nephrotoxicite des acides aristolochiques - de l'Université libre de ...

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES
Faculté de Médecine
Laboratoire de Recherche sur le Métabolisme des Peptides
NEPHROTOXICITE DES ACIDES ARISTOLOCHIQUES :
APPROCHES EXPERIMENTALES DE L’ATTEINTE
Promoteur : Dr. J. Nortier
TUBULAIRE PROXIMALE
Catherine LEBEAU
Thèse présentée en vue de l’obtention du titre de
Docteur en Sciences Biomédicales
Co-promoteur : Pr. M. Deschodt-Lanckman
Année académique 2005-2006

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES
Faculté de Médecine
Laboratoire de Recherche sur le Métabolisme des Peptides
NEPHROTOXICITE DES ACIDES ARISTOLOCHIQUES :
APPROCHES EXPERIMENTALES DE L’ATTEINTE
TUBULAIRE PROXIMALE
Catherine LEBEAU
Thèse présentée en vue de l’obtention du titre de
Docteur en Sciences Biomédicales
Promoteur : Dr. J. Nortier
Co-promoteur : Pr. M. Deschodt-Lanckman
COMPOSITION DU JURY
Président : Pr. Ph. Lebrun
Secrétaire : Dr. J. Nortier
Membre du jury : Pr. M. Deschodt-Lanckman
Membre du jury : Pr. M. Dratwa
Membre du jury : Pr. J-C. Noël
Membre du jury : Pr. P. Roger
Expert étranger : Pr. G. Friedlander
Expert étranger : Pr. C. Isnard Bagnis

CURRICULUM VITAE
Catherine Lebeau, née le 23 novembre 1973 à Uccle, est célibataire et de nationalité
Belge.
Etudes secondaires :
Athénée Emile Bockstael de Bruxelles, section latin-sciences (1985 – 1991)
Etudes universitaires :
Licenciée en Sciences chimiques au grade légal obtenu avec grande distinction,
Université Libre de Bruxelles (1991 – 1995)
Titre du mémoire: "Clonage et séquençage du gène MEP3 codant pour une
protéine homologue aux transporteurs d'ammonium chez Saccharomyces
cerevisiae". Laboratoire de Physiologie Cellulaire et de Génétique des
Levures, département de Biologie Moléculaire, Faculté des Sciences, ULB, Pr.
B. André
DEA en Sciences de la santé, Université Libre de Bruxelles (2001)
Activités de Recherche
Echangeur Na/Ca dans les cellules pancréatiques β de rat. Laboratoire de
Pharmacodynamie et de thérapeutique, Faculté de Médecine, ULB, Pr. A.
Herchuelz (1996 – 1997)
Transporteurs basolatéraux de chlore dans la maladie rénale polykystique
autosomale dominante
Néphrotoxicité des acides aristolochiques : étude in vitro.
Laboratoire de Physiopathologie , Faculté de Médecine, ULB, Pr. R.
Beauwens (1998 – 2002)
Néphrotoxicité des acides aristolochiques : étude in vivo. LRMP, Faculté de
Médecine, ULB, Pr. M. Deschodt-Lankman et Service de Néphrologie, Hôpital
Erasme, Dr. J. Nortier, (2003-2006)
Prix scientifique
Prix « Takis Anagnostopoulos » de la meilleure communication orale au colloque
“Les cellules rénales et les interactions cellulaires dans les épithéliums: du gène à
la physiopathologie”, Faculté de Médecine Necker, Paris, France, 20 et 21 juin
2002.
Publications scientifiques :
Van Eylen F, Lebeau C, et al. Diabetes 47: 1873-1880, 1998
Lebeau C, et al. Kidney Int. 60: 1332-1342, 2001
Lebeau C, et al. Pflügers Archiv – Eur J Physiol. 444: 722-731, 2002
Lebeau C, et al. Nephrol Dial Transplant. 20: 2321-2332, 2005

REMERCIEMENTS
La réalisation de ce travail n’aurait pu aboutir sans les conseils avisés des
différents responsables de laboratoire qui m’ont accueillie. Je souhaite tout d’abord
remercier le Professeur R. Beauwens du Laboratoire de Physiologie ainsi que le
Docteur O. Devuyst de la Division de Néphrologie de la Faculté de Médecine de
l’Université Catholique de Louvain pour m’avoir épaulée dans l’élaboration du travail
concernant l’approche in vitro. Je remercie également Madame Yvette Cnops,
technicienne travaillant dans l’unité du Docteur O. Devuyst, pour m’avoir initiée à la
technique des gels d’électrophorèse. Je tiens ensuite à adresser ma plus vive
gratitude à Madame le Professeur M. Deschodt-Lanckman du Laboratoire de
Recherche sur le Métabolisme des Peptides pour m’avoir témoigné sa confiance et
encouragée dans la poursuite de mon travail de thèse avec l’exploration des aspects
in vivo.
J’adresse également mes remerciements à Monsieur le Professeur J-L.
Vanherweghem pour son soutien constant et ses avis critiques et constructifs.
Je souhaite exprimer toute ma gratitude à l’égard du Docteur Joëlle Nortier,
promoteur de ce travail, pour son soutien à toute épreuve. Au cours des heures
passées à travailler ensemble, j’ai eu l’immense plaisir d’apprécier à sa juste valeur
ses discussions et remarques constructives, son enthousiasme, sa rigueur et son
perfectionnisme.
Mes plus vifs remerciements vont aussi au Docteur Frédéric Debelle pour
m’avoir transmis ses connaissances, guidée dans mes premiers pas au laboratoire et
familiarisée avec le modèle animal. Un tout grand merci à Monsieur Eric De Prez et
Madame Cécile Husson pour leur précieuse aide technique. Merci aussi à Agnieszka
Pozdzik ainsi qu’à Claire, Sofia, Aurore, Pascal et Claude (Laboratoire
d’Immunologie Expérimentale) pour leurs encouragements.

Je ne manquerai pas de remercier le Professeur V. Arlt pour sa collaboration
concernant la détection des adduits d’ADN aux aristolactames, le Professeur I.
Salmon pour ses conseils en histopathologie rénale, le Professeur J-P. Brion et sa
technicienne Madame Michelle Authelet pour l’étude en microscopie électronique.
Je remercie également le Fonds Alphonse et Jean Forton, le Fonds de la
Recherche Scientifique Médicale ainsi que la Banque Nationale de Belgique pour
leur contribution financière à la réalisation de ce travail.
Je ne sais comment remercier mon amie Anne Demols et Gilles Wolles qui ont
toujours su trouver les mots justes pour me soutenir et m’encourager tout au long de
mon travail de thèse.
Je remercie mes parents de m’avoir permis d’entamer mes études. Je
remercie très chaleureusement mon frère, Frédéric, pour son soutien et ses
encouragements.
Je ne sais quels mots choisir pour remercier du fond du cœur, Stéphane, pour
son aide à résoudre les pannes liées aux mystères de l’informatique ainsi que pour
ses précieux encouragements et son soutien au quotidien.

TABLE DES MATIERES
Pages
Liste des abréviations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
Résumé . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
CHAPITRE 1 : INTRODUCTION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1. Le rein : généralités . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.1. Unité anatomique, le néphron . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.2. Unité fonctionnelle, le néphron . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.2.1. Le glomérule . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.2.2. Le tubule rénal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.2.3. La vascularisation rénale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2. Le tubule proximal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.1. L’épithélium tubulaire proximal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.2. Réabsorption tubulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.2.1. Réabsorption du sodium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.2.2. Réabsorption des nutriments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.3. Sécrétion tubulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.3.1. Sécrétion d’hydrogène . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.3.2. Sécrétion d’ammonium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.4. Endocytose médiée par récepteur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.4.1. Mégaline et cubiline . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
2.5. Sécrétion et réabsorption tubulaire des drogues et xénobiotiques . . . 37
3. Marqueurs urinaires d’atteinte tubulaire proximale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
3.1. Atteinte structurelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
3.2. Atteinte fonctionnelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4. Cellules de rein d’opossum : modèle d’étude du tubule proximal . . . . . . . 51
4.1. Caractérisation de la lignée de cellules OK (opossum kidney) . . . . . . . 51
4.2. Endocytose médiée par récepteur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
1

5. Toxicité tubulaire des acides aristolochiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
5.1. Néphropathie aux plantes chinoises : aperçu clinique . . . . . . . . . . . . . 61
5.2. Données expérimentales chez l’animal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
5.2.1. Toxicité aiguë . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
5.2.2. Toxicité chronique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
CHAPITRE 2 : BUTS DU TRAVAIL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
CHAPITRE 3 : METHODOLOGIE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
1. Etude in vitro : effets des acides aristolochiques sur les cellules rénales
d’opossum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
1.1. Culture des cellules OK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
1.2. Exposition des cellules OK à différentes substances . . . . . . . . . . . . . 67
1.2.1. Acides aristolochiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
1.2.2. Cadmium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
1.2.3. Autres composés contenus dans les gélules amaigrissantes . . 68
1.3. Réabsorption d’albumine et de β2-microglobuline . . . . . . . . . . . . . . . . 69
1.3.1. Compétition avec d’autres protéines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
1.4. Tests de cytotoxicité et de viabilité cellulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
1.4.1. Dosage de lactate déshydrogénase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
1.4.2. Dosage de 3-(4,5-diméthyl-thiazoyl-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium
bromide (MTT) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
1.5. Observations en microscopie des cellules OK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
1.5.1. Microscopie conventionnelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
1.5.2. Microscopie confocale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
1.6. Marquage des protéines à la [ 35 S]L-méthionine . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
1.7. Réabsorption de méthyl-α-D-glucopyranoside (AMG) . . . . . . . . . . . . 73
1.8. Détection des adduits d’ADN spécifiques aux acides aristolochiques . . 73
1.9. Analyse de l’expression de la mégaline dans les extraits cellulaires . . 74
1.10. Analyses statistiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
2

2. Etude in vivo : effets de l’intoxication aux acides aristolochiques sur l’épithélium
tubulaire proximal de rat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
2.1. Conditionnement des rats Wistar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
2.2. Administration des acides aristolochiques aux rats . . . . . . . . . . . . . . . 76
2.2.1. Modèle initial de la néphropathie aux acides aristolochiques : rats
traités pendant 35 jours . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
2.2.2. Protocole court : rats traités pendant 5 jours . . . . . . . . . . . . . 77
2.2.3. Protocole destiné à des études histologiques particulières (10 jours)77
2.3. Prélèvement des urines, du sang et des reins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
2.4. Dosages de la créatinine plasmatique et urinaire . . . . . . . . . . . . . . . . 79
2.5. Dosage de l’activité leucine aminopeptidase dans l’urine . . . . . . . . . . 79
2.6. Dosage de l’activité endopeptidase neutre dans l’urine . . . . . . . . . . . . 80
2.7. Dosage de l’activité N-acétyl-β-D-glucosaminidase dans l’urine . . . . . 81
2.8. Dosage et analyse des protéines urinaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
2.9. Dosage d’albumine plasmatique et urinaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
2.10. Dosage d’alpha-glutathion-S-transférase urinaire . . . . . . . . . . . . . . . 83
2.11. Dosages de sodium, potassium et glucose urinaire et plasmatique . . 83
2.12. Histologie rénale conventionnelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
2.13. Immunomarquage de l’endopeptidase neutre . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
2.14. Immunomarquages de la mégaline et de la cubiline . . . . . . . . . . . . . 87
2.15. Microscopie électronique (étude préliminaire) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
2.16. Détection des adduits d’ADN spécifiques aux acides aristolochiques dans le
cortex rénal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
2.17. Analyses statistiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
CHAPITRE 4 : RESULTATS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
1. Etude in vitro : effets des acides aristolochiques sur la lignée cellulaire de rein
d’opossum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . 90
1.1. Endocytose de protéines médiée par récepteur . . . . .. . . . . . . . . . . . . 90
1.1.1. Albumine . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
1.1.2. Autres protéines . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
1.1.3. β2-microglobuline . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
3

1.1.4. Compétition entre albumine et β2-microglobuline . . . . . . . . . . . 92
1.2. Inhibition de la réabsorption d’albumine et de β2-microglobuline . . . . . 93
1.2.1. Effets des acides aristolochiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
1.2.2. Effets du cadmium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
1.2.3. Observation de l’inhibition en microscopie confocale . . . . . . . 98
1.2.4. Réversibilité de l’inhibition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
1.3. Viabilité et fonctionnalité des cellules OK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
1.3.1. Tests de cytotoxicité et de viabilité cellulaire . . . . . . . . . . . . . 100
1.3.2. Synthèse des protéines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
1.3.3. Réabsorption du glucose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
1.4. Détection des adduits d’ADN spécifiques aux acides aristolochiques . . 104
1.5. Expression de la mégaline . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
1.5.1. Colocalisation avec l’albumine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
1.5.2. Effets des acides aristolochiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
1.6. Effets d’autres composés contenus dans les gélules amaigrissantes . . 108
2. Etude in vivo : effets de l’intoxication aux acides aristolochiques sur l’épithélium
tubulaire proximal de rat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
2.1. Protocole long : rats traités pendant 35 jours . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
2.1.1. Paramètres biologiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
2.1.1.1. Créatinine plasmatique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
2.1.1.2. Protéines et enzymes urinaires . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
2.1.1.3. Relations structure-fonction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
2.1.2. Observations histologiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
2.1.2.1. Histologie conventionnelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
2.1.2.2. Immunomarquage de l’endopeptidase neutre . . . . . . 118
2.1.2.3. Evaluation semi-quantitative des lésions morphologiques 119
2.1.3. Détection des adduits d’ADN spécifiques aux acides aristolochiques
dans le cortex rénal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
2.2. Protocole de suivi des paramètres urinaires : rats traités pendant 35 jours 121
2.2.1. Paramètres reflétant l’atteinte fonctionnelle . . . . . . . . . . . . . . 122
2.2.2. Paramètres reflétant l’atteinte structurelle . . . . . . . . . . . . . . . 122
2.3. Protocole court : rats traités pendant 5 jours . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125
2.3.1. Paramètres biologiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
4

2.3.1.1. Créatinine plasmatique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
2.3.1.2. Protéines et enzymes urinaires . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
2.3.1.3. Relations structure-fonction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130
2.3.2. Observations histologiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
2.3.2.1. Histologie conventionnelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
2.3.2.2. Immunomarquage de l’endopeptidase neutre . . . . . . 132
2.3.3. Détection des adduits d’ADN spécifiques aux acides aristolochiques
dans le cortex rénal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134
2.4. Protocole destiné à des études histologiques particulières : rats traités pendant
10 jours . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136
2.4.1. Paramètres biologiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136
2.4.2. Immunomarquages de la mégaline et de la cubiline . . . . . . . . 137
2.4.3. Microscopie électronique : résultats préliminaires . . . . . . . . . 138
CHAPITRE 5 : DISCUSSION ET CONCLUSIONS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
1. Discussion et conclusion de l’approche in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
2. Discussion et conclusion de l’approche in vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147
3. Conclusion générale et perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154
ANNEXE 1 : Sécrétion et réabsorption tubulaires des drogues et xénobiotiques 158
A.1. Transporteurs tubulaires anioniques (OAT) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158
A.2. Transporteurs tubulaires cationiques (OCT) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161
ANNEXE 2 : Effets des acides aristolochiques sur l’expression de protéines
impliquées dans l’endocytose médiée par récepteur . . . . . . . . . . . . . . 165
5

ARTICLES PUBLIES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166
1. Aristolochic acid impedes endocytosis and induces DNA adducts in proximal tubule
cells. Kidney International 60: 1332-1342, 2001 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166
2. Early proximal tubule injury in experimental aristolochic acid nephropathy: functional
and histological studies. Nephrol Dial Transplant 20: 2321-2332, 2005 . . . . . . 178
BIBLIOGRAPHIE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191
THESE ANNEXE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 214
L’étude dans les cellules tubulaires proximales humaines en culture de l’effet des
ochratoxines (A, B, C) sur les agents médiateurs de l’apoptose, l’inflammation et la
fibrose devrait permettre de caractériser les voies de signalisation des MAP-kinases
impliquées dans le développement de la néphropathie tubulo-interstitielle
6

LISTE DES ABREVIATIONS
AA : Acides aristolochiques
AAI : Acide aristolochique de type I
AAIa : Acide aristolochique de type Ia
AAII : Acide aristolochique de type II
ADN : Acide désoxyribonucléique
AMC : 7-amino-4-méthyl-coumarine
AMG : Méthyl-α-D-glucopyranoside
AMP : Adénosine monophosphate
ATP : Adénosine triphosphate
BCA : Acide bicinchoninique
BSA : Albumine sérique bovine
CHN : Chinese-herb nephropathy, Néphropathie aux plantes chinoises
CPM : Coups par minute
CUB : Complement subcomponents C1r/C1s, epidermal growth factor-related
sea urchin protein and bone morphogenic protein-1
Cy5 : Cyanine 5
dA-AAI : 7-(déoxyadénosine-N 6 -yl)aristolactame I
dA-AAII : 7-(déoxyadénosine-N 6 -yl)aristolactame II
DAB : 3, 3’-diaminobenzidine
Dab2 : Disabled protein 2
dG-AAI : 7-(déoxyguanosine-N 2 -yl)aristolactame I
DMEM : Milieu Dubbelcco modifié selon Eagle
DMSO : Sulfoxide diméthyle
EC : Enzyme Commission numbers
ECL : Enhanced chemoluminescence
EDTA : Acide tétraacétique éthylènediamine
EGF : Epidermal growth factor
ELISA : Enzyme-linked immunosorbent assay
FITC : Fluorescéine isothiocyanate
GST : Glutathion-S-transférase
HDL : High density lipoprotein, Lipoprotéine de haute densité
HEPES : Acide N-(2-hydroxyéthyl)piperazine-N’-2-éthanesulphonique
HPLC : Chromatographie liquide à haute performance (ou pression)
HRP : Horseradish peroxidase
IGF-1 : Insulin-like growth factor 1
7

Km : Constante de Michaelis-Menten
LAP : Leucine aminopeptidase
LDH : Lactate déshydrogénase
LDL : Low density lipoprotein, Lipoprotéine de faible densité
LRP : Low density lipoprotein receptor related protein
MDR : Multidrug resistance protein
MOPS : Acide morpholinopropanesulphonique
MRP : Multidrug resistance-associated proteins
MTT : 3-(4,5-diméthyl-thiazoyl-2-yl)-2,5-diphenyltétrazolium bromide
NAD : Nicotinamide adénine dinucléotide
NAG : N-acétyl-β-D-glucosaminidase
NaPi : Co-transporteur sodium/phosphate
NEP : Endopeptidase neutre (EC 3.4.24.11)
NHE3 : Echangeur sodium/hydrogène de type 3
OAT : Transporteurs d’anions organiques
OCT : Transporteurs de cations organiques
OK : Opossum kidney, Rein d’opossum
PAH : Para-aminohippurate
PAI-1 : Plasminogen activator inhibitor-1
PAP : Pancreatitis associated protein-1
PAS : Acide periodique Schiff
PEG : Polyéthylène glycol
PTH : Hormone parathyroïdienne
RAP : Receptor associated protein, Protéine associée au récepteur
RBP : Retinol binding protein, protéine de liaison au rétinol
SDS : Dodécyl sulfate de sodium
TBS : Tampon Tris salin
TGF-β1 : Transforming growth factor β1
TMB : 3,3’,5,5’ tétraméthylbenzidine
tPA : Tissue plasminogen activator, Activateur tissulaire du plasminogène
TRIC : Tétraméthylrhodamine isothiocyanate
VLDL : Very low density lipoprotein, Lipoprotéine de très faible densité
Vmax : Vitesse maximale
8

RESUME
Les acides aristolochiques (AA) présents dans les aristoloches sont impliqués
dans le développement d’une insuffisance rénale progressive chez l’homme, appelée
néphropathie aux plantes chinoises (CHN). Elle se caractérise par une atrophie
tubulaire sévère et une fibrose interstitielle associée à une fréquence élevée de
cancers urothéliaux. L’observation en clinique d’une protéinurie tubulaire a suggéré
que le tubule proximal était la cible des AA.
Le but des travaux présentés est d’explorer les premières altérations induites
par les AA au niveau de la cellule tubulaire proximale.
L’approche in vitro montre que les AA inhibent de manière irréversible la
réabsorption d’albumine par les cellules de rein d’opossum (OK). L’altération par les
AA du processus d’endocytose médiée par récepteur s’expliquerait en partie par une
diminution de l’expression de la mégaline.
L’approche in vivo confirme la survenue précoce d’altérations structurelles et
fonctionnelles de l’épithélium tubulaire proximal dans le modèle de rat de la
néphropathie aux AA. L’évolution de ces atteintes est biphasique : phase aiguë
précoce suivie d’une phase chronique conduisant à une atrophie tubulaire majeure et
une fibrose interstitielle. De plus, la diminution de l’expression de la mégaline et de la
cubiline indique également que les AA interfèrent in vivo avec le mécanisme
d’endocytose médiée par récepteur.
En conclusion, les résultats in vivo confirment les observations in vitro, selon
lesquelles les AA induisent des altérations très précoces des cellules tubulaires
proximales. Une meilleure compréhension, à l’aide de ces deux approches, des
mécanismes physiopathologiques de l’atteinte tubulaire proximale précoce et de son
évolution fournirait des informations clés pour comprendre le développement et la
progression des maladies rénales aiguës et/ou chroniques.
9

CHAPITRE 1 : INTRODUCTION
1. Le rein : généralités
Les reins sont au nombre de deux et situés entre le péritoine pariétal et la
paroi postérieure de l’abdomen. Pour un homme adulte, chaque rein pèse entre 115
et 170 g et mesure en moyenne 10 à 12 cm de long, 5 à 7,5 cm de large et 2,5 cm
d’épaisseur.
Les reins font partie de l’appareil urinaire : l’urine est excrétée de chaque rein
par son uretère et accumulée dans la vessie avant d’être évacuée hors de
l’organisme par l’urètre.
Une des fonctions principales du rein est de maintenir l’homéostasie de
l’organisme en régulant la composition, le volume et la pression du sang. Pour y
parvenir, le rein contrôle, par réabsorption, l’élimination du sel et de l’eau afin de
maintenir la constance du volume et de l’osmolalité du compartiment extracellulaire.
Le rein participe également à la régulation de l’équilibre acide-base, à l’élimination
des produits terminaux du métabolisme (par exemple : urée, acide urique) et des
substances étrangères (par exemple : médicaments, toxines) mais aussi à la
conservation simultanée des composants essentiels comme le glucose ou les acides
aminés. Le fonctionnement physiologique du rein est sous la dépendance
d’hormones, comme le système rénine-angiotensine-aldostérone qui participe au
maintien de la pression sanguine. Le rein synthétise aussi l’érythropoïétine qui régule
la capacité de transport de l’oxygène du sang via la stimulation de l’érythropoïèse.
Enfin, le rein joue également un rôle dans le catabolisme (exemple : la dégradation
des protéines et des peptides) et la gluconéogenèse.
10

1.1. Unité anatomique, le néphron
La structure macroscopique des reins présente l’arrangement des néphrons
(Fig. 1). Le parenchyme, partie fonctionnelle du rein, est composé d’une région
externe, le cortex et une région interne, la médullaire. Le parenchyme rénal contient
approximativement un million de structures microscopiques appelées néphrons qui
constituent les unités fonctionnelles du rein. Les néphrons sont localisés pour la plus
grande part dans le cortex mais aussi dans la médullaire.
Hile
Figure 1. Structure macroscopique du rein de mammifère. D’après Wheater P.R. et al.
[Wheater P.R. et al., 1979].
La médullaire est composée de structures triangulaires striées, les pyramides
médullaires ou pyramides de Malpighi. Leur aspect strié s’explique par la présence
de tubules droits et de vaisseaux sanguins. Les bases des pyramides font face au
cortex, tandis que leurs sommets, les papilles rénales, sont orientés vers le centre du
rein.
11

Le cortex est la région d’aspect lisse qui s’étend de la capsule rénale aux
bases des pyramides et dans l’espace entre celles-ci. Le cortex se divise en une
région corticale externe et une région juxta-médullaire interne.
Les calices majeurs ou mineurs sont des espaces en forme d’entonnoir,
chaque petit calice reçoit l’urine des tubules collecteurs d’une pyramide et la déverse
dans un grand calice. Les calices convergent pour former une grande cavité, le
bassinet rénal. L’urine est évacuée vers la vessie par l’uretère.
L’artère et la veine rénale pénètrent et quittent le rein au-dessus de l’uretère
au niveau du hile.
Le rein est entouré de 3 couches de tissus. La couche interne, la capsule
fibreuse est une membrane fibreuse lisse et transparente qui est en continuité avec
la couche externe de l’uretère au niveau du hile. La couche moyenne, la capsule
adipeuse, est une masse de tissu adipeux qui entoure la capsule fibreuse. La couche
externe, le fascia rénal, est une fine couche de tissu conjonctif dense irrégulier qui
fixe le rein aux organes adjacents et à la paroi abdominale.
1.2. Unité fonctionnelle, le néphron
Le néphron est l’unité fonctionnelle du rein dont les trois fonctions principales
sont : la filtration, la réabsorption et la sécrétion. Le néphron est constitué de deux
parties principales : le corpuscule rénal ou glomérule rénal et le tubule rénal. (Fig. 2)
1.2.1. Le glomérule
Le glomérule rénal est la partie du néphron responsable de la filtration du
sang. Il est composé de deux structures, la capsule de Bowman et le glomérule (Fig.
3).
12

