nephrotoxicite des acides aristolochiques - de l'Université libre de ...
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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES<br />
Faculté <strong>de</strong> Mé<strong>de</strong>cine<br />
Laboratoire <strong>de</strong> Recherche sur le Métabolisme <strong><strong>de</strong>s</strong> Pepti<strong><strong>de</strong>s</strong><br />
NEPHROTOXICITE DES ACIDES ARISTOLOCHIQUES :<br />
APPROCHES EXPERIMENTALES DE L’ATTEINTE<br />
Promoteur : Dr. J. Nortier<br />
TUBULAIRE PROXIMALE<br />
Catherine LEBEAU<br />
Thèse présentée en vue <strong>de</strong> l’obtention du titre <strong>de</strong><br />
Docteur en Sciences Biomédicales<br />
Co-promoteur : Pr. M. Deschodt-Lanckman<br />
Année académique 2005-2006
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES<br />
Faculté <strong>de</strong> Mé<strong>de</strong>cine<br />
Laboratoire <strong>de</strong> Recherche sur le Métabolisme <strong><strong>de</strong>s</strong> Pepti<strong><strong>de</strong>s</strong><br />
NEPHROTOXICITE DES ACIDES ARISTOLOCHIQUES :<br />
APPROCHES EXPERIMENTALES DE L’ATTEINTE<br />
TUBULAIRE PROXIMALE<br />
Catherine LEBEAU<br />
Thèse présentée en vue <strong>de</strong> l’obtention du titre <strong>de</strong><br />
Docteur en Sciences Biomédicales<br />
Promoteur : Dr. J. Nortier<br />
Co-promoteur : Pr. M. Deschodt-Lanckman<br />
COMPOSITION DU JURY<br />
Prési<strong>de</strong>nt : Pr. Ph. Lebrun<br />
Secrétaire : Dr. J. Nortier<br />
Membre du jury : Pr. M. Deschodt-Lanckman<br />
Membre du jury : Pr. M. Dratwa<br />
Membre du jury : Pr. J-C. Noël<br />
Membre du jury : Pr. P. Roger<br />
Expert étranger : Pr. G. Friedlan<strong>de</strong>r<br />
Expert étranger : Pr. C. Isnard Bagnis
CURRICULUM VITAE<br />
Catherine Lebeau, née le 23 novembre 1973 à Uccle, est célibataire et <strong>de</strong> nationalité<br />
Belge.<br />
Etu<strong><strong>de</strong>s</strong> secondaires :<br />
Athénée Emile Bockstael <strong>de</strong> Bruxelles, section latin-sciences (1985 – 1991)<br />
Etu<strong><strong>de</strong>s</strong> universitaires :<br />
Licenciée en Sciences chimiques au gra<strong>de</strong> légal obtenu avec gran<strong>de</strong> distinction,<br />
Université Libre <strong>de</strong> Bruxelles (1991 – 1995)<br />
Titre du mémoire: "Clonage et séquençage du gène MEP3 codant pour une<br />
protéine homologue aux transporteurs d'ammonium chez Saccharomyces<br />
cerevisiae". Laboratoire <strong>de</strong> Physiologie Cellulaire et <strong>de</strong> Génétique <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
Levures, département <strong>de</strong> Biologie Moléculaire, Faculté <strong><strong>de</strong>s</strong> Sciences, ULB, Pr.<br />
B. André<br />
DEA en Sciences <strong>de</strong> la santé, Université Libre <strong>de</strong> Bruxelles (2001)<br />
Activités <strong>de</strong> Recherche<br />
Echangeur Na/Ca dans les cellules pancréatiques β <strong>de</strong> rat. Laboratoire <strong>de</strong><br />
Pharmacodynamie et <strong>de</strong> thérapeutique, Faculté <strong>de</strong> Mé<strong>de</strong>cine, ULB, Pr. A.<br />
Herchuelz (1996 – 1997)<br />
Transporteurs basolatéraux <strong>de</strong> chlore dans la maladie rénale polykystique<br />
autosomale dominante<br />
Néphrotoxicité <strong><strong>de</strong>s</strong> aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong> : étu<strong>de</strong> in vitro.<br />
Laboratoire <strong>de</strong> Physiopathologie , Faculté <strong>de</strong> Mé<strong>de</strong>cine, ULB, Pr. R.<br />
Beauwens (1998 – 2002)<br />
Néphrotoxicité <strong><strong>de</strong>s</strong> aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong> : étu<strong>de</strong> in vivo. LRMP, Faculté <strong>de</strong><br />
Mé<strong>de</strong>cine, ULB, Pr. M. Deschodt-Lankman et Service <strong>de</strong> Néphrologie, Hôpital<br />
Erasme, Dr. J. Nortier, (2003-2006)<br />
Prix scientifique<br />
Prix « Takis Anagnostopoulos » <strong>de</strong> la meilleure communication orale au colloque<br />
“Les cellules rénales et les interactions cellulaires dans les épithéliums: du gène à<br />
la physiopathologie”, Faculté <strong>de</strong> Mé<strong>de</strong>cine Necker, Paris, France, 20 et 21 juin<br />
2002.<br />
Publications scientifiques :<br />
Van Eylen F, Lebeau C, et al. Diabetes 47: 1873-1880, 1998<br />
Lebeau C, et al. Kidney Int. 60: 1332-1342, 2001<br />
Lebeau C, et al. Pflügers Archiv – Eur J Physiol. 444: 722-731, 2002<br />
Lebeau C, et al. Nephrol Dial Transplant. 20: 2321-2332, 2005
REMERCIEMENTS<br />
La réalisation <strong>de</strong> ce travail n’aurait pu aboutir sans les conseils avisés <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
différents responsables <strong>de</strong> laboratoire qui m’ont accueillie. Je souhaite tout d’abord<br />
remercier le Professeur R. Beauwens du Laboratoire <strong>de</strong> Physiologie ainsi que le<br />
Docteur O. Devuyst <strong>de</strong> la Division <strong>de</strong> Néphrologie <strong>de</strong> la Faculté <strong>de</strong> Mé<strong>de</strong>cine <strong>de</strong><br />
l’Université Catholique <strong>de</strong> Louvain pour m’avoir épaulée dans l’élaboration du travail<br />
concernant l’approche in vitro. Je remercie également Madame Yvette Cnops,<br />
technicienne travaillant dans l’unité du Docteur O. Devuyst, pour m’avoir initiée à la<br />
technique <strong><strong>de</strong>s</strong> gels d’électrophorèse. Je tiens ensuite à adresser ma plus vive<br />
gratitu<strong>de</strong> à Madame le Professeur M. Deschodt-Lanckman du Laboratoire <strong>de</strong><br />
Recherche sur le Métabolisme <strong><strong>de</strong>s</strong> Pepti<strong><strong>de</strong>s</strong> pour m’avoir témoigné sa confiance et<br />
encouragée dans la poursuite <strong>de</strong> mon travail <strong>de</strong> thèse avec l’exploration <strong><strong>de</strong>s</strong> aspects<br />
in vivo.<br />
J’adresse également mes remerciements à Monsieur le Professeur J-L.<br />
Vanherweghem pour son soutien constant et ses avis critiques et constructifs.<br />
Je souhaite exprimer toute ma gratitu<strong>de</strong> à l’égard du Docteur Joëlle Nortier,<br />
promoteur <strong>de</strong> ce travail, pour son soutien à toute épreuve. Au cours <strong><strong>de</strong>s</strong> heures<br />
passées à travailler ensemble, j’ai eu l’immense plaisir d’apprécier à sa juste valeur<br />
ses discussions et remarques constructives, son enthousiasme, sa rigueur et son<br />
perfectionnisme.<br />
Mes plus vifs remerciements vont aussi au Docteur Frédéric Debelle pour<br />
m’avoir transmis ses connaissances, guidée dans mes premiers pas au laboratoire et<br />
familiarisée avec le modèle animal. Un tout grand merci à Monsieur Eric De Prez et<br />
Madame Cécile Husson pour leur précieuse ai<strong>de</strong> technique. Merci aussi à Agnieszka<br />
Pozdzik ainsi qu’à Claire, Sofia, Aurore, Pascal et Clau<strong>de</strong> (Laboratoire<br />
d’Immunologie Expérimentale) pour leurs encouragements.
Je ne manquerai pas <strong>de</strong> remercier le Professeur V. Arlt pour sa collaboration<br />
concernant la détection <strong><strong>de</strong>s</strong> adduits d’ADN aux aristolactames, le Professeur I.<br />
Salmon pour ses conseils en histopathologie rénale, le Professeur J-P. Brion et sa<br />
technicienne Madame Michelle Authelet pour l’étu<strong>de</strong> en microscopie électronique.<br />
Je remercie également le Fonds Alphonse et Jean Forton, le Fonds <strong>de</strong> la<br />
Recherche Scientifique Médicale ainsi que la Banque Nationale <strong>de</strong> Belgique pour<br />
leur contribution financière à la réalisation <strong>de</strong> ce travail.<br />
Je ne sais comment remercier mon amie Anne Demols et Gilles Wolles qui ont<br />
toujours su trouver les mots justes pour me soutenir et m’encourager tout au long <strong>de</strong><br />
mon travail <strong>de</strong> thèse.<br />
Je remercie mes parents <strong>de</strong> m’avoir permis d’entamer mes étu<strong><strong>de</strong>s</strong>. Je<br />
remercie très chaleureusement mon frère, Frédéric, pour son soutien et ses<br />
encouragements.<br />
Je ne sais quels mots choisir pour remercier du fond du cœur, Stéphane, pour<br />
son ai<strong>de</strong> à résoudre les pannes liées aux mystères <strong>de</strong> l’informatique ainsi que pour<br />
ses précieux encouragements et son soutien au quotidien.
TABLE DES MATIERES<br />
Pages<br />
Liste <strong><strong>de</strong>s</strong> abréviations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7<br />
Résumé . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9<br />
CHAPITRE 1 : INTRODUCTION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10<br />
1. Le rein : généralités . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10<br />
1.1. Unité anatomique, le néphron . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11<br />
1.2. Unité fonctionnelle, le néphron . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12<br />
1.2.1. Le glomérule . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12<br />
1.2.2. Le tubule rénal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15<br />
1.2.3. La vascularisation rénale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18<br />
2. Le tubule proximal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20<br />
2.1. L’épithélium tubulaire proximal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21<br />
2.2. Réabsorption tubulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22<br />
2.2.1. Réabsorption du sodium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22<br />
2.2.2. Réabsorption <strong><strong>de</strong>s</strong> nutriments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23<br />
2.3. Sécrétion tubulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24<br />
2.3.1. Sécrétion d’hydrogène . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24<br />
2.3.2. Sécrétion d’ammonium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25<br />
2.4. Endocytose médiée par récepteur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25<br />
2.4.1. Mégaline et cubiline . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27<br />
2.5. Sécrétion et réabsorption tubulaire <strong><strong>de</strong>s</strong> drogues et xénobiotiques . . . 37<br />
3. Marqueurs urinaires d’atteinte tubulaire proximale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42<br />
3.1. Atteinte structurelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43<br />
3.2. Atteinte fonctionnelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45<br />
4. Cellules <strong>de</strong> rein d’opossum : modèle d’étu<strong>de</strong> du tubule proximal . . . . . . . 51<br />
4.1. Caractérisation <strong>de</strong> la lignée <strong>de</strong> cellules OK (opossum kidney) . . . . . . . 51<br />
4.2. Endocytose médiée par récepteur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56<br />
1
5. Toxicité tubulaire <strong><strong>de</strong>s</strong> aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong> . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59<br />
5.1. Néphropathie aux plantes chinoises : aperçu clinique . . . . . . . . . . . . . 61<br />
5.2. Données expérimentales chez l’animal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64<br />
5.2.1. Toxicité aiguë . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64<br />
5.2.2. Toxicité chronique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64<br />
CHAPITRE 2 : BUTS DU TRAVAIL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66<br />
CHAPITRE 3 : METHODOLOGIE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67<br />
1. Etu<strong>de</strong> in vitro : effets <strong><strong>de</strong>s</strong> aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong> sur les cellules rénales<br />
d’opossum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67<br />
1.1. Culture <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules OK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67<br />
1.2. Exposition <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules OK à différentes substances . . . . . . . . . . . . . 67<br />
1.2.1. Aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong> . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67<br />
1.2.2. Cadmium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68<br />
1.2.3. Autres composés contenus dans les gélules amaigrissantes . . 68<br />
1.3. Réabsorption d’albumine et <strong>de</strong> β2-microglobuline . . . . . . . . . . . . . . . . 69<br />
1.3.1. Compétition avec d’autres protéines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69<br />
1.4. Tests <strong>de</strong> cytotoxicité et <strong>de</strong> viabilité cellulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70<br />
1.4.1. Dosage <strong>de</strong> lactate déshydrogénase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70<br />
1.4.2. Dosage <strong>de</strong> 3-(4,5-diméthyl-thiazoyl-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium<br />
bromi<strong>de</strong> (MTT) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70<br />
1.5. Observations en microscopie <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules OK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71<br />
1.5.1. Microscopie conventionnelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71<br />
1.5.2. Microscopie confocale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71<br />
1.6. Marquage <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines à la [ 35 S]L-méthionine . . . . . . . . . . . . . . . . . 72<br />
1.7. Réabsorption <strong>de</strong> méthyl-α-D-glucopyranosi<strong>de</strong> (AMG) . . . . . . . . . . . . 73<br />
1.8. Détection <strong><strong>de</strong>s</strong> adduits d’ADN spécifiques aux aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong> . . 73<br />
1.9. Analyse <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong> la mégaline dans les extraits cellulaires . . 74<br />
1.10. Analyses statistiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75<br />
2
2. Etu<strong>de</strong> in vivo : effets <strong>de</strong> l’intoxication aux aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong> sur l’épithélium<br />
tubulaire proximal <strong>de</strong> rat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76<br />
2.1. Conditionnement <strong><strong>de</strong>s</strong> rats Wistar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76<br />
2.2. Administration <strong><strong>de</strong>s</strong> aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong> aux rats . . . . . . . . . . . . . . . 76<br />
2.2.1. Modèle initial <strong>de</strong> la néphropathie aux aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong> : rats<br />
traités pendant 35 jours . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77<br />
2.2.2. Protocole court : rats traités pendant 5 jours . . . . . . . . . . . . . 77<br />
2.2.3. Protocole <strong><strong>de</strong>s</strong>tiné à <strong><strong>de</strong>s</strong> étu<strong><strong>de</strong>s</strong> histologiques particulières (10 jours)77<br />
2.3. Prélèvement <strong><strong>de</strong>s</strong> urines, du sang et <strong><strong>de</strong>s</strong> reins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78<br />
2.4. Dosages <strong>de</strong> la créatinine plasmatique et urinaire . . . . . . . . . . . . . . . . 79<br />
2.5. Dosage <strong>de</strong> l’activité leucine aminopeptidase dans l’urine . . . . . . . . . . 79<br />
2.6. Dosage <strong>de</strong> l’activité endopeptidase neutre dans l’urine . . . . . . . . . . . . 80<br />
2.7. Dosage <strong>de</strong> l’activité N-acétyl-β-D-glucosaminidase dans l’urine . . . . . 81<br />
2.8. Dosage et analyse <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines urinaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81<br />
2.9. Dosage d’albumine plasmatique et urinaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82<br />
2.10. Dosage d’alpha-glutathion-S-transférase urinaire . . . . . . . . . . . . . . . 83<br />
2.11. Dosages <strong>de</strong> sodium, potassium et glucose urinaire et plasmatique . . 83<br />
2.12. Histologie rénale conventionnelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84<br />
2.13. Immunomarquage <strong>de</strong> l’endopeptidase neutre . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86<br />
2.14. Immunomarquages <strong>de</strong> la mégaline et <strong>de</strong> la cubiline . . . . . . . . . . . . . 87<br />
2.15. Microscopie électronique (étu<strong>de</strong> préliminaire) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88<br />
2.16. Détection <strong><strong>de</strong>s</strong> adduits d’ADN spécifiques aux aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong> dans le<br />
cortex rénal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88<br />
2.17. Analyses statistiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89<br />
CHAPITRE 4 : RESULTATS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90<br />
1. Etu<strong>de</strong> in vitro : effets <strong><strong>de</strong>s</strong> aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong> sur la lignée cellulaire <strong>de</strong> rein<br />
d’opossum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . 90<br />
1.1. Endocytose <strong>de</strong> protéines médiée par récepteur . . . . .. . . . . . . . . . . . . 90<br />
1.1.1. Albumine . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90<br />
1.1.2. Autres protéines . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92<br />
1.1.3. β2-microglobuline . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92<br />
3
1.1.4. Compétition entre albumine et β2-microglobuline . . . . . . . . . . . 92<br />
1.2. Inhibition <strong>de</strong> la réabsorption d’albumine et <strong>de</strong> β2-microglobuline . . . . . 93<br />
1.2.1. Effets <strong><strong>de</strong>s</strong> aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong> . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94<br />
1.2.2. Effets du cadmium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97<br />
1.2.3. Observation <strong>de</strong> l’inhibition en microscopie confocale . . . . . . . 98<br />
1.2.4. Réversibilité <strong>de</strong> l’inhibition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99<br />
1.3. Viabilité et fonctionnalité <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules OK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100<br />
1.3.1. Tests <strong>de</strong> cytotoxicité et <strong>de</strong> viabilité cellulaire . . . . . . . . . . . . . 100<br />
1.3.2. Synthèse <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102<br />
1.3.3. Réabsorption du glucose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103<br />
1.4. Détection <strong><strong>de</strong>s</strong> adduits d’ADN spécifiques aux aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong> . . 104<br />
1.5. Expression <strong>de</strong> la mégaline . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106<br />
1.5.1. Colocalisation avec l’albumine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106<br />
1.5.2. Effets <strong><strong>de</strong>s</strong> aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong> . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107<br />
1.6. Effets d’autres composés contenus dans les gélules amaigrissantes . . 108<br />
2. Etu<strong>de</strong> in vivo : effets <strong>de</strong> l’intoxication aux aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong> sur l’épithélium<br />
tubulaire proximal <strong>de</strong> rat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109<br />
2.1. Protocole long : rats traités pendant 35 jours . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109<br />
2.1.1. Paramètres biologiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111<br />
2.1.1.1. Créatinine plasmatique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111<br />
2.1.1.2. Protéines et enzymes urinaires . . . . . . . . . . . . . . . . . 111<br />
2.1.1.3. Relations structure-fonction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116<br />
2.1.2. Observations histologiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116<br />
2.1.2.1. Histologie conventionnelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116<br />
2.1.2.2. Immunomarquage <strong>de</strong> l’endopeptidase neutre . . . . . . 118<br />
2.1.2.3. Evaluation semi-quantitative <strong><strong>de</strong>s</strong> lésions morphologiques 119<br />
2.1.3. Détection <strong><strong>de</strong>s</strong> adduits d’ADN spécifiques aux aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong><br />
dans le cortex rénal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120<br />
2.2. Protocole <strong>de</strong> suivi <strong><strong>de</strong>s</strong> paramètres urinaires : rats traités pendant 35 jours 121<br />
2.2.1. Paramètres reflétant l’atteinte fonctionnelle . . . . . . . . . . . . . . 122<br />
2.2.2. Paramètres reflétant l’atteinte structurelle . . . . . . . . . . . . . . . 122<br />
2.3. Protocole court : rats traités pendant 5 jours . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125<br />
2.3.1. Paramètres biologiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126<br />
4
2.3.1.1. Créatinine plasmatique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126<br />
2.3.1.2. Protéines et enzymes urinaires . . . . . . . . . . . . . . . . . 127<br />
2.3.1.3. Relations structure-fonction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130<br />
2.3.2. Observations histologiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131<br />
2.3.2.1. Histologie conventionnelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131<br />
2.3.2.2. Immunomarquage <strong>de</strong> l’endopeptidase neutre . . . . . . 132<br />
2.3.3. Détection <strong><strong>de</strong>s</strong> adduits d’ADN spécifiques aux aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong><br />
dans le cortex rénal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134<br />
2.4. Protocole <strong><strong>de</strong>s</strong>tiné à <strong><strong>de</strong>s</strong> étu<strong><strong>de</strong>s</strong> histologiques particulières : rats traités pendant<br />
10 jours . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136<br />
2.4.1. Paramètres biologiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136<br />
2.4.2. Immunomarquages <strong>de</strong> la mégaline et <strong>de</strong> la cubiline . . . . . . . . 137<br />
2.4.3. Microscopie électronique : résultats préliminaires . . . . . . . . . 138<br />
CHAPITRE 5 : DISCUSSION ET CONCLUSIONS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141<br />
1. Discussion et conclusion <strong>de</strong> l’approche in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141<br />
2. Discussion et conclusion <strong>de</strong> l’approche in vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147<br />
3. Conclusion générale et perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154<br />
ANNEXE 1 : Sécrétion et réabsorption tubulaires <strong><strong>de</strong>s</strong> drogues et xénobiotiques 158<br />
A.1. Transporteurs tubulaires anioniques (OAT) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158<br />
A.2. Transporteurs tubulaires cationiques (OCT) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161<br />
ANNEXE 2 : Effets <strong><strong>de</strong>s</strong> aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong> sur l’expression <strong>de</strong> protéines<br />
impliquées dans l’endocytose médiée par récepteur . . . . . . . . . . . . . . 165<br />
5
ARTICLES PUBLIES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166<br />
1. Aristolochic acid impe<strong><strong>de</strong>s</strong> endocytosis and induces DNA adducts in proximal tubule<br />
cells. Kidney International 60: 1332-1342, 2001 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166<br />
2. Early proximal tubule injury in experimental aristolochic acid nephropathy: functional<br />
and histological studies. Nephrol Dial Transplant 20: 2321-2332, 2005 . . . . . . 178<br />
BIBLIOGRAPHIE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191<br />
THESE ANNEXE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 214<br />
L’étu<strong>de</strong> dans les cellules tubulaires proximales humaines en culture <strong>de</strong> l’effet <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
ochratoxines (A, B, C) sur les agents médiateurs <strong>de</strong> l’apoptose, l’inflammation et la<br />
fibrose <strong>de</strong>vrait permettre <strong>de</strong> caractériser les voies <strong>de</strong> signalisation <strong><strong>de</strong>s</strong> MAP-kinases<br />
impliquées dans le développement <strong>de</strong> la néphropathie tubulo-interstitielle<br />
6
LISTE DES ABREVIATIONS<br />
AA : Aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong><br />
AAI : Aci<strong>de</strong> aristolochique <strong>de</strong> type I<br />
AAIa : Aci<strong>de</strong> aristolochique <strong>de</strong> type Ia<br />
AAII : Aci<strong>de</strong> aristolochique <strong>de</strong> type II<br />
ADN : Aci<strong>de</strong> désoxyribonucléique<br />
AMC : 7-amino-4-méthyl-coumarine<br />
AMG : Méthyl-α-D-glucopyranosi<strong>de</strong><br />
AMP : Adénosine monophosphate<br />
ATP : Adénosine triphosphate<br />
BCA : Aci<strong>de</strong> bicinchoninique<br />
BSA : Albumine sérique bovine<br />
CHN : Chinese-herb nephropathy, Néphropathie aux plantes chinoises<br />
CPM : Coups par minute<br />
CUB : Complement subcomponents C1r/C1s, epi<strong>de</strong>rmal growth factor-related<br />
sea urchin protein and bone morphogenic protein-1<br />
Cy5 : Cyanine 5<br />
dA-AAI : 7-(déoxyadénosine-N 6 -yl)aristolactame I<br />
dA-AAII : 7-(déoxyadénosine-N 6 -yl)aristolactame II<br />
DAB : 3, 3’-diaminobenzidine<br />
Dab2 : Disabled protein 2<br />
dG-AAI : 7-(déoxyguanosine-N 2 -yl)aristolactame I<br />
DMEM : Milieu Dubbelcco modifié selon Eagle<br />
DMSO : Sulfoxi<strong>de</strong> diméthyle<br />
EC : Enzyme Commission numbers<br />
ECL : Enhanced chemoluminescence<br />
EDTA : Aci<strong>de</strong> tétraacétique éthylènediamine<br />
EGF : Epi<strong>de</strong>rmal growth factor<br />
ELISA : Enzyme-linked immunosorbent assay<br />
FITC : Fluorescéine isothiocyanate<br />
GST : Glutathion-S-transférase<br />
HDL : High <strong>de</strong>nsity lipoprotein, Lipoprotéine <strong>de</strong> haute <strong>de</strong>nsité<br />
HEPES : Aci<strong>de</strong> N-(2-hydroxyéthyl)piperazine-N’-2-éthanesulphonique<br />
HPLC : Chromatographie liqui<strong>de</strong> à haute performance (ou pression)<br />
HRP : Horseradish peroxidase<br />
IGF-1 : Insulin-like growth factor 1<br />
7
Km : Constante <strong>de</strong> Michaelis-Menten<br />
LAP : Leucine aminopeptidase<br />
LDH : Lactate déshydrogénase<br />
LDL : Low <strong>de</strong>nsity lipoprotein, Lipoprotéine <strong>de</strong> faible <strong>de</strong>nsité<br />
LRP : Low <strong>de</strong>nsity lipoprotein receptor related protein<br />
MDR : Multidrug resistance protein<br />
MOPS : Aci<strong>de</strong> morpholinopropanesulphonique<br />
MRP : Multidrug resistance-associated proteins<br />
MTT : 3-(4,5-diméthyl-thiazoyl-2-yl)-2,5-diphenyltétrazolium bromi<strong>de</strong><br />
NAD : Nicotinami<strong>de</strong> adénine dinucléoti<strong>de</strong><br />
NAG : N-acétyl-β-D-glucosaminidase<br />
NaPi : Co-transporteur sodium/phosphate<br />
NEP : Endopeptidase neutre (EC 3.4.24.11)<br />
NHE3 : Echangeur sodium/hydrogène <strong>de</strong> type 3<br />
OAT : Transporteurs d’anions organiques<br />
OCT : Transporteurs <strong>de</strong> cations organiques<br />
OK : Opossum kidney, Rein d’opossum<br />
PAH : Para-aminohippurate<br />
PAI-1 : Plasminogen activator inhibitor-1<br />
PAP : Pancreatitis associated protein-1<br />
PAS : Aci<strong>de</strong> periodique Schiff<br />
PEG : Polyéthylène glycol<br />
PTH : Hormone parathyroïdienne<br />
RAP : Receptor associated protein, Protéine associée au récepteur<br />
RBP : Retinol binding protein, protéine <strong>de</strong> liaison au rétinol<br />
SDS : Dodécyl sulfate <strong>de</strong> sodium<br />
TBS : Tampon Tris salin<br />
TGF-β1 : Transforming growth factor β1<br />
TMB : 3,3’,5,5’ tétraméthylbenzidine<br />
tPA : Tissue plasminogen activator, Activateur tissulaire du plasminogène<br />
TRIC : Tétraméthylrhodamine isothiocyanate<br />
VLDL : Very low <strong>de</strong>nsity lipoprotein, Lipoprotéine <strong>de</strong> très faible <strong>de</strong>nsité<br />
Vmax : Vitesse maximale<br />
8
RESUME<br />
Les aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong> (AA) présents dans les aristoloches sont impliqués<br />
dans le développement d’une insuffisance rénale progressive chez l’homme, appelée<br />
néphropathie aux plantes chinoises (CHN). Elle se caractérise par une atrophie<br />
tubulaire sévère et une fibrose interstitielle associée à une fréquence élevée <strong>de</strong><br />
cancers urothéliaux. L’observation en clinique d’une protéinurie tubulaire a suggéré<br />
que le tubule proximal était la cible <strong><strong>de</strong>s</strong> AA.<br />
Le but <strong><strong>de</strong>s</strong> travaux présentés est d’explorer les premières altérations induites<br />
par les AA au niveau <strong>de</strong> la cellule tubulaire proximale.<br />
L’approche in vitro montre que les AA inhibent <strong>de</strong> manière irréversible la<br />
réabsorption d’albumine par les cellules <strong>de</strong> rein d’opossum (OK). L’altération par les<br />
AA du processus d’endocytose médiée par récepteur s’expliquerait en partie par une<br />
diminution <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong> la mégaline.<br />
L’approche in vivo confirme la survenue précoce d’altérations structurelles et<br />
fonctionnelles <strong>de</strong> l’épithélium tubulaire proximal dans le modèle <strong>de</strong> rat <strong>de</strong> la<br />
néphropathie aux AA. L’évolution <strong>de</strong> ces atteintes est biphasique : phase aiguë<br />
précoce suivie d’une phase chronique conduisant à une atrophie tubulaire majeure et<br />
une fibrose interstitielle. De plus, la diminution <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong> la mégaline et <strong>de</strong> la<br />
cubiline indique également que les AA interfèrent in vivo avec le mécanisme<br />
d’endocytose médiée par récepteur.<br />
En conclusion, les résultats in vivo confirment les observations in vitro, selon<br />
lesquelles les AA induisent <strong><strong>de</strong>s</strong> altérations très précoces <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules tubulaires<br />
proximales. Une meilleure compréhension, à l’ai<strong>de</strong> <strong>de</strong> ces <strong>de</strong>ux approches, <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
mécanismes physiopathologiques <strong>de</strong> l’atteinte tubulaire proximale précoce et <strong>de</strong> son<br />
évolution fournirait <strong><strong>de</strong>s</strong> informations clés pour comprendre le développement et la<br />
progression <strong><strong>de</strong>s</strong> maladies rénales aiguës et/ou chroniques.<br />
9
CHAPITRE 1 : INTRODUCTION<br />
1. Le rein : généralités<br />
Les reins sont au nombre <strong>de</strong> <strong>de</strong>ux et situés entre le péritoine pariétal et la<br />
paroi postérieure <strong>de</strong> l’abdomen. Pour un homme adulte, chaque rein pèse entre 115<br />
et 170 g et mesure en moyenne 10 à 12 cm <strong>de</strong> long, 5 à 7,5 cm <strong>de</strong> large et 2,5 cm<br />
d’épaisseur.<br />
Les reins font partie <strong>de</strong> l’appareil urinaire : l’urine est excrétée <strong>de</strong> chaque rein<br />
par son uretère et accumulée dans la vessie avant d’être évacuée hors <strong>de</strong><br />
l’organisme par l’urètre.<br />
Une <strong><strong>de</strong>s</strong> fonctions principales du rein est <strong>de</strong> maintenir l’homéostasie <strong>de</strong><br />
l’organisme en régulant la composition, le volume et la pression du sang. Pour y<br />
parvenir, le rein contrôle, par réabsorption, l’élimination du sel et <strong>de</strong> l’eau afin <strong>de</strong><br />
maintenir la constance du volume et <strong>de</strong> l’osmolalité du compartiment extracellulaire.<br />
Le rein participe également à la régulation <strong>de</strong> l’équi<strong>libre</strong> aci<strong>de</strong>-base, à l’élimination<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> produits terminaux du métabolisme (par exemple : urée, aci<strong>de</strong> urique) et <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
substances étrangères (par exemple : médicaments, toxines) mais aussi à la<br />
conservation simultanée <strong><strong>de</strong>s</strong> composants essentiels comme le glucose ou les aci<strong><strong>de</strong>s</strong><br />
aminés. Le fonctionnement physiologique du rein est sous la dépendance<br />
d’hormones, comme le système rénine-angiotensine-aldostérone qui participe au<br />
maintien <strong>de</strong> la pression sanguine. Le rein synthétise aussi l’érythropoïétine qui régule<br />
la capacité <strong>de</strong> transport <strong>de</strong> l’oxygène du sang via la stimulation <strong>de</strong> l’érythropoïèse.<br />
Enfin, le rein joue également un rôle dans le catabolisme (exemple : la dégradation<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> protéines et <strong><strong>de</strong>s</strong> pepti<strong><strong>de</strong>s</strong>) et la gluconéogenèse.<br />
10
1.1. Unité anatomique, le néphron<br />
La structure macroscopique <strong><strong>de</strong>s</strong> reins présente l’arrangement <strong><strong>de</strong>s</strong> néphrons<br />
(Fig. 1). Le parenchyme, partie fonctionnelle du rein, est composé d’une région<br />
externe, le cortex et une région interne, la médullaire. Le parenchyme rénal contient<br />
approximativement un million <strong>de</strong> structures microscopiques appelées néphrons qui<br />
constituent les unités fonctionnelles du rein. Les néphrons sont localisés pour la plus<br />
gran<strong>de</strong> part dans le cortex mais aussi dans la médullaire.<br />
Hile<br />
Figure 1. Structure macroscopique du rein <strong>de</strong> mammifère. D’après Wheater P.R. et al.<br />
[Wheater P.R. et al., 1979].<br />
La médullaire est composée <strong>de</strong> structures triangulaires striées, les pyrami<strong><strong>de</strong>s</strong><br />
médullaires ou pyrami<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>de</strong> Malpighi. Leur aspect strié s’explique par la présence<br />
<strong>de</strong> tubules droits et <strong>de</strong> vaisseaux sanguins. Les bases <strong><strong>de</strong>s</strong> pyrami<strong><strong>de</strong>s</strong> font face au<br />
cortex, tandis que leurs sommets, les papilles rénales, sont orientés vers le centre du<br />
rein.<br />
11
Le cortex est la région d’aspect lisse qui s’étend <strong>de</strong> la capsule rénale aux<br />
bases <strong><strong>de</strong>s</strong> pyrami<strong><strong>de</strong>s</strong> et dans l’espace entre celles-ci. Le cortex se divise en une<br />
région corticale externe et une région juxta-médullaire interne.<br />
Les calices majeurs ou mineurs sont <strong><strong>de</strong>s</strong> espaces en forme d’entonnoir,<br />
chaque petit calice reçoit l’urine <strong><strong>de</strong>s</strong> tubules collecteurs d’une pyrami<strong>de</strong> et la déverse<br />
dans un grand calice. Les calices convergent pour former une gran<strong>de</strong> cavité, le<br />
bassinet rénal. L’urine est évacuée vers la vessie par l’uretère.<br />
L’artère et la veine rénale pénètrent et quittent le rein au-<strong><strong>de</strong>s</strong>sus <strong>de</strong> l’uretère<br />
au niveau du hile.<br />
Le rein est entouré <strong>de</strong> 3 couches <strong>de</strong> tissus. La couche interne, la capsule<br />
fibreuse est une membrane fibreuse lisse et transparente qui est en continuité avec<br />
la couche externe <strong>de</strong> l’uretère au niveau du hile. La couche moyenne, la capsule<br />
adipeuse, est une masse <strong>de</strong> tissu adipeux qui entoure la capsule fibreuse. La couche<br />
externe, le fascia rénal, est une fine couche <strong>de</strong> tissu conjonctif <strong>de</strong>nse irrégulier qui<br />
fixe le rein aux organes adjacents et à la paroi abdominale.<br />
1.2. Unité fonctionnelle, le néphron<br />
Le néphron est l’unité fonctionnelle du rein dont les trois fonctions principales<br />
sont : la filtration, la réabsorption et la sécrétion. Le néphron est constitué <strong>de</strong> <strong>de</strong>ux<br />
parties principales : le corpuscule rénal ou glomérule rénal et le tubule rénal. (Fig. 2)<br />
1.2.1. Le glomérule<br />
Le glomérule rénal est la partie du néphron responsable <strong>de</strong> la filtration du<br />
sang. Il est composé <strong>de</strong> <strong>de</strong>ux structures, la capsule <strong>de</strong> Bowman et le glomérule (Fig.<br />
3).<br />
12
CONNECTING TUBULE<br />
ASCENDING THIN LIMB<br />
OF HENLE’S LOOP<br />
GLOMERULUS<br />
DISTAL CONVOLUTED TUBULE<br />
DISTAL STRAIGHT TUBULE<br />
(THICK ASCENDING LIMB OF HENLE’S LOOP)<br />
Figure 2. Schéma <strong><strong>de</strong>s</strong> différentes subdivisions d’un rein <strong>de</strong> mammifère montrant la<br />
localisation <strong><strong>de</strong>s</strong> segments <strong><strong>de</strong>s</strong> néphrons par rapport aux parties du rein. D’après Maunsbach<br />
A.B. et al. [Maunsbach A.B. et al., 1992].<br />
La capsule <strong>de</strong> Bowman est formée par une seule couche <strong>de</strong> cellules aplaties<br />
reposant sur une membrane basale et constitue le feuillet pariétal qui est en<br />
continuité avec l’épithélium bordant le tubule rénal.<br />
Le glomérule est composé d’un réseau capillaire étroitement pelotonné qui<br />
s’invagine dans la capsule <strong>de</strong> Bowman et est enveloppé par une couche <strong>de</strong> cellules<br />
épithéliales, les podocytes, qui forment le feuillet viscéral <strong>de</strong> la capsule <strong>de</strong> Bowman.<br />
13
Figure 3. Schéma <strong><strong>de</strong>s</strong> principales structures du glomérule <strong>de</strong> mammifère. [Wheater P.R. et<br />
al., 1979].<br />
L’espace entre le feuillet pariétal et viscéral, appelé espace capsulaire, est en<br />
continuité avec la lumière du tubule rénal et constitue le pôle urinaire. A l’opposé,<br />
au pôle vasculaire, l’artériole afférente amène le sang au glomérule et le sang quitte<br />
le glomérule par l’artériole efférente après avoir circulé dans les capillaires.<br />
Le mésangium, composé <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules mésangiales et <strong>de</strong> la matrice<br />
mésangiale, est un autre élément important du glomérule. Les cellules mésangiales,<br />
apparentées aux monocytes, entourent les capillaires glomérulaires, leur fournissant<br />
un support structurel. Les cellules produisent la matrice extracellulaire, possé<strong>de</strong>nt<br />
une activité <strong>de</strong> phagocytose et sécrètent <strong><strong>de</strong>s</strong> prostaglandines, <strong><strong>de</strong>s</strong> pepti<strong><strong>de</strong>s</strong> et <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
cytokines.<br />
La fonction principale du glomérule est l’ultrafiltration du plasma au travers <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
capillaires glomérulaires. La barrière <strong>de</strong> filtration est composée <strong>de</strong> l’endothélium du<br />
capillaire, la membrane basale du capillaire et les podocytes. L’endothélium présente<br />
<strong>de</strong> nombreux pores ou fenestrations permettant à l’eau, aux protéines <strong>de</strong> petite taille<br />
et aux petites molécules <strong>de</strong> soluté comme le sodium, l’urée et le glucose, <strong>de</strong> passer<br />
14
<strong>libre</strong>ment mais retenant les cellules. Comme les cellules endothéliales expriment <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
glycoprotéines chargées négativement à leur surface, la filtration <strong><strong>de</strong>s</strong> grosses<br />
protéines anioniques peut être retardée. La membrane basale du capillaire est une<br />
matrice poreuse <strong>de</strong> protéines extracellulaires présentant <strong><strong>de</strong>s</strong> charges négatives à sa<br />
surface, c’est une barrière <strong>de</strong> filtration importante pour les protéines plasmatiques.<br />
Les podocytes possè<strong>de</strong>nt <strong>de</strong> longs prolongements cytoplasmiques en forme <strong>de</strong><br />
pieds, appelés pédicelles, qui entourent complètement la surface externe <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
capillaires. Les pédicelles entremêlés recouvrent la membrane basale, les espaces<br />
présents entre les pédicelles forment les fentes <strong>de</strong> filtration. Une membrane mince<br />
s’étend à la surface <strong>de</strong> ces fentes <strong>de</strong> filtration, empêchant le passage <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines<br />
<strong>de</strong> taille moyenne (Fig. 4).<br />
La structure <strong>de</strong> la barrière <strong>de</strong> filtration glomérulaire détermine la composition<br />
<strong>de</strong> l’ultrafiltrat du plasma. La barrière <strong>de</strong> filtration glomérulaire limite la filtration <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
molécules en fonction <strong>de</strong> leur taille et <strong>de</strong> leur charge électrique. En général, les<br />
molécules neutres <strong>de</strong> rayon inférieur à 20 Å sont filtrées <strong>libre</strong>ment, les molécules <strong>de</strong><br />
rayon supérieur à 42 Å ne sont pas filtrées et les molécules comprises entre 20 et 42<br />
Å sont filtrées à <strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>de</strong>grés variables.<br />
Le taux <strong>de</strong> filtration glomérulaire est <strong>de</strong> l’ordre <strong>de</strong> 120 ml/min, correspondant à<br />
environ 180 litres <strong>de</strong> plasma filtré par jour.<br />
L’ultrafiltrat plasmatique ou l’urine primitive possè<strong>de</strong> les mêmes concentrations en<br />
sels et en molécules organiques que le plasma.<br />
1.2.2. Le tubule rénal<br />
L’ultrafiltrat, contenu dans l’espace capsulaire, est déversé dans le tubule<br />
rénal qui s’étend <strong>de</strong> la capsule <strong>de</strong> Bowman jusqu’à sa jonction avec un tube<br />
collecteur. La première fonction du tubule rénal est la réabsorption sélective <strong>de</strong> l’eau,<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> ions inorganiques et d’autres molécules au départ <strong>de</strong> l’ultrafiltrat glomérulaire.<br />
15
Le tubule rénal est bordé par une couche unique <strong>de</strong> cellules épithéliales et<br />
comporte trois segments principaux qui sont dans l’ordre : le tubule contourné<br />
proximal, l’anse <strong>de</strong> Henlé et le tubule contourné distal (Fig. 2).<br />
A B<br />
Podocyte<br />
Anses capillaires Espace <strong>de</strong> Bowman<br />
C<br />
0,3 µm<br />
Pore dans<br />
l’endothélium<br />
Lumière du<br />
capillaire<br />
Fentes <strong>de</strong> filtration Pédicelles<br />
Espace <strong>de</strong> Bowman<br />
Podocyte<br />
Membrane basale<br />
Pédicelles<br />
Fentes <strong>de</strong> filtration<br />
Figure 4. Observation en microscopie électronique d’un glomérule (A, grossissement ×<br />
1440) et d’une anse d’un capillaire glomérulaire (B, grossissement × 7200). Vue en section<br />
longitudinale d’un capillaire glomérulaire (C, grossissement × 36000); sur la partie gauche, la<br />
distribution <strong><strong>de</strong>s</strong> charges négatives dans la paroi du capillaire glomérulaire est indiquée.<br />
D’après Valtin H. [Valtin H., 1983].<br />
16
Le tubule proximal est la partie du tubule attachée à la capsule glomérulaire<br />
et la plus longue. La portion initiale du tubule est contournée (tube contourné<br />
proximal, pars convoluta) et se prolonge par une section droite (pars recta). Le tubule<br />
proximal constitue l’essentiel du cortex rénal. Ce segment est plus longuement<br />
détaillé dans les pages suivantes (pages : 20-41).<br />
L’anse <strong>de</strong> Henlé débute à la partie terminale <strong>de</strong> la pars recta sous forme<br />
d’une branche droite à paroi mince, la branche grêle <strong><strong>de</strong>s</strong>cendante, et s’étend du<br />
cortex à la médullaire. Après formation d’une boucle en épingle à cheveux, l’anse <strong>de</strong><br />
Henlé remonte dans le cortex rénal sous forme d’une branche fine ascendante<br />
(uniquement pour les néphrons avec <strong>de</strong> longues anses <strong>de</strong> Henlé) et d’une branche à<br />
paroi plus épaisse, la branche large ascendante.<br />
Un petit segment <strong>de</strong> l’anse large ascendante est constitué <strong>de</strong> cellules spécialisées, la<br />
macula <strong>de</strong>nsa, qui jouxtent l’artériole afférente et efférente du néphron concerné. Les<br />
cellules <strong>de</strong> la macula <strong>de</strong>nsa contrôlent la concentration en sel (NaCl) dans le liqui<strong>de</strong><br />
<strong>de</strong> la lumière du tubule.<br />
L’anse <strong>de</strong> Henlé a pour fonction <strong>de</strong> produire un gradient osmotique du cortex au<br />
sommet <strong>de</strong> la médullaire rénale. La forte pression osmotique <strong><strong>de</strong>s</strong> liqui<strong><strong>de</strong>s</strong><br />
extracellulaires et la présence <strong>de</strong> l’hormone antidiurétique permettent la sortie <strong>de</strong><br />
l’eau par osmose à partir du liqui<strong>de</strong> contenu dans les tubules connecteurs et les<br />
tubes collecteurs. L’anse <strong>de</strong> Henlé et l’hormone antidiurétique sont donc<br />
responsables <strong>de</strong> la production d’une urine qui est hypertonique par rapport au<br />
plasma.<br />
Le tubule distal débute par une portion droite qui correspond à la branche<br />
large ascendante <strong>de</strong> l’anse <strong>de</strong> Henlé et se prolonge par une partie contournée.<br />
Le tubule distal a pour rôle essentiel <strong>de</strong> réabsorber les ions sodium du liqui<strong>de</strong><br />
tubulaire. Ce processus, directement lié à la sécrétion d’ions hydrogène et potassium<br />
dans le flui<strong>de</strong> tubulaire, est sous le contrôle <strong>de</strong> l’aldostérone, une hormone sécrétée<br />
par le cortex surrénalien.<br />
Le tubule connecteur relie ensuite le tubule distal au tubule collecteur. Le<br />
tubule collecteur se subdivise en une partie corticale et une partie médullaire : le<br />
17
tubule collecteur <strong>de</strong> la médullaire externe suivi du tubule collecteur <strong>de</strong> la médullaire<br />
interne.<br />
Les tubes collecteurs <strong>de</strong>viennent perméables à l’eau en présence d’hormone<br />
antidiurétique sécrétée par l’hypophyse. L’eau est alors attirée vers l’extérieur en<br />
raison <strong>de</strong> la forte pression osmotique <strong><strong>de</strong>s</strong> flui<strong><strong>de</strong>s</strong> extracellulaires médullaires.<br />
1.2.3. La vascularisation rénale<br />
Le débit sanguin rénal, assuré par les artères rénales, représente 20 à 25 %<br />
du débit cardiaque, soit environ 1200 ml/min. L’artère rénale se divise en cinq artères<br />
segmentaires afin d’irriguer les différents segments rénaux. Chaque artère<br />
segmentaire se ramifie en artères interlobaires, qui pénètrent le parenchyme et<br />
passent entre les pyrami<strong><strong>de</strong>s</strong> rénales. A la jonction cortico-médullaire, les artères<br />
interlobaires <strong>de</strong>viennent arquées, elles se divisent en une série d’artères<br />
interlobulaires, lesquelles s’enfoncent dans le cortex et se ramifient en artérioles<br />
afférentes. L’artériole afférente se scin<strong>de</strong> pour former les capillaires glomérulaires qui<br />
ensuite fusionnent pour constituer l’artériole efférente à la sortie du glomérule.<br />
Chaque artériole efférente d’un néphron cortical se ramifie en un réseau <strong>de</strong><br />
capillaires péritubulaires autour <strong><strong>de</strong>s</strong> tubules contournés proximal et distal. L’artériole<br />
efférente d’un néphron juxta-médullaire se divise également en capillaires<br />
péritubulaires ainsi qu’en vaisseaux en forme <strong>de</strong> boucle allongée, les vasa recta, qui<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong>cen<strong>de</strong>nt le long <strong>de</strong> l’anse <strong>de</strong> Henlé dans la médullaire (Fig. 5).<br />
Les capillaires péritubulaires se réunissent pour former les veinules péritubulaires,<br />
puis successivement les veines interlobulaires, les veines arquées, les veines<br />
interlobaires, les veines segmentaires et la veine rénale qui sort du rein au hile.<br />
18
A<br />
C<br />
MR = medullary ray<br />
CL = cortical labyrinth<br />
OS = outer stripe<br />
IS = inner stripe<br />
IM = inner medulla<br />
P = renal pelvis<br />
Artères<br />
interlobulaires<br />
Glomérule<br />
Vasa recta<br />
Figure 5. A. Vascularisation artérielle rénale (coupe longitudinale d’un rein <strong>de</strong> lapin). 1 :<br />
artère rénale, 2 : artère interlobaire, 3 : artère arquée, 4: artères interlobulaires. B.<br />
Vascularisation artérielle du cortex et <strong>de</strong> la médulaire externe (coupe longitudinale d’un rein<br />
<strong>de</strong> lapin). D’après INSERM [INSERM., 1980]. C. Schéma <strong>de</strong> la vascularisation rénale.<br />
D’après Kriz W. et al. [Kriz W. et al., 1988].<br />
B<br />
19
2. Le tubule proximal<br />
Le tubule proximal réabsorbe environ 99 % du volume <strong>de</strong> l’ultrafiltrat<br />
glomérulaire (environ 178 l par jour), contenant <strong><strong>de</strong>s</strong> sels, du glucose, <strong><strong>de</strong>s</strong> aci<strong><strong>de</strong>s</strong><br />
aminés, <strong><strong>de</strong>s</strong> vitamines, <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines et d’autres nutriments ainsi que <strong><strong>de</strong>s</strong> produits du<br />
métabolisme. Les constituants réabsorbés <strong>de</strong> l’ultrafiltrat retournent ensuite dans le<br />
sang à travers la paroi du tubule. La portion restante <strong>de</strong> l’ultrafiltrat (1 %, environ 1,5 l<br />
par jour) est excrétée sous forme d’urine. Le tubule proximal réabsorbe au départ <strong>de</strong><br />
l’ultrafiltrat 65 % d’eau, <strong>de</strong> Na + et K + , 60 % <strong>de</strong> Ca 2+ , 15 % <strong>de</strong> Mg 2+ , 55 % <strong>de</strong> Cl - , 93 %<br />
<strong>de</strong> bicarbonate, 65 % <strong>de</strong> phosphate, 96 % du glucose, presque 100 % <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines.<br />
Ces protéines, dites <strong>de</strong> faible poids moléculaire, correspon<strong>de</strong>nt entre autres à la β2-<br />
microglobuline, l’α1-microglobuline, l’α2-microglobuline, la protéine <strong>de</strong> liaison à la<br />
vitamine D, la protéine <strong>de</strong> liaison au rétinol, la protéine <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules <strong>de</strong> Clara<br />
(d’origine pulmonaire), le lysozyme ainsi que l’albumine.<br />
Les protéines sont réabsorbées à la membrane apicale <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules épithéliales du<br />
tubule proximal par un processus complexe et spécifique : l’endocytose médiée par<br />
récepteur. Après l’endocytose, les protéines sont dégradées par la voie lysosomale,<br />
les aci<strong><strong>de</strong>s</strong> aminés produits ainsi que les autres substances réabsorbées sont<br />
transportées au travers <strong>de</strong> la membrane basolatérale <strong>de</strong> la cellule et retournent dans<br />
les capillaires rénaux (Fig. 6).<br />
Apical membrane<br />
Basolateral membrane<br />
Figure 6. Schéma <strong>de</strong> la fonction tubulaire proximale: la réabsorption <strong>de</strong> l’ultrafiltrat<br />
glomérulaire par une cellule tubulaire proximale. D’après Christensen EI et al. [Christensen<br />
E.I. et al., 2002]<br />
20
L’altération <strong>de</strong> ce mécanisme <strong>de</strong> réabsorption tubulaire augmente le taux <strong>de</strong><br />
protéines dans l’urine, conduisant à une protéinurie dite tubulaire.<br />
2.1. L’épithélium tubulaire proximal<br />
Les cellules épithéliales du tubule proximal sont <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules polarisées<br />
possédant une membrane apicale ou luminale, -côté urine-, qui se distingue très<br />
nettement d’un point <strong>de</strong> vue fonctionnel <strong>de</strong> la membrane basale située côté sanguin.<br />
D’un point <strong>de</strong> vue structurel, la membrane apicale présente <strong><strong>de</strong>s</strong> microvillosités, dont<br />
l’ensemble forme la bordure en brosse, augmentant significativement la surface <strong>de</strong> la<br />
membrane.<br />
Chez la plupart <strong><strong>de</strong>s</strong> espèces <strong>de</strong> mammifères, le tubule proximal se subdivise<br />
en 3 segments en fonction <strong>de</strong> la structure <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules tubulaires proximales. Les<br />
<strong>de</strong>ux premiers segments sont principalement localisés dans la partie contournée<br />
(pars convoluta) et le troisième constitue la majeure partie <strong>de</strong> la section droite (pars<br />
recta).<br />
Chez le rat, le premier segment S1 se compose du début <strong>de</strong> la partie contournée, le<br />
second segment S2 consiste en la fin <strong>de</strong> la partie contournée et le tout début <strong>de</strong> la<br />
section droite, et le troisième segment S3 comprend le reste <strong>de</strong> la section droite. Les<br />
cellules du segment S1 sont plus gran<strong><strong>de</strong>s</strong>, les microvillosités <strong>de</strong> la bordure en brosse<br />
plus longues et les vacuoles apicales d’endocytose plus nombreuses que dans le<br />
segment S2. Au niveau du segment S3, les microvillosités <strong>de</strong> la bordure en brosse<br />
sont plus longues que pour les segments S1 et S2. Les mitochondries <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules<br />
du segment S3 sont plus petites, moins nombreuses et dispersées <strong>de</strong> manière plus<br />
aléatoire que dans les <strong>de</strong>ux autres segments, et ne présentent pas une association<br />
étroite avec la membrane plasmique (Fig. 7).<br />
21
Figure 7. Schéma <strong>de</strong> l’ultrastructure <strong>de</strong> l’épithélium <strong>de</strong> chacun <strong><strong>de</strong>s</strong> 3 segments du tubule<br />
proximal chez le rat (S1 à S3), illustrant les différences d’organisation cellulaire et <strong>de</strong><br />
distribution <strong><strong>de</strong>s</strong> mitochondries (M), lysosomes (L) vacuoles d’endocytose (E) et peroxisomes<br />
(P). [Maunsbach A.B. et al., 1992]<br />
2.2. Réabsorption tubulaire<br />
2.2.1. Réabsorption du sodium<br />
Les ions sodium sont réabsorbés dans chaque partie du tubule rénal par <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
systèmes <strong>de</strong> transport qui permettent non seulement <strong>de</strong> récupérer le sodium filtré par<br />
le glomérule mais aussi l’eau, les anions et les nutriments. D’autre part, ces<br />
systèmes <strong>de</strong> transport entraînent parfois la sécrétion <strong>de</strong> substances inutiles telles<br />
que les ions H + et K + excé<strong>de</strong>ntaires.<br />
La concentration intracellulaire du sodium inférieure à la concentration extracellulaire<br />
ainsi que le potentiel intracellulaire négatif induisent un gradient électrochimique<br />
permettant aux ions sodium contenus dans l’ultrafiltrat <strong>de</strong> rentrer par diffusion<br />
passive dans la cellule au travers <strong>de</strong> la bordure en brosse <strong>de</strong> la membrane apicale.<br />
Simultanément, la pompe Na + /K + -ATPase située à la membrane basale expulse du<br />
Na + hors <strong>de</strong> la cellule, tout en introduisant du K + dans la cellule. Les ions K + étant<br />
plus concentrés à l’intérieur <strong>de</strong> la cellule qu’à l’extérieur, le K + diffuse à l’extérieur <strong>de</strong><br />
la cellule par <strong><strong>de</strong>s</strong> canaux (Fig. 8).<br />
22
Na + Na + Na + Na +<br />
K + K +<br />
Na + Na + Na + Na +<br />
K + K +<br />
H 2 O<br />
Cl- Cl , HCO -<br />
3 - , HCO -<br />
3<br />
urée<br />
Apical Basolatéral<br />
Figure 8. Schéma <strong>de</strong> la réabsorption du sodium par la cellule tubulaire proximale du rein <strong>de</strong><br />
mammifère. Le sodium entre dans la cellule par diffusion passive à la membrane apicale et<br />
est transporté à la membrane basale par la pompe Na + /K + -ATPase. Le potassium est<br />
expulsé <strong>de</strong> la cellule par les canaux K + .<br />
Le transport actif primaire <strong>de</strong> sodium par la pompe Na + /K + -ATPase favorise la<br />
réabsorption <strong>de</strong> l’eau par osmose. Par conséquent, la concentration d’autres solutés<br />
est augmentée dans l’ultrafiltrat favorisant ainsi la réabsorption par diffusion facilitée<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> ions K + , Cl - et HCO3 - .<br />
2.2.2. Réabsorption <strong><strong>de</strong>s</strong> nutriments<br />
Na + Na +<br />
H 2 O<br />
Figure 9. Schéma <strong>de</strong> la réabsorption <strong><strong>de</strong>s</strong> nutriments par la cellule tubulaire proximale du rein<br />
<strong>de</strong> mammifère. Le glucose est réabsorbé par le symporteur sodium-glucose.<br />
Na + Na +<br />
K + K +<br />
glucose glucose<br />
ATP<br />
ADP<br />
K + K +<br />
H 2 O<br />
Cl- Cl , HCO -<br />
3 - , HCO -<br />
3<br />
urée<br />
Na + Na +<br />
K + K +<br />
Na + Na +<br />
K + K +<br />
ATP<br />
ADP<br />
Apical Basolatéral<br />
23
Le glucose filtré, les aci<strong><strong>de</strong>s</strong> aminés, l’aci<strong>de</strong> lactique et d’autres métabolites<br />
sont réabsorbés par les symporteurs <strong>de</strong> sodium, qui fonctionnent par transport actif<br />
secondaire. Un symporteur sodium-glucose achemine un ion Na + et une molécule <strong>de</strong><br />
glucose à l’intérieur <strong>de</strong> la cellule et la pompe à sodium permet <strong>de</strong> maintenir la<br />
concentration intracellulaire faible en ions Na + . La réabsorption <strong><strong>de</strong>s</strong> nutriments<br />
entraîne également la réabsorption d’eau par osmose (Fig. 9).<br />
2.3. Sécrétion tubulaire<br />
Les métabolites <strong>de</strong> l’organisme comme l’aci<strong>de</strong> urique, le glucuroni<strong>de</strong>,<br />
l’hippurate, les sulfates ainsi que <strong><strong>de</strong>s</strong> substances exogènes (pénicilline, diurétiques,<br />
aci<strong>de</strong> para-aminohippurique) parviennent dans l’urine tubulaire par sécrétion<br />
transcellulaire. D’autres substances, comme l’ammoniaque et les ions H + , sont<br />
uniquement produites par le métabolisme <strong>de</strong> la cellule tubulaire et parviennent dans<br />
le tubule par sécrétion cellulaire.<br />
La sécrétion tubulaire a pour fonction d’éliminer certaines substances <strong>de</strong><br />
