La phosphatase alcaline en milieu marin: ses caractéristiques, son ...

tel-00641975, version 1 - 17 Nov 2011
Technique de Dosage
Les incubations sont faites à 20°C dans une enceinte thermostatée.
Quatre concentrations de pNPP sont utilisées (10, 5, 2,5 et 1,25mM). Pour les mesures de
l’activité totale, le substrat est préparé dans de l’eau de mer du même prélèvement, préfiltrée
sur 0,45µ.
Des blancs substrats à des concentrations de 10, 5, 2,5, 1,25mM sont également réalisés.
La suspension d’enzyme est ensuite ajoutée aux substrats (0,4ml pour 4ml de substrat). Puis la
concentration de pNP libérée est mesurée au spectrophotomètre (Hélios Gamma, Thermo
Electron Corporation) à 410 nm pendant 4 heures, à intervalles réguliers.
Une gamme étalon du produit de la réaction (le paranitrophénol) est également réalisée avec
une solution mère à 1mM et par dilutions successives dans l’eau de mer afin d’obtenir des
concentrations de 15, 7,5 et 3,75 µM.
Pour les mesures des activités phosphatasiques de l’eau filtrée ou non filtrée, le substrat est
ajouté directement dans les échantillons.
Pour les mesures de l’activité des individus zooplanctoniques isolés, les différentes
concentrations en substrat (0,01, 0,1, 1 et 10 mM) sont préparées dans de l’eau de mer filtrée
sur 0,45 µm et les incubations se déroulent à 25°C.
Avec le méthylumbelliféryl-phosphate (MUF-P)
Principe du dosage
L’hydrolyse enzymatique du méthylumbelliféryl-phosphate par la phosphatase alcaline libère
du PO4 3- et un alcool : le méthylumbelliferone ou MUF, qui émet une fluorescence à 450 nm
lorsqu’il est excité à 340 nm.
MUF-P + H2O MUF + PO4 3-
Technique de Dosage
Les concentrations en MUF-P sont de 10, de 3,33, de 1,11, de 0,37, de 0,12, de 0,041 et de
0,013 µM. Elles sont préparées dans l’eau de mer filtrée ou non. Pendant l’incubation, les
tubes sont placés à l’obscurité dans une enceinte thermostatée à 20°C.
Une gamme étalon avec le MUF (méthylumbelliferone) est également réalisée à des
concentrations comprises entre 50 et 200 nM.
Un fluorimètre SFM 25, de Bio-tek instruments a été utilisé pour les mesures des
concentrations de MUF.
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