CONNECTING TUBULE
ASCENDING THIN LIMB
OF HENLE’S LOOP
GLOMERULUS
DISTAL CONVOLUTED TUBULE
DISTAL STRAIGHT TUBULE
(THICK ASCENDING LIMB OF HENLE’S LOOP)
Figure 2. Schéma des différentes subdivisions d’un rein de mammifère montrant la
localisation des segments des néphrons par rapport aux parties du rein. D’après Maunsbach
A.B. et al. [Maunsbach A.B. et al., 1992].
La capsule de Bowman est formée par une seule couche de cellules aplaties
reposant sur une membrane basale et constitue le feuillet pariétal qui est en
continuité avec l’épithélium bordant le tubule rénal.
Le glomérule est composé d’un réseau capillaire étroitement pelotonné qui
s’invagine dans la capsule de Bowman et est enveloppé par une couche de cellules
épithéliales, les podocytes, qui forment le feuillet viscéral de la capsule de Bowman.
13

Figure 3. Schéma des principales structures du glomérule de mammifère. [Wheater P.R. et
al., 1979].
L’espace entre le feuillet pariétal et viscéral, appelé espace capsulaire, est en
continuité avec la lumière du tubule rénal et constitue le pôle urinaire. A l’opposé,
au pôle vasculaire, l’artériole afférente amène le sang au glomérule et le sang quitte
le glomérule par l’artériole efférente après avoir circulé dans les capillaires.
Le mésangium, composé des cellules mésangiales et de la matrice
mésangiale, est un autre élément important du glomérule. Les cellules mésangiales,
apparentées aux monocytes, entourent les capillaires glomérulaires, leur fournissant
un support structurel. Les cellules produisent la matrice extracellulaire, possédent
une activité de phagocytose et sécrètent des prostaglandines, des peptides et des
cytokines.
La fonction principale du glomérule est l’ultrafiltration du plasma au travers des
capillaires glomérulaires. La barrière de filtration est composée de l’endothélium du
capillaire, la membrane basale du capillaire et les podocytes. L’endothélium présente
de nombreux pores ou fenestrations permettant à l’eau, aux protéines de petite taille
et aux petites molécules de soluté comme le sodium, l’urée et le glucose, de passer
14

librement mais retenant les cellules. Comme les cellules endothéliales expriment des
glycoprotéines chargées négativement à leur surface, la filtration des grosses
protéines anioniques peut être retardée. La membrane basale du capillaire est une
matrice poreuse de protéines extracellulaires présentant des charges négatives à sa
surface, c’est une barrière de filtration importante pour les protéines plasmatiques.
Les podocytes possèdent de longs prolongements cytoplasmiques en forme de
pieds, appelés pédicelles, qui entourent complètement la surface externe des
capillaires. Les pédicelles entremêlés recouvrent la membrane basale, les espaces
présents entre les pédicelles forment les fentes de filtration. Une membrane mince
s’étend à la surface de ces fentes de filtration, empêchant le passage des protéines
de taille moyenne (Fig. 4).
La structure de la barrière de filtration glomérulaire détermine la composition
de l’ultrafiltrat du plasma. La barrière de filtration glomérulaire limite la filtration des
molécules en fonction de leur taille et de leur charge électrique. En général, les
molécules neutres de rayon inférieur à 20 Å sont filtrées librement, les molécules de
rayon supérieur à 42 Å ne sont pas filtrées et les molécules comprises entre 20 et 42
Å sont filtrées à des degrés variables.
Le taux de filtration glomérulaire est de l’ordre de 120 ml/min, correspondant à
environ 180 litres de plasma filtré par jour.
L’ultrafiltrat plasmatique ou l’urine primitive possède les mêmes concentrations en
sels et en molécules organiques que le plasma.
1.2.2. Le tubule rénal
L’ultrafiltrat, contenu dans l’espace capsulaire, est déversé dans le tubule
rénal qui s’étend de la capsule de Bowman jusqu’à sa jonction avec un tube
collecteur. La première fonction du tubule rénal est la réabsorption sélective de l’eau,
des ions inorganiques et d’autres molécules au départ de l’ultrafiltrat glomérulaire.
15

Le tubule rénal est bordé par une couche unique de cellules épithéliales et
comporte trois segments principaux qui sont dans l’ordre : le tubule contourné
proximal, l’anse de Henlé et le tubule contourné distal (Fig. 2).
A B
Podocyte
Anses capillaires Espace de Bowman
C
0,3 µm
Pore dans
l’endothélium
Lumière du
capillaire
Fentes de filtration Pédicelles
Espace de Bowman
Podocyte
Membrane basale
Pédicelles
Fentes de filtration
Figure 4. Observation en microscopie électronique d’un glomérule (A, grossissement ×
1440) et d’une anse d’un capillaire glomérulaire (B, grossissement × 7200). Vue en section
longitudinale d’un capillaire glomérulaire (C, grossissement × 36000); sur la partie gauche, la
distribution des charges négatives dans la paroi du capillaire glomérulaire est indiquée.
D’après Valtin H. [Valtin H., 1983].
16

Le tubule proximal est la partie du tubule attachée à la capsule glomérulaire
et la plus longue. La portion initiale du tubule est contournée (tube contourné
proximal, pars convoluta) et se prolonge par une section droite (pars recta). Le tubule
proximal constitue l’essentiel du cortex rénal. Ce segment est plus longuement
détaillé dans les pages suivantes (pages : 20-41).
L’anse de Henlé débute à la partie terminale de la pars recta sous forme
d’une branche droite à paroi mince, la branche grêle descendante, et s’étend du
cortex à la médullaire. Après formation d’une boucle en épingle à cheveux, l’anse de
Henlé remonte dans le cortex rénal sous forme d’une branche fine ascendante
(uniquement pour les néphrons avec de longues anses de Henlé) et d’une branche à
paroi plus épaisse, la branche large ascendante.
Un petit segment de l’anse large ascendante est constitué de cellules spécialisées, la
macula densa, qui jouxtent l’artériole afférente et efférente du néphron concerné. Les
cellules de la macula densa contrôlent la concentration en sel (NaCl) dans le liquide
de la lumière du tubule.
L’anse de Henlé a pour fonction de produire un gradient osmotique du cortex au
sommet de la médullaire rénale. La forte pression osmotique des liquides
extracellulaires et la présence de l’hormone antidiurétique permettent la sortie de
l’eau par osmose à partir du liquide contenu dans les tubules connecteurs et les
tubes collecteurs. L’anse de Henlé et l’hormone antidiurétique sont donc
responsables de la production d’une urine qui est hypertonique par rapport au
plasma.
Le tubule distal débute par une portion droite qui correspond à la branche
large ascendante de l’anse de Henlé et se prolonge par une partie contournée.
Le tubule distal a pour rôle essentiel de réabsorber les ions sodium du liquide
tubulaire. Ce processus, directement lié à la sécrétion d’ions hydrogène et potassium
dans le fluide tubulaire, est sous le contrôle de l’aldostérone, une hormone sécrétée
par le cortex surrénalien.
Le tubule connecteur relie ensuite le tubule distal au tubule collecteur. Le
tubule collecteur se subdivise en une partie corticale et une partie médullaire : le
17

tubule collecteur de la médullaire externe suivi du tubule collecteur de la médullaire
interne.
Les tubes collecteurs deviennent perméables à l’eau en présence d’hormone
antidiurétique sécrétée par l’hypophyse. L’eau est alors attirée vers l’extérieur en
raison de la forte pression osmotique des fluides extracellulaires médullaires.
1.2.3. La vascularisation rénale
Le débit sanguin rénal, assuré par les artères rénales, représente 20 à 25 %
du débit cardiaque, soit environ 1200 ml/min. L’artère rénale se divise en cinq artères
segmentaires afin d’irriguer les différents segments rénaux. Chaque artère
segmentaire se ramifie en artères interlobaires, qui pénètrent le parenchyme et
passent entre les pyramides rénales. A la jonction cortico-médullaire, les artères
interlobaires deviennent arquées, elles se divisent en une série d’artères
interlobulaires, lesquelles s’enfoncent dans le cortex et se ramifient en artérioles
afférentes. L’artériole afférente se scinde pour former les capillaires glomérulaires qui
ensuite fusionnent pour constituer l’artériole efférente à la sortie du glomérule.
Chaque artériole efférente d’un néphron cortical se ramifie en un réseau de
capillaires péritubulaires autour des tubules contournés proximal et distal. L’artériole
efférente d’un néphron juxta-médullaire se divise également en capillaires
péritubulaires ainsi qu’en vaisseaux en forme de boucle allongée, les vasa recta, qui
descendent le long de l’anse de Henlé dans la médullaire (Fig. 5).
Les capillaires péritubulaires se réunissent pour former les veinules péritubulaires,
puis successivement les veines interlobulaires, les veines arquées, les veines
interlobaires, les veines segmentaires et la veine rénale qui sort du rein au hile.
18

A
C
MR = medullary ray
CL = cortical labyrinth
OS = outer stripe
IS = inner stripe
IM = inner medulla
P = renal pelvis
Artères
interlobulaires
Glomérule
Vasa recta
Figure 5. A. Vascularisation artérielle rénale (coupe longitudinale d’un rein de lapin). 1 :
artère rénale, 2 : artère interlobaire, 3 : artère arquée, 4: artères interlobulaires. B.
Vascularisation artérielle du cortex et de la médulaire externe (coupe longitudinale d’un rein
de lapin). D’après INSERM [INSERM., 1980]. C. Schéma de la vascularisation rénale.
D’après Kriz W. et al. [Kriz W. et al., 1988].
B
19

2. Le tubule proximal
Le tubule proximal réabsorbe environ 99 % du volume de l’ultrafiltrat
glomérulaire (environ 178 l par jour), contenant des sels, du glucose, des acides
aminés, des vitamines, des protéines et d’autres nutriments ainsi que des produits du
métabolisme. Les constituants réabsorbés de l’ultrafiltrat retournent ensuite dans le
sang à travers la paroi du tubule. La portion restante de l’ultrafiltrat (1 %, environ 1,5 l
par jour) est excrétée sous forme d’urine. Le tubule proximal réabsorbe au départ de
l’ultrafiltrat 65 % d’eau, de Na + et K + , 60 % de Ca 2+ , 15 % de Mg 2+ , 55 % de Cl - , 93 %
de bicarbonate, 65 % de phosphate, 96 % du glucose, presque 100 % des protéines.
Ces protéines, dites de faible poids moléculaire, correspondent entre autres à la β2-
microglobuline, l’α1-microglobuline, l’α2-microglobuline, la protéine de liaison à la
vitamine D, la protéine de liaison au rétinol, la protéine des cellules de Clara
(d’origine pulmonaire), le lysozyme ainsi que l’albumine.
Les protéines sont réabsorbées à la membrane apicale des cellules épithéliales du
tubule proximal par un processus complexe et spécifique : l’endocytose médiée par
récepteur. Après l’endocytose, les protéines sont dégradées par la voie lysosomale,
les acides aminés produits ainsi que les autres substances réabsorbées sont
transportées au travers de la membrane basolatérale de la cellule et retournent dans
les capillaires rénaux (Fig. 6).
Apical membrane
Basolateral membrane
Figure 6. Schéma de la fonction tubulaire proximale: la réabsorption de l’ultrafiltrat
glomérulaire par une cellule tubulaire proximale. D’après Christensen EI et al. [Christensen
E.I. et al., 2002]
20

L’altération de ce mécanisme de réabsorption tubulaire augmente le taux de
protéines dans l’urine, conduisant à une protéinurie dite tubulaire.
2.1. L’épithélium tubulaire proximal
Les cellules épithéliales du tubule proximal sont des cellules polarisées
possédant une membrane apicale ou luminale, -côté urine-, qui se distingue très
nettement d’un point de vue fonctionnel de la membrane basale située côté sanguin.
D’un point de vue structurel, la membrane apicale présente des microvillosités, dont
l’ensemble forme la bordure en brosse, augmentant significativement la surface de la
membrane.
Chez la plupart des espèces de mammifères, le tubule proximal se subdivise
en 3 segments en fonction de la structure des cellules tubulaires proximales. Les
deux premiers segments sont principalement localisés dans la partie contournée
(pars convoluta) et le troisième constitue la majeure partie de la section droite (pars
recta).
Chez le rat, le premier segment S1 se compose du début de la partie contournée, le
second segment S2 consiste en la fin de la partie contournée et le tout début de la
section droite, et le troisième segment S3 comprend le reste de la section droite. Les
cellules du segment S1 sont plus grandes, les microvillosités de la bordure en brosse
plus longues et les vacuoles apicales d’endocytose plus nombreuses que dans le
segment S2. Au niveau du segment S3, les microvillosités de la bordure en brosse
sont plus longues que pour les segments S1 et S2. Les mitochondries des cellules
du segment S3 sont plus petites, moins nombreuses et dispersées de manière plus
aléatoire que dans les deux autres segments, et ne présentent pas une association
étroite avec la membrane plasmique (Fig. 7).
21

Figure 7. Schéma de l’ultrastructure de l’épithélium de chacun des 3 segments du tubule
proximal chez le rat (S1 à S3), illustrant les différences d’organisation cellulaire et de
distribution des mitochondries (M), lysosomes (L) vacuoles d’endocytose (E) et peroxisomes
(P). [Maunsbach A.B. et al., 1992]
2.2. Réabsorption tubulaire
2.2.1. Réabsorption du sodium
Les ions sodium sont réabsorbés dans chaque partie du tubule rénal par des
systèmes de transport qui permettent non seulement de récupérer le sodium filtré par
le glomérule mais aussi l’eau, les anions et les nutriments. D’autre part, ces
systèmes de transport entraînent parfois la sécrétion de substances inutiles telles
que les ions H + et K + excédentaires.
La concentration intracellulaire du sodium inférieure à la concentration extracellulaire
ainsi que le potentiel intracellulaire négatif induisent un gradient électrochimique
permettant aux ions sodium contenus dans l’ultrafiltrat de rentrer par diffusion
passive dans la cellule au travers de la bordure en brosse de la membrane apicale.
Simultanément, la pompe Na + /K + -ATPase située à la membrane basale expulse du
Na + hors de la cellule, tout en introduisant du K + dans la cellule. Les ions K + étant
plus concentrés à l’intérieur de la cellule qu’à l’extérieur, le K + diffuse à l’extérieur de
la cellule par des canaux (Fig. 8).
22

Na + Na + Na + Na +
K + K +
Na + Na + Na + Na +
K + K +
H 2 O
Cl- Cl , HCO -
3 - , HCO -
3
urée
Apical Basolatéral
Figure 8. Schéma de la réabsorption du sodium par la cellule tubulaire proximale du rein de
mammifère. Le sodium entre dans la cellule par diffusion passive à la membrane apicale et
est transporté à la membrane basale par la pompe Na + /K + -ATPase. Le potassium est
expulsé de la cellule par les canaux K + .
Le transport actif primaire de sodium par la pompe Na + /K + -ATPase favorise la
réabsorption de l’eau par osmose. Par conséquent, la concentration d’autres solutés
est augmentée dans l’ultrafiltrat favorisant ainsi la réabsorption par diffusion facilitée
des ions K + , Cl - et HCO3 - .
2.2.2. Réabsorption des nutriments
Na + Na +
H 2 O
Figure 9. Schéma de la réabsorption des nutriments par la cellule tubulaire proximale du rein
de mammifère. Le glucose est réabsorbé par le symporteur sodium-glucose.
Na + Na +
K + K +
glucose glucose
ATP
ADP
K + K +
H 2 O
Cl- Cl , HCO -
3 - , HCO -
3
urée
Na + Na +
K + K +
Na + Na +
K + K +
ATP
ADP
Apical Basolatéral
23

Le glucose filtré, les acides aminés, l’acide lactique et d’autres métabolites
sont réabsorbés par les symporteurs de sodium, qui fonctionnent par transport actif
secondaire. Un symporteur sodium-glucose achemine un ion Na + et une molécule de
glucose à l’intérieur de la cellule et la pompe à sodium permet de maintenir la
concentration intracellulaire faible en ions Na + . La réabsorption des nutriments
entraîne également la réabsorption d’eau par osmose (Fig. 9).
2.3. Sécrétion tubulaire
Les métabolites de l’organisme comme l’acide urique, le glucuronide,
l’hippurate, les sulfates ainsi que des substances exogènes (pénicilline, diurétiques,
acide para-aminohippurique) parviennent dans l’urine tubulaire par sécrétion
transcellulaire. D’autres substances, comme l’ammoniaque et les ions H + , sont
uniquement produites par le métabolisme de la cellule tubulaire et parviennent dans
le tubule par sécrétion cellulaire.
La sécrétion tubulaire a pour fonction d’éliminer certaines substances de
l’organisme et de réguler le pH. Les substances sécrétées sont les ions K + , H + et
NH4 + , la créatinine et des médicaments (exemple : la pénicilline) et l’acide para-
aminohippurique.
2.3.1. Sécrétion d’hydrogène
La sécrétion des ions H + est effectuée par les antiporteurs Na + /H + situés à la
membrane apicale. Ces systèmes de transport actif secondaire dépendent de la
pompe à sodium afin de maintenir la concentration intracellulaire de sodium faible.
24

2.3.2. Sécrétion d’ammonium
Les cellules tubulaires produisent également de l’ammoniaque en désaminant
des acides aminés. La plus grande partie de l’ammoniaque s’associe à des ions H +
pour former des ions ammonium qui sont sécrétés par des antiporteurs Na + /NH4 + .
2.4. Endocytose médiée par récepteur
L’endocytose est un processus universel qui consiste pour une cellule à
internaliser, par un système de vésicules, des composants du milieu extérieur. Par
ce mécanisme, les cellules épithéliales polarisées de la membrane apicale du tubule
proximal réabsorbent les protéines plasmatiques qui n’ont pas été retenues par la
barrière de filtration glomérulaire.
L’épithélium tubulaire est caractérisé par la présence d’un appareillage
d’endocytose particulièrement bien développé (Fig. 10). Les nombreuses
invaginations de la membrane apicale à la base des microvillosités de la bordure en
brosse donnent naissance à des puits recouverts d’un manteau de clathrine. Ces
puits se referment pour former des vésicules intracytoplasmiques, des petits
endosomes ou préendosomes (< 0,5 µm) ainsi que des grands endosomes (> 0,5
µm) possédant ou non un manteau de clathrine. Des tubules apicaux denses
intracytoplasmiques sont liés aux petits ou aux grands endosomes ou circulent
librement dans le cytoplasme en direction de la membrane apicale. Ces tubules
apicaux denses permettent le recyclage des protéines membranaires à la membrane
apicale. Les lysosomes vont ensuite digérer les protéines en acides aminés
[Christensen E.I. et al., 1998].
Deux récepteurs multiligands, la mégaline et la cubiline, sont exprimés à la
membrane apicale des cellules épithéliales au niveau de la bordure en brosse et plus
particulièrement dans les espaces intermicrovillaires. Les ligands liés au complexe
mégaline-cubiline sont internalisés dans les puits à clathrine qui se referment pour
former les vésicules recouvertes de clathrine. L’acidification des endosomes par la
25

présence d’une pompe à proton, la proton ATPase type V et d’un canal chlore ClC5
[Marshansky V. et al., 1997; Marshansky V. et al., 2002] entraîne la perte du
manteau de clathrine ainsi que la dissociation du complexe ligand-récepteur. Les
tubules apicaux denses assurent le recyclage de la mégaline et de la cubiline vers la
membrane apicale. Les ligands sont transférés vers les prélysosomes puis les
lysosomes où ils sont dégradés.
Coated
vesicles
Figure 10. Schéma d’une cellule épithéliale absorptive présentant les mécanismes possibles
par lesquels la mégaline peut médier l’endocytose et le transport transcellulaire. [Christensen
E.I. et al., 2002].
Partie de gauche: La mégaline facilite l’endocytose de la cubiline par liaison à ce récepteur.
Les vitamines et le fer qui forment un complexe avec une protéine de transport ainsi que les
protéines se lient à la mégaline et/ou la cubiline pour être endocytosés. Les ligands se
dissocient des récepteurs sous l’action du faible pH dans les endosomes et les récepteurs
sont recyclés à la bordure en brosse par les tubules apicaux denses. Les composés
protéiniques sont dégradés alors que les vitamines et le fer sont transportés au travers de la
cellule épithéliale (mécanisme inconnu).
La partie de droite du schéma montre le transport transcellulaire médié par la mégaline pour
des protéines spécifiques comme la thyroglobuline [Marino M. et al., 2000] et la protéine de
liaison au rétinol [Marino M. et al., 2001].
26

2.4.1. Mégaline et cubiline
Structure et ligands
La mégaline et la cubiline sont deux glycoprotéines de haut poids moléculaire
dont les caractéristiques principales sont reprises dans le Tableau 1. Ces deux
récepteurs ont une structure très différente : la mégaline est une protéine
transmembranaire contrairement à la cubiline qui est une protéine membranaire
périphérique ne possédant pas de domaine transmembranaire (Fig. 11).
Tableau 1 : Caractéristiques de la mégaline et de la cubiline
Mégaline Cubiline
gp330
antigène de la néphrite d’Heymann
[Kerjaschki D. et al., 1982]
gp280
récepteur du complexe facteur intrinsèque
gastrique/cobalamine
[Seetharam B. et al., 1997]
600 kDa 460 kDa
Glycoprotéine récepteur transmembranaire
constituée d’un grand domaine
extracellulaire amino-terminal, un seul
domaine transmembranaire et d’une petite
extrémité cytoplasmique carboxy-terminale
[Saito A. et al., 1994]
Les séquences complètes d’ADN
complémentaire ont été déterminées chez le
rat [Saito A. et al., 1994] et chez l’homme
[Hjalm G. et al., 1996] et présentent 77 %
d’identité.
Gène humain localisé sur le chromosome
2q24-q31
[Korenberg J.R. et al., 1994]
Appartient à la famille des lipoprotéines
récepteurs de faible densité
[Raychowdhury R. et al., 1989]
Glycoprotéine périphérique de la membrane
qui ne possède pas de domaine
transmembranaire ni d’ancre
glycosylphosphatidyinositol. La région
amino-terminale (100 résidus) est
probablement nécessaire à l’association du
récepteur à la membrane plasmique.
[Kristiansen M. et al., 1999]
Les séquences complètes d’ADN
complémentaire ont été caractérisées pour
le rat [Moestrup S.K. et al., 1998a], l’homme
[Kozyraki R. et al., 1998] et le chien [Xu D. et
al., 1999]. Homologie de séquence de 70 %.
Gène humain localisé sur le chromosome
10p12.33-p13
[Kozyraki R. et al., 1998]
27

Apical plasma membrane
Figure 11. Structure de la mégaline et de la cubiline. D’après Christensen EI et al.
[Christensen E.I. et al., 2002]
La mégaline est constituée d’un grand domaine extracellulaire (~ 4400 acides
aminés) composé de 4 groupements riches en cystéine de type A « repeats » des
récepteurs des lipoprotéines de faible densité (LDL) qui correspondent aux régions
de liaison des ligands [Hjalm G. et al., 1996; Korenberg J.R. et al., 1994;
Raychowdhury R. et al., 1989; Saito A. et al., 1994]. Ces régions sont séparées par
17 domaines EGF (epidermal growth factor) de type « repeats » et de 8 régions
d’espacement pauvres en cystéine contenant des motifs YWTD qui interviennent
dans la libération des ligands dépendant du pH dans les endosomes [Davis C.G. et
al., 1987]. Un seul domaine transmembranaire (22 acides aminés) est suivi de
l’extrémité cytoplasmique (213 acides aminés) constituée de 2 séquences NPXY qui
permettent l’internalisation des puits de clathrine [Chen W.J. et al., 1990] et une
séquence ressemblant au motif NPXY.
La cubiline est principalement composée d’un domaine extracellulaire
composé de 27 domaines CUB (complement subcomponents C1r/C1s, EGF-related
sea urchin protein and bone morphogenic protein-1) qui permettent l’interaction avec
plusieurs protéines [Kristiansen M. et al., 1999; Kristiansen M. et al., 2000]. Les
domaines CUB sont précédés d’une séquence de 110 acides aminés suivie de 8
domaines EGF de type « repeats ». La région amino-terminale comporte un site
28

potentiel de palmitoylation et une structure aliphatique en hélice alpha. Ces deux
structures semblent contribuer à l’ancrage du récepteur dans la membrane
[Kristiansen M. et al., 1999].
La structure de la cubiline présente très peu d’homologie avec d’autres
récepteurs connus d’endocytose tandis que la mégaline appartient à la famille des
récepteurs LDL (Fig. 12). L’étroite homologie entre la structure de la mégaline et du
récepteur d’endocytose chez le nématode Caenorhabditis elegans indique que cette
protéine est fortement conservée au cours de l’évolution [Yochem J. et al., 1993].
Figure 12. Superfamille des récepteurs LDL (low density lipoprotein) montrant les
homologies de structure entre les membres de cette famille: récepteur LDL, récepteur VLDL
(very low density lipoprotein), récepteur 2 de l’apolipoprotéine E, LRP (LDL receptor related
protein), la mégaline et le récepteur chez Caenorhabditis elegans. [Christensen E.I. et al.,
1999b].
La cubiline ne possède pas de site d’interaction avec les protéines
adaptatrices ou d’autres médiateurs de l’endocytose dépendante de la clathrine ; une
liaison de haute affinité, calcium dépendante, et partiellement inhibée par la protéine
associée au récepteur (RAP) a été décrite entre la cubiline et la mégaline in vitro. La
mégaline semble donc médier l’endocytose et le transport intracellulaire de la
cubiline [Moestrup S.K. et al., 1998a]. En plus de cette interaction directe entre les
deux récepteurs, la mégaline et la cubiline ont plusieurs ligands en commun
(Tableau 2). La co-localisation entre la mégaline et la cubiline ainsi que
29

l’internalisation de l’albumine médiée par la mégaline et la cubiline sont décrites dans
le tubule proximal chez la souris (Fig. 13) [Christensen E.I. et al., 2004] et dans les
cellules tubulaires proximales de rein d’opossum [Zhai X.Y. et al., 2000].
Figure 13. Colocalisation de la mégaline, cubiline et de l’albumine à la membrane apicale
des cellules tubulaires proximales de souris. D’après Christensen EI et al. [Christensen E.I.
et al., 2004].
A. Double marquage en immunofluorescence de la mégaline (vert) et de la cubiline (rouge).
La couleur jaune illustre la colocalisation de la mégaline et de la cubiline au niveau de
l’épithélium apical des cellules. B. Double marquage en immunofluorescence de la mégaline
(vert) et de l’albumine (rouge). La couleur jaune correspond à la colocalisation de la
mégaline et de l’albumine à la membrane apicale des cellules. Barre = 10 µm.
Expression et régulation
La mégaline et la cubiline sont exprimées au niveau de la membrane
plasmique et de l’appareillage d’endocytose des cellules épithéliales (Tableau 3).
Elles sont co-exprimées par plusieurs épithéliums d’absorption comme l’intestin grêle
[Birn H. et al., 1997; Levine J.S. et al., 1984], le tubule proximal rénal [Chatelet F. et
al., 1986a; Kerjaschki D. et al., 1982; Sahali D. et al., 1988; Seetharam B. et al.,
1988], le feuillet viscéral du sac vitellin [Chatelet F. et al., 1986b; Sahali D. et al.,
1988] et le cytotrophoblaste placentaire [Juhlin C. et al., 1990; Sahali D. et al., 1992].
La mégaline semble être plus largement distribuée que la cubiline ; elle est entre
autre présente au niveau des podocytes glomérulaires de rat [Kerjaschki D. et al.,
1982].
30