l’organisme et <strong>de</strong> réguler le pH. Les substances sécrétées sont les ions K + , H + et<br />
NH4 + , la créatinine et <strong><strong>de</strong>s</strong> médicaments (exemple : la pénicilline) et l’aci<strong>de</strong> para-<br />
aminohippurique.<br />
2.3.1. Sécrétion d’hydrogène<br />
La sécrétion <strong><strong>de</strong>s</strong> ions H + est effectuée par les antiporteurs Na + /H + situés à la<br />
membrane apicale. Ces systèmes <strong>de</strong> transport actif secondaire dépen<strong>de</strong>nt <strong>de</strong> la<br />
pompe à sodium afin <strong>de</strong> maintenir la concentration intracellulaire <strong>de</strong> sodium faible.<br />
24
2.3.2. Sécrétion d’ammonium<br />
Les cellules tubulaires produisent également <strong>de</strong> l’ammoniaque en désaminant<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> aci<strong><strong>de</strong>s</strong> aminés. La plus gran<strong>de</strong> partie <strong>de</strong> l’ammoniaque s’associe à <strong><strong>de</strong>s</strong> ions H +<br />
pour former <strong><strong>de</strong>s</strong> ions ammonium qui sont sécrétés par <strong><strong>de</strong>s</strong> antiporteurs Na + /NH4 + .<br />
2.4. Endocytose médiée par récepteur<br />
L’endocytose est un processus universel qui consiste pour une cellule à<br />
internaliser, par un système <strong>de</strong> vésicules, <strong><strong>de</strong>s</strong> composants du milieu extérieur. Par<br />
ce mécanisme, les cellules épithéliales polarisées <strong>de</strong> la membrane apicale du tubule<br />
proximal réabsorbent les protéines plasmatiques qui n’ont pas été retenues par la<br />
barrière <strong>de</strong> filtration glomérulaire.<br />
L’épithélium tubulaire est caractérisé par la présence d’un appareillage<br />
d’endocytose particulièrement bien développé (Fig. 10). Les nombreuses<br />
invaginations <strong>de</strong> la membrane apicale à la base <strong><strong>de</strong>s</strong> microvillosités <strong>de</strong> la bordure en<br />
brosse donnent naissance à <strong><strong>de</strong>s</strong> puits recouverts d’un manteau <strong>de</strong> clathrine. Ces<br />
puits se referment pour former <strong><strong>de</strong>s</strong> vésicules intracytoplasmiques, <strong><strong>de</strong>s</strong> petits<br />
endosomes ou préendosomes (< 0,5 µm) ainsi que <strong><strong>de</strong>s</strong> grands endosomes (> 0,5<br />
µm) possédant ou non un manteau <strong>de</strong> clathrine. Des tubules apicaux <strong>de</strong>nses<br />
intracytoplasmiques sont liés aux petits ou aux grands endosomes ou circulent<br />
<strong>libre</strong>ment dans le cytoplasme en direction <strong>de</strong> la membrane apicale. Ces tubules<br />
apicaux <strong>de</strong>nses permettent le recyclage <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines membranaires à la membrane<br />
apicale. Les lysosomes vont ensuite digérer les protéines en aci<strong><strong>de</strong>s</strong> aminés<br />
[Christensen E.I. et al., 1998].<br />
Deux récepteurs multiligands, la mégaline et la cubiline, sont exprimés à la<br />
membrane apicale <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules épithéliales au niveau <strong>de</strong> la bordure en brosse et plus<br />
particulièrement dans les espaces intermicrovillaires. Les ligands liés au complexe<br />
mégaline-cubiline sont internalisés dans les puits à clathrine qui se referment pour<br />
former les vésicules recouvertes <strong>de</strong> clathrine. L’acidification <strong><strong>de</strong>s</strong> endosomes par la<br />
25
présence d’une pompe à proton, la proton ATPase type V et d’un canal chlore ClC5<br />
[Marshansky V. et al., 1997; Marshansky V. et al., 2002] entraîne la perte du<br />
manteau <strong>de</strong> clathrine ainsi que la dissociation du complexe ligand-récepteur. Les<br />
tubules apicaux <strong>de</strong>nses assurent le recyclage <strong>de</strong> la mégaline et <strong>de</strong> la cubiline vers la<br />
membrane apicale. Les ligands sont transférés vers les prélysosomes puis les<br />
lysosomes où ils sont dégradés.<br />
Coated<br />
vesicles<br />
Figure 10. Schéma d’une cellule épithéliale absorptive présentant les mécanismes possibles<br />
par lesquels la mégaline peut médier l’endocytose et le transport transcellulaire. [Christensen<br />
E.I. et al., 2002].<br />
Partie <strong>de</strong> gauche: La mégaline facilite l’endocytose <strong>de</strong> la cubiline par liaison à ce récepteur.<br />
Les vitamines et le fer qui forment un complexe avec une protéine <strong>de</strong> transport ainsi que les<br />
protéines se lient à la mégaline et/ou la cubiline pour être endocytosés. Les ligands se<br />
dissocient <strong><strong>de</strong>s</strong> récepteurs sous l’action du faible pH dans les endosomes et les récepteurs<br />
sont recyclés à la bordure en brosse par les tubules apicaux <strong>de</strong>nses. Les composés<br />
protéiniques sont dégradés alors que les vitamines et le fer sont transportés au travers <strong>de</strong> la<br />
cellule épithéliale (mécanisme inconnu).<br />
La partie <strong>de</strong> droite du schéma montre le transport transcellulaire médié par la mégaline pour<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> protéines spécifiques comme la thyroglobuline [Marino M. et al., 2000] et la protéine <strong>de</strong><br />
liaison au rétinol [Marino M. et al., 2001].<br />
26
2.4.1. Mégaline et cubiline<br />
Structure et ligands<br />
La mégaline et la cubiline sont <strong>de</strong>ux glycoprotéines <strong>de</strong> haut poids moléculaire<br />
dont les caractéristiques principales sont reprises dans le Tableau 1. Ces <strong>de</strong>ux<br />
récepteurs ont une structure très différente : la mégaline est une protéine<br />
transmembranaire contrairement à la cubiline qui est une protéine membranaire<br />
périphérique ne possédant pas <strong>de</strong> domaine transmembranaire (Fig. 11).<br />
Tableau 1 : Caractéristiques <strong>de</strong> la mégaline et <strong>de</strong> la cubiline<br />
Mégaline Cubiline<br />
gp330<br />
antigène <strong>de</strong> la néphrite d’Heymann<br />
[Kerjaschki D. et al., 1982]<br />
gp280<br />
récepteur du complexe facteur intrinsèque<br />
gastrique/cobalamine<br />
[Seetharam B. et al., 1997]<br />
600 kDa 460 kDa<br />
Glycoprotéine récepteur transmembranaire<br />
constituée d’un grand domaine<br />
extracellulaire amino-terminal, un seul<br />
domaine transmembranaire et d’une petite<br />
extrémité cytoplasmique carboxy-terminale<br />
[Saito A. et al., 1994]<br />
Les séquences complètes d’ADN<br />
complémentaire ont été déterminées chez le<br />
rat [Saito A. et al., 1994] et chez l’homme<br />
[Hjalm G. et al., 1996] et présentent 77 %<br />
d’i<strong>de</strong>ntité.<br />
Gène humain localisé sur le chromosome<br />
2q24-q31<br />
[Korenberg J.R. et al., 1994]<br />
Appartient à la famille <strong><strong>de</strong>s</strong> lipoprotéines<br />
récepteurs <strong>de</strong> faible <strong>de</strong>nsité<br />
[Raychowdhury R. et al., 1989]<br />
Glycoprotéine périphérique <strong>de</strong> la membrane<br />
qui ne possè<strong>de</strong> pas <strong>de</strong> domaine<br />
transmembranaire ni d’ancre<br />
glycosylphosphatidyinositol. La région<br />
amino-terminale (100 résidus) est<br />
probablement nécessaire à l’association du<br />
récepteur à la membrane plasmique.<br />
[Kristiansen M. et al., 1999]<br />
Les séquences complètes d’ADN<br />
complémentaire ont été caractérisées pour<br />
le rat [Moestrup S.K. et al., 1998a], l’homme<br />
[Kozyraki R. et al., 1998] et le chien [Xu D. et<br />
al., 1999]. Homologie <strong>de</strong> séquence <strong>de</strong> 70 %.<br />
Gène humain localisé sur le chromosome<br />
10p12.33-p13<br />
[Kozyraki R. et al., 1998]<br />
27
Apical plasma membrane<br />
Figure 11. Structure <strong>de</strong> la mégaline et <strong>de</strong> la cubiline. D’après Christensen EI et al.<br />
[Christensen E.I. et al., 2002]<br />
La mégaline est constituée d’un grand domaine extracellulaire (~ 4400 aci<strong><strong>de</strong>s</strong><br />
aminés) composé <strong>de</strong> 4 groupements riches en cystéine <strong>de</strong> type A « repeats » <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
récepteurs <strong><strong>de</strong>s</strong> lipoprotéines <strong>de</strong> faible <strong>de</strong>nsité (LDL) qui correspon<strong>de</strong>nt aux régions<br />
<strong>de</strong> liaison <strong><strong>de</strong>s</strong> ligands [Hjalm G. et al., 1996; Korenberg J.R. et al., 1994;<br />
Raychowdhury R. et al., 1989; Saito A. et al., 1994]. Ces régions sont séparées par<br />
17 domaines EGF (epi<strong>de</strong>rmal growth factor) <strong>de</strong> type « repeats » et <strong>de</strong> 8 régions<br />
d’espacement pauvres en cystéine contenant <strong><strong>de</strong>s</strong> motifs YWTD qui interviennent<br />
dans la libération <strong><strong>de</strong>s</strong> ligands dépendant du pH dans les endosomes [Davis C.G. et<br />
al., 1987]. Un seul domaine transmembranaire (22 aci<strong><strong>de</strong>s</strong> aminés) est suivi <strong>de</strong><br />
l’extrémité cytoplasmique (213 aci<strong><strong>de</strong>s</strong> aminés) constituée <strong>de</strong> 2 séquences NPXY qui<br />
permettent l’internalisation <strong><strong>de</strong>s</strong> puits <strong>de</strong> clathrine [Chen W.J. et al., 1990] et une<br />
séquence ressemblant au motif NPXY.<br />
La cubiline est principalement composée d’un domaine extracellulaire<br />
composé <strong>de</strong> 27 domaines CUB (complement subcomponents C1r/C1s, EGF-related<br />
sea urchin protein and bone morphogenic protein-1) qui permettent l’interaction avec<br />
plusieurs protéines [Kristiansen M. et al., 1999; Kristiansen M. et al., 2000]. Les<br />
domaines CUB sont précédés d’une séquence <strong>de</strong> 110 aci<strong><strong>de</strong>s</strong> aminés suivie <strong>de</strong> 8<br />
domaines EGF <strong>de</strong> type « repeats ». La région amino-terminale comporte un site<br />
28
potentiel <strong>de</strong> palmitoylation et une structure aliphatique en hélice alpha. Ces <strong>de</strong>ux<br />
structures semblent contribuer à l’ancrage du récepteur dans la membrane<br />
[Kristiansen M. et al., 1999].<br />
La structure <strong>de</strong> la cubiline présente très peu d’homologie avec d’autres<br />
récepteurs connus d’endocytose tandis que la mégaline appartient à la famille <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
récepteurs LDL (Fig. 12). L’étroite homologie entre la structure <strong>de</strong> la mégaline et du<br />
récepteur d’endocytose chez le némato<strong>de</strong> Caenorhabditis elegans indique que cette<br />
protéine est fortement conservée au cours <strong>de</strong> l’évolution [Yochem J. et al., 1993].<br />
Figure 12. Superfamille <strong><strong>de</strong>s</strong> récepteurs LDL (low <strong>de</strong>nsity lipoprotein) montrant les<br />
homologies <strong>de</strong> structure entre les membres <strong>de</strong> cette famille: récepteur LDL, récepteur VLDL<br />
(very low <strong>de</strong>nsity lipoprotein), récepteur 2 <strong>de</strong> l’apolipoprotéine E, LRP (LDL receptor related<br />
protein), la mégaline et le récepteur chez Caenorhabditis elegans. [Christensen E.I. et al.,<br />
1999b].<br />
La cubiline ne possè<strong>de</strong> pas <strong>de</strong> site d’interaction avec les protéines<br />
adaptatrices ou d’autres médiateurs <strong>de</strong> l’endocytose dépendante <strong>de</strong> la clathrine ; une<br />
liaison <strong>de</strong> haute affinité, calcium dépendante, et partiellement inhibée par la protéine<br />
associée au récepteur (RAP) a été décrite entre la cubiline et la mégaline in vitro. La<br />
mégaline semble donc médier l’endocytose et le transport intracellulaire <strong>de</strong> la<br />
cubiline [Moestrup S.K. et al., 1998a]. En plus <strong>de</strong> cette interaction directe entre les<br />
<strong>de</strong>ux récepteurs, la mégaline et la cubiline ont plusieurs ligands en commun<br />
(Tableau 2). La co-localisation entre la mégaline et la cubiline ainsi que<br />
29
l’internalisation <strong>de</strong> l’albumine médiée par la mégaline et la cubiline sont décrites dans<br />
le tubule proximal chez la souris (Fig. 13) [Christensen E.I. et al., 2004] et dans les<br />
cellules tubulaires proximales <strong>de</strong> rein d’opossum [Zhai X.Y. et al., 2000].<br />
Figure 13. Colocalisation <strong>de</strong> la mégaline, cubiline et <strong>de</strong> l’albumine à la membrane apicale<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> cellules tubulaires proximales <strong>de</strong> souris. D’après Christensen EI et al. [Christensen E.I.<br />
et al., 2004].<br />
A. Double marquage en immunofluorescence <strong>de</strong> la mégaline (vert) et <strong>de</strong> la cubiline (rouge).<br />
La couleur jaune illustre la colocalisation <strong>de</strong> la mégaline et <strong>de</strong> la cubiline au niveau <strong>de</strong><br />
l’épithélium apical <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules. B. Double marquage en immunofluorescence <strong>de</strong> la mégaline<br />
(vert) et <strong>de</strong> l’albumine (rouge). La couleur jaune correspond à la colocalisation <strong>de</strong> la<br />
mégaline et <strong>de</strong> l’albumine à la membrane apicale <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules. Barre = 10 µm.<br />
Expression et régulation<br />
La mégaline et la cubiline sont exprimées au niveau <strong>de</strong> la membrane<br />
plasmique et <strong>de</strong> l’appareillage d’endocytose <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules épithéliales (Tableau 3).<br />
Elles sont co-exprimées par plusieurs épithéliums d’absorption comme l’intestin grêle<br />
[Birn H. et al., 1997; Levine J.S. et al., 1984], le tubule proximal rénal [Chatelet F. et<br />
al., 1986a; Kerjaschki D. et al., 1982; Sahali D. et al., 1988; Seetharam B. et al.,<br />
1988], le feuillet viscéral du sac vitellin [Chatelet F. et al., 1986b; Sahali D. et al.,<br />
1988] et le cytotrophoblaste placentaire [Juhlin C. et al., 1990; Sahali D. et al., 1992].<br />
La mégaline semble être plus largement distribuée que la cubiline ; elle est entre<br />
autre présente au niveau <strong><strong>de</strong>s</strong> podocytes glomérulaires <strong>de</strong> rat [Kerjaschki D. et al.,<br />
1982].<br />
30
Tableau 2 : Ligands <strong>de</strong> la mégaline et <strong>de</strong> la cubiline [Christensen E.I. et al., 2002]<br />
Mégaline Cubiline<br />
Protéines <strong>de</strong> liaison <strong><strong>de</strong>s</strong> vitamines<br />
Transcobalamine – vitamine B12 [Moestrup S.K. et al., 1996]<br />
Facteur intrinsèque – vitamine B12 [Seetharam B. et al., 1997]<br />
Protéine <strong>de</strong> liaison <strong>de</strong> la vitamine D [Nykjaer A. et al., 1999]<br />
Protéine <strong>de</strong> liaison <strong>de</strong> la vitamine D [Nykjaer A. et al., 2001]<br />
Protéine <strong>de</strong> liaison du rétinol [Christensen E.I. et al., 1999a]<br />
Autres protéines <strong>de</strong> transport<br />
Albumine [Cui S. et al., 1996; Zhai X.Y. et al., 2000]<br />
Lactoferrine [Willnow T.E. et al., 1992]<br />
Albumine [Birn H. et al., 2000a; Zhai X.Y. et al., 2000]<br />
Hémoglobine [Gburek J. et al., 2002]<br />
Transferrine [Kozyraki R. et al., 2001]<br />
Myoglobine [Gburek J. et al., 2003]<br />
Hémoglobine [Gburek J. et al., 2002]<br />
Odorant-binding protein [Leheste J.R. et al., 1999]<br />
Myoglobine [Gburek J. et al., 2003]<br />
Transthyrétine [Sousa M.M. et al., 2000]<br />
Lipoprotéines<br />
Apolipoprotéine B [Stefansson S. et al., 1995a]<br />
Apolipoprotéine E [Willnow T.E. et al., 1992]<br />
Apolipoprotéine A-I [Kozyraki R. et al., 1999]<br />
Apolipoprotéine J/clusterine [Kounnas M.Z. et al., 1995]<br />
HDL (high <strong>de</strong>nsity lipoprotein) [Hammad S.M. et al., 1999]<br />
Apolipoprotéine H [Moestrup S.K. et al., 1998b]<br />
Hormones et hormones précurseurs<br />
Hormone parathyroïdienne [Hilpert J. et al., 1999]<br />
Insuline [Orlando R.A. et al., 1998]<br />
EGF [Orlando R.A. et al., 1998]<br />
Prolactine [Orlando R.A. et al., 1998]<br />
Thyroglobuline [Zheng G. et al., 1998]<br />
31
Aminoglycosi<strong><strong>de</strong>s</strong> [Moestrup S.K. et al., 1995]<br />
Polymyxine B [Moestrup S.K. et al., 1995]<br />
Aprotinine [Moestrup S.K. et al., 1995]<br />
Trichosanthine [Chan W.L. et al., 2000]<br />
PAI-1 [Stefansson S. et al., 1995b]<br />
PAI-1-urokinase [Moestrup S.K. et al., 1993]<br />
PAI-1-tPA [Moestrup S.K. et al., 1993; Willnow T.E. et al., 1992]<br />
Pro-urokinase [Stefansson S. et al., 1995b]<br />
Lipoprotéine lipase [Kounnas M.Z. et al., 1993]<br />
Plasminogène [Kanalas J.J. et al., 1993]<br />
β-amylase [Birn H. et al., 2000b]<br />
α1-microglobuline [Leheste J.R. et al., 1999]<br />
Lysozyme [Orlando R.A. et al., 1998]<br />
Chaînes légères <strong><strong>de</strong>s</strong> immunoglobulines [Birn H. et al., 2002]<br />
PAP-1 [Leheste J.R. et al., 1999]<br />
β2-microglobuline [Orlando R.A. et al., 1998]<br />
Drogues et toxines<br />
Enzymes et inhibiteurs d’enzymes<br />
Protéines apparentées à la réponse immune et <strong>de</strong> stress<br />
Autres<br />
RAP [Christensen E.I. et al., 1992; Kanalas J.J. et al., 1993; Kounnas<br />
M.Z. et al., 1992; Orlando R.A. et al., 1998; Willnow T.E. et al., 1992]<br />
Ca 2+ RAP [Birn H. et al., 1997]<br />
[Christensen E.I. et al., 1992]<br />
Cytochrome c [Orlando R.A. et al., 1998]<br />
Chaînes légères <strong><strong>de</strong>s</strong> immunoglobulines [Batuman V. et al., 1998]<br />
Protéine sécrétée par les cellules <strong>de</strong> Clara [Burmeister R. et al., 2001]<br />
32
Tableau 3 : Expression <strong>de</strong> la mégaline et <strong>de</strong> la cubiline [Christensen E.I. et al., 2002; Moestrup S.K. et al., 2001]<br />
Organe Mégaline Cubiline Références<br />
Rein : tubule proximal + +<br />
[Chatelet F. et al., 1986a; Kerjaschki D. et al., 1982; Sahali D. et al., 1988;<br />
Seetharam B. et al., 1988]<br />
Rein : podocytes du glomérule (chez le rat<br />
uniquement)<br />
+ - [Kerjaschki D. et al., 1982]<br />
Intestin grêle + + [Birn H. et al., 1997; Levine J.S. et al., 1984]<br />
Poumons : pneumocytes <strong>de</strong> type II + - [Chatelet F. et al., 1986b; Kounnas M.Z. et al., 1994; Zheng G. et al., 1994]<br />
Thyroï<strong>de</strong> + - [Kounnas M.Z. et al., 1994; Zheng G. et al., 1994]<br />
Thymus + + [Hammad S.M. et al., 2000]<br />
Cellules sécrétant l’hormone parathyroïdienne<br />
<strong>de</strong> la glan<strong>de</strong> parathyroï<strong>de</strong><br />
+ - [Juhlin C. et al., 1987; Zheng G. et al., 1994]<br />
Cellules <strong>de</strong> l’épendyme + - [Zheng G. et al., 1994]<br />
Epithélium ciliaire <strong>de</strong> l’oeil + - [Lundgren S. et al., 1997; Zheng G. et al., 1994]<br />
Epithélium <strong>de</strong> l’oreille interne + - [Kounnas M.Z. et al., 1994; Mizuta K. et al., 1999]<br />
Plexus choroï<strong><strong>de</strong>s</strong> + - [Kounnas M.Z. et al., 1994]<br />
Oviductes + - [Zheng G. et al., 1994]<br />
Muqueuse utérine + + [Zheng G. et al., 1994]<br />
Epididyme + - [Chatelet F. et al., 1986b; Zheng G. et al., 1994]<br />
Feuillet viscéral du sac vitellin + + [Chatelet F. et al., 1986b; Sahali D. et al., 1988]<br />
Cytotrophoblaste placentaire + + [Juhlin C. et al., 1990; Sahali D. et al., 1992]<br />
Endomètre + - [Bernadotte F. et al., 1989; Sahali D. et al., 1992]<br />
Trophecto<strong>de</strong>rme + - [Sahali D. et al., 1993]<br />
33
Dans les cellules du tubule proximal rénal et du feuillet viscéral du sac vitellin,<br />
la mégaline et la cubiline sont co-localisées tout au long <strong>de</strong> l’appareillage<br />
d’endocytose [Christensen E.I. et al., 1992; Kerjaschki D. et al., 1984; Sahali D. et<br />
al., 1988] incluant la bordure en brosse, les puits recouverts d’un manteau <strong>de</strong><br />
clathrine, les vésicules endocytaires et les tubules apicaux <strong>de</strong>nses [Christensen E.I.<br />
et al., 1998] (Fig. 14).<br />
Figure 14. Expression <strong>de</strong> la mégaline et <strong>de</strong> la cubiline dans l’appareillage endocytaire <strong>de</strong> la<br />
membrane apicale <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules tubulaires proximales du rein <strong>de</strong> rat. D’après Christensen EI<br />
et al. [Christensen E.I. et al., 2002].<br />
Les récepteurs sont i<strong>de</strong>ntifiés par immunocytochimie sur une cryosection <strong>de</strong> cortex rénal <strong>de</strong><br />
rat à l’ai<strong>de</strong> d’un anticorps <strong>de</strong> mouton anti-mégaline <strong>de</strong> rat marqué par un anticorps<br />
secondaire anti-mouton couplé à <strong><strong>de</strong>s</strong> particules d’or <strong>de</strong> 5 nm, et d’un anticorps <strong>de</strong> lapin anticubiline<br />
<strong>de</strong> rat marqué par un anticorps secondaire anti-lapin couplé à <strong><strong>de</strong>s</strong> particules d’or <strong>de</strong><br />
10 nm. Les récepteurs sont coexprimés sur les microvillosités (MV), dans les puits<br />
recouverts d’un manteau <strong>de</strong> clathrine à la membrane apicale (CP, coated pits), dans les<br />
endosomes (E) et dans les tubules apicaux <strong>de</strong>nses. Barre = 300 nm.<br />
L’expression <strong>de</strong> la mégaline et <strong>de</strong> la cubiline in vitro est stimulée par l’aci<strong>de</strong><br />
rétinoïque et le dibutyryl cyclique AMP, l’expression <strong>de</strong> la mégaline par la vitamine D<br />
[Hammad S.M. et al., 1999; Liu W. et al., 1998; Stefansson S. et al., 1995a].<br />
Une augmentation <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong> la mégaline est observée dans les reins<br />
<strong>de</strong> rats atteints <strong>de</strong> la néphrite d’Heymann, maladie glomérulaire expérimentale<br />
induite par <strong><strong>de</strong>s</strong> autoanticorps dirigés contre la mégaline [Makker S.P. et al., 1995].<br />
Les cellules neuronales, touchées dans la maladie d’Alzheimer, sont caractérisées<br />
par un dépôt extracellulaire <strong>de</strong> protéines β-amyloï<strong><strong>de</strong>s</strong> ; parallèlement, ces neurones<br />
34
présentent une accumulation intracellulaire d’apolipoprotéine E ainsi qu’une forte<br />
expression <strong>de</strong> mégaline à la surface cellulaire [LaFerla F.M. et al., 1997].<br />
Une diminution <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong> la mégaline au niveau rénal est observée dans<br />
certaines maladies caractérisées par une protéinurie et un défaut <strong>de</strong> réabsorption<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> protéines filtrées. Notamment, la maladie <strong>de</strong> Dent est causée par <strong><strong>de</strong>s</strong> mutations<br />
au niveau du canal chlore rénal ClC-5 [Thakker R.V., 1998]. En effet, une<br />
perturbation du ClC-5 diminue la réabsorption tubulaire proximale et induit une<br />
réduction <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong> la mégaline dans le tubule proximal [Piwon N. et al.,<br />
2000]. Ces observations indiquent donc l’existence d’une corrélation fonctionnelle<br />
entre le ClC-5 et l’endocytose médiée par la mégaline.<br />
Fonction<br />
L’implication <strong>de</strong> la mégaline et <strong>de</strong> la cubiline dans le processus <strong>de</strong><br />
réabsorption tubulaire <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines <strong>de</strong> faible poids moléculaire contenues dans<br />
l’ultrafiltrat glomérulaire est confirmée par le fait que les souris déficientes en<br />
mégaline ainsi que les chiens ayant une mauvaise post-transcription <strong>de</strong> la cubiline<br />
présentent une augmentation <strong>de</strong> l’excrétion urinaire <strong><strong>de</strong>s</strong> microprotéines.<br />
L’étu<strong>de</strong> sur <strong><strong>de</strong>s</strong> souris dont le gène <strong>de</strong> la mégaline a été invalidé montre que<br />
la plupart <strong><strong>de</strong>s</strong> souris meurent avant la naissance à cause <strong>de</strong> complications<br />
respiratoires liées à une altération <strong>de</strong> l’insufflation <strong><strong>de</strong>s</strong> poumons [Willnow T.E. et al.,<br />
1996]. Ces souris sont également caractérisées par <strong><strong>de</strong>s</strong> malformations du cerveau<br />
antérieur et <strong><strong>de</strong>s</strong> structures dérivées du cerveau antérieur, ce qui cause le syndrome<br />
d’holoprosencéphalie. Par conséquent, seulement 1 souris déficiente en mégaline<br />
sur 50 atteint l’âge adulte. Les urines <strong>de</strong> ces souris contiennent les protéines <strong>de</strong><br />
faible poids moléculaire, tout comme celles <strong><strong>de</strong>s</strong> patients atteints du syndrome <strong>de</strong><br />
Fanconi [Leheste J.R. et al., 1999]. En outre, les souris déficientes en mégaline<br />
présentent également <strong><strong>de</strong>s</strong> perturbations <strong>de</strong> l’homéostasie du calcium.<br />
L’étu<strong>de</strong> <strong>de</strong> patients ayant un déficit héréditaire <strong>de</strong> l’absorption <strong>de</strong> la vitamine<br />
B12, connu sous le nom d’anémie mégaloblastique autosomique récessive ou<br />
syndrome d’Imerslund-Gräsbeck, a permis d’acquérir la certitu<strong>de</strong> que la cubiline était<br />
le récepteur physiologique du complexe facteur intrinsèque/vitamine B12. En effet,<br />
35
<strong>de</strong>ux mutations différentes ont été i<strong>de</strong>ntifiées au niveau du gène <strong>de</strong> la cubiline chez<br />
ces patients, entraînant <strong><strong>de</strong>s</strong> anomalies <strong>de</strong> structure <strong>de</strong> la cubiline [Aminoff M. et al.,<br />
1999]. Une race <strong>de</strong> chiens, issus <strong>de</strong> parents consanguins ayant un développement<br />
intracellulaire médiocre <strong>de</strong> la cubiline, présente également une anémie<br />
mégaloblastique [Fyfe J.C. et al., 1991]. Les patients atteints <strong>de</strong> la maladie<br />
d’Imerslund-Gräsbeck ainsi que les chiens déficients en cubiline sont protéinuriques,<br />
mais sont normaux pour les autres phénotypes et fertiles. Les premières expériences<br />
d’invalidation du gène <strong>de</strong> la cubiline indiquent que les embryons meurent très<br />
précocement in utero. De même, l’injection d’anticorps anti-cubiline induit <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
malformations fœtales chez le rat, probablement dues à la fixation <strong><strong>de</strong>s</strong> anticorps sur<br />
le sac vitellin et à une inhibition <strong><strong>de</strong>s</strong> mécanismes d’endocytose qui assurent le<br />
transfert entre la mère et le fœtus [Le Panse S. et al., 1994; Sahali D. et al., 1988].<br />
La mégaline peut également influencer le transport <strong>de</strong> l’échangeur 3<br />
sodium/hydrogène (NHE3), ces <strong>de</strong>ux protéines semblent former un complexe<br />
multimérique à la membrane apicale <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules du tubule proximal [Biemes<strong>de</strong>rfer<br />
D. et al., 1999].<br />
La mégaline et la cubiline peuvent moduler la signalisation cellulaire<br />
essentiellement par la voie classique d’endocytose médiée par récepteur : en<br />
régulant la captation <strong><strong>de</strong>s</strong> hormones pour la dégradation comme l’hormone<br />
parathyroïdienne (PTH) [Hilpert J. et al., 1999], ou la captation <strong><strong>de</strong>s</strong> précurseurs<br />
d’hormones pour l’activation comme la 25-OH-vitamine D3 [Nykjaer A. et al., 1999;<br />
Nykjaer A. et al., 2001]. En effet, la 25-OH-vitamine D3 formant un complexe avec sa<br />
protéine <strong>de</strong> transport plasmatique, la protéine <strong>de</strong> liaison à la vitamine D, est<br />
réabsorbée au niveau <strong>de</strong> l’épithélium tubulaire proximal par endocytose médiée par<br />
récepteur incluant la mégaline et la cubiline. L’endocytose est nécessaire pour<br />
préserver la 25-OH-vitamine D3 et délivrer aux cellules le précurseur afin <strong>de</strong> générer<br />
la 1,25-(OH)2-vitamine D3 , un régulateur du métabolisme du calcium.<br />
L’extrémité cytoplasmique <strong>de</strong> la mégaline, probablement le domaine carboxyterminal<br />
NPXY, a été décrite comme interagissant avec Dab2 (disabled protein 2)<br />
[Oleinikov A.V. et al., 2000], une protéine intracellulaire potentiellement impliquée<br />
dans la signalisation et la régulation <strong>de</strong> la croissance cellulaire et la différenciation.<br />
36
La réabsorption tubulaire proximale <strong><strong>de</strong>s</strong> drogues polybasiques comme<br />
l’aprotinine, la polymyxine B et les aminoglycosi<strong><strong>de</strong>s</strong> incluant la gentamicine est<br />
également médiée par la mégaline [Moestrup S.K. et al., 1995]. La captation <strong>de</strong><br />
gentamicine médiée par la mégaline au niveau <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules tubulaires proximales est<br />
confirmée chez les souris déficientes en mégaline [Schmitz C. et al., 2002]. Ces<br />
drogues sont donc néphrotoxiques ainsi qu’ototoxiques. La toxicité est probablement<br />
induite par la mégaline qui accumule les drogues dans les cellules.<br />
2.5. Sécrétion et réabsorption tubulaire <strong><strong>de</strong>s</strong> drogues et<br />
xénobiotiques<br />
Le rein et le foie ont <strong><strong>de</strong>s</strong> fonctions complémentaires dans l’élimination <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
drogues et xénobiotiques. Le métabolisme se déroule principalement dans le foie où<br />
la substance originale est transformée en métabolites plus polaires et plus<br />
hydrophiles qui sont pris en charge par le rein pour leur élimination.<br />
Filtration glomérulaire<br />
La gran<strong>de</strong> majorité <strong><strong>de</strong>s</strong> drogues et xénobiotiques possè<strong>de</strong>nt un poids moléculaire<br />
bien inférieur (environs 30 kDa) à la limite <strong>de</strong> la barrière <strong>de</strong> la filtration glomérulaire.<br />
Cependant, beaucoup <strong>de</strong> ces substances se lient aux protéines présentes dans le<br />
sérum (95% <strong>de</strong> furosémi<strong>de</strong> et 98 % <strong><strong>de</strong>s</strong> anti-inflammatoires non stéroïdiens<br />
s’associent à l’albumine), et par conséquent la fraction filtrée est réduite aux<br />
molécules non liées. Les médicaments peuvent s’associer à différentes protéines<br />
sériques, la plus importante est l’albumine liant préférentiellement les composés<br />
aci<strong><strong>de</strong>s</strong>, suivie par l’α1-glycoprotéine aci<strong>de</strong> pour les composés basiques [Kragh-<br />
Hansen U., 1981; Routledge P.A., 1986]. Dans la majorité <strong><strong>de</strong>s</strong> cas, l’élimination<br />
rénale <strong><strong>de</strong>s</strong> drogues et xénobiotiques dépend <strong>de</strong> la sécrétion tubulaire active.<br />
Réabsorption tubulaire<br />
Les aci<strong><strong>de</strong>s</strong> et les bases faibles sont en général réabsorbés par diffusion<br />
passive au travers <strong>de</strong> l’épithélium tubulaire.<br />
37
Un certain nombre <strong>de</strong> drogues et xénobiotiques sont réabsorbés par <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
mécanismes facilités. En effet, certains anions organiques sont transportés à la<br />
membrane apicale du tubule proximal par un système <strong>de</strong> co-transport couplé au<br />
sodium (par exemple les vitamines comme l’aci<strong>de</strong> ascorbique, la biotine). Peu <strong>de</strong><br />
connaissances existent sur la réabsorption facilitée <strong><strong>de</strong>s</strong> cations organiques.<br />
Plusieurs médicaments ressemblant aux pepti<strong><strong>de</strong>s</strong> comme les antibiotiques β-<br />
lactames (ceftibuten, cyclacilline) sont <strong><strong>de</strong>s</strong> substrats <strong><strong>de</strong>s</strong> transporteurs <strong>de</strong> pepti<strong><strong>de</strong>s</strong><br />
localisés à la membrane <strong>de</strong> la bordure en brosse et absorbés par les cellules<br />
proximales. Les transporteurs <strong>de</strong> pepti<strong><strong>de</strong>s</strong> servent d’intermédiaire à un co-transport<br />
électrogénique <strong>de</strong> di- et tri-pepti<strong><strong>de</strong>s</strong> couplé aux protons, lequel fonctionne grâce au<br />
gradient <strong>de</strong> proton et à la différence <strong>de</strong> potentiel <strong>de</strong> membrane négative [Daniel H. et<br />
al., 1997].<br />
Des substances hautement hydrophiles insolubles dans les lipi<strong><strong>de</strong>s</strong> comme les<br />
aminoglycosi<strong><strong>de</strong>s</strong> cationiques et/ou peut-être le cadmium sont réabsorbées par<br />
endocytose médiée par récepteur [De Broe M.E. et al., 1984; Foulkes E.C., 1990;<br />
Templeton D.M., 1990].<br />
Sécrétion tubulaire rénale <strong><strong>de</strong>s</strong> drogues et xénobiotiques<br />
La plupart <strong><strong>de</strong>s</strong> xénobiotiques ioniques sont sécrétés par <strong>de</strong>ux mécanismes <strong>de</strong><br />
transport, l’un réservé à la sécrétion <strong><strong>de</strong>s</strong> anions organiques (« aci<strong><strong>de</strong>s</strong> organiques »),<br />
et l’autre à celle <strong><strong>de</strong>s</strong> cations organiques (« bases organiques »). La première étape<br />
<strong>de</strong> la sécrétion, le transport au travers <strong>de</strong> la membrane basolatérale, <strong>de</strong> chacun <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
<strong>de</strong>ux mécanismes généraux est effectuée par différents sous-systèmes susceptibles<br />
<strong>de</strong> correspondre à différentes molécules <strong>de</strong> transport pour lesquelles <strong><strong>de</strong>s</strong> substrats<br />
<strong>de</strong> structure moléculaire plutôt non-spécifique peuvent possé<strong>de</strong>r <strong><strong>de</strong>s</strong> affinités<br />
variables [Moller J.V. et al., 1982; Ullrich K.J., 1994]. Plusieurs isoformes <strong>de</strong> ses<br />
transporteurs ont été i<strong>de</strong>ntifiées et sont membres <strong>de</strong> la famille <strong><strong>de</strong>s</strong> transporteurs <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
ions organiques, comprenant les transporteurs d’anions organiques (OAT) et les<br />
transporteurs <strong>de</strong> cations organiques (OCT) [Burckhardt G. et al., 2000; Inui K.I. et al.,<br />
2000; Sekine T. et al., 2000].<br />
L’étu<strong>de</strong> <strong><strong>de</strong>s</strong> mécanismes <strong>de</strong> sécrétion <strong><strong>de</strong>s</strong> ions organiques provient<br />
essentiellement <strong><strong>de</strong>s</strong> investigations sur quelques substances transportées qui sont<br />
38
considérées comme représentatives d’autres ions organiques sécrétés. Pour les<br />
anions organiques, le substrat classique est le para-aminohippurate ; tandis que<br />
pour les cations organiques, les substrats classiques sont le tétraéthylammonium<br />
et la N1-méthylnicotinami<strong>de</strong>.<br />
Ces <strong>de</strong>ux systèmes <strong>de</strong> transport classiques sont exclusivement localisés dans<br />
le tubule proximal. La sécrétion n’est pas uniforme tout au long du tubule proximal et<br />
peut être différente entre les néphrons superficiels et juxtamédullaires. Comme le<br />
nombre <strong>de</strong> molécules transportées est limité, la sécrétion est saturable et sujette à la<br />
compétition entre les substrats.<br />
Les systèmes <strong>de</strong> transport <strong><strong>de</strong>s</strong> ions organiques ont été caractérisés aux <strong>de</strong>ux cotés<br />
<strong>de</strong> la membrane du tubule proximal (Fig. 15 et Fig. 16, pour plus <strong>de</strong> détails voir<br />
Annexe 1 pages : 157-163) [Pritchard J.B. et al., 1993].<br />
Figure 15. Schéma <strong><strong>de</strong>s</strong> processus <strong>de</strong> transport associés à la sécrétion <strong><strong>de</strong>s</strong> anions<br />
organiques (OAs) par les cellules tubulaires proximales rénales [Wright S.H. et al., 2004].<br />
Les cercles correspon<strong>de</strong>nt aux transporteurs. Les flèches indiquent la direction du transport<br />
net <strong>de</strong> substrat pendant la phase active <strong>de</strong> sécrétion. Les lignes soli<strong><strong>de</strong>s</strong> correspon<strong>de</strong>nt aux<br />
voies principales <strong>de</strong> transport <strong><strong>de</strong>s</strong> OAs, la ligne en pointillé à la voie secondaire, la ligne en<br />
tiret représente la diffusion.<br />
1. Na + /K + -ATPase; 2. NaDC-3; 3, 4, 5. OAT1, OAT2 et OAT3; 6. MRP2; 7. URAT1; 8. OAT4;<br />
9. Oatp1, OAT-K1/K2; 10. OATV1, NTP1; 11. Échangeur OA/OA physiologique. Description<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> transporteurs voir Annexe 1 § A.1. (pages 157-160).<br />
39
Figure 16. Schéma <strong><strong>de</strong>s</strong> processus <strong>de</strong> transport associés à la sécrétion <strong><strong>de</strong>s</strong> cations<br />
organiques (OCs) par les cellules tubulaires proximales rénales [Wright S.H. et al., 2004].<br />
Les cercles correspon<strong>de</strong>nt aux transporteurs. Les flèches indiquent la direction du transport<br />
net <strong>de</strong> substrat pendant la phase active <strong>de</strong> sécrétion. Les lignes soli<strong><strong>de</strong>s</strong> correspon<strong>de</strong>nt aux<br />
voies principales <strong>de</strong> transport <strong><strong>de</strong>s</strong> OCs, la ligne en pointillé à la voie secondaire, la ligne en<br />
tiret représente la diffusion.<br />
1. Na + /K + -ATPase; 2, 3, 4. OCT1, OCT2 et OCT3, 5. MDR1; 6. NHE3; 7. Echangeur OC/H + ;<br />
8. OCTN1; 9. OCTN2; 10. Voie électrogénique <strong>de</strong> réabsorption <strong>de</strong> la choline. Description <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
transporteurs voir Annexe 1 § A.2. (pages 160-163).<br />
En plus <strong>de</strong> ces systèmes <strong>de</strong> transport sécrétoire classique, d’autres<br />
mécanismes <strong>de</strong> transport sont impliqués dans l’excrétion rénale <strong><strong>de</strong>s</strong> xénobiotiques<br />
[Roch-Ramel F., 1998].<br />
Au niveau <strong>de</strong> la membrane basolatérale, l’échangeur oxalate/sulfate (SAT1) et le<br />
système <strong>de</strong> transport sodium-dicarboxylate (NaDC-3) ont été i<strong>de</strong>ntifiés [Karniski L.P.<br />
et al., 1998; Ullrich K.J., 1994; Wang H. et al., 2000].<br />
D’autres transporteurs ont été clonés et i<strong>de</strong>ntifiés à la bordure en brosse ;<br />
cependant, leur fonction dans le rein reste encore à définir. Parmi ceux-ci, les<br />
protéines associées à la résistance aux médicaments (MRP) et le transporteur multimédicaments/P-glycoprotéine<br />
(MDR/Pgp) sont <strong><strong>de</strong>s</strong> transporteurs actifs primaires<br />
dépendant <strong>de</strong> l’ATP, respectivement pour les anions organiques et les cations<br />
organiques [Borst P. et al., 2000; Klein I. et al., 1999]. Ils stimulent l’efflux actif <strong>de</strong> la<br />
cellule vers la lumière, d’une variété d’ions organiques. Un autre transporteur,<br />
OATP1, permet le transport apical <strong><strong>de</strong>s</strong> conjugués stéroïdiens et <strong>de</strong> la<br />
sulfobromophtaléine [Lu R. et al., 1996]. Les transporteurs OAT-K1 et OAT-K2<br />
40
favorisent le transport du méthotrexate et du folate [Masuda S. et al., 1999b; Masuda<br />
S. et al., 1999a]. L’OCTN1 et l’OCTN2 sont <strong><strong>de</strong>s</strong> transporteurs multispécifiques <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
cations organiques [Wu X. et al., 1999; Yabuuchi H. et al., 1999].<br />
Le rein est un organe particulièrement sensible aux atteintes toxiques pour<br />
plusieurs raisons. Le flux sanguin rénal (25% du débit cardiaque) est plus important<br />
en comparaison avec la majorité <strong><strong>de</strong>s</strong> autres tissus, la quantité <strong>de</strong> drogues délivrées<br />
au rein est donc plus élevée (50 fois). Le rein présente la plus gran<strong>de</strong> surface<br />
endothéliale par gramme <strong>de</strong> tissu et possè<strong>de</strong> la plus haute pression hydrostatique<br />
capillaire favorisant la retenue <strong><strong>de</strong>s</strong> antigènes circulants et la formation <strong>de</strong> complexes<br />
immuns. Le rein possè<strong>de</strong> également une haute activité métabolique ainsi que <strong>de</strong><br />
multiples systèmes enzymatiques. Le transport tubulaire et les autres processus<br />
rénaux métaboliques nécessitent une quantité considérable d’oxygène et sont<br />
sensibles à l’action <strong><strong>de</strong>s</strong> inhibiteurs métaboliques. Il est à noter que le segment S3 du<br />
tubule proximal possè<strong>de</strong> la plus gran<strong>de</strong> proportion d’oxygène délivré/oxygène<br />
consommé par rapport à toutes les autres entités fonctionnelles <strong>de</strong> l’organisme<br />
[Brezis M. et al., 1984]. Le rein est le seul endroit où les drogues fortement liées aux<br />
protéines se dissocient, traversent la cellule tubulaire et s’accumulent dans<br />
l’épithélium tubulaire et/ou atteignent la lumière tubulaire. Une gran<strong>de</strong> quantité<br />
d’enzymes épithéliaux tubulaires impliquées dans les systèmes <strong>de</strong> transport tubulaire<br />
peuvent être bloquées, étant donné notamment la très haute concentration en<br />
solutés dans le liqui<strong>de</strong> tubulaire pouvant atteindre <strong><strong>de</strong>s</strong> taux <strong>de</strong> concentrations <strong>de</strong><br />
l’urine/plasma dépassant 1000 dans certains cas.<br />
41
3. Marqueurs urinaires d’atteinte tubulaire proximale<br />
La détection et la mesure <strong><strong>de</strong>s</strong> marqueurs biologiques, substances présentes<br />
dans l’organisme, fournissent <strong><strong>de</strong>s</strong> informations sur la relation entre l’exposition aux<br />
xénobiotiques et les maladies. En effet, ces marqueurs, traduisant un changement<br />
d’état physiologique, indiquent la présence <strong>de</strong> stress dans les cellules, tissus ou<br />
organes, ou révèlent une lésion. L’utilisation <strong>de</strong> marqueurs biologiques permet, tout<br />
d’abord, d’i<strong>de</strong>ntifier les premières altérations structurelles et/ou fonctionnelles d’un<br />
organe cible, induites par l’exposition aux xénobiotiques, et ensuite d’obtenir <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
informations sur le(s) mécanisme(s) responsable(s) d’une telle exposition sur la<br />
santé d’un individu.<br />
Les enzymes urinaires et les protéines <strong>de</strong> faible poids moléculaire sont<br />
utilisées comme marqueurs précoces <strong>de</strong> toxicité vis-à-vis du néphron, permettant la<br />
détection <strong>de</strong> petits changements <strong>de</strong> fonction <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules épithéliales tubulaires dans<br />
beaucoup <strong>de</strong> conditions pathologiques. En effet, l’atteinte (qu’elle soit aiguë ou<br />
chronique) <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules tubulaires induit la libération dans la lumière tubulaire <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
enzymes et protéines <strong>de</strong> faible poids moléculaire physiologiquement présentes dans<br />
ces cellules. Leur excrétion augmente bien avant l’élévation d’autres marqueurs <strong>de</strong> la<br />
fonction rénale comme la créatinine [D'Amico G. et al., 2003].<br />
La créatinine plasmatique, quant à elle, est couramment utilisée pour évaluer<br />
le taux <strong>de</strong> filtration glomérulaire donnant <strong><strong>de</strong>s</strong> indications sur la fonction rénale.<br />
[(concentration urinaire <strong>de</strong> créatinine × débit urinaire) / concentration plasmatique <strong>de</strong><br />
créatinine = clearance <strong>de</strong> créatinine exprimée en ml/min, fournissant une<br />
approximation du taux <strong>de</strong> filtration glomérulaire].<br />
Les principaux marqueurs urinaires d’atteinte tubulaire proximale sont repris<br />
ci-<strong><strong>de</strong>s</strong>sous et répartis en <strong>de</strong>ux catégories selon qu’ils traduisent une atteinte<br />
structurelle ou une atteinte fonctionnelle.<br />
42
3.1. Atteinte structurelle<br />
Enzymurie<br />
En plus <strong>de</strong> leur libération physiologique normale par les cellules [Maruhn D. et<br />
al., 1976; Mutti A., 1989; Van<strong>de</strong>rlin<strong>de</strong> R.E., 1981], les enzymes se retrouvent en<br />
quantité anormale dans les urines suite à l’altération <strong>de</strong> la perméabilité <strong>de</strong> la<br />
membrane cellulaire, à l’augmentation du taux <strong>de</strong> synthèse enzymatique et à la<br />
nécrose cellulaire. Toutefois, les sources n’ayant aucun rapport avec l’activité<br />
enzymatique urinaire doivent être exclues comme les enzymes plasmatiques filtrées,<br />
les sécrétions provenant du tractus urogénital, les cellules non-rénales se retrouvant<br />
dans les urines, et l’effet <strong>de</strong> certains médicaments, comme les salicylates,<br />
susceptibles d’être à l’origine <strong>de</strong> la <strong><strong>de</strong>s</strong>quamation <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules rénales [Koenig H. et<br />
al., 1978].<br />
Comme la distribution <strong><strong>de</strong>s</strong> enzymes n’est pas uniforme tout au long du<br />
néphron, il est possible d’i<strong>de</strong>ntifier le site spécifique <strong>de</strong> l’atteinte rénale. En règle<br />
générale, l’activité enzymatique est la plus élevée dans le cortex, principalement<br />
dans les tubules proximaux, la plus faible dans les papilles, et intermédiaire dans la<br />
médullaire [Bernard A. et al., 1991b]. Cependant, sur la centaine d’enzymes urinaires<br />
évaluées, seulement un petit nombre sont considérées comme bio-marqueurs<br />
(Tableau 4).<br />
La lactate déshydrogénase (EC 1.1.1.27) est présente dans le cytoplasme<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> cellules, l’excrétion urinaire <strong>de</strong> cette enzyme augmente lors <strong>de</strong> lésions ou<br />
maladies rénales.<br />
La N-acétyl-ββββ-D-glucosaminidase (NAG, EC 3.2.1.52) est localisée dans les<br />
lysosomes <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules tubulaires proximales du segment S3 chez l’homme et du<br />
néphron distal. Chez le rat, par contre, la distribution <strong>de</strong> la NAG au niveau tubulaire<br />
proximal est différente, la quantité <strong>de</strong> NAG est plus importante dans les segments S1<br />
et S2 que S3 [Le Hir M. et al., 1980]. Avec une masse moléculaire d’environ 150 kD,<br />
le passage <strong>de</strong> la NAG au travers <strong>de</strong> la barrière glomérulaire est retardé et un taux<br />
élevé dans les urines reflète donc une atteinte <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules tubulaires proximales. La<br />
43
présence <strong>de</strong> NAG, une enzyme lysosomale intracellulaire, dans les urines indique<br />
que les organelles <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules tubulaires proximales sont endommagées.<br />
L’alanine aminopeptidase (EC 3.4.11.2) est uniquement présente à la<br />
bordure en brosse <strong>de</strong> l’épithélium tubulaire proximal. Tout comme la NAG, l’alanine<br />
aminopeptidase est très sensible à l’atteinte tubulaire aiguë [Lauwerys R.R. et al.,<br />
1987].<br />
Tableau 4 : Quelques enzymes utilisées comme in<strong>de</strong>x <strong>de</strong> néphrotoxicité [Finn W.F.<br />
et al., 2003].<br />
Alanine aminopeptidase<br />
Phosphatase alcaline<br />
γ-glutamyltransférase<br />
Maltase<br />
Trehalase<br />
Enzyme Localisation cellulaire<br />
Transaminase glutamique oxaloacétique<br />
Lactate déshydrogénase<br />
Malate déshydrogénase<br />
Glutathion S-transférase<br />
N-acétyl-β-D-glucosaminidase<br />
Phosphatase aci<strong>de</strong><br />
β-galactosidase<br />
β-glucosidase<br />
β-glucuronidase<br />
Bordure en brosse<br />
Cytoplasme<br />
Lysosome<br />
Glutamate déshydrogénase Mitochondrie<br />
La phosphatase alcaline intestinale et la phosphatase alcaline tissulaire<br />
non-spécifique sont <strong>de</strong>ux iso-enzymes urinaires (EC 3.1.3.1). La phosphatase<br />
alcaline intestinale est localisée à la bordure en brosse <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules épithéliales<br />
intestinales humaines mais est également présente dans le rein humain normal où<br />
elle est exclusivement exprimée à la bordure en brosse <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules épithéliales du<br />
44
segment S3 du tubule proximal [Verpooten G.F. et al., 1992]. La phosphatase<br />
alcaline intestinale présente dans les urines est donc d’origine rénale et spécifique<br />
du segment S3. Par contre, la phosphatase alcaline tissulaire humaine est localisée<br />
à la membrane <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules du foie, <strong><strong>de</strong>s</strong> ostéoblastes et fibroblastes ainsi qu’à la<br />
bordure en brosse tout au long <strong><strong>de</strong>s</strong> différents segments tubulaires proximaux<br />
[Nouwen E.J. et al., 1994].<br />
Les glutathion-S-transférases (GST, EC 2.5.1.18) sont <strong><strong>de</strong>s</strong> enzymes<br />
cytosoliques ; quatre isoenzymes ont été i<strong>de</strong>ntifiées : alpha, mu, pi et thêta [Hayes<br />
J.D. et al., 1995]. L’isoforme α-GST est localisée dans le cytoplasme <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules<br />
tubulaires proximales. L’isoforme π-GST est présente dans les cellules du tubule<br />
distal convoluté, <strong>de</strong> l’anse fine <strong>de</strong> Henlé, et <strong><strong>de</strong>s</strong> tubes collecteurs. Une augmentation<br />
<strong>de</strong> l’excrétion urinaire <strong>de</strong> l’α-GST reflète <strong><strong>de</strong>s</strong> altérations à la bordure en brosse <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
cellules tubulaires proximales [Branten A.J. et al., 2000].<br />
La distribution <strong><strong>de</strong>s</strong> enzymes dans tout le néphron varie en fonction <strong>de</strong><br />
l’espèce, le tableau 5 indique la localisation <strong><strong>de</strong>s</strong> enzymes chez le rat.<br />
3.2. Atteinte fonctionnelle<br />
Protéinurie<br />
Dans <strong><strong>de</strong>s</strong> conditions normales, la barrière <strong>de</strong> filtration glomérulaire empêche<br />
le passage <strong>de</strong> protéines <strong>de</strong> haut poids moléculaire du plasma vers la lumière du<br />
néphron. Dans certains états pathologiques, la sélectivité <strong>de</strong> la barrière <strong>de</strong> filtration<br />
se modifie, permettant aux protéines <strong>de</strong> haut poids moléculaire d’apparaître dans les<br />
urines. Par contre, dans les conditions normales, une quantité limitée <strong>de</strong> protéines <strong>de</strong><br />
faible poids moléculaire est filtrée et réabsorbée par les cellules tubulaires<br />
proximales. Lorsque la capacité <strong>de</strong> réabsorption <strong>de</strong> l’épithélium tubulaire proximal est<br />
perturbée, plusieurs protéines <strong>de</strong> faible poids moléculaire échappent à la<br />
réabsorption et sont détectées dans les urines. Par conséquent, la différence entre la<br />
protéinurie glomérulaire et la protéinurie tubulaire se base sur la quantité et la nature<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> protéines mesurées dans les urines (Fig. 17) [Peterson P.A. et al., 1969]. De<br />
45
plus, la filtration d’une quantité anormale et/ou le type <strong>de</strong> protéines influencent la<br />
progression <strong><strong>de</strong>s</strong> maladies rénales en induisant secondairement <strong><strong>de</strong>s</strong> altérations aux<br />
cellules <strong>de</strong> l’épithélium tubulaire et aux structures interstitielles [Bernard A. et al.,<br />
1991b; Nath K.A., 1992].<br />
Tableau 5 : Localisation d’enzymes dans le néphron chez le rat<br />
Enzyme<br />
Localisation<br />
cellulaire<br />
Localisation<br />
dans le néphron<br />
Référence<br />
Fructose-1,6-biphosphatase Tubule proximal [Burch H.B. et al., 1978]<br />
Pyruvate kinase Tubule distal [Schmid H. et al., 1980]<br />
Lactate déshydrogénase Cytosol Tout le néphron<br />
Anse fine et tubules<br />
[Burch H.B. et al., 1974]<br />
Aldose réductase<br />
collecteurs <strong>de</strong> la<br />
médullaire et <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
régions papillaires<br />
[Sands J.M. et al., 1989]<br />
Phosphatase alcaline Tout le néphron [Schmidt U. et al., 1971]<br />
5’-nucléotidase<br />
Bordure en<br />
Tout le néphron [Cole B.R. et al., 1982]<br />
Nucléoti<strong>de</strong> pyrophosphatase<br />
brosse<br />
Tubule proximal [Le Hir M. et al., 1986]<br />
γ-glutamyltransférase<br />
Tubule proximal [Heinle H. et al., 1977]<br />
Succinate déshydrogénase Tout le néphron [Schmid H., 1984]<br />
Mitochondrie<br />
Citrate synthase<br />
Tout le néphron [Le Hir M. et al., 1982]<br />
N-acétyl-β-D-glucosaminidase Tout le néphron [Gu<strong>de</strong>r W.G. et al., 1984]<br />
Phosphatase aci<strong>de</strong><br />
Lysosome<br />
Tout le néphron,<br />
excepté l’anse large<br />
ascendante <strong>de</strong><br />
Henlé <strong>de</strong> la<br />
médullaire<br />
[Olbricht C.J. et al., 1984]<br />
Protéinurie <strong>de</strong> haut poids moléculaire<br />
Un marqueur précoce <strong>de</strong> l’atteinte glomérulaire est l’apparition dans les urines<br />
<strong>de</strong> protéines plasmatiques <strong>de</strong> poids moléculaire supérieur à 50 kD dont l’albumine<br />
(69 kD), la transferrine (77 kD) et les immunoglobulines (146 kD).<br />
46
Figure 17. Trois types <strong>de</strong> protéinurie [Finn W.F. et al., 2003].<br />
L’albumine est quantitativement la protéine urinaire majeure provenant du<br />
plasma. La concentration moyenne <strong>de</strong> l’albumine dans les urines normales est au<br />
moins 5 fois supérieure à celle <strong><strong>de</strong>s</strong> autres protéines <strong>de</strong> haut poids moléculaire et au<br />
moins 50 fois supérieure à celle <strong>de</strong> la plupart <strong><strong>de</strong>s</strong> autres protéines <strong>de</strong> faible poids<br />
moléculaire. Etant donné sa taille moléculaire et sa forte charge négative, l’albumine<br />
est efficacement retenue par la barrière <strong>de</strong> filtration glomérulaire. La petite quantité<br />
d’albumine qui échappe néanmoins au filtre glomérulaire est réabsorbée par le<br />
tubule proximal avec une efficience présumée <strong>de</strong> 99 %. Une albuminurie élevée peut<br />
donc refléter soit une augmentation <strong>de</strong> la filtration glomérulaire, soit une déficience<br />
du transport tubulaire <strong>de</strong> l’albumine filtrée.<br />
La transferrine est une protéine transporteuse <strong>de</strong> fer dont la concentration<br />
urinaire est 15 fois plus faible que celle <strong>de</strong> l’albumine. La détection <strong>de</strong> transferrine<br />
dans les urines est le témoin précoce d’une implication glomérulaire dans certaines<br />
néphropathies, et est souvent associée avec l’albuminurie.<br />
Les immunoglobulines excrétées dans les urines sont composées<br />
préférentiellement <strong><strong>de</strong>s</strong> IgG, IgA et <strong><strong>de</strong>s</strong> chaînes légères d’immunoglobulines. La<br />
présence <strong><strong>de</strong>s</strong> IgG dans les urines indique une <strong>de</strong>nsité augmentée <strong><strong>de</strong>s</strong> pores larges<br />
dans la barrière <strong>de</strong> filtration glomérulaire, permettant le passage <strong>de</strong> toutes les<br />
protéines en fonction <strong>de</strong> leur taille et <strong>de</strong> leur charge. L’excrétion urinaire d’IgG reflète<br />
47
donc la sélectivité <strong>de</strong> la taille du filtre glomérulaire, signant la nature glomérulaire <strong>de</strong><br />
la protéinurie [Tencer J. et al., 1998].<br />
Protéines <strong>de</strong> faible poids moléculaire<br />
La protéinurie tubulaire est composée <strong>de</strong> protéines <strong>de</strong> faible poids<br />
moléculaire. Plusieurs protéines <strong>de</strong> faible poids moléculaire apparaissent<br />
normalement dans les urines et ont été mesurées en tant que marqueurs biologiques<br />
potentiels <strong>de</strong> l’atteinte tubulaire [Bernard A.M. et al., 1982] dont notamment : la β2-<br />
microglobuline, la protéine <strong>de</strong> liaison au rétinol (RBP, retinol binding protein) et l’α1-<br />
microglobuline [Bernard A. et al., 1979].<br />
La β2-microglobuline est une protéine globulaire <strong>de</strong> faible poids moléculaire<br />
(11,8 kD) synthétisée par quasi toutes les cellules nucléées et localisées à leur<br />
surface membranaire. Etant donné son poids moléculaire et son petit rayon, la β2-<br />
microglobuline est facilement filtrée par le glomérule. Dans <strong><strong>de</strong>s</strong> conditions normales,<br />
approximativement 99,9% <strong>de</strong> la β2-microglobuline filtrée sont réabsorbées par les<br />
cellules épithéliales du tubule proximal et finalement catabolisée. L’excrétion urinaire<br />
<strong>de</strong> β2-microglobuline est considérablement augmentée lors d’atteinte tubulaire<br />
proximale. Cependant, lorsque le pH urinaire est inférieur à 5,5, la β2-microglobuline<br />
est dégradée ; la protéine <strong>de</strong> liaison au rétinol et l’α1-microglobuline sont plus stables<br />
comme marqueurs urinaires [Bernard A.M. et al., 1987].<br />
La protéine <strong>de</strong> liaison au rétinol, également appelée α2-microglobuline, est<br />
une protéine <strong>de</strong> faible poids moléculaire (21,4 kD) synthétisée dans le réticulum<br />
endoplasmique <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules parenchymateuses du foie où elle se lie au rétinol. En<br />
effet, la fonction <strong>de</strong> la protéine <strong>de</strong> liaison au rétinol est <strong>de</strong> transporter la vitamine A,<br />
sous sa forme alcoolique (rétinol), du foie vers les tissus épithéliaux. Dans le plasma,<br />
la protéine <strong>de</strong> liaison au rétinol se lie à la transthyrétine (ou préalbumine). Une fois le<br />
rétinol délivré au tissu cible approprié, la protéine <strong>de</strong> liaison au rétinol change <strong>de</strong><br />
conformation, perd son affinité pour la transthyrétine, est ensuite rapi<strong>de</strong>ment<br />
éliminée du plasma par la filtration glomérulaire et finalement réabsorbée et<br />
catabolisée par les cellules tubulaires proximales. La réabsorption <strong>de</strong> la protéine <strong>de</strong><br />
liaison au rétinol implique la mégaline [Marino M. et al., 2001].<br />
48
L’α1-microglobuline (protéine HC , 26-30 kD) est une protéine glycosylée,<br />
associée à la nouvelle famille <strong>de</strong> petites protéines sécrétoires, comprenant la<br />
