés germinatives des semences de ray-grass traitées par thermothérapie à 60°C et 

80°C, pendant 4, 6, 8, 10 ou 12 jours avec une teneur initiale en eau de 10% ou 15 %, en 2002. 

Figure V.11 : Régression linéaire sur les pourcentages de plantes endophytées du lot 6. 

PARTIE VI : DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES 

Figure VI.1 : Cycle infectieux hypothétique d'E. typhina sur le dactyle

ECOLE DOCTORALE ABIES THESE

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