Tableau 2 : Ligands de la mégaline et de la cubiline [Christensen E.I. et al., 2002]
Mégaline Cubiline
Protéines de liaison des vitamines
Transcobalamine – vitamine B12 [Moestrup S.K. et al., 1996]
Facteur intrinsèque – vitamine B12 [Seetharam B. et al., 1997]
Protéine de liaison de la vitamine D [Nykjaer A. et al., 1999]
Protéine de liaison de la vitamine D [Nykjaer A. et al., 2001]
Protéine de liaison du rétinol [Christensen E.I. et al., 1999a]
Autres protéines de transport
Albumine [Cui S. et al., 1996; Zhai X.Y. et al., 2000]
Lactoferrine [Willnow T.E. et al., 1992]
Albumine [Birn H. et al., 2000a; Zhai X.Y. et al., 2000]
Hémoglobine [Gburek J. et al., 2002]
Transferrine [Kozyraki R. et al., 2001]
Myoglobine [Gburek J. et al., 2003]
Hémoglobine [Gburek J. et al., 2002]
Odorant-binding protein [Leheste J.R. et al., 1999]
Myoglobine [Gburek J. et al., 2003]
Transthyrétine [Sousa M.M. et al., 2000]
Lipoprotéines
Apolipoprotéine B [Stefansson S. et al., 1995a]
Apolipoprotéine E [Willnow T.E. et al., 1992]
Apolipoprotéine A-I [Kozyraki R. et al., 1999]
Apolipoprotéine J/clusterine [Kounnas M.Z. et al., 1995]
HDL (high density lipoprotein) [Hammad S.M. et al., 1999]
Apolipoprotéine H [Moestrup S.K. et al., 1998b]
Hormones et hormones précurseurs
Hormone parathyroïdienne [Hilpert J. et al., 1999]
Insuline [Orlando R.A. et al., 1998]
EGF [Orlando R.A. et al., 1998]
Prolactine [Orlando R.A. et al., 1998]
Thyroglobuline [Zheng G. et al., 1998]
31

Aminoglycosides [Moestrup S.K. et al., 1995]
Polymyxine B [Moestrup S.K. et al., 1995]
Aprotinine [Moestrup S.K. et al., 1995]
Trichosanthine [Chan W.L. et al., 2000]
PAI-1 [Stefansson S. et al., 1995b]
PAI-1-urokinase [Moestrup S.K. et al., 1993]
PAI-1-tPA [Moestrup S.K. et al., 1993; Willnow T.E. et al., 1992]
Pro-urokinase [Stefansson S. et al., 1995b]
Lipoprotéine lipase [Kounnas M.Z. et al., 1993]
Plasminogène [Kanalas J.J. et al., 1993]
β-amylase [Birn H. et al., 2000b]
α1-microglobuline [Leheste J.R. et al., 1999]
Lysozyme [Orlando R.A. et al., 1998]
Chaînes légères des immunoglobulines [Birn H. et al., 2002]
PAP-1 [Leheste J.R. et al., 1999]
β2-microglobuline [Orlando R.A. et al., 1998]
Drogues et toxines
Enzymes et inhibiteurs d’enzymes
Protéines apparentées à la réponse immune et de stress
Autres
RAP [Christensen E.I. et al., 1992; Kanalas J.J. et al., 1993; Kounnas
M.Z. et al., 1992; Orlando R.A. et al., 1998; Willnow T.E. et al., 1992]
Ca 2+ RAP [Birn H. et al., 1997]
[Christensen E.I. et al., 1992]
Cytochrome c [Orlando R.A. et al., 1998]
Chaînes légères des immunoglobulines [Batuman V. et al., 1998]
Protéine sécrétée par les cellules de Clara [Burmeister R. et al., 2001]
32

Tableau 3 : Expression de la mégaline et de la cubiline [Christensen E.I. et al., 2002; Moestrup S.K. et al., 2001]
Organe Mégaline Cubiline Références
Rein : tubule proximal + +
[Chatelet F. et al., 1986a; Kerjaschki D. et al., 1982; Sahali D. et al., 1988;
Seetharam B. et al., 1988]
Rein : podocytes du glomérule (chez le rat
uniquement)
+ - [Kerjaschki D. et al., 1982]
Intestin grêle + + [Birn H. et al., 1997; Levine J.S. et al., 1984]
Poumons : pneumocytes de type II + - [Chatelet F. et al., 1986b; Kounnas M.Z. et al., 1994; Zheng G. et al., 1994]
Thyroïde + - [Kounnas M.Z. et al., 1994; Zheng G. et al., 1994]
Thymus + + [Hammad S.M. et al., 2000]
Cellules sécrétant l’hormone parathyroïdienne
de la glande parathyroïde
+ - [Juhlin C. et al., 1987; Zheng G. et al., 1994]
Cellules de l’épendyme + - [Zheng G. et al., 1994]
Epithélium ciliaire de l’oeil + - [Lundgren S. et al., 1997; Zheng G. et al., 1994]
Epithélium de l’oreille interne + - [Kounnas M.Z. et al., 1994; Mizuta K. et al., 1999]
Plexus choroïdes + - [Kounnas M.Z. et al., 1994]
Oviductes + - [Zheng G. et al., 1994]
Muqueuse utérine + + [Zheng G. et al., 1994]
Epididyme + - [Chatelet F. et al., 1986b; Zheng G. et al., 1994]
Feuillet viscéral du sac vitellin + + [Chatelet F. et al., 1986b; Sahali D. et al., 1988]
Cytotrophoblaste placentaire + + [Juhlin C. et al., 1990; Sahali D. et al., 1992]
Endomètre + - [Bernadotte F. et al., 1989; Sahali D. et al., 1992]
Trophectoderme + - [Sahali D. et al., 1993]
33

Dans les cellules du tubule proximal rénal et du feuillet viscéral du sac vitellin,
la mégaline et la cubiline sont co-localisées tout au long de l’appareillage
d’endocytose [Christensen E.I. et al., 1992; Kerjaschki D. et al., 1984; Sahali D. et
al., 1988] incluant la bordure en brosse, les puits recouverts d’un manteau de
clathrine, les vésicules endocytaires et les tubules apicaux denses [Christensen E.I.
et al., 1998] (Fig. 14).
Figure 14. Expression de la mégaline et de la cubiline dans l’appareillage endocytaire de la
membrane apicale des cellules tubulaires proximales du rein de rat. D’après Christensen EI
et al. [Christensen E.I. et al., 2002].
Les récepteurs sont identifiés par immunocytochimie sur une cryosection de cortex rénal de
rat à l’aide d’un anticorps de mouton anti-mégaline de rat marqué par un anticorps
secondaire anti-mouton couplé à des particules d’or de 5 nm, et d’un anticorps de lapin anticubiline
de rat marqué par un anticorps secondaire anti-lapin couplé à des particules d’or de
10 nm. Les récepteurs sont coexprimés sur les microvillosités (MV), dans les puits
recouverts d’un manteau de clathrine à la membrane apicale (CP, coated pits), dans les
endosomes (E) et dans les tubules apicaux denses. Barre = 300 nm.
L’expression de la mégaline et de la cubiline in vitro est stimulée par l’acide
rétinoïque et le dibutyryl cyclique AMP, l’expression de la mégaline par la vitamine D
[Hammad S.M. et al., 1999; Liu W. et al., 1998; Stefansson S. et al., 1995a].
Une augmentation de l’expression de la mégaline est observée dans les reins
de rats atteints de la néphrite d’Heymann, maladie glomérulaire expérimentale
induite par des autoanticorps dirigés contre la mégaline [Makker S.P. et al., 1995].
Les cellules neuronales, touchées dans la maladie d’Alzheimer, sont caractérisées
par un dépôt extracellulaire de protéines β-amyloïdes ; parallèlement, ces neurones
34

présentent une accumulation intracellulaire d’apolipoprotéine E ainsi qu’une forte
expression de mégaline à la surface cellulaire [LaFerla F.M. et al., 1997].
Une diminution de l’expression de la mégaline au niveau rénal est observée dans
certaines maladies caractérisées par une protéinurie et un défaut de réabsorption
des protéines filtrées. Notamment, la maladie de Dent est causée par des mutations
au niveau du canal chlore rénal ClC-5 [Thakker R.V., 1998]. En effet, une
perturbation du ClC-5 diminue la réabsorption tubulaire proximale et induit une
réduction de l’expression de la mégaline dans le tubule proximal [Piwon N. et al.,
2000]. Ces observations indiquent donc l’existence d’une corrélation fonctionnelle
entre le ClC-5 et l’endocytose médiée par la mégaline.
Fonction
L’implication de la mégaline et de la cubiline dans le processus de
réabsorption tubulaire des protéines de faible poids moléculaire contenues dans
l’ultrafiltrat glomérulaire est confirmée par le fait que les souris déficientes en
mégaline ainsi que les chiens ayant une mauvaise post-transcription de la cubiline
présentent une augmentation de l’excrétion urinaire des microprotéines.
L’étude sur des souris dont le gène de la mégaline a été invalidé montre que
la plupart des souris meurent avant la naissance à cause de complications
respiratoires liées à une altération de l’insufflation des poumons [Willnow T.E. et al.,
1996]. Ces souris sont également caractérisées par des malformations du cerveau
antérieur et des structures dérivées du cerveau antérieur, ce qui cause le syndrome
d’holoprosencéphalie. Par conséquent, seulement 1 souris déficiente en mégaline
sur 50 atteint l’âge adulte. Les urines de ces souris contiennent les protéines de
faible poids moléculaire, tout comme celles des patients atteints du syndrome de
Fanconi [Leheste J.R. et al., 1999]. En outre, les souris déficientes en mégaline
présentent également des perturbations de l’homéostasie du calcium.
L’étude de patients ayant un déficit héréditaire de l’absorption de la vitamine
B12, connu sous le nom d’anémie mégaloblastique autosomique récessive ou
syndrome d’Imerslund-Gräsbeck, a permis d’acquérir la certitude que la cubiline était
le récepteur physiologique du complexe facteur intrinsèque/vitamine B12. En effet,
35

deux mutations différentes ont été identifiées au niveau du gène de la cubiline chez
ces patients, entraînant des anomalies de structure de la cubiline [Aminoff M. et al.,
1999]. Une race de chiens, issus de parents consanguins ayant un développement
intracellulaire médiocre de la cubiline, présente également une anémie
mégaloblastique [Fyfe J.C. et al., 1991]. Les patients atteints de la maladie
d’Imerslund-Gräsbeck ainsi que les chiens déficients en cubiline sont protéinuriques,
mais sont normaux pour les autres phénotypes et fertiles. Les premières expériences
d’invalidation du gène de la cubiline indiquent que les embryons meurent très
précocement in utero. De même, l’injection d’anticorps anti-cubiline induit des
malformations fœtales chez le rat, probablement dues à la fixation des anticorps sur
le sac vitellin et à une inhibition des mécanismes d’endocytose qui assurent le
transfert entre la mère et le fœtus [Le Panse S. et al., 1994; Sahali D. et al., 1988].
La mégaline peut également influencer le transport de l’échangeur 3
sodium/hydrogène (NHE3), ces deux protéines semblent former un complexe
multimérique à la membrane apicale des cellules du tubule proximal [Biemesderfer
D. et al., 1999].
La mégaline et la cubiline peuvent moduler la signalisation cellulaire
essentiellement par la voie classique d’endocytose médiée par récepteur : en
régulant la captation des hormones pour la dégradation comme l’hormone
parathyroïdienne (PTH) [Hilpert J. et al., 1999], ou la captation des précurseurs
d’hormones pour l’activation comme la 25-OH-vitamine D3 [Nykjaer A. et al., 1999;
Nykjaer A. et al., 2001]. En effet, la 25-OH-vitamine D3 formant un complexe avec sa
protéine de transport plasmatique, la protéine de liaison à la vitamine D, est
réabsorbée au niveau de l’épithélium tubulaire proximal par endocytose médiée par
récepteur incluant la mégaline et la cubiline. L’endocytose est nécessaire pour
préserver la 25-OH-vitamine D3 et délivrer aux cellules le précurseur afin de générer
la 1,25-(OH)2-vitamine D3 , un régulateur du métabolisme du calcium.
L’extrémité cytoplasmique de la mégaline, probablement le domaine carboxyterminal
NPXY, a été décrite comme interagissant avec Dab2 (disabled protein 2)
[Oleinikov A.V. et al., 2000], une protéine intracellulaire potentiellement impliquée
dans la signalisation et la régulation de la croissance cellulaire et la différenciation.
36

La réabsorption tubulaire proximale des drogues polybasiques comme
l’aprotinine, la polymyxine B et les aminoglycosides incluant la gentamicine est
également médiée par la mégaline [Moestrup S.K. et al., 1995]. La captation de
gentamicine médiée par la mégaline au niveau des cellules tubulaires proximales est
confirmée chez les souris déficientes en mégaline [Schmitz C. et al., 2002]. Ces
drogues sont donc néphrotoxiques ainsi qu’ototoxiques. La toxicité est probablement
induite par la mégaline qui accumule les drogues dans les cellules.
2.5. Sécrétion et réabsorption tubulaire des drogues et
xénobiotiques
Le rein et le foie ont des fonctions complémentaires dans l’élimination des
drogues et xénobiotiques. Le métabolisme se déroule principalement dans le foie où
la substance originale est transformée en métabolites plus polaires et plus
hydrophiles qui sont pris en charge par le rein pour leur élimination.
Filtration glomérulaire
La grande majorité des drogues et xénobiotiques possèdent un poids moléculaire
bien inférieur (environs 30 kDa) à la limite de la barrière de la filtration glomérulaire.
Cependant, beaucoup de ces substances se lient aux protéines présentes dans le
sérum (95% de furosémide et 98 % des anti-inflammatoires non stéroïdiens
s’associent à l’albumine), et par conséquent la fraction filtrée est réduite aux
molécules non liées. Les médicaments peuvent s’associer à différentes protéines
sériques, la plus importante est l’albumine liant préférentiellement les composés
acides, suivie par l’α1-glycoprotéine acide pour les composés basiques [Kragh-
Hansen U., 1981; Routledge P.A., 1986]. Dans la majorité des cas, l’élimination
rénale des drogues et xénobiotiques dépend de la sécrétion tubulaire active.
Réabsorption tubulaire
Les acides et les bases faibles sont en général réabsorbés par diffusion
passive au travers de l’épithélium tubulaire.
37

Un certain nombre de drogues et xénobiotiques sont réabsorbés par des
mécanismes facilités. En effet, certains anions organiques sont transportés à la
membrane apicale du tubule proximal par un système de co-transport couplé au
sodium (par exemple les vitamines comme l’acide ascorbique, la biotine). Peu de
connaissances existent sur la réabsorption facilitée des cations organiques.
Plusieurs médicaments ressemblant aux peptides comme les antibiotiques β-
lactames (ceftibuten, cyclacilline) sont des substrats des transporteurs de peptides
localisés à la membrane de la bordure en brosse et absorbés par les cellules
proximales. Les transporteurs de peptides servent d’intermédiaire à un co-transport
électrogénique de di- et tri-peptides couplé aux protons, lequel fonctionne grâce au
gradient de proton et à la différence de potentiel de membrane négative [Daniel H. et
al., 1997].
Des substances hautement hydrophiles insolubles dans les lipides comme les
aminoglycosides cationiques et/ou peut-être le cadmium sont réabsorbées par
endocytose médiée par récepteur [De Broe M.E. et al., 1984; Foulkes E.C., 1990;
Templeton D.M., 1990].
Sécrétion tubulaire rénale des drogues et xénobiotiques
La plupart des xénobiotiques ioniques sont sécrétés par deux mécanismes de
transport, l’un réservé à la sécrétion des anions organiques (« acides organiques »),
et l’autre à celle des cations organiques (« bases organiques »). La première étape
de la sécrétion, le transport au travers de la membrane basolatérale, de chacun des
deux mécanismes généraux est effectuée par différents sous-systèmes susceptibles
de correspondre à différentes molécules de transport pour lesquelles des substrats
de structure moléculaire plutôt non-spécifique peuvent posséder des affinités
variables [Moller J.V. et al., 1982; Ullrich K.J., 1994]. Plusieurs isoformes de ses
transporteurs ont été identifiées et sont membres de la famille des transporteurs des
ions organiques, comprenant les transporteurs d’anions organiques (OAT) et les
transporteurs de cations organiques (OCT) [Burckhardt G. et al., 2000; Inui K.I. et al.,
2000; Sekine T. et al., 2000].
L’étude des mécanismes de sécrétion des ions organiques provient
essentiellement des investigations sur quelques substances transportées qui sont
38

considérées comme représentatives d’autres ions organiques sécrétés. Pour les
anions organiques, le substrat classique est le para-aminohippurate ; tandis que
pour les cations organiques, les substrats classiques sont le tétraéthylammonium
et la N1-méthylnicotinamide.
Ces deux systèmes de transport classiques sont exclusivement localisés dans
le tubule proximal. La sécrétion n’est pas uniforme tout au long du tubule proximal et
peut être différente entre les néphrons superficiels et juxtamédullaires. Comme le
nombre de molécules transportées est limité, la sécrétion est saturable et sujette à la
compétition entre les substrats.
Les systèmes de transport des ions organiques ont été caractérisés aux deux cotés
de la membrane du tubule proximal (Fig. 15 et Fig. 16, pour plus de détails voir
Annexe 1 pages : 157-163) [Pritchard J.B. et al., 1993].
Figure 15. Schéma des processus de transport associés à la sécrétion des anions
organiques (OAs) par les cellules tubulaires proximales rénales [Wright S.H. et al., 2004].
Les cercles correspondent aux transporteurs. Les flèches indiquent la direction du transport
net de substrat pendant la phase active de sécrétion. Les lignes solides correspondent aux
voies principales de transport des OAs, la ligne en pointillé à la voie secondaire, la ligne en
tiret représente la diffusion.
1. Na + /K + -ATPase; 2. NaDC-3; 3, 4, 5. OAT1, OAT2 et OAT3; 6. MRP2; 7. URAT1; 8. OAT4;
9. Oatp1, OAT-K1/K2; 10. OATV1, NTP1; 11. Échangeur OA/OA physiologique. Description
des transporteurs voir Annexe 1 § A.1. (pages 157-160).
39

Figure 16. Schéma des processus de transport associés à la sécrétion des cations
organiques (OCs) par les cellules tubulaires proximales rénales [Wright S.H. et al., 2004].
Les cercles correspondent aux transporteurs. Les flèches indiquent la direction du transport
net de substrat pendant la phase active de sécrétion. Les lignes solides correspondent aux
voies principales de transport des OCs, la ligne en pointillé à la voie secondaire, la ligne en
tiret représente la diffusion.
1. Na + /K + -ATPase; 2, 3, 4. OCT1, OCT2 et OCT3, 5. MDR1; 6. NHE3; 7. Echangeur OC/H + ;
8. OCTN1; 9. OCTN2; 10. Voie électrogénique de réabsorption de la choline. Description des
transporteurs voir Annexe 1 § A.2. (pages 160-163).
En plus de ces systèmes de transport sécrétoire classique, d’autres
mécanismes de transport sont impliqués dans l’excrétion rénale des xénobiotiques
[Roch-Ramel F., 1998].
Au niveau de la membrane basolatérale, l’échangeur oxalate/sulfate (SAT1) et le
système de transport sodium-dicarboxylate (NaDC-3) ont été identifiés [Karniski L.P.
et al., 1998; Ullrich K.J., 1994; Wang H. et al., 2000].
D’autres transporteurs ont été clonés et identifiés à la bordure en brosse ;
cependant, leur fonction dans le rein reste encore à définir. Parmi ceux-ci, les
protéines associées à la résistance aux médicaments (MRP) et le transporteur multimédicaments/P-glycoprotéine
(MDR/Pgp) sont des transporteurs actifs primaires
dépendant de l’ATP, respectivement pour les anions organiques et les cations
organiques [Borst P. et al., 2000; Klein I. et al., 1999]. Ils stimulent l’efflux actif de la
cellule vers la lumière, d’une variété d’ions organiques. Un autre transporteur,
OATP1, permet le transport apical des conjugués stéroïdiens et de la
sulfobromophtaléine [Lu R. et al., 1996]. Les transporteurs OAT-K1 et OAT-K2
40

favorisent le transport du méthotrexate et du folate [Masuda S. et al., 1999b; Masuda
S. et al., 1999a]. L’OCTN1 et l’OCTN2 sont des transporteurs multispécifiques des
cations organiques [Wu X. et al., 1999; Yabuuchi H. et al., 1999].
Le rein est un organe particulièrement sensible aux atteintes toxiques pour
plusieurs raisons. Le flux sanguin rénal (25% du débit cardiaque) est plus important
en comparaison avec la majorité des autres tissus, la quantité de drogues délivrées
au rein est donc plus élevée (50 fois). Le rein présente la plus grande surface
endothéliale par gramme de tissu et possède la plus haute pression hydrostatique
capillaire favorisant la retenue des antigènes circulants et la formation de complexes
immuns. Le rein possède également une haute activité métabolique ainsi que de
multiples systèmes enzymatiques. Le transport tubulaire et les autres processus
rénaux métaboliques nécessitent une quantité considérable d’oxygène et sont
sensibles à l’action des inhibiteurs métaboliques. Il est à noter que le segment S3 du
tubule proximal possède la plus grande proportion d’oxygène délivré/oxygène
consommé par rapport à toutes les autres entités fonctionnelles de l’organisme
[Brezis M. et al., 1984]. Le rein est le seul endroit où les drogues fortement liées aux
protéines se dissocient, traversent la cellule tubulaire et s’accumulent dans
l’épithélium tubulaire et/ou atteignent la lumière tubulaire. Une grande quantité
d’enzymes épithéliaux tubulaires impliquées dans les systèmes de transport tubulaire
peuvent être bloquées, étant donné notamment la très haute concentration en
solutés dans le liquide tubulaire pouvant atteindre des taux de concentrations de
l’urine/plasma dépassant 1000 dans certains cas.
41

3. Marqueurs urinaires d’atteinte tubulaire proximale
La détection et la mesure des marqueurs biologiques, substances présentes
dans l’organisme, fournissent des informations sur la relation entre l’exposition aux
xénobiotiques et les maladies. En effet, ces marqueurs, traduisant un changement
d’état physiologique, indiquent la présence de stress dans les cellules, tissus ou
organes, ou révèlent une lésion. L’utilisation de marqueurs biologiques permet, tout
d’abord, d’identifier les premières altérations structurelles et/ou fonctionnelles d’un
organe cible, induites par l’exposition aux xénobiotiques, et ensuite d’obtenir des
informations sur le(s) mécanisme(s) responsable(s) d’une telle exposition sur la
santé d’un individu.
Les enzymes urinaires et les protéines de faible poids moléculaire sont
utilisées comme marqueurs précoces de toxicité vis-à-vis du néphron, permettant la
détection de petits changements de fonction des cellules épithéliales tubulaires dans
beaucoup de conditions pathologiques. En effet, l’atteinte (qu’elle soit aiguë ou
chronique) des cellules tubulaires induit la libération dans la lumière tubulaire des
enzymes et protéines de faible poids moléculaire physiologiquement présentes dans
ces cellules. Leur excrétion augmente bien avant l’élévation d’autres marqueurs de la
fonction rénale comme la créatinine [D'Amico G. et al., 2003].
La créatinine plasmatique, quant à elle, est couramment utilisée pour évaluer
le taux de filtration glomérulaire donnant des indications sur la fonction rénale.
[(concentration urinaire de créatinine × débit urinaire) / concentration plasmatique de
créatinine = clearance de créatinine exprimée en ml/min, fournissant une
approximation du taux de filtration glomérulaire].
Les principaux marqueurs urinaires d’atteinte tubulaire proximale sont repris
ci-dessous et répartis en deux catégories selon qu’ils traduisent une atteinte
structurelle ou une atteinte fonctionnelle.
42