protéine <strong>de</strong> liaison au rétinol. L’α1-microglobuline est principalement synthétisée<br />
dans le foie et est présente dans le plasma sous une forme <strong>libre</strong> ou liée à différentes<br />
protéines <strong>de</strong> haut poids moléculaire comme l’immunoglobuline A ou l’albumine. Bien<br />
que la moitié <strong>de</strong> la quantité présente dans le plasma soit complexée à<br />
l’immunoglobuline A, la forme <strong>libre</strong> est facilement filtrée au travers <strong>de</strong> la membrane<br />
glomérulaire. Cette forme <strong>libre</strong> est utilisée comme indicateur <strong>de</strong> dysfonction tubulaire<br />
[Ekstrom B. et al., 1975; Grubb A., 1992; Weber M.H. et al., 1992].<br />
Autres protéines<br />
La Protéine 1, également appelée protéine <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules <strong>de</strong> Clara, est une α-<br />
microprotéine (environ 20 kD). L’excrétion urinaire <strong>de</strong> protéine 1 augmente chez les<br />
patients présentant un dysfonctionnement tubulaire proximal [Bernard A. et al.,<br />
1991a].<br />
Les amylases (EC 3.2.1.1) sont <strong><strong>de</strong>s</strong> enzymes <strong>de</strong> faible poids moléculaire et<br />
excrétées en gran<strong><strong>de</strong>s</strong> quantités dans les protéinuries tubulaires. Les amylases<br />
sériques sont principalement synthétisées par les glan<strong><strong>de</strong>s</strong> salivaires et le pancréas.<br />
Ces <strong>de</strong>ux iso-enzymes possè<strong>de</strong>nt la même taille moléculaire (29Å) mais <strong><strong>de</strong>s</strong> charges<br />
nettes différentes dans le plasma ; le rapport urinaire <strong>de</strong> l’amylase salivaire sur<br />
l’amymase pancréatique peut <strong>de</strong>venir utile pour explorer les changements <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
charges négatives <strong>de</strong> la membrane basale glomérulaire [Recio F. et al., 1994]<br />
Le lysozyme (EC 3.2.1.17) ou muramidase est une enzyme qui catalyse<br />
l’hydrolyse <strong>de</strong> la couche <strong>de</strong> peptidoglycan <strong>de</strong> la paroi cellulaire <strong><strong>de</strong>s</strong> bactéries. Il<br />
provient <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules phagocytaires et est activement sécrété par les monocytes et<br />
les macrophages. L’excrétion urinaire <strong>de</strong> lysozyme augmente lors d’infections <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
voies urinaires, <strong>de</strong> lésions tubulaires proximales et d’une synthèse excessive <strong>de</strong><br />
lysozyme endogène qui dépasse largement la capacité d’absorption du tubule<br />
proximal.<br />
49
La cystatine C est une protéine basique non-glycosylée avec pratiquement le<br />
même poids moléculaire (13,3 kD) que la β2-microglobuline. Toutes les cellules<br />
nucléées produisent un taux stable <strong>de</strong> cystatine qui n’est pas influencé par<br />
l’inflammation. Les concentrations plasmatiques <strong>de</strong> cystatine changent avec l’âge en<br />
parallèle avec les modifications du taux <strong>de</strong> filtration glomérulaire. La cystatine C est<br />
présente dans les urines lors <strong>de</strong> dysfonctionnements tubulaires. La cystatine C est<br />
considérée par certains comme un marqueur endogène <strong>de</strong> la fonction rénale plus<br />
fiable que la créatinine.<br />
La glycoprotéine <strong>de</strong> Tamm-Horsfall (80 kD) est la plus abondante protéine<br />
d’origine rénale présente dans les urines normales et le constituant majeur <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
débris urinaires [TAMM I. et al., 1950]. La protéine <strong>de</strong> Tamm-Horsfall est localisée à<br />
la membrane <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules épithéliales <strong>de</strong> la branche ascendante large <strong>de</strong> l’anse <strong>de</strong><br />
Henlé. L’excrétion urinaire <strong>de</strong> cette protéine peut augmenter suite à une atteinte <strong>de</strong><br />
la partie distale du tubule, mais peut être anormale lorsque la masse rénale est<br />
réduite [Thornley C. et al., 1985].<br />
50
4. Cellules <strong>de</strong> rein d’opossum : modèle d’étu<strong>de</strong> du<br />
tubule proximal<br />
4.1. Caractérisation <strong>de</strong> la lignée <strong>de</strong> cellules OK (opossum<br />
kidney)<br />
La lignée <strong>de</strong> cellules OK a été établie au départ <strong>de</strong> tissu rénal d’un opossum<br />
adulte d’Amérique (Di<strong>de</strong>lphys virginiana). Cette lignée prolifère rapi<strong>de</strong>ment et est<br />
stable du point <strong>de</strong> vue morphologique et <strong>de</strong> son caryotype [Koyama H. et al., 1978].<br />
Les cellules OK s’organisent en monocouches <strong>de</strong> cellules épithéliales polarisées et<br />
partagent <strong>de</strong> nombreuses propriétés morphologiques et fonctionnelles avec les<br />
cellules tubulaires proximales [Malstrom K. et al., 1987].<br />
Propriétés <strong>de</strong> transport<br />
La membrane apicale <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules OK comporte les systèmes <strong>de</strong> transport<br />
couplés au Na + pour les aci<strong><strong>de</strong>s</strong> aminés, le glucose, les protons et le phosphate<br />
inorganique ainsi qu’une sensibilité hormonale à la PTH et à la calcitonine<br />
[Malmstrom K. et al., 1986; Malstrom K. et al., 1987] (Tableau 6). La lignée rénale <strong>de</strong><br />
cellules OK est la seule lignée cellulaire établie avec <strong><strong>de</strong>s</strong> caractéristiques proximales<br />
ayant la capacité <strong>de</strong> réguler le co-transport Na + dépendant/phosphate en réponse,<br />
soit à un agent rapi<strong>de</strong> comme la PTH [Hruska K.A. et al., 1987; Teitelbaum A.P. et<br />
al., 1984; Teitelbaum A.P. et al., 1986], soit un stimulus prolongé comme une<br />
déprivation chronique en phosphate organique ou l’exposition à <strong>de</strong> l’hormone<br />
thyroïdienne [Quamme G. et al., 1989; Yonemura K. et al., 1990]. En effet, les<br />
récepteurs <strong>de</strong> haute affinité pour la PTH, présents dans les cellules OK, sont couplés<br />
à l’activation <strong>de</strong> l’adénylate cyclase et l’inhibition du co-transport Na + /phosphate<br />
[Caverzasio J. et al., 1986; Cole J.A. et al., 1987; Malmstrom K. et al., 1986;<br />
Teitelbaum A.P. et al., 1986].<br />
51
Tableau 6 : Caractéristiques <strong><strong>de</strong>s</strong> transports tubulaires au niveau <strong>de</strong> l’épithélium proximal <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules OK<br />
Transporteur Sodium Localisation Substrat Activateur Inhibiteur Régulateur Références<br />
Na + /aci<strong><strong>de</strong>s</strong> aminés<br />
Na + /hexoses<br />
Na + /glucose<br />
dépendant apicale<br />
Aci<strong><strong>de</strong>s</strong> aminés aci<strong><strong>de</strong>s</strong> : Lglutamate<br />
Aci<strong><strong>de</strong>s</strong> aminés neutres :<br />
L-proline, L-alanine, Lphénylalanine<br />
Aci<strong><strong>de</strong>s</strong> aminés neutres :<br />
indépendant basolatérale<br />
L-alanine<br />
Aci<strong><strong>de</strong>s</strong> aminés<br />
dépendant apicale<br />
dibasiques : L-arginine<br />
α-méthyl-D-glucosi<strong>de</strong><br />
D-glucose<br />
Phlorizine<br />
indépendant basolatérale D-glucose Cytochalasine B<br />
Na + /phosphate dépendant PTH PTH<br />
Na + /phosphate<br />
inorganique<br />
NaPi type IIa<br />
Na + /sulfate<br />
inorganique<br />
dépendant apicale<br />
indépendant<br />
Hormonale,<br />
PTH<br />
[Malstrom K. et al.,<br />
1987; Schwegler J.S. et<br />
al., 1989b]<br />
[Malstrom K. et al.,<br />
1987; Van <strong>de</strong>n B.L. et<br />
al., 1989]<br />
[Caverzasio J. et al.,<br />
1986; Malmstrom K. et<br />
al., 1986; Teitelbaum<br />
A.P. et al., 1984]<br />
[Cole J.A. et al., 1987;<br />
Malstrom K. et al., 1987]<br />
[Malstrom<br />
1987]<br />
K. et al.,<br />
52
Échangeur Na + /H +<br />
NHE3<br />
Echangeur<br />
H + /cations<br />
organiques<br />
Echangeur cations<br />
organiques/cations<br />
organiques<br />
Echangeur<br />
PAH/anions<br />
organiques<br />
Echangeur PAH<br />
(anions<br />
organiques)/dicarb<br />
oxylates<br />
Echangeur PAH<br />
(anions<br />
organiques)/dicarb<br />
oxylates<br />
apicale Insuline PTH amilori<strong>de</strong><br />
apicale Tetraéthylammonium<br />
apicale<br />
dépendant basolatérale PAH<br />
Para-aminohippurate<br />
(PAH)<br />
Cations organiques<br />
(1mM): N 1 -<br />
méthylnicotine ami<strong>de</strong>,<br />
amilori<strong>de</strong>, cimetidine,<br />
verapamil,<br />
procainami<strong>de</strong>,<br />
quinidine<br />
Probénéci<strong>de</strong>,<br />
furosémi<strong>de</strong>, diéthyl<br />
pyrocarbonate<br />
(inhibiteur du transport<br />
d’anions organiques<br />
sensibles au potentiel),<br />
dicarboxylates<br />
Dicarboxylates (αkétoglutarate),<br />
probénéci<strong>de</strong>,<br />
furosémi<strong>de</strong>,<br />
antibitiques β-lactames<br />
(benzylpénicilline,<br />
cefazoline)<br />
PTH (par la<br />
voie <strong>de</strong> la<br />
protéine<br />
kinase C)<br />
EGF<br />
[Gekle M. et al., 1999;<br />
Helmle-Kolb C. et al.,<br />
1990; Klisic J. et al.,<br />
2002; Malstrom K. et al.,<br />
1987; Pollock A.S. et al.,<br />
1986]<br />
[McKinney T.D. et al.,<br />
1990; Yuan G. et al.,<br />
1991]<br />
[Habu Y. et al., 2002;<br />
Nagai J. et al., 1997;<br />
Takano M. et al., 1994]<br />
[Hori R. et al., 1993;<br />
Nagai J. et al., 1995;<br />
Sauvant C. et al., 2001;<br />
Takano M. et al., 1994]<br />
53
Les cellules OK contiennent également <strong><strong>de</strong>s</strong> transports spécifiques <strong><strong>de</strong>s</strong> anions<br />
et <strong><strong>de</strong>s</strong> cations organiques [Hori R. et al., 1993; Yuan G. et al., 1991].<br />
Dans les cellules OK, la distribution <strong><strong>de</strong>s</strong> transporteurs d’hexoses dépendant et<br />
indépendant du sodium ainsi que l’existence à la membrane apicale <strong>de</strong> systèmes <strong>de</strong><br />
transport couplé au sodium pour le glutamate (dépendant du K + interne), la L-proline<br />
et la L-alanine, le phosphate inorganique et l’échangeur Na + /H + sont en accord avec<br />
les données caractérisant le transport tubulaire proximal [Malstrom K. et al., 1987].<br />
Réponse hormonale<br />
La PTH inhibe l’activité du co-transporteur Na/Pi <strong>de</strong> type IIa (NaPi-4), exprimé<br />
à la surface apicale <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules OK [Sorribas V. et al., 1994]; la diminution associée<br />
à l’expression <strong>de</strong> la protéine du co-transporteur Na/Pi <strong>de</strong> type IIa à la membrane<br />
apicale entraîne une accumulation subapicale transitoire du transporteur et sa<br />
dégradation lysosomale [Keusch I. et al., 1998; Malmstrom K. et al., 1987; Pfister<br />
M.F. et al., 1997; Pfister M.F. et al., 1998]. La première étape <strong>de</strong> la régulation par la<br />
PTH est l’internalisation <strong>de</strong> la protéine du co-transporteur Na/Pi <strong>de</strong> type IIa au départ<br />
<strong>de</strong> la membrane apicale conduisant à sa dégradation lysosomale [Jankowski M. et<br />
al., 1999].<br />
L’insuline stimule l’activité <strong>de</strong> l’échangeur Na + /H + NHE3. Dans les cellules OK,<br />
l’insuline augmente l’activité <strong>de</strong> l’échange Na + /H + <strong>de</strong> manière dépendante du temps<br />
et <strong>de</strong> la concentration ; cet effet est dû à l’activation <strong>de</strong> NHE3. L’insuline semble<br />
stimuler l’activité <strong>de</strong> NHE3 tubulaire rénal par un mécanisme biphasique impliquant<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> facteurs post-transcriptionnels et une augmentation <strong>de</strong> l’expression du gène <strong>de</strong><br />
NHE3 ; ces effets sont amplifiés sous l’action <strong>de</strong> l’hydrocortisone [Klisic J. et al.,<br />
2002].<br />
Les cellules OK sont également sensibles à d’autres hormones : le facteur<br />
atrial natriurétique [Nakai M. et al., 1988], la calcitonine [Malmstrom K. et al., 1986],<br />
la <strong>de</strong>xaméthasone [Rizzoli R. et al., 1987], la dopamine [Cheng L. et al., 1990],<br />
l’épinéphrine [Murphy T.J. et al., 1988], le facteur <strong>de</strong> croissance 1 analogue à<br />
l’insuline (IGF1) [Caverzasio J. et al., 1989], la prostaglandine E2 [Malmstrom K. et<br />
54
al., 1986], la sérotonine [Murphy T.J. et al., 1989], l’hormone thyroïdienne [Yonemura<br />
K. et al., 1990] et la vitamine D [Binswanger U. et al., 1993; Wald H. et al., 1998].<br />
Propriétés électriques<br />
Le potentiel <strong>de</strong> membrane <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules OK est principalement (70%)<br />
déterminé par la conductance <strong><strong>de</strong>s</strong> ions K + qui est bloquée par le baryum. La<br />
dépolarisation <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules OK est rapi<strong>de</strong> en réponse à l’acidité intracellulaire,<br />
complètement réversible et peut être protégée par l’amilori<strong>de</strong>. La perméabilité au K +<br />
est donc régulée par le pH intracellulaire. La présence <strong>de</strong> l’échangeur Na + /H + permet<br />
<strong>de</strong> compenser la charge aci<strong>de</strong> intracellulaire induisant une repolarisation <strong>de</strong> la<br />
membrane cellulaire par modification <strong>de</strong> la conductance K + . La pompe<br />
électrogénique Na + /K + -ATPase contribue également à la conductance totale <strong>de</strong> la<br />
membrane cellulaire (mais à 30%) [Schwegler J.S. et al., 1989a].<br />
La résistance transépithéliale est extrêmement faible dans les monocouches<br />
<strong>de</strong> cellules OK. Les cellules OK forment un grand nombre <strong>de</strong> dômes reflétant un<br />
transport <strong>de</strong> soluté du côté apical vers le côté basolatéral. La réponse très rapi<strong>de</strong> aux<br />
changements <strong>de</strong> concentration ionique suggère que la conductance K + est localisée<br />
à la membrane apicale <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules. Les monocouches <strong>de</strong> cellules OK sont<br />
électriquement faibles [Schwegler J.S. et al., 1989a].<br />
Propriétés biochimiques<br />
La croissance <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules OK n’étant que légèrement diminuée dans un<br />
milieu défini sans sérum par rapport à un milieu contenant du sérum, les<br />
observations suivantes ont été réalisées pour <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules OK en milieu sans sérum.<br />
L’activité <strong>de</strong> la glutathion-S-transférase, un marqueur enzymatique spécifique du<br />
cytosol <strong><strong>de</strong>s</strong> tubules proximaux est faible et le contenu total en glutathion diminue au<br />
cours du temps. L’activité spécifique <strong><strong>de</strong>s</strong> enzymes marqueurs <strong>de</strong> la bordure en<br />
brosse comme l’alanine aminopeptidase et la phosphatase alcaline est très faible ;<br />
l’activité <strong>de</strong> la γ-glutamyl transpeptidase est absente. En effet, les cellules OK<br />
présentent une très faible quantité <strong>de</strong> microvillosités. L’activité <strong>de</strong> l’enzyme<br />
lysosomale NAG est bien présente dans les cellules OK. L’activité <strong>de</strong> la succinate<br />
déshydrogénase, une enzyme associée aux mitochondries, est constante. L’activité<br />
<strong>de</strong> la Na + /K + -ATPase est stable. L’activité <strong>de</strong> la lactate déshydrogénase et <strong>de</strong><br />
55
l’hexokinase, enzyme <strong>de</strong> la glycolyse, restent stables. Les cellules OK expriment une<br />
très faible activité phosphoénolpyruvate carboxykinase [Courjault F. et al., 1991].<br />
4.2. Endocytose médiée par récepteur<br />
Les cellules OK ont la capacité <strong>de</strong> réabsorber les protéines par un mécanisme<br />
d’endocytose bien distinct <strong>de</strong> l’endocytose en phase flui<strong>de</strong> [Schwegler J.S. et al.,<br />
1991]. En effet, les monocouches <strong>de</strong> cellules OK réabsorbent l’albumine marquée à<br />
la fluorescéine isothiocyanate (FITC) selon une cinétique <strong>de</strong> saturation dépendante<br />
du temps et <strong>de</strong> la concentration, contrairement à l’inuline-FITC qui entre dans les<br />
cellules par un processus non-saturable (Fig. 18). Le système <strong>de</strong> transport <strong>de</strong><br />
l’albumine dans les cellules OK possè<strong>de</strong> une affinité apparente <strong>de</strong> 24 mg/l (20-30<br />
mg/l), laquelle correspond à la concentration physiologique estimée dans la lumière<br />
tubulaire (30mg/l [Eisenbach G.M. et al., 1975]). L’endocytose d’albumine-FITC<br />
atteint son maximum à un pH extracellulaire <strong>de</strong> 7,4 mais est réduite en milieu aci<strong>de</strong><br />
ou alcalin. Par contre, la concentration extracellulaire <strong>de</strong> sodium, <strong>de</strong> chlore ou <strong>de</strong><br />
calcium n’influence pas l’absorption d’albumine-FITC. Les cellules OK représentent<br />
un modèle bien adapté pour étudier la réabsorption tubulaire proximale <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
protéines.<br />
L’albumine-FITC est un marqueur fiable pour suivre l’endocytose médiée par<br />
récepteur : seulement environ 2 % <strong>de</strong> son endocytose est attribuée à l’endocytose en<br />
phase flui<strong>de</strong>. L’albumine capturée par les cellules OK est dégradée en fonction du<br />
pH vésiculaire. L’acidification <strong><strong>de</strong>s</strong> endosomes est particulièrement importante dans<br />
l’endocytose médiée par récepteur <strong>de</strong> l’albumine. Par contre, la formation <strong>de</strong><br />
vésicules d’endocytose en phase flui<strong>de</strong> n’est pas influencée par l’alcalinisation <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
endosomes ni par l’acidification du cytoplasme. Les cellules OK constituent<br />
également un bon modèle pour étudier le pH endosomal [Gekle M. et al., 1995a]<br />
La cinétique <strong>de</strong> l’endocytose d’albumine-FITC par les cellules OK est<br />
influencée par le Ca 2+ et l’AMP cyclique mais pas au niveau <strong>de</strong> la formation <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
vésicules d’endocytose, contrairement à l’endocytose en phase flui<strong>de</strong> du FITC-<br />
56
<strong>de</strong>xtran qui n’est pas modifiée. Le Ca 2+ est nécessaire à l’endocytose médiée par<br />
récepteur mais n’intervient probablement pas dans sa régulation. Par contre, l’AMP<br />
cyclique peut influencer l’endocytose médiée par récepteur dans <strong><strong>de</strong>s</strong> conditions<br />
physiologiques [Gekle M. et al., 1995b].<br />
A<br />
B<br />
Figure 18. Cinétiques <strong>de</strong> l’absorption d’albumine-FITC et d’inuline-FITC. A. Evolution au<br />
cours du temps <strong>de</strong> la fluorescence intracellulaire après incubation avec 0,5 g/l d’albumine à<br />
37°C en milieu bicarbonate (cercle) et sur glace en solution Ringer (triangle). FITC-inuline :<br />
0,5g/l, 37°C en milieu bicarbonate (cercle noir). B. Taux d’absorption initial (15 min)<br />
d’albumine-FITC (cercle) et d’inuline-FITC (cercle noir) à différentes concentrations du<br />
substrat (37°C, milieu bicarbonate). n = 4-6. [Schwegler J.S. et al., 1991].<br />
Les cellules OK expriment un site <strong>de</strong> liaison <strong>de</strong> haute affinité pour l’albumine à<br />
la membrane apicale ; ce site <strong>de</strong> liaison est sensible au pH et lie l’albumine en<br />
quantité physiologique [Gekle M. et al., 1996].<br />
L’endocytose d’albumine par les cellules OK se déroule par la voie<br />
dépendante <strong>de</strong> la clathrine et dépend essentiellement <strong>de</strong> l’intégrité du cytosquelette<br />
d’actine. Les microtubules facilitent l’absorption par endocytose. La voie<br />
d’endocytose médiée par les cavéoles, vésicules recouvertes d’un manteau <strong>de</strong><br />
cavéoline, n’est pas impliquée dans l’endocytose <strong>de</strong> l’albumine dans les cellules OK<br />
[Gekle M. et al., 1997].<br />
57
Enfin, l’endocytose d’albumine par les cellules OK implique les <strong>de</strong>ux<br />
récepteurs mégaline et cubiline intervenant dans l’endocytose médiée par récepteur.<br />
Ces <strong>de</strong>ux glycoprotéines sont co-exprimées et principalement co-localisées à la<br />
surface <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules (Fig. 19A). Des observations en microscopie électronique<br />
montrent que la mégaline et la cubiline sont co-localisées à la surface <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
microvillosités, dans les puits recouverts d’un manteau <strong>de</strong> clathrine et dans les<br />
compartiments endocytaires (Fig. 19B). Seules les cellules exprimant la mégaline et<br />
la cubiline sont capables d’absorber l’albumine, indiquant une association entre ces<br />
<strong>de</strong>ux récepteurs et l’endocytose d’albumine [Zhai X.Y. et al., 2000].<br />
Figure 19. A. & B: Colocalisation (en jaune) par immunofluorescence <strong>de</strong> la mégaline (FITC,<br />
en vert) et <strong>de</strong> la cubiline (TRIC, en rouge) dans les cellules OK (A ×1100, B ×1800).<br />
C & D: Colocalisation (en jaune) par immunofluorescence d’albumine-FITC (en vert) et <strong>de</strong> la<br />
cubiline (C) ou la mégaline (D) marquée au TRIC (en rouge). Grossissement ×1400.<br />
E. Double marquage immunocytochimique pour la mégaline et la cubiline observé en<br />
microscopie électronique. La mégaline (particules d’or 5 nm) et la cubiline (particules d’or 10<br />
nm) sont distribuées ensemble à la membrane apicale (flèche) et dans les vacuoles<br />
d’endocytoses (tête <strong>de</strong> flèche) dans les cellules OK. MV: microvillosités. Grossissement<br />
×86000. [Zhai X.Y. et al., 2000].<br />
E<br />
58
5. Toxicité tubulaire <strong><strong>de</strong>s</strong> aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong><br />
Aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong><br />
Les aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong> (AA) sont extraits <strong>de</strong> plantes <strong>de</strong> la famille <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
Aristolochia (par exemple Aristolochia clematitis, Aristolochia fangchi et Aristolochia<br />
Manshurensis) et consistent en un mélange <strong>de</strong> composés structurellement dérivés<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> aci<strong><strong>de</strong>s</strong> carboxyliques nitrophénantrènes, principalement l’aci<strong>de</strong> aristolochique I<br />
(AAI) et l’aci<strong>de</strong> aristolochique II (AAII) (Figure 20) [Mix D.B. et al., 1982].<br />
Figure 20. Structure chimique <strong>de</strong> l’aci<strong>de</strong> aristolochique I (AAI), aci<strong>de</strong> 8-méthoxy-6-nitrophénantro-(3,4,d)-1,3-dioxolo-5-carboxylique<br />
et <strong>de</strong> l’aci<strong>de</strong> aristolochique II (AAII), aci<strong>de</strong> 6nitro-phénantro-(3,4,d)-1,3-dioxolo-5-carboxylique<br />
[Arlt V.M. et al., 2002].<br />
Métabolisme<br />
Les étu<strong><strong>de</strong>s</strong> du métabolisme <strong><strong>de</strong>s</strong> AA dans différentes espèces dont l’être<br />
humain montrent que les aristolactames produits par nitroréduction sont les<br />
principaux métabolites retrouvés dans les urines et les fèces [Krumbiegel G. et al.,<br />
1987]. L’aristolactame Ia, le principal métabolite d’AAI, est produit par <strong>de</strong>ux voies<br />
métaboliques, l’une par l’aristolactame I et l’autre par AAIa (Fig. 21).<br />
Formation d’adduits d’ADN<br />
La transformation <strong><strong>de</strong>s</strong> aristolactames en agents aux propriétés mutagènes<br />
résulte <strong>de</strong> l’activation métabolique <strong><strong>de</strong>s</strong> AA ; cette activation comporte une étape<br />
cruciale, la nitroréduction [Schmeiser H.H. et al., 1984]. En effet, un ion Nacylnitrenium<br />
cyclique porteur d’une charge positive délocalisée est produit ; il se lie<br />
59
Figure 21. Métabolisme <strong>de</strong> l’aci<strong>de</strong> aristolochique I et <strong>de</strong> l’aci<strong>de</strong> aristolochique II chez<br />
différentes espèces <strong>de</strong> mammifère, y compris l’homme [Krumbiegel G. et al., 1987].<br />
préférentiellement aux groupes amino exocycliques <strong><strong>de</strong>s</strong> nucléoti<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong><strong>de</strong>s</strong> bases<br />
puriques <strong>de</strong> l’ADN, formant les adduits d’ADN, ou est hydrolysé en 7hydroxyaristolactame<br />
correspondant (Fig. 22) [Arlt V.M. et al., 2002]. Les structures<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> principaux adduits d’ADN ont été déterminées par spectroscopie : 7-<br />
(déoxyadénosine-N 6 -yl)aristolactame I (dA-AAI), 7-(déoxguanosine-N 2 -<br />
yl)aristolactame I (dG-AAI), 7-(déoxyadénosine-N 6 -yl)aristolactame II (dA-AAII) [Pfau<br />
W. et al., 1990; Pfau W. et al., 1991]. La métho<strong>de</strong> la plus couramment utilisée pour<br />
détecter les adduits d’ADN est le dosage très sensible du post-marquage au 32 P.<br />
Cette métho<strong>de</strong> appliquée tant in vitro qu’in vivo est quasi spécifique [Stiborova M. et<br />
al., 1998].<br />
60
Figure 22. Activation métabolique et formation <strong><strong>de</strong>s</strong> adduits d’ADN aux aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong><br />
I (AAI, R = OCH3) et II (AAII, R = H); 7-(déoxyadénosine-N 6 -yl)aristolactame I ou II (dA-AAI<br />
ou dA-AAII), 7-(déoxyguanosine-N 2 -yl)aristolactame I ou II (dG-AAI ou dG-AAII) [Arlt V.M. et<br />
al., 2002].<br />
5.1. Néphropathie aux plantes chinoises : aperçu clinique<br />
La néphropathie dite aux plantes chinoises (CHN, Chinese-herb nephropathy)<br />
a été observée pour la première fois au début <strong><strong>de</strong>s</strong> années 1990 en Belgique. Elle<br />
consiste en une atteinte rénale, qui progresse rapi<strong>de</strong>ment jusqu’au sta<strong>de</strong> terminal, et<br />
a été initialement rapportée chez un nombre <strong>de</strong> femmes qui ont toutes ingéré <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
gélules amaigrissantes contenant <strong><strong>de</strong>s</strong> plantes chinoises [Vanherweghem J.L. et al.,<br />
61
1993]. Dans le courant <strong>de</strong> l’année 1990, la prescription magistrale du cabinet<br />
bruxellois a été modifiée en introduisant <strong><strong>de</strong>s</strong> extraits <strong>de</strong> poudre <strong>de</strong> plantes chinoises,<br />
à savoir Stephania tetrandra et Magnolia officinalis. Les analyses phytochimiques<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> échantillons <strong>de</strong> soi-disant Stephania tetrandra ont montré la présence d’AA<br />
extraits d’Aristolochia fangchi en lieu et place <strong>de</strong> la tétandrine attendue [Vanhaelen<br />
M. et al., 1994].<br />
Des cas similaires d’insuffisance rénale, ayant un rapport ou non avec le<br />
contexte <strong>de</strong> régime amaigrissant, ont été décrits <strong>de</strong> par le mon<strong>de</strong> chez <strong><strong>de</strong>s</strong> patients<br />
exposés aux espèces d’Aristolochia contenant <strong><strong>de</strong>s</strong> AA : en France [Pourrat J. et al.,<br />
1994; Stengel B. et al., 1998], en Espagne [Pena J.M. et al., 1996], au Royaume-Uni<br />
[Cronin A.J. et al., 2002; Lord G.M. et al., 1999], en Allemagne [Krumme B. et al.,<br />
2001], à Taiwan [Chang C.H. et al., 2001; Yang C.S. et al., 2000; Yang S.S. et al.,<br />
2002], au Japon [Tanaka A. et al., 2000a; Tanaka A. et al., 2000b], en Chine [Chen<br />
W. et al., 2001; Gillerot G. et al., 2001; Lee S. et al., 2004; Li X. et al., 2001; Yang L.<br />
et al., 2003; Yu Y. et al., 2003] et aux Etats-Unis [Meyer M.M. et al., 2000].<br />
Aperçu clinique<br />
Dans la plupart <strong><strong>de</strong>s</strong> cas, l’insuffisance rénale a été détectée par une analyse<br />
sanguine <strong>de</strong> routine. Cette néphropathie ne s’accompagne ni d’albuminurie ni<br />
d’anomalies du sédiment urinaire. Excepté quelques observations <strong>de</strong> syndrome <strong>de</strong><br />
Fanconi [Krumme B. et al., 2001; Tanaka A. et al., 2000a; Tanaka A. et al., 2001;<br />
Yang S.S. et al., 2002], la majorité <strong><strong>de</strong>s</strong> cas sont caractérisés par une insuffisance<br />
rénale chronique, évoluant vers une insuffisance rénale terminale nécessitant<br />
l’instauration d’un traitement <strong>de</strong> suppléance (dialyse, transplantation rénale).<br />
L’examen anatomo-pathologique <strong><strong>de</strong>s</strong> reins <strong><strong>de</strong>s</strong> patientes CHN révèle une<br />
fibrose interstitielle pauci-cellulaire étendue accompagnée d’une atrophie tubulaire<br />
sévère accompagnée d’une perte <strong><strong>de</strong>s</strong> tubules. Ces lésions progressent du cortex<br />
superficiel vers le cortex profond. Les glomérules sont relativement épargnés ;<br />
cependant un collapsus <strong><strong>de</strong>s</strong> capillaires, une fragmentation <strong>de</strong> la membrane basale et<br />
un épaississement fibreux <strong>de</strong> la capsule <strong>de</strong> Bowman sont observés [Cosyns J.P. et<br />
al., 1994a; Depierreux M. et al., 1994]. Un gonflement endothélial et un<br />
62
épaississement fibreux <strong>de</strong> la paroi <strong><strong>de</strong>s</strong> artérioles interlobulaires et efférentes ont<br />
également été observés [Depierreux M. et al., 1994].<br />
L’atteinte structurelle <strong>de</strong> l’épithélium tubulaire proximal chez les patientes CHN<br />
a été confirmée par différentes étu<strong><strong>de</strong>s</strong> cliniques, indiquant que la cellule tubulaire<br />
proximale est la cible principale <strong>de</strong> la néphropathie induite par les AA. En effet, une<br />
excrétion accrue <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines <strong>de</strong> faible poids moléculaire filtrées comme la protéine<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> cellules <strong>de</strong> Clara, la protéine <strong>de</strong> liaison au rétinol, la β2-microglobuline, l’α1-<br />
microglobuline et la cystatine C a été observée, témoignant d’un dysfonctionnement<br />
<strong>de</strong> la réabsorption tubulaire proximale [Kabanda A. et al., 1995; Nortier J.L. et al.,<br />
1997]. En parallèle, l’excrétion urinaire <strong>de</strong> l’endopeptidase neutre (NEP) est<br />
progressivement réduite chez les patientes atteintes <strong>de</strong> la néphropathie aux plantes<br />
chinoises, reflétant une perte <strong>de</strong> la bordure en brosse. Une excrétion urinaire<br />
anormale <strong>de</strong> l’enzyme lysosomale NAG, un autre marqueur <strong>de</strong> l’atteinte tubulaire est<br />
également observée [Nortier J.L. et al., 1997]. Finalement, le profil <strong>de</strong> l’aminoacidurie<br />
enregistré chez <strong><strong>de</strong>s</strong> patientes CHN présentant un syndrome <strong>de</strong> Fanconi (excrétion<br />
augmentée <strong>de</strong> proline, d’hydroxyproline et citrulline avec une excrétion quasi<br />
normale <strong>de</strong> glycine) suggère que les AA affecteraient <strong>de</strong> manière prédominante le<br />
système <strong>de</strong> transport <strong>de</strong> faible affinité <strong>de</strong> la proline à la membrane <strong>de</strong> la bordure en<br />
brosse du tubule proximal [Tanaka A. et al., 2000b].<br />
Une association entre la CHN et les tumeurs <strong><strong>de</strong>s</strong> voies urinaires excrétrices a<br />
été rapportée. Tout d’abord, <strong><strong>de</strong>s</strong> atypies modérées et une hyperplasie atypique <strong>de</strong><br />
l’urothélium ont été décrites sur les pièces <strong>de</strong> néphrectomie réalisées lors <strong>de</strong> la<br />
transplantation rénale <strong>de</strong> patientes CHN [Cosyns J.P. et al., 1994a]. Ensuite, <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
cancers <strong><strong>de</strong>s</strong> voies urinaires ont été observés : urothéliomes localisés à la vessie<br />
[Cosyns J.P. et al., 1994b], au bassinet [Vanherweghem J.L. et al., 1995] et à<br />
l’uretère [Lord G.M. et al., 2001]. L’analyse systématique <strong><strong>de</strong>s</strong> reins et uretères<br />
propres <strong><strong>de</strong>s</strong> patientes CHN atteintes d’une insuffisance rénale au sta<strong>de</strong> terminal a<br />
montré la présence <strong>de</strong> carcinomes urothéliaux du bassinet et/ou <strong>de</strong> l’uretère [Cosyns<br />
J.P. et al., 1999; Nortier J.L. et al., 2000].<br />
L’exposition aux AA est confirmée par la détection <strong><strong>de</strong>s</strong> adduits d’ADN<br />
spécifiques aux AA (dA-AAI, dG-AAI, dA-AAI) dans <strong><strong>de</strong>s</strong> échantillons <strong>de</strong> tissus rénaux<br />
63
<strong><strong>de</strong>s</strong> patientes atteintes <strong>de</strong> néphropathie aux plantes chinoises [Nortier J.L. et al.,<br />
2000; Schmeiser H.H. et al., 1996].<br />
5.2. Données expérimentales chez l’animal<br />
5.2.1. Toxicité aiguë<br />
Les effets <strong>de</strong> la toxicité aiguë <strong><strong>de</strong>s</strong> AA ont été testés chez <strong><strong>de</strong>s</strong> rats Wistar et<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> souris NMRI <strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>de</strong>ux sexes. L’administration d’une seule dose d’AA par gavage<br />
(120-300 mg/kg) ou par injection intraveineuse (38-110 mg/kg) induit en quelques<br />
jours une nécrose tubulaire aiguë sévère. L’exposition à <strong><strong>de</strong>s</strong> doses élevées produit<br />
une insuffisance rénale aiguë causant la mort <strong><strong>de</strong>s</strong> animaux endéans 15 jours.<br />
[Mengs U., 1987]. Des lésions cancéreuses locales <strong>de</strong> la partie antérieure <strong>de</strong><br />
l’estomac sont également observées lors <strong>de</strong> l’administration par gavage (10 mg<br />
kg/jour) [Mengs U., 1983]. Suite à l’administration par gavage d’une dose d’AA (10-<br />
100 mg/kg) à <strong><strong>de</strong>s</strong> rats Wistar femelles, <strong><strong>de</strong>s</strong> lésions rénales se développent en 3<br />
jours, l’effet étant dépendant <strong>de</strong> la dose. D’un point <strong>de</strong> vue histologique, une nécrose<br />
<strong>de</strong> l’épithélium tubulaire rénal est observée et principalement localisée dans la pars<br />
recta du tubule proximal. D’un point <strong>de</strong> vue fonctionnel, une augmentation <strong>de</strong> la<br />
créatinine plasmatique ainsi que <strong>de</strong> l’excrétion urinaire <strong>de</strong> protéines, <strong>de</strong> glucose, <strong>de</strong><br />
NAG, <strong>de</strong> gamma-glutamyl transférase et <strong>de</strong> malate déshydrogénase est observée<br />
[Mengs U. et al., 1993].<br />
5.2.2. Toxicité chronique<br />
Les effets <strong>de</strong> la toxicité chronique ont été étudiés chez <strong><strong>de</strong>s</strong> rats Wistar mâles<br />
et femelles traités par gavage : <strong><strong>de</strong>s</strong> tumeurs se développent en fonction <strong>de</strong> la dose et<br />
<strong>de</strong> la durée du traitement. Après 3 mois d’exposition aux AA (1-10 mg/kg), <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
lésions cancéreuses apparaissent dans la partie antérieure <strong>de</strong> l’estomac. Après 3 à 6<br />
mois sans traitement, <strong><strong>de</strong>s</strong> métastases sont observées dans la partie antérieure <strong>de</strong><br />
64
l’estomac ; <strong><strong>de</strong>s</strong> adénomes et occasionnellement <strong><strong>de</strong>s</strong> carcinomes apparaissent dans<br />
le cortex rénal tandis qu’une hyperplasie évoluant vers un papillome ou un carcinome<br />
est présente dans le bassinet ou la vessie [Mengs U. et al., 1982]. L’effet<br />
carcinogène <strong><strong>de</strong>s</strong> AA est similaire chez la souris femelle <strong>de</strong> souche NMRI après un<br />
traitement aux AA (5 mg/kg) pendant 3 semaines [Mengs U., 1988]. L’administration<br />
par voie orale d’AA (25 mg/kg) à <strong><strong>de</strong>s</strong> rats Wistar mâles pendant 4 semaines induit<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> lésions dégénératives dans les reins, la partie antérieure <strong>de</strong> l’estomac, la vessie<br />
et les testicules. L’atteinte la plus sévère est localisée dans les tubules corticaux<br />
rénaux sous forme <strong>de</strong> nécrose tubulaire. Une protéinurie et une glycosurie sont<br />
également observées [Mengs U. et al., 1992]. L’administration orale d’AA (10 mg/kg)<br />
à <strong><strong>de</strong>s</strong> rats Wistar mâles et femelles pendant 3 mois (5 jours/semaine) entraîne le<br />
développement <strong>de</strong> tumeurs mais pas <strong>de</strong> fibrose au niveau <strong>de</strong> l’interstitium rénal<br />
après 3 et 11 mois [Cosyns J.P. et al., 1998]. Par contre, lorsque <strong><strong>de</strong>s</strong> lapins blancs<br />
New Zealand femelles reçoivent une injection intra-péritonéale d’AA (0,1 mg/kg)<br />
pendant 17 et 21 mois (5 jours/semaine), la fibrose interstitielle rénale se développe<br />
en association avec l’altération <strong>de</strong> l’épithélium tubulaire proximal. Les premières<br />
lésions s’observent au niveau <strong>de</strong> la partie droite (S3) <strong><strong>de</strong>s</strong> tubules proximaux et<br />
s’éten<strong>de</strong>nt aux parties contournées (S1 et S2) <strong><strong>de</strong>s</strong> tubules proximaux pour les<br />
atteintes plus sévères. Les animaux traités par les AA présentent une protéinurie<br />
tubulaire, une glycosurie, une anémie, une augmentation <strong>de</strong> la créatinine sérique, et<br />
une croissance perturbée. De plus, les AA induisent la formation d’adduits d’ADN<br />
spécifiques dans les reins <strong>de</strong> ces lapins et <strong><strong>de</strong>s</strong> tumeurs urothéliales [Cosyns J.P. et<br />
al., 2001].<br />
Finalement, un modèle expérimental <strong>de</strong> néphropathie induite par les AA a été<br />
développé chez le rat Wistar mâle. L’administration quotidienne d’AA (10 mg/kg <strong>de</strong><br />
poids corporel) par injection sous-cutanée pendant 35 jours à <strong><strong>de</strong>s</strong> rats en régime<br />
hypo- ou normosodé conduit à une insuffisance rénale, au développement d’une<br />
fibrose interstitielle et d’atrophie tubulaire. Une diminution <strong>de</strong> l’excrétion urinaire <strong>de</strong><br />
leucine aminopeptidase (LAP), une protéinurie, une glycosurie, ainsi qu’une<br />
augmentation <strong>de</strong> la créatinine sérique s’observent aux jours 10 et 35. Des dysplasies<br />
urothéliales sont également présentes [Debelle F.D. et al., 2002; Debelle F.D. et al.,<br />
2004].<br />
65
CHAPITRE 2 : BUTS DU TRAVAIL<br />
Le but <strong><strong>de</strong>s</strong> travaux présentés est d’apporter une contribution à la<br />
compréhension plus approfondie <strong>de</strong> l’implication <strong><strong>de</strong>s</strong> AA dans le développement et la<br />
progression <strong>de</strong> la néphropathie dite aux plantes chinoises. Sur base <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
observations cliniques décrites précé<strong>de</strong>mment, suggérant que le tubule proximal est<br />
la cible <strong><strong>de</strong>s</strong> AA, nos travaux ont pour objectif, d’une part, <strong>de</strong> confirmer l’atteinte <strong>de</strong> la<br />
cellule tubulaire proximale dans la toxicité aux AA et, d’autre part, d’examiner les<br />
altérations structurelles et fonctionnelles précoces <strong>de</strong> l’épithélium tubulaire proximal<br />
dans la néphropathie expérimentale aux AA.<br />
Une première approche in vitro a été réalisée afin d’étudier les effets <strong><strong>de</strong>s</strong> AA<br />
sur la réabsorption <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines <strong>de</strong> faible poids moléculaire, principale fonction<br />
tubulaire proximale, par les cellules OK qui constituent un modèle bien établi du<br />
tubule proximal. Les effets <strong><strong>de</strong>s</strong> AA ont été comparés à ceux du CdCl2, un toxique<br />
connu pour altérer les fonctions du tubule proximal.<br />
Une secon<strong>de</strong> approche in vivo a pour objectif <strong>de</strong> caractériser <strong>de</strong> manière<br />
biochimique et histologique les lésions tubulaires proximales induites par les<br />
injections sous-cutanées quotidiennes d’AA en utilisant le modèle <strong>de</strong> rat <strong>de</strong> la<br />
néphropathie aux AA. Les altérations structurelles et fonctionnelles précoces du<br />
tubule proximal ont été étudiées (5 jours d’injection) ainsi que leur évolution au cours<br />
du temps (35 jours d’injection).<br />
66
CHAPITRE 3 : METHODOLOGIE<br />
1. Etu<strong>de</strong> in vitro : effets <strong><strong>de</strong>s</strong> aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong><br />
sur les cellules rénales d’opossum<br />
1.1. Culture <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules OK<br />
Les cellules rénales d’opossum (OK) ont été fournies par le Dr G. Friedlan<strong>de</strong>r<br />
(Université Xavier-Bichat, Paris, France). Les cellules du passage numéro 46 au<br />
numéro 108 sont cultivées dans le milieu Dubbelcco modifié selon Eagle (DMEM)-<br />
F12 contenant 10 % <strong>de</strong> sérum fœtal <strong>de</strong> bœuf, 10 U/ml <strong>de</strong> pénicilline et 10 µg/ml <strong>de</strong><br />
streptomycine (Life Technologies, Merelbeke, Belgique). Les cellules sont incubées à<br />
37°C dans <strong>de</strong> l’air contenant 5 % <strong>de</strong> CO2. A confluence, les cellules sont détachées<br />
par incubation avec une solution <strong>de</strong> trypsine-EDTA pendant 10 min et remises en<br />
culture à la dilution 1/5 <strong>de</strong>ux fois par semaine.<br />
1.2. Exposition <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules OK à différentes substances<br />
1.2.1. Aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong><br />
Les cellules OK confluentes sont traitées pendant 24 h avec du DMSO 0,1 %<br />
(contrôle) ou avec <strong><strong>de</strong>s</strong> AA à la concentration <strong>de</strong> 10 ou 20 µmol/l (Sigma, Bornem,<br />
Belgique). Le mélange d’AA utilisé est constitué <strong>de</strong> AAI (69 %) et AAII (19 %) ; les<br />
AA sont solubilisés dans du DMSO (concentration finale : 0,1%).<br />
Dans une autre série d’expériences, le temps d’exposition aux AA (20 µmol/l) est <strong>de</strong><br />
15 min et <strong>de</strong> 2, 6, 14, 18 heures.<br />
67
Pour les expériences <strong>de</strong> récupération, après 24 h d’exposition aux AA (20 µmol/l), les<br />
monocouches <strong>de</strong> cellules OK sont incubées dans le milieu <strong>de</strong> culture pendant 1, 2, 3<br />
et 6 jours.<br />
Les cellules OK sont également exposées pendant 24 h à un mélange <strong><strong>de</strong>s</strong> AA<br />
extraits <strong>de</strong> la plante (20 µmol/l) ainsi qu’à chacun <strong><strong>de</strong>s</strong> dérivés AAI et AAII isolé au<br />
départ <strong>de</strong> cet extrait (20 µmol/l). Ces 3 substances ont été fournies par le Prof H.<br />
Schmeiser (Division of Molecular Toxicology, Deutsches Krebsforschungszentrum,<br />
German Cancer Research Center, Hei<strong>de</strong>lberg, Allemagne).<br />
1.2.2. Cadmium<br />
Les cellules OK confluentes sont traitées avec du CdCl2 à la concentration <strong>de</strong><br />
15 µmol/l (Sigma, Bornem, Belgique) pendant 24 h. Le CdCl2 est solubilisé dans <strong>de</strong><br />
l’eau et les contrôles correspon<strong>de</strong>nt aux cellules dans le milieu <strong>de</strong> culture.<br />
Dans une autre série d’expériences, le temps d’exposition au CdCl2 (15 µmol/l) <strong>de</strong><br />
est <strong>de</strong> 15 min et <strong>de</strong> 2, 6, 14, 18 heures.<br />
Pour les expériences <strong>de</strong> récupération, après 24 h d’exposition au CdCl2 (15 µmol/l),<br />
les monocouches <strong>de</strong> cellules OK sont incubées pendant 1, 2, 3 et 6 jours dans le<br />
milieu <strong>de</strong> culture.<br />
1.2.3. Autres composés contenus dans les gélules amaigrissantes<br />
Les cellules OK confluentes sont traitées avec <strong>de</strong> la fenfluramine à la<br />
concentration <strong>de</strong> 20 et 100 µmol/l (préparation obtenue à la pharmacie <strong>de</strong> l’hôpital<br />
Erasme, Bruxelles, Belgique), du diéthylpropion à la concentration <strong>de</strong> 20 et 100<br />
µmol/l (préparation obtenue à la pharmacie <strong>de</strong> l’hôpital Erasme, Bruxelles, Belgique)<br />
et <strong>de</strong> l’acétazolami<strong>de</strong> à la concentration <strong>de</strong> 20 µmol/l (Sigma, Bornem, Belgique).<br />
Ces 3 composés sont solubilisés dans l’eau.<br />
68
1.3. Réabsorption d’albumine et <strong>de</strong> β2-microglobuline<br />
Les expériences <strong>de</strong> réabsorption sont réalisées comme décrit précé<strong>de</strong>mment<br />
[Schwegler J.S. et al., 1991]. Les cellules OK sont cultivées dans les plaques à 6<br />
puits et traitées à confluence comme détaillé plus haut. Après 3 rinçages avec la<br />
solution <strong>de</strong> Ringer (en mmol : NaCl 130, KCl 4, MgCl2.6H2O 1, CaCl2.2H2O 1,<br />
glucose 5, HEPES 10, titrée à pH 7,4 avec du Tris(hydroxyméthyl)-aminométhane),<br />
les cellules OK sont incubées à 37°C pendant 15 min avec différentes concentrations<br />
d’albumine-fluorescéine isothiocyanate (FITC, Molecular Probes, Lei<strong>de</strong>n, Les Pays-<br />
Bas) ou <strong>de</strong> β2-microglobuline-Cy5 dilués dans la solution <strong>de</strong> Ringer. L’incubation est<br />
arrêtée par 10 rinçages <strong><strong>de</strong>s</strong> monocouches <strong>de</strong> cellules à 4°C avec la solution <strong>de</strong><br />
Ringer froi<strong>de</strong>. Les cellules sont ensuite lysées avec une solution <strong>de</strong> 10 mmol/l <strong>de</strong><br />
MOPS (pH 7,4) contenant 0,1% <strong>de</strong> Triton X-100. La fluorescence intracellulaire est<br />
mesurée à l’ai<strong>de</strong> d’un spectrofluorimètre à un seul faisceau (Kontron SFM25, AG<br />
Instruments, Zurich, Suisse) à longueur d’on<strong>de</strong> d’excitation <strong>de</strong> 492 nm et d’émission<br />
<strong>de</strong> 520 nm pour l’albumine-FITC ou à 649 et 670 nm pour la β2-microglobuline-Cy5.<br />
La fluorescence <strong>de</strong> la <strong>de</strong>rnière solution <strong>de</strong> rinçage (avant la lyse <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules) est<br />
comparable à celle du bruit <strong>de</strong> fond. Le contenu en protéines est mesuré par la<br />
réaction <strong>de</strong> biuret à l’ai<strong>de</strong> du dosage <strong>de</strong> protéines BCA (Bicinchoninic acid Protein<br />
Assay Reageant kit, Pierce, Polylab, Anvers, Belgique). La quantité d’albumine et <strong>de</strong><br />
β2-microglobuline réabsorbée est exprimée en pmol/mg <strong>de</strong> protéine.<br />
La β2-microglobuline (1mg ; ICN Biomedicals, Asse-Relegem, Belgique) est<br />
marquée avec le colorant cyanine à l’ai<strong>de</strong> du kit <strong>de</strong> marquage Cy5 (Amersham<br />
Pharmacia Biotech Benelux, Roosendaal, Les Pays-Bas).<br />
1.3.1. Compétition avec d’autres protéines<br />
Les cellules OK ont été exposées pendant la pério<strong>de</strong> d’incubation <strong>de</strong> 15 min<br />
en présence d’albumine-FITC (0,8 µmol/l) et d’autres protéines à la concentration <strong>de</strong><br />
1 mg/ml: cytochrome C, lysozyme, aprotinine, hémoglobine, myoglobine, α2-<br />
69
macroglobuline, lactoferrine, transferrine, thyroglobuline, α1 aci<strong>de</strong> glycoprotéine<br />
(Sigma, Bornem, Belgique).<br />
1.4. Tests <strong>de</strong> cytotoxicité et <strong>de</strong> viabilité cellulaire<br />
1.4.1. Dosage <strong>de</strong> lactate déshydrogénase<br />
Les cellules OK sont cultivées dans les plaques à 96 puits et exposées à<br />
confluence aux substances comme détaillé ci-<strong><strong>de</strong>s</strong>sus. Le milieu <strong>de</strong> culture est<br />
remplacé par du milieu <strong>de</strong> culture frais sans sérum, le maximum <strong>de</strong> lactate<br />
déshydrogénase (LDH) libéré est obtenu par ajout <strong>de</strong> Triton (1 %) dans le milieu <strong>de</strong><br />
culture sans sérum. Après 6 heures d’incubation, le surnageant <strong>de</strong> la culture est<br />
récupéré et incubé à température ambiante avec le mélange <strong>de</strong> « réaction » du<br />
« Cytotoxicity Detection kit » (Roche Diagnostics, Bruxelles, Belgique). Ce mélange<br />
<strong>de</strong> « réaction » est composé d’un catalyseur (diaphorase/NAD + ) et d’une solution<br />
colorante contenant du chlorure <strong>de</strong> iodotétrazolium et du lactate <strong>de</strong> sodium. Les<br />
mesures <strong>de</strong> LDH sont réalisées à la longueur d’on<strong>de</strong> <strong>de</strong> 490 nm (avec 655 nm<br />
comme référence), la quantité <strong>de</strong> LDH libéré est exprimé en absorbance (A490nm –<br />
A655nm). Toutes les conditions sont effectuées en triple.<br />
1.4.2. Dosage <strong>de</strong> 3-(4,5-diméthyl-thiazoyl-2-yl)-2,5-diphényltétrazo-<br />
lium bromi<strong>de</strong> (MTT)<br />
Les cellules OK sont cultivées dans les plaques à 96 puits et traitées à<br />
confluence comme décrit ci-<strong><strong>de</strong>s</strong>sus. La solution MTT (5 mg/ml ; Sigma, Bornem,<br />
Belgique) est ensuite ajoutée dans les puits et les cellules sont incubées pendant<br />
3h30 à 37°C avec 5 % <strong>de</strong> CO2. Les cristaux <strong>de</strong> MTT formazan formés sont<br />
solubilisés avec une solution acidifiée d’isopropanol. Les <strong>de</strong>nsités optiques sont<br />
mesurées à la longueur d’on<strong>de</strong> <strong>de</strong> 570 nm (avec 655 nm comme référence). La<br />
70
viabilité cellulaire est exprimée en % du contrôle. Toutes les conditions sont réalisées<br />
en triple.<br />
1.5. Observation en microscopie <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules OK<br />
1.5.1. Microscopie conventionnelle<br />
Les cellules OK sont cultivées sur <strong><strong>de</strong>s</strong> lamelles en verre, traitées comme<br />
décrit ci-<strong><strong>de</strong>s</strong>sus, et fixées pendant 10 min avec du paraformaldéhy<strong>de</strong> 4 % en tampon<br />
phosphate 0,1 mol/l <strong>de</strong> pH 7,4 à température ambiante. Les cellules sont ensuite<br />
colorées à l’hématoxyline-éosine et observées sous un microscope optique DMR<br />
couplé à un système microphotographique MPS60 (Leica, Heerbrugg, Suisse).<br />
1.5.2. Microscopie confocale<br />
Endocytose d’albumine<br />
Pour l’étu<strong>de</strong> fonctionnelle <strong>de</strong> l’endocytose, les cellules OK sont cultivées sur<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> lamelles en verre. Après rinçage avec la solution <strong>de</strong> Ringer, les monocouches <strong>de</strong><br />
cellules OK sont incubées pendant 15 min à 37°C avec la solution <strong>de</strong> Ringer<br />
contenant l’albumine-FITC (150 µmol/l), et ensuite placées sur glace, rincées à froid<br />
et fixées comme décrit ci-<strong><strong>de</strong>s</strong>sus. Les cellules sont alors observées sous un<br />
microscope à fluorescence Zeiss Axiovert couplé à un microscope confocal à<br />
balayage laser (MRC 1000 ; Bio-Rad, Hercules, CA, USA) équipé d’un laser argonkrypton<br />
et d’un logiciel Laser-Sharp (Bio-Rad). Les images sont ensuite analysées à<br />
l’ai<strong>de</strong> du logiciel NIH-image 1.62 (Bethesda, MD, USA).<br />
Colocalisation entre l’endocytose d’albumine et la mégaline<br />
L’étu<strong>de</strong> <strong>de</strong> colocalisation entre l’endocytose d’albumine et la mégaline est<br />
réalisée sur les cellules OK incubées durant 2, 5 et 15 min avec <strong>de</strong> l’albumine-FITC<br />
(150 µmol/l) et ensuite fixées. L’immunomarquage avec un anticorps <strong>de</strong> mouton anti-<br />
71
mégaline (dilution 1/200) [Devuyst O. et al., 1999; Le Panse S. et al., 1995] est<br />
réalisé. Les cellules sont ensuite rincées et incubées avec un anticorps anti-mouton<br />
marqué au TRIC (tétraméthylrhodamine isothiocyanate, Sigma, Bornem, Belgique) à<br />
la dilution 1/200. Après rinçages, les cellules sont observées à l’ai<strong>de</strong> du système<br />
d’imagerie confocale décrit ci-<strong><strong>de</strong>s</strong>sus. Les paramètres d’analyse confocale sont<br />
définis afin d’éviter les interférences <strong>de</strong> signaux entre les 2 canaux <strong>de</strong> fluorescence.<br />
Toutes les expériences ont été réalisées en double et comparées à celles effectuées<br />
en absence d’anticorps primaire à titre <strong>de</strong> contrôle.<br />
1.6. Marquage <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines à la [ 35 S]L-méthionine<br />
Les cellules OK, cultivées dans <strong><strong>de</strong>s</strong> boîtes <strong>de</strong> 60 mm, sont exposées comme<br />
décrit ci-<strong><strong>de</strong>s</strong>sus ou incubées pendant 1 h en présence <strong>de</strong> cycloheximi<strong>de</strong> à la<br />
concentration <strong>de</strong> 100 µmol/l (Sigma, Bornem, Belgique), un inhibiteur <strong>de</strong> la synthèse<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> protéines. Après rinçage avec du DMEM ne contenant pas <strong>de</strong> méthionine, les<br />
monocouches <strong>de</strong> cellules sont exposées pendant 2 h à ~ 20 µCi/ml <strong>de</strong> [ 35 S]Lméthionine<br />
(NEN Life Science Products, Zaventem, Belgique) en DMEM sans<br />
méthionine. Après rinçage, les cellules sont incubées pendant 1 ou 20 h avec du<br />
DMEM contenant 10 mmol/l <strong>de</strong> méthionine à 37°C avec 5 % <strong>de</strong> CO2. Après rinçage à<br />
froid, les cellules sont lysées pendant 20 min sur glace avec une solution <strong>de</strong> pH 8<br />
composée <strong>de</strong> 10 mmol/l Tris et 1 mmol/l EDTA. Les cellules sont grattées et les<br />
lysats récupérés. Les protéines <strong>de</strong> ces lysats sont ensuite précipitées à l’ai<strong>de</strong> d’une<br />
solution d’aci<strong>de</strong> trichloroacétique 10 % pendant 30 min sur glace et centrifugées à<br />
1600 × g à 4°C pendant 20 min. Finalement, les culots resuspendus avec du SDS 1<br />
% (dodécyl sulfate <strong>de</strong> sodium ; Sigma, Bornem, Belgique) sont mis dans un liqui<strong>de</strong><br />
<strong>de</strong> scintillation Ready Protein + pour le comptage <strong><strong>de</strong>s</strong> émissions β (1214 Rackbeta<br />
liquid scintillation counter, LKB Wallac, Finlan<strong>de</strong>). La quantité <strong>de</strong> protéines<br />
synthétisées est exprimée en 10 6 CPM/mg <strong>de</strong> protéine.<br />
72
1.7. Réabsorption <strong>de</strong> méthyl-α-D-glucopyranosi<strong>de</strong> (AMG)<br />
Les cellules OK sont cultivées à confluence dans <strong><strong>de</strong>s</strong> plaques à 6 puits et<br />
traitées comme décrit précé<strong>de</strong>mment. Après rinçage, les monocouches <strong>de</strong> cellules<br />
sont incubées avec différentes concentrations <strong>de</strong> [ 14 C]-AMG (NEN Life Science<br />
Products, Zaventem, Belgique) en solution <strong>de</strong> Ringer à 37°C pendant 10 min. Ce<br />
temps est dans la phase linéaire <strong>de</strong> réabsorption. Après rinçages à froid avec la<br />
solution <strong>de</strong> Ringer, les cellules lysées avec 0,1 mol/l <strong>de</strong> HNO3 sont mises dans le<br />
liqui<strong>de</strong> <strong>de</strong> scintillation Ready Protein + pour le comptage <strong><strong>de</strong>s</strong> émissions β. La quantité<br />
d’AMG réabsorbée est exprimée en nmol/mg <strong>de</strong> protéine.<br />
1.8. Détection <strong><strong>de</strong>s</strong> adduits d’ADN spécifiques aux aci<strong><strong>de</strong>s</strong><br />
<strong>aristolochiques</strong><br />
La détection <strong><strong>de</strong>s</strong> adduits d’ADN spécifiques aux AA dans les extraits<br />
cellulaires a été réalisée par le Dr. V.M. Arlt dans le laboratoire <strong>de</strong> la Division <strong>de</strong><br />
Toxicologie Moléculaire du Prof. H.H. Schmeiser (Deutsches<br />
Krebsforschungszentrum, German Cancer Research Center, Hei<strong>de</strong>lberg,<br />
Allemagne). Les adduits d’ADN spécifiques aux AA sont détectés par la métho<strong>de</strong><br />
d’enrichissement à la nucléase P1 du post-marquage 32 P comme décrit<br />
précé<strong>de</strong>mment [Schmeiser H.H. et al., 1997]. Brièvement, l’ADN <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules OK est<br />
isolé par la métho<strong>de</strong> d’extraction au phénol après trypsinisation <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules OK pour<br />
les différents traitements étudiés. Les échantillons d’ADN (12,5 µg) sont digérés,<br />
enrichis à la nucléase P1 et post-marqués au 32 P. Ensuite, ces échantillons sont<br />
séparés par chromatographie sur <strong><strong>de</strong>s</strong> couches minces en polyéthylèneiminecellulose<br />
(Macherey and Nagel, Düren, Allemagne). Les conditions <strong>de</strong><br />
chromatographie utilisées sont les suivantes : D1 : 1 mol/l phosphate <strong>de</strong> sodium, pH<br />
6,8 ; D3 : 3,5 mol/l formate <strong>de</strong> lithium, 8,5 mol/l urée, pH 4,0 ; D4 : 0,8 mol/l chlorure<br />
<strong>de</strong> lithium, 0,5 mol/l Tris-HCl, 8,5 mol/l urée, pH 9,0 ; D5 : 1,7 mol/l NaH2PO4, pH 6,0.<br />
L’autoradiographie <strong>de</strong> ces plaques chromatographiques à l’ai<strong>de</strong> <strong>de</strong> « Packard Instant<br />
Imager » (Canberra Co., Dowers Grove, IL, USA) permet d’analyser et <strong>de</strong> quantifier<br />
73
les adduits d’ADN. Les adduits d’ADN spécifiques aux AA sont i<strong>de</strong>ntifiés comme<br />
décrit précé<strong>de</strong>mment [Bieler C.A. et al., 1997]. La quantification <strong><strong>de</strong>s</strong> adduits d’ADN<br />
se base sur le nombre <strong>de</strong> coups par minute, l’activité spécifique <strong>de</strong> l’ATP[γ- 32 P] et la<br />
quantité d’ADN utilisée (pmol ADN-P). Le taux d’adduits d’ADN spécifique aux AA<br />
est exprimé en quantité relative d’adduits d’ADN/10 7 nucléoti<strong><strong>de</strong>s</strong> normaux.<br />
1.9. Analyse <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong> la mégaline dans les<br />
extraits cellulaires<br />
Les lysats cellulaires sont préparés au départ <strong>de</strong> cellules OK confluentes<br />
exposées dans différentes conditions [Devuyst O. et al., 1999]. Après lavages en<br />
PBS (en mmol/l: 68 NaCl, 1,3 KCl, 4 Na2HPO4, 0,7 KH2PO4, titré à pH 7,4 par du<br />
HCl) et un léger grattage, les cellules sont centrifugées à 8000 × g pendant 90<br />
secon<strong><strong>de</strong>s</strong> et les culots sont congelés dans <strong>de</strong> l’azote liqui<strong>de</strong>. Les culots congelés<br />
