La phosphatase alcaline en milieu marin: ses caractéristiques, son ...
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tel-00641975, version 1 - 17 Nov 2011<br />
Des aliquotes de 50 ml d’eau de mer brute ou d’eau filtrée sur 0,45µ (filtres Acrodisc stériles<br />
avec membrane <strong>en</strong> polyethersulfone hydrophile montés sur seringues de 20 ml stériles), ont<br />
été conservés à -20°C dans des flacons <strong>en</strong> polypropylène aseptiques.<br />
2.8 Analyse des composés phosphorés organiques<br />
Le phosphore organique se prés<strong>en</strong>te sous forme dissoute et sous forme particulaire. <strong>La</strong> forme<br />
dissoute est dosée après passage d’eau de mer sur des filtres de 0,45 µm (Acrodisc).<br />
Le phosphore dissous<br />
Les composés organiques phosphorés dissous ont été regroupés <strong>en</strong> 3 clas<strong>ses</strong><br />
-Le phosphore organique <strong>en</strong>zymatiquem<strong>en</strong>t hydrolysable (PHPase):<br />
-Le phosphore organique hydrolysable (POH)<br />
-Le phosphore organique oxydable (PNH)<br />
Le phosphore organique <strong>en</strong>zymatiquem<strong>en</strong>t hydrolysable dissous (PHPase)<br />
Il correspond au phosphore organique qui peut être hydrolysé par les <strong>phosphatase</strong>s prés<strong>en</strong>tes<br />
dans l’eau de mer. Pour le dosage de cette fraction, une hydrolyse a été effectuée in vitro par<br />
addition de <strong>phosphatase</strong> <strong>alcaline</strong> purifiée à de l’eau de mer.<br />
Les conditions de cette hydrolyse ont été optimisées notamm<strong>en</strong>t le temps d’incubation et les<br />
conc<strong>en</strong>trations d’<strong>en</strong>zyme nécessaires. Pour cela, nous avons utilisé de la <strong>phosphatase</strong> <strong>alcaline</strong><br />
purifiée issue de l’intestin de veau (Sigma P-3877) et du paranitrophényl phosphate (pNPP)<br />
comme substrat spécifique. <strong>La</strong> conc<strong>en</strong>tration de pNPP était de7 µM. Cette conc<strong>en</strong>tration est<br />
beaucoup plus élevée que celle des composés phosphorés du <strong>milieu</strong> naturel. Elle permettra de<br />
s’assurer que la durée d’hydrolyse des composés phosphorés naturels est suffisante. Cinq<br />
conc<strong>en</strong>trations <strong>en</strong> <strong>en</strong>zyme ont été testées allant de 9 à 0,035 mg/l. Afin d’accélérer la vitesse<br />
de réaction, les tubes <strong>son</strong>t placés au bain marie à 37°C. <strong>La</strong> vitesse de la réaction est mesurée<br />
par le dosage du paranitrophénol (PNP) produit au cours de la réaction, à 410 nm (Voir<br />
technique de dosage plus loin). Les résultats obt<strong>en</strong>us <strong>son</strong>t prés<strong>en</strong>tés sur la figure 1.<br />
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