3.1. Atteinte structurelle
Enzymurie
En plus de leur libération physiologique normale par les cellules [Maruhn D. et
al., 1976; Mutti A., 1989; Vanderlinde R.E., 1981], les enzymes se retrouvent en
quantité anormale dans les urines suite à l’altération de la perméabilité de la
membrane cellulaire, à l’augmentation du taux de synthèse enzymatique et à la
nécrose cellulaire. Toutefois, les sources n’ayant aucun rapport avec l’activité
enzymatique urinaire doivent être exclues comme les enzymes plasmatiques filtrées,
les sécrétions provenant du tractus urogénital, les cellules non-rénales se retrouvant
dans les urines, et l’effet de certains médicaments, comme les salicylates,
susceptibles d’être à l’origine de la desquamation des cellules rénales [Koenig H. et
al., 1978].
Comme la distribution des enzymes n’est pas uniforme tout au long du
néphron, il est possible d’identifier le site spécifique de l’atteinte rénale. En règle
générale, l’activité enzymatique est la plus élevée dans le cortex, principalement
dans les tubules proximaux, la plus faible dans les papilles, et intermédiaire dans la
médullaire [Bernard A. et al., 1991b]. Cependant, sur la centaine d’enzymes urinaires
évaluées, seulement un petit nombre sont considérées comme bio-marqueurs
(Tableau 4).
La lactate déshydrogénase (EC 1.1.1.27) est présente dans le cytoplasme
des cellules, l’excrétion urinaire de cette enzyme augmente lors de lésions ou
maladies rénales.
La N-acétyl-ββββ-D-glucosaminidase (NAG, EC 3.2.1.52) est localisée dans les
lysosomes des cellules tubulaires proximales du segment S3 chez l’homme et du
néphron distal. Chez le rat, par contre, la distribution de la NAG au niveau tubulaire
proximal est différente, la quantité de NAG est plus importante dans les segments S1
et S2 que S3 [Le Hir M. et al., 1980]. Avec une masse moléculaire d’environ 150 kD,
le passage de la NAG au travers de la barrière glomérulaire est retardé et un taux
élevé dans les urines reflète donc une atteinte des cellules tubulaires proximales. La
43

présence de NAG, une enzyme lysosomale intracellulaire, dans les urines indique
que les organelles des cellules tubulaires proximales sont endommagées.
L’alanine aminopeptidase (EC 3.4.11.2) est uniquement présente à la
bordure en brosse de l’épithélium tubulaire proximal. Tout comme la NAG, l’alanine
aminopeptidase est très sensible à l’atteinte tubulaire aiguë [Lauwerys R.R. et al.,
1987].
Tableau 4 : Quelques enzymes utilisées comme index de néphrotoxicité [Finn W.F.
et al., 2003].
Alanine aminopeptidase
Phosphatase alcaline
γ-glutamyltransférase
Maltase
Trehalase
Enzyme Localisation cellulaire
Transaminase glutamique oxaloacétique
Lactate déshydrogénase
Malate déshydrogénase
Glutathion S-transférase
N-acétyl-β-D-glucosaminidase
Phosphatase acide
β-galactosidase
β-glucosidase
β-glucuronidase
Bordure en brosse
Cytoplasme
Lysosome
Glutamate déshydrogénase Mitochondrie
La phosphatase alcaline intestinale et la phosphatase alcaline tissulaire
non-spécifique sont deux iso-enzymes urinaires (EC 3.1.3.1). La phosphatase
alcaline intestinale est localisée à la bordure en brosse des cellules épithéliales
intestinales humaines mais est également présente dans le rein humain normal où
elle est exclusivement exprimée à la bordure en brosse des cellules épithéliales du
44

segment S3 du tubule proximal [Verpooten G.F. et al., 1992]. La phosphatase
alcaline intestinale présente dans les urines est donc d’origine rénale et spécifique
du segment S3. Par contre, la phosphatase alcaline tissulaire humaine est localisée
à la membrane des cellules du foie, des ostéoblastes et fibroblastes ainsi qu’à la
bordure en brosse tout au long des différents segments tubulaires proximaux
[Nouwen E.J. et al., 1994].
Les glutathion-S-transférases (GST, EC 2.5.1.18) sont des enzymes
cytosoliques ; quatre isoenzymes ont été identifiées : alpha, mu, pi et thêta [Hayes
J.D. et al., 1995]. L’isoforme α-GST est localisée dans le cytoplasme des cellules
tubulaires proximales. L’isoforme π-GST est présente dans les cellules du tubule
distal convoluté, de l’anse fine de Henlé, et des tubes collecteurs. Une augmentation
de l’excrétion urinaire de l’α-GST reflète des altérations à la bordure en brosse des
cellules tubulaires proximales [Branten A.J. et al., 2000].
La distribution des enzymes dans tout le néphron varie en fonction de
l’espèce, le tableau 5 indique la localisation des enzymes chez le rat.
3.2. Atteinte fonctionnelle
Protéinurie
Dans des conditions normales, la barrière de filtration glomérulaire empêche
le passage de protéines de haut poids moléculaire du plasma vers la lumière du
néphron. Dans certains états pathologiques, la sélectivité de la barrière de filtration
se modifie, permettant aux protéines de haut poids moléculaire d’apparaître dans les
urines. Par contre, dans les conditions normales, une quantité limitée de protéines de
faible poids moléculaire est filtrée et réabsorbée par les cellules tubulaires
proximales. Lorsque la capacité de réabsorption de l’épithélium tubulaire proximal est
perturbée, plusieurs protéines de faible poids moléculaire échappent à la
réabsorption et sont détectées dans les urines. Par conséquent, la différence entre la
protéinurie glomérulaire et la protéinurie tubulaire se base sur la quantité et la nature
des protéines mesurées dans les urines (Fig. 17) [Peterson P.A. et al., 1969]. De
45

plus, la filtration d’une quantité anormale et/ou le type de protéines influencent la
progression des maladies rénales en induisant secondairement des altérations aux
cellules de l’épithélium tubulaire et aux structures interstitielles [Bernard A. et al.,
1991b; Nath K.A., 1992].
Tableau 5 : Localisation d’enzymes dans le néphron chez le rat
Enzyme
Localisation
cellulaire
Localisation
dans le néphron
Référence
Fructose-1,6-biphosphatase Tubule proximal [Burch H.B. et al., 1978]
Pyruvate kinase Tubule distal [Schmid H. et al., 1980]
Lactate déshydrogénase Cytosol Tout le néphron
Anse fine et tubules
[Burch H.B. et al., 1974]
Aldose réductase
collecteurs de la
médullaire et des
régions papillaires
[Sands J.M. et al., 1989]
Phosphatase alcaline Tout le néphron [Schmidt U. et al., 1971]
5’-nucléotidase
Bordure en
Tout le néphron [Cole B.R. et al., 1982]
Nucléotide pyrophosphatase
brosse
Tubule proximal [Le Hir M. et al., 1986]
γ-glutamyltransférase
Tubule proximal [Heinle H. et al., 1977]
Succinate déshydrogénase Tout le néphron [Schmid H., 1984]
Mitochondrie
Citrate synthase
Tout le néphron [Le Hir M. et al., 1982]
N-acétyl-β-D-glucosaminidase Tout le néphron [Guder W.G. et al., 1984]
Phosphatase acide
Lysosome
Tout le néphron,
excepté l’anse large
ascendante de
Henlé de la
médullaire
[Olbricht C.J. et al., 1984]
Protéinurie de haut poids moléculaire
Un marqueur précoce de l’atteinte glomérulaire est l’apparition dans les urines
de protéines plasmatiques de poids moléculaire supérieur à 50 kD dont l’albumine
(69 kD), la transferrine (77 kD) et les immunoglobulines (146 kD).
46

Figure 17. Trois types de protéinurie [Finn W.F. et al., 2003].
L’albumine est quantitativement la protéine urinaire majeure provenant du
plasma. La concentration moyenne de l’albumine dans les urines normales est au
moins 5 fois supérieure à celle des autres protéines de haut poids moléculaire et au
moins 50 fois supérieure à celle de la plupart des autres protéines de faible poids
moléculaire. Etant donné sa taille moléculaire et sa forte charge négative, l’albumine
est efficacement retenue par la barrière de filtration glomérulaire. La petite quantité
d’albumine qui échappe néanmoins au filtre glomérulaire est réabsorbée par le
tubule proximal avec une efficience présumée de 99 %. Une albuminurie élevée peut
donc refléter soit une augmentation de la filtration glomérulaire, soit une déficience
du transport tubulaire de l’albumine filtrée.
La transferrine est une protéine transporteuse de fer dont la concentration
urinaire est 15 fois plus faible que celle de l’albumine. La détection de transferrine
dans les urines est le témoin précoce d’une implication glomérulaire dans certaines
néphropathies, et est souvent associée avec l’albuminurie.
Les immunoglobulines excrétées dans les urines sont composées
préférentiellement des IgG, IgA et des chaînes légères d’immunoglobulines. La
présence des IgG dans les urines indique une densité augmentée des pores larges
dans la barrière de filtration glomérulaire, permettant le passage de toutes les
protéines en fonction de leur taille et de leur charge. L’excrétion urinaire d’IgG reflète
47

donc la sélectivité de la taille du filtre glomérulaire, signant la nature glomérulaire de
la protéinurie [Tencer J. et al., 1998].
Protéines de faible poids moléculaire
La protéinurie tubulaire est composée de protéines de faible poids
moléculaire. Plusieurs protéines de faible poids moléculaire apparaissent
normalement dans les urines et ont été mesurées en tant que marqueurs biologiques
potentiels de l’atteinte tubulaire [Bernard A.M. et al., 1982] dont notamment : la β2-
microglobuline, la protéine de liaison au rétinol (RBP, retinol binding protein) et l’α1-
microglobuline [Bernard A. et al., 1979].
La β2-microglobuline est une protéine globulaire de faible poids moléculaire
(11,8 kD) synthétisée par quasi toutes les cellules nucléées et localisées à leur
surface membranaire. Etant donné son poids moléculaire et son petit rayon, la β2-
microglobuline est facilement filtrée par le glomérule. Dans des conditions normales,
approximativement 99,9% de la β2-microglobuline filtrée sont réabsorbées par les
cellules épithéliales du tubule proximal et finalement catabolisée. L’excrétion urinaire
de β2-microglobuline est considérablement augmentée lors d’atteinte tubulaire
proximale. Cependant, lorsque le pH urinaire est inférieur à 5,5, la β2-microglobuline
est dégradée ; la protéine de liaison au rétinol et l’α1-microglobuline sont plus stables
comme marqueurs urinaires [Bernard A.M. et al., 1987].
La protéine de liaison au rétinol, également appelée α2-microglobuline, est
une protéine de faible poids moléculaire (21,4 kD) synthétisée dans le réticulum
endoplasmique des cellules parenchymateuses du foie où elle se lie au rétinol. En
effet, la fonction de la protéine de liaison au rétinol est de transporter la vitamine A,
sous sa forme alcoolique (rétinol), du foie vers les tissus épithéliaux. Dans le plasma,
la protéine de liaison au rétinol se lie à la transthyrétine (ou préalbumine). Une fois le
rétinol délivré au tissu cible approprié, la protéine de liaison au rétinol change de
conformation, perd son affinité pour la transthyrétine, est ensuite rapidement
éliminée du plasma par la filtration glomérulaire et finalement réabsorbée et
catabolisée par les cellules tubulaires proximales. La réabsorption de la protéine de
liaison au rétinol implique la mégaline [Marino M. et al., 2001].
48

L’α1-microglobuline (protéine HC , 26-30 kD) est une protéine glycosylée,
associée à la nouvelle famille de petites protéines sécrétoires, comprenant la
protéine de liaison au rétinol. L’α1-microglobuline est principalement synthétisée
dans le foie et est présente dans le plasma sous une forme libre ou liée à différentes
protéines de haut poids moléculaire comme l’immunoglobuline A ou l’albumine. Bien
que la moitié de la quantité présente dans le plasma soit complexée à
l’immunoglobuline A, la forme libre est facilement filtrée au travers de la membrane
glomérulaire. Cette forme libre est utilisée comme indicateur de dysfonction tubulaire
[Ekstrom B. et al., 1975; Grubb A., 1992; Weber M.H. et al., 1992].
Autres protéines
La Protéine 1, également appelée protéine des cellules de Clara, est une α-
microprotéine (environ 20 kD). L’excrétion urinaire de protéine 1 augmente chez les
patients présentant un dysfonctionnement tubulaire proximal [Bernard A. et al.,
1991a].
Les amylases (EC 3.2.1.1) sont des enzymes de faible poids moléculaire et
excrétées en grandes quantités dans les protéinuries tubulaires. Les amylases
sériques sont principalement synthétisées par les glandes salivaires et le pancréas.
Ces deux iso-enzymes possèdent la même taille moléculaire (29Å) mais des charges
nettes différentes dans le plasma ; le rapport urinaire de l’amylase salivaire sur
l’amymase pancréatique peut devenir utile pour explorer les changements des
charges négatives de la membrane basale glomérulaire [Recio F. et al., 1994]
Le lysozyme (EC 3.2.1.17) ou muramidase est une enzyme qui catalyse
l’hydrolyse de la couche de peptidoglycan de la paroi cellulaire des bactéries. Il
provient des cellules phagocytaires et est activement sécrété par les monocytes et
les macrophages. L’excrétion urinaire de lysozyme augmente lors d’infections des
voies urinaires, de lésions tubulaires proximales et d’une synthèse excessive de
lysozyme endogène qui dépasse largement la capacité d’absorption du tubule
proximal.
49

La cystatine C est une protéine basique non-glycosylée avec pratiquement le
même poids moléculaire (13,3 kD) que la β2-microglobuline. Toutes les cellules
nucléées produisent un taux stable de cystatine qui n’est pas influencé par
l’inflammation. Les concentrations plasmatiques de cystatine changent avec l’âge en
parallèle avec les modifications du taux de filtration glomérulaire. La cystatine C est
présente dans les urines lors de dysfonctionnements tubulaires. La cystatine C est
considérée par certains comme un marqueur endogène de la fonction rénale plus
fiable que la créatinine.
La glycoprotéine de Tamm-Horsfall (80 kD) est la plus abondante protéine
d’origine rénale présente dans les urines normales et le constituant majeur des
débris urinaires [TAMM I. et al., 1950]. La protéine de Tamm-Horsfall est localisée à
la membrane des cellules épithéliales de la branche ascendante large de l’anse de
Henlé. L’excrétion urinaire de cette protéine peut augmenter suite à une atteinte de
la partie distale du tubule, mais peut être anormale lorsque la masse rénale est
réduite [Thornley C. et al., 1985].
50

4. Cellules de rein d’opossum : modèle d’étude du
tubule proximal
4.1. Caractérisation de la lignée de cellules OK (opossum
kidney)
La lignée de cellules OK a été établie au départ de tissu rénal d’un opossum
adulte d’Amérique (Didelphys virginiana). Cette lignée prolifère rapidement et est
stable du point de vue morphologique et de son caryotype [Koyama H. et al., 1978].
Les cellules OK s’organisent en monocouches de cellules épithéliales polarisées et
partagent de nombreuses propriétés morphologiques et fonctionnelles avec les
cellules tubulaires proximales [Malstrom K. et al., 1987].
Propriétés de transport
La membrane apicale des cellules OK comporte les systèmes de transport
couplés au Na + pour les acides aminés, le glucose, les protons et le phosphate
inorganique ainsi qu’une sensibilité hormonale à la PTH et à la calcitonine
[Malmstrom K. et al., 1986; Malstrom K. et al., 1987] (Tableau 6). La lignée rénale de
cellules OK est la seule lignée cellulaire établie avec des caractéristiques proximales
ayant la capacité de réguler le co-transport Na + dépendant/phosphate en réponse,
soit à un agent rapide comme la PTH [Hruska K.A. et al., 1987; Teitelbaum A.P. et
al., 1984; Teitelbaum A.P. et al., 1986], soit un stimulus prolongé comme une
déprivation chronique en phosphate organique ou l’exposition à de l’hormone
thyroïdienne [Quamme G. et al., 1989; Yonemura K. et al., 1990]. En effet, les
récepteurs de haute affinité pour la PTH, présents dans les cellules OK, sont couplés
à l’activation de l’adénylate cyclase et l’inhibition du co-transport Na + /phosphate
[Caverzasio J. et al., 1986; Cole J.A. et al., 1987; Malmstrom K. et al., 1986;
Teitelbaum A.P. et al., 1986].
51

Tableau 6 : Caractéristiques des transports tubulaires au niveau de l’épithélium proximal des cellules OK
Transporteur Sodium Localisation Substrat Activateur Inhibiteur Régulateur Références
Na + /acides aminés
Na + /hexoses
Na + /glucose
dépendant apicale
Acides aminés acides : Lglutamate
Acides aminés neutres :
L-proline, L-alanine, Lphénylalanine
Acides aminés neutres :
indépendant basolatérale
L-alanine
Acides aminés
dépendant apicale
dibasiques : L-arginine
α-méthyl-D-glucoside
D-glucose
Phlorizine
indépendant basolatérale D-glucose Cytochalasine B
Na + /phosphate dépendant PTH PTH
Na + /phosphate
inorganique
NaPi type IIa
Na + /sulfate
inorganique
dépendant apicale
indépendant
Hormonale,
PTH
[Malstrom K. et al.,
1987; Schwegler J.S. et
al., 1989b]
[Malstrom K. et al.,
1987; Van den B.L. et
al., 1989]
[Caverzasio J. et al.,
1986; Malmstrom K. et
al., 1986; Teitelbaum
A.P. et al., 1984]
[Cole J.A. et al., 1987;
Malstrom K. et al., 1987]
[Malstrom
1987]
K. et al.,
52

Échangeur Na + /H +
NHE3
Echangeur
H + /cations
organiques
Echangeur cations
organiques/cations
organiques
Echangeur
PAH/anions
organiques
Echangeur PAH
(anions
organiques)/dicarb
oxylates
Echangeur PAH
(anions
organiques)/dicarb
oxylates
apicale Insuline PTH amiloride
apicale Tetraéthylammonium
apicale
dépendant basolatérale PAH
Para-aminohippurate
(PAH)
Cations organiques
(1mM): N 1 -
méthylnicotine amide,
amiloride, cimetidine,
verapamil,
procainamide,
quinidine
Probénécide,
furosémide, diéthyl
pyrocarbonate
(inhibiteur du transport
d’anions organiques
sensibles au potentiel),
dicarboxylates
Dicarboxylates (αkétoglutarate),
probénécide,
furosémide,
antibitiques β-lactames
(benzylpénicilline,
cefazoline)
PTH (par la
voie de la
protéine
kinase C)
EGF
[Gekle M. et al., 1999;
Helmle-Kolb C. et al.,
1990; Klisic J. et al.,
2002; Malstrom K. et al.,
1987; Pollock A.S. et al.,
1986]
[McKinney T.D. et al.,
1990; Yuan G. et al.,
1991]
[Habu Y. et al., 2002;
Nagai J. et al., 1997;
Takano M. et al., 1994]
[Hori R. et al., 1993;
Nagai J. et al., 1995;
Sauvant C. et al., 2001;
Takano M. et al., 1994]
53

Les cellules OK contiennent également des transports spécifiques des anions
et des cations organiques [Hori R. et al., 1993; Yuan G. et al., 1991].
Dans les cellules OK, la distribution des transporteurs d’hexoses dépendant et
indépendant du sodium ainsi que l’existence à la membrane apicale de systèmes de
transport couplé au sodium pour le glutamate (dépendant du K + interne), la L-proline
et la L-alanine, le phosphate inorganique et l’échangeur Na + /H + sont en accord avec
les données caractérisant le transport tubulaire proximal [Malstrom K. et al., 1987].
Réponse hormonale
La PTH inhibe l’activité du co-transporteur Na/Pi de type IIa (NaPi-4), exprimé
à la surface apicale des cellules OK [Sorribas V. et al., 1994]; la diminution associée
à l’expression de la protéine du co-transporteur Na/Pi de type IIa à la membrane
apicale entraîne une accumulation subapicale transitoire du transporteur et sa
dégradation lysosomale [Keusch I. et al., 1998; Malmstrom K. et al., 1987; Pfister
M.F. et al., 1997; Pfister M.F. et al., 1998]. La première étape de la régulation par la
PTH est l’internalisation de la protéine du co-transporteur Na/Pi de type IIa au départ
de la membrane apicale conduisant à sa dégradation lysosomale [Jankowski M. et
al., 1999].
L’insuline stimule l’activité de l’échangeur Na + /H + NHE3. Dans les cellules OK,
l’insuline augmente l’activité de l’échange Na + /H + de manière dépendante du temps
et de la concentration ; cet effet est dû à l’activation de NHE3. L’insuline semble
stimuler l’activité de NHE3 tubulaire rénal par un mécanisme biphasique impliquant
des facteurs post-transcriptionnels et une augmentation de l’expression du gène de
NHE3 ; ces effets sont amplifiés sous l’action de l’hydrocortisone [Klisic J. et al.,
2002].
Les cellules OK sont également sensibles à d’autres hormones : le facteur
atrial natriurétique [Nakai M. et al., 1988], la calcitonine [Malmstrom K. et al., 1986],
la dexaméthasone [Rizzoli R. et al., 1987], la dopamine [Cheng L. et al., 1990],
l’épinéphrine [Murphy T.J. et al., 1988], le facteur de croissance 1 analogue à
l’insuline (IGF1) [Caverzasio J. et al., 1989], la prostaglandine E2 [Malmstrom K. et
54

al., 1986], la sérotonine [Murphy T.J. et al., 1989], l’hormone thyroïdienne [Yonemura
K. et al., 1990] et la vitamine D [Binswanger U. et al., 1993; Wald H. et al., 1998].
Propriétés électriques
Le potentiel de membrane des cellules OK est principalement (70%)
déterminé par la conductance des ions K + qui est bloquée par le baryum. La
dépolarisation des cellules OK est rapide en réponse à l’acidité intracellulaire,
complètement réversible et peut être protégée par l’amiloride. La perméabilité au K +
est donc régulée par le pH intracellulaire. La présence de l’échangeur Na + /H + permet
de compenser la charge acide intracellulaire induisant une repolarisation de la
membrane cellulaire par modification de la conductance K + . La pompe
électrogénique Na + /K + -ATPase contribue également à la conductance totale de la
membrane cellulaire (mais à 30%) [Schwegler J.S. et al., 1989a].
La résistance transépithéliale est extrêmement faible dans les monocouches
de cellules OK. Les cellules OK forment un grand nombre de dômes reflétant un
transport de soluté du côté apical vers le côté basolatéral. La réponse très rapide aux
changements de concentration ionique suggère que la conductance K + est localisée
à la membrane apicale des cellules. Les monocouches de cellules OK sont
électriquement faibles [Schwegler J.S. et al., 1989a].
Propriétés biochimiques
La croissance des cellules OK n’étant que légèrement diminuée dans un
milieu défini sans sérum par rapport à un milieu contenant du sérum, les
observations suivantes ont été réalisées pour des cellules OK en milieu sans sérum.
L’activité de la glutathion-S-transférase, un marqueur enzymatique spécifique du
cytosol des tubules proximaux est faible et le contenu total en glutathion diminue au
cours du temps. L’activité spécifique des enzymes marqueurs de la bordure en
brosse comme l’alanine aminopeptidase et la phosphatase alcaline est très faible ;
l’activité de la γ-glutamyl transpeptidase est absente. En effet, les cellules OK
présentent une très faible quantité de microvillosités. L’activité de l’enzyme
lysosomale NAG est bien présente dans les cellules OK. L’activité de la succinate
déshydrogénase, une enzyme associée aux mitochondries, est constante. L’activité
de la Na + /K + -ATPase est stable. L’activité de la lactate déshydrogénase et de
55

l’hexokinase, enzyme de la glycolyse, restent stables. Les cellules OK expriment une
très faible activité phosphoénolpyruvate carboxykinase [Courjault F. et al., 1991].
4.2. Endocytose médiée par récepteur
Les cellules OK ont la capacité de réabsorber les protéines par un mécanisme
d’endocytose bien distinct de l’endocytose en phase fluide [Schwegler J.S. et al.,
1991]. En effet, les monocouches de cellules OK réabsorbent l’albumine marquée à
la fluorescéine isothiocyanate (FITC) selon une cinétique de saturation dépendante
du temps et de la concentration, contrairement à l’inuline-FITC qui entre dans les
cellules par un processus non-saturable (Fig. 18). Le système de transport de
l’albumine dans les cellules OK possède une affinité apparente de 24 mg/l (20-30
mg/l), laquelle correspond à la concentration physiologique estimée dans la lumière
tubulaire (30mg/l [Eisenbach G.M. et al., 1975]). L’endocytose d’albumine-FITC
atteint son maximum à un pH extracellulaire de 7,4 mais est réduite en milieu acide
ou alcalin. Par contre, la concentration extracellulaire de sodium, de chlore ou de
calcium n’influence pas l’absorption d’albumine-FITC. Les cellules OK représentent
un modèle bien adapté pour étudier la réabsorption tubulaire proximale des
protéines.
L’albumine-FITC est un marqueur fiable pour suivre l’endocytose médiée par
récepteur : seulement environ 2 % de son endocytose est attribuée à l’endocytose en
phase fluide. L’albumine capturée par les cellules OK est dégradée en fonction du
pH vésiculaire. L’acidification des endosomes est particulièrement importante dans
l’endocytose médiée par récepteur de l’albumine. Par contre, la formation de
vésicules d’endocytose en phase fluide n’est pas influencée par l’alcalinisation des
endosomes ni par l’acidification du cytoplasme. Les cellules OK constituent
également un bon modèle pour étudier le pH endosomal [Gekle M. et al., 1995a]
La cinétique de l’endocytose d’albumine-FITC par les cellules OK est
influencée par le Ca 2+ et l’AMP cyclique mais pas au niveau de la formation des
vésicules d’endocytose, contrairement à l’endocytose en phase fluide du FITC-
56

dextran qui n’est pas modifiée. Le Ca 2+ est nécessaire à l’endocytose médiée par
récepteur mais n’intervient probablement pas dans sa régulation. Par contre, l’AMP
cyclique peut influencer l’endocytose médiée par récepteur dans des conditions
physiologiques [Gekle M. et al., 1995b].
A
B
Figure 18. Cinétiques de l’absorption d’albumine-FITC et d’inuline-FITC. A. Evolution au
cours du temps de la fluorescence intracellulaire après incubation avec 0,5 g/l d’albumine à
37°C en milieu bicarbonate (cercle) et sur glace en solution Ringer (triangle). FITC-inuline :
0,5g/l, 37°C en milieu bicarbonate (cercle noir). B. Taux d’absorption initial (15 min)
d’albumine-FITC (cercle) et d’inuline-FITC (cercle noir) à différentes concentrations du
substrat (37°C, milieu bicarbonate). n = 4-6. [Schwegler J.S. et al., 1991].
Les cellules OK expriment un site de liaison de haute affinité pour l’albumine à
la membrane apicale ; ce site de liaison est sensible au pH et lie l’albumine en
quantité physiologique [Gekle M. et al., 1996].
L’endocytose d’albumine par les cellules OK se déroule par la voie
dépendante de la clathrine et dépend essentiellement de l’intégrité du cytosquelette
d’actine. Les microtubules facilitent l’absorption par endocytose. La voie
d’endocytose médiée par les cavéoles, vésicules recouvertes d’un manteau de
cavéoline, n’est pas impliquée dans l’endocytose de l’albumine dans les cellules OK
[Gekle M. et al., 1997].
57