sont solubilisés dans du tampon <strong>de</strong> lyse froid contenant <strong><strong>de</strong>s</strong> inhibiteurs <strong>de</strong> protéases<br />
(Complete Mini® ; Roche Diagnostics, Bruxelles, Belgique), brièvement traités aux<br />
ultrasons (Branson Sonifer 250, 2 pulses à 40 % d’intensité), et ensuite centrifugés à<br />
16000 × g pendant 1 min à 4°C. Le surnageant est récolté et mis en présence <strong>de</strong> 10<br />
% SDS et chauffé à 95°C pendant 90 secon<strong><strong>de</strong>s</strong>.<br />
Les extraits cellulaires (30 µg) et l’extrait membranaire <strong>de</strong> cortex rénal <strong>de</strong> rat<br />
(30 µg), utilisé comme contrôle positif, sont séparés par <strong><strong>de</strong>s</strong> gels <strong>de</strong> SDSpolyacrylami<strong>de</strong><br />
( 5%) et transférés sur membranes <strong>de</strong> nitrocellulose. Après les<br />
étapes <strong>de</strong> blocage, les membranes sont incubées toute la nuit à 4°C avec l’anticorps<br />
<strong>de</strong> mouton anti-mégaline (dilution 1/2500) [Le Panse S. et al., 1995]. Elles sont<br />
ensuite lavées, incubées avec l’anticorps anti-mouton marqué à la peroxidase (Dako,<br />
Prosan, Merelbeke, Belgique) et révélées à l’ECL (enhanced chemioluminescence<br />
kit, Amersham Pharmacia Biotech, Roosendaal, Les Pays-Bas). Avant d’effectuer un<br />
nouveau marquage, les membranes sont rincées, le premier marquage est ensuite<br />
enlevé en incubant les membranes pendant 30 min à 55°C dans une solution <strong>de</strong> pH<br />
7,4 composée <strong>de</strong> 62,5 mmol/l <strong>de</strong> Tris-HCl, 2 % SDS, 100 mmol/l <strong>de</strong> β-<br />
74
mercaptoéthanol. Après lavage, l’absence <strong>de</strong> signal est vérifiée par incubation avec<br />
l’ECL en exposant un film pendant 1h. Les membranes sont ensuite incubées avec<br />
l’anticorps monoclonal anti-β-actine (dilution 1/10000, Sigma, Bornem, Belgique),<br />
suivi <strong>de</strong> l’anticorps anti-souris marqué à la peroxydase (Dako, Prosan, Merelbeke,<br />
Belgique) et finalement exposées à l’ECL. Trois immunomarquages indépendants<br />
pour la détection <strong>de</strong> la mégaline dans les cellules OK ont été réalisés.<br />
L’analyse <strong>de</strong>nsitométrique est effectuée sur un immunoblot représentatif à<br />
l’ai<strong>de</strong> d’un Scanjet Hewlett Packart modèle IVC utilisant un logiciel NIH Image V1.60<br />
(Bethesda, MD, USA). Les <strong>de</strong>nsités optiques, données en unités <strong>de</strong> pixels<br />
arbitraires, pour la mégaline sont normalisées par rapport à la β-actine et exprimées<br />
en pourcentage du signal obtenu pour les cellules OK contrôles. Chaque évaluation<br />
est obtenue en double.<br />
1.10. Analyses statistiques<br />
Tous les résultats représentent la moyenne ± l’erreur standard à la moyenne.<br />
Les comparaisons sont réalisées à l’ai<strong>de</strong> <strong>de</strong> l’analyse pairée « Stu<strong>de</strong>nt t test ».<br />
75
2. Etu<strong>de</strong> in vivo : effets <strong>de</strong> l’intoxication aux aci<strong><strong>de</strong>s</strong><br />
<strong>aristolochiques</strong> sur l’épithélium tubulaire proximal<br />
<strong>de</strong> rat.<br />
2.1. Conditionnement <strong><strong>de</strong>s</strong> rats Wistar<br />
Des rats mâles <strong>de</strong> souche Wistar, provenant <strong>de</strong> l’Elevage agréé Janvier (Le<br />
Genest Saint-Isle, France) ont été hébergés dans l’animalerie <strong>de</strong> la Faculté <strong>de</strong><br />
Mé<strong>de</strong>cine <strong>de</strong> l’Université Libre <strong>de</strong> Bruxelles (Belgique) dans <strong><strong>de</strong>s</strong> conditions<br />
contrôlées <strong>de</strong> température, d’humidité et <strong>de</strong> luminosité. Au cours <strong><strong>de</strong>s</strong> protocoles, les<br />
animaux ont un <strong>libre</strong> accès à l’eau (eau <strong>de</strong> distribution) et à la nourriture, à savoir un<br />
régime alimentaire complet pour rat contenant un taux normal <strong>de</strong> sodium (Carfil<br />
Quality, Oud-Turnhout, Belgique). Avant chaque protocole, une semaine<br />
d’acclimatation est laissée aux animaux afin qu’ils puissent s’adapter à leur nouvel<br />
environnement.<br />
Les protocoles ont été approuvés par le Comité d’Ethique et du Bien-être<br />
Animal (Faculté <strong>de</strong> Mé<strong>de</strong>cine, Université Libre <strong>de</strong> Bruxelles, Belgique).<br />
2.2. Administration <strong><strong>de</strong>s</strong> aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong> aux rats<br />
Le mélange d’AA (Acros Organics Co., Geel, Belgique) utilisé pour les<br />
injections, est composé <strong>de</strong> 40 % <strong>de</strong> AAI et 60 % <strong>de</strong> AAII. Les AA (20 mg/ml) sont<br />
solubilisés avec du polyéthylène glycol (PEG) 400 (Fluka Chemie, Buchs, Suisse) et<br />
dilués dans <strong>de</strong> l’eau pour injection à la concentration finale <strong>de</strong> 10 mg/ml. Les rats<br />
traités aux AA reçoivent une injection quotidienne sous-cutanée d’AA à la<br />
concentration <strong>de</strong> 10 mg/kg <strong>de</strong> poids corporel tandis que les rats contrôles reçoivent<br />
une injection journalière d’une solution volume/volume <strong>de</strong> PEG 400 et d’eau pour<br />
76
injection. Les rats sont pesés chaque semaine afin d’ajuster la dose d’AA à<br />
administrer.<br />
2.2.1. Modèle initial <strong>de</strong> la néphropathie aux aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong> :<br />
rats traités pendant 35 jours<br />
Septante-<strong>de</strong>ux rats, âgés <strong>de</strong> 4 semaines, sont répartis au hasard au jour 0 en<br />
<strong>de</strong>ux groupes <strong>de</strong> poids équivalents. Un premier groupe <strong>de</strong> 36 rats correspond aux<br />
rats traités aux AA et un <strong>de</strong>uxième groupe <strong>de</strong> 36 rats représente les rats contrôles.<br />
Six rats par groupe sont sacrifiés après 3, 7, 10, 14, 18 et 35 jours d’injection.<br />
Une secon<strong>de</strong> série d’expériences est réalisée sur base du protocole détaillé ci<strong><strong>de</strong>s</strong>sus<br />
afin <strong>de</strong> suivre l’évolution au cours du temps <strong><strong>de</strong>s</strong> paramètres urinaires<br />
pendant 35 jours. Sept rats, âgés <strong>de</strong> 4 semaines, sont divisés en <strong>de</strong>ux groupes au<br />
jour 0 : quatre pour le groupe exposé aux AA et trois rats contrôles. Pour chaque rat,<br />
les urines <strong>de</strong> 24 heures sont récoltées aux jours 0, 3, 5, 7, 10, 13, 15, 18, 22, 24, 27,<br />
31 et 35.<br />
2.2.2. Protocole court : rats traités pendant 5 jours<br />
Soixante rats, âgés <strong>de</strong> 7 semaines, sont divisés en <strong>de</strong>ux groupes (n = 30) au<br />
jour 0. Les injections sont réalisées chaque jour comme décrit ci-<strong><strong>de</strong>s</strong>sus. Six rats du<br />
groupe exposé aux AA et six du groupe contrôle sont euthanasiés après 1, 2, 3, 4 et<br />
5 jours d’injection.<br />
2.2.3. Protocole <strong><strong>de</strong>s</strong>tiné à <strong><strong>de</strong>s</strong> étu<strong><strong>de</strong>s</strong> histologiques particulières<br />
(10 jours)<br />
Trente rats, âgés <strong>de</strong> 7 semaines, sont divisés en <strong>de</strong>ux groupes (n = 15) au<br />
jour 0. Les injections quotidiennes sont réalisées comme décrit ci-<strong><strong>de</strong>s</strong>sus. Trois rats<br />
77
du groupe exposé aux AA et trois du groupe contrôle sont euthanasiés après<br />
respectivement 1, 2, 3, 4, 7 et 10 jours d’injection.<br />
2.3. Prélèvement <strong><strong>de</strong>s</strong> urines, du sang et <strong><strong>de</strong>s</strong> reins<br />
Urines<br />
Avant le sacrifice, les urines sont collectées (durée approximative : 20 à 24 h)<br />
en plaçant les rats dans <strong><strong>de</strong>s</strong> cages à métabolisme pour rongeurs. Les échantillons<br />
d’urine sont, en fonction du dosage ultérieur, centrifugés à 1600 × g pendant 15 min<br />
à 4°C ou dilués dans du glycérol (dilution 1/3) avant d’être conservés à –20°C.<br />
Sang et reins<br />
Aux jours <strong>de</strong> sacrifice, les rats sont profondément anesthésiés par injection<br />
intra-péritonéale d’une solution composée d’un analgésique, la kétamine (Imalgen,<br />
Leo Pharma Belgium, Wilrijk, Belgique) et d’un sédatif puissant, la xylazine (Rompun,<br />
Bayer, Bruxelles, Belgique). Après ouverture <strong>de</strong> la cage thoracique, le sang est<br />
récolté par ponction intracardiaque à l’ai<strong>de</strong> d’une seringue contenant du dipotassium-<br />
EDTA et les reins sont prélevés.<br />
Le plasma est centrifugé à 1600 × g pendant 15 min à 4°C et congelé à –20°C<br />
en prévision <strong><strong>de</strong>s</strong> dosages ultérieurs.<br />
Après décapsulation, la moitié d’un rein est fixée dans une solution<br />
tamponnée <strong>de</strong> formaldéhy<strong>de</strong> 4% pour les analyses histologiques sur coupes en<br />
paraffine. Pour les étu<strong><strong>de</strong>s</strong> sur coupes au cryostat, un <strong>de</strong>mi-rein est fixé dans une<br />
solution tamponnée en phosphate <strong>de</strong> paraformaldéhy<strong>de</strong> 4% et ensuite cryoprotégé<br />
par immersions successives dans <strong><strong>de</strong>s</strong> solutions <strong>de</strong> saccharose 10, 20 et 30%, avant<br />
la congélation dans <strong>de</strong> l’isopentane.<br />
D’autre part, un fragment <strong>de</strong> cortex rénal est disséqué, congelé dans <strong>de</strong> l’azote<br />
liqui<strong>de</strong> et conservé à –80°C pour la détection d’adduits d’ADN spécifiques aux AA.<br />
78
2.4. Dosages <strong>de</strong> la créatinine plasmatique et urinaire<br />
Créatinine plasmatique<br />
La concentration <strong>de</strong> créatinine plasmatique est mesurée par une métho<strong>de</strong> <strong>de</strong><br />
chromatographie liqui<strong>de</strong> à haute performance (HPLC) adaptée <strong>de</strong> Xue et al. [Xue<br />
G.P. et al., 1988]. Brièvement, les échantillons <strong>de</strong> plasma sont d’abord traités avec<br />
<strong>de</strong> l’acétonitrile afin <strong>de</strong> les déprotéiner et ensuite analysés par HPLC sur une colonne<br />
échangeuse <strong>de</strong> cation <strong>de</strong> haute affinité (colonne Spherisorb 5 µm SCX, 4,0 × 250<br />
mm, Waters, Milford, MA, USA). La phase mobile est composée d’acétonitrile (9 %)<br />
dans une solution 40 mM <strong>de</strong> phosphate d’ammonium à pH 5,3, utilisée pour l’élution<br />
<strong>de</strong> la colonne au débit <strong>de</strong> 1,0 ml/min à température ambiante. L’absorbance <strong>de</strong> la<br />
créatinine est mesurée à la longueur d’on<strong>de</strong> <strong>de</strong> 230 nm. L’i<strong>de</strong>ntification et la<br />
quantification du pic <strong>de</strong> créatinine détecté sont réalisées par comparaison avec une<br />
courbe standard <strong>de</strong> créatinine (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgique). La concentration<br />
<strong>de</strong> créatinine plasmatique est exprimée en µmol/l.<br />
Créatinine urinaire<br />
La concentration <strong>de</strong> créatinine urinaire est déterminée par la métho<strong>de</strong><br />
pseudocinétique <strong>de</strong> Jaffé à l’ai<strong>de</strong> du « Creatinine Diagnostic Kit » (Sigma-Aldrich,<br />
Bornem, Belgique). Succinctement, les échantillons d’urine dilués 40 × sont incubés<br />
pendant 4 min 30 sec à 37°C avec une solution volume/volume d’aci<strong>de</strong> picrique 37<br />
mM et <strong>de</strong> NaOH 0,3 M. La quantité <strong>de</strong> créatinine est mesurée à la longueur d’on<strong>de</strong><br />
<strong>de</strong> 492 nm, rapportée à une courbe standard <strong>de</strong> créatinine et exprimée en mmol/l.<br />
2.5. Dosage <strong>de</strong> l’activité leucine aminopeptidase dans<br />
l’urine<br />
L’excrétion urinaire <strong>de</strong> leucine aminopeptidase (LAP), enzyme originaire <strong>de</strong> la<br />
bordure en brosse du tubule proximal, est mesurée par dosage spectrofluorimétrique<br />
d’activité enzymatique. Les échantillons d’urine en glycérol sont portés à la dilution<br />
finale <strong>de</strong> 30 × et 60 × dans du tampon Tris-HCl 50 mM à pH 7,6 et incubés avec le<br />
79
substrat synthétique leucine-7-amino-4-méthyl-coumarine (Bachem, Bubendorf,<br />
Suisse) à 37°C pendant une heure. La réaction enzymatique est arrêtée en chauffant<br />
les échantillons à 95°C pendant 5 min. L’activité LAP est déduite <strong>de</strong> la mesure <strong>de</strong> la<br />
fluorescence du 7-amino-4-méthyl-coumarine (AMC), libéré par la réaction, à la<br />
longueur d’on<strong>de</strong> d’excitation <strong>de</strong> 367 nm et d’émission <strong>de</strong> 440 nm ; elle est exprimée<br />
en nmol d’AMC produit/mmol <strong>de</strong> créatinine/h.<br />
2.6. Dosage <strong>de</strong> l’activité endopeptidase neutre dans l’urine<br />
L’excrétion urinaire d’endopeptidase neutre (NEP), enzyme également<br />
localisée à la bordure en brosse du tubule proximal, est mesurée par dosage<br />
spectrofluorimétrique d’activité enzymatique. Les échantillons d’urine en glycérol sont<br />
portés à la dilution finale <strong>de</strong> 120 × dans du tampon Tris-HCl 50 mM à pH 7,6 et<br />
incubés avec le substrat synthétique succinyl-alanyl-alanyl-phénylalanine-7-amino-4-<br />
méthyl-coumarine (Bachem, Bubendorf, Suisse) à 37°C pendant une heure. La<br />
réaction enzymatique est arrêtée en ajoutant du phosphoramidon [N-(α-<br />
rhamnopyranosyloxyhydroxyphosphinyl)-leucine-tryptophane, Sigma-Aldrich,<br />
Bornem, Belgique]. Les échantillons sont incubés avec un excès d’aminopeptidase<br />
(EC 3.4.11.2, Pierce, Rockford, USA) à 56°C pendant 30 min afin <strong>de</strong> libérer l’AMC.<br />
Cette réaction est ensuite arrêtée par incubation <strong><strong>de</strong>s</strong> échantillons à 95°C pendant 5<br />
min. L’activité NEP correspond à la mesure <strong>de</strong> la fluorescence <strong>de</strong> l’AMC libéré par la<br />
réaction, à la longueur d’on<strong>de</strong> d’excitation <strong>de</strong> 367 nm et d’émission <strong>de</strong> 440 nm.<br />
L’activité NEP est rapportée à une courbe standard établie au départ <strong>de</strong> NEP purifiée<br />
extraite <strong>de</strong> rein humain [Deschodt-Lanckman M. et al., 1988] et exprimée en<br />
µg/mmol <strong>de</strong> créatinine.<br />
80
2.7. Dosage <strong>de</strong> l’activité N-acétyl-β-D-glucosaminidase<br />
dans l’urine<br />
L’excrétion urinaire <strong>de</strong> N-acétyl-β-D-glucosaminidase (NAG), enzyme<br />
présente dans les lysosomes, est mesurée par un dosage colorimétrique en adaptant<br />
le protocole fourni (Roche Diagnostics Belgium, Bruxelles, Belgique). Brièvement, les<br />
échantillons d’urines sont incubés avec le substrat 3-crésolsulfonphthaléinyl-N-<br />
acétyl-β-D-glucosamini<strong>de</strong> à 37°C pendant 30 min. Après arrêt <strong>de</strong> la réaction, le<br />
produit <strong>de</strong> l’hydrolyse du substrat, le 3-crésolsulfonphtaléine, est détecté à la<br />
longueur d’on<strong>de</strong> <strong>de</strong> 540 nm. L’activité NAG est déterminée en rapportant les<br />
mesures <strong>de</strong> <strong>de</strong>nsité optique à une courbe standard <strong>de</strong> NAG et exprimée en<br />
mUnités/mmol <strong>de</strong> créatinine.<br />
2.8. Dosage et analyse <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines urinaires<br />
Dosage <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines urinaires<br />
Les protéines urinaires sont dosées par la métho<strong>de</strong> <strong>de</strong> Bradford [Bradford<br />
M.M., 1976]. Après ajout du réactif <strong>de</strong> Bradford aux échantillons d’urine dilués 20 ×,<br />
les <strong>de</strong>nsités optiques sont mesurées à la longueur d’on<strong>de</strong> <strong>de</strong> 620 nm et rapportées à<br />
une courbe standard d’albumine sérique bovine (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgique).<br />
La quantité <strong>de</strong> protéines urinaires est exprimée en mg/mmol <strong>de</strong> créatinine.<br />
Electrophorèse <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines urinaires<br />
Avant <strong>de</strong> séparer les protéines urinaires par migration sur gel<br />
d’électrophorèse, les protéines sont précipitées avec une solution d’aci<strong>de</strong><br />
trichloracétique 10 %, centrifugées à 1600 × g pendant 10 min, lavées avec <strong>de</strong><br />
l’éthanol 100 % et séchées par évaporation au Speed-Vac. Le culot est resuspendu<br />
dans le tampon <strong>de</strong> Laemmli 1 × (31,2 mM Tris-HCl, 5 % glycérol, 1 % SDS, 0,5 % β-<br />
mercaptoéthanol, bleu <strong>de</strong> bromophénol). Après dénaturation à 95°C pendant 2 min,<br />
20 µg d’échantillon <strong>de</strong> protéines sont séparés par électrophorèse sur gel Tris-HCl<br />
composé d’un gradient <strong>de</strong> 4 à 20 % (Ready gel Tris-HCl 4-20 %, Bio-Rad<br />
81
Laboratories, Nazareth-Eke, Belgique). Les gels sont colorés avec une solution <strong>de</strong><br />
bleu <strong>de</strong> Coomassie (30 % méthanol, 10 % aci<strong>de</strong> acétique, 60 % H2O, 0,1 % bleu <strong>de</strong><br />
Coomassie). Ils sont ensuite incubés avec la solution <strong>de</strong> décoloration (40 %<br />
méthanol, 10 % aci<strong>de</strong> acétique, 50 % H2O, 0,5 % glycérol) et séchés.<br />
Analyse semi-quantitative<br />
L’analyse semi-quantitative <strong>de</strong> la proportion d’albumine, <strong>de</strong> protéines <strong>de</strong> faible<br />
et <strong>de</strong> haut poids moléculaires sur ces gels d’électrophorèse est réalisée par la<br />
numérisation <strong><strong>de</strong>s</strong> profils <strong>de</strong> migration (CanoScan N676U, Canon Inc., Tokyo, Japon),<br />
suivie <strong>de</strong> leur examen par analyseur d’images (Scion Image version b4.0.2, Scion<br />
corporation, MA, USA). La quantité relative d’albumine ainsi que <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines <strong>de</strong><br />
faible et haut poids moléculaires est rapportée aux valeurs <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines urinaires<br />
totales et exprimée en mg/mmol <strong>de</strong> créatinine.<br />
2.9. Dosage d’albumine plasmatique et urinaire<br />
L’albumine plasmatique et urinaire est mesurée par une métho<strong>de</strong> ELISA pour<br />
l’albumine <strong>de</strong> rat (rat albumin ELISA quantitation kit, Bethyl Laboratories, IMTEC<br />
Diagnostics, Anvers, Belgique). Brièvement, les plaques ELISA sont incubées avec<br />
l’anticorps <strong>de</strong> capture <strong>de</strong> lapin anti-albumine <strong>de</strong> rat purifié par affinité, dilué (1/100)<br />
dans du carbonate <strong>de</strong> sodium 0,05 M à pH 9,6 (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgique), à<br />
température ambiante pendant 1 heure. Entre chaque nouvelle incubation, les puits<br />
sont abondamment rincés avec la solution <strong>de</strong> lavage (Tris 50 mM, NaCl 138 mM, KCl<br />
2,7 mM, Tween 0,05 %, pH 8,0). Puis, la solution <strong>de</strong> blocage (Tris 50 mM, NaCl 138<br />
mM, KCl 2,7 mM, BSA 1 %, pH 8,0) est ajoutée pendant 30 min à température<br />
ambiante. Ensuite, les échantillons <strong>de</strong> plasma et d’urine, respectivement aux<br />
dilutions × 2 10 6 et × 10 3 , sont incubés à température ambiante pendant 1 heure.<br />
Ensuite, l’anticorps <strong>de</strong> détection <strong>de</strong> lapin anti-albumine <strong>de</strong> rat conjugué à l’HRP<br />
(HorseRadish Peroxidase) à la dilution 1/50000 est incubé pendant 1 heure à<br />
température ambiante et est révélé à l’ai<strong>de</strong> du substrat enzymatique 3,3’,5,5’<br />
tétraméthylbenzidine (TMB) qui réagit avec la peroxydase. Enfin, la réaction est<br />
arrêtée avec <strong>de</strong> l’aci<strong>de</strong> sulfurique 1 N et le produit final <strong>de</strong> couleur jaune est mesuré<br />
82
à la longueur d’on<strong>de</strong> <strong>de</strong> 450 nm. Les valeurs obtenues sont rapportées à une courbe<br />
standard d’albumine <strong>de</strong> rat et exprimées en mg/mmol <strong>de</strong> créatinine.<br />
Le rapport albuminurie/protéinurie totale, exprimé en %, est égal au rapport <strong>de</strong><br />
la concentration d’albumine urinaire sur la concentration <strong>de</strong> protéines urinaires<br />
totales<br />
2.10. Dosage d’alpha-glutathion-S-transférase urinaire<br />
L’excrétion urinaire d’alpha-glutathion-S-transférase (α-GST), localisée au<br />
niveau <strong><strong>de</strong>s</strong> tubules proximaux et distaux, est mesurée par un dosage immunoenzymatique<br />
selon le protocole fourni (Biotrin, Herman Diagnostics, Wemmel,<br />
Belgique). Brièvement, les échantillons d’urines dilués 5 × sont incubés pendant 1 h<br />
à température ambiante dans une plaque coatée avec <strong><strong>de</strong>s</strong> IgG dirigés contre l’α-GST<br />
<strong>de</strong> rat. Après rinçages, l’anticorps conjugué, anti-rat α-GST IgG conjugué à l’HRP,<br />
est ajouté pendant 1 h à température ambiante. Ensuite, le substrat enzymatique<br />
TMB réagit avec la peroxydase pendant 15 min pour révéler le signal. Cette réaction<br />
est arrêtée à l’ai<strong>de</strong> d’une solution d’aci<strong>de</strong> sulfurique 1N. La <strong>de</strong>nsité optique du produit<br />
final <strong>de</strong> couleur jaune est mesurée à la longueur d’on<strong>de</strong> <strong>de</strong> 450 nm. Les valeurs<br />
obtenues sont calculées par rapport à une courbe standard d’α-GST <strong>de</strong> rat et<br />
exprimées en µg/mmol <strong>de</strong> créatinine.<br />
2.11. Dosages <strong>de</strong> sodium, potassium et glucose urinaire et<br />
plasmatique<br />
Les dosages <strong>de</strong> sodium, potassium et glucose dans les urines et le plasma<br />
ont été réalisés au Laboratoire <strong>de</strong> Chimie en collaboration avec le Dr. B. Gulbis<br />
(Hôpital Erasme, Bruxelles, Belgique). Les dosages <strong>de</strong> sodium et <strong>de</strong> potassium sont<br />
basés sur la mesure <strong>de</strong> la différence <strong>de</strong> potentiel entre une électro<strong>de</strong> <strong>de</strong> référence et<br />
une électro<strong>de</strong> ion-sélective au sodium ou au potassium. Le dosage du glucose<br />
83
epose sur une métho<strong>de</strong> enzymatique. Toutes ces analyses sont effectuées sur un<br />
analyseur automatique Cobas Mira (Roche Diagnostics Division, Bruxelles,<br />
Belgique).<br />
La fraction d’excrétion du sodium, du potassium et du glucose est exprimée en<br />
%. Par exemple pour le glucose, elle est calculée par l’équation suivante :<br />
(concentration <strong>de</strong> glucose urinaire × concentration <strong>de</strong> créatinine plasmatique) /<br />
(concentration <strong>de</strong> glucose plasmatique × concentration <strong>de</strong> créatinine urinaire).<br />
2.12. Histologie rénale conventionnelle<br />
Les tissus fixés <strong>de</strong> rein sont enrobés <strong>de</strong> paraffine et coupés à une épaisseur<br />
<strong>de</strong> 5 µm. Pour analyser les lésions en microscopie optique, les coupes ont été<br />
colorées à l’hématoxyline-éosine et au trichrome <strong>de</strong> Goldner.<br />
Hématoxyline-éosine<br />
Pour la coloration hématoxyline-éosine, les coupes sont d’abord déparaffinées<br />
dans <strong><strong>de</strong>s</strong> bains <strong>de</strong> toluène 100 % et réhydratées par passages successifs dans <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
bains d’isopropanol allant <strong>de</strong> 100 à 70 %. Ensuite, les coupes <strong>de</strong> tissus sont<br />
incubées pendant 4 min dans l’hématoxyline <strong>de</strong> Mayer (Merck KGaA, VWR<br />
International, Leuven, Belgique), rincées et différenciées dans l’alcool chlorhydrique<br />
(isopropanol 70%, aci<strong>de</strong> chlorhydrique 35%) pendant 10 secon<strong><strong>de</strong>s</strong>. Après rinçages,<br />
les coupes sont incubées dans l’éosine 1 % pendant 1 min et rincées. Avant d’être<br />
montées au DPX, les coupes sont déshydratées dans <strong><strong>de</strong>s</strong> bains d’isopropanol allant<br />
<strong>de</strong> 70 à 100 %, suivi <strong>de</strong> toluène 100 %.<br />
Trichrome <strong>de</strong> Goldner<br />
La coloration au trichrome <strong>de</strong> Goldner a été réalisée dans le Département<br />
d’Anatomie Pathologique du Prof. I. Salmon (Hôpital Erasme, Bruxelles, Belgique).<br />
Brièvement, les coupes sont déparaffinées et incubées avec l’hématoxyline <strong>de</strong> Groat<br />
pendant 5 min. Après rinçage, les coupes sont incubées avec du Ponceau fuschine<br />
aci<strong>de</strong> pendant 5 min. Ensuite, les coupes sont rincées dans <strong>de</strong> l’eau acétéifiée (aci<strong>de</strong><br />
84
acétique 1%), incubées avec <strong>de</strong> l’orange G pendant 5 min, rincées, incubées avec<br />
du vert lumière pendant 5 min, rincées. Les coupes sont déshydratées et montées.<br />
Semi-quantification <strong><strong>de</strong>s</strong> lésions tubulo-interstitielles<br />
L’évaluation semi-quantitative <strong><strong>de</strong>s</strong> lésions tubulo-interstitielles représentatives du<br />
cortex rénal a été réalisée sur base <strong><strong>de</strong>s</strong> scores établis précé<strong>de</strong>mment [Debelle F.D.<br />
et al., 2002] et détaillés ci-<strong><strong>de</strong>s</strong>sous:<br />
Scores semi-quantitatifs <strong><strong>de</strong>s</strong> lésions morphologiques du cortex rénal<br />
Score Nécrose tubulaire Atrophie tubulaire Fibrose interstitielle<br />
0 Absente Absente Absente<br />
1<br />
Quelques tubules<br />
isolés<br />
Quelques tubules<br />
isolés<br />
2 Plusieurs foyers Plusieurs foyers<br />
Faible avec un léger<br />
épaississement <strong>de</strong> la<br />
membrane basale<br />
tubulaire<br />
Modérée avec un<br />
agrandissement focal <strong>de</strong><br />
l’interstitium<br />
3 Massive Massive Sévère avec <strong>de</strong> zones<br />
<strong>de</strong> fibrose confluentes<br />
L’établissement du score <strong>de</strong> ces lésions a été effectué au grossissement <strong>de</strong> 200 ×<br />
par trois observateurs indépendants (F. Debelle, A. Pozdzik et C. Lebeau).<br />
Aci<strong>de</strong> periodique <strong>de</strong> Schiff (PAS)<br />
Pour étudier l’intégrité <strong>de</strong> la bordure en brosse, les coupes en paraffine <strong>de</strong><br />
tissu rénal ont été colorées à l’aci<strong>de</strong> periodique <strong>de</strong> Schiff (PAS). Brièvement, les<br />
coupes <strong>de</strong> tissu sont déparaffinées, réhydratées et incubées avec l’aci<strong>de</strong> periodique<br />
1% pendant 10 min à température ambiante. Ensuite, ces coupes sont rincées et<br />
incubées dans le réactif <strong>de</strong> Schiff pendant 15 min à température ambiante. Après<br />
lavages, les coupes sont contre-colorées à l’hématoxyline <strong>de</strong> Mayer : incubation <strong>de</strong> 4<br />
min dans l’hématoxyline <strong>de</strong> Mayer, lavages, différenciation 10 secon<strong><strong>de</strong>s</strong> dans l’alcool<br />
chlorhydrique, rinçages. Finalement, les coupes sont déshydratées dans<br />
l’isopropanol passant successivement <strong>de</strong> 70, 90 à 100 % suivi du toluène 100 % et<br />
85
ensuite montées à l’ai<strong>de</strong> <strong>de</strong> la solution <strong>de</strong> montage DPX (Fluka, Sigma-Aldrich,<br />
Bornem, Belgique).<br />
2.13. Immunomarquage <strong>de</strong> l’endopeptidase neutre<br />
L’immunomarquage <strong>de</strong> l’endopeptidase neutre (NEP), localisée à la bordure<br />
en brosse, est réalisé sur <strong><strong>de</strong>s</strong> coupes en paraffine <strong>de</strong> tissu rénal. Ces coupes sont<br />
déparaffinées et réhydratées avant d’être incubées dans du méthanol contenant 0,3<br />
% d’H2O2 pendant 30 min afin d’inhiber l’activité peroxydase endogène. Les coupes<br />
sont ensuite rincées dans une solution tamponnée saline <strong>de</strong> Tris (TBS : NaCl 154<br />
mM, Tris 10 mM, pH 7,6), comme entre chaque incubation détaillée ci-<strong><strong>de</strong>s</strong>sous. Pour<br />
bloquer les sites aspécifiques, les coupes sont incubées avec du sérum normal <strong>de</strong><br />
chèvre (Vectastain Elite®ABC kit Rabbit IgG, Vector Laboratories, Labconsult,<br />
Bruxelles, Belgique) pendant 20 min, suivi d’une solution d’avidine D pendant 15 min<br />
et d’une solution <strong>de</strong> biotine pendant 15 min (Avidin/Biotin blocking kit, Vector<br />
Laboratories, Labconsult, Bruxelles, Belgique). Ensuite, les coupes sont incubées<br />
avec l’anticorps primaire polyclonal <strong>de</strong> lapin anti-endopeptidase neutre (Chemicon<br />
International, Biognost, Heule, Belgique), dilué à 1/2000 en sérum normal <strong>de</strong> chèvre,<br />
à température ambiante pendant toute la nuit. L’anticorps secondaire biotinylé <strong>de</strong><br />
chèvre anti-IgG <strong>de</strong> lapin est alors ajouté pendant 30 min. Après 30 min d’incubation<br />
avec le complexe avidine et peroxidase « horseradish » biotinylé, le marquage est<br />
révélé par 2 min d’incubation avec la solution <strong>de</strong> 3, 3’-dianimobenzidine (DAB<br />
substrate kit for peroxidase, Vector Laboratories, Labconsult, Bruxelles, Belgique).<br />
Finalement, les coupes sont contre-colorées à l’hématoxyline <strong>de</strong> Mayer,<br />
déshydratées et montées à l’ai<strong>de</strong> <strong>de</strong> la solution <strong>de</strong> montage DPX.<br />
Analyse semi-quantitative<br />
La semi-quantification <strong>de</strong> l’immunomarquage NEP est établie sur base du<br />
nombre <strong>de</strong> tubules proximaux positifs pour la NEP par champ au grossissement <strong>de</strong><br />
200 ×. Un champ correspond à une population moyenne d’approximativement 85<br />
tubules proximaux. Dix champs sont examinés par coupe rénale ; le nombre <strong>de</strong><br />
tubules proximaux positifs pour la NEP et le nombre total <strong>de</strong> tubules proximaux sont<br />
86
comptés par champ. La moyenne du nombre total <strong>de</strong> tubules et la moyenne du<br />
nombre <strong>de</strong> tubules NEP positifs sont calculées pour ces dix champs et permettent<br />
d’exprimer la quantité <strong>de</strong> tubules proximaux NEP positifs en % <strong>de</strong> tubules proximaux<br />
totaux pour un rat. La valeur finale pour chaque temps est égale au nombre moyen<br />
<strong>de</strong> tubules NEP positifs obtenu pour les 6 rats. Ce comptage est réalisé par <strong>de</strong>ux<br />
observatrices indépendantes (A. Pozdzik et C. Lebeau).<br />
2.14. Immunomarquages <strong>de</strong> la mégaline et <strong>de</strong> la cubiline<br />
L’immunomarquage <strong>de</strong> la mégaline et <strong>de</strong> la cubiline, <strong>de</strong>ux récepteurs localisés<br />
à la bordure en brosse et intervenant dans le processus d’endocytose, est réalisé sur<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> cryosections <strong>de</strong> tissu rénal <strong>de</strong> 8 µm. Après incubation <strong><strong>de</strong>s</strong> coupes dans le<br />
tampon TBS, l’activité peroxidase endogène est inhibée en incubant les coupes <strong>de</strong><br />
rein dans une solution <strong>de</strong> méthanol contenant 0,3% <strong>de</strong> H2O2 pendant 30 min. Entre<br />
chaque traitement, les coupes sont rincées avec le tampon TBS. Pour bloquer les<br />
sites aspécifiques, les coupes <strong>de</strong> tissu sont incubées pendant 20 min avec du sérum<br />
normal <strong>de</strong> cheval ou <strong>de</strong> chèvre (Vectastain Elite®ABC kit Mouse or Rabbit IgG,<br />
Vector Laboratories, Labconsult, Bruxelles, Belgique), respectivement pour la<br />
mégaline ou la cubiline ; puis, avec une solution d’avidine D pendant 15 min suivie<br />
d’une solution <strong>de</strong> biotine pendant 15 min. Les coupes <strong>de</strong> tissu sont ensuite incubées<br />
pendant toute la nuit à température ambiante avec l’anticorps primaire monoclonal<br />
<strong>de</strong> souris anti-mégaline ou polyclonal <strong>de</strong> lapin anti-cubiline, dilué respectivement<br />
1/1000 ou 1/2000 en sérum normal correspondant. Les <strong>de</strong>ux anticorps ont été<br />
obtenus auprès du Dr V. Marshansky (Program in Membrane Biology and Renal<br />
Unit, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston, USA). Les<br />
coupes sont ensuite traitées pendant 30 min avec l’anticorps secondaire biotinylé <strong>de</strong><br />
cheval anti-IgG <strong>de</strong> souris ou <strong>de</strong> chèvre anti-IgG <strong>de</strong> lapin. Après 30 min d’incubation<br />
avec le complexe avidine et peroxidase « horseradish » biotinylé, le marquage est<br />
révélé par 2 min d’incubation avec la solution <strong>de</strong> DAB. Finalement, les coupes sont<br />
contre-colorées à l’hématoxyline <strong>de</strong> Mayer, déshydratées et montées à l’ai<strong>de</strong> <strong>de</strong> la<br />
solution <strong>de</strong> montage DPX.<br />
87
2.15. Microscopie électronique (étu<strong>de</strong> préliminaire)<br />
Pour la microscopie électronique, les échantillons <strong>de</strong> cortex rénal (maximum 1<br />
mm 3 ) sont prélevés et immédiatement fixés pendant 90 min à température ambiante<br />
avec une solution glutaraldéhy<strong>de</strong> 4% en tampon Millonig 0,1M, pH 7,4. Après lavage<br />
avec du tampon Millonig contenant 0,5% <strong>de</strong> glucose, les échantillons sont post-fixés<br />
avec du tétroxi<strong>de</strong> d’osmium 2% pendant 30 min, déshydratés par passages<br />
successifs dans <strong>de</strong> l’éthanol 25, 50, 70, 90, 100% et enrobés dans <strong>de</strong> la résine<br />
LX112. Les coupes semi-fines et ultra-fines sont réalisées à l’ai<strong>de</strong> <strong>de</strong><br />
l’ultramicrotome LKB (LKB Instruments, Rockville, Md., USA). Les coupes semi-fines<br />
sont colorées au bleu <strong>de</strong> toluidine et observées au microscope afin <strong>de</strong> vérifier la<br />
qualité du tissu et <strong>de</strong> définir la zone d’intérêt. Les coupes ultra-fines sont colorées<br />
avec <strong>de</strong> l’acétate d’uranyle et du citrate <strong>de</strong> plomb et examinées au microscope<br />
électronique EM 109 Zeiss (Zeiss, Allemagne).<br />
2.16. Détection <strong><strong>de</strong>s</strong> adduits d’ADN spécifiques aux aci<strong><strong>de</strong>s</strong><br />
<strong>aristolochiques</strong> dans le cortex rénal <strong>de</strong> rat<br />
La détection <strong><strong>de</strong>s</strong> adduits d’ADN spécifiques aux AA dans le tissu rénal a été<br />
réalisée par le Dr. V.M. Arlt du Laboratoire <strong>de</strong> Carcinogénèse Moléculaire du Prof.<br />
D.H. Phillips (Institute of Cancer Research, Sutton, Surrey, Royaume-Uni). La<br />
métho<strong>de</strong> pour détecter les adduits d’ADN spécifiques aux AA est i<strong>de</strong>ntique à celle<br />
utilisée pour les cellules OK (voir le chapitre méthodologie § 1.8, pages 73-74).<br />
Brièvement, l’ADN <strong><strong>de</strong>s</strong> échantillons <strong>de</strong> tissu <strong>de</strong> cortex rénal est isolé par une<br />
métho<strong>de</strong> standard d’extraction au phénol. La préparation enzymatique <strong><strong>de</strong>s</strong> adduits<br />
d’ADN est réalisée comme détaillé précé<strong>de</strong>mment [Arlt V.M. et al., 2001]. Les<br />
conditions <strong>de</strong> chromatographie utilisées sont : les solvants D1, D3 et D4 (détails voir<br />
le chapitre méthodologie § 1.8, pages 73-74). Les résultats sont exprimés en adduits<br />
d’ADN par 10 8 nucléoti<strong><strong>de</strong>s</strong>.<br />
88
2.17. Analyses statistiques<br />
Tous les résultats représentent la moyenne ± l’erreur standard à la moyenne<br />
(SEM). A chaque temps, les comparaisons entre les rats contrôles et les rats<br />
exposés aux AA sont réalisées par le test non paramétrique <strong>de</strong> Mann-Whitney. Les<br />
corrélations entre les paramètres structurels et fonctionnels d’atteinte tubulaire sont<br />
évaluées par le test non paramétrique <strong>de</strong> Spearman. Les valeurs sont considérées<br />
comme statistiquement significatives à partir <strong>de</strong> P < 0,05.<br />
89
CHAPITRE 4 : RESULTATS<br />
1. Etu<strong>de</strong> in vitro : effets <strong><strong>de</strong>s</strong> aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong><br />
sur la lignée cellulaire <strong>de</strong> rein d’opossum<br />
Les cellules <strong>de</strong> rein d’opossum (« opossum kidney », OK) constituent un<br />
modèle bien établi pour étudier les différents processus <strong>de</strong> transport ayant lieu dans<br />
le tubule proximal. En effet, ces cellules OK possè<strong>de</strong>nt <strong>de</strong> nombreuses propriétés<br />
morphologiques et fonctionnelles communes avec l’épithélium tubulaire proximal. En<br />
particulier, elles ont la capacité <strong>de</strong> réabsorber <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines par endocytose médiée<br />
par récepteur ; ce processus nécessite les récepteurs mégaline et cubiline exprimés<br />
à la surface <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules OK [Schwegler J.S. et al., 1991; Zhai X.Y. et al., 2000]<br />
1.1. Endocytose <strong>de</strong> protéines médiée par récepteur<br />
1.1.1. Albumine<br />
L’albumine est une protéine totalement réabsorbée par le tubule proximal. Afin<br />
<strong>de</strong> suivre sa réabsorption par les cellules OK, <strong>de</strong> l’albumine marquée à la<br />
fluorescéine isothiocyanate (FITC) est utilisée. Les cellules OK sont incubées<br />
pendant 15 min avec <strong><strong>de</strong>s</strong> concentrations différentes d’albumine-FITC : 0,080 ;<br />
0,150 ; 0,380 ; 0,760 ; 1,50 et 3,80 µmol/l ; à 37°C, elles réabsorbent l’albumine-FITC<br />
selon la cinétique <strong>de</strong> Michaelis-Menten caractéristique <strong>de</strong> l’endocytose médiée par<br />
récepteur, comme décrit précé<strong>de</strong>mment [Schwegler J.S. et al., 1991]. La faible<br />
quantité d’albumine-FITC mesurée à 4°C reflète probablement l’albumine qui adhère<br />
aux cellules malgré les lavages (Fig. 1.1A).<br />
90
Réabsorption d’albumine-FITC<br />
d’albumine-FITC<br />
A<br />
(pmol/mg protéine)<br />
30<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
37°C<br />
4°C<br />
0<br />
0 1 2 3 4 5<br />
[Albumine-FITC] (µmol/l)<br />
Réabsorption <strong>de</strong> β β2-microglobuline-Cy5 2-microglobuline-Cy5<br />
Figure 1.1. Réabsorption d’albumine-FITC (A) et β2-microglobuline-Cy5 (B) par les cellules<br />
OK. Les cellules sont incubées pendant 15 min avec <strong><strong>de</strong>s</strong> concentrations croissantes du<br />
substrat à respectivement 37°C (triangle, n = 3) ou 4°C (cercle, n = 3).<br />
Réabsorption d’albumine-FITC<br />
(% du contrôle)<br />
120<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
Contrôle<br />
*<br />
Cytochrome C<br />
Lysozyme Lysozyme<br />
*<br />
Aprotinine Aprotinine<br />
*<br />
Hémoglobine<br />
Hémoglobine<br />
Figure 1.2. Réabsorption d’albumine-FITC par les cellules OK en compétition avec<br />
différentes protéines. Les cellules sont incubées pendant 15 min avec albumine-FITC (0,8<br />
µmol/l) et différentes protéines (1mg/ml). Chaque colonne représente la différence entre les<br />
valeurs obtenues à 37°C et 4°C (n = 3). La signification statistique correspond à * P < 0,01<br />
par comparaison aux valeurs contrôles.<br />
(pmol/mg protéine)<br />
Myoglobine<br />
Myoglobine<br />
B<br />
*<br />
30<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0<br />
0 1 2 3 4 5<br />
*<br />
ββ 2 2-microglobuline -microglobuline<br />
*<br />
α 2 2-macroglobuline -macroglobuline<br />
[β 2 -microglobuline-Cy5] (µmol/l)<br />
*<br />
Lactoferrine<br />
Lactoferrine<br />
*<br />
Transferrine<br />
Transferrine<br />
*<br />
*<br />
α 1 ac glycoprotéine<br />
glycoprotéine<br />
Thyroglobuline<br />
Thyroglobuline<br />
91
1.1.2. Autres protéines<br />
En vue <strong>de</strong> vérifier la spécificité <strong>de</strong> la réabsorption d’albumine, une compétition<br />
avec plusieurs autres protéines <strong>de</strong> nature différente est réalisée. La figure 1.2 montre<br />
que la réabsorption d’albumine-FITC est significativement inhibée lorsque les cellules<br />
sont incubées en présence du cytochrome C, d’aprotinine, d’hémoglobine, <strong>de</strong><br />
myoglobine, <strong>de</strong> β2-microglobuline, d’α2-macroglobuline, <strong>de</strong> lactoferrine, <strong>de</strong><br />
transferrine, d’α1-glycoprotéine aci<strong>de</strong> et <strong>de</strong> thyroglobuline ; seul le lysozyme ne<br />
modifie pas la réabsorption d’albumine. Ces résultats indiquent que toute une série<br />
d’autres protéines entrent en compétition avec l’endocytose d’albumine pour le<br />
même site <strong>de</strong> réabsorption.<br />
1.1.3. β2-microglobuline<br />
Parmi les protéines testées, la β2-microglobuline, une protéine <strong>de</strong> faible poids<br />
moléculaire, est choisie pour confirmer la cinétique <strong>de</strong> réabsorption. La β2-<br />
microglobuline est couplée à un marqueur cyanine Cy5 (voir chapitre méthodologie §<br />
1.3, page 69). Les cellules OK sont incubées pendant 15 min en présence <strong>de</strong><br />
différentes concentrations <strong>de</strong> β2-microglobuline-Cy5 : 0,085 ; 0,210 ; 0,425 ; 0,850 ;<br />
2,10 et 4,25 µmol/l. Comme pour l’albumine-FITC, la β2-microglobuline-Cy5 est<br />
réabsorbée suivant la cinétique <strong>de</strong> Michaelis-Menten à 37°C reflétant l’endocytose<br />
médiée par récepteur (Fig. 1.1B).<br />
1.1.4. Compétition entre albumine et β2-microglobuline<br />
Afin <strong>de</strong> vérifier si l’albumine et la β2-microglobuline se fixent sur le même<br />
récepteur, la compétition entre ces <strong>de</strong>ux protéines est étudiée. Lorsque les<br />
monocouches <strong>de</strong> cellules OK sont incubées pendant 15 min avec 0,8 µmol/l<br />
d’albumine-FITC en présence d’un excès <strong>de</strong> 100 × <strong>de</strong> β2-microglobuline, la<br />
réabsorption d’albumine-FITC est significativement inhibée d’environ 60 % (Fig.<br />
92
1.3A). De même, lorsque les cellules OK sont incubées pendant 15 min avec 0,8<br />
µmol/l <strong>de</strong> β2-microglobuline-Cy5 en présence d’un excès <strong>de</strong> 100 × d’albumine, la<br />
réabsorption <strong>de</strong> β2-microglobuline-Cy5 est également réduite d’environ 60 % (Fig.<br />
1.3B). Ces observations suggèrent que ces <strong>de</strong>ux protéines sont en compétition pour<br />
le même récepteur membranaire dans les cellules OK.<br />
Réabsorption d’albumine-FITC<br />
A B<br />
(pmol/mg protéine)<br />
12<br />
10<br />
8<br />
6<br />
4<br />
2<br />
0<br />
Contrôle Contrôle Contrôle ββ β22 2-microglobuline -microglobuline<br />
-microglobuline<br />
Figure 1.3. Compétition entre l’albumine et la β2-microglobuline pour l’endocytose médiée<br />
par récepteur dans les cellules OK. A : Inhibition <strong>de</strong> la réabsorption d’albumine-FITC (0,8<br />
µmol/l) par un excès <strong>de</strong> 100 × <strong>de</strong> β2-microglobuline. B : Inhibition <strong>de</strong> la réabsorption <strong>de</strong> β2microglobuline-Cy5<br />
(0,8 µmol/l) par un excès <strong>de</strong> 100 × d’albumine. Chaque colonne<br />
représente la différence entre les valeurs obtenues à 37°C et 4°C (n = 3). La signification<br />
statistique correspond à * P < 0,05 par comparaison aux valeurs contrôles.<br />
1.2. Inhibition <strong>de</strong> la réabsorption d’albumine et <strong>de</strong> β2-<br />
microglobuline<br />
Selon les données présentées ci-<strong><strong>de</strong>s</strong>sus, la fonction tubulaire proximale <strong>de</strong><br />
réabsorption <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines peut être étudiée en observant les modifications du<br />
processus d’endocytose d’albumine et <strong>de</strong> β2-microglobuline par les cellules OK. La<br />
néphrotoxicité potentielle <strong><strong>de</strong>s</strong> aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong> (AA) est examinée dans ce<br />
modèle cellulaire et comparée au chlorure <strong>de</strong> cadmium (CdCl2), une néphrotoxine<br />
bien connue pour altérer cette fonction tubulaire proximale.<br />
*<br />
Réabsorption <strong>de</strong> β 2 -microglobuline-Cy5<br />
(pmol/mg protéine)<br />
12<br />
10<br />
8<br />
6<br />
4<br />
2<br />
0<br />
*<br />
Contrôle Contrôle Contrôle Albumine Albumine Albumine<br />
93
1.2.1. Effets <strong><strong>de</strong>s</strong> aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong><br />
Les monocouches <strong>de</strong> cellules OK sont exposées pendant 24 h au DMSO<br />
0,1% (contrôle), aux AA 10 ou 20 µmol/l, ou aux AA 20 µmol/l suivi <strong>de</strong> 24 h <strong>de</strong><br />
récupération dans le milieu <strong>de</strong> culture. La réabsorption d’albumine-FITC est ensuite<br />
évaluée en fonction <strong>de</strong> différentes concentrations du substrat. Comme le montre la<br />
figure 1.4A, l’endocytose d’albumine par les cellules OK est nettement réduite après<br />
24 h <strong>de</strong> traitement par 10 ou 20 µmol/l d’AA. De plus, après 24 h d’exposition aux AA<br />
20 µmol/l suivie <strong>de</strong> 24 h <strong>de</strong> récupération dans le milieu <strong>de</strong> culture, la réabsorption<br />
d’albumine reste inhibée.<br />
De même, la réabsorption <strong>de</strong> β2-microglobuline est fortement diminuée après 24 h<br />
d’incubation avec les AA 10 ou 20 µmol/l et cette inhibition persiste lorsque les<br />
cellules OK sont exposées pendant 24 h aux AA 20 µmol/l suivis <strong>de</strong> 24 h <strong>de</strong><br />
récupération dans le milieu <strong>de</strong> culture (Fig. 1.4B).<br />
L’analyse <strong><strong>de</strong>s</strong> paramètres cinétiques <strong>de</strong> Michaelis-Menten <strong><strong>de</strong>s</strong> courbes <strong>de</strong><br />
réabsorption montre une diminution significative <strong><strong>de</strong>s</strong> valeurs <strong>de</strong> la vitesse maximale<br />
Vmax ; cette réduction dépend <strong>de</strong> la dose <strong>de</strong> AA utilisée (Tableau 1.1). La valeur <strong>de</strong><br />
l’affinité apparente Km est inchangée par le traitement aux AA à la concentration <strong>de</strong><br />
10 µmol/l, mais elle est augmentée lorsque la concentration <strong><strong>de</strong>s</strong> AA atteint 20 µmol/l.<br />
Réabsorption d’albumine-FITC<br />
A<br />
(pmol/mg protéine)<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
Contrôle (DMSO 0,1%)<br />
AA 10 µmol/l<br />
AA 20 µmol/l<br />
AA 20 µmol/l (récupération)<br />
0<br />
0<br />
0 1 2 3 4 5<br />
0 1 2 3 4 5<br />
[Albumine-FITC] (µmol/l)<br />
[β 2 -microglobuline-Cy5] (µmol/l)<br />
Figure 1.4. Effets <strong><strong>de</strong>s</strong> aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong> (AA) sur la réabsorption d’albumine-FITC (A) et<br />
<strong>de</strong> la β2-microglobuline-Cy5 (B) par les cellules OK. Les cellules sont exposées pendant 24 h<br />
au DMSO 0,1% (contrôle), aux AA 10 µmol/l ou aux AA 20 µmol/l d’AA suivi ou non d’une<br />
récupération en milieu <strong>de</strong> culture pendant 24 h. Chaque point correspond à la différence<br />
entre les valeurs observées à 37°C et 4°C (n = 3).<br />
Réabsorption <strong>de</strong> ββ 2-microglobuline-Cy5<br />
2-microglobuline-Cy5<br />
2-microglobuline-Cy5<br />
(pmol/mg protéine) protéine) protéine)<br />
B<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
94
Tableau 1.1. Paramètres cinétiques <strong>de</strong> Michaelis-Menten <strong>de</strong> l’endocytose<br />
d’albumine-FITC et β2-microglobuline-Cy5 par les cellules OK<br />
Albumine-FITC β2-microglobuline-Cy5<br />
pmol/l pmol/mg protéine pmol/l pmol/mg protéine<br />
Km Vmax Km Vmax<br />
Contrôle 477 ± 88 15,2 ± 2,1 844 ± 129 19,8 ± 3,3<br />
CdCl2 15 µmol/l - 24h 376 ± 38 11,9 ± 1,5 * 878 ± 194 9,1 ± 1,5 *<br />
DMSO 0,1% - 24h 360 ± 12 14,1 ± 2,8 533 ± 76 21,6 ± 4,5<br />
AA 10 µmol/l - 24h 394 ± 40 11,7 ± 2,7 * 394 ± 98 8,2 ± 3,1 *<br />
AA 20 µmol/l - 24h 456 ± 30 * 7,2 ± 2,3 * 431 ± 51 5,8 ± 1,4 *<br />
AA 20 µmol/l – récupération n.d. § 1,6 ± 1,1 * n.d. § 2,9 ± 1,6 *<br />
Les valeurs <strong>de</strong> l’affinité apparente (Km) et <strong>de</strong> la vitesse maximale (Vmax) sont calculées par<br />
l’équation linéarisée d’Eadie-Hofstee (n = 3). La signification statistique correspond à * P <<br />
0,05 par comparaison aux valeurs <strong><strong>de</strong>s</strong> contrôles pairés.<br />
§ n.d. non détectable, ces valeurs n’ont pas pu être déterminées en raison <strong><strong>de</strong>s</strong> faibles<br />
valeurs du plateau (Vmax).<br />
Pour déterminer l’évolution au cours du temps <strong>de</strong> l’inhibition <strong>de</strong> la réabsorption<br />
d’albumine suite à l’exposition <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules OK aux AA, <strong><strong>de</strong>s</strong> monocouches <strong>de</strong> cellules<br />
sont traitées avec les AA 20 µmol/l pendant différents temps à savoir 15 min, 2, 6,<br />
14, 18 et 24 heures. La réabsorption d’albumine, mesurée après 15 min d’incubation<br />
avec 0.8 µmol/l d’albumine-FITC, est progressivement inhibée. La signification<br />
statistique est atteinte et maintenue à partir <strong>de</strong> 14 h d’exposition aux AA (Fig.1.5).<br />
160<br />
140<br />
120<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
* *<br />
*<br />
0<br />
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24<br />
Temps d’exposition aux AA (heures)<br />
Figure 1.5. Evolution au cours du temps <strong>de</strong> l’inhibition par les AA <strong>de</strong> la réabsorption<br />
d’albumine-FITC dans les cellules OK. Les cellules sont exposées au DMSO 0,1% (contrôle)<br />
ou aux AA 20 µmol/l pendant 15 min, 2, 6, 14, 18 et 24 h. Chaque point représente la<br />
différence entre les valeurs observées à 37°C et 4°C (n = 3). La signification statistique<br />
correspond à * P < 0,05 par comparaison aux valeurs contrôles.<br />
Réabsorption d’albumine-FITC<br />
(% du contrôle)<br />
95
Les AA utilisés dans les expériences précé<strong>de</strong>ntes sont composés d’un<br />
mélange <strong>de</strong> <strong>de</strong>ux dérivés nitrophénantrènes AAI et AAII. Afin <strong>de</strong> déterminer si la<br />
nature <strong><strong>de</strong>s</strong> AA influence l’effet inhibiteur, les cellules OK sont exposées à l’extrait <strong>de</strong><br />
plante Aristolochia sp. ainsi qu’à l’AAI et l’AAII isolés <strong>de</strong> l’extrait <strong>de</strong> plante. La<br />
réabsorption d’albumine-FITC est significativement réduite dans les mêmes<br />
proportions lorsque les cellules OK exposées à l’AAI, l’extrait d’Aristolochia sp. et au<br />
mélange <strong>de</strong> AA commercialisé par Sigma (20 µmol/l, Fig. 1.6). Par contre,<br />
l’endocytose d’albumine est comparable à celle du contrôle pour les cellules<br />
exposées à l’AAII.<br />
Dans la suite <strong>de</strong> ce travail, toutes les étu<strong><strong>de</strong>s</strong> présentées sont réalisées en présence<br />
du mélange d’AA commercialisé par Sigma.<br />
Réabsorption d’albumine-FITC<br />
(pmol/mg protéine)<br />
Figure 1.6. Effet <strong>de</strong> la nature <strong><strong>de</strong>s</strong> aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong> (AA) sur la réabsorption d’albumine-<br />
FITC par les cellules OK. Les cellules sont exposées à 0,1% DMSO (contrôle) ou à 20 µmol/l<br />
d’AAI, d’AAII, d’extrait d’Aristolochia sp. ou d’AA (Sigma) pendant 24 h. Chaque point<br />
correspond à la différence entre les valeurs observées à 37°C et 4°C (n = 3). La signification<br />
statistique correspond à * P < 0,05 par comparaison aux valeurs contrôles.<br />
En résumé, l’exposition <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules OK aux AA (principalement l’AAI) inhibe<br />
l’endocytose d’albumine et <strong>de</strong> la β2-microglobuline <strong>de</strong> façon dose-dépendante et <strong>de</strong><br />
manière irréversible.<br />
10<br />
8<br />
6<br />
4<br />
2<br />
0<br />
*<br />
*<br />
DMSO AAI AAII AA<br />
Aristolochia sp.<br />
*<br />
AA<br />
96
Réabsorption d’albumine-FITC<br />
1.2.2. Effets du cadmium<br />
A titre <strong>de</strong> comparaison, <strong><strong>de</strong>s</strong> expériences similaires sont réalisées en parallèle<br />
avec du CdCl2. La réabsorption d’albumine et <strong>de</strong> β2-microglobuline est également<br />
nettement réduite après exposition <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules OK pendant 24 h au CdCl2 15 µmol/l<br />
(Fig. 1.7). L’intensité <strong>de</strong> l’inhibition est comparable à celle observée pour les AA.<br />
L’analyse <strong><strong>de</strong>s</strong> paramètres cinétiques montre également une diminution<br />
significative <strong><strong>de</strong>s</strong> valeurs <strong>de</strong> Vmax sans modification <strong><strong>de</strong>s</strong> valeurs du Km (Tableau 1.1)<br />
comme décrit pour les AA.<br />
A<br />
(pmol/mg protéine)<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
Contrôle<br />
CdCl 2 15 µmol/l<br />
0<br />
0 1 2 3 4 5<br />
[Albumine-FITC] (µmol/l)<br />
Figure 1.7. Effet du chlorure <strong>de</strong> cadmium (CdCl2) sur la réabsorption d’albumine-FITC (A) et<br />
<strong>de</strong> la β2-microglobuline-Cy5 (B) par les cellules OK. Les cellules sont exposées avec 15<br />
µmol/l <strong>de</strong> CdCl2 (cercle) ou sans (triangle) pendant 24 h. Chaque point correspond à la<br />
différence entre les valeurs observées à 37°C et 4°C (n = 3).<br />
Contrairement aux AA, l’effet inhibiteur induit par le CdCl2 est déjà présent<br />
après 15 min d’exposition, <strong>de</strong>vient significatif après 2 heures et n’est pas modifié au<br />
cours <strong>de</strong> la pério<strong>de</strong> d’exposition au CdCl2 (Fig. 1.8).<br />
Réabsorption <strong>de</strong> β β2-microglobuline-Cy5 2-microglobuline-Cy5<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
B<br />
(pmol/mg protéine)<br />
0<br />
0 1 2 3 4 5<br />
[β 2 -microglobuline-Cy5] (µmol/l)<br />
97
Réabsorption d’albumine-FITC<br />
(% du contrôle)<br />
Figure 1.8. Evolution au cours du temps <strong>de</strong> l’inhibition par le CdCl2 <strong>de</strong> la réabsorption<br />
d’albumine-FITC par les cellules OK. Les cellules sont exposées à 15 µmol/l <strong>de</strong> CdCl2<br />
pendant 15 min, 2, 6, 14, 18 et 24 h. Chaque point représente la différence entre les valeurs<br />
observées à 37°C et 4°C (n = 3). La signification statistique correspond à * P < 0,05 par<br />
comparaison aux valeurs contrôles.<br />
1.2.3. Observation <strong>de</strong> l’inhibition en microscopie confocale<br />
L’observation en microscopie confocale montre que les cellules OK contrôles<br />
et celles exposées au DMSO 0,1% présentent, après 15 min d’incubation avec<br />
l’albumine-FITC 150 µmol/l, <strong><strong>de</strong>s</strong> granules fluorescents verts à l’intérieur <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules<br />
(Fig. 1.9). Par contre, les cellules exposées aux AA 20 µmol/l ou au CdCl2 15 µmol/l<br />
ne présentent quasi aucune fluorescence, signe qu’elles n’ont quasi pas réabsorbé<br />
d’albumine-FITC.<br />
Contrôle<br />
DMSO<br />
160<br />
140<br />
120<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
*<br />
* * * *<br />
0<br />
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24<br />
Temps d’exposition au CdCl 2 (heures)<br />
CdCl 2<br />
Figure 1.9. Observation en microscopie confocale <strong>de</strong> la réabsorption d’albumine-FITC (150<br />
µmol/l, 15 min d’exposition) par les monocouches <strong>de</strong> cellules OK. Les cellules OK sont<br />
incubées pendant 24 h soit avec le milieu <strong>de</strong> culture ou du DMSO 0,1% (contrôles), soit avec<br />
du CdCl2 15 µmol/l ou <strong><strong>de</strong>s</strong> AA 20 µmol/l. Grossissement 350 ×.<br />
AA<br />
98
1.2.4. Réversibilité <strong>de</strong> l’inhibition<br />
Etant donné l’effet inhibiteur persistant <strong><strong>de</strong>s</strong> AA sur l’endocytose <strong>de</strong> protéines<br />
après 24 h <strong>de</strong> récupération (Fig. 1.4), la pério<strong>de</strong> <strong>de</strong> récupération dans le milieu <strong>de</strong><br />
culture est prolongée jusqu’à 6 jours. Lorsque les cellules OK sont incubées en<br />
présence <strong><strong>de</strong>s</strong> AA 20 µmol/l pendant 24 h et que l’incubation est suivie d’une pério<strong>de</strong><br />
<strong>de</strong> récupération <strong>de</strong> 1, 2, 3 ou 6 jours, l’inhibition <strong>de</strong> la réabsorption d’albumine<br />
s’intensifie progressivement et persiste jusqu’au 6 ème jour (Fig. 1.10). Par contre, en<br />
cas d’exposition au CdCl2 15 µmol/l, la réabsorption d’albumine est inhibée après 24<br />
h mais retourne progressivement vers <strong><strong>de</strong>s</strong> valeurs normales pendant la pério<strong>de</strong> <strong>de</strong><br />
récupération (Fig. 1.10).<br />
Réabsorption d’albumine-FITC<br />
(% du contrôle)<br />
120<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
* *<br />
Contrôle 0 1 2 3 6<br />
Temps <strong>de</strong> récupération après 24 h d’exposition (jours)<br />
Figure 1.10. Etu<strong>de</strong> comparative <strong>de</strong> la réversibilité <strong>de</strong> l’inhibition <strong>de</strong> la réabsorption<br />
d’albumine-FITC par les AA (colonne noire) et le CdCl2 (colonne grise). Les monocouches <strong>de</strong><br />
cellules OK sont incubées avec du DMSO 0,1%, <strong><strong>de</strong>s</strong> AA 20 µmol/l ou du CdCl2 15 µmol/l<br />
pendant 24 h suivi <strong>de</strong> 0, 1, 2, 3 et 6 jours <strong>de</strong> récupération dans le milieu <strong>de</strong> culture. La<br />
réabsorption d’albumine-FITC (0,8 µmol/l) est réalisée pendant 15 min après chaque temps<br />
<strong>de</strong> récupération. Chaque point représente la différence entre les valeurs observées à 37°C et<br />
4°C (n = 3). Les significations statistiques correspon<strong>de</strong>nt à * P < 0,05 par comparaison aux<br />
valeurs <strong><strong>de</strong>s</strong> contrôles; § P < 0,05 par comparaison aux valeurs <strong><strong>de</strong>s</strong> contrôles et du jour 0; #<br />
P < 0,05 par comparaison aux valeurs <strong><strong>de</strong>s</strong> contrôles et <strong><strong>de</strong>s</strong> jours 0 et 1; £ P < 0,05 par<br />
comparaison aux valeurs <strong><strong>de</strong>s</strong> contrôles et du jour 1.<br />
En résumé, l’exposition <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules OK au CdCl2 inhibe l’endocytose <strong>de</strong><br />
l’albumine et <strong>de</strong> la β2-microglobuline mais <strong>de</strong> manière réversible.<br />
§<br />
*<br />
AA<br />
CdCl 2<br />
#<br />
*<br />
§<br />
£<br />
§<br />
#<br />
99
1.3. Viabilité et fonctionnalité <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules OK<br />
L’observation <strong>de</strong> la morphologie <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules OK colorées à l’hématoxylineéosine<br />
montre qu’aucune modification morphologique n’est visible au niveau <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
cellules exposées aux AA 20 µmol/l ou au CdCl2 15 µmol/l, excepté la présence <strong>de</strong><br />
noyaux <strong>de</strong> tailles significatives au niveau <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules traitées aux AA (Fig. 1.11). Ce<br />
résultat suggère que l’inhibition <strong>de</strong> la réabsorption <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines par les cellules OK<br />
exposées à ces agents toxiques n’est pas liée à une réduction du nombre <strong>de</strong><br />
cellules.<br />
Contrôle<br />
DMSO<br />
CdCl 2<br />
Figure 1.11. Observation morphologique <strong><strong>de</strong>s</strong> monocouches <strong>de</strong> cellules OK colorées en<br />
hématoxyline-éosine après 24 h d’exposition au CdCl2 15 µmol/l ou aux AA 20 µmol/l. Les<br />
monocouches <strong>de</strong> cellules OK contrôles sont incubées avec du milieu <strong>de</strong> culture seul ou du<br />
DMSO 0,1%. Grossissement 300 ×.<br />
1.3.1. Test <strong>de</strong> cytotoxicité et <strong>de</strong> viabilité cellulaire<br />
Pour renforcer ces observations morphologiques, d’autres tests <strong>de</strong> cytotoxicité<br />
et <strong>de</strong> viabilité cellulaire sont réalisés afin d’éliminer l’hypothèse selon laquelle les<br />
effets d’inhibition <strong>de</strong> la réabsorption <strong>de</strong> protéines résulteraient <strong>de</strong> la diminution du<br />
nombre <strong>de</strong> cellules vivantes consécutive à l’exposition aux AA et CdCl2.<br />
L’intégrité <strong><strong>de</strong>s</strong> membranes cellulaires est évaluée par la mesure <strong>de</strong> LDH<br />
libérée dans le milieu extracellulaire en cas <strong>de</strong> rupture <strong>de</strong> la membrane. Au niveau<br />
AA<br />
100
<strong><strong>de</strong>s</strong> cellules traitées pendant 24 h au DMSO 0,1%, aux AA 10 ou 20 µmol/l et au<br />
CdCl2 15 µmol/l, la quantité <strong>de</strong> LDH libérée est comparable à celle <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules<br />
contrôles (Fig. 1.12). Ce taux <strong>de</strong> LDH libérée est significativement réduit par rapport<br />
à la quantité maximale <strong>de</strong> LDH libérée par les cellules en présence <strong>de</strong> Triton-X100.<br />
Ces observations permettent <strong>de</strong> conclure qu’aucun effet toxique n’est observé au<br />
niveau <strong>de</strong> la membrane plasmique lorsque les cellules OK sont exposées aux AA ou<br />
au CdCl2.<br />
LDH libérée<br />
(Absorbance [A [A490nm 490nm –A –A655nm]) 655nm])<br />
Figure 1.12. Mesure <strong>de</strong> la lactate déshydrogénase (LDH) libérée par les cellules OK. Les<br />
cellules sont exposées au DMSO 0,1%, aux AA 10 ou 20 µmol/l ou au CdCl2 15 µmol/l<br />
pendant 24 h. Le maximum <strong>de</strong> LDH libérée est obtenu en incubant les cellules avec du<br />
Triton-X100 (TX100, 1 %) (n = 3). La signification statistique correspond à * P < 0,05 par<br />
comparaison aux valeurs obtenues dans les conditions <strong>de</strong> contrôle positif (TritonX-100).<br />
100<br />
90<br />
80<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0<br />
AA<br />
10 µM<br />
AA<br />
20 µM<br />
CdCl 2<br />
15 µM<br />
Figure 1.13. Effets <strong><strong>de</strong>s</strong> AA et du CdCl2 sur la viabilité <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules OK par dosage MTT. Les<br />
cellules sont exposées aux AA 10 ou 20 µmol/l ou au CdCl2 15 µmol/l pendant 24 h (n = 3).<br />
Viabilité cellulaire<br />
(% du contrôle)<br />
10<br />
9<br />
8<br />
7<br />
6<br />
5<br />
4<br />
3<br />
2<br />
1<br />
0<br />
* * * * *<br />
TX100 cellules DMSO AA<br />
1%<br />
0.1% 10µM<br />
AA<br />
20µM<br />
CdCl 2<br />
15µM<br />
Du point <strong>de</strong> vue <strong>de</strong> la viabilité cellulaire, le dosage MTT [3-(4,5-diméthylthiazoyl-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium<br />
bromi<strong>de</strong>] est réalisé après avoir exposé les<br />
cellules OK aux AA 10 ou 20 µmol/l et au CdCl2 15 µmol/l pendant 24 h. Ce dosage<br />
évalue la quantité <strong>de</strong> MTT réduit par la déshydrogénase mitochondriale <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules<br />
vivantes. Les résultats montrent une légère diminution non significative <strong>de</strong> la viabilité<br />
101
cellulaire par rapport au contrôle, indiquant donc que les cellules OK traitées par les<br />
AA ou le CdCl2 sont bien vivantes (Fig. 1.13).<br />
1.3.2. Synthèse <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines<br />
Pour estimer l’effet <strong><strong>de</strong>s</strong> AA ou du CdCl2 sur la synthèse <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines, la<br />
mesure <strong>de</strong> l’incorporation <strong>de</strong> [ 35 S]L-méthionine est réalisée après différents<br />
traitements <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules OK. Lorsque les cellules sont exposées aux AA ou CdCl2,<br />
aucune différence significative n’est observée après 1 ou 20 h d’incubation en<br />
présence d’un excès <strong>de</strong> méthionine non marquée, permettant ainsi d’évaluer<br />
respectivement les protéines <strong>de</strong> courte ou longue durée <strong>de</strong> vie (Fig. 1.14). Par<br />
contre, lorsque les monocouches <strong>de</strong> cellules sont incubées en présence <strong>de</strong><br />
cycloheximi<strong>de</strong> (100 µmol/l), un inhibiteur spécifique <strong>de</strong> la synthèse protéique, la<br />
quantité <strong>de</strong> protéine synthétisées est significativement inhibée après 1h et 20 en<br />
présence <strong>de</strong> méthionine non marquée. Ces résultats indiquent que les traitements<br />
par les AA ou le CdCl2 n’interfèrent pas <strong>de</strong> façon majeure avec la synthèse <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
protéines.<br />
Taux <strong>de</strong> protéines synthétisées<br />
(106 Taux <strong>de</strong> protéines synthétisées<br />
(10 CPM/mg protéine)<br />
6 CPM/mg protéine)<br />
30<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0<br />
* *<br />
1 h 20 h<br />
Contrôle<br />
AA<br />
CdCl2 CdCl2<br />
Cycloheximi<strong>de</strong><br />
Figure 1.14. Effets <strong><strong>de</strong>s</strong> AA et du CdCl2 sur la synthèse <strong>de</strong> protéines dans les cellules OK.<br />
Les cellules sont exposées aux AA 20 µmol/l ou au CdCl2 15 µmol/l <strong>de</strong> pendant 24 h, ou au<br />
cycloheximi<strong>de</strong> 100 µmol/l pendant 1 h. Après 2 h d’exposition à la [ 35 S]L-méthionine, les<br />
monocouches <strong>de</strong> cellules sont incubées pendant 1 ou 20 h avec du milieu <strong>de</strong> culture<br />
contenant un excès <strong>de</strong> méthionine (n = 3). La signification statistique correspond à * P < 0,05<br />
par comparaison aux valeurs contrôles. CPM: Coups par minute.<br />
102
1.3.3. Réabsorption du glucose<br />
Pour vérifier l’effet <strong><strong>de</strong>s</strong> AA et du CdCl2 sur une autre fonction <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules OK,<br />
la réabsorption <strong>de</strong> glucose est mesurée à l’ai<strong>de</strong> d’un analogue du glucose, l’AMG<br />
(méthyl-α-D-glucopyranosi<strong>de</strong>), un substrat du co-transporteur Na + /glucose mais pas<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> co-transporteurs ubiquitaires <strong><strong>de</strong>s</strong> hexoses. La réabsorption d’AMG par les<br />
cellules OK exposées pendant 24 h aux AA 20 µmol/l ou au CdCl2 15 µmol/l est<br />
équivalente à celle <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules contrôles (Fig. 1.15). La détermination <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
paramètres <strong>de</strong> Michaelis-Menten montre également qu’il n’y a pas d’effet <strong>de</strong> ces<br />
substances sur les valeurs d’affinité apparente ni <strong>de</strong> la vitesse maximum (Tableau<br />
1.2). Ces données indiquent donc que la réabsorption d’AMG n’est pas<br />
fonctionnellement altérée suite aux traitements <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules et que le gradient du<br />
sodium intracellulaire vers le milieu extracellulaire est conservé (étant donné que<br />
l’AMG est co-transporté avec les ions Na + ).<br />
Réabsorption d’AMG<br />
(nmol/mg protéine)<br />
A<br />
30<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
Contrôle<br />
AA 20 µmol/l<br />
0<br />
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10<br />
[AMG] (mM)<br />
Figure 1.15. Effets <strong><strong>de</strong>s</strong> AA (A) et du CdCl2 (B) sur la réabsorption <strong>de</strong> méthyl-α-Dglucopyranosi<strong>de</strong><br />
(AMG) par les cellules OK. Les cellules sont exposées aux AA 20 µmol/l ou<br />
au CdCl2 15 µmol/l pendant 24 h. La réabsorption d’AMG est mesurée après 10 min<br />
d’incubation <strong><strong>de</strong>s</strong> monocouches <strong>de</strong> cellules avec [ 14 C]-AMG (n = 3).<br />
B<br />
Réabsorption d’AMG<br />
(nmol/mg protéine)<br />
30<br />
25<br />
Contrôle<br />
CdCl 2 15 µmol/l<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0<br />
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10<br />
[AMG] (mM)<br />
103
Tableau 1.2. Paramètres cinétiques <strong>de</strong> Michaelis-Menten <strong>de</strong> la réabsorption <strong>de</strong><br />
méthyl-α-D-glucopyranosi<strong>de</strong> (AMG) par les cellules OK<br />
AMG<br />
mmol/l pmol/mg protéine<br />
Km Vmax<br />
Contrôle 2852 ± 196 29935 ± 1997<br />
CdCl2 15 µmol/l - 24h 3455 ± 167 30000 ± 3050<br />
DMSO 0,1% - 24h 3066 ± 306 30596 ± 2242<br />
AA 20 µmol/l - 24h 3180 ± 267 26466 ± 2037<br />
Les valeurs <strong>de</strong> l’affinité apparente (Km) et <strong>de</strong> la vitesse maximale (Vmax) sont calculées par<br />
l’équation linéarisée d’Eadie-Hofstee (n = 3).<br />
1.4. Détection <strong><strong>de</strong>s</strong> adduits d’ADN spécifiques aux aci<strong><strong>de</strong>s</strong><br />
<strong>aristolochiques</strong><br />
La persistance <strong>de</strong> l’effet inhibiteur induit par les AA sur la réabsorption<br />
d’albumine et <strong>de</strong> β2-microglobuline ainsi que l’absence <strong>de</strong> modification significative<br />
<strong>de</strong> la synthèse <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines ou <strong>de</strong> signes <strong>de</strong> toxicité sont surprenantes. Par<br />
conséquent, l’altération <strong>de</strong> l’ADN suite à l’exposition <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules OK aux AA est<br />
étudiée en recherchant, par la métho<strong>de</strong> <strong>de</strong> post-marquage au 32 P, la formation<br />
adduits d’ADN spécifiques aux AA. Le profil chromatographique <strong><strong>de</strong>s</strong> adduits d’ADN<br />
spécifiques aux AA obtenus dans les cellules OK (Fig. 1.16) se compose :<br />
• <strong>de</strong> <strong>de</strong>ux spots majeurs correspondant aux adduits d’adénosine-aristolactame<br />
I : 7-(déoxyadénosine-N 6 -yl)aristolactame I (dA-AAI) et <strong>de</strong> guanosine-<br />
aristolactame I : 7-(déoxyguanosine-N 2 -yl)aristolactame I (dG-AAI)<br />
• d’un troisième spot mineur d’adduits d’adénosine-aristolactame II : 7-<br />
(déoxyadénosine-N 6 -yl)aristoloctame II (dA-AAII).<br />
Ces trois spots sont caractéristiques du profil d’adduits d’ADN spécifiques <strong><strong>de</strong>s</strong> AA<br />
précé<strong>de</strong>mment décrits [Bieler C.A. et al., 1997; Schmeiser H.H. et al., 1997]. Les<br />
cellules OK sont donc capables <strong>de</strong> métaboliser les AA induisant la formation<br />
d’adduits d’ADN.<br />
104
De tels adduits d’ADN ne sont pas détectés dans les cellules OK contrôles ou<br />
exposées au DMSO 0,1% ou CdCl2.<br />
2 3<br />
Origine<br />
1<br />
Figure 1.16. Autoradiographie <strong><strong>de</strong>s</strong> adduits d’ADN spécifiques aux AA dans les cellules OK.<br />
Spot 1 : 7-(déoxyadénosine-N 6 -yl)-aristolactame I (dA-AAI), spot 2 : 7-(déoxyguanosine-N 2 -<br />
yl)-aristolactame I (dG-AAI) et spot 3 : 7-(déoxyadénosine-N 6 -yl)-aristolactame II (dA-AAII).<br />
Tableau 1.3. Formation <strong><strong>de</strong>s</strong> adduits d’ADN spécifiques aux AA dans les cellules OK<br />
RAL/ 10 7 nucléoti<strong><strong>de</strong>s</strong> normaux<br />
Exposition aux AA dA-AAI (spot 1) dG-AAI (spot 2) dA-AAII (spot 3)<br />
20 µmol/l - 15 min 0.11 ± 0.02 0.31 ± 0.01 n.d.<br />
20 µmol/l - 2 h 0.53 ± 0.03 1.9 ± 0.6 0.16 ± 0.03<br />
20 µmol/l - 14 h 4.2 ± 1.3 24.0 ± 9.2 1.5 ± 0.5<br />
10 µmol/l - 24 h 28.1 ± 1.9 16.0 ± 2.1 3.0 ± 0.4<br />
20 µmol/l - 24 h 55.6 ± 15.0 25.5 ± 0.6 5.6 ± 1.3<br />
20 µmol/l - 24 h + 1 jour <strong>de</strong> récupération 58.6 ± 10.6 28.8 ± 1.7 6.2 ± 0.2<br />
20 µmol/l - 24 h + 6 jours <strong>de</strong> récupération 7.7 ± 1.3 6.9 ± 1.9 0.74 ± 0.19<br />
Le taux d’adduits d’ADN spécifiques aux AA est exprimé en quantité relative d’adduits (RAL)<br />
par 10 7 nucléoti<strong><strong>de</strong>s</strong> normaux (n = 3). Spot 1 : dA-AAI [7-(déoxyadénosine-N 6 -yl)aristolactame<br />
I], spot 2 : dG-AAI [7-(déoxyguanosine-N 2 -yl)aristolactame I], spot 3 : dA-AAII [7-<br />
(déoxyadénosine-N 6 -yl)aristolactame II]. n.d. non détectable.<br />
L’analyse quantitative montre que le taux d’adduits d’ADN augmentent<br />
linéairement en fonction <strong>de</strong> la durée d’exposition aux AA (Tableau 1.3). De même, la<br />
quantité d’adduits d’ADN est doublée lorsque la concentration <strong><strong>de</strong>s</strong> AA passe <strong>de</strong> 10<br />
µmol/l à 20 µmol/l (24 h d’exposition). Par contre, le taux d’adduits d’ADN est<br />
105
comparable après 24 h d’exposition aux AA suivies ou non <strong>de</strong> 1 jour <strong>de</strong> récupération<br />
dans le milieu <strong>de</strong> culture. Cependant, après 6 jours <strong>de</strong> récupération dans le milieu <strong>de</strong><br />
culture, la quantité d’adduits est réduite mais reste significative. Ces observations<br />
reflètent clairement une altération <strong>de</strong> l’ADN dans les cellules OK induite par les AA.<br />
1.5. Expression <strong>de</strong> la mégaline<br />
1.5.1. Colocalisation avec l’albumine<br />
Albumine<br />
Mégaline<br />
Albumine +<br />
Mégaline<br />
2 min<br />
5 min<br />
15 min<br />
Figure 1.17. Endocytose d’albumine et expression endogène <strong>de</strong> mégaline dans les cellules<br />
OK: microscopie confocale. Pour l’endocytose d’albumine, les monocouches <strong>de</strong> cellules OK<br />
sont incubées avec <strong>de</strong> l’albumine-FITC pendant 2, 5 et 15 min. Une colocalisation (émission<br />
jaune) s’observe entre l’albumine endocytée (émission verte) et la mégaline (émission rouge)<br />
à ces 3 temps. Les paramètres <strong><strong>de</strong>s</strong> images confocales sont i<strong>de</strong>ntiques pour les 3 temps<br />
observés. Grossissement 200 ×.<br />
Afin d’observer au microscope confocal l’endocytose d’albumine par les<br />
cellules OK, les monocouches <strong>de</strong> cellules OK sont incubées avec l’albumine-FITC<br />
pendant 2, 5 et 15 min. Après 2 min, <strong><strong>de</strong>s</strong> vésicules d’endocytose fluorescentes<br />
apparaissent à proximité <strong>de</strong> la membrane cellulaire et s’éten<strong>de</strong>nt profondément dans<br />
106
le cytoplasme après 5 et 15 min (Fig. 1.17, émission verte). La mégaline endogène<br />
est ensuite détectée dans les cellules OK par immunomarquage fluorescent. Le<br />
marquage <strong>de</strong> la mégaline est présent à la membrane <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules après 2 min et une<br />
internalisation progressive <strong>de</strong> ce marquage s’observe après 5 et 15 min d’incubation<br />
avec l’albumine (Fig. 1.17, émission rouge). L’observation <strong>de</strong> la colocalisation entre<br />
l’albumine et la mégaline à ces trois temps montre qu’une gran<strong>de</strong> partie <strong>de</strong><br />
l’albumine est colocalisée avec la mégaline d’abord à la membrane plasmique <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
cellules et ensuite dans les vésicules intracellulaires (Fig. 1.17, émission jaune).<br />
1.5.2. Effets <strong><strong>de</strong>s</strong> aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong><br />
Comme l’internalisation <strong>de</strong> l’albumine est fortement réduite en présence <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
AA (voir résultats précé<strong>de</strong>nts), l’effet <strong>de</strong> ce traitement sur l’expression <strong>de</strong> la mégaline<br />
endogène est étudié par l’analyse immunoblot. Une ban<strong>de</strong> <strong>de</strong> taille supérieure à 500<br />
kD, correspondant à la masse moléculaire prédite pour la mégaline, est présente<br />
dans le cortex rénal <strong>de</strong> rat et les extraits <strong>de</strong> cellules OK traitées ou non. Une<br />
diminution <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong> la mégaline est observée pour les cellules OK<br />
exposées à 20 µmol/l d’AA pendant 24 h (Fig. 1.18A).<br />
A<br />
250 kD<br />
50 kD<br />
37 kD<br />
Rein <strong>de</strong> rat<br />
Cellules OK<br />
DMSO<br />
AA<br />
Mégaline<br />
β-actine<br />
0<br />
Cellules OK DMSO AA<br />
Figure 1.18. Effet <strong><strong>de</strong>s</strong> AA sur l’expression <strong>de</strong> la mégaline dans les cellules OK: analyse<br />
immunoblot (A) et <strong>de</strong>nsitométrique (B). L’extrait membranaire du cortex rénal <strong>de</strong> rat, utilisé<br />
comme contrôle positif, et les lysats <strong>de</strong> cellules OK non traités ou exposées au DMSO 0,1 %<br />
ou aux AA 20 µmol/l pendant 24 h, sont séparés par électrophorèse. Ce film est représentatif<br />
<strong>de</strong> 3 expériences indépendantes. Les <strong>de</strong>nsités optiques relatives sont obtenues en double et<br />
normalisées par rapport à la β-actine.<br />
B<br />
Densité optique optique relative (%)<br />
150<br />
100<br />
50<br />
100<br />
125<br />
55<br />
107
L’analyse semiquantitative <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong> la mégaline relative à la β-actine<br />
montre une légère augmentation (+ 24 %) <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong> la mégaline dans les<br />
cellules OK exposées au DMSO par rapport aux cellules non traitées. Cependant,<br />
pour les cellules traitées aux AA, une diminution <strong>de</strong> moitié (- 45 %) est observée par<br />
rapport aux cellules OK non traitées ainsi qu’une réduction <strong>de</strong> l’ordre <strong>de</strong> 70 % par<br />
rapport aux cellules exposées au DMSO (Fig. 1.18B).<br />
1.6. Effets d’autres composés contenus dans les gélules<br />
amaigrissantes<br />
D’autres composés contenus dans les pilules amaigrissantes sont testés pour<br />
évaluer leur capacité d’interférer ou non avec la réabsorption d’albumine. Les<br />
cellules OK sont incubées pendant 24 h avec 20 et 100 µmol/l <strong>de</strong> fenfluramine, 20 et<br />
100 µmol/l <strong>de</strong> diéthylpropion ainsi que 20 µmol/l d’acétazolami<strong>de</strong>. Aucun <strong>de</strong> ces<br />
produits ne modifie la réabsorption d’albumine par les cellules OK (Fig. 1.19A).<br />
De même, les traitements combinés <strong>de</strong> 1 µmol/l d’AA avec 20 ou 100 µmol/l <strong>de</strong><br />
fenfluramine, 20 ou 100 µmol/l <strong>de</strong> diéthylpropion et 20 µmol/l d’acétazolami<strong>de</strong> n’ont<br />
aucun effet sur la réabsorption <strong>de</strong> l’albumine (Fig. 1.19B).<br />
Ces résultats indiquent donc que seuls les AA contenus dans les préparations à<br />
visée amaigrissante altèrent l’endocytose <strong>de</strong> protéines par les cellules OK.<br />
A<br />
B<br />
140<br />
120<br />
100<br />
80<br />
140<br />
120<br />
100<br />
80<br />
60<br />
60<br />
40<br />
40<br />
20<br />
20<br />
0<br />
0<br />
Réabsorption d’albumine-FITC<br />
(% du contrôle)<br />
Contrôle<br />
Fenfluramine<br />
20 µmol/l<br />
Fenfluramine<br />
100 µmol/l<br />
Diéthylpropion<br />
20 µmol/l<br />
Diéthylpropion<br />
100 µmol/l<br />
Acétazolami<strong>de</strong><br />
20 µmol/l<br />
B<br />
Réabsorption d’albumine-FITC<br />
d’albumine-FITC<br />
(% du contrôle) contrôle)<br />
Figure 1.19. Effet d’autres composés contenus dans les préparations à visée amaigrissante sur la<br />
réabsorption d’albumine par les cellules OK en présence ou non d’AA. A : Les cellules sont traitées<br />
pendant 24 h avec <strong>de</strong> la fenfluramine 20 et 100 µmol/l, du diéthylpropion 20 et 100 µmol/l ou <strong>de</strong><br />
l’acétazolami<strong>de</strong> 20 µmol/l et ensuite incubées avec 0,8 µmol/l d’albumine-FITC pendant 15 min. B :<br />
Les cellules sont traitées avec du DMSO 0,1%, <strong><strong>de</strong>s</strong> AA 1 µmol/l ainsi qu’ avec <strong><strong>de</strong>s</strong> AA 1 µmol/l en<br />
présence <strong><strong>de</strong>s</strong> mêmes produits qu’à la figure A. (n = 3).<br />
Contrôle<br />
DMSO<br />
AA 1 µmol/l<br />
Fenflu 20 µmol/l<br />
+ AA 1 µmol/l<br />
Fenflu 100 µmol/l<br />
+AA1µmol/l<br />
Diéthyl 20 µmol/l<br />
+AA1µmol/l<br />
Diéthyl 100 µmol/l<br />
+ AA 1 µmol/l<br />
Acéta 20 µmol/l<br />
+ AA 1 µmol/l<br />
108
2. Etu<strong>de</strong> in vivo : effets <strong>de</strong> l’intoxication aux aci<strong><strong>de</strong>s</strong><br />
<strong>aristolochiques</strong> sur l’épithélium tubulaire proximal<br />
<strong>de</strong> rat.<br />
Un modèle expérimental animal <strong>de</strong> néphropathie aux AA a été développé<br />
dans notre laboratoire. Des rats Wistar mâles reçoivent en sous-cutané une dose<br />
journalière <strong>de</strong> 10 mg/kg <strong>de</strong> poids corporel d’AA pendant 35 jours. Cette intoxication<br />
conduit au développement d’une fibrose interstitielle associée à une atrophie<br />
tubulaire et à une insuffisance rénale. Une diminution <strong>de</strong> l’excrétion urinaire <strong>de</strong> LAP,<br />
enzyme localisée à la bordure en brosse, est déjà observée au jour 10 et suggère<br />
une atteinte précoce <strong><strong>de</strong>s</strong> tubules proximaux [Debelle F.D. et al., 2002; Debelle F.D.<br />
et al., 2004].<br />
Les résultats in vitro décrits dans la première partie <strong>de</strong> ce travail ainsi que les<br />
premières observations in vivo suggèrent que le tubule proximal est la cible <strong><strong>de</strong>s</strong> AA.<br />
Par conséquent, ce modèle expérimental <strong>de</strong> néphropathie chronique aux AA est<br />
utilisé afin d’étudier l’évolution au cours du temps <strong><strong>de</strong>s</strong> altérations structurelles et<br />
fonctionnelles du tubule proximal et d’établir un lien entre les mesures biochimiques<br />
et les observations histologiques.<br />
2.1. Protocole long : rats traités pendant 35 jours<br />
J -7<br />
PERIODE D’INJECTION<br />
Acclimatation<br />
(10 mg/kg AA ou solvant, 7 jours/ semaine)<br />
0 3 7 10 14 18<br />
35<br />
Jours <strong>de</strong> sacrifice (n = 6 rats / groupe)<br />
Figure 2.1. Schéma <strong>de</strong> la procédure suivie durant le protocole expérimental long (rats traités<br />
pendant 35 jours).<br />
109
Tableau 2.1. Paramètres biologiques étudiés chez les rats traités aux AA et les rats contrôles.<br />
Mesures Rats Jour 3 Jour 7 Jour 10 Jour 14 Jour 18 Jour 35<br />
Poids <strong><strong>de</strong>s</strong> rats AA 203 ± 5 228 ± 8 251 ± 6 274 ± 9 297 ± 8 325 ± 14 *<br />
(g) Contrôle 205± 7 238 ± 5 257 ± 6 290 ± 7 310 ± 8 386 ± 15<br />
Créatinine plasmatique AA 14.6 ± 0.3 17.5 ± 0.8 19.9 ± 1.0 21.5 ± 0.6 19.7 ± 0.7 31.1 ± 3.5 *<br />
(µmol/l) Contrôle 15.8 ± 1.1 18.3 ± 1.1 17.4 ± 0.7 22.5 ± 2.6 20.2 ± 2.0 22.0 ± 1.3<br />
Débit urinaire AA 6.2 ± 0.8 10.1 ± 0.8 * 14.3 ± 2.3 * 17.3 ± 2.6 ** 16.7 ± 2.1 ** 18.9 ± 1.9 **<br />
(µl/min) Contrôle 5.5 ± 0.3 7.6 ± 0.5 8.0 ± 0.5 8.2 ± 0.5 7.6 ± 0.9 7.3 ± 0.8<br />
NAG urinaire AA 392 ± 63 692 ± 124 1077 ± 257 ** 1352 ± 355 ** 822 ± 115 * 2123 ± 349 **<br />
(mU/mmol créatinine) Contrôle 219 ± 73 281 ± 44 264 ± 61 259 ± 52 363 ± 86 370 ± 41<br />
Fraction d’excrétion du sodium AA 0.22 ± 0.01 0.26 ± 0.02 0.31 ± 0.02 0.30 ± 0.02 0.24 ± 0.02 0.30 ± 0.06<br />
(%) Contrôle 0.25 ± 0.02 0.32 ± 0.02 0.29 ± 0.02 0.37 ± 0.04 0.19 ± 0.01 0.17 ± 0.03<br />
Fraction d’excrétion du potassium AA 7.99 ± 0.17 7.75 ± 0.42 ** 12.5 ± 0.8 12.6 ± 0.71 8.36 ± 0.55 15.4 ± 2.4 **<br />
(%) Contrôle 8.57 ± 0.02 10.2 ± 0.5 11.0 ± 0.7 12.1 ± 1.5 7.81 ± 0.79 7.80 ± 0.47<br />
Fraction d’excrétion du glucose AA 0.025 ± 0.002 0.029 ± 0.005 0.047 ± 0.007 * 0.040 ± 0.009 0.027 ± 0.006 0.203 ± 0.118<br />
(%) Contrôle 0.020 ± 0.003 0.025 ± 0.003 0.026 ± 0.004 0.036 ± 0.005 0.027 ± 0.007 0.042 ± 0.004<br />
pH urinaire AA 8,4 ± 0,1 8,1 ± 0,2 8,0 ± 0,4 * 8,1 ± 0,1 * 8,0 ± 0,1 7,3 ± 0,1<br />
Contrôle 8,5 ± 0,1 8,4 ± 0,1 8,6 ± 0,1 8,6 ± 0,1 8,2 ± 0,1 8,0 ± 0,3<br />
pH plasmatique AA 8,3 ± 0,1 8,1 ± 0,1 * 8,6 ± 0,4 8,6 ± 0,1 8,6 ± 0,1 8,6 ± 0,1<br />
Contrôle 8,2 ± 0,1 8,4 ± 0,0 8,5 ± 0,1 8,5 ± 0,1 8,7 ± 0,1 8,6 ± 0,1<br />
Les valeurs représentent la moyenne ± SEM (n = 6). La signification correspond à * P < 0.05 et ** P < 0.01 par comparaison aux valeurs<br />
contrôles.<br />
110
Le schéma du protocole <strong>de</strong> 35 jours est présenté à la figure 2.1 et détaillé<br />
dans le chapitre méthodologie § 2.2.1 (page 77).<br />
2.1.1. Paramètres biologiques<br />
Le poids moyen <strong><strong>de</strong>s</strong> 2 groupes <strong>de</strong> rats est obtenu avant chaque sacrifice et<br />
présente une évolution croissante au cours du temps (Tableau. 2.1). Néanmoins bien<br />
que les rats contrôles aient un poids équivalent à celui <strong><strong>de</strong>s</strong> rats traités aux AA du jour<br />
3 au jour 18, une diminution significative est observée au jour 35 pour les rats<br />
injectés aux AA par rapport aux rats contrôles.<br />
2.1.1.1. Créatinine plasmatique<br />
Le dosage <strong>de</strong> créatinine plasmatique est effectué afin d’évaluer la fonction<br />
rénale. Chez les rats traités aux AA pendant 35 jours, la créatinine plasmatique<br />
moyenne reste stable jusqu’au jour 18 et augmente <strong>de</strong> manière significative au jour<br />
35 (Tableau 2.1), reproduisant les résultats décrits précé<strong>de</strong>mment [Debelle F.D. et<br />
al., 2002].<br />
2.1.1.2. Protéines et enzymes urinaires<br />
En vue d’obtenir <strong><strong>de</strong>s</strong> informations sur la fonction tubulaire, plusieurs<br />
paramètres urinaires sont mesurés. Le débit urinaire augmente significativement<br />
chez les rats traités aux AA à partir du 7 ème jour et persiste jusqu’au jour 35,<br />
indiquant que les rats sont <strong>de</strong>venus polyuriques (Tableau 2.1).<br />
Protéinurie et albuminurie<br />
Une protéinurie significative est observée dès le jour 7 et s’intensifie jusqu’au<br />
jour 35 reflétant une altération <strong>de</strong> la réabsorption <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines (Fig. 2.2A).<br />
L’albuminurie augmente, atteint la signification statistique dès le 3 ème jour et reste<br />
111
élevée jusqu’au jour 35 (Fig. 2.2B). Le taux d’albumine plasmatique est normal tout<br />
au long du protocole. Le rapport albuminurie/protéinurie totale reste constant à tous<br />
les temps pour les rats contrôles, alors que chez les rats traités aux AA, une<br />
augmentation significative <strong>de</strong> ce rapport n’est observée qu’aux jours 3 et 35. Cette<br />
élévation est moindre aux autres jours (Fig. 2.2C). Ces observations suggèrent que<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> protéines autres que l’albumine sont excrétées dans les urines, probablement<br />
suite à un défaut précoce <strong>de</strong> réabsorption tubulaire. Il s’agit donc bien d’une<br />
protéinurie dite tubulaire.<br />
Protéinurie totale (mg/mmol créatinine)<br />
A B<br />
500 500<br />
400 400<br />
300 300<br />
200 200<br />
100 100<br />
0<br />
Contrôle<br />
AA<br />
**<br />
3 7 10 14 18 35<br />
C<br />
**<br />
**<br />
Temps (jours)<br />
Rapport albuminurie/protéinurie totale (%)<br />
35<br />
30<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0<br />
**<br />
**<br />
Contrôle<br />
AA<br />
*<br />
3 7 10 14 18 35<br />
Temps (jours)<br />
3 7 10 14 18 35<br />
Figure 2.2. Protéinurie totale (A), albuminurie (B) et rapport albuminurie/protéinurie totale (C)<br />
déterminés chez les rats contrôles (colonne grise) et les rats traités aux AA (colonne noire)<br />
aux jours 3, 7, 10, 14, 18 et 35. Les résultats représentent la moyenne ± SEM (n = 6). Les<br />
significations statistiques correspon<strong>de</strong>nt à * P < 0,05 et ** P < 0,01 par comparaison aux<br />
valeurs contrôles.<br />
Afin d’i<strong>de</strong>ntifier les protéines excrétées dans les urines <strong><strong>de</strong>s</strong> rats traités aux AA,<br />
les protéines contenues dans les échantillons urinaires sont précipitées avant d’être<br />
séparées par électrophorèse. Pour chaque temps, les profils d’électrophorèse <strong>de</strong><br />
Albuminurie (mg/mmol créatinine)<br />
120<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
Contrôle<br />
AA<br />
**<br />
**<br />
***<br />
Temps (jours)<br />
*<br />
**<br />
112
<strong>de</strong>ux rats contrôles et <strong>de</strong> <strong>de</strong>ux rats traités aux AA sont présentés à la figure 2.3. Aux<br />
jours 3 (Fig. 2.3A) et 35 (Fig. 2.3C), l’intensité <strong><strong>de</strong>s</strong> ban<strong><strong>de</strong>s</strong> correspondant à<br />
l’albumine et à la transferrine (positionnée juste au-<strong><strong>de</strong>s</strong>sus) augmente nettement<br />
pour les <strong>de</strong>ux rats traités aux AA. Par contre, aux jours 7, 10, 14 et 18, les ban<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>de</strong><br />
ces <strong>de</strong>ux protéines sont plus intenses pour un seul <strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>de</strong>ux rats (Fig. 2.3A-C).<br />
A<br />
250<br />
150<br />
100<br />
75<br />
50<br />
37<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
AA Contrôle AA Contrôle<br />
Jour 3 Jour 7<br />
C<br />
250<br />
150<br />
100<br />
75<br />
50<br />
37<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
AA Contrôle AA Contrôle<br />
AA Contrôle AA Contrôle<br />
Jour 10 Jour 14<br />
Transferrine<br />
Albumine<br />
DBP<br />
α 2 -microglobuline<br />
β 2 -microglobuline<br />
Jour 18 Jour 35<br />
Figure 2.3. Séparation <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines urinaires par électrophorèse pour <strong>de</strong>ux rats contrôles<br />
et <strong>de</strong>ux rats traités aux AA (AA). La partie A correspond aux jours 3 et 7, la partie B aux jours<br />
10 et 14 et la partie C aux jours 18 et 35. Le standard <strong>de</strong> poids moléculaire est annoté à<br />
gauche <strong><strong>de</strong>s</strong> gels et l’i<strong>de</strong>ntification <strong>de</strong> certaines protéines à droite. (Gels Tris-HCl 4-20%).<br />
La variation d’intensité étant difficilement décelable pour les ban<strong><strong>de</strong>s</strong><br />
correspondant aux protéines <strong>de</strong> faible poids moléculaire dont la protéine <strong>de</strong> liaison à<br />
la vitamine D, l’α2-microglobuline et la β2-microglobuline, une analyse semi-<br />
quantitative <strong>de</strong> ces profils d’électrophorèse est réalisée en considérant 3 catégories :<br />
les protéines <strong>de</strong> haut poids moléculaire correspondant aux protéines <strong>de</strong> taille<br />
supérieure à l’albumine, l’albumine et les protéines <strong>de</strong> faible poids moléculaire (dites<br />
microprotéines). Cette analyse semi-quantitative <strong>de</strong> l’électrophorèse <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines<br />
urinaires montre une augmentation significative <strong>de</strong> la quantité <strong>de</strong> protéines <strong>de</strong> haut<br />
poids moléculaire aux jours 3, 7, et 35 ainsi que <strong>de</strong> l’albumine aux jours 3, 14 et 35<br />
(Tableau 2.2). Le taux urinaire <strong>de</strong> protéines <strong>de</strong> faible poids moléculaire double au<br />
jour 10 et s’élève progressivement à partir du jour 10 jusqu’au jour 35, suggérant une<br />
B<br />
Immunoglobuline<br />
Transferrine<br />
Albumine<br />
DBP<br />
α α2-microglobuline 2-microglobuline<br />
2-microglobuline<br />
β 2 -microglobuline<br />
113
altération <strong>de</strong> la fonction <strong>de</strong> réabsorption <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules tubulaires proximales (Tableau<br />
2.2).<br />
Tableau 2.2. Analyse semi-quantitative <strong><strong>de</strong>s</strong> électrophorèses <strong>de</strong> protéines urinaires<br />
réalisées chez les rats traités aux AA et les rats contrôles<br />
Jour Rats<br />
3<br />
7<br />
10<br />
14<br />
18<br />
35<br />
mg/mmol créatinine<br />
HMWP Albumine LMWP<br />
AA 12,9 ± 1,1 ** 19,5 ± 4,0 * 58,9 ± 7,4<br />
Contrôle 7,3 ± 0,8 8,6 ± 1,3 57,3 ± 5,1<br />
AA 9,0 ± 1,0 ** 14,2 ± 4,3 95,1 ± 3,1<br />
Contrôle 4,3 ± 0,5 6,1 ± 0,8 67,6 ± 10,6<br />
AA 13,7 ± 6,3 25,0 ± 10,0 184,8 ± 8,4 **<br />
Contrôle 6,5 ± 1,2 7,7 ± 0,8 92,7 ± 10,2<br />
AA 15,7 ± 9,2 53,4 ± 22,3 * 249,1 ± 22,4 **<br />
Contrôle 2,9 ± 0,4 4,8 ± 0,8 146,9 ± 10,1<br />
AA 6,6 ± 3,1 15,7 ± 6,6 182,0 ± 12,9 **<br />
Contrôle 3,5 ± 1,0 5,7 ± 0,9 112,4 ± 11,2<br />
AA 27,3 ± 13,9 ** 79,9 ± 13,8 ** 251,5 ± 14,8 **<br />
Contrôle 1,7 ± 0,2 4,7 ± 1,0 140,5 ± 8,7<br />
Les valeurs pour les protéines <strong>de</strong> haut poids moléculaire (HMWP : High Molecular Weight<br />
Proteins), l’albumine et les protéines <strong>de</strong> faible poids moléculaire (LMWP : Low Molecular<br />
Weight Proteins) représentent la moyenne ± SEM (n = 6). La signification statistique<br />
correspond à * P < 0 ,05 et ** P < 0,01 par comparaison aux valeurs contrôles.<br />
Enzymurie NAG<br />
L’excrétion urinaire <strong>de</strong> la NAG, enzyme localisée dans les lysosomes <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
cellules épithéliales rénales, principalement proximales, est déterminée à chaque<br />
temps du protocole. L’enzymurie NAG augmente à partir du jour 3, atteint la<br />
signification statistique au jour 10 et s’intensifie progressivement jusqu’au jour 35,<br />
reflétant ainsi une perte d’intégrité d’un nombre croissant <strong>de</strong> cellules rénales<br />
(Tableau 2.1).<br />
114
Autres analyses<br />
D’autres paramètres biologiques sont dosés afin <strong>de</strong> calculer la fraction<br />
d’excrétion du sodium, du potassium et du glucose (Tableau 2.1). La fraction<br />
d’excrétion du sodium pour les rats traités aux AA est comparable à celle <strong><strong>de</strong>s</strong> rats<br />
contrôles. La fraction d’excrétion du potassium diminue significativement au jour 7 et<br />
augmente au jour 35 chez les rats injectés aux AA. La fraction d’excrétion du glucose<br />
est significativement élevée au jour 10 et augmente sans être statistiquement<br />
significative au jour 35.<br />
De même, les mesures <strong>de</strong> pH urinaire et plasmatique montrent que le pH<br />
reste constant chez les rats traités aux AA par rapport aux contrôles, excepté aux<br />
jours 10 et 14 pour le pH urinaire et au jour 7 pour le pH plasmatique (Tableau 2.1).<br />
A<br />
Protéinurie totale (mg/mmol (mg/mmol créatinine) créatinine)<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000<br />
NAG urinaire (mU/mmol créatinine)<br />
C<br />
Créatinine plasmatique (µmol/l)<br />
40 40<br />
30 30<br />
20 20<br />
10 10<br />
r = 0.80 (Spearman)<br />
P < 0.0001<br />
0<br />
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000<br />
NAG urinaire (mU/mmol créatinine)<br />
r = 0.65 (Spearman)<br />
P < 0.0001<br />
Figure 2.4. Corrélations structure-fonction entre l’enzymurie NAG et la protéinurie totale (A),<br />
l’albuminurie (B) et la créatinine plasmatique (C) chez les rats traités aux AA (n = 36).<br />
Albuminurie (mg/mmol créatinine)<br />
B<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000<br />
NAG urinaire (mU/mmol créatinine)<br />
r = 0.54 (Spearman)<br />
P = 0.0007<br />
115
2.1.1.3. Relations structure-fonction<br />
Des corrélations structure-fonction sont déterminées sur base <strong><strong>de</strong>s</strong> données<br />
biochimiques individuelles pour chaque temps afin d’établir <strong><strong>de</strong>s</strong> liens entre les<br />
différents paramètres d’atteinte tubulaire structurelle et fonctionnelle. Les plus<br />
représentatives sont : l’enzymurie NAG est étroitement corrélée avec la protéinurie<br />
totale (Fig. 2.4A), avec l’albuminurie (Fig.2.4B) et avec le taux <strong>de</strong> créatinine<br />
plasmatique (Fig. 2.4C).<br />
2.1.2. Observations histologiques<br />
2.1.2.1. Histologie conventionnelle<br />
Les lésions morphologiques sont étudiées à l’ai<strong>de</strong> <strong>de</strong> différentes colorations<br />
permettant d’approfondir l’une ou l’autre anomalie du secteur tubulo-interstitiel.<br />
Aucune lésion n’est décelée dans les glomérules. Les altérations morphologiques<br />
sont exclusivement observées dans la partie externe <strong>de</strong> la médullaire externe ainsi<br />
qu’au niveau <strong>de</strong> la strie médullaire. Ces zones correspondant à la localisation <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
tubules proximaux du segment S3 sont les plus sensibles à l’hypoxie.<br />
Hématoxyline-éosine<br />
La coloration hématoxyline-éosine sur les coupes <strong>de</strong> tissu rénal <strong><strong>de</strong>s</strong> rats<br />
traités aux AA met en évi<strong>de</strong>nce <strong><strong>de</strong>s</strong> anomalies précoces et évolutives au cours du<br />
temps au niveau <strong><strong>de</strong>s</strong> tubules proximaux. En effet, un gonflement <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules<br />
tubulaires proximales ainsi que l’apparition <strong>de</strong> cellules nécrotiques dans la lumière<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> tubules sont observés dès le jour 3 (Fig. 2.5B). Ensuite, <strong><strong>de</strong>s</strong> foyers <strong>de</strong> nécrose<br />
tubulaire sont présents aux jours 7 et 10 (Fig. 2.5C-D). Ces altérations <strong>de</strong> l’épithélium<br />
tubulaire évoluent vers l’atrophie tubulaire, laquelle se développe progressivement à<br />
partir du jour 10 jusqu’au jour 35 (Fig. 2.5D-G). Notons également la présence et le<br />
développement <strong>de</strong> l’infiltrat inflammatoire <strong>de</strong> cellules mononuclées à partir du jour 3<br />
jusqu’au jour 35 (Fig. 2.5B-G).<br />
116
A: Contrôle – Jour 3 B: AA – Jour 3<br />
E: AA – Jour 14<br />
#<br />
*<br />
F: AA – Jour 18<br />
#<br />
#<br />
C: AA – Jour 7<br />
#<br />
*<br />
Figure 2.5. Coloration hématoxyline-éosine <strong><strong>de</strong>s</strong> coupes <strong>de</strong> tissu rénal <strong><strong>de</strong>s</strong> rats contrôles aux<br />
jours 3 et 35 (A & H) ainsi que <strong><strong>de</strong>s</strong> rats traités aux AA aux jours 3, 7, 10, 14, 18 et 35 (B-G).<br />
Les lésions morphologiques représentatives du secteur tubulo-interstitiel sont observées :<br />
gonflement <strong>de</strong> la cellule tubulaire (flèche), nécrose tubulaire (*), atrophie tubulaire (tête <strong>de</strong><br />
flèche) et infiltrat inflammatoire <strong>de</strong> cellules mononuclées (#). Grossissement 400 ×.<br />
Trichrome <strong>de</strong> Goldner<br />
Sur les coupes colorées au trichrome <strong>de</strong> Goldner, la fibrose interstitielle,<br />
consistant en un dépôt <strong>de</strong> matrice extracellulaire constituée <strong>de</strong> fibres <strong>de</strong> collagène,<br />
est observée au jour 10 et s’intensifie graduellement jusqu’au jour 35 (Fig. 2.6B-E).<br />
A: Contrôle – Jour 10<br />
Figure 2.6. Coloration au trichrome <strong>de</strong> Goldner <strong><strong>de</strong>s</strong> coupes <strong>de</strong> tissu rénal <strong><strong>de</strong>s</strong> rats contrôles<br />
aux jour 10 et 35 (A & F) ainsi que <strong><strong>de</strong>s</strong> rats traités aux AA aux jours 10, 14, 18 et 35 (B-E).<br />
Cette coloration montre le développement <strong>de</strong> la fibrose interstitielle (vert clair).<br />
Grossissement 400 ×.<br />
#<br />
*<br />
*<br />
*<br />
G: AA – Jour 35<br />
B: AA – Jour 10 C: AA – Jour 14<br />
D: AA – Jour 10<br />
*<br />
#<br />
*<br />
H: Contrôle – Jour 35<br />
D: AA – Jour 18 E: AA – Jour 35<br />
F: Contrôle – Jour 35<br />
117
Aci<strong>de</strong> periodique Schiff (PAS)<br />
La coloration aci<strong>de</strong> periodique Schiff (PAS) permet d’examiner plus en détails<br />
la bordure en brosse <strong>de</strong> l’épithélium tubulaire proximal et les membranes basales.<br />
Cette coloration montre l’intégrité <strong>de</strong> la bordure en brosse à la membrane apicale<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> tubules proximaux et <strong>de</strong> la membrane basale pour les rats contrôles (Fig. 2.7A<br />
& H). Par contre, chez les rats traités aux AA, dès le jour 3, une désorganisation <strong>de</strong><br />
la bordure en brosse est visible (Fig. 2.7B). Une perte progressive <strong>de</strong> la bordure en<br />
brosse <strong><strong>de</strong>s</strong> tubules proximaux est ainsi observée du jour 7 jusqu’au jour 35 (Fig.<br />
2.7C-G). Les tubules proximaux ayant perdu leur bordure en brosse apparaissent<br />
dilatés, leurs cellules sont aplaties avec un cytoplasme réduit (Fig. 2.7C-F). Les<br />
tubules <strong>de</strong>viennent atrophiques et leur membrane basale résiduelle est épaissie au<br />
jour 35 (Fig. 2.7G). Des cellules nécrotiques ainsi que <strong><strong>de</strong>s</strong> débris cellulaires sont<br />
présents dans la lumière <strong><strong>de</strong>s</strong> tubules proximaux aux jours 7, 10, 14 et 18 (Fig. 2.7C-<br />
F).<br />
A: Contrôle – Jour 3 B: AA – Jour 3<br />
C: AA – Jour 7 D: AA – Jour 10<br />
E: AA – Jour 14 F: AA – Jour 18<br />
G: AA – Jour 35<br />
H: Contrôle – Jour 35<br />
Figure 2.7. Coloration à l’aci<strong>de</strong> periodique <strong>de</strong> Schiff (PAS) <strong><strong>de</strong>s</strong> coupes <strong>de</strong> tissu rénal <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
rats contrôles aux jours 3 et 35 (A & H) ainsi que <strong><strong>de</strong>s</strong> rats traités aux AA aux jours 3, 7, 10,<br />
14, 18 et 35 (B-G). Grossissement 400 ×.<br />
2.1.2.2. Immunomarquage <strong>de</strong> l’endopeptidase neutre<br />
Pour confirmer les atteintes <strong>de</strong> la bordure en brosse observées au PAS, un<br />
immunomarquage <strong>de</strong> la NEP, enzyme ancrée dans la membrane apicale <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules<br />
tubulaires proximales, est réalisé. L’observation <strong><strong>de</strong>s</strong> coupes <strong>de</strong> tissu rénal <strong><strong>de</strong>s</strong> rats<br />
contrôles montre que la NEP est localisée à la bordure en brosse <strong>de</strong> l’épithélium du<br />
118
tubule proximal (Fig. 2.8A & H). Par contre, chez les rats exposés aux AA, une perte<br />
ponctuelle du marquage est observée au jour 3 (Fig. 2.8B). Ensuite, une disparition<br />
partielle ou totale du marquage <strong>de</strong> la NEP à la bordure en brosse est observée aux<br />
jours 7, 10, 14, 18 et 35 (Fig. 2.8C-G). Ainsi, le nombre <strong>de</strong> tubules proximaux ayant<br />
perdu leur bordure en brosse augmente au cours du temps d’exposition aux AA. Les<br />
observations du PAS et du marquage <strong>de</strong> la NEP sont comparables et indiquent donc<br />
que les altérations structurelles <strong><strong>de</strong>s</strong> tubules proximaux se caractérisent par une<br />
disparition progressive <strong>de</strong> la bordure en brosse.<br />
A: Contrôle – Jour 3 B: AA – Jour 3<br />
C: AA – Jour 7 D: AA – Jour 10<br />
E: AA – Jour 14 F: AA – Jour 18<br />
G: AA – Jour 35<br />
H: Contrôle – Jour 35<br />
Figure 2.8. Marquage immunohistochimique <strong>de</strong> l’endopeptidase neutre (NEP) sur les<br />
coupes <strong>de</strong> tissu rénal <strong><strong>de</strong>s</strong> rats contrôles aux jours 3 et 35 (A & H) ainsi que <strong><strong>de</strong>s</strong> rats traités<br />
aux AA aux jours 3, 7, 10, 14, 18 et 35 (B-G). Grossissement 400 ×.<br />
2.1.2.3. Evaluation semi-quantitative <strong><strong>de</strong>s</strong> lésions morphologiques<br />
L’évaluation semi-quantitative <strong><strong>de</strong>s</strong> lésions morphologiques décrites ci-<strong><strong>de</strong>s</strong>sus<br />
est effectuée au départ <strong><strong>de</strong>s</strong> coupes <strong>de</strong> tissu rénal <strong><strong>de</strong>s</strong> rats traités aux AA colorées à<br />
l’hématoxyline-éosine et au trichrome <strong>de</strong> Goldner. Les scores allant <strong>de</strong> 0 à 3 sont<br />
établis pour la nécrose tubulaire, la fibrose interstitielle et l’atrophie tubulaire (pour<br />
plus <strong>de</strong> détails voir le chapitre méthodologie § 2.12, page 85). Cette évaluation,<br />
présentée à la figure 2.9, montre que la présence <strong>de</strong> foyers <strong>de</strong> nécrose tubulaire est<br />
maximale au jour 7 et fortement diminuée à partir du jour 10. Ensuite, l’atrophie<br />
tubulaire apparaît au jour 7, évolue progressivement, elle est la plus intense au jour<br />
35. Parallèlement, la fibrose interstitielle faiblement présente au jour 7 se développe<br />
graduellement jusqu’au jour 35 où elle est maximale. Ces résultats confortent les<br />
119
observations histologiques décrites précé<strong>de</strong>mment et indiquent que les tubules<br />
proximaux sont précocement altérés suite aux injections d’AA.<br />
Score<br />
3<br />
2<br />
1<br />
0<br />
Nécrose tubulaire<br />
Atrophie tubulaire<br />
Fibrose interstitielle<br />
3 7 10 14 18 35<br />
Temps (jours)<br />
Figure 2.9. Evaluation semi-quantitative <strong><strong>de</strong>s</strong> lésions morphologiques observées chez les<br />
rats traités aux AA aux jours 3, 7, 10, 14, 18 et 35: nécrose tubulaire (colonne noire),<br />
atrophie tubulaire (colonne grise) et fibrose interstitielle (colonne hachurée). Les résultats<br />
représentent la moyenne ± SEM (n = 6).<br />
2.1.3. Détection <strong><strong>de</strong>s</strong> adduits d’ADN spécifiques aux aci<strong><strong>de</strong>s</strong><br />
<strong>aristolochiques</strong> dans le cortex rénal<br />
Les adduits d’ADN spécifiques aux AA sont détectés dans <strong><strong>de</strong>s</strong> échantillons <strong>de</strong><br />
cortex rénal issus <strong><strong>de</strong>s</strong> rats traités aux AA. Par contre, aucun adduit n’est décelé chez<br />
les rats contrôles. Pour rappel, l’image caractéristique <strong><strong>de</strong>s</strong> adduits d’ADN spécifiques<br />
aux AA, présentée à la Fig. 2.10A, se compose <strong>de</strong> trois spots majeurs d’adduits : 7-<br />
(déoxyadénosine-N 6 -yl)-aristolactame I (dA-AAI, spot 1), 7-(déoxyguanosine-N 2 -yl)aristolactame<br />
I (dG-AAI, spot 2) et 7-(déoxyadénosine-N 6 -yl)-aristolactame II (dA-<br />
AAII, spot 3) [Bieler C.A. et al., 1997; Stiborova M. et al., 1994].<br />
L’analyse quantitative révèle qu’une quantité constante d’adduits d’ADN est<br />
atteinte dès le jour 3 et se maintient jusqu’au jour 35 (Fig. 2.10B). Une légère<br />
augmentation du taux d’adduits d’ADN est observée au jour 18 mais n’est pas<br />
statistiquement significative. La quantité totale <strong><strong>de</strong>s</strong> adduits d’ADN spécifiques aux AA<br />
120
chez les rats est donc stable et comprise entre 800 et 1000 adduits par 10 8<br />
nucléoti<strong><strong>de</strong>s</strong> comme rapporté dans un protocole précé<strong>de</strong>nt [Debelle F. et al., 2003].<br />
A B<br />
2<br />
Figure 2.10. A : Autoradiographie <strong><strong>de</strong>s</strong> adduits d’ADN spécifiques aux AA dans le cortex<br />
rénal <strong><strong>de</strong>s</strong> rats traités aux AA. B : Quantité d’adduits d’ADN spécifiques aux AA formés dans<br />
le cortex rénal <strong><strong>de</strong>s</strong> rats traités aux AA aux jours 3, 7, 10, 14, 18 et 35. Les résultats<br />
représentent la moyenne ± SEM (n = 4). Chaque échantillon d’ADN est post-marqué une<br />
seule fois. Spot 1 : 7-déoxyadénosine-N 6 -yl)-aristolactame I (dA-AAI : colonne noire), spot 2 :<br />
7-(déoxyguanosine-N 2 -yl)-aristolactame I (dG-AAI : colonne hachurée) et spot 3 : 7-<br />
(déoxyadénosine-N 6 -yl)-aristolactame II (dA-AAII : colonne grise).<br />
2.2. Protocole <strong>de</strong> suivi <strong><strong>de</strong>s</strong> paramètres urinaires: rats<br />
traités pendant 35 jours<br />
Acclimatation<br />
J -7<br />
3<br />
1<br />
Adduits par 10 8 Adduits par 10 nucléoti<strong><strong>de</strong>s</strong> normaux<br />
8 nucléoti<strong><strong>de</strong>s</strong> normaux<br />
1600<br />
1400<br />
1200<br />
1000<br />
800<br />
600<br />
400<br />
200<br />
0<br />
Spot 1 (dA-AAI)<br />
Spot 2 (dG-AAI)<br />
Spot 3 (dA-AAII)<br />
3 7 10 14 18 35<br />
Temps (jours)<br />
PERIODE D’INJECTION<br />
(10 mg/kg AA ou solvant, 7 jours/ semaine)<br />
0 3 5 7 10 13 15 18 22 24 27 31<br />
Jours <strong>de</strong> récolte d’urines<br />
(n = 4 rats traités et 3 rats contrôles)<br />
Figure 2.11. Schéma <strong>de</strong> la procédure suivie durant le protocole expérimental <strong>de</strong> suivi <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
paramètres urinaires (rats traités pendant 35 jours).<br />
35<br />
121
L’analyse <strong><strong>de</strong>s</strong> résultats obtenus dans le protocole précé<strong>de</strong>nt montre que le<br />
dosage <strong><strong>de</strong>s</strong> paramètres urinaires permet <strong>de</strong> détecter, dès le 3 ème jour, les atteintes<br />
structurelles et fonctionnelles <strong>de</strong> l’épithélium tubulaire proximal développées suite à<br />
l’administration <strong><strong>de</strong>s</strong> AA. Dès lors, un protocole <strong>de</strong> suivi plus rapproché <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
paramètres urinaires est effectué afin d’étudier l’évolution individuelle au cours du<br />
temps <strong><strong>de</strong>s</strong> altérations structurelles et fonctionnelles occasionnées chez <strong><strong>de</strong>s</strong> rats<br />
intoxiqués aux AA pendant 35 jours (Fig. 2.11, protocole détaillé dans le chapitre<br />
méthodologie § 2.2.1 page 77).<br />
2.2.1. Paramètres reflétant l’atteinte fonctionnelle<br />
Chez un rat contrôle représentatif du groupe, l’excrétion urinaire <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines<br />
totales et <strong>de</strong> l’albumine n’est pas différente <strong>de</strong> la valeur basale correspondant au jour<br />
0 (Fig. 2.12A). Par contre, chez quatre rats traités aux AA, la protéinurie augmente<br />
rapi<strong>de</strong>ment entre le jour 3 et 7, retourne à une valeur basale au jour 10 et ensuite<br />
s’élève progressivement (Fig. 2.13). L’albuminurie augmente autour du jour 5 (du<br />
jour 3 au jour 7), et présente ensuite une évolution variable en fonction <strong><strong>de</strong>s</strong> rats (Fig.<br />
2.13). Le suivi <strong>de</strong> ces <strong>de</strong>ux paramètres biologiques indique que l’atteinte<br />
fonctionnelle <strong>de</strong> l’épithélium tubulaire proximal semble se développer en <strong>de</strong>ux<br />
phases.<br />
2.2.2. Paramètres reflétant l’atteinte structurelle<br />
Dans le groupe <strong><strong>de</strong>s</strong> rats contrôles, aucune modification par rapport aux<br />
valeurs du jour 0 n’est observée pour la NAG, l’α-GST, la LAP et la NEP (Fig. 2.12B-<br />
C). Afin d’étudier l’intégrité <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules tubulaires, <strong>de</strong>ux enzymes cytosoliques, la<br />
NAG et l’α-GST sont dosées. Comme observé précé<strong>de</strong>mment pour la protéinurie et<br />
l’albuminurie, l’enzymurie NAG ainsi que l’enzymurie α-GST augmentent rapi<strong>de</strong>ment<br />
au cours <strong><strong>de</strong>s</strong> premiers jours d’injection <strong><strong>de</strong>s</strong> rats aux AA, avec un maximum aux jours<br />
5 et 7. Ensuite, elles diminuent et finalement s’élèvent plus progressivement au cours<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>de</strong>rniers jours (Fig. 2.14).<br />
122
De même, les enzymuries LAP et NEP évoluent selon un profil semblable à<br />
celui <strong>de</strong> la NAG et <strong>de</strong> l’α-GST. En effet, dans le groupe <strong><strong>de</strong>s</strong> rats traités aux AA, une<br />
libération précoce <strong>de</strong> la LAP et <strong>de</strong> la NEP s’observe dans un premier temps aux<br />
jours 3 et 7, elle est suivie par une excrétion progressive dans un <strong>de</strong>uxième temps<br />
(Fig. 2.15).<br />
Ces enzymes, marqueurs <strong>de</strong> l’intégrité cellulaire et <strong>de</strong> la bordure en brosse,<br />
suggèrent donc que la structure tubulaire est altérée par le traitement aux AA et que<br />
ces lésions structurelles évoluent en <strong>de</strong>ux phases distinctes.<br />
Paramètres urinaires (mg/mmol créatinine)<br />
A<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
Protéines urinaires<br />
Albumine urinaire<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
C<br />
Temps (jours)<br />
Activité LAP urinaire<br />
(µmol AMC produit/mmol créatinine/h)<br />
200<br />
150<br />
100<br />
50<br />
0<br />
LAP urinaire<br />
NEP urinaire<br />
NAG urinaire (mU/mmol créatinine)<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Temps (jours)<br />
Figure 2.12. Evolution au cours du temps <strong>de</strong> paramètres urinaires chez un même rat<br />
contrôle représentatif aux jours 0, 3, 5, 7, 10, 13, 15, 18, 22, 24, 27, 31 et 35. A : Protéinurie<br />
totale (cercle noir) et albuminurie (cercle gris). B : N-acetyl-β-D-glucosaminidase (NAG, carré<br />
noir) et alpha-glutathione S-transférase (α-GST, carré gris). C : Leucine aminiopeptidase<br />
(LAP, triangle noir) et endopeptidase neutre (NEP, triangle gris). AMC: 7-amino-4-méthylcoumarine.<br />
B<br />
5000<br />
4000<br />
3000<br />
2000<br />
1000<br />
0<br />
Temps (jours)<br />
NAG urinaire<br />
α-GST urinaire<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
250<br />
200<br />
150<br />
100<br />
50<br />
0<br />
NEP urinaire (µg/mmol créatinine)<br />
140<br />
120<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
αα-GST αα-GST urinaire (µg/mmol créatinine)<br />
123
Paramètres urinaires (mg/mmol créatinine)<br />
Paramètres urinaires (mg/mmol créatinine)<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Temps (jours)<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Temps (jours)<br />
Protéines urinaires<br />
Albumine urinaire<br />
Rat 1 Rat 2<br />
Paramètres urinaires (mg/mmol créatinine)<br />
Paramètres urinaires (mg/mmol créatinine)<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Temps (jours)<br />
Rat 3 Rat 4<br />
Figure 2.13. Evolution au cours du temps <strong>de</strong> la protéinurie totale (cercle noir) et <strong>de</strong><br />
l’albuminurie (cercle gris) chez quatre rats traités aux AA.<br />
NAG urinaire (mU/mmol créatinine)<br />
NAG urinaire (mU/mmol créatinine)<br />
5000<br />
120<br />
4000<br />
alpha-GST<br />
100<br />
3000<br />
80<br />
urinaire<br />
60<br />
2000<br />
(µg/mmol<br />
40<br />
1000<br />
20<br />
créatinine)<br />
0<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Temps (jours)<br />
5000 250<br />
4000<br />
200<br />
alpha-GST<br />
3000<br />
150<br />
urinaire<br />
2000<br />
100<br />
(µg/mmol<br />
1000<br />
50<br />
créatinine)<br />
0<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Temps (jours)<br />
140<br />
0<br />
0<br />
Figure 2.14. Evolution au cours du temps <strong><strong>de</strong>s</strong> enzymuries NAG (carré noir) et alpha-GST<br />
(carré gris) chez quatre rats traités aux AA.<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
NAG urinaire<br />
alpha-GST urinaire<br />
NAG urinaire (mU/mmol créatinine)<br />
NAG urinaire (mU/mmol créatinine)<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
0<br />
Temps (jours)<br />
Rat 1 Rat 2<br />
5000<br />
120<br />
4000<br />
alpha-GST<br />
100<br />
3000<br />
80<br />
urinaire<br />
60<br />
2000<br />
(µg/mmol<br />
40<br />
1000<br />
20<br />
créatinine)<br />
0<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Temps (jours)<br />
Rat 3 Rat 4<br />
5000 140<br />
120<br />
4000<br />
alpha-GST<br />
100<br />
3000<br />
80<br />
urinaire<br />
60<br />
2000<br />
(µg/mmol<br />
40<br />
1000<br />
20<br />
créatinine)<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Temps (jours)<br />
140<br />
0<br />
0<br />
124
Activité LAP urinaire<br />
Activité LAP urinaire<br />
(µmol AMC produit/mmol créatinine/h)<br />
(µmol AMC produit/mmol créatinine/h)<br />
200<br />
150<br />
100<br />
50<br />
0<br />
200<br />
150<br />
100<br />
50<br />
0<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Temps (jours)<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Temps (jours)<br />
Figure 2.15. Evolution au cours du temps <strong><strong>de</strong>s</strong> enzymuries LAP (triangle noir) et NEP<br />
(triangle gris) chez quatre rats traités aux AA.<br />
2.3. Protocole court : rats traités pendant 5 jours<br />
Acclimatation<br />
J -7<br />
250<br />
200<br />
150<br />
100<br />
50<br />
0<br />
LAP urinaire<br />
NEP urinaire<br />
Rat 1 Rat 2<br />
NEP urinaire (µg/mmol créatinine)<br />
Activité LAP urinaire<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Temps (jours)<br />
Rat 3 Rat 4<br />
250<br />
200<br />
150<br />
100<br />
50<br />
0<br />
NEP urinaire (µg/mmol créatinine)<br />
Activité LAP urinaire<br />
0 1 2 3 4 5<br />
Jours <strong>de</strong> sacrifice (n = 6 rats / groupe)<br />
Figure 2.16. Schéma <strong>de</strong> la procédure suivie durant le protocole expérimental court (rats<br />
traités pendant 5 jours).<br />
Les résultats <strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>de</strong>ux protocoles précé<strong>de</strong>nts montrent que l’administration<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> AA induit <strong><strong>de</strong>s</strong> altérations structurelles et fonctionnelles <strong>de</strong> l’épithélium tubulaire<br />
proximal dès le 3 ème jour d’injection. Par conséquent, un protocole <strong>de</strong> plus courte<br />
(µmol AMC produit/mmol créatinine/h)<br />
(µmol AMC produit/mmol créatinine/h)<br />
200<br />
150<br />
100<br />
50<br />
0<br />
200<br />
150<br />
100<br />
50<br />
0<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Temps (jours)<br />
PERIODE D’INJECTION<br />
(10 mg/kg AA ou solvant, 1 fois/ jour)<br />
250<br />
200<br />
150<br />
100<br />
50<br />
0<br />
250<br />
200<br />
150<br />
100<br />
50<br />
0<br />
NEP urinaire (µg/mmol créatinine)<br />
NEP urinaire (µg/mmol créatinine)<br />
125
durée est réalisé afin d’étudier les premiers changements structurels et/ou<br />
fonctionnels <strong>de</strong> l’épithélium tubulaire proximal après l’intoxication aux AA (Fig. 2.16,<br />
protocole détaillé dans le chapitre méthodologie § 2.2.2. page 77).<br />
2.3.1. Paramètres biologiques<br />
La mesure du poids <strong><strong>de</strong>s</strong> rats avant chaque sacrifice montre que les rats traités<br />
aux AA et les rats contrôles ont un poids moyen équivalent et stable sur la pério<strong>de</strong><br />