Enfin, l’endocytose d’albumine par les cellules OK implique les deux
récepteurs mégaline et cubiline intervenant dans l’endocytose médiée par récepteur.
Ces deux glycoprotéines sont co-exprimées et principalement co-localisées à la
surface des cellules (Fig. 19A). Des observations en microscopie électronique
montrent que la mégaline et la cubiline sont co-localisées à la surface des
microvillosités, dans les puits recouverts d’un manteau de clathrine et dans les
compartiments endocytaires (Fig. 19B). Seules les cellules exprimant la mégaline et
la cubiline sont capables d’absorber l’albumine, indiquant une association entre ces
deux récepteurs et l’endocytose d’albumine [Zhai X.Y. et al., 2000].
Figure 19. A. & B: Colocalisation (en jaune) par immunofluorescence de la mégaline (FITC,
en vert) et de la cubiline (TRIC, en rouge) dans les cellules OK (A ×1100, B ×1800).
C & D: Colocalisation (en jaune) par immunofluorescence d’albumine-FITC (en vert) et de la
cubiline (C) ou la mégaline (D) marquée au TRIC (en rouge). Grossissement ×1400.
E. Double marquage immunocytochimique pour la mégaline et la cubiline observé en
microscopie électronique. La mégaline (particules d’or 5 nm) et la cubiline (particules d’or 10
nm) sont distribuées ensemble à la membrane apicale (flèche) et dans les vacuoles
d’endocytoses (tête de flèche) dans les cellules OK. MV: microvillosités. Grossissement
×86000. [Zhai X.Y. et al., 2000].
E
58

5. Toxicité tubulaire des acides aristolochiques
Acides aristolochiques
Les acides aristolochiques (AA) sont extraits de plantes de la famille des
Aristolochia (par exemple Aristolochia clematitis, Aristolochia fangchi et Aristolochia
Manshurensis) et consistent en un mélange de composés structurellement dérivés
des acides carboxyliques nitrophénantrènes, principalement l’acide aristolochique I
(AAI) et l’acide aristolochique II (AAII) (Figure 20) [Mix D.B. et al., 1982].
Figure 20. Structure chimique de l’acide aristolochique I (AAI), acide 8-méthoxy-6-nitrophénantro-(3,4,d)-1,3-dioxolo-5-carboxylique
et de l’acide aristolochique II (AAII), acide 6nitro-phénantro-(3,4,d)-1,3-dioxolo-5-carboxylique
[Arlt V.M. et al., 2002].
Métabolisme
Les études du métabolisme des AA dans différentes espèces dont l’être
humain montrent que les aristolactames produits par nitroréduction sont les
principaux métabolites retrouvés dans les urines et les fèces [Krumbiegel G. et al.,
1987]. L’aristolactame Ia, le principal métabolite d’AAI, est produit par deux voies
métaboliques, l’une par l’aristolactame I et l’autre par AAIa (Fig. 21).
Formation d’adduits d’ADN
La transformation des aristolactames en agents aux propriétés mutagènes
résulte de l’activation métabolique des AA ; cette activation comporte une étape
cruciale, la nitroréduction [Schmeiser H.H. et al., 1984]. En effet, un ion Nacylnitrenium
cyclique porteur d’une charge positive délocalisée est produit ; il se lie
59

Figure 21. Métabolisme de l’acide aristolochique I et de l’acide aristolochique II chez
différentes espèces de mammifère, y compris l’homme [Krumbiegel G. et al., 1987].
préférentiellement aux groupes amino exocycliques des nucléotides des bases
puriques de l’ADN, formant les adduits d’ADN, ou est hydrolysé en 7hydroxyaristolactame
correspondant (Fig. 22) [Arlt V.M. et al., 2002]. Les structures
des principaux adduits d’ADN ont été déterminées par spectroscopie : 7-
(déoxyadénosine-N 6 -yl)aristolactame I (dA-AAI), 7-(déoxguanosine-N 2 -
yl)aristolactame I (dG-AAI), 7-(déoxyadénosine-N 6 -yl)aristolactame II (dA-AAII) [Pfau
W. et al., 1990; Pfau W. et al., 1991]. La méthode la plus couramment utilisée pour
détecter les adduits d’ADN est le dosage très sensible du post-marquage au 32 P.
Cette méthode appliquée tant in vitro qu’in vivo est quasi spécifique [Stiborova M. et
al., 1998].
60

Figure 22. Activation métabolique et formation des adduits d’ADN aux acides aristolochiques
I (AAI, R = OCH3) et II (AAII, R = H); 7-(déoxyadénosine-N 6 -yl)aristolactame I ou II (dA-AAI
ou dA-AAII), 7-(déoxyguanosine-N 2 -yl)aristolactame I ou II (dG-AAI ou dG-AAII) [Arlt V.M. et
al., 2002].
5.1. Néphropathie aux plantes chinoises : aperçu clinique
La néphropathie dite aux plantes chinoises (CHN, Chinese-herb nephropathy)
a été observée pour la première fois au début des années 1990 en Belgique. Elle
consiste en une atteinte rénale, qui progresse rapidement jusqu’au stade terminal, et
a été initialement rapportée chez un nombre de femmes qui ont toutes ingéré des
gélules amaigrissantes contenant des plantes chinoises [Vanherweghem J.L. et al.,
61

1993]. Dans le courant de l’année 1990, la prescription magistrale du cabinet
bruxellois a été modifiée en introduisant des extraits de poudre de plantes chinoises,
à savoir Stephania tetrandra et Magnolia officinalis. Les analyses phytochimiques
des échantillons de soi-disant Stephania tetrandra ont montré la présence d’AA
extraits d’Aristolochia fangchi en lieu et place de la tétandrine attendue [Vanhaelen
M. et al., 1994].
Des cas similaires d’insuffisance rénale, ayant un rapport ou non avec le
contexte de régime amaigrissant, ont été décrits de par le monde chez des patients
exposés aux espèces d’Aristolochia contenant des AA : en France [Pourrat J. et al.,
1994; Stengel B. et al., 1998], en Espagne [Pena J.M. et al., 1996], au Royaume-Uni
[Cronin A.J. et al., 2002; Lord G.M. et al., 1999], en Allemagne [Krumme B. et al.,
2001], à Taiwan [Chang C.H. et al., 2001; Yang C.S. et al., 2000; Yang S.S. et al.,
2002], au Japon [Tanaka A. et al., 2000a; Tanaka A. et al., 2000b], en Chine [Chen
W. et al., 2001; Gillerot G. et al., 2001; Lee S. et al., 2004; Li X. et al., 2001; Yang L.
et al., 2003; Yu Y. et al., 2003] et aux Etats-Unis [Meyer M.M. et al., 2000].
Aperçu clinique
Dans la plupart des cas, l’insuffisance rénale a été détectée par une analyse
sanguine de routine. Cette néphropathie ne s’accompagne ni d’albuminurie ni
d’anomalies du sédiment urinaire. Excepté quelques observations de syndrome de
Fanconi [Krumme B. et al., 2001; Tanaka A. et al., 2000a; Tanaka A. et al., 2001;
Yang S.S. et al., 2002], la majorité des cas sont caractérisés par une insuffisance
rénale chronique, évoluant vers une insuffisance rénale terminale nécessitant
l’instauration d’un traitement de suppléance (dialyse, transplantation rénale).
L’examen anatomo-pathologique des reins des patientes CHN révèle une
fibrose interstitielle pauci-cellulaire étendue accompagnée d’une atrophie tubulaire
sévère accompagnée d’une perte des tubules. Ces lésions progressent du cortex
superficiel vers le cortex profond. Les glomérules sont relativement épargnés ;
cependant un collapsus des capillaires, une fragmentation de la membrane basale et
un épaississement fibreux de la capsule de Bowman sont observés [Cosyns J.P. et
al., 1994a; Depierreux M. et al., 1994]. Un gonflement endothélial et un
62

épaississement fibreux de la paroi des artérioles interlobulaires et efférentes ont
également été observés [Depierreux M. et al., 1994].
L’atteinte structurelle de l’épithélium tubulaire proximal chez les patientes CHN
a été confirmée par différentes études cliniques, indiquant que la cellule tubulaire
proximale est la cible principale de la néphropathie induite par les AA. En effet, une
excrétion accrue des protéines de faible poids moléculaire filtrées comme la protéine
des cellules de Clara, la protéine de liaison au rétinol, la β2-microglobuline, l’α1-
microglobuline et la cystatine C a été observée, témoignant d’un dysfonctionnement
de la réabsorption tubulaire proximale [Kabanda A. et al., 1995; Nortier J.L. et al.,
1997]. En parallèle, l’excrétion urinaire de l’endopeptidase neutre (NEP) est
progressivement réduite chez les patientes atteintes de la néphropathie aux plantes
chinoises, reflétant une perte de la bordure en brosse. Une excrétion urinaire
anormale de l’enzyme lysosomale NAG, un autre marqueur de l’atteinte tubulaire est
également observée [Nortier J.L. et al., 1997]. Finalement, le profil de l’aminoacidurie
enregistré chez des patientes CHN présentant un syndrome de Fanconi (excrétion
augmentée de proline, d’hydroxyproline et citrulline avec une excrétion quasi
normale de glycine) suggère que les AA affecteraient de manière prédominante le
système de transport de faible affinité de la proline à la membrane de la bordure en
brosse du tubule proximal [Tanaka A. et al., 2000b].
Une association entre la CHN et les tumeurs des voies urinaires excrétrices a
été rapportée. Tout d’abord, des atypies modérées et une hyperplasie atypique de
l’urothélium ont été décrites sur les pièces de néphrectomie réalisées lors de la
transplantation rénale de patientes CHN [Cosyns J.P. et al., 1994a]. Ensuite, des
cancers des voies urinaires ont été observés : urothéliomes localisés à la vessie
[Cosyns J.P. et al., 1994b], au bassinet [Vanherweghem J.L. et al., 1995] et à
l’uretère [Lord G.M. et al., 2001]. L’analyse systématique des reins et uretères
propres des patientes CHN atteintes d’une insuffisance rénale au stade terminal a
montré la présence de carcinomes urothéliaux du bassinet et/ou de l’uretère [Cosyns
J.P. et al., 1999; Nortier J.L. et al., 2000].
L’exposition aux AA est confirmée par la détection des adduits d’ADN
spécifiques aux AA (dA-AAI, dG-AAI, dA-AAI) dans des échantillons de tissus rénaux
63

des patientes atteintes de néphropathie aux plantes chinoises [Nortier J.L. et al.,
2000; Schmeiser H.H. et al., 1996].
5.2. Données expérimentales chez l’animal
5.2.1. Toxicité aiguë
Les effets de la toxicité aiguë des AA ont été testés chez des rats Wistar et
des souris NMRI des deux sexes. L’administration d’une seule dose d’AA par gavage
(120-300 mg/kg) ou par injection intraveineuse (38-110 mg/kg) induit en quelques
jours une nécrose tubulaire aiguë sévère. L’exposition à des doses élevées produit
une insuffisance rénale aiguë causant la mort des animaux endéans 15 jours.
[Mengs U., 1987]. Des lésions cancéreuses locales de la partie antérieure de
l’estomac sont également observées lors de l’administration par gavage (10 mg
kg/jour) [Mengs U., 1983]. Suite à l’administration par gavage d’une dose d’AA (10-
100 mg/kg) à des rats Wistar femelles, des lésions rénales se développent en 3
jours, l’effet étant dépendant de la dose. D’un point de vue histologique, une nécrose
de l’épithélium tubulaire rénal est observée et principalement localisée dans la pars
recta du tubule proximal. D’un point de vue fonctionnel, une augmentation de la
créatinine plasmatique ainsi que de l’excrétion urinaire de protéines, de glucose, de
NAG, de gamma-glutamyl transférase et de malate déshydrogénase est observée
[Mengs U. et al., 1993].
5.2.2. Toxicité chronique
Les effets de la toxicité chronique ont été étudiés chez des rats Wistar mâles
et femelles traités par gavage : des tumeurs se développent en fonction de la dose et
de la durée du traitement. Après 3 mois d’exposition aux AA (1-10 mg/kg), des
lésions cancéreuses apparaissent dans la partie antérieure de l’estomac. Après 3 à 6
mois sans traitement, des métastases sont observées dans la partie antérieure de
64

l’estomac ; des adénomes et occasionnellement des carcinomes apparaissent dans
le cortex rénal tandis qu’une hyperplasie évoluant vers un papillome ou un carcinome
est présente dans le bassinet ou la vessie [Mengs U. et al., 1982]. L’effet
carcinogène des AA est similaire chez la souris femelle de souche NMRI après un
traitement aux AA (5 mg/kg) pendant 3 semaines [Mengs U., 1988]. L’administration
par voie orale d’AA (25 mg/kg) à des rats Wistar mâles pendant 4 semaines induit
des lésions dégénératives dans les reins, la partie antérieure de l’estomac, la vessie
et les testicules. L’atteinte la plus sévère est localisée dans les tubules corticaux
rénaux sous forme de nécrose tubulaire. Une protéinurie et une glycosurie sont
également observées [Mengs U. et al., 1992]. L’administration orale d’AA (10 mg/kg)
à des rats Wistar mâles et femelles pendant 3 mois (5 jours/semaine) entraîne le
développement de tumeurs mais pas de fibrose au niveau de l’interstitium rénal
après 3 et 11 mois [Cosyns J.P. et al., 1998]. Par contre, lorsque des lapins blancs
New Zealand femelles reçoivent une injection intra-péritonéale d’AA (0,1 mg/kg)
pendant 17 et 21 mois (5 jours/semaine), la fibrose interstitielle rénale se développe
en association avec l’altération de l’épithélium tubulaire proximal. Les premières
lésions s’observent au niveau de la partie droite (S3) des tubules proximaux et
s’étendent aux parties contournées (S1 et S2) des tubules proximaux pour les
atteintes plus sévères. Les animaux traités par les AA présentent une protéinurie
tubulaire, une glycosurie, une anémie, une augmentation de la créatinine sérique, et
une croissance perturbée. De plus, les AA induisent la formation d’adduits d’ADN
spécifiques dans les reins de ces lapins et des tumeurs urothéliales [Cosyns J.P. et
al., 2001].
Finalement, un modèle expérimental de néphropathie induite par les AA a été
développé chez le rat Wistar mâle. L’administration quotidienne d’AA (10 mg/kg de
poids corporel) par injection sous-cutanée pendant 35 jours à des rats en régime
hypo- ou normosodé conduit à une insuffisance rénale, au développement d’une
fibrose interstitielle et d’atrophie tubulaire. Une diminution de l’excrétion urinaire de
leucine aminopeptidase (LAP), une protéinurie, une glycosurie, ainsi qu’une
augmentation de la créatinine sérique s’observent aux jours 10 et 35. Des dysplasies
urothéliales sont également présentes [Debelle F.D. et al., 2002; Debelle F.D. et al.,
2004].
65

CHAPITRE 2 : BUTS DU TRAVAIL
Le but des travaux présentés est d’apporter une contribution à la
compréhension plus approfondie de l’implication des AA dans le développement et la
progression de la néphropathie dite aux plantes chinoises. Sur base des
observations cliniques décrites précédemment, suggérant que le tubule proximal est
la cible des AA, nos travaux ont pour objectif, d’une part, de confirmer l’atteinte de la
cellule tubulaire proximale dans la toxicité aux AA et, d’autre part, d’examiner les
altérations structurelles et fonctionnelles précoces de l’épithélium tubulaire proximal
dans la néphropathie expérimentale aux AA.
Une première approche in vitro a été réalisée afin d’étudier les effets des AA
sur la réabsorption des protéines de faible poids moléculaire, principale fonction
tubulaire proximale, par les cellules OK qui constituent un modèle bien établi du
tubule proximal. Les effets des AA ont été comparés à ceux du CdCl2, un toxique
connu pour altérer les fonctions du tubule proximal.
Une seconde approche in vivo a pour objectif de caractériser de manière
biochimique et histologique les lésions tubulaires proximales induites par les
injections sous-cutanées quotidiennes d’AA en utilisant le modèle de rat de la
néphropathie aux AA. Les altérations structurelles et fonctionnelles précoces du
tubule proximal ont été étudiées (5 jours d’injection) ainsi que leur évolution au cours
du temps (35 jours d’injection).
66

CHAPITRE 3 : METHODOLOGIE
1. Etude in vitro : effets des acides aristolochiques
sur les cellules rénales d’opossum
1.1. Culture des cellules OK
Les cellules rénales d’opossum (OK) ont été fournies par le Dr G. Friedlander
(Université Xavier-Bichat, Paris, France). Les cellules du passage numéro 46 au
numéro 108 sont cultivées dans le milieu Dubbelcco modifié selon Eagle (DMEM)-
F12 contenant 10 % de sérum fœtal de bœuf, 10 U/ml de pénicilline et 10 µg/ml de
streptomycine (Life Technologies, Merelbeke, Belgique). Les cellules sont incubées à
37°C dans de l’air contenant 5 % de CO2. A confluence, les cellules sont détachées
par incubation avec une solution de trypsine-EDTA pendant 10 min et remises en
culture à la dilution 1/5 deux fois par semaine.
1.2. Exposition des cellules OK à différentes substances
1.2.1. Acides aristolochiques
Les cellules OK confluentes sont traitées pendant 24 h avec du DMSO 0,1 %
(contrôle) ou avec des AA à la concentration de 10 ou 20 µmol/l (Sigma, Bornem,
Belgique). Le mélange d’AA utilisé est constitué de AAI (69 %) et AAII (19 %) ; les
AA sont solubilisés dans du DMSO (concentration finale : 0,1%).
Dans une autre série d’expériences, le temps d’exposition aux AA (20 µmol/l) est de
15 min et de 2, 6, 14, 18 heures.
67

Pour les expériences de récupération, après 24 h d’exposition aux AA (20 µmol/l), les
monocouches de cellules OK sont incubées dans le milieu de culture pendant 1, 2, 3
et 6 jours.
Les cellules OK sont également exposées pendant 24 h à un mélange des AA
extraits de la plante (20 µmol/l) ainsi qu’à chacun des dérivés AAI et AAII isolé au
départ de cet extrait (20 µmol/l). Ces 3 substances ont été fournies par le Prof H.
Schmeiser (Division of Molecular Toxicology, Deutsches Krebsforschungszentrum,
German Cancer Research Center, Heidelberg, Allemagne).
1.2.2. Cadmium
Les cellules OK confluentes sont traitées avec du CdCl2 à la concentration de
15 µmol/l (Sigma, Bornem, Belgique) pendant 24 h. Le CdCl2 est solubilisé dans de
l’eau et les contrôles correspondent aux cellules dans le milieu de culture.
Dans une autre série d’expériences, le temps d’exposition au CdCl2 (15 µmol/l) de
est de 15 min et de 2, 6, 14, 18 heures.
Pour les expériences de récupération, après 24 h d’exposition au CdCl2 (15 µmol/l),
les monocouches de cellules OK sont incubées pendant 1, 2, 3 et 6 jours dans le
milieu de culture.
1.2.3. Autres composés contenus dans les gélules amaigrissantes
Les cellules OK confluentes sont traitées avec de la fenfluramine à la
concentration de 20 et 100 µmol/l (préparation obtenue à la pharmacie de l’hôpital
Erasme, Bruxelles, Belgique), du diéthylpropion à la concentration de 20 et 100
µmol/l (préparation obtenue à la pharmacie de l’hôpital Erasme, Bruxelles, Belgique)
et de l’acétazolamide à la concentration de 20 µmol/l (Sigma, Bornem, Belgique).
Ces 3 composés sont solubilisés dans l’eau.
68

1.3. Réabsorption d’albumine et de β2-microglobuline
Les expériences de réabsorption sont réalisées comme décrit précédemment
[Schwegler J.S. et al., 1991]. Les cellules OK sont cultivées dans les plaques à 6
puits et traitées à confluence comme détaillé plus haut. Après 3 rinçages avec la
solution de Ringer (en mmol : NaCl 130, KCl 4, MgCl2.6H2O 1, CaCl2.2H2O 1,
glucose 5, HEPES 10, titrée à pH 7,4 avec du Tris(hydroxyméthyl)-aminométhane),
les cellules OK sont incubées à 37°C pendant 15 min avec différentes concentrations
d’albumine-fluorescéine isothiocyanate (FITC, Molecular Probes, Leiden, Les Pays-
Bas) ou de β2-microglobuline-Cy5 dilués dans la solution de Ringer. L’incubation est
arrêtée par 10 rinçages des monocouches de cellules à 4°C avec la solution de
Ringer froide. Les cellules sont ensuite lysées avec une solution de 10 mmol/l de
MOPS (pH 7,4) contenant 0,1% de Triton X-100. La fluorescence intracellulaire est
mesurée à l’aide d’un spectrofluorimètre à un seul faisceau (Kontron SFM25, AG
Instruments, Zurich, Suisse) à longueur d’onde d’excitation de 492 nm et d’émission
de 520 nm pour l’albumine-FITC ou à 649 et 670 nm pour la β2-microglobuline-Cy5.
La fluorescence de la dernière solution de rinçage (avant la lyse des cellules) est
comparable à celle du bruit de fond. Le contenu en protéines est mesuré par la
réaction de biuret à l’aide du dosage de protéines BCA (Bicinchoninic acid Protein
Assay Reageant kit, Pierce, Polylab, Anvers, Belgique). La quantité d’albumine et de
β2-microglobuline réabsorbée est exprimée en pmol/mg de protéine.
La β2-microglobuline (1mg ; ICN Biomedicals, Asse-Relegem, Belgique) est
marquée avec le colorant cyanine à l’aide du kit de marquage Cy5 (Amersham
Pharmacia Biotech Benelux, Roosendaal, Les Pays-Bas).
1.3.1. Compétition avec d’autres protéines
Les cellules OK ont été exposées pendant la période d’incubation de 15 min
en présence d’albumine-FITC (0,8 µmol/l) et d’autres protéines à la concentration de
1 mg/ml: cytochrome C, lysozyme, aprotinine, hémoglobine, myoglobine, α2-
69

macroglobuline, lactoferrine, transferrine, thyroglobuline, α1 acide glycoprotéine
(Sigma, Bornem, Belgique).
1.4. Tests de cytotoxicité et de viabilité cellulaire
1.4.1. Dosage de lactate déshydrogénase
Les cellules OK sont cultivées dans les plaques à 96 puits et exposées à
confluence aux substances comme détaillé ci-dessus. Le milieu de culture est
remplacé par du milieu de culture frais sans sérum, le maximum de lactate
déshydrogénase (LDH) libéré est obtenu par ajout de Triton (1 %) dans le milieu de
culture sans sérum. Après 6 heures d’incubation, le surnageant de la culture est
récupéré et incubé à température ambiante avec le mélange de « réaction » du
« Cytotoxicity Detection kit » (Roche Diagnostics, Bruxelles, Belgique). Ce mélange
de « réaction » est composé d’un catalyseur (diaphorase/NAD + ) et d’une solution
colorante contenant du chlorure de iodotétrazolium et du lactate de sodium. Les
mesures de LDH sont réalisées à la longueur d’onde de 490 nm (avec 655 nm
comme référence), la quantité de LDH libéré est exprimé en absorbance (A490nm –
A655nm). Toutes les conditions sont effectuées en triple.
1.4.2. Dosage de 3-(4,5-diméthyl-thiazoyl-2-yl)-2,5-diphényltétrazo-
lium bromide (MTT)
Les cellules OK sont cultivées dans les plaques à 96 puits et traitées à
confluence comme décrit ci-dessus. La solution MTT (5 mg/ml ; Sigma, Bornem,
Belgique) est ensuite ajoutée dans les puits et les cellules sont incubées pendant
3h30 à 37°C avec 5 % de CO2. Les cristaux de MTT formazan formés sont
solubilisés avec une solution acidifiée d’isopropanol. Les densités optiques sont
mesurées à la longueur d’onde de 570 nm (avec 655 nm comme référence). La
70

viabilité cellulaire est exprimée en % du contrôle. Toutes les conditions sont réalisées
en triple.
1.5. Observation en microscopie des cellules OK
1.5.1. Microscopie conventionnelle
Les cellules OK sont cultivées sur des lamelles en verre, traitées comme
décrit ci-dessus, et fixées pendant 10 min avec du paraformaldéhyde 4 % en tampon
phosphate 0,1 mol/l de pH 7,4 à température ambiante. Les cellules sont ensuite
colorées à l’hématoxyline-éosine et observées sous un microscope optique DMR
couplé à un système microphotographique MPS60 (Leica, Heerbrugg, Suisse).
1.5.2. Microscopie confocale
Endocytose d’albumine
Pour l’étude fonctionnelle de l’endocytose, les cellules OK sont cultivées sur
des lamelles en verre. Après rinçage avec la solution de Ringer, les monocouches de
cellules OK sont incubées pendant 15 min à 37°C avec la solution de Ringer
contenant l’albumine-FITC (150 µmol/l), et ensuite placées sur glace, rincées à froid
et fixées comme décrit ci-dessus. Les cellules sont alors observées sous un
microscope à fluorescence Zeiss Axiovert couplé à un microscope confocal à
balayage laser (MRC 1000 ; Bio-Rad, Hercules, CA, USA) équipé d’un laser argonkrypton
et d’un logiciel Laser-Sharp (Bio-Rad). Les images sont ensuite analysées à
l’aide du logiciel NIH-image 1.62 (Bethesda, MD, USA).
Colocalisation entre l’endocytose d’albumine et la mégaline
L’étude de colocalisation entre l’endocytose d’albumine et la mégaline est
réalisée sur les cellules OK incubées durant 2, 5 et 15 min avec de l’albumine-FITC
(150 µmol/l) et ensuite fixées. L’immunomarquage avec un anticorps de mouton anti-
71

mégaline (dilution 1/200) [Devuyst O. et al., 1999; Le Panse S. et al., 1995] est
réalisé. Les cellules sont ensuite rincées et incubées avec un anticorps anti-mouton
marqué au TRIC (tétraméthylrhodamine isothiocyanate, Sigma, Bornem, Belgique) à
la dilution 1/200. Après rinçages, les cellules sont observées à l’aide du système
d’imagerie confocale décrit ci-dessus. Les paramètres d’analyse confocale sont
définis afin d’éviter les interférences de signaux entre les 2 canaux de fluorescence.
Toutes les expériences ont été réalisées en double et comparées à celles effectuées
en absence d’anticorps primaire à titre de contrôle.
1.6. Marquage des protéines à la [ 35 S]L-méthionine
Les cellules OK, cultivées dans des boîtes de 60 mm, sont exposées comme
décrit ci-dessus ou incubées pendant 1 h en présence de cycloheximide à la
concentration de 100 µmol/l (Sigma, Bornem, Belgique), un inhibiteur de la synthèse
des protéines. Après rinçage avec du DMEM ne contenant pas de méthionine, les
monocouches de cellules sont exposées pendant 2 h à ~ 20 µCi/ml de [ 35 S]Lméthionine
(NEN Life Science Products, Zaventem, Belgique) en DMEM sans
méthionine. Après rinçage, les cellules sont incubées pendant 1 ou 20 h avec du
DMEM contenant 10 mmol/l de méthionine à 37°C avec 5 % de CO2. Après rinçage à
froid, les cellules sont lysées pendant 20 min sur glace avec une solution de pH 8
composée de 10 mmol/l Tris et 1 mmol/l EDTA. Les cellules sont grattées et les
lysats récupérés. Les protéines de ces lysats sont ensuite précipitées à l’aide d’une
solution d’acide trichloroacétique 10 % pendant 30 min sur glace et centrifugées à
1600 × g à 4°C pendant 20 min. Finalement, les culots resuspendus avec du SDS 1
% (dodécyl sulfate de sodium ; Sigma, Bornem, Belgique) sont mis dans un liquide
de scintillation Ready Protein + pour le comptage des émissions β (1214 Rackbeta
liquid scintillation counter, LKB Wallac, Finlande). La quantité de protéines
synthétisées est exprimée en 10 6 CPM/mg de protéine.
72