<strong>de</strong> 5 jours (Fig. 2.17). Pour réaliser ce protocole court, les rats choisis ont un poids<br />
plus élevé (± 100 g) que ceux <strong><strong>de</strong>s</strong> protocoles longs, afin <strong>de</strong> se situer en <strong>de</strong>hors <strong>de</strong><br />
leur phase <strong>de</strong> croissance.<br />
Figure 2.17. Poids moyen <strong><strong>de</strong>s</strong> rats contrôles (colonne grise) et traités aux AA (colonne<br />
noire) aux jours 1, 2, 3, 4 et 5. Les résultats représentent la moyenne ± SEM (n = 6).<br />
2.3.1.1. Créatinine plasmatique<br />
Poids <strong><strong>de</strong>s</strong> rats (g)<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
Contrôle<br />
AA<br />
0 1 2 3 4 5<br />
Temps (jours)<br />
La créatinine plasmatique augmente significativement aux jours 1 et 3 pour les<br />
rats traités aux AA et évolue jusqu’au jour 5 (Fig. 2.18). Cette élévation du taux <strong>de</strong><br />
créatinine plasmatique suggère que les rats injectés aux AA ont développé une<br />
insuffisance rénale aiguë transitoire.<br />
126
Créatinine plasmatique (µmol/l)<br />
Figure 2.18. Créatinine plasmatique <strong><strong>de</strong>s</strong> rats contrôles (colonne grise) et <strong><strong>de</strong>s</strong> rats traités aux<br />
AA (colonne noire) aux jours 1, 2, 3, 4 et 5. Les résultats représentent la moyenne ± SEM (n<br />
= 6). Les significations statistiques correspon<strong>de</strong>nt à * P < 0,05 et ** P < 0,01 par<br />
comparaison aux valeurs contrôles.<br />
2.3.1.2. Protéines et enzymes urinaires<br />
Protéinurie et albuminurie<br />
Les rats traités aux AA et les rats contrôles ont un débit urinaire comparable<br />
durant les 5 jours (Fig. 2.19). Par contre, l’excrétion urinaire <strong>de</strong> protéines totales<br />
augmente significativement pour les rats traités aux AA dès le 1 er jour et évolue<br />
rapi<strong>de</strong>ment jusqu’au jour 5 (Fig. 2.20A). Cette protéinurie indique donc qu’une seule<br />
injection d’AA suffit à induire <strong><strong>de</strong>s</strong> altérations <strong>de</strong> l’épithélium tubulaire proximal.<br />
Débit urinaire (µl/min)<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0<br />
Contrôle<br />
AA<br />
*<br />
1 2 3 4 5<br />
Contrôle<br />
AA<br />
*<br />
Temps (jours)<br />
0 1 2 3 4 5<br />
Figure 2.19. Débit urinaire <strong><strong>de</strong>s</strong> rats contrôles (colonne grise) et <strong><strong>de</strong>s</strong> rats traités aux AA<br />
(colonne noire) aux jours 1, 2, 3, 4 et 5. Les résultats représentent la moyenne ± SEM (n = 6,<br />
excepté au jour 3 dans le groupe <strong><strong>de</strong>s</strong> rats traités aux AA n = 5). La signification statistique<br />
correspond à * P < 0,05 par comparaison aux valeurs contrôles.<br />
**<br />
Temps (jours)<br />
127
Protéinurie totale (mg/ mmol créatinine)<br />
A B<br />
600<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
Contrôle<br />
AA<br />
*<br />
0 1 2 3 4 5<br />
C<br />
**<br />
Temps (jours)<br />
Rapport albuminurie/protéinurie totale (%)<br />
**<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
**<br />
**<br />
Contrôle<br />
AA<br />
0 1 2 3 4 5<br />
Temps (jours)<br />
Figure 2.20. Protéinurie totale (A), albuminurie (B) et rapport albuminurie/protéinurie totale<br />
(C) chez les rats contrôles (colonne grise) et les rats traités aux AA (colonne noire) aux jours<br />
1, 2, 3, 4 et 5. Les résultats représentent la moyenne ± SEM (n = 6, excepté au jour 3 dans<br />
le groupe <strong><strong>de</strong>s</strong> rats traités aux AA n = 5). Les significations statistiques correspon<strong>de</strong>nt à * P <<br />
0,05 et ** P < 0,01 par comparaison aux valeurs contrôles.<br />
De même, l’excrétion urinaire d’albumine augmente <strong>de</strong> manière significative à<br />
partir du jour 2 jusqu’au jour 5 et présente un niveau maximal très élevé au jour 4<br />
(Fig. 2.20B). Le taux d’albumine plasmatique <strong><strong>de</strong>s</strong> rats traités et <strong><strong>de</strong>s</strong> rats contrôles est<br />
comparable et stable sur la durée <strong>de</strong> ce protocole court. L’albuminurie résulte donc<br />
d’un défaut précoce <strong>de</strong> la réabsorption tubulaire.<br />
Le rapport albumine urinaire/protéines urinaires totales est constant pendant<br />
les 5 jours pour les rats contrôles (Fig. 2.20C). Par contre, pour les rats traités aux<br />
AA, une augmentation significative <strong>de</strong> ce rapport albuminurie/protéinurie totale est<br />
observée dès le jour 2 jusqu’au jour 5 ; cette élévation est doublée au jour 4<br />
atteignant un niveau d’environ 80%.<br />
Albuminurie (mg/mmol créatinine)<br />
600<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
**<br />
0<br />
**<br />
Contrôle<br />
AA<br />
0 1 2 3 4 5<br />
**<br />
**<br />
**<br />
**<br />
Temps (jours)<br />
**<br />
**<br />
128
Afin d’i<strong>de</strong>ntifier les protéines urinaires excrétées, les échantillons urinaires<br />
sont séparés par gel d’électrophorèse. Les profils électrophorétiques obtenus ne<br />
montrent aucune différence entre les rats contrôles et traités aux AA au jour 1 (Fig.<br />
2.21A). Par contre, l’intensité <strong><strong>de</strong>s</strong> ban<strong><strong>de</strong>s</strong> correspondant à l’albumine et à la<br />
transferrine est augmentée chez les rats traités aux AA pour les autres temps du<br />
protocole (Fig. 2.21B-E). Aux jours 1, 2 et 3, tous les rats injectés aux AA n’ont pas<br />
les mêmes profils protéiques, reflétant une hétérogénéité dans la réponse <strong><strong>de</strong>s</strong> rats<br />
aux AA. Cependant, aux jours 4 et 5, les rats semblent être intoxiqués par les AA<br />
avec la même intensité. Les résultats obtenus sur les gels d’électrophorèse<br />
confirment les dosages décrits précé<strong>de</strong>mment. L’α2-microglobuline et la β2-<br />
microglobuline sont présentes dans les rats contrôles et traités aux AA.<br />
250<br />
150<br />
100<br />
75<br />
50<br />
37<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
A B<br />
AA Contrôle<br />
Figure 2.21. Electrophorèses <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines urinaires <strong>de</strong> 2 ou 3 rats contrôles et <strong>de</strong> 6 rats<br />
traités aux AA aux jours 1 (A), 2 (B), 3 (C), 4 (D) et 5 (E). Le standard <strong>de</strong> poids moléculaire<br />
est annoté à la gauche <strong><strong>de</strong>s</strong> gels et certaines protéines sont indiquées à droite. (Gels Tris-HCl<br />
4-20%).<br />
36<br />
28<br />
17<br />
84<br />
AA Contrôle<br />
C AA Contrôle<br />
AA Contrôle D<br />
250<br />
150<br />
100<br />
75<br />
50<br />
37<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
E<br />
250<br />
150<br />
100<br />
75<br />
50<br />
37<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
AA Contrôle<br />
Transferrine<br />
Albumine<br />
Transferrine<br />
Albumine<br />
α 2 -microglobuline<br />
β 2 -microglobuline<br />
α 2 -microglobuline<br />
β 2 -microglobuline<br />
129
Enzymurie NAG<br />
L’excrétion urinaire <strong>de</strong> la NAG est significativement élevée aux jours 2, 4 et 5<br />
(Fig. 2.22). Cette augmentation s’intensifie aux jours 4 et 5. L’activité urinaire NAG<br />
présente la même évolution que l’albuminurie (Fig. 2.20B), le rapport<br />
albumine/protéines urinaires totales (Fig. 2.20C) et la créatinine plasmatique (Fig.<br />
2.18). Ces données indiquent que la perte d’intégrité <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules tubulaires induit<br />
d’une part, une excrétion urinaire <strong>de</strong> protéines (principalement <strong>de</strong> l’albumine) et<br />
d’autre part, une altération <strong>de</strong> la fonction rénale menant à une insuffisance rénale<br />
aiguë transitoire.<br />
NAG urinaire (mU/mmol créatinine)<br />
2000<br />
1800<br />
1600<br />
1400<br />
1200<br />
1000<br />
0 1 2 3 4 5<br />
Temps (jours)<br />
Figure 2.22. Enzymurie NAG pour les rats contrôles (colonne grise) et les rats traités aux AA<br />
(colonne noire) aux jours 1, 2, 3, 4 et 5. Les résultats représentent la moyenne ± SEM (n = 6,<br />
excepté au jour 3 pour les rats traités aux AA n = 5). La signification statistique correspond à<br />
** P < 0,01 par comparaison aux valeurs contrôles.<br />
2.3.1.3. Relations structure-fonction<br />
800<br />
600<br />
400<br />
200<br />
0<br />
Contrôle<br />
AA<br />
**<br />
Les corrélations entre la structure et la fonction sont établies à l’ai<strong>de</strong> <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
données biochimiques individuelles pour chaque temps. L’enzymurie NAG est<br />
étroitement corrélée à la protéinurie (Fig. 2.23A), l’albuminurie (Fig. 2.23B) ainsi que<br />
la créatinine plasmatique (Fig. 2.23C). Ces résultats sont similaires à ceux observés<br />
dans le protocole <strong>de</strong> 35 jours (voir le chapitre résultats § 2.1.1.3 page 115-116).<br />
**<br />
**<br />
130
Protéinurie totale (mg/mmol créatinine)<br />
A B<br />
600<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
0 500 1000 1500 2000 2500<br />
NAG urinaire (mU/mmol créatinine)<br />
C<br />
r = 0.7084 (Spearman)<br />
P < 0.0001<br />
Figure 2.23. Corrélations structure-fonction entre l’enzymurie NAG et la protéinurie totale<br />
(A), l’albuminurie (B) et la créatinine plasmatique (C) pour les rats traités aux AA (n = 30).<br />
2.3.2. Observations histologiques<br />
2.3.2.1. Histologie conventionnelle<br />
Créatinine plasmatique (µmol/l)<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
100<br />
r = 0.81 (Spearman)<br />
0<br />
P < 0.0001<br />
0 500 1000 1500 2000 2500<br />
0<br />
r = 0.50 (Spearman)<br />
P = 0.0044<br />
0 500 1000 1500 2000<br />
NAG urinaire (mU/mmol créatinine)<br />
NAG urinaire (mU/ mmol créatinine)<br />
La coloration au PAS <strong><strong>de</strong>s</strong> coupes <strong>de</strong> tissu rénal <strong><strong>de</strong>s</strong> rats contrôles montre que<br />
la bordure en brosse est préservée au niveau <strong>de</strong> la membrane apicale <strong><strong>de</strong>s</strong> tubules<br />
proximaux et que la membrane basale est bien délimitée (Fig. 2.24A). Dès le premier<br />
jour d’exposition aux AA, un gonflement <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules tubulaires proximales est<br />
observé (Fig. 2.24B). Ensuite, dès le <strong>de</strong>uxième jour <strong>de</strong> traitement aux AA, la<br />
déstructuration <strong>de</strong> l’épithélium proximal progresse rapi<strong>de</strong>ment, la bordure en brosse<br />
apicale disparaît partiellement et les débris cellulaires ainsi que les cellules<br />
nécrotiques sont observées dans la lumière <strong><strong>de</strong>s</strong> tubules proximaux (Fig. 2.24C).<br />
Albuminurie (mg/mmol créatinine)<br />
800<br />
700<br />
600<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
131
Finalement, la perte <strong>de</strong> bordure en brosse est partielle ou complète au jour 3 (Fig.<br />
2.24D) et <strong>de</strong>vient complète aux jours 4 et 5 (Fig. 2.24E-F). L’épithélium tubulaire<br />
proximal est totalement détruit, quelques cellules ou noyaux seulement restent<br />
attachés à la membrane basale et la lumière tubulaire est remplie <strong>de</strong> débris<br />
cellulaires et cellules nécrotiques provocant l’obstruction <strong><strong>de</strong>s</strong> tubules proximaux (Fig.<br />
2.24E-F).<br />
Ces observations sont compatibles avec une nécrose tubulaire aiguë précoce<br />
décelée dès le <strong>de</strong>uxième jour d’administration <strong><strong>de</strong>s</strong> AA, <strong>de</strong>venant massive aux jours 4<br />
et 5.<br />
A: Contrôle – Jour 1 B: AA – Jour 1 C: AA – Jour 2<br />
D: AA – Jour 3<br />
#<br />
#<br />
*<br />
E: AA – Jour 4<br />
Figure 2.24. Coloration à l’aci<strong>de</strong> periodique <strong>de</strong> Schiff (PAS) <strong><strong>de</strong>s</strong> coupes <strong>de</strong> rein <strong>de</strong> rats<br />
contrôles au jour 1 (A) ainsi que <strong>de</strong> rats traités aux AA aux jours 1, 2, 3, 4 et 5 (B-F).<br />
Gonflement <strong>de</strong> la cellule tubulaire (flèche), cellules nécrotiques (*), fragments cellulaires (#).<br />
Grossissement 400 × pour A-F et 80 × pour G-H.<br />
2.3.2.2. Immunomarquage <strong>de</strong> l’endopeptidase neutre<br />
#<br />
G: AA – Jour 4 (80 ×)<br />
H: AA – Jour 5 (80 ×)<br />
Afin d’examiner plus précisément la bordure en brosse <strong><strong>de</strong>s</strong> tubules proximaux,<br />
le marquage immunohistochimique <strong>de</strong> la NEP est effectué sur les coupes <strong>de</strong> tissu<br />
#<br />
*<br />
*<br />
*<br />
F: AA – Jour 5<br />
#<br />
*<br />
#<br />
*<br />
*<br />
132
énal. La NEP est présente sous forme granulaire à la bordure en brosse <strong>de</strong> la<br />
membrane apicale <strong><strong>de</strong>s</strong> tubules proximaux chez les rats contrôles (Fig. 2.25A). De<br />
même, la NEP est localisée <strong>de</strong> manière similaire chez les rats traités aux AA pendant<br />
1 jour (Fig. 2.25B). Par contre, une disparition partielle ou totale du marquage <strong>de</strong> la<br />
NEP s’observe aux jours 2 et 3 (Fig. 2.25C-D). Cette perte <strong>de</strong> NEP à la bordure en<br />
brosse est complète aux jours 4 et 5 (Fig. 2.25E-F). Ces résultats confirment les<br />
observations <strong><strong>de</strong>s</strong> coupes <strong>de</strong> tissu rénal colorées au PAS indiquant l’altération<br />
morphologique <strong>de</strong> l’épithélium tubulaire proximal.<br />
A: Contrôle – Jour 1 B: AA – Jour 1 C: AA – Jour 2<br />
D: AA – Jour 3<br />
E: AA – Jour 4<br />
F: AA – Jour 5<br />
G: AA – Jour 4 (200 ×)<br />
H: AA – Jour 5 (200 ×)<br />
Figure 2.25. Marquage immunohistochimique <strong>de</strong> l’endopeptidase neutre (NEP, flèche) sur<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> coupes <strong>de</strong> rein <strong>de</strong> rats contrôles au jour 1 (A) ainsi que <strong><strong>de</strong>s</strong> coupes <strong>de</strong> rein <strong>de</strong> rats<br />
traités aux AA aux jours 1, 2, 3, 4 et 5 (B-F). Grossissement 400 × pour A-F et 200 × pour G-<br />
H.<br />
Parallèlement à ces observations histologiques, la semi-quantification <strong>de</strong> ce<br />
marquage est réalisée. Les tubules proximaux présentant le marquage <strong>de</strong> la NEP à<br />
la bordure en brosse apicale sont considérés comme positifs. Par champ, les tubules<br />
proximaux positifs pour la NEP sont comptés et leur nombre est rapporté à la<br />
quantité totale <strong>de</strong> tubules. Cette analyse montre que le nombre <strong>de</strong> tubules proximaux<br />
positifs pour le marquage NEP est significativement diminué à partir du 2 ème jour<br />
d’exposition aux AA et évolue graduellement jusqu’au 5 ème jour (Fig. 2.26).<br />
133
Tubules proximaux NEP positifs (%)<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
Contrôle<br />
AA<br />
1 2 3<br />
Temps (jours)<br />
4 5<br />
Figure 2.26. Evaluation semi-quantitative du nombre <strong>de</strong> tubules proximaux positifs pour le<br />
marquage <strong>de</strong> la NEP à la bordure en brosse pour les rats contrôles (colonne grise) et traités<br />
aux AA (colonne noire) aux jours 1, 2, 3, 4 et 5. Les résultats représentent la moyenne ±<br />
SEM (n = 6). La signification statistique correspond à *** P < 0,0001 par comparaison aux<br />
valeurs contrôles.<br />
2.3.3. Détection <strong><strong>de</strong>s</strong> adduits d’ADN spécifiques aux aci<strong><strong>de</strong>s</strong><br />
<strong>aristolochiques</strong> dans le cortex rénal<br />
***<br />
L’analyse quantitative <strong><strong>de</strong>s</strong> adduits d’ADN spécifiques aux AA montre que les<br />
trois spots majeurs d’adduits d’ADN sont détectés dès le premier jour d’exposition<br />
aux AA et leur quantité est doublée au 2 ème jour (Fig. 2.27). Le taux total <strong>de</strong> ces<br />
adduits atteint un niveau maximum à partir du 2 ème jour et reste stable au cours <strong>de</strong> ce<br />
protocole. Le taux total maximum <strong><strong>de</strong>s</strong> adduits d’ADN spécifiques aux AA correspond<br />
à celui observé dans le protocole <strong>de</strong> 35 jours (Fig. 2.10).<br />
Les corrélations entre le taux total (somme <strong><strong>de</strong>s</strong> 3 spots) d’adduits d’ADN<br />
spécifiques aux AA et les paramètres biologiques sont établies à l’ai<strong>de</strong> <strong><strong>de</strong>s</strong> données<br />
biochimiques individuelles pour chaque temps. La quantité d’adduits d’ADN est<br />
corrélée avec l’enzymurie NAG. Cette corrélation est également étroite avec la<br />
protéinurie totale, l’albuminurie et la créatinine plasmatique (Fig. 2.28). Ces résultats<br />
suggèrent que le dysfonctionnement <strong>de</strong> la cellule tubulaire et, dans une moindre<br />
mesure, l’intégrité <strong>de</strong> la cellule sont étroitement corrélés au <strong>de</strong>gré d’intoxication induit<br />
par les AA.<br />
***<br />
***<br />
***<br />
134
Adduits par 10 8 Adduits par 10 nucléoti<strong><strong>de</strong>s</strong> normaux<br />
8 nucléoti<strong><strong>de</strong>s</strong> normaux<br />
1200<br />
1000<br />
800<br />
600<br />
400<br />
200<br />
0<br />
Spot 1 (dA-AAI)<br />
Spot 2 (dG-AAI)<br />
Spot 3 (dA-AAII)<br />
**<br />
1 2 3 4 5<br />
Temps (jours)<br />
Figure 2.27. Quantité d’adduits d’ADN spécifiques aux AA détectés dans le cortex rénal <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
rats traités aux AA aux jours 1, 2, 3, 4 et 5. Les résultats représentent la moyenne ± SEM (n<br />
= 6). Chaque échantillon d’ADN est post-marqué une seule fois. Spot 1 : 7-déoxyadénosine-<br />
N 6 -yl)-aristolactame I (dA-AAI : colonne noire), spot 2 : 7-(déoxyguanosine-N 2 -yl)aristolactame<br />
I (dG-AAI : colonne hachurée) et spot 3 : 7-(déoxyadénosine-N 6 -yl)aristolactame<br />
II (dA-AAII : colonne grise). La signification statistique correspond à ** P < 0,01<br />
par comparaison aux valeurs du jour 1.<br />
NAG urinaire (mU/mmol créatinine)<br />
Albumine urinaire (mg/mmol créatinine)<br />
3000<br />
2500<br />
2000<br />
1500<br />
1000 1000<br />
500<br />
r = 0.61 (Spearman)<br />
P = 0.0004<br />
0<br />
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600<br />
800<br />
700<br />
600<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
Adduits totaux par 10 8 Adduits totaux par 10 nucléoti<strong><strong>de</strong>s</strong> normaux<br />
8 nucléoti<strong><strong>de</strong>s</strong> normaux<br />
Figure 2.28. Corrélations entre la quantité totale (somme <strong><strong>de</strong>s</strong> 3 spots) d’adduits d’ADN<br />
spécifiques aux AA et l’enzymurie NAG (A), la protéinurie totale (B), l’albuminurie (C) et la<br />
créatinine plasmatique (D) pour les rats traités aux AA (n = 30).<br />
**<br />
Protéines urinaires (mg/mmol créatinine)<br />
Créatinine plasmatique (µmol/l)<br />
800<br />
A B<br />
C<br />
r = 0,75 (Spearman)<br />
P < 0.0001<br />
0<br />
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600<br />
Adduits totaux par 10 8 Adduits totaux par 10 nucléoti<strong><strong>de</strong>s</strong> normaux<br />
8 nucléoti<strong><strong>de</strong>s</strong> normaux<br />
600<br />
400<br />
200<br />
** **<br />
r = 0.68 (Spearman)<br />
P < 0.0001<br />
0<br />
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600<br />
120<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
D<br />
Adduits totaux par 10 8 Adduits totaux par 10 nucléoti<strong><strong>de</strong>s</strong> normaux<br />
8 nucléoti<strong><strong>de</strong>s</strong> normaux<br />
20<br />
0<br />
r = - 0.69 (Spearman)<br />
P < 0.0001<br />
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600<br />
Adduits totaux par 10 8 Adduits totaux par 10 nucléoti<strong><strong>de</strong>s</strong> normaux<br />
8 nucléoti<strong><strong>de</strong>s</strong> normaux<br />
135
2.4. Protocole <strong><strong>de</strong>s</strong>tiné à <strong><strong>de</strong>s</strong> étu<strong><strong>de</strong>s</strong> histologiques<br />
particulières : rats traités pendant 10 jours<br />
Les données biologiques et histologiques présentées montrent que la<br />
structure et la fonction <strong>de</strong> l’épithélium apical <strong><strong>de</strong>s</strong> tubules proximaux sont altérées. Un<br />
protocole <strong><strong>de</strong>s</strong>tiné à récolter <strong><strong>de</strong>s</strong> échantillons histologiques est réalisé afin d’une part<br />
d’étudier en immunohistochimie l’effet <strong><strong>de</strong>s</strong> AA sur l’expression <strong>de</strong> la mégaline et <strong>de</strong><br />
la cubiline, <strong>de</strong>ux protéines impliquées dans le processus d’endocytose médiée par<br />
récepteur et d’autre part d’observer en microscopie électronique les premières<br />
modifications cellulaires induites par les AA (Fig. 2.29).<br />
Acclimatation<br />
J -7<br />
Figure 2.29. Schéma <strong>de</strong> la procédure suivie durant le protocole <strong><strong>de</strong>s</strong>tiné à <strong><strong>de</strong>s</strong> étu<strong><strong>de</strong>s</strong><br />
histologiques particulières (rats traités pendant 10 jours).<br />
2.4.1. Paramètres biologiques<br />
PERIODE D’INJECTION<br />
(10 mg/kg AA ou solvant, 1 fois/ jour)<br />
0 1 2 3<br />
4 7 10<br />
Jours <strong>de</strong> sacrifice (n = 3 rats / groupe)<br />
La mesure <strong>de</strong> l’excrétion <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines urinaires confirme les résultats<br />
obtenus précé<strong>de</strong>mment. En effet, la protéinurie totale augmente à partir du jour 2<br />
jusqu’au jour 4 et finalement diminue jusqu’au jour dix chez les rats traités aux AA.<br />
Par contre, chez les rats contrôles, la quantité <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines urinaires excrétées<br />
reste stable au cours du temps. Les données obtenues correspon<strong>de</strong>nt aux<br />
observations précé<strong>de</strong>ntes et indiquent que les échantillons prélevés pour l’histologie<br />
sont représentatifs <strong><strong>de</strong>s</strong> altérations tubulaires proximales induites par les AA.<br />
136
2.4.2. Immunomarquages <strong>de</strong> la mégaline et <strong>de</strong> la cubiline<br />
Les marquages <strong>de</strong> la mégaline et <strong>de</strong> la cubiline sont réalisés afin d’obtenir <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
informations complémentaires concernant l’atteinte fonctionnelle <strong><strong>de</strong>s</strong> tubules<br />
proximaux.<br />
Le marquage <strong>de</strong> la mégaline s’observe à la bordure en brosse <strong><strong>de</strong>s</strong> tubules<br />
proximaux pour les rats contrôles. Ce marquage est plus intense au niveau <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
tubules proximaux <strong><strong>de</strong>s</strong> segments S1 et S2 que du segment S3 (Fig. 2.30A & I). Chez<br />
les rats traités aux AA, l’expression <strong>de</strong> la mégaline au niveau du tissu rénal est<br />
partiellement ou totalement diminuée uniquement pour les tubules proximaux du<br />
segment S3 à partir du jour 2 jusqu’au jour 10 (Fig. 2.30 B-D). Par contre, le<br />
marquage <strong>de</strong> la mégaline n’est pas altéré pour les segments S1 et S2.<br />
A: Contrôle – Jour 4<br />
Mégaline<br />
B: AA – Jour 2 C: AA – Jour 4<br />
D: AA – Jour 10<br />
E: Contrôle – Jour 4 F: AA – Jour 2 G: AA – Jour 4<br />
H: AA – Jour 10<br />
I: Contrôle – Jour 4<br />
Mégaline<br />
Cubiline<br />
J: Contrôle – Jour 4<br />
Cubiline<br />
Figure 2.30. Marquages immunohistochimiques <strong>de</strong> la mégaline (A-D & I) et <strong>de</strong> la cubiline (E-<br />
H & J) chez les rats contrôles (A & E, flèche) et les rats traités aux AA aux jours 2 (B & F), 4<br />
(C & G) et 10 (D & H). Grossissement 400 × <strong>de</strong> A à H et 80 × <strong>de</strong> I à J.<br />
137
Le marquage <strong>de</strong> la cubiline est également plus intense à la membrane apicale<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> tubules proximaux <strong><strong>de</strong>s</strong> segments S1 et S2 qu’au niveau du segment S3 chez les<br />
rats contrôles (Fig. 2.30E & J). L’expression <strong>de</strong> la cubiline chez les rats exposés aux<br />
AA est réduite au niveau <strong>de</strong> l’épithélium apical <strong>de</strong> quelques ou plusieurs tubules<br />
proximaux du segment S3 à partir du jour 2 jusqu’au jour 10. Par contre, le<br />
marquage n’est pas modifié pour les segments tubulaires proximaux S1 et S2 (Fig.<br />
2.30F-H).<br />
Ces résultats indiquent donc que l’altération <strong>de</strong> la réabsorption <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines<br />
est notamment liée à l’absence <strong>de</strong> la mégaline et <strong>de</strong> la cubiline au niveau <strong>de</strong><br />
l’épithélium apical <strong><strong>de</strong>s</strong> tubules proximaux du segment S3.<br />
2.4.3. Microscopie électronique : résultats préliminaires<br />
L’étu<strong>de</strong> en microscopie électronique est réalisée afin d’obtenir <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
informations sur les premières lésions cellulaires induites par les AA. Tenant compte<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> résultats obtenus dans les protocoles précé<strong>de</strong>nts, le jour 2 est choisi pour les<br />
observations en microscopie électronique.<br />
Chez un rat contrôle, l’ultrastructure d’une partie du cortex rénal montre la<br />
présence <strong>de</strong> trois tubules proximaux et d’un tube distal. Le tube distal se distingue<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> tubules proximaux par l’absence <strong>de</strong> bordure en brosse, une lumière plus large et<br />
un contenu en organites cytoplasmiques moins important (Fig. 2.31A). L’organisation<br />
du contenu cytoplasmique et <strong>de</strong> la structure <strong>de</strong> la bordure en brosse permettent <strong>de</strong><br />
différencier les 3 segments proximaux (voir le chapitre introduction § 2.1, pages 21-<br />
22 et Fig. 7). Dans le segment S1, les mitochondries sont plus gran<strong><strong>de</strong>s</strong> et plus<br />
nombreuses et la bordure en brosse est plus longue que dans le segment S2. Dans<br />
le segment S3, les mitochondries sont beaucoup plus dispersées et moins<br />
nombreuses que dans les segments S1 et S2 (Fig. 2.31A).<br />
Chez ce rat contrôle, les tubes proximaux présentent une membrane basale<br />
régulière et une bordure en brosse à la membrane apicale. La bordure en brosse <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
cellules tubulaires proximales est constituée <strong>de</strong> microvillosités qui remplissent la<br />
lumière <strong><strong>de</strong>s</strong> tubules. Un grand nombre <strong>de</strong> vacuoles d’endocytose sont présentes au<br />
138
niveau <strong>de</strong> l’épithélium apical. Ces vacuoles sont vi<strong><strong>de</strong>s</strong> (<strong>de</strong> couleur blanche) ou<br />
remplies <strong>de</strong> matériel protéique. Au niveau <strong>de</strong> la membrane basale, <strong><strong>de</strong>s</strong> petites<br />
vacuoles s’observent également. Les lysosomes, contenus dans le cytoplasme, se<br />
distinguent par leur couleur noire ou grise en fonction du matériel qu’ils renferment<br />
(Fig. 2.31). Une cellule du segment S3 est présentée à la figure 2.31B ainsi qu’une<br />
bordure en brosse à la figure 2.31C.<br />
A (× 1100)<br />
BB<br />
S1<br />
D<br />
S2<br />
BB<br />
S3<br />
B (× 4400)<br />
Figure 2.31. Microscopie électronique obtenue chez un rat contrôle au jour 2.<br />
A: Trois tubules proximaux (segment S1, S2 et S3) et un tube distal (D). B: Cellule tubulaire<br />
proximale du segment S3. C: Microvillosités <strong>de</strong> la bordure en brosse (BB).<br />
Les grossissements sont indiqués entre parenthèses.<br />
Chez un rat traité pendant 2 jours aux AA, les cellules tubulaires proximales<br />
sont désorganisées, elles possè<strong>de</strong>nt une membrane basale moins régulière que<br />
celle du rat contrôle. La membrane basale apparaît dénudée à certains endroits (Fig.<br />
2.32A). La perte totale ou partielle <strong><strong>de</strong>s</strong> microvillosités <strong>de</strong> l’épithélium apical s’observe<br />
au niveau <strong><strong>de</strong>s</strong> tubules proximaux endommagés (Fig. 2.32A-B). Les vacuoles<br />
d’endocytose sont moins nombreuses et plus petites pour l’ensemble <strong><strong>de</strong>s</strong> tubules<br />
proximaux par comparaison avec le contrôle. La lumière tubulaire contient du<br />
matériel protéique, <strong><strong>de</strong>s</strong> débris cellulaires et <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules <strong><strong>de</strong>s</strong>quamées en apparence<br />
viable (Fig. 2.32C). La figure 2.32D montre une cellule tubulaire qui déverse son<br />
contenu cellulaire dans la lumière tubulaire.<br />
BB<br />
C (× 7000)<br />
BB<br />
139
A (× 1100)<br />
C (× 3000)<br />
BB<br />
BB<br />
DC<br />
DC<br />
B (× 4400)<br />
D (× 3000)<br />
Figure 2.32. Microscopie électronique obtenue chez un rat traité aux AA pendant 2 jours.<br />
A: Tubules proximaux altérés avec perte <strong>de</strong> bordure en brosse (BB) et présence <strong>de</strong> débris<br />
cellulaires (DC) dans la lumière du tubule. B: Cellules tubulaires désorganisées avec perte<br />
<strong>de</strong> la bordure en brosse. C: Cellules tubulaires contenant <strong><strong>de</strong>s</strong> débris cellulaires dans la<br />
lumière tubulaire. D: Cellule tubulaire éclatée avec perte <strong>de</strong> son contenu dans la lumière. Les<br />
grossissements sont indiqués entre parenthèses.<br />
Ces résultats préliminaires obtenus en microscopie électronique confirment<br />
que la structure cellulaire <strong><strong>de</strong>s</strong> tubules proximaux est déjà altérée après 2 jours<br />
d’intoxication aux AA. Ces données authentifient donc les anomalies structurelles et<br />
fonctionnelles observées dans les protocles précé<strong>de</strong>nts.<br />
BB<br />
DC<br />
BB<br />
BB<br />
140
CHAPITRE 5 : DISCUSSION ET CONCLUSIONS<br />
Les approches in vitro et in vivo <strong>de</strong> ce travail permettent d’explorer les<br />
évènements précoces <strong>de</strong> l’intoxication <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules tubulaires par les AA.<br />
1. Discussion et conclusion <strong>de</strong> l’approche in vitro<br />
Endocytose <strong>de</strong> protéines médiée par récepteur dans les cellules OK<br />
L’étu<strong>de</strong> sur la lignée cellulaire <strong>de</strong> rein d’opossum confirme que l’albumine et la<br />
β2-microglobuline sont réabsorbées dans les cellules OK par endocytose médiée par<br />
récepteur (Fig. 1.1 et Tableau 1.1) [Gekle M. et al., 1996; Schwegler J.S. et al.,<br />
1991]. Ces <strong>de</strong>ux protéines sont en compétition pour le même récepteur membranaire<br />
(Fig. 1.3) ; <strong>de</strong> plus, l’endocytose d’albumine entre également en compétition avec<br />
plusieurs autres protéines (Fig. 1.2). La majorité <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines testées sont décrites<br />
comme <strong><strong>de</strong>s</strong> ligands <strong>de</strong> la mégaline et <strong>de</strong> la cubiline (Tableau 2). Ceci suggère que la<br />
réabsorption <strong>de</strong> ces différentes protéines dans les cellules OK s’effectue par<br />
l’intermédiaire d’un complexe impliquant la mégaline et la cubiline, complexe localisé<br />
au niveau <strong>de</strong> la bordure en brosse <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules épithéliales du tubule proximal [Birn<br />
H. et al., 2000a; Christensen E.I. et al., 1998; Cui S. et al., 1996] mais également<br />
présent dans les cellules OK [Zhai X.Y. et al., 2000]. L’analyse immunoblot ainsi que<br />
l’observation <strong>de</strong> l’immunomarquage confirment que la mégaline est exprimée dans<br />
les cellules OK et localisée à la membrane cellulaire (Fig. 1.17 et Fig. 1.18). De plus,<br />
les observations en microscopie confocale réalisées après incubation en présence<br />
d’albumine-FITC montrent que l’albumine est colocalisée avec la mégaline dans un<br />
premier temps à la membrane plasmique <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules et ensuite dans les vésicules<br />
intracellulaires (Fig. 1.17).<br />
141
Inhibition <strong>de</strong> la réabsorption <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines et réversibilité <strong>de</strong> l’inhibition<br />
Comme le but recherché était d’obtenir spécifiquement les premiers signes <strong>de</strong><br />
la toxicité <strong><strong>de</strong>s</strong> AA dans <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules en culture sans une exposition prolongée à<br />
l’agent toxique, les cellules OK ont été exposées à <strong><strong>de</strong>s</strong> doses assez fortes d’AA<br />
pendant 24 h. Par conséquent, la dose d’AA utilisée dans cette étu<strong>de</strong> est<br />
approximativement <strong>de</strong> l’ordre d’une fois plus élevée que celle absorbée<br />
quotidiennement par les patientes atteintes <strong>de</strong> la CHN [Vanherweghem J.L. et al.,<br />
1993]. Cette exposition est reflétée par la détection d’adduits d’ADN spécifiques aux<br />
AA. D’autres indications semblent suggérer que les AA se concentrent dans la cellule<br />
tubulaire proximale par l’intermédiaire d’un transporteur d’anions organiques au<br />
niveau <strong>de</strong> la membrane basale (OAT1) qui échange <strong><strong>de</strong>s</strong> anions organiques comme<br />
le PAH (et AA) avec l’α-kétoglutarate [Hosoyamada M. et al., 1999]. Ce mécanisme<br />
<strong>de</strong> transport est lié au cotransport Na + /α-kétoglutarate localisé en parallèle et<br />
concentre les AA dans la cellule tubulaire proximale.<br />
L’exposition <strong><strong>de</strong>s</strong> monocouches <strong>de</strong> cellules OK pendant 24 h aux AA ou au<br />
CdCl2 inhibe la réabsorption d’albumine (Fig. 1.9) ; le mécanisme d’endocytose <strong>de</strong> la<br />
réabsorption <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines est altéré <strong>de</strong> la même manière pour les <strong>de</strong>ux conditions<br />
expérimentales (Fig. 1.4 et Fig. 1.7).<br />
Les effets observés suite à l’exposition <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules aux AA ou au CdCl2 ne<br />
proviennent pas d’une toxicité non spécifique puisque la morphologie cellulaire n’est<br />
apparemment pas modifiée (Fig. 1.11) ; <strong>de</strong> même, la viabilité cellulaire (Fig. 1.12 et<br />
Fig. 1.13) et la synthèse <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines (Fig. 1.14) semblent ne pas être altérées.<br />
De plus, l’absence d’inhibition du co-transport Na + /glucose (Fig. 1.15 et Tableau 1.2)<br />
suggère que la faible concentration intracellulaire <strong>de</strong> Na + est maintenue, dès lors la<br />
Na + /K + -ATPase reste certainement active dans les cellules OK qui ont été exposées<br />
aux AA ou au CdCl2.<br />
L’inhibition <strong>de</strong> la réabsorption d’albumine pourrait provenir d’une altération <strong>de</strong><br />
l’interaction entre le ligand et le récepteur à la surface cellulaire, d’une formation<br />
réduite <strong>de</strong> vésicules recouvertes d’un manteau <strong>de</strong> clathrine, d’anomalies <strong>de</strong> la<br />
circulation <strong><strong>de</strong>s</strong> vésicules intracellulaires, d’une réduction <strong>de</strong> la dissociation entre le<br />
ligand et le récepteur dans l’endosome, ou <strong>de</strong> changements dans le processus <strong>de</strong><br />
fusion entre l’endosome et le lysosome. Les inhibitions induites par les AA et le<br />
142
CdCl2 sont caractérisées par une réduction <strong>de</strong> la vitesse maximale (Vmax) sans<br />
modification <strong><strong>de</strong>s</strong> valeurs <strong>de</strong> l’affinité apparente (Km), indiquant que les AA et le CdCl2<br />
diminuent le nombre <strong>de</strong> récepteurs recyclés capables d’internaliser les protéines <strong>de</strong><br />
faible poids moléculaire. Ceci correspond en réalité à une réduction <strong>de</strong> la quantité <strong>de</strong><br />
récepteurs à la membrane plasmique, <strong>de</strong> leur internalisation ou <strong>de</strong> leur recyclage,<br />
sans changement <strong>de</strong> leur affinité (Tableau 1.1).<br />
Cependant, une différence frappante entre les AA et le CdCl2 est observée<br />
lorsque la réversibilité <strong>de</strong> l’inhibition est examinée (Fig.1.10). Quand les AA sont<br />
retirés du milieu <strong>de</strong> culture et que la pério<strong>de</strong> d’incubation est prolongée jusqu’à 6<br />
jours, la réabsorption d’albumine reste inhibée, suggérant une altération permanente<br />
du mécanisme d’endocytose. Par contre, le retrait du CdCl2 conduit à une<br />
récupération progressive, mais incomplète <strong>de</strong> la réabsorption <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines pendant<br />
la pério<strong>de</strong> <strong>de</strong> récupération <strong>de</strong> 6 jours. Donc, contrairement aux AA, le CdCl2 n’induit<br />
pas une altération permanente <strong>de</strong> la réabsorption <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines dans les cellules OK.<br />
Comme les cellules tubulaires concentrent et excrètent <strong><strong>de</strong>s</strong> xénobiotiques par<br />
différents mécanismes [Burckhardt G. et al., 2000], d’autres médicaments pris<br />
simultanément par les patientes atteintes <strong>de</strong> la CHN pourraient éventuellement<br />
influencer l’accumulation intracellulaire <strong><strong>de</strong>s</strong> AA. Cependant, les principaux composés<br />
contenus dans les gélules amaigrissantes (fenfluramine, diéthylproprion,<br />
acétazolami<strong>de</strong>), en présence ou non d’AA, ne modifient pas la réabsorption<br />
d’albumine (Fig. 1.19), suggérant que seuls les AA altèrent l’endocytose <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
protéines dans les cellules OK.<br />
Néphrotoxicité du cadmium et inhibition transitoire <strong>de</strong> l’endocytose<br />
Une caractéristique principale <strong>de</strong> la néphropathie induite par le cadmium est la<br />
réduction <strong>de</strong> la capacité <strong>de</strong> réabsorption du tubule proximal, se manifestant par une<br />
protéinurie, une phosphaturie, une glucosurie, une aminoacidurie et une polyurie<br />
hyperosmolaire [Adams R.G. et al., 1969; Ahn D.W. et al., 1995; Herak-Kramberger<br />
C.M. et al., 1996; Herak-Kramberger C.M. et al., 1998; Kim K.R. et al., 1990; Lee<br />
H.Y. et al., 1991; Thevenod F. et al., 1999]. Le cadmium interfère avec différents<br />
composés <strong>de</strong> cellules épithéliales incluant la dépolymérisation <strong><strong>de</strong>s</strong> microtubules<br />
[Sabolic I. et al., 2001; Sabolic I. et al., 2002] et l’inhibition <strong>de</strong> la Na + /K + -ATPase<br />
143
[Thevenod F. et al., 1999]. De plus, le cadmium diminue fortement l’activité et la<br />
quantité <strong>de</strong> H + -ATPase vacuolaire à la membrane apicale du tubule proximal, et<br />
dissipe les gradients <strong>de</strong> pH transmembranaires dans les vésicules d’endocytose du<br />
cortex rénal <strong>de</strong> rat. Ces effets peuvent induire une diminution <strong>de</strong> l’endocytose ainsi<br />
qu’une perte <strong><strong>de</strong>s</strong> invaginations d’endocytose et <strong><strong>de</strong>s</strong> vésicules subapicales dans les<br />
cellules tubulaires proximales. L’altération du processus d’endocytose peut être à<br />
l’origine d’une diminution <strong>de</strong> la réabsorption <strong><strong>de</strong>s</strong> microprotéines filtrées. Il en résulte<br />
une protéinurie tubulaire, et/ou une perturbation du recyclage <strong><strong>de</strong>s</strong> vésicules<br />
intracellulaires, conduisant à une perte <strong>de</strong> certains transporteurs spécifiques au<br />
niveau <strong>de</strong> la bordure en brosse [Herak-Kramberger C.M. et al., 1998].<br />
L’inhibition <strong>de</strong> l’acidification intravésiculaire induite par le cadmium dans les<br />
vésicules d’endocytose est complètement restaurée, suggérant un effet réversible du<br />
cadmium sur la H + -ATPase vacuolaire [Herak-Kramberger C.M. et al., 1998].<br />
Une autre étu<strong>de</strong> réalisée par Choi et collaborateurs montre qu’une exposition<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> monocouches <strong>de</strong> cellules OK à 100 µM <strong>de</strong> CdCl2 pendant 1 h inhibe<br />
l’endocytose <strong>de</strong> l’albumine médiée par récepteur en réduisant le nombre <strong>de</strong> sites <strong>de</strong><br />
liaison sans changement d’affinité pour la liaison du ligand, ni <strong>de</strong> dépendance au pH.<br />
Ces résultats suggèrent que l’inhibition est probablement due à une atteinte <strong>de</strong><br />
l’acidification <strong><strong>de</strong>s</strong> endosomes et à une diminution <strong>de</strong> la dissociation entre le ligand et<br />
le récepteur, altérant le recyclage du récepteur et l’efficacité globale du processus<br />
d’endocytose [Choi J.S. et al., 1999].<br />
Inhibition irréversible <strong>de</strong> l’endocytose induite par les aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong><br />
L’absence <strong>de</strong> récupération suite à l’exposition aux AA suggère que l’effet<br />
toxique est lié à une diminution prolongée d’une ou plusieurs protéines impliquées<br />
dans l’endocytose médiée par récepteur. Une telle toxicité pourrait être mise en<br />
évi<strong>de</strong>nce en mesurant la synthèse totale <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines. Néanmoins, cet effet ne<br />
représenterait qu’un faible pourcentage <strong>de</strong> la quantité totale <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines mesurées.<br />
Toutefois, l’évaluation <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong> la mégaline par analyse immunoblot dans<br />
les cellules exposées aux AA présente une diminution significative (~ 70 %) par<br />
rapport aux cellules exposées au DMSO (Fig. 1.18). Notons qu’une étu<strong>de</strong><br />
préliminaire montre que l’effet <strong><strong>de</strong>s</strong> AA sur l’expression <strong>de</strong> la mégaline s’observerait<br />
également pour d’autres protéines impliquées dans le processus d’endocytose<br />
144
médiée par récepteur comme la cubiline et le canal chlore ClC-5 localisé dans les<br />
endosomes. L’expression <strong>de</strong> ces <strong>de</strong>ux protéines est diminuée après exposition aux<br />
AA (voir Annexe 2, page 164) [Lebeau C. et al., 2003]. Par contre, les AA ne<br />
semblent pas modifier l’expression <strong>de</strong> la H + -ATPase vacuolaire [Lebeau C. et al.,<br />
2002].<br />
Adduits d’ADN spécifiques aux aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong><br />
Les 3 spots caractéristiques <strong><strong>de</strong>s</strong> adduits d’ADN spécifiques aux AA sont<br />
observés dans les cellules OK exposées aux AA (Fig. 1.16), mais pas dans les<br />
cellules contrôles, ni celles exposées au CdCl2. Le taux d’adduits d’ADN spécifiques<br />
aux AA augmente avec la concentration d’AA, reste stable 24 h après le retrait <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
AA et est toujours élevé après la pério<strong>de</strong> <strong>de</strong> 6 jours <strong>de</strong> récupération (Tableau 1.3).<br />
Ces observations sont en accord avec la persistance <strong><strong>de</strong>s</strong> adduits d’ADN spécifiques<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> AA dans différents organes <strong>de</strong> rats exposés aux AA [Bieler C.A. et al., 1997] et<br />
dans les tissus <strong>de</strong> patientes atteintes <strong>de</strong> CHN terminale [Nortier J.L. et al., 2000].<br />
L’inhibition <strong>de</strong> la réabsorption <strong>de</strong> protéines par les monocouches <strong>de</strong> cellules<br />
OK nécessite une incubation prolongée en présence <strong><strong>de</strong>s</strong> AA pendant au moins 14 h ;<br />
les adduits d’ADN spécifiques aux AA sont déjà détectés à ce temps. De plus, ces<br />
<strong>de</strong>ux altérations sont dose-dépendantes <strong>de</strong> manière similaire et persistent pendant la<br />
pério<strong>de</strong> <strong>de</strong> récupération en absence <strong><strong>de</strong>s</strong> AA. Pour cette raison, il est tentant <strong>de</strong><br />
suggérer l’existence d’une relation causale entre l’exposition aux AA, les dommages<br />
spécifiques <strong>de</strong> l’ADN, et les altérations cellulaires spécifiques au taux <strong>de</strong><br />
transcription, particulièrement au niveau <strong>de</strong> la diminution <strong>de</strong> la synthèse <strong>de</strong> la<br />
mégaline.<br />
Le métabolisme <strong><strong>de</strong>s</strong> AA est différent selon les espèces comme décrit pour les<br />
mammifères [Krumbiegel G. et al., 1987]. Chez l’homme, les métabolites urinaires<br />
sont l’aristolactame I et II, correspondant respectivement à l’AAI et AAII, provenant<br />
<strong>de</strong> la formation d’un cycle monoami<strong>de</strong> (lactame). Notons que les adduits d’ADN<br />
spécifiques aux AA, dérivés <strong><strong>de</strong>s</strong> aristolactames I et II, sont semblables chez l’homme<br />
et les cellules OK, suggérant un métabolisme comparable dans les cellules<br />
tubulaires proximales et OK.<br />
145
Conclusion<br />
Une exposition transitoire <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules OK, utilisées en tant que modèle <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
cellules épithéliales tubulaires proximales, aux AA ou au CdCl2 inhibe le mécanisme<br />
d’endocytose <strong>de</strong> réabsorption <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines. Cependant, alors que l’exposition au<br />
CdCl2 mène à un effet transitoire, l’exposition aux AA aboutit à une altération<br />
permanente <strong>de</strong> l’endocytose d’albumine sans signe <strong>de</strong> récupération même après six<br />
jours <strong>de</strong> retrait. Les AA induisent également dans les cellules OK la formation<br />
d’adduits d’ADN spécifiques aux AA ainsi qu’une diminution significative <strong>de</strong><br />
l’expression <strong>de</strong> la mégaline, un récepteur impliqué dans l’endocytose d’albumine.<br />
Cependant, le lien entre ces <strong>de</strong>ux phénomènes n’est pas établi.<br />
En conclusion, ces résultats suggèrent que la diminution <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong> la<br />
mégaline explique, du moins en partie, l’inhibition <strong>de</strong> la réabsorption <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines à<br />
la bordure en brosse <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules tubulaires proximales.<br />
146
2. Discussion et conclusion <strong>de</strong> l’approche in vivo<br />
Modèles expérimentaux animaux <strong>de</strong> la néphropathie aux aci<strong><strong>de</strong>s</strong><br />
<strong>aristolochiques</strong><br />
L’établissement d’un modèle expérimental <strong>de</strong> néphropathie aux AA<br />
reproduisant la CHN chez l’animal ne fut pas évi<strong>de</strong>nt. Précé<strong>de</strong>mment, la<br />
néphrotoxicité aiguë aux AA a été induite expérimentalement par voie orale ou<br />
intraveineuse. Après l’administration d’une seule dose d’AA (oral : 120-300 mg/kg et<br />
intraveineux : 38-110 mg/kg) à <strong><strong>de</strong>s</strong> rats, une nécrose tubulaire sévère a été observée<br />
en quelques jours [Mengs U., 1987]. Des rats traités par les AA (oral : 10-100 mg/kg)<br />
présentent endéans les 3 jours une augmentation du taux <strong>de</strong> créatinine plasmatique,<br />
<strong>de</strong> protéines urinaires et <strong>de</strong> l’enzymurie NAG [Mengs U. et al., 1993]. L’insuffisance<br />
rénale chronique et la fibrose interstitielle en association à l’altération <strong>de</strong> l’épithélium<br />
tubulaire proximal ont été induites pour la première fois chez <strong><strong>de</strong>s</strong> lapins blancs New<br />
Zealand par l’injection intra-péritonéale d’AA (0,1 mg/kg, 5 jours/semaines, pendant<br />
17-21 mois) [Cosyns J.P. et al., 2001]. Dans le modèle <strong>de</strong> rat utilisé dans ce travail,<br />
les lésions caractéristiques <strong>de</strong> la CHN, à savoir l’insuffisance rénale, l’atrophie<br />
tubulaire et la fibrose interstitielle, ont été reproduites par l'injection sous-cutanée<br />
d’AA (10 mg/kg/jour) pendant 35 jours à <strong><strong>de</strong>s</strong> rats Wistar mâles [Debelle F.D. et al.,<br />
2002]. Etant donné les altérations tubulaires proximales précoces dans les modèles<br />
expérimentaux, les auteurs suggèrent la possibilité que la fibrose interstitielle rénale<br />
soit précédée d’un dysfonctionnement tubulaire aigu [Cosyns J.P. et al., 2001;<br />
Debelle F.D. et al., 2002].<br />
Modèle <strong>de</strong> rat <strong>de</strong> la néphropathie aux aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong> : dose et étu<strong><strong>de</strong>s</strong><br />
préliminaires<br />
La pertinence du modèle ainsi que la dose d’AA utilisée sont déjà explicitées<br />
dans l’étu<strong>de</strong> expérimentale initiale [Debelle F.D. et al., 2002]. Le choix <strong>de</strong> la dose<br />
d’AA est basé sur l’observation clinique <strong><strong>de</strong>s</strong> patientes atteintes <strong>de</strong> la CHN [Nortier<br />
J.L. et al., 2000; Vanhaelen M. et al., 1994; Vanherweghem J.L. et al., 1993]. La<br />
quantité totale d’AA ingérée par certaines patientes était <strong>de</strong> 10 mg/kg <strong>de</strong> poids<br />
corporel, représentant une dose journalière <strong>de</strong> 0,29 mg d’AA/kg <strong>de</strong> poids corporel<br />
pendant 35 jours. La dose d’AA choisie dans le modèle expérimental est dès lors 30<br />
147
fois supérieure à celle <strong><strong>de</strong>s</strong> patientes atteintes <strong>de</strong> la CHN. La dose utilisée semble<br />
cruciale au développement <strong>de</strong> la néphrotoxicité. En effet, l’injection aux rats <strong>de</strong> 1<br />
mg/kg d’AA à la place <strong>de</strong> 10 mg/kg n’induit pas le développement <strong>de</strong> l’insuffisance<br />
rénale et <strong>de</strong> la fibrose interstitielle [Debelle F.D. et al., 2002].<br />
Au moment d’établir le modèle <strong>de</strong> rat <strong>de</strong> la néphropathie aux AA, <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
expériences préliminaires montraient déjà une augmentation progressive <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
paramètres urinaires et <strong>de</strong> la créatinine plasmatique dans les rats contrôles [Debelle<br />
F.D. et al., 2002]. Ces observations peuvent être mises en relation avec la<br />
croissance <strong><strong>de</strong>s</strong> animaux plutôt qu’à une toxicité éventuelle <strong>de</strong> la solution utilisée pour<br />
dissoudre les AA. En effet, les rats qui ont reçu <strong><strong>de</strong>s</strong> injections d’eau ou <strong>de</strong> la solution<br />
<strong>de</strong> PEG ne présentent pas d’altération <strong><strong>de</strong>s</strong> paramètres biochimiques et les<br />
échantillons <strong>de</strong> tissus rénaux sont normaux du point <strong>de</strong> vue histologique.<br />
Rats traités aux aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong> pendant 35 jours<br />
L’étu<strong>de</strong> <strong><strong>de</strong>s</strong> atteintes tubulaires proximales dans le modèle expérimental <strong>de</strong><br />
rat <strong>de</strong> la néphropathie aux AA montre que les AA induisent une augmentation <strong>de</strong> la<br />
créatinine plasmatique au jour 35 (Tableau 2.1), suggérant le développement d’une<br />
insuffisance rénale comme décrit précé<strong>de</strong>mment [Debelle F.D. et al., 2002].<br />
Dès le jour 3, l’enzymurie NAG est augmentée et <strong>de</strong>vient significative au jour<br />
10, reflétant une perte <strong>de</strong> l’intégrité <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules rénales (Tableau 2.1). De même, à<br />
partir du jour 7, les rats <strong>de</strong>viennent polyuriques (Tableau 2.1) ; parallèlement, une<br />
protéinurie <strong>de</strong> type tubulaire est observée, reflétant une altération <strong>de</strong> la réabsorption<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> protéines (Figure 2.2). L’analyse <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines urinaires indique que l’albumine<br />
ainsi que <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines <strong>de</strong> haut poids moléculaire sont excrétées durant les premiers<br />
jours, suivies <strong>de</strong> la libération <strong>de</strong> protéines <strong>de</strong> faible poids moléculaire à partir du jour<br />
10, suggérant l’altération <strong>de</strong> la fonction <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules tubulaires proximales (Tableau<br />
2.2 et Figure 2.3).<br />
Dans <strong><strong>de</strong>s</strong> conditions physiologiques normales, la filtration et la réabsorption<br />
d’albumine sont en équi<strong>libre</strong> et moins <strong>de</strong> 1% <strong>de</strong> l’albumine filtrée se retrouve dans<br />
l’urine définitive. Les états pathologiques caractérisés par une augmentation <strong>de</strong><br />
l’excrétion d’albumine peuvent provenir <strong>de</strong> <strong>de</strong>ux dysfonctionnements distincts (mise<br />
à part une surproduction pathologique <strong>de</strong> protéines) : soit une augmentation <strong>de</strong> la<br />
quantité filtrée par hyperperméabilité glomérulaire avec capacité <strong>de</strong> liaison à la<br />
membrane <strong>de</strong> la bordure en brosse dépassée (albuminurie d’origine glomérulaire),<br />
148
soit une capacité <strong>de</strong> réabsorption réduite sans changement <strong>de</strong> la quantité d’albumine<br />
filtrée (albumiurie d’origine tubulaire).<br />
Des corrélations sont établies entre un paramètre structurel, l’enzymurie NAG,<br />
et <strong><strong>de</strong>s</strong> données fonctionnelles, comme la protéinurie, l’albuminurie et la créatinine<br />
plasmatique (Fig. 2.4). Cette relation structure-fonction est confirmée par les<br />
corrélations existantes entre les scores histologiques <strong>de</strong> l’atteinte tubulo-interstitielle<br />
et les paramètres biochimiques fonctionnels comme la protéinurie (r = 0,77 ; n = 36 ;<br />
P < 0,0001), la créatinine plasmatique (r = 0,68 ; n = 36 ; P < 0,0001) et structurels<br />
comme l’enzymurie NAG (r = 0,66 ; n = 36 ; P < 0,0001). Les scores d’atrophie<br />
tubulaire sont aussi en étroite corrélation avec la protéinurie (r = 0,76 ; n = 36 ; P <<br />
0,0001), la créatinine plasmatique (r = 0,69 ; n = 36 ; P < 0,0001) et l’enzymurie NAG<br />
(r = 0,52 ; n = 36 ; P = 0,0002). Ces observations suggèrent que la perte d’intégrité<br />
cellulaire reflète l’atrophie progressive <strong>de</strong> l’épithélium tubulaire et que les atteintes<br />
structurelles <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules tubulaires entraînent <strong><strong>de</strong>s</strong> altérations fonctionnelles.<br />
Les observations histologiques (PAS, Fig. 2.7 et immunomarquage NEP, Fig.<br />
2.8) montrent une perte <strong>de</strong> la bordure en brosse <strong>de</strong> l’épithélium tubulaire proximal du<br />
jour 7 au jour 35. Ces résultats suggèrent que les altérations tubulaires proximales<br />
sont donc liées à la disparition <strong>de</strong> la bordure en brosse. Les lésions morphologiques<br />
commencent par une phase <strong>de</strong> nécrose, suivie par l’apparition progressive d’une<br />
atrophie tubulaire accompagnée par une fibrose interstitielle (Fig. 2.9).<br />
L’ensemble <strong><strong>de</strong>s</strong> résultats histologiques et biochimiques indiquent que<br />
l’administration <strong><strong>de</strong>s</strong> AA induit une altération précoce <strong>de</strong> l’épithélium tubulaire<br />
proximal.<br />
L’analyse plus détaillée <strong><strong>de</strong>s</strong> paramètres urinaires suivis pendant 35 jours<br />
montre que la protéinurie totale ainsi que les enzymuries NAG, α-GST, LAP et NEP<br />
augmentent déjà durant les 3 premiers jours <strong>de</strong> l’intoxication aux AA, retournent à<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> taux <strong>de</strong> base, et finalement s’élèvent à nouveau (Fig. 2.13-2.15). Ces résultats<br />
suggèrent que les atteintes tubulaires fonctionnelles et structurelles se déroulent en<br />
<strong>de</strong>ux phases : une phase aiguë précoce et une phase d’installation <strong><strong>de</strong>s</strong> lésions<br />
chroniques.<br />
149
Les différences dans la conception <strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>de</strong>ux protocoles longs (rats traités<br />
pendant 35 jours) doivent être prises en considération pour expliquer l’absence<br />
d’évolution biphasique dans le premier protocole long. Dans une première série<br />
d’expériences, les échantillons d’urines sont récoltés à <strong><strong>de</strong>s</strong> temps fixes avant le<br />
sacrifice <strong>de</strong> l’animal (jours : 3, 5, 7, 10, 14, 18 et 35 ; Fig. 2.1). Par contre, dans une<br />
<strong>de</strong>uxième série d’expériences, les récoltes d’urines individuelles sont analysées plus<br />
régulièrement tout au long du protocole (jours : 0, 3, 5, 7, 10, 13, 15, 18, 22, 24, 27,<br />
31 et 35 ; Fig. 2.11). En plus <strong>de</strong> l’hétérogénéité entre les échantillons provenant<br />
d’animaux différents d’un temps à l’autre, la probabilité <strong>de</strong> manquer <strong><strong>de</strong>s</strong> pics<br />
d’enzymurie et microprotéinurie est beaucoup plus gran<strong>de</strong> aux temps déterminés du<br />
protocole long que lors du suivi <strong>de</strong> l’évolution individuelle au cours du temps.<br />
Rats traités aux aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong> pendant 5 jours<br />
Le dysfonctionnement précoce <strong>de</strong> l’épithélium tubulaire proximal est reflété<br />
par la mise en évi<strong>de</strong>nce d’une protéinurie tubulaire (Fig. 2.20A) et d’une albuminurie<br />
(Fig. 2.20B) après un seul jour d’administration <strong><strong>de</strong>s</strong> AA. De même, l’altération<br />
structurelle se décèle dès le 2 ème jour <strong>de</strong> traitement aux AA par l’augmentation <strong>de</strong><br />
l’enzymurie NAG (Fig. 2.22). L’enzymurie NAG est en étroite corrélation avec la<br />
protéinurie, l’albuminurie et la créatinine plasmatique (Fig. 2.23).<br />
En accord avec les données biochimiques, les observations histologiques<br />
consistent en un gonflement <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules après le premier jour d’injection <strong><strong>de</strong>s</strong> AA,<br />
une perte progressive <strong>de</strong> la bordure en brosse dès le 2 ème jour, suivi 3 jours plus tard<br />
d’une nécrose (Fig. 2.24). La nécrose tubulaire provoque l’obstruction transitoire <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
tubules proximaux laquelle induit probablement une rétro-filtration entraînant<br />
l’augmentation <strong>de</strong> la pression au niveau du filtre glomérulaire avec passage<br />
d’albumine en gran<strong>de</strong> quantité. Une réduction <strong>de</strong> l’immunomarquage <strong>de</strong> la NEP<br />
s’observe au niveau du segment S3 du tubule proximal (Fig. 2.25-2.26). Cet enzyme<br />
est, en effet, localisée dans la partie droite (pars recta) du tubule proximal [Ronco P.<br />
et al., 1988]. De plus, l’expression <strong>de</strong> la mégaline et <strong>de</strong> la cubiline, <strong>de</strong>ux récepteurs<br />
impliqués dans l’endocytose médiée par récepteur, sont également réduites<br />
précocement (au jour 2) au niveau <strong>de</strong> l’épithélium apical du segment S3 (Fig. 2.30).<br />
La progression du processus d’atrophie tubulaire est tellement sévère que <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
150
étu<strong><strong>de</strong>s</strong> par immunomarquage <strong>de</strong> la mégaline et <strong>de</strong> la cubiline au-<strong>de</strong>là du jour 10 ne<br />
sont pas justifiées.<br />
La présence <strong>de</strong> lésions structurelles précoces est également confirmée par<br />
l’altération <strong>de</strong> la structure cellulaire <strong><strong>de</strong>s</strong> tubules proximaux observée en microscopie<br />
électronique après 2 jours d’intoxication aux AA (Fig. 2.32).<br />
Nos observations histologiques sont en accord avec les <strong><strong>de</strong>s</strong>criptions faites<br />
dans la littérature. D’un point <strong>de</strong> vue histologique, les lésions structurelles <strong>de</strong><br />
l’épithélium tubulaire proximal associées à une insuffisance rénale aiguë sont<br />
connues pour être d’origine ischémique ou toxique. Les cellules épithéliales du<br />
tubule proximal appartenant au segment S3 présentent <strong><strong>de</strong>s</strong> changements<br />
morphologiques précoces caractéristiques incluant la formation <strong>de</strong> vésicules à la<br />
membrane apicale, avec perte <strong>de</strong> la bordure en brosse [Bonventre J.V. et al., 2003].<br />
Adduits d’ADN spécifiques aux aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong><br />
Les signes précoces d’atteintes sont liés à une intoxication rapi<strong>de</strong> et intense<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> cellules. En effet, les adduits d’ADN spécifiques aux AA sont détectés dès le 1 er<br />
jour et atteignent un niveau maximum à partir du 2 ème jour (Fig. 2.27), lequel reste<br />
constant jusqu’au jour 35 (Fig. 2.10). La différence d’intensité <strong><strong>de</strong>s</strong> spots d’adduits<br />
d’ADN (spot 1 : dA-AAI et spot 3 : dA-AAII) observés sur le profil chromatographique<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> rats (Fig. 2.10) et <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules OK (Fig. 1.16) s’explique par le métabolisme<br />
propre à chaque espèce mais également par les proportions différentes d’aci<strong><strong>de</strong>s</strong><br />
<strong>aristolochiques</strong> I et II contenus dans la préparation d’aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong> utilisée<br />
pour l’étu<strong>de</strong> in vivo (AAI 40 % et AAII 60 %) et l’étu<strong>de</strong> in vitro (AAI 69 % et AAII 19<br />
%).<br />
Au cours <strong><strong>de</strong>s</strong> premiers jours d’intoxication, une augmentation significative <strong>de</strong> la<br />
créatinine plasmatique est observée, suggérant un dysfonctionnement rénal précoce<br />
(Fig. 2.18). De même, le taux d’adduits d’ADN spécifiques aux AA est corrélé avec<br />
l’enzymurie NAG, la protéinurie, l’albuminurie et la créatinine plasmatique (Fig. 2.28).<br />
Ces adduits d’ADN attestent <strong>de</strong> l’intoxication aux AA, et sont à mettre en parallèle<br />
avec la sévérité <strong><strong>de</strong>s</strong> atteintes fonctionnelles et structurelles <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules tubulaires<br />
proximales.<br />
151
Progression <strong>de</strong> l’atteinte rénale dans la néphropathie aux aci<strong><strong>de</strong>s</strong><br />
<strong>aristolochiques</strong><br />
Une étu<strong>de</strong> récente réalisée chez les rats montre qu’une insuffisance rénale<br />
aiguë est présente après 5 jours <strong>de</strong> traitement par voie orale aux AA (4 mg/jour).<br />
Cependant, une récupération <strong>de</strong> la fonction rénale s’observe après le retrait <strong><strong>de</strong>s</strong> AA<br />
pendant 14 jours [Liu M.C. et al., 2003]. Des signes <strong>de</strong> régénération tubulaire sont<br />
présents mais les dilatations tubulaires restent sévères. Dans une autre étu<strong>de</strong><br />
utilisant <strong><strong>de</strong>s</strong> souris FVB, les injections intra-péritonéales quotidiennes d’AA (5 mg/kg<br />
<strong>de</strong> poids corporel) pendant 2 semaines induisent une dégénérescence tubulaire et<br />
une insuffisance rénale. La régénération <strong>de</strong> l’épithélium tubulaire accompagnée<br />
d’une fibrose péri-tubulaire modérée s’observe 4 semaines après l’arrêt du traitement<br />
aux AA [Okada H. et al., 2003].<br />
Dans le modèle d’intoxication aux AA présenté dans ce travail, la progression vers<br />
une insuffisance rénale chronique et la fibrose interstitielle observée après une<br />
phase aiguë précoce est probablement liée à la poursuite <strong><strong>de</strong>s</strong> injections souscutanées<br />
d’AA aux rats pendant 35 jours.<br />
De manière intéressante, <strong><strong>de</strong>s</strong> observations similaires <strong>de</strong> nécrose tubulaire aiguë et<br />
d’une insuffisance rénale aiguë ont été décrites récemment chez un patient après<br />
l’ingestion d’AA pendant 10 jours [Lo S.H. et al., 2004].<br />
L’évolution biphasique <strong><strong>de</strong>s</strong> altérations structurelles et fonctionnelles induites<br />
par l’intoxication aux AA est en accord avec la capacité intrinsèque <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules<br />
épithéliales tubulaires survivantes à s’adapter à la perte <strong>de</strong> cellules adjacentes par<br />
dédifférenciation et prolifération [Bonventre J.V., 2003]. En effet, contrairement à<br />
d’autres organes comme le cœur ou le cerveau, le rein peut récupérer complètement<br />
d’une atteinte aiguë d’origine ischémique ou toxique susceptible <strong>de</strong> conduire à la<br />
défaillance totale et définitive <strong>de</strong> l’organe entier. Après une altération sévère, les<br />
cellules viables et non viables sont <strong><strong>de</strong>s</strong>quamées, laissant la membrane basale<br />
comme seule barrière entre l’ultrafiltrat et l’interstitium péritubulaire. Les débris<br />
cellulaires s’accumulant dans la lumière tubulaire, induisent une obstruction<br />
intratubulaire responsable <strong>de</strong> l’augmentation <strong>de</strong> la pression intratubulaire, processus<br />
à l’origine <strong>de</strong> la rétro-filtration glomérulaire.<br />
152
Conclusion<br />
L’intoxication aux AA induit dans le modèle <strong>de</strong> rat <strong>de</strong> la néphropathie aux AA<br />
une évolution biphasique <strong><strong>de</strong>s</strong> atteintes morphologiques et fonctionnelles au niveau<br />
<strong>de</strong> l’épithélium tubulaire proximal. Les défauts <strong>de</strong> réabsorption par endocytose<br />
médiée par récepteur et les anomalies structurelles du segment S3 du tubule<br />
proximal sont précoces (dès les 3 premiers jours d’exposition aux AA), reflétant une<br />
phase aiguë d’atteinte tubulaire proximale.<br />
Ces observations pourraient expliquer le syndrome <strong>de</strong> Fanconi décrit dans certaines<br />
formes d’intoxication aux AA chez l’homme [Krumme B. et al., 2001].<br />
153
3. Conclusion générale et perspectives<br />
Les <strong>de</strong>ux approches, in vivo et in vitro, sont complémentaires mais comportent<br />
chacune <strong><strong>de</strong>s</strong> limitations. Les cellules OK possè<strong>de</strong>nt <strong>de</strong> nombreuses propriétés<br />
communes avec le transport tubulaire ; cependant, elles présentent une très faible<br />
quantité <strong>de</strong> microvillosités et n’expriment pas ou peu d’enzymes <strong>de</strong> la bordure en<br />
brosse. Le modèle <strong>de</strong> rat <strong>de</strong> la néphropathie aux AA ne reste qu’un modèle animal,<br />
et ne permet pas d’établir une correspondance stricte avec le tableau clinique<br />
complexe présenté par les patientes atteintes <strong>de</strong> la CHN. Pour se rapprocher un peu<br />
plus <strong>de</strong> l’homme, il serait intéressant <strong>de</strong> passer <strong>de</strong> la lignée <strong>de</strong> rein d’opossum à une<br />
lignée tubulaire proximale humaine. Toutefois, il faudrait s’assurer que les cellules<br />
humaines en culture possè<strong>de</strong>nt les caractéristiques <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules tubulaires<br />
proximales, à savoir les différents systèmes <strong>de</strong> transport et la réponse aux<br />
hormones, ainsi que le mécanisme d’endocytose médiée par récepteur impliquant la<br />
mégaline et la cubiline.<br />
Le seul mécanisme capable <strong>de</strong> médier la réabsorption <strong>de</strong> l’albumine est<br />
l’endocytose. Dans le tubule proximal, l’albumine est réabsorbée <strong>de</strong> manière quasi<br />
équivalente par le tubule proximal contourné et le tubule proximal droit ; la<br />
réabsorption d’albumine s’effectue par endocytose médiée par les puits recouverts<br />
d’un manteau <strong>de</strong> clathrine et non par d’autres voies comme l’endocytose médiée par<br />
les cavéoles ou l’endocytose indépendante <strong>de</strong> la clathrine et <strong><strong>de</strong>s</strong> cavéoles<br />
[Christensen E.I. et al., 1998].<br />
L’altération <strong>de</strong> l’acidification <strong><strong>de</strong>s</strong> endosomes peut avoir <strong><strong>de</strong>s</strong> conséquences sur<br />
la réabsorption d’albumine par endocytose. En effet, dans la maladie <strong>de</strong> Dent’s, une<br />
déficience <strong>de</strong> la conductance du contre-ion vésiculaire ClC-5 conduit à une<br />
protéinurie [Piwon N. et al., 2000; Wang S.S. et al., 2000]. Ce mécanisme semble<br />
responsable <strong>de</strong> la protéinurie induite par le cadmium ou le cisplatine [Choi J.S. et al.,<br />
1999; Herak-Kramberger C.M. et al., 1998; Takano M. et al., 2002]. Des changement<br />
<strong>de</strong> la cinétique tubulaire peuvent également survenir dans la maladie rénale<br />
polykystique autosomale dominante (ADPKD) où une perte <strong>de</strong> la machinerie<br />
d’endocytose est observée [Obermuller N. et al., 2001]. En cas <strong>de</strong> contamination<br />
alimentaire par l’ochratoxine A, une réduction du nombre <strong>de</strong> sites <strong>de</strong> liaison <strong>de</strong><br />
154
l’albumine à la membrane apicale ainsi qu’une augmentation <strong>de</strong> l’exocytose ont été<br />
rapportées [Gekle M. et al., 1994]. Sur base d’étu<strong><strong>de</strong>s</strong> animales, le TGF-β1<br />
(transforming growth factor β1) contribuerait à la protéinurie dans l’hypertension ou le<br />
diabète, probablement en altérant l’activité lysosomale [Russo L.M. et al., 2002]. Sur<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> cultures cellulaires, le TGF-β1 inhibe l’endocytose d’albumine en réduisant<br />
l’expression <strong>de</strong> la mégaline et <strong>de</strong> la cubiline, ainsi qu’en diminuant l’internalisation et<br />
la dégradation [Gekle M. et al., 2003].<br />
Tout comme dans les cellules OK où l’expression <strong>de</strong> la mégaline est réduite<br />
après exposition aux AA, l’administration <strong><strong>de</strong>s</strong> AA aux rats induit une diminution <strong>de</strong><br />
l’expression <strong>de</strong> la mégaline et <strong>de</strong> la cubiline. L’implication <strong>de</strong> la mégaline et <strong>de</strong> la<br />
cubiline dans le processus d’endocytose concor<strong>de</strong> avec les étu<strong><strong>de</strong>s</strong> effectuées sur<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> souris dont le gène pour la mégaline a été invalidé et sur <strong><strong>de</strong>s</strong> chiens déficients<br />
en cubiline. Ces animaux présentent une réduction importante <strong>de</strong> la réabsorption<br />
rénale <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines [Birn H. et al., 2000a; Christensen E.I. et al., 2002].<br />
L’ultrastructure <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules tubulaires proximales <strong><strong>de</strong>s</strong> souris déficientes en mégaline<br />
est caractérisée par une réduction significative du nombre <strong>de</strong> compartiments<br />
cellulaires constituant l’appareillage d’endocytose au niveau apical (puits recouverts<br />
d’un manteau <strong>de</strong> clathrine, vésicules d’endocytose et lysosomes), suggérant que la<br />
mégaline est essentielle au maintien <strong>de</strong> l’activité normale d’endocytose tubulaire<br />
proximale [Leheste J.R. et al., 1999]. Par contre, les chiens déficients en cubiline<br />
semblent possé<strong>de</strong>r <strong><strong>de</strong>s</strong> tubules proximaux normaux d’un point <strong>de</strong> vue <strong>de</strong><br />
l’ultrastructure incluant l’appareillage d’endocytose. Chez ces animaux, seule<br />
l’albuminurie semblerait se développer [Abbate M. et al., 2001].<br />
Les altérations du processus d’endocytose médiée par récepteur et donc les<br />
atteintes fonctionnelles précoces induites par les AA pourraient s’expliquer par la<br />
perte du phénotype différencié <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules épithéliales du segment S3 du tubule<br />
proximal. Cette perte du phénotype différencié se caractérise par la perturbation <strong>de</strong><br />
la bordure en brosse, le gonflement <strong>de</strong> la membrane apicale, la fragmentation et<br />
l’internalisation, ainsi qu’un changement rapi<strong>de</strong> <strong>de</strong> la polarité cellulaire [Molitoris B.A.<br />
et al., 1988]. Des anomalies sont présentes dans le cytosquelette apical cortical :<br />
délocalisation <strong>de</strong> l’actine <strong>de</strong> la membrane cellulaire apicale à la membrane latérale<br />
155
[Brown D. et al., 1997; Molitoris B.A. et al., 1992]. La réduction <strong>de</strong> l’ATP cellulaire<br />
lors d’atteintes tubulaires conduit à une augmentation <strong>de</strong> la concentration <strong>de</strong> calcium<br />
cytosolique dans la cellule. En plus <strong>de</strong> son effet vasoconstricteur, le calcium peut<br />
contribuer à la toxicité épithélium-cellule en induisant l’activation <strong><strong>de</strong>s</strong> protéases et<br />
phospholipases, la rupture du cytosquelette et la perturbation du métabolisme <strong>de</strong><br />
l’énergie mitochondriale [Bonventre J.V., 1993]. La réduction d’ATP du segment S3<br />
du tubule proximal conduit également à la perturbation <strong><strong>de</strong>s</strong> complexes <strong>de</strong> jonction<br />
cellule-cellule [Abbate M. et al., 1994; Brown D. et al., 1997]. L’interruption <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
jonctions serrées altère la perméabilité paracellulaire ainsi que la polarité cellulaire.<br />
Le changement <strong>de</strong> polarité cellulaire a <strong>de</strong> multiples effets induisant un adressage<br />
incorrect <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines membranaires (Na + /K + -ATPase, intégrines).<br />
La récupération rénale se déroule en étapes successives incluant la<br />
prolifération <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules épithéliales, dites pluripotentes, susceptibles <strong>de</strong> recouvrir<br />
les zones dénudées <strong>de</strong> la membrane basale. La dédifférenciation et la prolifération<br />
cellulaires permettent <strong>de</strong> rétablir le nombre <strong>de</strong> cellules. Ensuite, la différenciation<br />
conduit au rétablissement <strong>de</strong> l’intégrité fonctionnelle du néphron [Thadhani R. et al.,<br />
1996]. Lors <strong>de</strong> la dédifférenciation, la cellule épithéliale tubulaire proximale passe<br />
d’un phénotype différencié à un phénotype moins différencié. Cette étape est très<br />
importante pour la reconstruction <strong>de</strong> l’architecture tubulaire proximale. Cette phase<br />
<strong>de</strong> récupération reprend beaucoup d’aspects du développement rénal : un grand<br />
nombre <strong>de</strong> protéines fortement exprimées lors du développement du mésenchyme<br />
métanéphrique (transition mésenchymale-épithéliale) sont exprimées en gran<strong>de</strong><br />
quantité au cours <strong>de</strong> la phase <strong>de</strong> récupération rénale [Witzgall R. et al., 1994].<br />
D’autres acteurs peuvent jouer un rôle important lors <strong>de</strong> la progression <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
atteintes tubulaires proximales. Vingt-quatre heures après la phase <strong>de</strong> nécrose<br />
tubulaire aiguë et jusqu’au jour 35 du protocole d’administration <strong><strong>de</strong>s</strong> AA, l’interstitium<br />
rénal est infiltré par <strong><strong>de</strong>s</strong> monocytes/macrophages ED1 positifs [Debelle F.D. et al.,<br />
2004]. Les macrophages activés stimulent la réponse immune adaptative<br />
(lymphocytes T CD4+ et CD8+ objectivés par immunomarquage). L’atrophie<br />
tubulaire est intense dans les zones préalablement riches en macrophages activés et<br />
lymphocytes CD8+ potentiellement toxiques envers les cellules tubulaires. Le<br />
développement et la caractérisation <strong>de</strong> l’infiltrat inflammatoire (macrophages et<br />
156
lymphocytes) font l’objet d’une étu<strong>de</strong> en cours <strong>de</strong> réalisation par le Dr. Agnieszka<br />
Pozdzik et ne sont pas abordés dans ce travail. De façon intéressante, le modèle <strong>de</strong><br />
néphropathie toxique étudié illustre en 35 jours le concept physiopathologique<br />
suivant : nécrose tubulaire précoce, afflux interstitiel <strong>de</strong> cellules immunocompétentes<br />
contribuant au développement <strong>de</strong> la fibrose interstitielle via le TGF-β actif d’origine<br />
tubulaire et interstitielle [Pozdzik A. et al., 2005] [Nortier J. et al., 2005]. Dans cette<br />
optique, l’implication du processus <strong>de</strong> différenciation épithélio-mésenchymateuse au<br />
niveau <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules tubulaires proximales reste à investiguer.<br />
Les <strong>de</strong>ux approches expérimentales, in vitro et in vivo <strong>de</strong> ce travail montrent<br />
que l’épithélium tubulaire proximal est la cible principale <strong>de</strong> l’intoxication aux AA. Ces<br />
<strong>de</strong>ux approches constituent <strong>de</strong> bons modèles pour explorer plus en détails : le<br />
mécanisme d’endocytose médiée par récepteur intervenant dans la réabsorption <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
protéines ; le processus <strong>de</strong> régénération et/ou différenciation <strong>de</strong> la cellule tubulaire<br />
proximale à l’origine <strong>de</strong> signaux profibrosants pour le secteur interstitiel ainsi que la<br />
ou les voie(s) d’entrée <strong><strong>de</strong>s</strong> AA dans la cellule tubulaire proximale. De plus, l’atteinte<br />
tubulaire proximale très précoce dans le modèle animal représente un avantage<br />
majeur pour explorer les mécanismes conduisant à la nécrose tubulaire aiguë,<br />
souvent présente dans les atteintes d’origine toxique ou ischémique, ainsi que ceux<br />
favorisant la réparation <strong>de</strong> l’épithélium.<br />
Il est primordial <strong>de</strong> rappeler que le pronostic fonctionnel <strong><strong>de</strong>s</strong> maladies rénales<br />
est déterminé histologiquement par la sévérité <strong><strong>de</strong>s</strong> lésions du compartiment tubulointerstitiel<br />
(intensité <strong>de</strong> l’infiltrat inflammatoire, <strong>de</strong> l’atrophie tubulaire et <strong>de</strong> la fibrose<br />
interstitielle) [Bohle A. et al., 1977]. En conséquence, l’étu<strong>de</strong> approfondie <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
mécanismes physiopathologiques <strong>de</strong> l’atteinte tubulaire proximale et <strong>de</strong> la<br />
progression <strong>de</strong> cette atteinte conduisant au développement <strong>de</strong> la fibrose interstitielle<br />
est une voie <strong>de</strong> recherche prometteuse car elle fournirait <strong><strong>de</strong>s</strong> informations utiles pour<br />
le développement ultérieur <strong>de</strong> stratégies préventives <strong>de</strong> progression <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
néphropathies aiguës et/ou chroniques.<br />
157
ANNEXE 1 : Sécrétion et réabsorption tubulaires <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
drogues et xénobiotiques<br />
Les transports tubulaires sont classés en fonction <strong>de</strong> la spécificité du substrat<br />
anionique ou cationique et <strong>de</strong> la localisation apicale ou basolatérale au niveau <strong>de</strong><br />
l’épithélium tubulaire rénal. L’efficacité et la toxicité <strong>de</strong> nombreux médicaments ou<br />
toxiques environnementaux sont ainsi déterminées par leurs interactions avec les<br />
systèmes <strong>de</strong> transport organique anionique et cationique rénaux [Pritchard J.B. et al.,<br />
1993; Ullrich K.J., 1994].<br />
A.1. Transporteurs tubulaires anioniques (OAT)<br />
De nombreux transporteurs tubulaires anioniques ont été décrits et <strong>de</strong>ux<br />
systèmes indépendants individualisés : les transporteurs du para-aminohippurate<br />
(PAH) liés au sodium et un système indépendant du sodium. Deux transports<br />
couplés en série sont impliqués dans tous les cas : passage <strong><strong>de</strong>s</strong> composés véhiculés<br />
par le sang dans la cellule tubulaire au travers <strong>de</strong> la membrane basolatérale puis <strong>de</strong><br />
la cellule tubulaire à la lumière tubulaire à travers la membrane apicale (Fig. 15,<br />
Tableau annexe 1.1).<br />
Transport basolatéral<br />
La famille OAT : OAT1 ou l’échangeur PAH/dicarboxylate<br />
L’entrée basolatérale <strong><strong>de</strong>s</strong> anions se fait contre un gradient électrochimique<br />
puisque le milieu intracellulaire <strong>de</strong> la cellule est chargé négativement. En effet, la<br />
Na + /K + -ATPase en maintenant un gradient sodium, favorise le co-transport entrant<br />
<strong>de</strong> sodium/dicarboxylate dans la cellule et permet ainsi la réabsorption <strong><strong>de</strong>s</strong> anions en<br />
échange d’un ion α-cétoglutarate sortant [Martinez F. et al., 1990; Pritchard J.B.,<br />
1995; Shimada H. et al., 1987]. L’ α-cétoglutarate, principalement généré par le<br />
métabolisme mitochondrial, est le contre-ion <strong>de</strong> l’ion dicarboxylate dans la cellule<br />
tubulaire rénale.<br />
158
Tableau annexe 1.1. Transporteurs associés à la sécrétion d’anions organiques par les cellules tubulaires proximales rénales<br />
[Wright S.H. et al., 2004].<br />
Transporteurs Localisation Description Références<br />
Na + /K + -ATPase basolatérale<br />
NaDC-3 basolatérale<br />
OAT1, OAT3 basolatérale<br />
Maintien du gradient K + associé au potentiel <strong>de</strong> membrane<br />
ainsi que le gradient Na + . Ces <strong>de</strong>ux gradients représentent<br />
la force motrice associée à la captation active <strong><strong>de</strong>s</strong> anions<br />
organiques (OA) à la membrane basale<br />
Co-transporteur sodium-dicarboxylate qui génère un<br />
gradient α-cétoglutarate (α-KG)<br />
Responsable du transport secondaire actif <strong><strong>de</strong>s</strong> anions<br />
organiques <strong>de</strong> type I par l’intermédiaire d’un transporteur<br />
échangeant l’α-cétoglutarate intracellulaire contre un anion<br />
organique extracellulaire<br />
[Wang H. et al., 2000]<br />
[Burckhardt G. et al., 2000; Inui K.I. et al.,<br />
2000; Sekine T. et al., 2000]<br />
OAT2 ? Pas <strong>de</strong> <strong><strong>de</strong>s</strong>cription précise [Burckhardt G. et al., 2000]<br />
MRP2 apicale<br />
Sortie active dépendante <strong>de</strong> l’ATP <strong><strong>de</strong>s</strong> anions organiques [Borst P. et al., 2000; Klein I. et al., 1999]<br />
<strong>de</strong> type II<br />
URAT1 apicale<br />
Réabsorption d’urate en échange d’un anion organique<br />
intracellulaire <strong>de</strong> type I<br />
OAT4 apicale Flux sortant sélectif d’anions organiques <strong>de</strong> type I<br />
Oatp1, OAT-K1/K2 apicale Flux entrant d’anions organiques <strong>de</strong> type I et II<br />
[Lu R. et al., 1996; Masuda S. et al.,<br />
1999b; Masuda S. et al., 1999a]<br />
OATV1, NPT1 apicale Flux sortant sélectif d’anions organiques <strong>de</strong> type I [Busch A.E. et al., 1996]<br />
Echangeur OA/OA apicale Echangeur physiologique<br />
Les anions organiques <strong>de</strong> type I ont en général un poids moléculaire inférieur à 400 et sont <strong><strong>de</strong>s</strong> composés typiquement monovalents comme le PAH, le<br />
probénéci<strong>de</strong> et la fluorescéine.<br />
Les anions organiques <strong>de</strong> type II ont un poids moléculaire supérieur à 500 et sont souvent polyvalents comme, par exemple : la calcéine et l’estradiol-17β-Dglucoroni<strong>de</strong>.<br />
159
L’OAT3 est peut-être l’autre système <strong>de</strong> transport basolatéral indépendant du<br />
sodium.<br />
Transport apical<br />
La sortie <strong><strong>de</strong>s</strong> anions organiques au travers <strong>de</strong> la membrane apicale est sous<br />
la dépendance d’un échange anionique <strong>de</strong> faible affinité ou par diffusion facilitée, et<br />
d’un transport indépendant du transport <strong>de</strong> sodium mais nécessitant <strong>de</strong> l’ATP. Les<br />
transporteurs récemment clonés comme OAT-K1/K2, OAT4 et NPT1 pourraient être<br />
responsables <strong>de</strong> ces mouvements.<br />
Le co-transporteur Na + -phosphate, NaPi-1 ou NPT1 est responsable du transport<br />
électrogénique <strong><strong>de</strong>s</strong> anions organiques [Busch A.E. et al., 1996; Uchino H. et al.,<br />
2000], un homologue <strong>de</strong> NPT1, OATV1, a été récemment cloné [Jutabha P. et al.,<br />
2003].<br />
Oatp ou la famille <strong><strong>de</strong>s</strong> transporteurs d’anions organiques polypeptidiques<br />
Ces transporteurs <strong>de</strong> sodium sont indépendants <strong>de</strong> la sulfobrophtaléine, <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
aci<strong><strong>de</strong>s</strong> biliaires conjugués et non conjugués. Dans le tubule proximal, oatp1 sert <strong>de</strong><br />
voie <strong>de</strong> sortie physiologique apicale préférentielle pour les stéroï<strong><strong>de</strong>s</strong>, en particulier le<br />
17-β-D-glucuroni<strong>de</strong> [Kanai N. et al., 1996] ainsi que les oestrogènes [Lu R. et al.,<br />
1996]. Oatp3 est également exprimé dans le rein et transporte le taurocholate ainsi<br />
que <strong><strong>de</strong>s</strong> hormones thyroïdiennes [Abe T. et al., 1998]. Oatp2 est un transporteur<br />
spécifique du foie et n’est pas exprimé dans le rein [Abe T. et al., 1998].<br />
OAT-K1 et OAT-K2, <strong>de</strong>ux transporteurs homologues d’anions organiques, sont<br />
spécifiques du rein [Masuda S. et al., 1999b; Masuda S. et al., 1999a]. OAT-K1<br />
semble être le site d’interaction entre les anti-inflammatoires non stéroïdiens<br />
(indométhacine, képrofène, ibuprofène, flufenamate, phénylbutazone) et le<br />
méthotrexate [Masuda S. et al., 1997].<br />
MRP membre <strong>de</strong> la famille <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines associées à la résistance aux<br />
médicaments<br />
Ces transporteurs, appartenant à la super famille <strong><strong>de</strong>s</strong> ABC transporteurs, sont<br />
impliqués dans le transport d’une large variété <strong>de</strong> substrats protéiques, peptidiques,<br />
<strong>de</strong> sucres ou d’ions inorganiques ainsi que <strong>de</strong> médicaments comme les<br />
antibiotiques. Les membres les plus importants <strong>de</strong> cette famille sont la P-<br />
160
glycoprotéine (P-gp) et la protéine associée à la résistance aux médicaments (MRP).<br />
Elles sont impliquées dans la sortie <strong><strong>de</strong>s</strong> médicaments anticancéreux <strong>de</strong> la cellule<br />
tumorale, et le régulateur transmembranaire <strong>de</strong> la conductance <strong>de</strong> la fibrose kystique<br />
(CFTR). MRP est un transporteur anionique tandis que la P-gp est un transporteur<br />
cationique.<br />
Dans le rein, MRP2, une isoforme <strong>de</strong> la protéine associée à la résistance aux<br />
médicaments, est localisée à la membrane apicale du tubule proximal chez l’homme<br />
et le rat [Schaub T.P. et al., 1999]. Les substrats sont <strong><strong>de</strong>s</strong> conjugués anioniques du<br />
glutathion (leukotriène C4) ou du glucuroni<strong>de</strong> (estradiol-17-β-D-glucuroni<strong>de</strong>) ainsi<br />
que <strong><strong>de</strong>s</strong> substrats non-conjugués comme le probénéci<strong>de</strong>, le sulfinpyrazone,<br />
l’indométhacine, le furosémi<strong>de</strong> et la pénicilline [Bakos E. et al., 2000]. La MRP1, une<br />
autre protéine associée à la résistance aux médicaments dans les cellules<br />
cancéreuses, est exprimée dans très peu <strong>de</strong> segments tubulaires rénaux et pas dans<br />
le tubule proximal [Peng K.C. et al., 1999].<br />
A.2. Transporteurs tubulaires cationiques (OCT)<br />
Dans le rein, les transporteurs <strong><strong>de</strong>s</strong> cations organiques interviennent dans les<br />
phénomènes physiologiques et pharmacologiques <strong>de</strong> réabsorption et d’excrétion <strong>de</strong><br />
cations organiques endogènes (guanine, choline, les monoamines bioactives comme<br />
la dopamine, l’épinéphrine et l’histamine), <strong><strong>de</strong>s</strong> médicaments cationiques (cimétidine,<br />
procaïnami<strong>de</strong> et quinine) et <strong><strong>de</strong>s</strong> toxines cationiques. Ces transporteurs sont localisés<br />
dans les segments proximaux et distaux du tubule rénal ainsi que dans les canaux<br />
collecteurs. Un transport facilité par la différence <strong>de</strong> potentiel à la membrane<br />
basolatérale est combiné à un transport induit par le gradient en ion H + transmembranaire<br />
dans la bordure en brosse tubulaire, lequel est entretenu par l’activité<br />
<strong>de</strong> l’échangeur sodium/proton et/ou <strong>de</strong> la pompe à proton vacuolaire (Fig. 16,<br />
Tableau annexe 1.2).<br />
161
Tableau annexe 1.2. Transporteurs associés à la sécrétion <strong>de</strong> cations organiques par les cellules tubulaires proximales rénales [Wright S.H. et<br />
al., 2004].<br />
Transporteurs Localisation Description Références<br />
Na + /K + -ATPase basolatérale<br />
OCT1, OCT2,<br />
OCT3<br />
basolatérale<br />
MDR1 apicale<br />
Maintien du gradient K + associé au potentiel <strong>de</strong> membrane<br />
(négatif à l’intérieur) ainsi que le gradient Na + . Ces <strong>de</strong>ux<br />
gradients représentent la force motrice associée à la<br />
sécrétion active <strong><strong>de</strong>s</strong> cations organiques (OC) à la<br />
membrane basale<br />
Diffusion facilitée électrogénique associée à la captation<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> cations organiques <strong>de</strong> type I.<br />
Semblent également assurer l’échange électroneutre<br />
OC/OC<br />
Sortie active dépendante <strong>de</strong> l’ATP <strong><strong>de</strong>s</strong> cations organiques<br />
<strong>de</strong> type II<br />
[Karbach U. et al., 2000; Koepsell H. et al.,<br />
1999; Okuda M. et al., 1999; Sugawara-<br />
Yokoo M. et al., 2000; Wu X. et al., 2000]<br />
[<strong>de</strong> Lannoy I.A. et al., 1994; Ford J.M. et<br />
al., 1990; Horio M. et al., 1990; Koren G.,<br />
1987; Schramm U. et al., 1995; Speeg<br />
K.V. et al., 1992]<br />
NHE3 apicale<br />
Echangeur Na + /H + qui maintient le gradient électrochimique<br />
<strong>de</strong> l’hydrogène nécessaire à l’activité <strong>de</strong> l’échangeur OC/H +<br />
et OCTN1<br />
Echangeur OC/H + apicale Echangeur physiologique OC <strong>de</strong> type I/H +<br />
OCTN1 apicale Echange électroneutre OC/H + . [Yabuuchi H. et al., 1999]<br />
OCTN2 apicale<br />
Assure le co-transporteur Na + Voie électrogénique<br />
-carnitine ainsi que la [Wu X. et al., 1999]<br />
captation électrogénique <strong>de</strong> TEA et certains substrats <strong>de</strong><br />
type I<br />
<strong>de</strong> réabsorption <strong>de</strong><br />
la choline<br />
apicale Voie physiologique<br />
Les cations organiques <strong>de</strong> type I ont en général un poids moléculaire inférieur à 400 et sont <strong><strong>de</strong>s</strong> composés monovalents comme le tétraéthylammonium<br />
(TEA), le tributylméthylammonium (TBuMA) et la procainami<strong>de</strong> éthobromi<strong>de</strong>.<br />
Les anions organiques <strong>de</strong> type II ont un poids moléculaire généralement supérieur à 500 et sont souvent polyvalents comme, par exemple : la d-tubocurarine,<br />
le vercuronium et l’hexafluorenium.<br />
162
Transport basolatéral<br />
La famille <strong><strong>de</strong>s</strong> transporteurs organiques cationiques : OCT<br />
Le premier transporteur <strong>de</strong> cations organiques OCT1 a été cloné chez le rat<br />
[Grun<strong>de</strong>mann D. et al., 1994]; <strong>de</strong>puis, plusieurs transporteurs <strong>de</strong> cations homologues<br />
ont été i<strong>de</strong>ntifiés [Koepsell H. et al., 1999].<br />
Les isoformes OCT1 et OCT2 possè<strong>de</strong>nt <strong><strong>de</strong>s</strong> affinités pour un grand nombre<br />
<strong>de</strong> substrats et sont <strong><strong>de</strong>s</strong> transports voltage dépendant. Chez le rat, OCT1 et OCT2<br />
sont principalement exprimés dans le rein, localisés à la membrane basolatérale du<br />
tubule proximal [Karbach U. et al., 2000; Sugawara-Yokoo M. et al., 2000]. Ils jouent<br />
probablement un rôle dans la sécrétion <strong><strong>de</strong>s</strong> cations organiques [Okuda M. et al.,<br />
1999]. Le taux d’expression du mRNA et <strong>de</strong> la protéine OCT2 <strong>de</strong> rat chez les mâles<br />
est beaucoup plus élevé que chez les femelles ; cette observation est en corrélation<br />
avec le transport <strong>de</strong> tétraéthylammonium plus important chez les mâles dans <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
vésicules <strong>de</strong> la membrane basolatérale et sur les coupes <strong>de</strong> cortex [Urakami Y. et<br />
al., 1999]. Comme aucune différence <strong>de</strong> sexe n’est observée pour l’expression<br />
rénale <strong>de</strong> OCT1 <strong>de</strong> rat, l’OCT2 <strong>de</strong> rat et non l’OCT1 peut constituer le principal<br />
transporteur rénal <strong>de</strong> cations organiques chez le rat.<br />
Une autre isoforme, OCT3 <strong>de</strong> rat qui transporte le tétraéthylammonium et la<br />
guanidine est exprimée dans plusieurs organes dont le rein [Wu X. et al., 2000].<br />
Transport apical<br />
Transporteur multi-médicament/P-glycoprotéine (MDR ou P-gp)<br />
La MDR/P-glycoprotéine (« transporteur multi-médicament ») est une protéine<br />
transmembranaire qui agit comme une pompe énergie dépendante responsable <strong>de</strong><br />
l’efflux d’une gran<strong>de</strong> variété <strong>de</strong> médicaments au travers <strong>de</strong> la membrane plasmique<br />
<strong>de</strong> différents types <strong>de</strong> cellules [Ford J.M. et al., 1990]. La MDR/P-gp est exprimée<br />
dans les tissus sains et plus particulièrement dans les organes intervenant dans le<br />
<strong>de</strong>venir cinétique <strong><strong>de</strong>s</strong> médicaments. La membrane apicale <strong><strong>de</strong>s</strong> tubules proximaux est<br />
particulièrement riche en MDR/P-gp. La MDR/P-gp peut expulser un grand nombre<br />
<strong>de</strong> composés organiques comme la vinblastine, la vincristine, la colchicine, les<br />
analogues <strong>de</strong> la cyclosporine hors <strong>de</strong> la cellule proximale rénale [<strong>de</strong> Lannoy I.A. et<br />
al., 1994; Schramm U. et al., 1995; Speeg K.V. et al., 1992]. Certaines substances<br />
sont transportées aussi bien par la MDR/P-gp que par le transport organique <strong>de</strong><br />
cations incluant la daunomycine, la colchicine, le verapamil, la quinidine et la<br />
163
vinblastine [Horio M. et al., 1990]; cependant la digoxine, qui n’est pas un cation<br />
organique, se limite uniquement à la P-gp [Koren G., 1987].<br />
Transporteurs <strong>de</strong> cations organiques apicaux<br />
Les <strong>de</strong>ux transporteurs <strong>de</strong> cations organiques OCTN1 et OCTN2 sont<br />
i<strong>de</strong>ntifiés dans le rein et d’autres organes chez le rat, la souris, le lapin et l’humain<br />
[Wu X. et al., 1999; Yabuuchi H. et al., 1999].<br />
L’OCTN1 est un transporteur <strong>de</strong> cations organiques multi-spécifique,<br />
bidirectionnel et dépendant du pH et probablement stimulé par un mécanisme<br />
antiport <strong>de</strong> protons. L’OCTN1 semble être impliqué dans la sécrétion <strong><strong>de</strong>s</strong> cations<br />
organiques à la membrane apicale.<br />
Dans le rein, l’OCTN2 est principalement exprimé dans les cellules <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
tubules proximaux et distaux ainsi que dans les glomérules. L’OCTN2 possè<strong>de</strong> les<br />
mêmes caractéristiques fonctionnelles que OCTN1 mais les affinités pour les<br />
substrats sont différentes pour les <strong>de</strong>ux transporteurs [Wu X. et al., 1999]. L’OCTN2<br />
semble jouer un rôle dans la sécrétion <strong><strong>de</strong>s</strong> cations organiques et dans la<br />
réabsorption <strong>de</strong> la carnitine par un co-transport sodium carnitine.<br />
164
ANNEXE 2 : Effets <strong><strong>de</strong>s</strong> aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong> sur<br />
l’expression <strong>de</strong> protéines impliquées dans l’endocytose<br />
médiée par récepteur<br />
Dans <strong>de</strong>ux expériences préliminaires indépendantes, les cellules OK sont<br />
exposées aux AA 20 µmol/l pendant 24 h suivi ou non d’une récupération en milieu<br />
<strong>de</strong> culture pendant 2 ou 6 jours. Les lysats cellulaires sont séparés par<br />
électrophorèse et transférés sur membrane <strong>de</strong> nitrocellulose. La membrane est<br />
incubée successivement avec l’anticorps <strong>de</strong> mouton anti-mégaline, l’anticorps<br />
humain anti-cubiline, l’anticorps humain anti-ClC-5 et l’anticorps monoclonal β-actine.<br />
Les <strong>de</strong>nsités optiques relatives sont obtenues en double et normalisées par rapport à<br />
la β-actine.<br />
L’analyse semiquantitative, normalisée par rapport à la β-actine, montre que<br />
l’expression endogène <strong>de</strong> la mégaline dans les cellules OK est diminuée <strong>de</strong> 33 %<br />
après 24 h d’exposition aux AA, <strong>de</strong> 45 % et 91 % respectivement après 2 et 6 jours<br />
<strong>de</strong> récupération. Parallèlement, l’expression endogène du ClC-5 est également<br />
réduite <strong>de</strong> 19 %, 72 % et 85 %, respectivement après 0, 2 et 6 jours <strong>de</strong> récupération.<br />
Par contre, l’expression endogène <strong>de</strong> la cubiline est légèrement augmentée <strong>de</strong> 14 %<br />
après 24 h d’exposition aux AA et ensuite diminuée <strong>de</strong> 43 % et 72 % respectivement<br />
après 2 et 6 jours <strong>de</strong> récupération (Fig. annexe 2) [Lebeau C. et al., 2002; Lebeau C.<br />
et al., 2003].<br />
L’exposition aux AA induit une inhibition progressive et permanente <strong>de</strong><br />
l’expression <strong>de</strong> ces trois protéines impliquées dans le processus d’endocytose<br />
médiée par récepteur.<br />
Densité optique relative (% du contrôle)<br />
120<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
AA (20 µmol/l)<br />
AA + 2 jours <strong>de</strong> récupération<br />
AA + 6 jours <strong>de</strong> récupération<br />
Mégaline Cubiline ClC-5<br />
Figure annexe 2 : Effet <strong><strong>de</strong>s</strong> AA sur l’expression endogène <strong>de</strong> la mégaline, <strong>de</strong> la cubiline et<br />
du ClC-5 dans les cellules OK : analyse <strong>de</strong>nsitométrique.<br />
165
ARTICLES PUBLIES<br />
Aristolochic acid impe<strong><strong>de</strong>s</strong> endocytosis and induces<br />
DNA adducts in proximal tubule cells<br />
Lebeau C, Arlt VM, Schmeiser HH, Boom A, Verroust PJ,<br />
Devuyst O, Beauwens R<br />
Kidney International 60: 1332-1342, 2001<br />
166
167
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169
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171
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174
175
176
177
Early proximal tubule injury in experimental<br />
aristolochic acid nephropathy : functional and<br />
histological studies<br />
Lebeau C, Debelle FD, Arlt VM, Pozdzik A, De Prez EG,<br />
Phillips DH, Deschodt-Lanckman MM, Vanherweghem J-L,<br />
Nortier JL<br />
Nephrol Dial Transplant 20: 2321-2332, 2005<br />
178
179
180
181
182
183
184
185
186
187
188
189
190
BIBLIOGRAPHIE<br />
Abbate M., Bonventre J.V. and Brown D. The microtubule network of renal epithelial cells is<br />
disrupted by ischemia and reperfusion. Am. J. Physiol. 267: F971-F978, 1994.<br />
Abbate M. and Remuzzi G. Novel mechanism(s) implicated in tubular albumin reabsorption<br />
and handling. Am. J. Kidney Dis. 38: 196-204, 2001.<br />
Abe T., Kakyo M., Sakagami H., Tokui T., Nishio T., Tanemoto M., Nomura H., Hebert S.C.,<br />
Matsuno S., Kondo H. and Yawo H. Molecular characterization and tissue distribution<br />
of a new organic anion transporter subtype (oatp3) that transports thyroid hormones<br />
and taurocholate and comparison with oatp2. J. Biol. Chem. 273: 22395-22401, 1998.<br />
Adams R.G., Harrison J.F. and Scott P. The <strong>de</strong>velopment of cadmium-induced proteinuria,<br />
impaired renal function, and osteomalacia in alkaline battery workers. Q. J. Med. 38:<br />
425-443, 1969.<br />
Ahn D.W. and Park Y.S. Transport of inorganic phosphate in renal cortical brush-bor<strong>de</strong>r<br />
membrane vesicles of cadmium-intoxicated rats. Toxicol. Appl. Pharmacol. 133: 239-<br />
243, 1995.<br />
Aminoff M., Carter J.E., Chadwick R.B., Johnson C., Grasbeck R., Ab<strong>de</strong>laal M.A., Broch H. ,<br />
Jenner L.B., Verroust P.J., Moestrup S.K., <strong>de</strong> la C.A. and Krahe R. Mutations in<br />
CUBN, encoding the intrinsic factor-vitamin B12 receptor, cubilin, cause hereditary<br />
megaloblastic anaemia 1. Nat. Genet. 21: 309-313, 1999.<br />
Arlt V.M., Pfohl-Leszkowicz A., Cosyns J. and Schmeiser H.H. Analyses of DNA adducts<br />
formed by ochratoxin A and aristolochic acid in patients with Chinese herbs<br />
nephropathy. Mutat. Res. 494: 143-150, 2001.<br />
Arlt V.M., Stiborova M. and Schmeiser H.H. Aristolochic acid as a probable human cancer<br />
hazard in herbal remedies: a review. Mutagenesis 17: 265-277, 2002.<br />
Bakos E., Evers R., Sinko E., Varadi A., Borst P. and Sarkadi B. Interactions of the human<br />
multidrug resistance proteins MRP1 and MRP2 with organic anions. Mol. Pharmacol.<br />
57: 760 -768, 2000.<br />
Batuman V., Verroust P.J., Navar G.L., Kaysen J.H., Goda F.O., Campbell W.C., Simon E.,<br />
Pontillon F., Lyles M., Bruno J. and Hammond T.G. Myeloma light chains are ligands<br />
for cubilin (gp280). Am. J. Physiol. 275: F246-F254, 1998.<br />
Bernadotte F., Holmdahl R., Juhlin C. and Mattsson R. Expression of a cell surface antigen<br />
with potential Ca2+-sensor/receptor function in rat placenta and uterus. J. Reprod.<br />
Immunol. 16: 199-205, 1989.<br />
Bernard A., Buchet J.P., Roels H., Masson P. and Lauwerys R. Renal excretion of proteins<br />
and enzymes in workers exposed to cadmium. Eur. J. Clin. Invest 9: 11-22, 1979.<br />
191
Bernard A., Lauwerys R., Noel A., Van<strong>de</strong>leene B. and Lambert A. Determination by latex<br />
immunoassay of protein 1 in normal and pathological urine. Clin. Chim. Acta 201:<br />
231-245, 1991a.<br />
Bernard A. and Lauwerys R.R. Proteinuria: changes and mechanisms in toxic nephropathies.<br />
Crit Rev. Toxicol. 21: 373-405, 1991b.<br />
Bernard A.M., Moreau D. and Lauwerys R. Comparison of retinol-binding protein and beta 2microglobulin<br />
<strong>de</strong>termination in urine for the early <strong>de</strong>tection of tubular proteinuria. Clin.<br />
Chim. Acta 126: 1-7, 1982.<br />
Bernard A.M., Vyskocil A.A., Mahieu P. and Lauwerys R.R. Assessment of urinary retinolbinding<br />
protein as an in<strong>de</strong>x of proximal tubular injury. Clin. Chem. 33: 775-779, 1987.<br />
Bieler C.A., Stiborova M., Wiessler M., Cosyns J.P., van Ypersele <strong>de</strong> Strihou C. and<br />
Schmeiser H.H. 32P-post-labelling analysis of DNA adducts formed by aristolochic<br />
acid in tissues from patients with Chinese herbs nephropathy. Carcinogenesis 18:<br />
1063-1067, 1997.<br />
Biemes<strong>de</strong>rfer D., Nagy T., DeGray B. and Aronson P.S. Specific association of megalin and<br />
the Na+/H+ exchanger isoform NHE3 in the proximal tubule. J. Biol. Chem. 274:<br />
17518-17524, 1999.<br />
Binswanger U., Helmle-Kolb C., Forgo J., Mrkic B. and Murer H. Rapid stimulation of Na+/H+<br />
exchange by 1,25-dihydroxyvitamin D3; interaction with parathyroid-hormone<strong>de</strong>pen<strong>de</strong>nt<br />
inhibition. Pflugers Arch. 424: 391-397, 1993.<br />
Birn H., Fyfe J.C., Jacobsen C., Mounier F., Verroust P.J., Orskov H., Willnow T.E.,<br />
Moestrup S.K. and Christensen E.I. Cubilin is an albumin binding protein important for<br />
renal tubular albumin reabsorption. J. Clin. Invest 105: 1353-1361, 2000a.<br />
Birn H., Verroust P.J., Nexo E., Hager H., Jacobsen C., Christensen E.I. and Moestrup S.K.<br />
Characterization of an epithelial approximately 460-kDa protein that facilitates<br />
endocytosis of intrinsic factor-vitamin B12 and binds receptor-associated protein. J.<br />
Biol. Chem. 272: 26497-26504, 1997.<br />
Birn H., Vorum H., Verroust P.J., Moestrup S.K. and Christensen E.I. Receptor-associated<br />
protein is important for normal processing of megalin in kidney proximal tubules. J.<br />
Am. Soc. Nephrol. 11: 191-202, 2000b.<br />
Birn H., Willnow T.E., Nielsen R., Nor<strong>de</strong>n A.G., Bonsch C., Moestrup S.K., Nexo E. and<br />
Christensen E.I. Megalin is essential for renal proximal tubule reabsorption and<br />
accumulation of transcobalamin-B(12). Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282: F408-<br />
F416, 2002.<br />
Bohle A., Grund K.E., Mackensen S. and Tolon M. Correlations between renal interstitium<br />
and level of serum creatinine. Morphometric investigations of biopsies in<br />
perimembranous glomerulonephritis. Virchows Arch. A Pathol. Anat. Histol. 373: 15-<br />
22, 1977.<br />
Bonventre J.V. Mechanisms of ischemic acute renal failure. Kidney Int. 43: 1160-1178, 1993.<br />
Bonventre J.V. Dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acute renal<br />
failure. J. Am. Soc. Nephrol. 14 Suppl 1: S55-S61, 2003.<br />
192
Bonventre J.V. and Weinberg J.M. Recent advances in the pathophysiology of ischemic<br />
acute renal failure. J. Am. Soc. Nephrol. 14 : 2199-2210, 2003.<br />
Borst P., Evers R., Kool M. and Wijnholds J. A family of drug transporters: the multidrug<br />
resistance-associated proteins. J. Natl. Cancer Inst. 92: 1295-1302, 2000.<br />
Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of<br />
protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254,<br />
1976.<br />
Branten A.J., Mul<strong>de</strong>r T.P., Peters W.H., Assmann K.J. and Wetzels J.F. Urinary excretion of<br />
glutathione S transferases alpha and pi in patients with proteinuria: reflection of the<br />
site of tubular injury. Nephron 85: 120-126, 2000.<br />
Brezis M., Rosen S., Silva P. and Epstein F.H. Renal ischemia: a new perspective. Kidney<br />
Int. 26: 375-383, 1984.<br />
Brown D., Lee R. and Bonventre J.V. Redistribution of villin to proximal tubule basolateral<br />
membranes after ischemia and reperfusion. Am. J. Physiol. 273: F1003-F1012, 1997.<br />
Burch H.B., Lowry O.H., Perry S.G., Fan L. and Fagioli S. Effect of age on pyruvate kinase<br />
and lactate <strong>de</strong>hydrogenase distribution in rat kidney. Am. J. Physiol. 226: 1227-1231,<br />
1974.<br />
Burch H.B., Narins R.G., Chu C., Fagioli S., Choi S. , McCarthy W. and Lowry O.H.<br />
Distribution along the rat nephron of three enzymes of gluconeogenesis in acidosis<br />
and starvation. Am. J. Physiol. 235: F246-F253, 1978.<br />
Burckhardt G. and Wolff N.A. Structure of renal organic anion and cation transporters. Am. J.<br />
Physiol. Renal Physiol. 278: F853-F866, 2000.<br />
Burmeister R., Boe I.M., Nykjaer A., Jacobsen C., Moestrup S.K., Verroust P., Christensen<br />
E.I., Lund J. and Willnow T.E. A two-receptor pathway for catabolism of Clara cell<br />
secretory protein in the kidney. J. Biol. Chem. 276: 13295-13301, 2001.<br />
Busch A.E., Schuster A., Wal<strong>de</strong>gger S., Wagner C.A., Zempel G., Broer S., Biber J., Murer<br />
H. and Lang F. Expression of a renal type I sodium/phosphate transporter (NaPi-1)<br />
induces a conductance in Xenopus oocytes permeable for organic and inorganic<br />
anions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 93: 5347-5351, 1996.<br />
Caverzasio J. and Bonjour J.P. Insulin-like growth factor I stimulates Na-<strong>de</strong>pen<strong>de</strong>nt Pi<br />
transport in cultured kidney cells. Am. J. Physiol. 257: F712-F717, 1989.<br />
Caverzasio J., Rizzoli R. and Bonjour J.P. Sodium-<strong>de</strong>pen<strong>de</strong>nt phosphate transport inhibited<br />
by parathyroid hormone and cyclic AMP stimulation in an opossum kidney cell line. J.<br />
Biol. Chem. 261: 3233-3237, 1986.<br />
Chan W.L., Shaw P.C., Tam S.C., Jacobsen C., Gliemann J. and Nielsen M.S. Trichosanthin<br />
interacts with and enters cells via LDL receptor family members. Biochem. Biophys.<br />
Res. Commun. 270: 453-457, 2000.<br />
Chang C.H., Wang Y.M., Yang A.H. and Chiang S.S. Rapidly progressive interstitial renal<br />
fibrosis associated with chinese herbal medications. Am. J. Nephrol. 21: 441-448,<br />
2001.<br />
193
Chatelet F., Brianti E., Ronco P., Roland J. and Verroust P. Ultrastructural localization by<br />
monoclonal antibodies of brush bor<strong>de</strong>r antigens expressed by glomeruli. I. Renal<br />
distribution. Am. J. Pathol. 122: 500-511, 1986a.<br />
Chatelet F., Brianti E., Ronco P., Roland J. and Verroust P. Ultrastructural localization by<br />
monoclonal antibodies of brush bor<strong>de</strong>r antigens expressed by glomeruli. II. Extrarenal<br />
distribution. Am. J. Pathol. 122: 512-519, 1986b.<br />
Chen W., Chen Y. and Li A. [The clinical and pathological manifestations of aristolochic acid<br />
nephropathy--the report of 58 cases]. Zhonghua Yi. Xue. Za Zhi. 81: 1101 -1105,<br />
2001.<br />
Chen W.J., Goldstein J.L. and Brown M.S. NPXY, a sequence often found in cytoplasmic<br />
tails, is required for coated pit-mediated internalization of the low <strong>de</strong>nsity lipoprotein<br />
receptor. J. Biol. Chem. 265: 3116-3123, 1990.<br />
Cheng L., Precht P., Frank D. and Liang C.T. Dopamine stimulation of cAMP production in<br />
cultured opossum kidney cells. Am. J. Physiol. 258: F877 -F882, 1990.<br />
Choi J.S., Kim K.R., Ahn D.W. and Park Y.S. Cadmium inhibits albumin endocytosis in<br />
opossum kidney epithelial cells. Toxicol. Appl. Pharmacol. 161: 146-152, 1999.<br />
Christensen E.I. and Birn H. Megalin and cubilin: multifunctional endocytic receptors. Nat.<br />
Rev. Mol. Cell Biol. 3: 256-266, 2002.<br />
Christensen E.I., Birn H., Verroust P. and Moestrup S.K. Membrane receptors for<br />
endocytosis in the renal proximal tubule. Int. Rev. Cytol. 180: 237-284, 1998.<br />
Christensen E.I. and Gburek J. Protein reabsorption in renal proximal tubule-function and<br />
dysfunction in kidney pathophysiology. Pediatr. Nephrol. 19: 714-721, 2004.<br />
Christensen E.I., Gliemann J. and Moestrup S.K. Renal tubule gp330 is a calcium binding<br />
receptor for endocytic uptake of protein. J. Histochem. Cytochem. 40: 1481-1490,<br />
1992.<br />
Christensen E.I., Moskaug J.O., Vorum H., Jacobsen C., Gun<strong>de</strong>rsen T.E., Nykjaer A.,<br />
Blomhoff R., Willnow T.E. and Moestrup S.K. Evi<strong>de</strong>nce for an essential role of<br />
megalin in transepithelial transport of retinol. J. Am. Soc. Nephrol. 10: 685-695,<br />
1999a.<br />
Christensen E.I. and Willnow T.E. Essential role of megalin in renal proximal tubule for<br />
vitamin homeostasis. J. Am. Soc. Nephrol. 10: 2224-2236, 1999b.<br />
Cole B.R., Hays A.E., Boylan J.G., Burch H.B. and Lowry O.H. Distribution of enzymes of<br />
a<strong>de</strong>nylate and guanylate nucleoti<strong>de</strong> metabolism in rat nephron. Am. J. Physiol. 243:<br />
F349-F355 , 1982.<br />
Cole J.A., Eber S.L., Poelling R.E., Thorne P.K. and Forte L.R. A dual mechanism for<br />
regulation of kidney phosphate transport by parathyroid hormone. Am. J. Physiol.<br />
253: E221-E227 , 1987.<br />
Cosyns J.P., Dehoux J.P., Guiot Y., Goebbels R.M., Robert A., Bernard A.M. and van<br />
Ypersele <strong>de</strong> Strihou C. Chronic aristolochic acid toxicity in rabbits: a mo<strong>de</strong>l of<br />
Chinese herbs nephropathy? Kidney Int. 59: 2164-2173 , 2001.<br />
194
Cosyns J.P., Goebbels R.M., Liberton V., Schmeiser H.H., Bieler C.A. and Bernard A.M.<br />
Chinese herbs nephropathy-associated slimming regimen induces tumours in the<br />
forestomach but no interstitial nephropathy in rats. Arch. Toxicol. 72: 738-743, 1998.<br />
Cosyns J.P., Jadoul M., Squifflet J.P., De Plaen J.F., Ferluga D. and van Ypersele <strong>de</strong> Strihou<br />
C. Chinese herbs nephropathy: a clue to Balkan en<strong>de</strong>mic nephropathy? Kidney Int.<br />
45: 1680-1688, 1994a.<br />
Cosyns J.P., Jadoul M., Squifflet J.P., Van Cangh P.J. and van Ypersele D.S. Urothelial<br />
malignancy in nephropathy due to Chinese herbs. Lancet 344: 188, 1994b.<br />
Cosyns J.P., Jadoul M., Squifflet J.P., Wese F.X. and van Ypersele <strong>de</strong> Strihou C. Urothelial<br />
lesions in Chinese-herb nephropathy. Am. J. Kidney Dis. 33: 1011-1017, 1999.<br />
Courjault F., Gerin B., Leroy D., Chevalier J. and Toutain H. Morphological and biochemical<br />
characterization of the opossum kidney cell line and primary cultures of rabbit<br />
proximal tubule cells in serum-free <strong>de</strong>fined medium. Cell Biol. Int. Rep. 15: 1225-<br />
1234, 1991.<br />
Cronin A.J., Maidment G., Cook T., Kite G.C., Simmonds M.S., Pusey C.D. and Lord G.M.<br />
Aristolochic acid as a causative factor in a case of Chinese herbal nephropathy.<br />
Nephrol. Dial. Transplant. 17: 524-525, 2002.<br />
Cui S., Verroust P.J., Moestrup S.K. and Christensen E.I. Megalin/gp330 mediates uptake of<br />
albumin in renal proximal tubule. Am. J. Physiol 271: F900-F907, 1996.<br />
D'Amico G. and Bazzi C. Urinary protein and enzyme excretion as markers of tubular<br />
damage. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 12: 639-643, 2003.<br />
Daniel H. and Herget M. Cellular and molecular mechanisms of renal pepti<strong>de</strong> transport. Am.<br />
J. Physiol. 273: F1-F8, 1997.<br />
Davis C.G., Goldstein J.L., Sudhof T.C., An<strong>de</strong>rson R.G., Russell D.W. and Brown M.S. Acid<strong>de</strong>pen<strong>de</strong>nt<br />
ligand dissociation and recycling of LDL receptor mediated by growth<br />
factor homology region. Nature 326: 760-765, 1987.<br />
De Broe M.E., Paulus G.J., Verpooten G.A., Roels F., Buyssens N., We<strong>de</strong>en R., Van Hoof<br />
F. and Tulkens P.M. Early effects of gentamicin, tobramycin, and amikacin on the<br />
human kidney. Kidney Int. 25: 643-652, 1984.<br />
<strong>de</strong> Lannoy I.A., Mandin R.S. and Silverman M. Renal secretion of vinblastine, vincristine and<br />
colchicine in vivo. J. Pharmacol. Exp. Ther. 268: 388-395, 1994.<br />
Debelle F., Nortier J., Arlt V.M., De Prez E., Vienne A., Salmon I., Phillips D.H., Deschodt-<br />
Lanckman M. and Vanherweghem J.L. Effects of <strong>de</strong>xfenfluramine on aristolochic acid<br />
nephrotoxicity in a rat mo<strong>de</strong>l for Chinese-herb nephropathy. Arch. Toxicol. 77: 218-<br />
226, 2003.<br />
Debelle F.D., Nortier J.L., De Prez E.G., Garbar C.H., Vienne A.R., Salmon I.J., Deschodt-<br />
Lanckman M.M. and Vanherweghem J.L. Aristolochic acids induce chronic renal<br />
failure with interstitial fibrosis in salt-<strong>de</strong>pleted rats. J. Am. Soc. Nephrol. 13: 431-436,<br />
2002.<br />
Debelle F.D., Nortier J.L., Husson C.P., De Prez E.G., Vienne A.R., Rombaut K., Salmon I.J.,<br />
Deschodt-Lanckman M.M. and Vanherweghem J.L. The renin-angiotensin system<br />
195
locka<strong>de</strong> does not prevent renal interstitial fibrosis induced by aristolochic acids.<br />
Kidney Int. 66: 1815-1825, 2004.<br />
Depierreux M., Van Damme B., Van<strong>de</strong>n Houte K. and Vanherweghem J.L. Pathologic<br />
aspects of a newly <strong><strong>de</strong>s</strong>cribed nephropathy related to the prolonged use of Chinese<br />
herbs. Am. J. Kidney Dis. 24: 172-180, 1994.<br />
Deschodt-Lanckman M., Pauwels S., Najdovski T., Dimaline R. and Dockray G.J. In vitro and<br />
in vivo <strong>de</strong>gradation of human gastrin by endopeptidase 24.11. Gastroenterology 94:<br />
712-721, 1988.<br />
Devuyst O., Christie P.T., Courtoy P.J., Beauwens R. and Thakker R.V. Intra-renal and<br />
subcellular distribution of the human chlori<strong>de</strong> channel, CLC-5, reveals a<br />
pathophysiological basis for Dent's disease. Hum. Mol. Genet. 8: 247-257, 1999.<br />
Eisenbach G.M., Liew J.B., Boylan J.W., Manz N. and Muir P. Effect of angiotensin on the<br />
filtration of protein in the rat kidney: a micropuncture study. Kidney Int. 8: 80-87,<br />
1975.<br />
Ekstrom B., Peterson P.A. and Berggard I. A urinary and plasma alpha1-glycoprotein of low<br />
molecular weight: isolation and some properties. Biochem. Biophys. Res. Commun.<br />
65: 1427-1433, 1975.<br />
Finn W.F. and Porter G.A. Clinical nephrotoxins. 2nd Ed. edited by De Broe M. E. , Porter G.<br />
A. , Bennett W. N. and Verpooten G. A. 621-655, 2003.<br />
Ford J.M. and Hait W.N. Pharmacology of drugs that alter multidrug resistance in cancer.<br />
Pharmacol. Rev. 42: 155-199, 1990.<br />
Foulkes E.C. Transport of heavy metals by the kidney. Toxicol. Lett. 53: 29-31, 1990.<br />
Fyfe J.C., Ramanujam K.S., Ramaswamy K., Patterson D.F. and Seetharam B. Defective<br />
brush-bor<strong>de</strong>r expression of intrinsic factor-cobalamin receptor in canine inherited<br />
intestinal cobalamin malabsorption. J. Biol. Chem. 266: 4489-4494, 1991.<br />