1.7. Réabsorption de méthyl-α-D-glucopyranoside (AMG)
Les cellules OK sont cultivées à confluence dans des plaques à 6 puits et
traitées comme décrit précédemment. Après rinçage, les monocouches de cellules
sont incubées avec différentes concentrations de [ 14 C]-AMG (NEN Life Science
Products, Zaventem, Belgique) en solution de Ringer à 37°C pendant 10 min. Ce
temps est dans la phase linéaire de réabsorption. Après rinçages à froid avec la
solution de Ringer, les cellules lysées avec 0,1 mol/l de HNO3 sont mises dans le
liquide de scintillation Ready Protein + pour le comptage des émissions β. La quantité
d’AMG réabsorbée est exprimée en nmol/mg de protéine.
1.8. Détection des adduits d’ADN spécifiques aux acides
aristolochiques
La détection des adduits d’ADN spécifiques aux AA dans les extraits
cellulaires a été réalisée par le Dr. V.M. Arlt dans le laboratoire de la Division de
Toxicologie Moléculaire du Prof. H.H. Schmeiser (Deutsches
Krebsforschungszentrum, German Cancer Research Center, Heidelberg,
Allemagne). Les adduits d’ADN spécifiques aux AA sont détectés par la méthode
d’enrichissement à la nucléase P1 du post-marquage 32 P comme décrit
précédemment [Schmeiser H.H. et al., 1997]. Brièvement, l’ADN des cellules OK est
isolé par la méthode d’extraction au phénol après trypsinisation des cellules OK pour
les différents traitements étudiés. Les échantillons d’ADN (12,5 µg) sont digérés,
enrichis à la nucléase P1 et post-marqués au 32 P. Ensuite, ces échantillons sont
séparés par chromatographie sur des couches minces en polyéthylèneiminecellulose
(Macherey and Nagel, Düren, Allemagne). Les conditions de
chromatographie utilisées sont les suivantes : D1 : 1 mol/l phosphate de sodium, pH
6,8 ; D3 : 3,5 mol/l formate de lithium, 8,5 mol/l urée, pH 4,0 ; D4 : 0,8 mol/l chlorure
de lithium, 0,5 mol/l Tris-HCl, 8,5 mol/l urée, pH 9,0 ; D5 : 1,7 mol/l NaH2PO4, pH 6,0.
L’autoradiographie de ces plaques chromatographiques à l’aide de « Packard Instant
Imager » (Canberra Co., Dowers Grove, IL, USA) permet d’analyser et de quantifier
73

les adduits d’ADN. Les adduits d’ADN spécifiques aux AA sont identifiés comme
décrit précédemment [Bieler C.A. et al., 1997]. La quantification des adduits d’ADN
se base sur le nombre de coups par minute, l’activité spécifique de l’ATP[γ- 32 P] et la
quantité d’ADN utilisée (pmol ADN-P). Le taux d’adduits d’ADN spécifique aux AA
est exprimé en quantité relative d’adduits d’ADN/10 7 nucléotides normaux.
1.9. Analyse de l’expression de la mégaline dans les
extraits cellulaires
Les lysats cellulaires sont préparés au départ de cellules OK confluentes
exposées dans différentes conditions [Devuyst O. et al., 1999]. Après lavages en
PBS (en mmol/l: 68 NaCl, 1,3 KCl, 4 Na2HPO4, 0,7 KH2PO4, titré à pH 7,4 par du
HCl) et un léger grattage, les cellules sont centrifugées à 8000 × g pendant 90
secondes et les culots sont congelés dans de l’azote liquide. Les culots congelés
sont solubilisés dans du tampon de lyse froid contenant des inhibiteurs de protéases
(Complete Mini® ; Roche Diagnostics, Bruxelles, Belgique), brièvement traités aux
ultrasons (Branson Sonifer 250, 2 pulses à 40 % d’intensité), et ensuite centrifugés à
16000 × g pendant 1 min à 4°C. Le surnageant est récolté et mis en présence de 10
% SDS et chauffé à 95°C pendant 90 secondes.
Les extraits cellulaires (30 µg) et l’extrait membranaire de cortex rénal de rat
(30 µg), utilisé comme contrôle positif, sont séparés par des gels de SDSpolyacrylamide
( 5%) et transférés sur membranes de nitrocellulose. Après les
étapes de blocage, les membranes sont incubées toute la nuit à 4°C avec l’anticorps
de mouton anti-mégaline (dilution 1/2500) [Le Panse S. et al., 1995]. Elles sont
ensuite lavées, incubées avec l’anticorps anti-mouton marqué à la peroxidase (Dako,
Prosan, Merelbeke, Belgique) et révélées à l’ECL (enhanced chemioluminescence
kit, Amersham Pharmacia Biotech, Roosendaal, Les Pays-Bas). Avant d’effectuer un
nouveau marquage, les membranes sont rincées, le premier marquage est ensuite
enlevé en incubant les membranes pendant 30 min à 55°C dans une solution de pH
7,4 composée de 62,5 mmol/l de Tris-HCl, 2 % SDS, 100 mmol/l de β-
74

mercaptoéthanol. Après lavage, l’absence de signal est vérifiée par incubation avec
l’ECL en exposant un film pendant 1h. Les membranes sont ensuite incubées avec
l’anticorps monoclonal anti-β-actine (dilution 1/10000, Sigma, Bornem, Belgique),
suivi de l’anticorps anti-souris marqué à la peroxydase (Dako, Prosan, Merelbeke,
Belgique) et finalement exposées à l’ECL. Trois immunomarquages indépendants
pour la détection de la mégaline dans les cellules OK ont été réalisés.
L’analyse densitométrique est effectuée sur un immunoblot représentatif à
l’aide d’un Scanjet Hewlett Packart modèle IVC utilisant un logiciel NIH Image V1.60
(Bethesda, MD, USA). Les densités optiques, données en unités de pixels
arbitraires, pour la mégaline sont normalisées par rapport à la β-actine et exprimées
en pourcentage du signal obtenu pour les cellules OK contrôles. Chaque évaluation
est obtenue en double.
1.10. Analyses statistiques
Tous les résultats représentent la moyenne ± l’erreur standard à la moyenne.
Les comparaisons sont réalisées à l’aide de l’analyse pairée « Student t test ».
75

2. Etude in vivo : effets de l’intoxication aux acides
aristolochiques sur l’épithélium tubulaire proximal
de rat.
2.1. Conditionnement des rats Wistar
Des rats mâles de souche Wistar, provenant de l’Elevage agréé Janvier (Le
Genest Saint-Isle, France) ont été hébergés dans l’animalerie de la Faculté de
Médecine de l’Université Libre de Bruxelles (Belgique) dans des conditions
contrôlées de température, d’humidité et de luminosité. Au cours des protocoles, les
animaux ont un libre accès à l’eau (eau de distribution) et à la nourriture, à savoir un
régime alimentaire complet pour rat contenant un taux normal de sodium (Carfil
Quality, Oud-Turnhout, Belgique). Avant chaque protocole, une semaine
d’acclimatation est laissée aux animaux afin qu’ils puissent s’adapter à leur nouvel
environnement.
Les protocoles ont été approuvés par le Comité d’Ethique et du Bien-être
Animal (Faculté de Médecine, Université Libre de Bruxelles, Belgique).
2.2. Administration des acides aristolochiques aux rats
Le mélange d’AA (Acros Organics Co., Geel, Belgique) utilisé pour les
injections, est composé de 40 % de AAI et 60 % de AAII. Les AA (20 mg/ml) sont
solubilisés avec du polyéthylène glycol (PEG) 400 (Fluka Chemie, Buchs, Suisse) et
dilués dans de l’eau pour injection à la concentration finale de 10 mg/ml. Les rats
traités aux AA reçoivent une injection quotidienne sous-cutanée d’AA à la
concentration de 10 mg/kg de poids corporel tandis que les rats contrôles reçoivent
une injection journalière d’une solution volume/volume de PEG 400 et d’eau pour
76

injection. Les rats sont pesés chaque semaine afin d’ajuster la dose d’AA à
administrer.
2.2.1. Modèle initial de la néphropathie aux acides aristolochiques :
rats traités pendant 35 jours
Septante-deux rats, âgés de 4 semaines, sont répartis au hasard au jour 0 en
deux groupes de poids équivalents. Un premier groupe de 36 rats correspond aux
rats traités aux AA et un deuxième groupe de 36 rats représente les rats contrôles.
Six rats par groupe sont sacrifiés après 3, 7, 10, 14, 18 et 35 jours d’injection.
Une seconde série d’expériences est réalisée sur base du protocole détaillé cidessus
afin de suivre l’évolution au cours du temps des paramètres urinaires
pendant 35 jours. Sept rats, âgés de 4 semaines, sont divisés en deux groupes au
jour 0 : quatre pour le groupe exposé aux AA et trois rats contrôles. Pour chaque rat,
les urines de 24 heures sont récoltées aux jours 0, 3, 5, 7, 10, 13, 15, 18, 22, 24, 27,
31 et 35.
2.2.2. Protocole court : rats traités pendant 5 jours
Soixante rats, âgés de 7 semaines, sont divisés en deux groupes (n = 30) au
jour 0. Les injections sont réalisées chaque jour comme décrit ci-dessus. Six rats du
groupe exposé aux AA et six du groupe contrôle sont euthanasiés après 1, 2, 3, 4 et
5 jours d’injection.
2.2.3. Protocole destiné à des études histologiques particulières
(10 jours)
Trente rats, âgés de 7 semaines, sont divisés en deux groupes (n = 15) au
jour 0. Les injections quotidiennes sont réalisées comme décrit ci-dessus. Trois rats
77

du groupe exposé aux AA et trois du groupe contrôle sont euthanasiés après
respectivement 1, 2, 3, 4, 7 et 10 jours d’injection.
2.3. Prélèvement des urines, du sang et des reins
Urines
Avant le sacrifice, les urines sont collectées (durée approximative : 20 à 24 h)
en plaçant les rats dans des cages à métabolisme pour rongeurs. Les échantillons
d’urine sont, en fonction du dosage ultérieur, centrifugés à 1600 × g pendant 15 min
à 4°C ou dilués dans du glycérol (dilution 1/3) avant d’être conservés à –20°C.
Sang et reins
Aux jours de sacrifice, les rats sont profondément anesthésiés par injection
intra-péritonéale d’une solution composée d’un analgésique, la kétamine (Imalgen,
Leo Pharma Belgium, Wilrijk, Belgique) et d’un sédatif puissant, la xylazine (Rompun,
Bayer, Bruxelles, Belgique). Après ouverture de la cage thoracique, le sang est
récolté par ponction intracardiaque à l’aide d’une seringue contenant du dipotassium-
EDTA et les reins sont prélevés.
Le plasma est centrifugé à 1600 × g pendant 15 min à 4°C et congelé à –20°C
en prévision des dosages ultérieurs.
Après décapsulation, la moitié d’un rein est fixée dans une solution
tamponnée de formaldéhyde 4% pour les analyses histologiques sur coupes en
paraffine. Pour les études sur coupes au cryostat, un demi-rein est fixé dans une
solution tamponnée en phosphate de paraformaldéhyde 4% et ensuite cryoprotégé
par immersions successives dans des solutions de saccharose 10, 20 et 30%, avant
la congélation dans de l’isopentane.
D’autre part, un fragment de cortex rénal est disséqué, congelé dans de l’azote
liquide et conservé à –80°C pour la détection d’adduits d’ADN spécifiques aux AA.
78

2.4. Dosages de la créatinine plasmatique et urinaire
Créatinine plasmatique
La concentration de créatinine plasmatique est mesurée par une méthode de
chromatographie liquide à haute performance (HPLC) adaptée de Xue et al. [Xue
G.P. et al., 1988]. Brièvement, les échantillons de plasma sont d’abord traités avec
de l’acétonitrile afin de les déprotéiner et ensuite analysés par HPLC sur une colonne
échangeuse de cation de haute affinité (colonne Spherisorb 5 µm SCX, 4,0 × 250
mm, Waters, Milford, MA, USA). La phase mobile est composée d’acétonitrile (9 %)
dans une solution 40 mM de phosphate d’ammonium à pH 5,3, utilisée pour l’élution
de la colonne au débit de 1,0 ml/min à température ambiante. L’absorbance de la
créatinine est mesurée à la longueur d’onde de 230 nm. L’identification et la
quantification du pic de créatinine détecté sont réalisées par comparaison avec une
courbe standard de créatinine (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgique). La concentration
de créatinine plasmatique est exprimée en µmol/l.
Créatinine urinaire
La concentration de créatinine urinaire est déterminée par la méthode
pseudocinétique de Jaffé à l’aide du « Creatinine Diagnostic Kit » (Sigma-Aldrich,
Bornem, Belgique). Succinctement, les échantillons d’urine dilués 40 × sont incubés
pendant 4 min 30 sec à 37°C avec une solution volume/volume d’acide picrique 37
mM et de NaOH 0,3 M. La quantité de créatinine est mesurée à la longueur d’onde
de 492 nm, rapportée à une courbe standard de créatinine et exprimée en mmol/l.
2.5. Dosage de l’activité leucine aminopeptidase dans
l’urine
L’excrétion urinaire de leucine aminopeptidase (LAP), enzyme originaire de la
bordure en brosse du tubule proximal, est mesurée par dosage spectrofluorimétrique
d’activité enzymatique. Les échantillons d’urine en glycérol sont portés à la dilution
finale de 30 × et 60 × dans du tampon Tris-HCl 50 mM à pH 7,6 et incubés avec le
79

substrat synthétique leucine-7-amino-4-méthyl-coumarine (Bachem, Bubendorf,
Suisse) à 37°C pendant une heure. La réaction enzymatique est arrêtée en chauffant
les échantillons à 95°C pendant 5 min. L’activité LAP est déduite de la mesure de la
fluorescence du 7-amino-4-méthyl-coumarine (AMC), libéré par la réaction, à la
longueur d’onde d’excitation de 367 nm et d’émission de 440 nm ; elle est exprimée
en nmol d’AMC produit/mmol de créatinine/h.
2.6. Dosage de l’activité endopeptidase neutre dans l’urine
L’excrétion urinaire d’endopeptidase neutre (NEP), enzyme également
localisée à la bordure en brosse du tubule proximal, est mesurée par dosage
spectrofluorimétrique d’activité enzymatique. Les échantillons d’urine en glycérol sont
portés à la dilution finale de 120 × dans du tampon Tris-HCl 50 mM à pH 7,6 et
incubés avec le substrat synthétique succinyl-alanyl-alanyl-phénylalanine-7-amino-4-
méthyl-coumarine (Bachem, Bubendorf, Suisse) à 37°C pendant une heure. La
réaction enzymatique est arrêtée en ajoutant du phosphoramidon [N-(α-
rhamnopyranosyloxyhydroxyphosphinyl)-leucine-tryptophane, Sigma-Aldrich,
Bornem, Belgique]. Les échantillons sont incubés avec un excès d’aminopeptidase
(EC 3.4.11.2, Pierce, Rockford, USA) à 56°C pendant 30 min afin de libérer l’AMC.
Cette réaction est ensuite arrêtée par incubation des échantillons à 95°C pendant 5
min. L’activité NEP correspond à la mesure de la fluorescence de l’AMC libéré par la
réaction, à la longueur d’onde d’excitation de 367 nm et d’émission de 440 nm.
L’activité NEP est rapportée à une courbe standard établie au départ de NEP purifiée
extraite de rein humain [Deschodt-Lanckman M. et al., 1988] et exprimée en
µg/mmol de créatinine.
80

2.7. Dosage de l’activité N-acétyl-β-D-glucosaminidase
dans l’urine
L’excrétion urinaire de N-acétyl-β-D-glucosaminidase (NAG), enzyme
présente dans les lysosomes, est mesurée par un dosage colorimétrique en adaptant
le protocole fourni (Roche Diagnostics Belgium, Bruxelles, Belgique). Brièvement, les
échantillons d’urines sont incubés avec le substrat 3-crésolsulfonphthaléinyl-N-
acétyl-β-D-glucosaminide à 37°C pendant 30 min. Après arrêt de la réaction, le
produit de l’hydrolyse du substrat, le 3-crésolsulfonphtaléine, est détecté à la
longueur d’onde de 540 nm. L’activité NAG est déterminée en rapportant les
mesures de densité optique à une courbe standard de NAG et exprimée en
mUnités/mmol de créatinine.
2.8. Dosage et analyse des protéines urinaires
Dosage des protéines urinaires
Les protéines urinaires sont dosées par la méthode de Bradford [Bradford
M.M., 1976]. Après ajout du réactif de Bradford aux échantillons d’urine dilués 20 ×,
les densités optiques sont mesurées à la longueur d’onde de 620 nm et rapportées à
une courbe standard d’albumine sérique bovine (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgique).
La quantité de protéines urinaires est exprimée en mg/mmol de créatinine.
Electrophorèse des protéines urinaires
Avant de séparer les protéines urinaires par migration sur gel
d’électrophorèse, les protéines sont précipitées avec une solution d’acide
trichloracétique 10 %, centrifugées à 1600 × g pendant 10 min, lavées avec de
l’éthanol 100 % et séchées par évaporation au Speed-Vac. Le culot est resuspendu
dans le tampon de Laemmli 1 × (31,2 mM Tris-HCl, 5 % glycérol, 1 % SDS, 0,5 % β-
mercaptoéthanol, bleu de bromophénol). Après dénaturation à 95°C pendant 2 min,
20 µg d’échantillon de protéines sont séparés par électrophorèse sur gel Tris-HCl
composé d’un gradient de 4 à 20 % (Ready gel Tris-HCl 4-20 %, Bio-Rad
81

Laboratories, Nazareth-Eke, Belgique). Les gels sont colorés avec une solution de
bleu de Coomassie (30 % méthanol, 10 % acide acétique, 60 % H2O, 0,1 % bleu de
Coomassie). Ils sont ensuite incubés avec la solution de décoloration (40 %
méthanol, 10 % acide acétique, 50 % H2O, 0,5 % glycérol) et séchés.
Analyse semi-quantitative
L’analyse semi-quantitative de la proportion d’albumine, de protéines de faible
et de haut poids moléculaires sur ces gels d’électrophorèse est réalisée par la
numérisation des profils de migration (CanoScan N676U, Canon Inc., Tokyo, Japon),
suivie de leur examen par analyseur d’images (Scion Image version b4.0.2, Scion
corporation, MA, USA). La quantité relative d’albumine ainsi que des protéines de
faible et haut poids moléculaires est rapportée aux valeurs des protéines urinaires
totales et exprimée en mg/mmol de créatinine.
2.9. Dosage d’albumine plasmatique et urinaire
L’albumine plasmatique et urinaire est mesurée par une méthode ELISA pour
l’albumine de rat (rat albumin ELISA quantitation kit, Bethyl Laboratories, IMTEC
Diagnostics, Anvers, Belgique). Brièvement, les plaques ELISA sont incubées avec
l’anticorps de capture de lapin anti-albumine de rat purifié par affinité, dilué (1/100)
dans du carbonate de sodium 0,05 M à pH 9,6 (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgique), à
température ambiante pendant 1 heure. Entre chaque nouvelle incubation, les puits
sont abondamment rincés avec la solution de lavage (Tris 50 mM, NaCl 138 mM, KCl
2,7 mM, Tween 0,05 %, pH 8,0). Puis, la solution de blocage (Tris 50 mM, NaCl 138
mM, KCl 2,7 mM, BSA 1 %, pH 8,0) est ajoutée pendant 30 min à température
ambiante. Ensuite, les échantillons de plasma et d’urine, respectivement aux
dilutions × 2 10 6 et × 10 3 , sont incubés à température ambiante pendant 1 heure.
Ensuite, l’anticorps de détection de lapin anti-albumine de rat conjugué à l’HRP
(HorseRadish Peroxidase) à la dilution 1/50000 est incubé pendant 1 heure à
température ambiante et est révélé à l’aide du substrat enzymatique 3,3’,5,5’
tétraméthylbenzidine (TMB) qui réagit avec la peroxydase. Enfin, la réaction est
arrêtée avec de l’acide sulfurique 1 N et le produit final de couleur jaune est mesuré
82