Gburek J., Birn H., Verroust P.J., Goj B., Jacobsen C., Moestrup S.K., Willnow T.E. and<br />
Christensen E.I. Renal uptake of myoglobin is mediated by the endocytic receptors<br />
megalin and cubilin. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285: F451-F458, 2003.<br />
Gburek J., Verroust P.J., Willnow T.E., Fyfe J.C., Nowacki W., Jacobsen C., Moestrup S.K.<br />
and Christensen E.I. Megalin and cubilin are endocytic receptors involved in renal<br />
clearance of hemoglobin. J. Am. Soc. Nephrol. 13: 423-430, 2002.<br />
Gekle M., Drumm K., Mil<strong>de</strong>nberger S., Freudinger R., Gassner B. and Silbernagl S. Inhibition<br />
of Na+-H+ exchange impairs receptor-mediated albumin endocytosis in renal<br />
proximal tubule-<strong>de</strong>rived epithelial cells from opossum. J. Physiol. 520 Pt 3: 709-721,<br />
1999.<br />
Gekle M., Knaus P., Nielsen R., Mil<strong>de</strong>nberger S., Freudinger R., Wohlfarth V., Sauvant C.<br />
and Christensen E.I. Transforming growth factor-beta1 reduces megalin- and cubilinmediated<br />
endocytosis of albumin in proximal-tubule-<strong>de</strong>rived opossum kidney cells. J.<br />
Physiol. 552: 471-481, 2003.<br />
Gekle M., Mil<strong>de</strong>nberger S., Freudinger R., Schwerdt G. and Silbernagl S. Albumin<br />
endocytosis in OK cells: <strong>de</strong>pen<strong>de</strong>nce on actin and microtubules and regulation by<br />
protein kinases. Am. J. Physiol. 272: F668 -F677, 1997.<br />
196
Gekle M., Mil<strong>de</strong>nberger S., Freudinger R. and Silbernagl S. The mycotoxin ochratoxin-A<br />
impairs protein uptake in cells <strong>de</strong>rived from the proximal tubule of the kidney<br />
(opossum kidney cells). J. Pharmacol. Exp. Ther. 271: 1-6, 1994.<br />
Gekle M., Mil<strong>de</strong>nberger S., Freudinger R. and Silbernagl S. Endosomal alkalinization<br />
reduces Jmax and Km of albumin receptor- mediated endocytosis in OK cells. Am. J.<br />
Physiol. 268: F899-F906, 1995a.<br />
Gekle M., Mil<strong>de</strong>nberger S., Freudinger R. and Silbernagl S. Kinetics of receptor-mediated<br />
endocytosis of albumin in cells <strong>de</strong>rived from the proximal tubule of the kidney<br />
(opossum kidney cells): influence of Ca2+ and cAMP. Pflugers Arch. 430: 374-380,<br />
1995b.<br />
Gekle M., Mil<strong>de</strong>nberger S., Freudinger R. and Silbernagl S. Functional characterization of<br />
albumin binding to the apical membrane of OK cells. Am. J. Physiol. 271: F286-F291,<br />
1996.<br />
Gillerot G., Jadoul M., Arlt V.M., van Ypersele D.S., Schmeiser H.H., But P.P., Bieler C.A.<br />
and Cosyns J.P. Aristolochic acid nephropathy in a Chinese patient: time to abandon<br />
the term "Chinese herbs nephropathy"? Am. J. Kidney Dis. 38: E26-2001.<br />
Grubb A. Diagnostic value of analysis of cystatin C and protein HC in biological fluids. Clin.<br />
Nephrol. 38 Suppl 1: S20-S27, 1992.<br />
Grun<strong>de</strong>mann D., Gorboulev V., Gambaryan S., Veyhl M. and Koepsell H. Drug excretion<br />
mediated by a new prototype of polyspecific transporter. Nature 372: 549-552, 1994.<br />
Gu<strong>de</strong>r W.G. and Ross B.D. Enzyme distribution along the nephron. Kidney Int. 26: 101-111,<br />
1984.<br />
Habu Y., Yano I., Hashimoto Y., Saito H. and Inui K. p-Aminohippurate transport at the<br />
apical membrane in the OK kidney epithelial cell line. Pharm. Res. 19: 1822-1826,<br />
2002.<br />
Hammad S.M., Barth J.L., Knaak C. and Argraves W.S. Megalin acts in concert with cubilin<br />
to mediate endocytosis of high <strong>de</strong>nsity lipoproteins. J. Biol. Chem. 275: 12003-12008,<br />
2000.<br />
Hammad S.M., Stefansson S., Twal W.O., Drake C.J., Fleming P., Remaley A., Brewer H.B.,<br />
Jr. and Argraves W.S. Cubilin, the endocytic receptor for intrinsic factor-vitamin B(12)<br />
complex, mediates high-<strong>de</strong>nsity lipoprotein holoparticle endocytosis. Proc. Natl. Acad.<br />
Sci. U. S. A 96: 10158-10163, 1999.<br />
Hayes J.D. and Pulford D.J. The glutathione S-transferase supergene family: regulation of<br />
GST and the contribution of the isoenzymes to cancer chemoprotection and drug<br />
resistance. Crit Rev. Biochem. Mol. Biol. 30: 445-600, 1995.<br />
Heinle H. and Wen<strong>de</strong>l A. The activities of the key enzymes of the gamma-glutamyl cycle in<br />
microdissected segments of the rat nephron. FEBS Lett. 73: 220-224, 1977.<br />
Helmle-Kolb C., Montrose M.H., Stange G. and Murer H. Regulation of Na+/H+ exchange in<br />
opossum kidney cells by parathyroid hormone, cyclic AMP and phorbol esters.<br />
Pflugers Arch. 415: 461-470, 1990.<br />
Herak-Kramberger C.M., Brown D. and Sabolic I. Cadmium inhibits vacuolar H(+)-ATPase<br />
and endocytosis in rat kidney cortex. Kidney Int. 53: 1713-1726, 1998.<br />
197
Herak-Kramberger C.M., Spindler B., Biber J., Murer H. and Sabolic I. Renal type II Na/Picotransporter<br />
is strongly impaired whereas the Na/sulphate-cotransporter and<br />
aquaporin 1 are unchanged in cadmium-treated rats. Pflugers Arch. 432: 336-344,<br />
1996.<br />
Hilpert J., Nykjaer A., Jacobsen C., Wallukat G., Nielsen R., Moestrup S.K., Haller H., Luft<br />
F.C., Christensen E.I. and Willnow T.E. Megalin antagonizes activation of the<br />
parathyroid hormone receptor. J. Biol. Chem. 274: 5620-5625, 1999.<br />
Hjalm G., Murray E., Crumley G., Harazim W., Lundgren S., Onyango I., Ek B., Larsson M.,<br />
Juhlin C., Hellman P., Davis H., Akerstrom G., Rask L. and Morse B. Cloning and<br />
sequencing of human gp330, a Ca(2+)-binding receptor with potential intracellular<br />
signaling properties. Eur. J. Biochem. 239: 132-137, 1996.<br />
Hori R., Okamura M., Takayama A., Hirozane K. and Takano M. Transport of organic anion<br />
in the OK kidney epithelial cell line. Am. J. Physiol. 264: F975-F980, 1993.<br />
Horio M., Pastan I., Gottesman M.M. and Handler J.S. Transepithelial transport of vinblastine<br />
by kidney-<strong>de</strong>rived cell lines. Application of a new kinetic mo<strong>de</strong>l to estimate in situ Km<br />
of the pump. Biochim. Biophys. Acta 1027: 116-122, 1990.<br />
Hosoyamada M., Sekine T., Kanai Y. and Endou H. Molecular cloning and functional<br />
expression of a multispecific organic anion transporter from human kidney. Am. J.<br />
Physiol. 276: F122-F128, 1999.<br />
Hruska K.A., Moskowitz D., Esbrit P., Civitelli R., Westbrook S. and Huskey M. Stimulation<br />
of inositol trisphosphate and diacylglycerol production in renal tubular cells by<br />
parathyroid hormone. J. Clin. Invest 79: 230-239, 1987.<br />
INSERM. La fonction rénale. Edité par Bonvalet J. P. , INSERM/Flammarion Mé<strong>de</strong>cine 16-<br />
17, 1980.<br />
Inui K.I., Masuda S. and Saito H. Cellular and molecular aspects of drug transport in the<br />
kidney. Kidney Int. 58: 944-958, 2000.<br />
Jankowski M., Biber J. and Murer H. PTH-induced internalization of a type IIa Na/Pi<br />
cotransporter in OK-cells. Pflugers Arch. 438: 689-693, 1999.<br />
Juhlin C., Holmdahl R., Johansson H., Rastad J., Akerstrom G. and Klareskog L. Monoclonal<br />
antibodies with exclusive reactivity against parathyroid cells and tubule cells of the<br />
kidney. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 84: 2990-2994, 1987.<br />
Juhlin C., Lundgren S., Johansson H., Lorentzen J., Rask L., Larsson E., Rastad J.,<br />
Akerstrom G. and Klareskog L. 500-Kilodalton calcium sensor regulating cytoplasmic<br />
Ca2+ in cytotrophoblast cells of human placenta. J. Biol. Chem. 265: 8275-8279,<br />
1990.<br />
Jutabha P., Kanai Y., Hosoyamada M., Chairoungdua A., Kim d.K., Iribe Y., Babu E., Kim<br />
J.Y., Anzai N., Chatsudthipong V. and Endou H. I<strong>de</strong>ntification of a novel voltagedriven<br />
organic anion transporter present at apical membrane of renal proximal tubule.<br />
J. Biol. Chem. 278: 27930-27938, 2003.<br />
Kabanda A., Jadoul M., Lauwerys R., Bernard A. and van Ypersele <strong>de</strong> Strihou C. Low<br />
molecular weight proteinuria in Chinese herbs nephropathy. Kidney Int. 48: 1571-<br />
1576, 1995.<br />
198
Kanai N., Lu R., Bao Y., Wolkoff A.W. and Schuster V.L. Transient expression of oatp<br />
organic anion transporter in mammalian cells: i<strong>de</strong>ntification of candidate substrates.<br />
Am. J. Physiol. 270: F319-F325, 1996.<br />
Kanalas J.J. and Makker S.P. Analysis of a 45-kDa protein that binds to the Heymann<br />
nephritis autoantigen GP330. J. Biol. Chem. 268: 8188-8192, 1993.<br />
Karbach U., Kricke J., Meyer-Wentrup F., Gorboulev V., Volk C., Loffing-Cueni D., Kaissling<br />
B., Bachmann S. and Koepsell H. Localization of organic cation transporters OCT1<br />
and OCT2 in rat kidney. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 279: F679-F687, 2000.<br />
Karniski L.P., Lotscher M., Fucentese M., Hilfiker H., Biber J. and Murer H.<br />
Immunolocalization of sat-1 sulfate/oxalate/bicarbonate anion exchanger in the rat<br />
kidney. Am. J. Physiol. 275: F79-F87, 1998.<br />
Kerjaschki D. and Farquhar M.G. The pathogenic antigen of Heymann nephritis is a<br />
membrane glycoprotein of the renal proximal tubule brush bor<strong>de</strong>r. Proc. Natl. Acad.<br />
Sci. U. S. A 79: 5557-5561, 1982.<br />
Kerjaschki D., Noronha-Blob L., Sacktor B. and Farquhar M.G. Microdomains of distinctive<br />
glycoprotein composition in the kidney proximal tubule brush bor<strong>de</strong>r. J. Cell Biol. 98:<br />
1505-1513, 1984.<br />
Keusch I., Traebert M., Lotscher M., Kaissling B., Murer H. and Biber J. Parathyroid hormone<br />
and dietary phosphate provoke a lysosomal routing of the proximal tubular Na/Picotransporter<br />
type II. Kidney Int. 54: 1224-1232, 1998.<br />
Kim K.R., Lee H.Y., Kim C.K. and Park Y.S. Alteration of renal amino acid transport system<br />
in cadmium-intoxicated rats. Toxicol. Appl. Pharmacol. 106: 102-111, 1990.<br />
Klein I., Sarkadi B. and Varadi A. An inventory of the human ABC proteins. Biochim. Biophys.<br />
Acta 1461: 237-262, 1999.<br />
Klisic J., Hu M.C., Nief V., Reyes L., Fuster D., Moe O.W. and Ambuhl P.M. Insulin activates<br />
Na(+)/H(+) exchanger 3: biphasic response and glucocorticoid <strong>de</strong>pen<strong>de</strong>nce. Am. J.<br />
Physiol. Renal Physiol. 283: F532-F539, 2002.<br />
Koenig H., Goldstone A. and Hughes C. Lysosomal enzymuria in the testosterone-treated<br />
mouse. A manifestation of cell <strong>de</strong>fecation of residual bodies. Lab. Invest. 39: 329-<br />
341, 1978.<br />
Koepsell H., Gorboulev V. and Arndt P. Molecular pharmacology of organic cation<br />
transporters in kidney. J. Membr. Biol. 167: 103-117, 1999.<br />
Koren G. Clinical pharmacokinetic significance of the renal tubular secretion of digoxin. Clin.<br />
Pharmacokinet. 13: 334- 343, 1987.<br />
Korenberg J.R., Argraves K.M., Chen X.N., Tran H., Strickland D.K. and Argraves W.S.<br />
Chromosomal localization of human genes for the LDL receptor family member<br />
glycoprotein 330 (LRP2) and its associated protein RAP (LRPAP1). Genomics 22:<br />
88-93, 1994.<br />
Kounnas M.Z., Argraves W.S. and Strickland D.K. The 39-kDa receptor-associated protein<br />
interacts with two members of the low <strong>de</strong>nsity lipoprotein receptor family, alpha 2macroglobulin<br />
receptor and glycoprotein 330. J. Biol. Chem. 267: 21162-21166,<br />
1992.<br />
199
Kounnas M.Z., Chappell D.A., Strickland D.K. and Argraves W.S. Glycoprotein 330, a<br />
member of the low <strong>de</strong>nsity lipoprotein receptor family, binds lipoprotein lipase in vitro.<br />
J. Biol. Chem. 268: 14176-14181, 1993.<br />
Kounnas M.Z., Hau<strong>de</strong>nschild C.C., Strickland D.K. and Argraves W.S. Immunological<br />
localization of glycoprotein 330, low <strong>de</strong>nsity lipoprotein receptor related protein and<br />
39 kDa receptor associated protein in embryonic mouse tissues. In Vivo 8: 343-351,<br />
1994.<br />
Kounnas M.Z., Loukinova E.B., Stefansson S., Harmony J.A., Brewer B.H., Strickland D.K.<br />
and Argraves W.S. I<strong>de</strong>ntification of glycoprotein 330 as an endocytic receptor for<br />
apolipoprotein J/clusterin. J. Biol. Chem. 270: 13070-13075, 1995.<br />
Koyama H., Goodpasture C., Miller M.M., Teplitz R.L. and Riggs A.D. Establishment and<br />
characterization of a cell line from the American opossum (Di<strong>de</strong>lphys virginiana). In<br />
Vitro 14: 239-246, 1978.<br />
Kozyraki R., Fyfe J., Kristiansen M., Ger<strong><strong>de</strong>s</strong> C., Jacobsen C., Cui S., Christensen E.I.,<br />
Aminoff M., <strong>de</strong> la C.A., Krahe R., Verroust P.J. and Moestrup S.K. The intrinsic factorvitamin<br />
B12 receptor, cubilin, is a high-affinity apolipoprotein A-I receptor facilitating<br />
endocytosis of high-<strong>de</strong>nsity lipoprotein. Nat. Med. 5: 656-661, 1999.<br />
Kozyraki R., Fyfe J., Verroust P.J., Jacobsen C., Dautry-Varsat A., Gburek J., Willnow T.E.,<br />
Christensen E.I. and Moestrup S.K. Megalin-<strong>de</strong>pen<strong>de</strong>nt cubilin-mediated endocytosis<br />
is a major pathway for the apical uptake of transferrin in polarized epithelia. Proc.<br />
Natl. Acad. Sci. U. S. A 98: 12491-12496, 2001.<br />
Kozyraki R., Kristiansen M., Silahtaroglu A., Hansen C., Jacobsen C., Tommerup N.,<br />
Verroust P.J. and Moestrup S.K. The human intrinsic factor-vitamin B12 receptor,<br />
cubilin: molecular characterization and chromosomal mapping of the gene to 10p<br />
within the autosomal recessive megaloblastic anemia (MGA1) region. Blood 91:<br />
3593-3600, 1998.<br />
Kragh-Hansen U. Molecular aspects of ligand binding to serum albumin. Pharmacol. Rev. 33:<br />
17-53, 1981.<br />
Kristiansen M., Aminoff M., Jacobsen C., <strong>de</strong> la C.A., Krahe R., Verroust P.J. and Moestrup<br />
S.K. Cubilin P1297L mutation associated with hereditary megaloblastic anemia 1<br />
causes impaired recognition of intrinsic factor-vitamin B(12) by cubilin. Blood 96: 405-<br />
409, 2000.<br />
Kristiansen M., Kozyraki R., Jacobsen C., Nexo E., Verroust P.J. and Moestrup S.K.<br />
Molecular dissection of the intrinsic factor-vitamin B12 receptor, cubilin, discloses<br />
regions important for membrane association and ligand binding. J. Biol. Chem. 274:<br />
20540-20544, 1999.<br />
Kriz W. and Bankir L. A standard nomenclature for structures of the kidney. The Renal<br />
Commission of the International Union of Physiological Sciences (IUPS). Kidney Int.<br />
33: 1-7, 1988.<br />
Krumbiegel G., Hallensleben J., Mennicke W.H., Rittmann N. and Roth H.J. Studies on the<br />
metabolism of aristolochic acids I and II. Xenobiotica 17: 981-991, 1987.<br />
200
Krumme B., Endmeir R., Vanhaelen M. and Walb D. Reversible Fanconi syndrome after<br />
ingestion of a Chinese herbal 'remedy' containing aristolochic acid. Nephrol. Dial.<br />
Transplant. 16: 400-402, 2001.<br />
LaFerla F.M., Troncoso J.C., Strickland D.K., Kawas C.H. and Jay G. Neuronal cell <strong>de</strong>ath in<br />
Alzheimer's disease correlates with apoE uptake and intracellular Abeta stabilization.<br />
J. Clin. Invest 100: 310-320, 1997.<br />
Lauwerys R.R. and Bernard A. Early <strong>de</strong>tection of the nephrotoxic effects of industrial<br />
chemicals: state of the art and future prospects. Am. J. Ind. Med. 11: 275-285, 1987.<br />
Le Hir M. and Dubach U.C. Activities of enzymes of the tricarboxylic acid cycle in segments<br />
of the rat nephron. Pflugers Arch. 395 : 239-243, 1982.<br />
Le Hir M., Dubach U.C. and Angielski S. Localization of nucleoti<strong>de</strong> pyrophosphatase in the<br />
rat kidney. Histochemistry 86: 207-210, 1986.<br />
Le Hir M., Dubach U.C. and Gu<strong>de</strong>r W.G. Distribution of acid hydrolases in the nephron of<br />
normal and diabetic rats. Int. J. Biochem. 12: 41-45, 1980.<br />
Le Panse S., Ayani E., Mulliez N., Chatelet F., Cywiner-Golenzer C., Galceran M., Cita<strong>de</strong>lle<br />
D., Roux C., Ronco P. and Verroust P. Antibodies to the 280-kd coated pit protein,<br />
target of teratogenic antibodies, produce alterations in the traffic of internalized<br />
proteins. Am. J. Pathol. 145: 1526-1536, 1994.<br />
Le Panse S., Galceran M., Pontillon F., Lelongt B., van <strong>de</strong> P.M., Ronco P.M. and Verroust<br />
P.J. Immunofunctional properties of a yolk sac epithelial cell line expressing two<br />
proteins gp280 and gp330 of the intermicrovillar area of proximal tubule cells:<br />
inhibition of endocytosis by the specific antibodies. Eur. J. Cell Biol. 67: 120-129,<br />
1995.<br />
Lebeau C., Verroust P., Arlt V.M., Devuyst O. and Beauwens R. Aristolochic acid and<br />
ochratoxin A interfere differently with receptor-mediated endocytosis in proximal<br />
tubule cells. Nephrologie 24: 65, 2003.<br />
Lebeau C., Verroust P.J., Arlt V.M., Devuyst O. and Beauwens R. The nephrotoxins<br />
aristolochic acid and ochratoxin A interfere with receptor-mediated endocytosis in<br />
proximal tubule cells. J. Am. Soc. Nephrol. 13: 157A, 2002.<br />
Lee H.Y., Kim K.R. and Park Y.S. Transport kinetics of glucose and alanine in renal brushbor<strong>de</strong>r<br />
membrane vesicles of cadmium-intoxicated rabbits. Pharmacol. Toxicol. 69:<br />
390-395, 1991.<br />
Lee S., Lee T., Lee B., Choi H., Yang M., Ihm C.G. and Kim M. Fanconi's syndrome and<br />
subsequent progressive renal failure caused by a Chinese herb containing<br />
aristolochic acid. Nephrology. (Carlton. ) 9: 126-129, 2004.<br />
Leheste J.R., Rolinski B., Vorum H., Hilpert J., Nykjaer A., Jacobsen C., Aucouturier P.,<br />
Moskaug J.O., Otto A., Christensen E.I. and Willnow T.E. Megalin knockout mice as<br />
an animal mo<strong>de</strong>l of low molecular weight proteinuria. Am. J. Pathol. 155: 1361-1370,<br />
1999.<br />
Levine J.S., Allen R.H., Alpers D.H. and Seetharam B. Immunocytochemical localization of<br />
the intrinsic factor-cobalamin receptor in dog-ileum: distribution of intracellular<br />
receptor during cell maturation. J. Cell Biol. 98: 1111-1118, 1984.<br />
201
Li X., Yang L. and Yu Y. [An analysis of the clinical and pathological characteristics of mutong<br />
(a Chinese herb) induced tubulointerstitial nephropathy] . Zhonghua Nei Ke. Za<br />
Zhi. 40: 681-687, 2001.<br />
Liu M.C., Maruyama S., Mizuno M., Morita Y., Hanaki S., Yuzawa Y. and Matsuo S. The<br />
nephrotoxicity of Aristolochia manshuriensis in rats is attributable to its aristolochic<br />
acids. Clin. Exp. Nephrol. 7: 186-194, 2003.<br />
Liu W., Yu W.R., Carling T., Juhlin C., Rastad J., Ri<strong>de</strong>felt P., Akerstrom G. and Hellman P.<br />
Regulation of gp330/megalin expression by vitamins A and D. Eur. J. Clin. Invest 28:<br />
100-107, 1998.<br />
Lo S.H., Mo K.L., Wong K.S., Poon S.P., Chan C.K., Lai C.K. and Chan A. Aristolochic acid<br />
nephropathy complicating a patient with focal segmental glomerulosclerosis. Nephrol.<br />
Dial. Transplant. 19: 1913-1915, 2004.<br />
Lord G.M., Cook T., Arlt V.M., Schmeiser H.H., Williams G. and Pusey C.D. Urothelial<br />
malignant disease and Chinese herbal nephropathy. Lancet 358: 1515-1516 , 2001.<br />
Lord G.M., Tagore R., Cook T., Gower P. and Pusey C.D. Nephropathy caused by Chinese<br />
herbs in the UK. Lancet 354: 481 -482, 1999.<br />
Lu R., Kanai N., Bao Y., Wolkoff A.W. and Schuster V.L. Regulation of renal oatp mRNA<br />
expression by testosterone. Am. J. Physiol. 270: F332-F337, 1996.<br />
Lundgren S., Carling T., Hjalm G., Juhlin C., Rastad J., Pihlgren U., Rask L., Akerstrom G.<br />
and Hellman P. Tissue distribution of human gp330/megalin, a putative Ca(2+)sensing<br />
protein. J. Histochem. Cytochem. 45: 383-392, 1997.<br />
Makker S.P., Widstrom R. and Huang J. Transcription and translation of gp600 and receptorassociated<br />
protein (RAP) in active Heymann nephritis. Am. J. Pathol. 146: 1481-<br />
1487, 1995.<br />
Malmstrom K. and Murer H. Parathyroid hormone inhibits phosphate transport in OK cells but<br />
not in LLC-PK1 and JTC-12.P3 cells. Am. J. Physiol. 251: C23-C31, 1986.<br />
Malmstrom K. and Murer H. Parathyroid hormone regulates phosphate transport in OK cells<br />
via an irreversible inactivation of a membrane protein. FEBS Lett. 216: 257-260,<br />
1987.<br />
Malstrom K., Stange G. and Murer H. I<strong>de</strong>ntification of proximal tubular transport functions in<br />
the established kidney cell line, OK. Biochim. Biophys. Acta 902: 269-277, 1987.<br />
Marino M., Andrews D., Brown D. and McCluskey R.T. Transcytosis of retinol-binding protein<br />
across renal proximal tubule cells after megalin (gp 330)-mediated endocytosis. J.<br />
Am. Soc. Nephrol. 12: 637-648, 2001.<br />
Marino M., Zheng G., Chiovato L., Pinchera A., Brown D., Andrews D. and McCluskey R.T.<br />
Role of megalin (gp330) in transcytosis of thyroglobulin by thyroid cells. A novel<br />
function in the control of thyroid hormone release. J. Biol. Chem. 275: 7125-7137,<br />
2000.<br />
Marshansky V., Ausiello D.A. and Brown D. Physiological importance of endosomal<br />
acidification: potential role in proximal tubulopathies. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens.<br />
11: 527-537, 2002.<br />
202
Marshansky V., Bourgoin S., Londono I., Bendayan M., Maranda B. and Vinay P. Receptormediated<br />
endocytosis in kidney proximal tubules: recent advances and hypothesis.<br />
Electrophoresis 18: 2661-2676, 1997.<br />
Martinez F., Manganel M., Montrose-Rafiza<strong>de</strong>h C., Werner D. and Roch-Ramel F. Transport<br />
of urate and p-aminohippurate in rabbit renal brush-bor<strong>de</strong>r membranes. Am. J.<br />
Physiol. 258: F1145-F1153, 1990.<br />
Maruhn D., Fuchs I., Mues G. and Bock K.D. Normal limits of urinary excretion of eleven<br />
enzymes. Clin. Chem. 22: 1567-1574 , 1976.<br />
Masuda S., Ibaramoto K., Takeuchi A., Saito H., Hashimoto Y. and Inui K.I. Cloning and<br />
functional characterization of a new multispecific organic anion transporter, OAT-K2,<br />
in rat kidney. Mol. Pharmacol. 55: 743-752, 1999a.<br />
Masuda S., Saito H. and Inui K.I. Interactions of nonsteroidal anti-inflammatory drugs with rat<br />
renal organic anion transporter, OAT-K1. J. Pharmacol. Exp. Ther. 283: 1039-1042,<br />
1997.<br />
Masuda S., Takeuchi A., Saito H., Hashimoto Y. and Inui K. Functional analysis of rat renal<br />
organic anion transporter OAT-K1: bidirectional methotrexate transport in apical<br />
membrane. FEBS Lett. 459: 128-132, 1999b.<br />
Maunsbach A.B. and Christensen E.I. Handbook of Physiology (Renal Physiology vol 1).<br />
edited by Windhager EE, New York, Cornell University Medical College 41-107, 1992.<br />
McKinney T.D., Scheller M.B., Hosford M. and McAteer J.A. Tetraethylammonium transport<br />
by OK cells. J. Am. Soc. Nephrol. 1: 902-909, 1990.<br />
Mengs U. On the histopathogenesis of rat forestomach carcinoma caused by aristolochic<br />
acid. Arch. Toxicol. 52: 209-220, 1983.<br />
Mengs U. Acute toxicity of aristolochic acid in ro<strong>de</strong>nts. Arch. Toxicol. 59: 328-331, 1987.<br />
Mengs U. Tumour induction in mice following exposure to aristolochic acid. Arch. Toxicol. 61:<br />
504-505, 1988.<br />
Mengs U., Lang W. and Poch J.A. The carcinogenic action of aristolochic acid in rats. Arch.<br />
Toxicol. 51: 107-119, 1982.<br />
Mengs U. and Stotzem C.D. Toxicity of aristolochic acid - a subacute study in male rats.<br />
Med. Sci. Res. 20: 223-224, 1992.<br />
Mengs U. and Stotzem C.D. Renal toxicity of aristolochic acid in rats as an example of<br />
nephrotoxicity testing in routine toxicology. Arch. Toxicol. 67: 307-311, 1993.<br />
Meyer M.M., Chen T.P. and Bennett W.M. Chinese herb nephropathy. B.U.M.C. proceedings<br />
13: 334-337, 2000.<br />
Mix D.B., Guinau<strong>de</strong>au H. and Shamma M. The aristolochic acids and aristolactams. J.<br />
Natural Products 45: 657-666, 1982.<br />
Mizuta K., Saito A., Watanabe T., Nagura M., Arakawa M., Shimizu F. and Hoshino T.<br />
Ultrastructural localization of megalin in the rat cochlear duct. Hear. Res. 129: 83-91,<br />
1999.<br />
203
Moestrup S.K., Birn H., Fischer P.B., Petersen C.M., Verroust P.J., Sim R.B., Christensen<br />
E.I. and Nexo E. Megalin-mediated endocytosis of transcobalamin-vitamin-B12<br />
complexes suggests a role of the receptor in vitamin-B12 homeostasis. Proc. Natl.<br />
Acad. Sci. U. S. A 93: 8612-8617, 1996.<br />
Moestrup S.K., Cui S., Vorum H., Bregengard C., Bjorn S.E., Norris K., Gliemann J. and<br />
Christensen E.I. Evi<strong>de</strong>nce that epithelial glycoprotein 330/megalin mediates uptake of<br />
polybasic drugs. J. Clin. Invest 96: 1404-1413, 1995.<br />
Moestrup S.K., Kozyraki R., Kristiansen M., Kaysen J.H., Rasmussen H.H., Brault D.,<br />
Pontillon F., Goda F.O., Christensen E.I., Hammond T.G. and Verroust P.J. The<br />
intrinsic factor-vitamin B12 receptor and target of teratogenic antibodies is a megalinbinding<br />
peripheral membrane protein with homology to <strong>de</strong>velopmental proteins. J.<br />
Biol. Chem. 273: 5235-5242, 1998a.<br />
Moestrup S.K., Nielsen S., Andreasen P., Jorgensen K.E., Nykjaer A., Roigaard H.,<br />
Gliemann J. and Christensen E.I. Epithelial glycoprotein-330 mediates endocytosis of<br />
plasminogen activator-plasminogen activator inhibitor type-1 complexes. J. Biol.<br />
Chem. 268: 16564-16570, 1993.<br />
Moestrup S.K., Schousboe I., Jacobsen C., Leheste J.R., Christensen E.I. and Willnow T.E.<br />
beta2-glycoprotein-I (apolipoprotein H) and beta2-glycoprotein-I-phospholipid<br />
complex harbor a recognition site for the endocytic receptor megalin. J. Clin. Invest<br />
102: 902-909, 1998b.<br />
Moestrup S.K. and Verroust P.J. Megalin- and cubilin-mediated endocytosis of protein-bound<br />
vitamins, lipids, and hormones in polarized epithelia. Annu. Rev. Nutr. 21: 407-428,<br />
2001.<br />
Molitoris B.A., Dahl R. and Geer<strong><strong>de</strong>s</strong> A. Cytoskeleton disruption and apical redistribution of<br />
proximal tubule Na(+)-K(+)-ATPase during ischemia. Am. J. Physiol. 263: F488-F495,<br />
1992.<br />
Molitoris B.A., Hoilien C.A., Dahl R., Ahnen D.J., Wilson P.D. and Kim J. Characterization of<br />
ischemia-induced loss of epithelial polarity. J. Membr. Biol. 106: 233-242, 1988.<br />
Moller J.V. and Sheikh M.I. Renal organic anion transport system: pharmacological,<br />
physiological, and biochemical aspects. Pharmacol. Rev. 34: 315-358, 1982.<br />
Murphy T.J. and Bylund D.B. Characterization of alpha-2 adrenergic receptors in the OK cell,<br />
an opossum kidney cell line. J. Pharmacol. Exp. Ther. 244: 571-578, 1988.<br />
Murphy T.J. and Bylund D.B. Characterization of serotonin-1B receptors negatively coupled<br />
to a<strong>de</strong>nylate cyclase in OK cells, a renal epithelial cell line from the opossum. J.<br />
Pharmacol. Exp. Ther. 249: 535-543, 1989.<br />
Mutti A. Detection of renal diseases in humans: <strong>de</strong>veloping markers and methods. Toxicol.<br />
Lett. 46: 177-191, 1989.<br />
Nagai J., Takano M., Hirozane K., Yasuhara M. and Inui K. Specificity of p-aminohippurate<br />
transport system in the OK kidney epithelial cell line. J. Pharmacol. Exp. Ther. 274:<br />
1161-1166, 1995.<br />
Nagai J., Yano I., Hashimoto Y., Takano M. and Inui K. Inhibition of PAH transport by<br />
parathyroid hormone in OK cells: involvement of protein kinase C pathway. Am. J.<br />
Physiol. 273: F674-F679, 1997.<br />
204
Nakai M., Fukase M., Kinoshita Y. and Fujita T. Atrial natriuretic factor inhibits phosphate<br />
uptake in opossum kidney cells: as a mo<strong>de</strong>l of renal proximal tubules. Biochem.<br />
Biophys. Res. Commun. 152: 1416-1420, 1988.<br />
Nath K.A. Tubulointerstitial changes as a major <strong>de</strong>terminant in the progression of renal<br />
damage. Am. J. Kidney Dis. 20: 1-17, 1992.<br />
Nortier J., Pozdzik A., Debelle F., Bourgea<strong>de</strong> M-F., Salmon I., Deschodt-Lanckman M. and<br />
Vanherweghem J.L. Role of inflammatory infiltrating cells in toxic experimental<br />
interstitial fibrosis (aristolochic acids). J. Am. Soc. Nephrol. 16: 645A, 2005.<br />
Nortier J.L., Deschodt-Lanckman M.M., Simon S., Thielemans N.O., De Prez E.G.,<br />
Depierreux M.F., Tielemans C.L., Richard C., Lauwerys R.R., Bernard A.M. and<br />
Vanherweghem J.L. Proximal tubular injury in Chinese herbs nephropathy: monitoring<br />
by neutral endopeptidase enzymuria. Kidney Int. 51: 288-293, 1997.<br />
Nortier J.L., Martinez M.C., Schmeiser H.H., Arlt V.M., Bieler C.A., Petein M., Depierreux<br />
M.F., De Pauw L., Abramowicz D., Vereerstraeten P. and Vanherweghem J.L.<br />
Urothelial carcinoma associated with the use of a Chinese herb (Aristolochia fangchi).<br />
N. Engl. J. Med. 342: 1686-1692, 2000.<br />
Nouwen E.J. and De Broe M.E. Human intestinal versus tissue-nonspecific alkaline<br />
phosphatase as complementary urinary markers for the proximal tubule. Kidney Int.<br />
Suppl 47: S43-S51, 1994.<br />
Nykjaer A., Dragun D., Walther D., Vorum H., Jacobsen C., Herz J., Melsen F., Christensen<br />
E.I. and Willnow T.E. An endocytic pathway essential for renal uptake and activation<br />
of the steroid 25-(OH) vitamin D3. Cell 96: 507-515, 1999.<br />
Nykjaer A., Fyfe J.C., Kozyraki R., Leheste J.R., Jacobsen C., Nielsen M.S., Verroust P.J.,<br />
Aminoff M., <strong>de</strong> la C.A., Moestrup S.K., Ray R., Gliemann J., Willnow T.E. and<br />
Christensen E.I. Cubilin dysfunction causes abnormal metabolism of the steroid<br />
hormone 25(OH) vitamin D(3). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 98: 13895-13900, 2001.<br />
Obermuller N., Kranzlin B., Blum W.F., Gretz N. and Witzgall R. An endocytosis <strong>de</strong>fect as a<br />
possible cause of proteinuria in polycystic kidney disease. Am. J. Physiol. Renal<br />
Physiol. 280: F244-F253, 2001.<br />
Okada H., Watanabe Y., Inoue T., Kobayashi T., Kanno Y., Shiota G., Nakamura T., Sugaya<br />
T., Fukamizu A. and Suzuki H. Transgene-<strong>de</strong>rived hepatocyte growth factor<br />
attenuates reactive renal fibrosis in aristolochic acid nephrotoxicity. Nephrol. Dial.<br />
Transplant. 18: 2515-2523, 2003.<br />
Okuda M., Urakami Y., Saito H. and Inui K. Molecular mechanisms of organic cation<br />
transport in OCT2-expressing Xenopus oocytes. Biochim. Biophys. Acta 1417: 224-<br />
231, 1999.<br />
Olbricht C.J., Garg L.C., Cannon J.K. and Tisher C.C. Acid phosphatase activity in the<br />
mammalian nephron. Am. J. Physiol. 247: F252-F259, 1984.<br />
Oleinikov A.V., Zhao J. and Makker S.P. Cytosolic adaptor protein Dab2 is an intracellular<br />
ligand of endocytic receptor gp600/megalin. Biochem. J. 347 Pt 3: 613-621, 2000.<br />
Orlando R.A., Ra<strong>de</strong>r K., Authier F., Yamazaki H., Posner B.I., Bergeron J.J. and Farquhar<br />
M.G. Megalin is an endocytic receptor for insulin. J. Am. Soc. Nephrol. 9: 1759-1766,<br />
1998.<br />
205
Pena J.M., Borras M., Ramos J. and Montoliu J. Rapidly progressive interstitial renal fibrosis<br />
due to a chronic intake of a herb (Aristolochia pistolochia) infusion. Nephrol. Dial.<br />
Transplant. 11: 1359-1360, 1996.<br />
Peng K.C., Cluzeaud F., Bens M., Van Huyen J.P., Wioland M.A., Lacave R. and Van<strong>de</strong>walle<br />
A. Tissue and cell distribution of the multidrug resistance-associated protein (MRP) in<br />
mouse intestine and kidney. J. Histochem. Cytochem. 47: 757 -768, 1999.<br />
Peterson P.A., Evrin P.E. and Berggard I. Differentiation of glomerular, tubular, and normal<br />
proteinuria: <strong>de</strong>terminations of urinary excretion of beta-2-macroglobulin, albumin, and<br />
total protein. J. Clin. Invest 48: 1189-1198, 1969.<br />
Pfau W., Schmeiser H.H. and Wiessler M. Aristolochic acid binds covalently to the exocyclic<br />
amino group of purine nucleoti<strong><strong>de</strong>s</strong> in DNA. Carcinogenesis 11: 313-319, 1990.<br />
Pfau W., Schmeiser H.H. and Wiessler M. N6-a<strong>de</strong>nyl arylation of DNA by aristolochic acid II<br />
and a synthetic mo<strong>de</strong>l for the putative proximate carcinogen . Chem. Res. Toxicol. 4:<br />
581-586, 1991.<br />
Pfister M.F., Le<strong>de</strong>rer E., Forgo J., Ziegler U., Lotscher M., Quabius E.S., Biber J. and Murer<br />
H. Parathyroid hormone-<strong>de</strong>pen<strong>de</strong>nt <strong>de</strong>gradation of type II Na+/Pi cotransporters. J.<br />
Biol. Chem. 272: 20125-20130, 1997.<br />
Pfister M.F., Ruf I., Stange G., Ziegler U., Le<strong>de</strong>rer E., Biber J. and Murer H. Parathyroid<br />
hormone leads to the lysosomal <strong>de</strong>gradation of the renal type II Na/Pi cotransporter.<br />
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 95: 1909-1914, 1998.<br />
Piwon N., Gunther W., Schwake M., Bosl M.R. and Jentsch T.J. ClC-5 Cl- -channel<br />
disruption impairs endocytosis in a mouse mo<strong>de</strong>l for Dent's disease. Nature 408:<br />
369-373, 2000.<br />
Pollock A.S., Warnock D.G. and Strewler G.J. Parathyroid hormone inhibition of Na+-H+<br />
antiporter activity in a cultured renal cell line. Am. J. Physiol. 250: F217-F225, 1986.<br />
Pourrat J., Montastruc J.L., Lacombe J.L., Cisterne J.M., Rascol O. and Dumazer P.<br />
[Nephropathy associated with Chinese herbal drugs. 2 cases]. Presse Med. 23: 1669-<br />
1994.<br />
Pozdzik A., Salmon I., Debelle F., Bourgea<strong>de</strong> M-F., Deschodt-Lanckman M., Vanherweghem<br />
J.L. and Nortier J. Rôle <strong>de</strong> l'infiltrat inflammatoire dans la fibrose interstitielle<br />
expérimentale toxique (aci<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>aristolochiques</strong>). Néphrologie et Thérapeutique 1:<br />
S171, 2005.<br />
Pritchard J.B. Intracellular alpha-ketoglutarate controls the efficacy of renal organic anion<br />
transport. J. Pharmacol. Exp. Ther. 274: 1278-1284, 1995.<br />
Pritchard J.B. and Miller D.S. Mechanisms mediating renal secretion of organic anions and<br />
cations. Physiol Rev. 73: 765-796, 1993.<br />
Quamme G., Biber J. and Murer H. Sodium-phosphate cotransport in OK cells: inhibition by<br />
PTH and "adaptation" to low phosphate. Am. J. Physiol. 257: F967-F973, 1989.<br />
Raychowdhury R., Niles J.L., McCluskey R.T. and Smith J.A. Autoimmune target in<br />
Heymann nephritis is a glycoprotein with homology to the LDL receptor. Science 244:<br />
1163-1165, 1989.<br />
206
Recio F. and Villamil F. Charge selectivity and urine amylase isoenzymes. Kidney Int. Suppl<br />
47: S89-S92, 1994.<br />
Rizzoli R. and Bonjour J.P. Effect of <strong>de</strong>xamethasone on parathyroid hormone stimulation of<br />
cyclic AMP in an opossum kidney cell line. J. Cell Physiol. 132: 517-523, 1987.<br />
Roch-Ramel F. Renal transport of organic anions. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 7: 517-<br />
524, 1998.<br />
Ronco P., Pollard H., Galceran M., Delauche M., Schwartz J.C. and Verroust P. Distribution<br />
of enkephalinase (membrane metalloendopeptidase, E.C. 3.4.24.11) in rat organs.<br />
Detection using a monoclonal antibody. Lab Invest 58: 210-217, 1988.<br />
Routledge P.A. The plasma protein binding of basic drugs. Br. J. Clin. Pharmacol. 22: 499-<br />
506, 1986.<br />
Russo L.M., Osicka T.M., Bonnet F., Jerums G. and Comper W.D. Albuminuria in<br />
hypertension is linked to altered lysosomal activity and TGF-beta1 expression.<br />
Hypertension 39: 281-286, 2002.<br />
Sabolic I., Herak-Kramberger C.M. and Brown D. Subchronic cadmium treatment affects the<br />
abundance and arrangement of cytoskeletal proteins in rat renal proximal tubule cells.<br />
Toxicology 165: 205-216, 2001.<br />
Sabolic I., Ljubojevic M., Herak-Kramberger C.M. and Brown D. Cd-MT causes endocytosis<br />
of brush-bor<strong>de</strong>r transporters in rat renal proximal tubules. Am. J. Physiol. Renal<br />
Physiol. 283: F1389-F1402, 2002.<br />
Sahali D., Mulliez N., Chatelet F., Dupuis R., Ronco P. and Verroust P. Characterization of a<br />
280-kD protein restricted to the coated pits of the renal brush bor<strong>de</strong>r and the epithelial<br />
cells of the yolk sac. Teratogenic effect of the specific monoclonal antibodies. J. Exp.<br />
Med. 167: 213-218, 1988.<br />
Sahali D., Mulliez N., Chatelet F., Laurent-Winter C., Cita<strong>de</strong>lle D., Roux C., Ronco P. and<br />
Verroust P. Coexpression in humans by kidney and fetal envelopes of a 280 kDacoated<br />
pit-restricted protein. Similarity with the murine target of teratogenic<br />
antibodies. Am. J. Pathol. 140: 33-44, 1992.<br />
Sahali D., Mulliez N., Chatelet F., Laurent-Winter C., Cita<strong>de</strong>lle D., Sabourin J.C., Roux C.,<br />
Ronco P. and Verroust P. Comparative immunochemistry and ontogeny of two<br />
closely related coated pit proteins. The 280-kd target of teratogenic antibodies and<br />
the 330-kd target of nephritogenic antibodies. Am. J. Pathol. 142: 1654-1667, 1993.<br />
Saito A., Pietromonaco S., Loo A.K. and Farquhar M.G. Complete cloning and sequencing<br />
of rat gp330/"megalin," a distinctive member of the low <strong>de</strong>nsity lipoprotein receptor<br />
gene family. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 91: 9725-9729, 1994.<br />
Sands J.M., Terada Y., Bernard L.M. and Knepper M.A. Aldose reductase activities in<br />
microdissected rat renal tubule segments. Am. J. Physiol. 256: F563-F569, 1989.<br />
Sauvant C., Holzinger H. and Gekle M. Modulation of the basolateral and apical step of<br />
transepithelial organic anion secretion in proximal tubular opossum kidney cells.<br />
Acute effects of epi<strong>de</strong>rmal growth factor and mitogen-activated protein kinase. J. Biol.<br />
Chem. 276: 14695-14703, 2001.<br />
207
Schaub T.P., Kartenbeck J., Konig J., Spring H., Dorsam J., Staehler G., Storkel S., Thon<br />
W.F. and Keppler D. Expression of the MRP2 gene-enco<strong>de</strong>d conjugate export pump<br />
in human kidney proximal tubules and in renal cell carcinoma. J. Am. Soc. Nephrol.<br />
10: 1159-1169, 1999.<br />
Schmeiser H.H., Bieler C.A., Wiessler M., van Ypersele <strong>de</strong> Strihou C. and Cosyns J.P.<br />
Detection of DNA adducts formed by aristolochic acid in renal tissue from patients<br />
with Chinese herbs nephropathy. Cancer Res. 56: 2025-2028, 1996.<br />
Schmeiser H.H., Frei E., Wiessler M. and Stiborova M. Comparison of DNA adduct formation<br />
by aristolochic acids in various in vitro activation systems by 32P-post-labelling:<br />
evi<strong>de</strong>nce for reductive activation by peroxidases. Carcinogenesis 18: 1055-1062,<br />
1997.<br />
Schmeiser H.H., Pool B.L. and Wiessler M. Mutagenicity of the two main components of<br />
commercially available carcinogenic aristolochic acid in Salmonella typhimurium.<br />
Cancer Lett. 23: 97-101, 1984.<br />
Schmid H. Quantitative microphotometric succinate <strong>de</strong>hydrogenase histochemistry in human<br />
nephron. Basic Appl. Histochem. 28: 221-231, 1984.<br />
Schmid H., Mall A., Scholz M. and Schmidt U. Unchanged glycolytic capacity in rat kidney<br />
un<strong>de</strong>r conditions of stimulated gluconeogenesis. Determination of<br />
phosphofructokinase and pyruvate kinase in microdissected nephron segments of<br />
fasted and acidotic animals. Hoppe Seylers. Z. Physiol Chem. 361: 819-827, 1980.<br />
Schmidt U. and Dubach U.C. Quantitative Histochemie am Nephron: Oxydoreduktasen und<br />
Na K stimulierte ATPase. Prog. Histochem. Cytochem. 2: 185-298, 1971.<br />
Schmitz C., Hilpert J., Jacobsen C., Boensch C., Christensen E.I., Luft F.C. and Willnow T.E.<br />
Megalin <strong>de</strong>ficiency offers protection from renal aminoglycosi<strong>de</strong> accumulation. J. Biol.<br />
Chem. 277: 618-622, 2002.<br />
Schramm U., Fricker G., Wenger R. and Miller D.S. P-glycoprotein-mediated secretion of a<br />
fluorescent cyclosporin analogue by teleost renal proximal tubules. Am. J. Physiol.<br />
268: F46-F52, 1995.<br />
Schwegler J.S., Heppelmann B., Mil<strong>de</strong>nberger S. and Silbernagl S. Receptor-mediated<br />
endocytosis of albumin in cultured opossum kidney cells: a mo<strong>de</strong>l for proximal tubular<br />
protein reabsorption. Pflugers Arch. 418: 383-392, 1991.<br />
Schwegler J.S., Heuner A. and Silbernagl S. Electrical properties of cultured renal tubular<br />
cells (OK) grown in confluent monolayers. Pflugers Arch. 415: 183-190, 1989a.<br />
Schwegler J.S., Heuner A. and Silbernagl S. Electrogenic transport of neutral and dibasic<br />
amino acids in a cultured opossum kidney cell line (OK). Pflugers Arch. 414: 543-550,<br />
1989b.<br />
Seetharam B., Christensen E.I., Moestrup S.K., Hammond T.G. and Verroust P.J.<br />
I<strong>de</strong>ntification of rat yolk sac target protein of teratogenic antibodies, gp280, as<br />
intrinsic factor-cobalamin receptor. J. Clin. Invest 99: 2317-2322, 1997.<br />
Seetharam B., Levine J.S., Ramasamy M. and Alpers D.H. Purification, properties, and<br />
immunochemical localization of a receptor for intrinsic factor-cobalamin complex in<br />
the rat kidney. J. Biol. Chem. 263: 4443-4449, 1988.<br />
208
Sekine T., Cha S.H. and Endou H. The multispecific organic anion transporter (OAT) family.<br />
Pflugers Arch. 440: 337-350, 2000.<br />
Shimada H., Moewes B. and Burckhardt G. Indirect coupling to Na+ of p-aminohippuric acid<br />
uptake into rat renal basolateral membrane vesicles. Am. J. Physiol. 253: F795-F801,<br />
1987.<br />
Sorribas V., Markovich D., Hayes G., Stange G., Forgo J., Biber J. and Murer H. Cloning of<br />
a Na/Pi cotransporter from opossum kidney cells. J. Biol. Chem. 269: 6615-6621,<br />
1994.<br />
Sousa M.M., Nor<strong>de</strong>n A.G., Jacobsen C., Willnow T.E., Christensen E.I., Thakker R.V.,<br />
Verroust P.J., Moestrup S.K. and Saraiva M.J. Evi<strong>de</strong>nce for the role of megalin in<br />
renal uptake of transthyretin. J. Biol. Chem. 275: 38176-38181, 2000.<br />
Speeg K.V., Maldonado A.L., Liaci J. and Muirhead D. Effect of cyclosporine on colchicine<br />
secretion by the kidney multidrug transporter studied in vivo. J. Pharmacol. Exp. Ther.<br />
261: 50-55, 1992.<br />
Stefansson S., Chappell D.A., Argraves K.M., Strickland D.K. and Argraves W.S.<br />
Glycoprotein 330/low <strong>de</strong>nsity lipoprotein receptor-related protein-2 mediates<br />
endocytosis of low <strong>de</strong>nsity lipoproteins via interaction with apolipoprotein B100. J.<br />
Biol. Chem. 270: 19417-19421, 1995a.<br />
Stefansson S., Kounnas M.Z., Henkin J., Mallampalli R.K., Chappell D.A., Strickland D.K.<br />
and Argraves W.S. gp330 on type II pneumocytes mediates endocytosis leading to<br />
<strong>de</strong>gradation of pro-urokinase, plasminogen activator inhibitor-1 and urokinaseplasminogen<br />
activator inhibitor-1 complex. J. Cell Sci. 108 ( Pt 6): 2361-2368, 1995b.<br />
Stengel B. and Jones E. [End-stage renal insufficiency associated with Chinese herbal<br />
consumption in France]. Nephrologie 19: 15-20, 1998.<br />
Stiborova M., Fernando R.C., Schmeiser H.H., Frei E., Pfau W. and Wiessler M.<br />
Characterization of DNA adducts formed by aristolochic acids in the target organ<br />
(forestomach) of rats by 32P-postlabelling analysis using different chromatographic<br />
procedures. Carcinogenesis 15: 1187-1192, 1994.<br />
Stiborova M., Frei E., Bieler C.A. and Schmeiser H.H. 32P-Postlabelling: A sensitive<br />
technique for the <strong>de</strong>tection of DNA adducts. Chem. Listy 92: 661-668, 1998.<br />
Sugawara-Yokoo M., Urakami Y., Koyama H., Fujikura K., Masuda S., Saito H., Naruse T.,<br />
Inui K. and Takata K. Differential localization of organic cation transporters rOCT1<br />
and rOCT2 in the basolateral membrane of rat kidney proximal tubules. Histochem.<br />
Cell Biol. 114: 175-180, 2000.<br />
Takano M., Hirozane K., Okamura M., Takayama A., Nagai J. and Hori R. p-Aminohippurate<br />
transport in apical and basolateral membranes of the OK kidney epithelial cells. J.<br />
Pharmacol. Exp. Ther. 269: 970-975, 1994.<br />
Takano M., Nakanishi N., Kitahara Y., Sasaki Y., Murakami T. and Nagai J. Cisplatin-induced<br />
inhibition of receptor-mediated endocytosis of protein in the kidney. Kidney Int. 62:<br />
1707-1717, 2002.<br />
TAMM I. and HORSFALL F.L., Jr. Characterization and separation of an inhibitor of viral<br />
hemagglutination present in urine. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 74: 106-108, 1950.<br />
209
Tanaka A., Nishida R., Maeda K., Sugawara A. and Kuwahara T. Chinese herb nephropathy<br />
in Japan presents adult-onset Fanconi syndrome: could different components of<br />
aristolochic acids cause a different type of Chinese herb nephropathy? Clin. Nephrol.<br />
53: 301-306, 2000a.<br />
Tanaka A., Nishida R., Yokoi H. and Kuwahara T. The characteristic pattern of aminoaciduria<br />
in patients with aristolochic acid-induced Fanconi syndrome: could iminoaciduria be<br />
the hallmark of this syndrome? Clin. Nephrol. 54: 198-202, 2000b.<br />
Tanaka A., Nishida R., Yoshida T., Koshikawa M., Goto M. and Kuwahara T. Outbreak of<br />
Chinese herb nephropathy in Japan: are there any differences from Belgium? Intern.<br />
Med. 40: 296-300, 2001.<br />
Teitelbaum A.P., Nissenson R.A., Zitzner L.A. and Simon K. Dual regulation of PTHstimulated<br />
a<strong>de</strong>nylate cyclase activity by GTP. Am. J. Physiol. 251: F858-F864, 1986.<br />
Teitelbaum A.P. and Strewler G.J. Parathyroid hormone receptors coupled to cyclic<br />
a<strong>de</strong>nosine monophosphate formation in an established renal cell line. Endocrinology<br />
114: 980-985, 1984.<br />
Templeton D.M. Cadmium uptake by cells of renal origin. J. Biol. Chem. 265: 21764-21770,<br />
1990.<br />
Tencer J., Frick I.M., Oquist B.W., Alm P. and Rippe B. Size-selectivity of the glomerular<br />
barrier to high molecular weight proteins: upper size limitations of shunt pathways.<br />
Kidney Int. 53: 709-715, 1998.<br />
Thadhani R., Pascual M. and Bonventre J.V. Acute renal failure. N. Engl. J. Med. 334: 1448-<br />
1460, 1996.<br />
Thakker R.V. The role of renal chlori<strong>de</strong> channel mutations in kidney stone disease and<br />
nephrocalcinosis. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 7: 385-388, 1998.<br />
Thevenod F. and Friedmann J.M. Cadmium-mediated oxidative stress in kidney proximal<br />
tubule cells induces <strong>de</strong>gradation of Na+/K(+)-ATPase through proteasomal and endo-<br />
/lysosomal proteolytic pathways. FASEB J. 13 : 1751-1761, 1999.<br />
Thornley C., Dawnay A. and Cattell W.R. Human Tamm-Horsfall glycoprotein: urinary and<br />
plasma levels in normal subjects and patients with renal disease <strong>de</strong>termined by a fully<br />
validated radioimmunoassay. Clin. Sci. (Lond) 68: 529-535, 1985.<br />
Uchino H., Tamai I., Yamashita K., Minemoto Y., Sai Y., Yabuuchi H., Miyamoto K., Takeda<br />
E. and Tsuji A. p-aminohippuric acid transport at renal apical membrane mediated by<br />
human inorganic phosphate transporter NPT1. Biochem. Biophys. Res. Commun.<br />
270: 254-259, 2000.<br />
Ullrich K.J. Specificity of transporters for 'organic anions' and 'organic cations' in the kidney.<br />
Biochim. Biophys. Acta 1197: 45 -62, 1994.<br />
Urakami Y., Nakamura N., Takahashi K., Okuda M., Saito H., Hashimoto Y. and Inui K.<br />
Gen<strong>de</strong>r differences in expression of organic cation transporter OCT2 in rat kidney.<br />
FEBS Lett. 461: 339-342, 1999.<br />
Valtin H. Renal function. Second Edition, Little, Brown and Company: Boston/Toronto 46-47,<br />
1983.<br />
210
Van <strong>de</strong>n B.L., De Smedt H. and Borghgraef R. Characteristics of Na+-<strong>de</strong>pen<strong>de</strong>nt hexose<br />
transport in OK, an established renal epithelial cell line. Biochim. Biophys. Acta 979:<br />
91-98, 1989.<br />
Van<strong>de</strong>rlin<strong>de</strong> R.E. Urinary enzyme measurements in the diagnosis of renal disor<strong>de</strong>rs. Ann.<br />
Clin. Lab Sci. 11: 189-201, 1981.<br />
Vanhaelen M., Vanhaelen-Fastre R., But P. and Vanherweghem J.L. I<strong>de</strong>ntification of<br />
aristolochic acid in Chinese herbs. Lancet 343: 174, 1994.<br />
Vanherweghem J.L., Depierreux M., Tielemans C., Abramowicz D., Dratwa M., Jadoul M.,<br />
Richard C., Van<strong>de</strong>rvel<strong>de</strong> D., Verbeelen D., Vanhaelen-Fastre R. and . Rapidly<br />
progressive interstitial renal fibrosis in young women: association with slimming<br />
regimen including Chinese herbs. Lancet 341: 387- 391, 1993.<br />
Vanherweghem J.L., Tielemans C., Simon J. and Depierreux M. Chinese herbs nephropathy<br />
and renal pelvic carcinoma. Nephrol. Dial. Transplant. 10: 270-273, 1995.<br />
Verpooten G.F., Nuyts G.D., Hoylaerts M.F., Nouwen E.J., Vassanyiova Z., Dlhopolcek P.<br />
and De Broe M.E. Immunoassay in urine of a specific marker for proximal tubular S3<br />
segment. Clin. Chem. 38: 642-647, 1992.<br />
Wald H., Dranitzki-Elhalel M., Backenroth R. and Popovtzer M.M. Evi<strong>de</strong>nce for interference<br />
of vitamin D with PTH/PTHrP receptor expression in opossum kidney cells. Pflugers<br />
Arch. 436: 289-294, 1998.<br />
Wang H., Fei Y.J., Kekuda R., Yang-Feng T.L., Devoe L.D., Leibach F.H., Prasad P.D. and<br />
Ganapathy V. Structure, function, and genomic organization of human Na(+)<strong>de</strong>pen<strong>de</strong>nt<br />
high-affinity dicarboxylate transporter. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 278:<br />
C1019-C1030, 2000.<br />
Wang S.S., Devuyst O., Courtoy P.J., Wang X.T., Wang H., Wang Y., Thakker R.V., Guggino<br />
S. and Guggino W.B. Mice lacking renal chlori<strong>de</strong> channel, CLC-5, are a mo<strong>de</strong>l for<br />
Dent's disease, a nephrolithiasis disor<strong>de</strong>r associated with <strong>de</strong>fective receptor-<br />
mediated endocytosis. Hum. Mol. Genet. 9: 2937-2945, 2000.<br />
Weber M.H. and Verwiebe R. Alpha 1-microglobulin (protein HC): features of a promising<br />
indicator of proximal tubular dysfunction. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 30: 683-<br />
691, 1992.<br />
Wheater P.R., Burkitt H.G. and Daniels V.G. Histologie fonctionnelle. Mé<strong>de</strong>cine et Sciences<br />
internationales 208-225, 1979.<br />
Willnow T.E., Goldstein J.L., Orth K., Brown M.S. and Herz J. Low <strong>de</strong>nsity lipoprotein<br />
receptor-related protein and gp330 bind similar ligands, including plasminogen<br />
activator-inhibitor complexes and lactoferrin, an inhibitor of chylomicron remnant<br />
clearance. J. Biol. Chem. 267: 26172-26180, 1992.<br />
Willnow T.E., Hilpert J., Armstrong S.A., Rohlmann A., Hammer R.E., Burns D.K. and Herz J.<br />
Defective forebrain <strong>de</strong>velopment in mice lacking gp330/megalin. Proc. Natl. Acad.<br />
Sci. U. S. A 93: 8460-8464, 1996.<br />
Witzgall R., Brown D., Schwarz C. and Bonventre J.V. Localization of proliferating cell<br />
nuclear antigen, vimentin, c-Fos, and clusterin in the postischemic kidney. Evi<strong>de</strong>nce<br />
for a heterogenous genetic response among nephron segments, and a large pool of<br />
mitotically active and <strong>de</strong>differentiated cells. J. Clin. Invest 93: 2175-2188, 1994.<br />
211
Wright S.H. and Dantzler W.H. Molecular and cellular physiology of renal organic cation and<br />
anion transport. Physiol. Rev. 84: 987-1049, 2004.<br />
Wu X., Huang W., Ganapathy M.E., Wang H., Kekuda R., Conway S.J., Leibach F.H. and<br />
Ganapathy V. Structure, function, and regional distribution of the organic cation<br />
transporter OCT3 in the kidney. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 279: F449-F458,<br />
2000.<br />
Wu X., Huang W., Prasad P.D., Seth P., Rajan D.P., Leibach F.H., Chen J., Conway S.J.<br />
and Ganapathy V. Functional characteristics and tissue distribution pattern of organic<br />
cation transporter 2 (OCTN2), an organic cation/carnitine transporter. J. Pharmacol.<br />
Exp. Ther. 290: 1482-1492, 1999.<br />
Xu D., Kozyraki R., Newman T.C. and Fyfe J.C. Genetic evi<strong>de</strong>nce of an accessory activity<br />
required specifically for cubilin brush-bor<strong>de</strong>r expression and intrinsic factor-cobalamin<br />
absorption. Blood 94: 3604-3606, 1999.<br />
Xue G.P., Fishlock R.C. and Snoswell A.M. Determination of creatinine in whole blood,<br />
plasma, and urine by high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 171:<br />
135-140, 1988.<br />
Yabuuchi H., Tamai I., Nezu J., Sakamoto K., Oku A., Shimane M., Sai Y. and Tsuji A. Novel<br />
membrane transporter OCTN1 mediates multispecific, bidirectional, and pH<strong>de</strong>pen<strong>de</strong>nt<br />
transport of organic cations. J. Pharmacol. Exp. Ther. 289: 768-773, 1999.<br />
Yang C.S., Lin C.H., Chang S.H. and Hsu H.C. Rapidly progressive fibrosing interstitial<br />
nephritis associated with Chinese herbal drugs. Am. J. Kidney Dis. 35: 313-318,<br />
2000.<br />
Yang L., Zhou X., Pang N., Chen W., Dong B., Chen Y.P. and Zou W.Z. [Clinical analysis of<br />
two children with aristolochic acid nephropathy]. Zhonghua Er. Ke. Za Zhi. 41: 552-<br />
553, 2003.<br />
Yang S.S., Chu P., Lin Y.F., Chen A. and Lin S.H. Aristolochic acid-induced Fanconi's<br />
syndrome and nephropathy presenting as hypokalemic paralysis. Am. J. Kidney Dis.<br />
39: E14, 2002.<br />
Yochem J. and Greenwald I. A gene for a low <strong>de</strong>nsity lipoprotein receptor-related protein in<br />
the nemato<strong>de</strong> Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 90: 4572-4576,<br />
1993.<br />
Yonemura K., Cheng L., Sacktor B. and Kinsella J.L. Stimulation by thyroid hormone of Na+-<br />
H+ exchange activity in cultured opossum kidney cells. Am. J. Physiol. 258: F333-<br />
F338, 1990.<br />
Yu Y., Zheng F.L. and Li H. [Chinese herbs-induced renal failure with Fanconi syndrome: a<br />
report of 6 cases]. Zhonghua Nei Ke. Za Zhi. 42: 110-112, 2003.<br />
Yuan G., Ott R.J., Salgado C. and Giacomini K.M. Transport of organic cations by a renal<br />
epithelial cell line (OK). J. Biol. Chem. 266: 8978-8986, 1991.<br />
Zhai X.Y., Nielsen R., Birn H., Drumm K., Mil<strong>de</strong>nberger S., Freudinger R., Moestrup S.K.,<br />
Verroust P.J., Christensen E.I. and Gekle M. Cubilin- and megalin-mediated uptake of<br />
albumin in cultured proximal tubule cells of opossum kidney. Kidney Int. 58: 1523-<br />
1533, 2000.<br />
212
Zheng G., Bachinsky D.R., Stamenkovic I., Strickland D.K., Brown D., Andres G. and<br />
McCluskey R.T. Organ distribution in rats of two members of the low-<strong>de</strong>nsity<br />
lipoprotein receptor gene family, gp330 and LRP/alpa 2MR, and the receptorassociated<br />
protein (RAP). J. Histochem. Cytochem. 42: 531-542, 1994.<br />
Zheng G., Marino' M., Zhao J. and McCluskey R.T. Megalin (gp330): a putative endocytic<br />
receptor for thyroglobulin (Tg). Endocrinology 139: 1462 -1465, 1998.<br />
213
THESE ANNEXE<br />
Les ochratoxines (A, B, C) sont <strong><strong>de</strong>s</strong> mycotoxines structurellement proches<br />
impliquées dans la contamination <strong>de</strong> divers aliments <strong><strong>de</strong>s</strong>tinés à l’homme ou aux<br />
animaux d’élevage. L’ochratoxine A, la plus étudiée et toxique <strong><strong>de</strong>s</strong> trois, est<br />
cancérigène et impliquée dans le développement <strong>de</strong> néphropathies chroniques. Une<br />
étu<strong>de</strong> récente montre que l’ochratoxine A induit la nécrose, l’apoptose,<br />
l’inflammation, la fibrose et la transition épithélio-mésenchymateuse dans <strong><strong>de</strong>s</strong> lignées<br />
<strong>de</strong> cellules tubulaires proximales d’origine animale. De plus, l’exposition à<br />
l’ochratoxine A conduit à l’activation <strong><strong>de</strong>s</strong> protéines kinases activées par un mitogène<br />
(MAPK) : la kinase régulée par un signal extracellulaire 1 et 2 (ERK1/2), la kinase<br />
amino-terminale c-jun (JNK) et la protéine kinase 38 à régulation extracellulaire (p38)<br />
[Sauvant C. et al., 2005b]. Cependant, l’inhibition <strong>de</strong> ERK1/2 amplifie les effets <strong>de</strong><br />
l’ochratoxine A et induit même une toxicité à <strong><strong>de</strong>s</strong> concentrations normalement nontoxiques<br />
[Sauvant C. et al., 2005a]. En général, ERK1/2 est supposée intervenir dans<br />
la mitogénèse et la différenciation cellulaire, alors que JNK et p38 agiraient en faveur<br />
<strong>de</strong> l’apoptose, l’inflammation et la fibrose [Tian W. et al., 2000].<br />
Dès lors, ce projet a pour objectif d’étudier <strong>de</strong> façon comparative l’effet <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
ochratoxines A, B et C sur la nécrose, l’apoptose, l’inflammation, la fibrose et les<br />
voies <strong>de</strong> signalisations <strong><strong>de</strong>s</strong> MAPK (ERK1/2, JNK et p38) dans les lignées <strong>de</strong> cellules<br />
tubulaires proximales humaines immortalisées (IHEK) et normales (RPTEC).<br />
Dans un premier temps, l’effet <strong><strong>de</strong>s</strong> ochratoxines A, B et C sera testé sur la<br />
nécrose par dosage <strong>de</strong> la libération <strong>de</strong> lactate déshydrogènase ainsi que l’apoptose<br />
par mesure <strong>de</strong> l’activité <strong>de</strong> la caspase-3. Différents paramètres intervenant dans le<br />
développement <strong><strong>de</strong>s</strong> néphropathies tubulo-interstitielles seront également mesurés :<br />
l’inflammation par mesure <strong>de</strong> l’activité du facteur nucléaire-kB (NF-κB); la fibrose par<br />
dosage spécifique <strong><strong>de</strong>s</strong> collagènes I, III et IV ; la transformation épithélioméssenchymateuse<br />
par mesure <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong> l’ARN <strong>de</strong> l’«α-smooth muscle<br />
actin». De même que l’activation <strong><strong>de</strong>s</strong> MAPK (ERK1/2, JNK et p38) est mesurée par<br />
la quantification <strong><strong>de</strong>s</strong> MAPK phosphorylées. La comparaison <strong><strong>de</strong>s</strong> effets obtenus pour<br />
l’ochratoxine A, B et C permettrait d’établir une corrélation entre la structure et la<br />
toxicité <strong><strong>de</strong>s</strong> ochratoxines.<br />
Dans un <strong>de</strong>uxième temps, l’implication plus précise <strong><strong>de</strong>s</strong> voies <strong>de</strong> signalisation<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> MAPK dans la toxicité rénale aux ochratoxines A, B et C sera explorée à l’ai<strong>de</strong><br />
d’inhibiteurs spécifiques: U0126 pour la voie ERK1/2, SP600125 pour la voie JNK et<br />
SB203580 pour la voie p38. Les paramètres décrits précé<strong>de</strong>mment seront mesurés.<br />
Les résultats obtenus <strong>de</strong>vraient fournir <strong><strong>de</strong>s</strong> informations comparatives sur le(s)<br />
mécanisme(s) <strong>de</strong> la toxicité tubulaire induite par les ochratoxines A, B, C.<br />
Ultérieurement, ces données permettraient d’élaborer une stratégie thérapeutique en<br />
vue <strong>de</strong> ralentir ou empêcher la progression <strong>de</strong> la néphropathie tubulo-interstitielle.<br />
Sauvant C., Holzinger H. and Gekle M. Proximal tubular toxicity of ochratoxin A is amplified by simultaneous<br />
inhibition of the extracellular signal-regulated kinases 1/2. J. Pharmacol. Exp. Ther. 313: 234-241,<br />
2005a.<br />
Sauvant C., Holzinger H. and Gekle M. The nephrotoxin ochratoxin A induces key parameters of chronic<br />
interstitial nephropathy in renal proximal tubular cells. Cell Physiol Biochem. 15 : 125-134, 2005b.<br />
Tian W., Zhang Z. and Cohen D.M. MAPK signaling and the kidney. Am. J. Physiol Renal Physiol 279: F593-<br />
F604, 2000.<br />
214