à la longueur d’onde de 450 nm. Les valeurs obtenues sont rapportées à une courbe
standard d’albumine de rat et exprimées en mg/mmol de créatinine.
Le rapport albuminurie/protéinurie totale, exprimé en %, est égal au rapport de
la concentration d’albumine urinaire sur la concentration de protéines urinaires
totales
2.10. Dosage d’alpha-glutathion-S-transférase urinaire
L’excrétion urinaire d’alpha-glutathion-S-transférase (α-GST), localisée au
niveau des tubules proximaux et distaux, est mesurée par un dosage immunoenzymatique
selon le protocole fourni (Biotrin, Herman Diagnostics, Wemmel,
Belgique). Brièvement, les échantillons d’urines dilués 5 × sont incubés pendant 1 h
à température ambiante dans une plaque coatée avec des IgG dirigés contre l’α-GST
de rat. Après rinçages, l’anticorps conjugué, anti-rat α-GST IgG conjugué à l’HRP,
est ajouté pendant 1 h à température ambiante. Ensuite, le substrat enzymatique
TMB réagit avec la peroxydase pendant 15 min pour révéler le signal. Cette réaction
est arrêtée à l’aide d’une solution d’acide sulfurique 1N. La densité optique du produit
final de couleur jaune est mesurée à la longueur d’onde de 450 nm. Les valeurs
obtenues sont calculées par rapport à une courbe standard d’α-GST de rat et
exprimées en µg/mmol de créatinine.
2.11. Dosages de sodium, potassium et glucose urinaire et
plasmatique
Les dosages de sodium, potassium et glucose dans les urines et le plasma
ont été réalisés au Laboratoire de Chimie en collaboration avec le Dr. B. Gulbis
(Hôpital Erasme, Bruxelles, Belgique). Les dosages de sodium et de potassium sont
basés sur la mesure de la différence de potentiel entre une électrode de référence et
une électrode ion-sélective au sodium ou au potassium. Le dosage du glucose
83

epose sur une méthode enzymatique. Toutes ces analyses sont effectuées sur un
analyseur automatique Cobas Mira (Roche Diagnostics Division, Bruxelles,
Belgique).
La fraction d’excrétion du sodium, du potassium et du glucose est exprimée en
%. Par exemple pour le glucose, elle est calculée par l’équation suivante :
(concentration de glucose urinaire × concentration de créatinine plasmatique) /
(concentration de glucose plasmatique × concentration de créatinine urinaire).
2.12. Histologie rénale conventionnelle
Les tissus fixés de rein sont enrobés de paraffine et coupés à une épaisseur
de 5 µm. Pour analyser les lésions en microscopie optique, les coupes ont été
colorées à l’hématoxyline-éosine et au trichrome de Goldner.
Hématoxyline-éosine
Pour la coloration hématoxyline-éosine, les coupes sont d’abord déparaffinées
dans des bains de toluène 100 % et réhydratées par passages successifs dans des
bains d’isopropanol allant de 100 à 70 %. Ensuite, les coupes de tissus sont
incubées pendant 4 min dans l’hématoxyline de Mayer (Merck KGaA, VWR
International, Leuven, Belgique), rincées et différenciées dans l’alcool chlorhydrique
(isopropanol 70%, acide chlorhydrique 35%) pendant 10 secondes. Après rinçages,
les coupes sont incubées dans l’éosine 1 % pendant 1 min et rincées. Avant d’être
montées au DPX, les coupes sont déshydratées dans des bains d’isopropanol allant
de 70 à 100 %, suivi de toluène 100 %.
Trichrome de Goldner
La coloration au trichrome de Goldner a été réalisée dans le Département
d’Anatomie Pathologique du Prof. I. Salmon (Hôpital Erasme, Bruxelles, Belgique).
Brièvement, les coupes sont déparaffinées et incubées avec l’hématoxyline de Groat
pendant 5 min. Après rinçage, les coupes sont incubées avec du Ponceau fuschine
acide pendant 5 min. Ensuite, les coupes sont rincées dans de l’eau acétéifiée (acide
84

acétique 1%), incubées avec de l’orange G pendant 5 min, rincées, incubées avec
du vert lumière pendant 5 min, rincées. Les coupes sont déshydratées et montées.
Semi-quantification des lésions tubulo-interstitielles
L’évaluation semi-quantitative des lésions tubulo-interstitielles représentatives du
cortex rénal a été réalisée sur base des scores établis précédemment [Debelle F.D.
et al., 2002] et détaillés ci-dessous:
Scores semi-quantitatifs des lésions morphologiques du cortex rénal
Score Nécrose tubulaire Atrophie tubulaire Fibrose interstitielle
0 Absente Absente Absente
1
Quelques tubules
isolés
Quelques tubules
isolés
2 Plusieurs foyers Plusieurs foyers
Faible avec un léger
épaississement de la
membrane basale
tubulaire
Modérée avec un
agrandissement focal de
l’interstitium
3 Massive Massive Sévère avec de zones
de fibrose confluentes
L’établissement du score de ces lésions a été effectué au grossissement de 200 ×
par trois observateurs indépendants (F. Debelle, A. Pozdzik et C. Lebeau).
Acide periodique de Schiff (PAS)
Pour étudier l’intégrité de la bordure en brosse, les coupes en paraffine de
tissu rénal ont été colorées à l’acide periodique de Schiff (PAS). Brièvement, les
coupes de tissu sont déparaffinées, réhydratées et incubées avec l’acide periodique
1% pendant 10 min à température ambiante. Ensuite, ces coupes sont rincées et
incubées dans le réactif de Schiff pendant 15 min à température ambiante. Après
lavages, les coupes sont contre-colorées à l’hématoxyline de Mayer : incubation de 4
min dans l’hématoxyline de Mayer, lavages, différenciation 10 secondes dans l’alcool
chlorhydrique, rinçages. Finalement, les coupes sont déshydratées dans
l’isopropanol passant successivement de 70, 90 à 100 % suivi du toluène 100 % et
85

ensuite montées à l’aide de la solution de montage DPX (Fluka, Sigma-Aldrich,
Bornem, Belgique).
2.13. Immunomarquage de l’endopeptidase neutre
L’immunomarquage de l’endopeptidase neutre (NEP), localisée à la bordure
en brosse, est réalisé sur des coupes en paraffine de tissu rénal. Ces coupes sont
déparaffinées et réhydratées avant d’être incubées dans du méthanol contenant 0,3
% d’H2O2 pendant 30 min afin d’inhiber l’activité peroxydase endogène. Les coupes
sont ensuite rincées dans une solution tamponnée saline de Tris (TBS : NaCl 154
mM, Tris 10 mM, pH 7,6), comme entre chaque incubation détaillée ci-dessous. Pour
bloquer les sites aspécifiques, les coupes sont incubées avec du sérum normal de
chèvre (Vectastain Elite®ABC kit Rabbit IgG, Vector Laboratories, Labconsult,
Bruxelles, Belgique) pendant 20 min, suivi d’une solution d’avidine D pendant 15 min
et d’une solution de biotine pendant 15 min (Avidin/Biotin blocking kit, Vector
Laboratories, Labconsult, Bruxelles, Belgique). Ensuite, les coupes sont incubées
avec l’anticorps primaire polyclonal de lapin anti-endopeptidase neutre (Chemicon
International, Biognost, Heule, Belgique), dilué à 1/2000 en sérum normal de chèvre,
à température ambiante pendant toute la nuit. L’anticorps secondaire biotinylé de
chèvre anti-IgG de lapin est alors ajouté pendant 30 min. Après 30 min d’incubation
avec le complexe avidine et peroxidase « horseradish » biotinylé, le marquage est
révélé par 2 min d’incubation avec la solution de 3, 3’-dianimobenzidine (DAB
substrate kit for peroxidase, Vector Laboratories, Labconsult, Bruxelles, Belgique).
Finalement, les coupes sont contre-colorées à l’hématoxyline de Mayer,
déshydratées et montées à l’aide de la solution de montage DPX.
Analyse semi-quantitative
La semi-quantification de l’immunomarquage NEP est établie sur base du
nombre de tubules proximaux positifs pour la NEP par champ au grossissement de
200 ×. Un champ correspond à une population moyenne d’approximativement 85
tubules proximaux. Dix champs sont examinés par coupe rénale ; le nombre de
tubules proximaux positifs pour la NEP et le nombre total de tubules proximaux sont
86

comptés par champ. La moyenne du nombre total de tubules et la moyenne du
nombre de tubules NEP positifs sont calculées pour ces dix champs et permettent
d’exprimer la quantité de tubules proximaux NEP positifs en % de tubules proximaux
totaux pour un rat. La valeur finale pour chaque temps est égale au nombre moyen
de tubules NEP positifs obtenu pour les 6 rats. Ce comptage est réalisé par deux
observatrices indépendantes (A. Pozdzik et C. Lebeau).
2.14. Immunomarquages de la mégaline et de la cubiline
L’immunomarquage de la mégaline et de la cubiline, deux récepteurs localisés
à la bordure en brosse et intervenant dans le processus d’endocytose, est réalisé sur
des cryosections de tissu rénal de 8 µm. Après incubation des coupes dans le
tampon TBS, l’activité peroxidase endogène est inhibée en incubant les coupes de
rein dans une solution de méthanol contenant 0,3% de H2O2 pendant 30 min. Entre
chaque traitement, les coupes sont rincées avec le tampon TBS. Pour bloquer les
sites aspécifiques, les coupes de tissu sont incubées pendant 20 min avec du sérum
normal de cheval ou de chèvre (Vectastain Elite®ABC kit Mouse or Rabbit IgG,
Vector Laboratories, Labconsult, Bruxelles, Belgique), respectivement pour la
mégaline ou la cubiline ; puis, avec une solution d’avidine D pendant 15 min suivie
d’une solution de biotine pendant 15 min. Les coupes de tissu sont ensuite incubées
pendant toute la nuit à température ambiante avec l’anticorps primaire monoclonal
de souris anti-mégaline ou polyclonal de lapin anti-cubiline, dilué respectivement
1/1000 ou 1/2000 en sérum normal correspondant. Les deux anticorps ont été
obtenus auprès du Dr V. Marshansky (Program in Membrane Biology and Renal
Unit, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston, USA). Les
coupes sont ensuite traitées pendant 30 min avec l’anticorps secondaire biotinylé de
cheval anti-IgG de souris ou de chèvre anti-IgG de lapin. Après 30 min d’incubation
avec le complexe avidine et peroxidase « horseradish » biotinylé, le marquage est
révélé par 2 min d’incubation avec la solution de DAB. Finalement, les coupes sont
contre-colorées à l’hématoxyline de Mayer, déshydratées et montées à l’aide de la
solution de montage DPX.
87

2.15. Microscopie électronique (étude préliminaire)
Pour la microscopie électronique, les échantillons de cortex rénal (maximum 1
mm 3 ) sont prélevés et immédiatement fixés pendant 90 min à température ambiante
avec une solution glutaraldéhyde 4% en tampon Millonig 0,1M, pH 7,4. Après lavage
avec du tampon Millonig contenant 0,5% de glucose, les échantillons sont post-fixés
avec du tétroxide d’osmium 2% pendant 30 min, déshydratés par passages
successifs dans de l’éthanol 25, 50, 70, 90, 100% et enrobés dans de la résine
LX112. Les coupes semi-fines et ultra-fines sont réalisées à l’aide de
l’ultramicrotome LKB (LKB Instruments, Rockville, Md., USA). Les coupes semi-fines
sont colorées au bleu de toluidine et observées au microscope afin de vérifier la
qualité du tissu et de définir la zone d’intérêt. Les coupes ultra-fines sont colorées
avec de l’acétate d’uranyle et du citrate de plomb et examinées au microscope
électronique EM 109 Zeiss (Zeiss, Allemagne).
2.16. Détection des adduits d’ADN spécifiques aux acides
aristolochiques dans le cortex rénal de rat
La détection des adduits d’ADN spécifiques aux AA dans le tissu rénal a été
réalisée par le Dr. V.M. Arlt du Laboratoire de Carcinogénèse Moléculaire du Prof.
D.H. Phillips (Institute of Cancer Research, Sutton, Surrey, Royaume-Uni). La
méthode pour détecter les adduits d’ADN spécifiques aux AA est identique à celle
utilisée pour les cellules OK (voir le chapitre méthodologie § 1.8, pages 73-74).
Brièvement, l’ADN des échantillons de tissu de cortex rénal est isolé par une
méthode standard d’extraction au phénol. La préparation enzymatique des adduits
d’ADN est réalisée comme détaillé précédemment [Arlt V.M. et al., 2001]. Les
conditions de chromatographie utilisées sont : les solvants D1, D3 et D4 (détails voir
le chapitre méthodologie § 1.8, pages 73-74). Les résultats sont exprimés en adduits
d’ADN par 10 8 nucléotides.
88

2.17. Analyses statistiques
Tous les résultats représentent la moyenne ± l’erreur standard à la moyenne
(SEM). A chaque temps, les comparaisons entre les rats contrôles et les rats
exposés aux AA sont réalisées par le test non paramétrique de Mann-Whitney. Les
corrélations entre les paramètres structurels et fonctionnels d’atteinte tubulaire sont
évaluées par le test non paramétrique de Spearman. Les valeurs sont considérées
comme statistiquement significatives à partir de P < 0,05.
89

CHAPITRE 4 : RESULTATS
1. Etude in vitro : effets des acides aristolochiques
sur la lignée cellulaire de rein d’opossum
Les cellules de rein d’opossum (« opossum kidney », OK) constituent un
modèle bien établi pour étudier les différents processus de transport ayant lieu dans
le tubule proximal. En effet, ces cellules OK possèdent de nombreuses propriétés
morphologiques et fonctionnelles communes avec l’épithélium tubulaire proximal. En
particulier, elles ont la capacité de réabsorber des protéines par endocytose médiée
par récepteur ; ce processus nécessite les récepteurs mégaline et cubiline exprimés
à la surface des cellules OK [Schwegler J.S. et al., 1991; Zhai X.Y. et al., 2000]
1.1. Endocytose de protéines médiée par récepteur
1.1.1. Albumine
L’albumine est une protéine totalement réabsorbée par le tubule proximal. Afin
de suivre sa réabsorption par les cellules OK, de l’albumine marquée à la
fluorescéine isothiocyanate (FITC) est utilisée. Les cellules OK sont incubées
pendant 15 min avec des concentrations différentes d’albumine-FITC : 0,080 ;
0,150 ; 0,380 ; 0,760 ; 1,50 et 3,80 µmol/l ; à 37°C, elles réabsorbent l’albumine-FITC
selon la cinétique de Michaelis-Menten caractéristique de l’endocytose médiée par
récepteur, comme décrit précédemment [Schwegler J.S. et al., 1991]. La faible
quantité d’albumine-FITC mesurée à 4°C reflète probablement l’albumine qui adhère
aux cellules malgré les lavages (Fig. 1.1A).
90

Réabsorption d’albumine-FITC
d’albumine-FITC
A
(pmol/mg protéine)
30
25
20
15
10
5
37°C
4°C
0
0 1 2 3 4 5
[Albumine-FITC] (µmol/l)
Réabsorption de β β2-microglobuline-Cy5 2-microglobuline-Cy5
Figure 1.1. Réabsorption d’albumine-FITC (A) et β2-microglobuline-Cy5 (B) par les cellules
OK. Les cellules sont incubées pendant 15 min avec des concentrations croissantes du
substrat à respectivement 37°C (triangle, n = 3) ou 4°C (cercle, n = 3).
Réabsorption d’albumine-FITC
(% du contrôle)
120
100
80
60
40
20
0
Contrôle
*
Cytochrome C
Lysozyme Lysozyme
*
Aprotinine Aprotinine
*
Hémoglobine
Hémoglobine
Figure 1.2. Réabsorption d’albumine-FITC par les cellules OK en compétition avec
différentes protéines. Les cellules sont incubées pendant 15 min avec albumine-FITC (0,8
µmol/l) et différentes protéines (1mg/ml). Chaque colonne représente la différence entre les
valeurs obtenues à 37°C et 4°C (n = 3). La signification statistique correspond à * P < 0,01
par comparaison aux valeurs contrôles.
(pmol/mg protéine)
Myoglobine
Myoglobine
B
*
30
25
20
15
10
5
0
0 1 2 3 4 5
*
ββ 2 2-microglobuline -microglobuline
*
α 2 2-macroglobuline -macroglobuline
[β 2 -microglobuline-Cy5] (µmol/l)
*
Lactoferrine
Lactoferrine
*
Transferrine
Transferrine
*
*
α 1 ac glycoprotéine
glycoprotéine
Thyroglobuline
Thyroglobuline
91

1.1.2. Autres protéines
En vue de vérifier la spécificité de la réabsorption d’albumine, une compétition
avec plusieurs autres protéines de nature différente est réalisée. La figure 1.2 montre
que la réabsorption d’albumine-FITC est significativement inhibée lorsque les cellules
sont incubées en présence du cytochrome C, d’aprotinine, d’hémoglobine, de
myoglobine, de β2-microglobuline, d’α2-macroglobuline, de lactoferrine, de
transferrine, d’α1-glycoprotéine acide et de thyroglobuline ; seul le lysozyme ne
modifie pas la réabsorption d’albumine. Ces résultats indiquent que toute une série
d’autres protéines entrent en compétition avec l’endocytose d’albumine pour le
même site de réabsorption.
1.1.3. β2-microglobuline
Parmi les protéines testées, la β2-microglobuline, une protéine de faible poids
moléculaire, est choisie pour confirmer la cinétique de réabsorption. La β2-
microglobuline est couplée à un marqueur cyanine Cy5 (voir chapitre méthodologie §
1.3, page 69). Les cellules OK sont incubées pendant 15 min en présence de
différentes concentrations de β2-microglobuline-Cy5 : 0,085 ; 0,210 ; 0,425 ; 0,850 ;
2,10 et 4,25 µmol/l. Comme pour l’albumine-FITC, la β2-microglobuline-Cy5 est
réabsorbée suivant la cinétique de Michaelis-Menten à 37°C reflétant l’endocytose
médiée par récepteur (Fig. 1.1B).
1.1.4. Compétition entre albumine et β2-microglobuline
Afin de vérifier si l’albumine et la β2-microglobuline se fixent sur le même
récepteur, la compétition entre ces deux protéines est étudiée. Lorsque les
monocouches de cellules OK sont incubées pendant 15 min avec 0,8 µmol/l
d’albumine-FITC en présence d’un excès de 100 × de β2-microglobuline, la
réabsorption d’albumine-FITC est significativement inhibée d’environ 60 % (Fig.
92

1.3A). De même, lorsque les cellules OK sont incubées pendant 15 min avec 0,8
µmol/l de β2-microglobuline-Cy5 en présence d’un excès de 100 × d’albumine, la
réabsorption de β2-microglobuline-Cy5 est également réduite d’environ 60 % (Fig.
1.3B). Ces observations suggèrent que ces deux protéines sont en compétition pour
le même récepteur membranaire dans les cellules OK.
Réabsorption d’albumine-FITC
A B
(pmol/mg protéine)
12
10
8
6
4
2
0
Contrôle Contrôle Contrôle ββ β22 2-microglobuline -microglobuline
-microglobuline
Figure 1.3. Compétition entre l’albumine et la β2-microglobuline pour l’endocytose médiée
par récepteur dans les cellules OK. A : Inhibition de la réabsorption d’albumine-FITC (0,8
µmol/l) par un excès de 100 × de β2-microglobuline. B : Inhibition de la réabsorption de β2microglobuline-Cy5
(0,8 µmol/l) par un excès de 100 × d’albumine. Chaque colonne
représente la différence entre les valeurs obtenues à 37°C et 4°C (n = 3). La signification
statistique correspond à * P < 0,05 par comparaison aux valeurs contrôles.
1.2. Inhibition de la réabsorption d’albumine et de β2-
microglobuline
Selon les données présentées ci-dessus, la fonction tubulaire proximale de
réabsorption des protéines peut être étudiée en observant les modifications du
processus d’endocytose d’albumine et de β2-microglobuline par les cellules OK. La
néphrotoxicité potentielle des acides aristolochiques (AA) est examinée dans ce
modèle cellulaire et comparée au chlorure de cadmium (CdCl2), une néphrotoxine
bien connue pour altérer cette fonction tubulaire proximale.
*
Réabsorption de β 2 -microglobuline-Cy5
(pmol/mg protéine)
12
10
8
6
4
2
0
*
Contrôle Contrôle Contrôle Albumine Albumine Albumine
93

1.2.1. Effets des acides aristolochiques
Les monocouches de cellules OK sont exposées pendant 24 h au DMSO
0,1% (contrôle), aux AA 10 ou 20 µmol/l, ou aux AA 20 µmol/l suivi de 24 h de
récupération dans le milieu de culture. La réabsorption d’albumine-FITC est ensuite
évaluée en fonction de différentes concentrations du substrat. Comme le montre la
figure 1.4A, l’endocytose d’albumine par les cellules OK est nettement réduite après
24 h de traitement par 10 ou 20 µmol/l d’AA. De plus, après 24 h d’exposition aux AA
20 µmol/l suivie de 24 h de récupération dans le milieu de culture, la réabsorption
d’albumine reste inhibée.
De même, la réabsorption de β2-microglobuline est fortement diminuée après 24 h
d’incubation avec les AA 10 ou 20 µmol/l et cette inhibition persiste lorsque les
cellules OK sont exposées pendant 24 h aux AA 20 µmol/l suivis de 24 h de
récupération dans le milieu de culture (Fig. 1.4B).
L’analyse des paramètres cinétiques de Michaelis-Menten des courbes de
réabsorption montre une diminution significative des valeurs de la vitesse maximale
Vmax ; cette réduction dépend de la dose de AA utilisée (Tableau 1.1). La valeur de
l’affinité apparente Km est inchangée par le traitement aux AA à la concentration de
10 µmol/l, mais elle est augmentée lorsque la concentration des AA atteint 20 µmol/l.
Réabsorption d’albumine-FITC
A
(pmol/mg protéine)
25
20
15
10
5
Contrôle (DMSO 0,1%)
AA 10 µmol/l
AA 20 µmol/l
AA 20 µmol/l (récupération)
0
0
0 1 2 3 4 5
0 1 2 3 4 5
[Albumine-FITC] (µmol/l)
[β 2 -microglobuline-Cy5] (µmol/l)
Figure 1.4. Effets des acides aristolochiques (AA) sur la réabsorption d’albumine-FITC (A) et
de la β2-microglobuline-Cy5 (B) par les cellules OK. Les cellules sont exposées pendant 24 h
au DMSO 0,1% (contrôle), aux AA 10 µmol/l ou aux AA 20 µmol/l d’AA suivi ou non d’une
récupération en milieu de culture pendant 24 h. Chaque point correspond à la différence
entre les valeurs observées à 37°C et 4°C (n = 3).
Réabsorption de ββ 2-microglobuline-Cy5
2-microglobuline-Cy5
2-microglobuline-Cy5
(pmol/mg protéine) protéine) protéine)
B
25
20
15
10
5
94

Tableau 1.1. Paramètres cinétiques de Michaelis-Menten de l’endocytose
d’albumine-FITC et β2-microglobuline-Cy5 par les cellules OK
Albumine-FITC β2-microglobuline-Cy5
pmol/l pmol/mg protéine pmol/l pmol/mg protéine
Km Vmax Km Vmax
Contrôle 477 ± 88 15,2 ± 2,1 844 ± 129 19,8 ± 3,3
CdCl2 15 µmol/l - 24h 376 ± 38 11,9 ± 1,5 * 878 ± 194 9,1 ± 1,5 *
DMSO 0,1% - 24h 360 ± 12 14,1 ± 2,8 533 ± 76 21,6 ± 4,5
AA 10 µmol/l - 24h 394 ± 40 11,7 ± 2,7 * 394 ± 98 8,2 ± 3,1 *
AA 20 µmol/l - 24h 456 ± 30 * 7,2 ± 2,3 * 431 ± 51 5,8 ± 1,4 *
AA 20 µmol/l – récupération n.d. § 1,6 ± 1,1 * n.d. § 2,9 ± 1,6 *
Les valeurs de l’affinité apparente (Km) et de la vitesse maximale (Vmax) sont calculées par
l’équation linéarisée d’Eadie-Hofstee (n = 3). La signification statistique correspond à * P <
0,05 par comparaison aux valeurs des contrôles pairés.
§ n.d. non détectable, ces valeurs n’ont pas pu être déterminées en raison des faibles
valeurs du plateau (Vmax).
Pour déterminer l’évolution au cours du temps de l’inhibition de la réabsorption
d’albumine suite à l’exposition des cellules OK aux AA, des monocouches de cellules
sont traitées avec les AA 20 µmol/l pendant différents temps à savoir 15 min, 2, 6,
14, 18 et 24 heures. La réabsorption d’albumine, mesurée après 15 min d’incubation
avec 0.8 µmol/l d’albumine-FITC, est progressivement inhibée. La signification
statistique est atteinte et maintenue à partir de 14 h d’exposition aux AA (Fig.1.5).
160
140
120
100
80
60
40
20
* *
*
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Temps d’exposition aux AA (heures)
Figure 1.5. Evolution au cours du temps de l’inhibition par les AA de la réabsorption
d’albumine-FITC dans les cellules OK. Les cellules sont exposées au DMSO 0,1% (contrôle)
ou aux AA 20 µmol/l pendant 15 min, 2, 6, 14, 18 et 24 h. Chaque point représente la
différence entre les valeurs observées à 37°C et 4°C (n = 3). La signification statistique
correspond à * P < 0,05 par comparaison aux valeurs contrôles.
Réabsorption d’albumine-FITC
(% du contrôle)
95

Les AA utilisés dans les expériences précédentes sont composés d’un
mélange de deux dérivés nitrophénantrènes AAI et AAII. Afin de déterminer si la
nature des AA influence l’effet inhibiteur, les cellules OK sont exposées à l’extrait de
plante Aristolochia sp. ainsi qu’à l’AAI et l’AAII isolés de l’extrait de plante. La
réabsorption d’albumine-FITC est significativement réduite dans les mêmes
proportions lorsque les cellules OK exposées à l’AAI, l’extrait d’Aristolochia sp. et au
mélange de AA commercialisé par Sigma (20 µmol/l, Fig. 1.6). Par contre,
l’endocytose d’albumine est comparable à celle du contrôle pour les cellules
exposées à l’AAII.
Dans la suite de ce travail, toutes les études présentées sont réalisées en présence
du mélange d’AA commercialisé par Sigma.
Réabsorption d’albumine-FITC
(pmol/mg protéine)
Figure 1.6. Effet de la nature des acides aristolochiques (AA) sur la réabsorption d’albumine-
FITC par les cellules OK. Les cellules sont exposées à 0,1% DMSO (contrôle) ou à 20 µmol/l
d’AAI, d’AAII, d’extrait d’Aristolochia sp. ou d’AA (Sigma) pendant 24 h. Chaque point
correspond à la différence entre les valeurs observées à 37°C et 4°C (n = 3). La signification
statistique correspond à * P < 0,05 par comparaison aux valeurs contrôles.
En résumé, l’exposition des cellules OK aux AA (principalement l’AAI) inhibe
l’endocytose d’albumine et de la β2-microglobuline de façon dose-dépendante et de
manière irréversible.
10
8
6
4
2
0
*
*
DMSO AAI AAII AA
Aristolochia sp.
*
AA
96

Réabsorption d’albumine-FITC
1.2.2. Effets du cadmium
A titre de comparaison, des expériences similaires sont réalisées en parallèle
avec du CdCl2. La réabsorption d’albumine et de β2-microglobuline est également
nettement réduite après exposition des cellules OK pendant 24 h au CdCl2 15 µmol/l
(Fig. 1.7). L’intensité de l’inhibition est comparable à celle observée pour les AA.
L’analyse des paramètres cinétiques montre également une diminution
significative des valeurs de Vmax sans modification des valeurs du Km (Tableau 1.1)
comme décrit pour les AA.
A
(pmol/mg protéine)
25
20
15
10
5
Contrôle
CdCl 2 15 µmol/l
0
0 1 2 3 4 5
[Albumine-FITC] (µmol/l)
Figure 1.7. Effet du chlorure de cadmium (CdCl2) sur la réabsorption d’albumine-FITC (A) et
de la β2-microglobuline-Cy5 (B) par les cellules OK. Les cellules sont exposées avec 15
µmol/l de CdCl2 (cercle) ou sans (triangle) pendant 24 h. Chaque point correspond à la
différence entre les valeurs observées à 37°C et 4°C (n = 3).
Contrairement aux AA, l’effet inhibiteur induit par le CdCl2 est déjà présent
après 15 min d’exposition, devient significatif après 2 heures et n’est pas modifié au
cours de la période d’exposition au CdCl2 (Fig. 1.8).
Réabsorption de β β2-microglobuline-Cy5 2-microglobuline-Cy5
25
20
15
10
5
B
(pmol/mg protéine)
0
0 1 2 3 4 5
[β 2 -microglobuline-Cy5] (µmol/l)
97

Réabsorption d’albumine-FITC
(% du contrôle)
Figure 1.8. Evolution au cours du temps de l’inhibition par le CdCl2 de la réabsorption
d’albumine-FITC par les cellules OK. Les cellules sont exposées à 15 µmol/l de CdCl2
pendant 15 min, 2, 6, 14, 18 et 24 h. Chaque point représente la différence entre les valeurs
observées à 37°C et 4°C (n = 3). La signification statistique correspond à * P < 0,05 par
comparaison aux valeurs contrôles.
1.2.3. Observation de l’inhibition en microscopie confocale
L’observation en microscopie confocale montre que les cellules OK contrôles
et celles exposées au DMSO 0,1% présentent, après 15 min d’incubation avec
l’albumine-FITC 150 µmol/l, des granules fluorescents verts à l’intérieur des cellules
(Fig. 1.9). Par contre, les cellules exposées aux AA 20 µmol/l ou au CdCl2 15 µmol/l
ne présentent quasi aucune fluorescence, signe qu’elles n’ont quasi pas réabsorbé
d’albumine-FITC.
Contrôle
DMSO
160
140
120
100
80
60
40
20
*
* * * *
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Temps d’exposition au CdCl 2 (heures)
CdCl 2
Figure 1.9. Observation en microscopie confocale de la réabsorption d’albumine-FITC (150
µmol/l, 15 min d’exposition) par les monocouches de cellules OK. Les cellules OK sont
incubées pendant 24 h soit avec le milieu de culture ou du DMSO 0,1% (contrôles), soit avec
du CdCl2 15 µmol/l ou des AA 20 µmol/l. Grossissement 350 ×.
AA
98

1.2.4. Réversibilité de l’inhibition
Etant donné l’effet inhibiteur persistant des AA sur l’endocytose de protéines
après 24 h de récupération (Fig. 1.4), la période de récupération dans le milieu de
culture est prolongée jusqu’à 6 jours. Lorsque les cellules OK sont incubées en
présence des AA 20 µmol/l pendant 24 h et que l’incubation est suivie d’une période
de récupération de 1, 2, 3 ou 6 jours, l’inhibition de la réabsorption d’albumine
s’intensifie progressivement et persiste jusqu’au 6 ème jour (Fig. 1.10). Par contre, en
cas d’exposition au CdCl2 15 µmol/l, la réabsorption d’albumine est inhibée après 24
h mais retourne progressivement vers des valeurs normales pendant la période de
récupération (Fig. 1.10).
Réabsorption d’albumine-FITC
(% du contrôle)
120
100
80
60
40
20
0
* *
Contrôle 0 1 2 3 6
Temps de récupération après 24 h d’exposition (jours)
Figure 1.10. Etude comparative de la réversibilité de l’inhibition de la réabsorption
d’albumine-FITC par les AA (colonne noire) et le CdCl2 (colonne grise). Les monocouches de
cellules OK sont incubées avec du DMSO 0,1%, des AA 20 µmol/l ou du CdCl2 15 µmol/l
pendant 24 h suivi de 0, 1, 2, 3 et 6 jours de récupération dans le milieu de culture. La
réabsorption d’albumine-FITC (0,8 µmol/l) est réalisée pendant 15 min après chaque temps
de récupération. Chaque point représente la différence entre les valeurs observées à 37°C et
4°C (n = 3). Les significations statistiques correspondent à * P < 0,05 par comparaison aux
valeurs des contrôles; § P < 0,05 par comparaison aux valeurs des contrôles et du jour 0; #
P < 0,05 par comparaison aux valeurs des contrôles et des jours 0 et 1; £ P < 0,05 par
comparaison aux valeurs des contrôles et du jour 1.
En résumé, l’exposition des cellules OK au CdCl2 inhibe l’endocytose de
l’albumine et de la β2-microglobuline mais de manière réversible.
§
*
AA
CdCl 2
#
*
§
£
§
#
99

1.3. Viabilité et fonctionnalité des cellules OK
L’observation de la morphologie des cellules OK colorées à l’hématoxylineéosine
montre qu’aucune modification morphologique n’est visible au niveau des
cellules exposées aux AA 20 µmol/l ou au CdCl2 15 µmol/l, excepté la présence de
noyaux de tailles significatives au niveau des cellules traitées aux AA (Fig. 1.11). Ce
résultat suggère que l’inhibition de la réabsorption des protéines par les cellules OK
exposées à ces agents toxiques n’est pas liée à une réduction du nombre de
cellules.
Contrôle
DMSO
CdCl 2
Figure 1.11. Observation morphologique des monocouches de cellules OK colorées en
hématoxyline-éosine après 24 h d’exposition au CdCl2 15 µmol/l ou aux AA 20 µmol/l. Les
monocouches de cellules OK contrôles sont incubées avec du milieu de culture seul ou du
DMSO 0,1%. Grossissement 300 ×.
1.3.1. Test de cytotoxicité et de viabilité cellulaire
Pour renforcer ces observations morphologiques, d’autres tests de cytotoxicité
et de viabilité cellulaire sont réalisés afin d’éliminer l’hypothèse selon laquelle les
effets d’inhibition de la réabsorption de protéines résulteraient de la diminution du
nombre de cellules vivantes consécutive à l’exposition aux AA et CdCl2.
L’intégrité des membranes cellulaires est évaluée par la mesure de LDH
libérée dans le milieu extracellulaire en cas de rupture de la membrane. Au niveau
AA
100

des cellules traitées pendant 24 h au DMSO 0,1%, aux AA 10 ou 20 µmol/l et au
CdCl2 15 µmol/l, la quantité de LDH libérée est comparable à celle des cellules
contrôles (Fig. 1.12). Ce taux de LDH libérée est significativement réduit par rapport
à la quantité maximale de LDH libérée par les cellules en présence de Triton-X100.
Ces observations permettent de conclure qu’aucun effet toxique n’est observé au
niveau de la membrane plasmique lorsque les cellules OK sont exposées aux AA ou
au CdCl2.
LDH libérée
(Absorbance [A [A490nm 490nm –A –A655nm]) 655nm])
Figure 1.12. Mesure de la lactate déshydrogénase (LDH) libérée par les cellules OK. Les
cellules sont exposées au DMSO 0,1%, aux AA 10 ou 20 µmol/l ou au CdCl2 15 µmol/l
pendant 24 h. Le maximum de LDH libérée est obtenu en incubant les cellules avec du
Triton-X100 (TX100, 1 %) (n = 3). La signification statistique correspond à * P < 0,05 par
comparaison aux valeurs obtenues dans les conditions de contrôle positif (TritonX-100).
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
AA
10 µM
AA
20 µM
CdCl 2
15 µM
Figure 1.13. Effets des AA et du CdCl2 sur la viabilité des cellules OK par dosage MTT. Les
cellules sont exposées aux AA 10 ou 20 µmol/l ou au CdCl2 15 µmol/l pendant 24 h (n = 3).
Viabilité cellulaire
(% du contrôle)
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
* * * * *
TX100 cellules DMSO AA
1%
0.1% 10µM
AA
20µM
CdCl 2
15µM
Du point de vue de la viabilité cellulaire, le dosage MTT [3-(4,5-diméthylthiazoyl-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium
bromide] est réalisé après avoir exposé les
cellules OK aux AA 10 ou 20 µmol/l et au CdCl2 15 µmol/l pendant 24 h. Ce dosage
évalue la quantité de MTT réduit par la déshydrogénase mitochondriale des cellules
vivantes. Les résultats montrent une légère diminution non significative de la viabilité
101

cellulaire par rapport au contrôle, indiquant donc que les cellules OK traitées par les
AA ou le CdCl2 sont bien vivantes (Fig. 1.13).
1.3.2. Synthèse des protéines
Pour estimer l’effet des AA ou du CdCl2 sur la synthèse des protéines, la
mesure de l’incorporation de [ 35 S]L-méthionine est réalisée après différents
traitements des cellules OK. Lorsque les cellules sont exposées aux AA ou CdCl2,
aucune différence significative n’est observée après 1 ou 20 h d’incubation en
présence d’un excès de méthionine non marquée, permettant ainsi d’évaluer
respectivement les protéines de courte ou longue durée de vie (Fig. 1.14). Par
contre, lorsque les monocouches de cellules sont incubées en présence de
cycloheximide (100 µmol/l), un inhibiteur spécifique de la synthèse protéique, la
quantité de protéine synthétisées est significativement inhibée après 1h et 20 en
présence de méthionine non marquée. Ces résultats indiquent que les traitements
par les AA ou le CdCl2 n’interfèrent pas de façon majeure avec la synthèse des
protéines.
Taux de protéines synthétisées
(106 Taux de protéines synthétisées
(10 CPM/mg protéine)
6 CPM/mg protéine)
30
25
20
15
10
5
0
* *
1 h 20 h
Contrôle
AA
CdCl2 CdCl2
Cycloheximide
Figure 1.14. Effets des AA et du CdCl2 sur la synthèse de protéines dans les cellules OK.
Les cellules sont exposées aux AA 20 µmol/l ou au CdCl2 15 µmol/l de pendant 24 h, ou au
cycloheximide 100 µmol/l pendant 1 h. Après 2 h d’exposition à la [ 35 S]L-méthionine, les
monocouches de cellules sont incubées pendant 1 ou 20 h avec du milieu de culture
contenant un excès de méthionine (n = 3). La signification statistique correspond à * P < 0,05
par comparaison aux valeurs contrôles. CPM: Coups par minute.
102

1.3.3. Réabsorption du glucose
Pour vérifier l’effet des AA et du CdCl2 sur une autre fonction des cellules OK,
la réabsorption de glucose est mesurée à l’aide d’un analogue du glucose, l’AMG
(méthyl-α-D-glucopyranoside), un substrat du co-transporteur Na + /glucose mais pas
des co-transporteurs ubiquitaires des hexoses. La réabsorption d’AMG par les
cellules OK exposées pendant 24 h aux AA 20 µmol/l ou au CdCl2 15 µmol/l est
équivalente à celle des cellules contrôles (Fig. 1.15). La détermination des
paramètres de Michaelis-Menten montre également qu’il n’y a pas d’effet de ces
substances sur les valeurs d’affinité apparente ni de la vitesse maximum (Tableau
1.2). Ces données indiquent donc que la réabsorption d’AMG n’est pas
fonctionnellement altérée suite aux traitements des cellules et que le gradient du
sodium intracellulaire vers le milieu extracellulaire est conservé (étant donné que
l’AMG est co-transporté avec les ions Na + ).
Réabsorption d’AMG
(nmol/mg protéine)
A
30
25
20
15
10
5
Contrôle
AA 20 µmol/l
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
[AMG] (mM)
Figure 1.15. Effets des AA (A) et du CdCl2 (B) sur la réabsorption de méthyl-α-Dglucopyranoside
(AMG) par les cellules OK. Les cellules sont exposées aux AA 20 µmol/l ou
au CdCl2 15 µmol/l pendant 24 h. La réabsorption d’AMG est mesurée après 10 min
d’incubation des monocouches de cellules avec [ 14 C]-AMG (n = 3).
B
Réabsorption d’AMG
(nmol/mg protéine)
30
25
Contrôle
CdCl 2 15 µmol/l
20
15
10
5
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
[AMG] (mM)
103

Tableau 1.2. Paramètres cinétiques de Michaelis-Menten de la réabsorption de
méthyl-α-D-glucopyranoside (AMG) par les cellules OK
AMG
mmol/l pmol/mg protéine
Km Vmax
Contrôle 2852 ± 196 29935 ± 1997
CdCl2 15 µmol/l - 24h 3455 ± 167 30000 ± 3050
DMSO 0,1% - 24h 3066 ± 306 30596 ± 2242
AA 20 µmol/l - 24h 3180 ± 267 26466 ± 2037
Les valeurs de l’affinité apparente (Km) et de la vitesse maximale (Vmax) sont calculées par
l’équation linéarisée d’Eadie-Hofstee (n = 3).
1.4. Détection des adduits d’ADN spécifiques aux acides
aristolochiques
La persistance de l’effet inhibiteur induit par les AA sur la réabsorption
d’albumine et de β2-microglobuline ainsi que l’absence de modification significative
de la synthèse des protéines ou de signes de toxicité sont surprenantes. Par
conséquent, l’altération de l’ADN suite à l’exposition des cellules OK aux AA est
étudiée en recherchant, par la méthode de post-marquage au 32 P, la formation
adduits d’ADN spécifiques aux AA. Le profil chromatographique des adduits d’ADN
spécifiques aux AA obtenus dans les cellules OK (Fig. 1.16) se compose :
• de deux spots majeurs correspondant aux adduits d’adénosine-aristolactame
I : 7-(déoxyadénosine-N 6 -yl)aristolactame I (dA-AAI) et de guanosine-
aristolactame I : 7-(déoxyguanosine-N 2 -yl)aristolactame I (dG-AAI)
• d’un troisième spot mineur d’adduits d’adénosine-aristolactame II : 7-
(déoxyadénosine-N 6 -yl)aristoloctame II (dA-AAII).
Ces trois spots sont caractéristiques du profil d’adduits d’ADN spécifiques des AA
précédemment décrits [Bieler C.A. et al., 1997; Schmeiser H.H. et al., 1997]. Les
cellules OK sont donc capables de métaboliser les AA induisant la formation
d’adduits d’ADN.
104

De tels adduits d’ADN ne sont pas détectés dans les cellules OK contrôles ou
exposées au DMSO 0,1% ou CdCl2.
2 3
Origine
1
Figure 1.16. Autoradiographie des adduits d’ADN spécifiques aux AA dans les cellules OK.
Spot 1 : 7-(déoxyadénosine-N 6 -yl)-aristolactame I (dA-AAI), spot 2 : 7-(déoxyguanosine-N 2 -
yl)-aristolactame I (dG-AAI) et spot 3 : 7-(déoxyadénosine-N 6 -yl)-aristolactame II (dA-AAII).
Tableau 1.3. Formation des adduits d’ADN spécifiques aux AA dans les cellules OK
RAL/ 10 7 nucléotides normaux
Exposition aux AA dA-AAI (spot 1) dG-AAI (spot 2) dA-AAII (spot 3)
20 µmol/l - 15 min 0.11 ± 0.02 0.31 ± 0.01 n.d.
20 µmol/l - 2 h 0.53 ± 0.03 1.9 ± 0.6 0.16 ± 0.03
20 µmol/l - 14 h 4.2 ± 1.3 24.0 ± 9.2 1.5 ± 0.5
10 µmol/l - 24 h 28.1 ± 1.9 16.0 ± 2.1 3.0 ± 0.4
20 µmol/l - 24 h 55.6 ± 15.0 25.5 ± 0.6 5.6 ± 1.3
20 µmol/l - 24 h + 1 jour de récupération 58.6 ± 10.6 28.8 ± 1.7 6.2 ± 0.2
20 µmol/l - 24 h + 6 jours de récupération 7.7 ± 1.3 6.9 ± 1.9 0.74 ± 0.19
Le taux d’adduits d’ADN spécifiques aux AA est exprimé en quantité relative d’adduits (RAL)
par 10 7 nucléotides normaux (n = 3). Spot 1 : dA-AAI [7-(déoxyadénosine-N 6 -yl)aristolactame
I], spot 2 : dG-AAI [7-(déoxyguanosine-N 2 -yl)aristolactame I], spot 3 : dA-AAII [7-
(déoxyadénosine-N 6 -yl)aristolactame II]. n.d. non détectable.
L’analyse quantitative montre que le taux d’adduits d’ADN augmentent
linéairement en fonction de la durée d’exposition aux AA (Tableau 1.3). De même, la
quantité d’adduits d’ADN est doublée lorsque la concentration des AA passe de 10
µmol/l à 20 µmol/l (24 h d’exposition). Par contre, le taux d’adduits d’ADN est
105

comparable après 24 h d’exposition aux AA suivies ou non de 1 jour de récupération
dans le milieu de culture. Cependant, après 6 jours de récupération dans le milieu de
culture, la quantité d’adduits est réduite mais reste significative. Ces observations
reflètent clairement une altération de l’ADN dans les cellules OK induite par les AA.
1.5. Expression de la mégaline
1.5.1. Colocalisation avec l’albumine
Albumine
Mégaline
Albumine +
Mégaline
2 min
5 min
15 min
Figure 1.17. Endocytose d’albumine et expression endogène de mégaline dans les cellules
OK: microscopie confocale. Pour l’endocytose d’albumine, les monocouches de cellules OK
sont incubées avec de l’albumine-FITC pendant 2, 5 et 15 min. Une colocalisation (émission
jaune) s’observe entre l’albumine endocytée (émission verte) et la mégaline (émission rouge)
à ces 3 temps. Les paramètres des images confocales sont identiques pour les 3 temps
observés. Grossissement 200 ×.
Afin d’observer au microscope confocal l’endocytose d’albumine par les
cellules OK, les monocouches de cellules OK sont incubées avec l’albumine-FITC
pendant 2, 5 et 15 min. Après 2 min, des vésicules d’endocytose fluorescentes
apparaissent à proximité de la membrane cellulaire et s’étendent profondément dans
106

le cytoplasme après 5 et 15 min (Fig. 1.17, émission verte). La mégaline endogène
est ensuite détectée dans les cellules OK par immunomarquage fluorescent. Le
marquage de la mégaline est présent à la membrane des cellules après 2 min et une
internalisation progressive de ce marquage s’observe après 5 et 15 min d’incubation
avec l’albumine (Fig. 1.17, émission rouge). L’observation de la colocalisation entre
l’albumine et la mégaline à ces trois temps montre qu’une grande partie de
l’albumine est colocalisée avec la mégaline d’abord à la membrane plasmique des
cellules et ensuite dans les vésicules intracellulaires (Fig. 1.17, émission jaune).
1.5.2. Effets des acides aristolochiques
Comme l’internalisation de l’albumine est fortement réduite en présence des
AA (voir résultats précédents), l’effet de ce traitement sur l’expression de la mégaline
endogène est étudié par l’analyse immunoblot. Une bande de taille supérieure à 500
kD, correspondant à la masse moléculaire prédite pour la mégaline, est présente
dans le cortex rénal de rat et les extraits de cellules OK traitées ou non. Une
diminution de l’expression de la mégaline est observée pour les cellules OK
exposées à 20 µmol/l d’AA pendant 24 h (Fig. 1.18A).
A
250 kD
50 kD
37 kD
Rein de rat
Cellules OK
DMSO
AA
Mégaline
β-actine
0
Cellules OK DMSO AA
Figure 1.18. Effet des AA sur l’expression de la mégaline dans les cellules OK: analyse
immunoblot (A) et densitométrique (B). L’extrait membranaire du cortex rénal de rat, utilisé
comme contrôle positif, et les lysats de cellules OK non traités ou exposées au DMSO 0,1 %
ou aux AA 20 µmol/l pendant 24 h, sont séparés par électrophorèse. Ce film est représentatif
de 3 expériences indépendantes. Les densités optiques relatives sont obtenues en double et
normalisées par rapport à la β-actine.
B
Densité optique optique relative (%)
150
100
50
100
125
55
107

L’analyse semiquantitative de l’expression de la mégaline relative à la β-actine
montre une légère augmentation (+ 24 %) de l’expression de la mégaline dans les
cellules OK exposées au DMSO par rapport aux cellules non traitées. Cependant,
pour les cellules traitées aux AA, une diminution de moitié (- 45 %) est observée par
rapport aux cellules OK non traitées ainsi qu’une réduction de l’ordre de 70 % par
rapport aux cellules exposées au DMSO (Fig. 1.18B).
1.6. Effets d’autres composés contenus dans les gélules
amaigrissantes
D’autres composés contenus dans les pilules amaigrissantes sont testés pour
évaluer leur capacité d’interférer ou non avec la réabsorption d’albumine. Les
cellules OK sont incubées pendant 24 h avec 20 et 100 µmol/l de fenfluramine, 20 et
100 µmol/l de diéthylpropion ainsi que 20 µmol/l d’acétazolamide. Aucun de ces
produits ne modifie la réabsorption d’albumine par les cellules OK (Fig. 1.19A).
De même, les traitements combinés de 1 µmol/l d’AA avec 20 ou 100 µmol/l de
fenfluramine, 20 ou 100 µmol/l de diéthylpropion et 20 µmol/l d’acétazolamide n’ont
aucun effet sur la réabsorption de l’albumine (Fig. 1.19B).
Ces résultats indiquent donc que seuls les AA contenus dans les préparations à
visée amaigrissante altèrent l’endocytose de protéines par les cellules OK.
A
B
140
120
100
80
140
120
100
80
60
60
40
40
20
20
0
0
Réabsorption d’albumine-FITC
(% du contrôle)
Contrôle
Fenfluramine
20 µmol/l
Fenfluramine
100 µmol/l
Diéthylpropion
20 µmol/l
Diéthylpropion
100 µmol/l
Acétazolamide
20 µmol/l
B
Réabsorption d’albumine-FITC
d’albumine-FITC
(% du contrôle) contrôle)
Figure 1.19. Effet d’autres composés contenus dans les préparations à visée amaigrissante sur la
réabsorption d’albumine par les cellules OK en présence ou non d’AA. A : Les cellules sont traitées
pendant 24 h avec de la fenfluramine 20 et 100 µmol/l, du diéthylpropion 20 et 100 µmol/l ou de
l’acétazolamide 20 µmol/l et ensuite incubées avec 0,8 µmol/l d’albumine-FITC pendant 15 min. B :
Les cellules sont traitées avec du DMSO 0,1%, des AA 1 µmol/l ainsi qu’ avec des AA 1 µmol/l en
présence des mêmes produits qu’à la figure A. (n = 3).
Contrôle
DMSO
AA 1 µmol/l
Fenflu 20 µmol/l
+ AA 1 µmol/l
Fenflu 100 µmol/l
+AA1µmol/l
Diéthyl 20 µmol/l
+AA1µmol/l
Diéthyl 100 µmol/l
+ AA 1 µmol/l
Acéta 20 µmol/l
+ AA 1 µmol/l
108

2. Etude in vivo : effets de l’intoxication aux acides
aristolochiques sur l’épithélium tubulaire proximal
de rat.
Un modèle expérimental animal de néphropathie aux AA a été développé
dans notre laboratoire. Des rats Wistar mâles reçoivent en sous-cutané une dose
journalière de 10 mg/kg de poids corporel d’AA pendant 35 jours. Cette intoxication
conduit au développement d’une fibrose interstitielle associée à une atrophie
tubulaire et à une insuffisance rénale. Une diminution de l’excrétion urinaire de LAP,
enzyme localisée à la bordure en brosse, est déjà observée au jour 10 et suggère
une atteinte précoce des tubules proximaux [Debelle F.D. et al., 2002; Debelle F.D.
et al., 2004].
Les résultats in vitro décrits dans la première partie de ce travail ainsi que les
premières observations in vivo suggèrent que le tubule proximal est la cible des AA.
Par conséquent, ce modèle expérimental de néphropathie chronique aux AA est
utilisé afin d’étudier l’évolution au cours du temps des altérations structurelles et
fonctionnelles du tubule proximal et d’établir un lien entre les mesures biochimiques
et les observations histologiques.
2.1. Protocole long : rats traités pendant 35 jours
J -7
PERIODE D’INJECTION
Acclimatation
(10 mg/kg AA ou solvant, 7 jours/ semaine)
0 3 7 10 14 18
35
Jours de sacrifice (n = 6 rats / groupe)
Figure 2.1. Schéma de la procédure suivie durant le protocole expérimental long (rats traités
pendant 35 jours).
109

Tableau 2.1. Paramètres biologiques étudiés chez les rats traités aux AA et les rats contrôles.
Mesures Rats Jour 3 Jour 7 Jour 10 Jour 14 Jour 18 Jour 35
Poids des rats AA 203 ± 5 228 ± 8 251 ± 6 274 ± 9 297 ± 8 325 ± 14 *
(g) Contrôle 205± 7 238 ± 5 257 ± 6 290 ± 7 310 ± 8 386 ± 15
Créatinine plasmatique AA 14.6 ± 0.3 17.5 ± 0.8 19.9 ± 1.0 21.5 ± 0.6 19.7 ± 0.7 31.1 ± 3.5 *
(µmol/l) Contrôle 15.8 ± 1.1 18.3 ± 1.1 17.4 ± 0.7 22.5 ± 2.6 20.2 ± 2.0 22.0 ± 1.3
Débit urinaire AA 6.2 ± 0.8 10.1 ± 0.8 * 14.3 ± 2.3 * 17.3 ± 2.6 ** 16.7 ± 2.1 ** 18.9 ± 1.9 **
(µl/min) Contrôle 5.5 ± 0.3 7.6 ± 0.5 8.0 ± 0.5 8.2 ± 0.5 7.6 ± 0.9 7.3 ± 0.8
NAG urinaire AA 392 ± 63 692 ± 124 1077 ± 257 ** 1352 ± 355 ** 822 ± 115 * 2123 ± 349 **
(mU/mmol créatinine) Contrôle 219 ± 73 281 ± 44 264 ± 61 259 ± 52 363 ± 86 370 ± 41
Fraction d’excrétion du sodium AA 0.22 ± 0.01 0.26 ± 0.02 0.31 ± 0.02 0.30 ± 0.02 0.24 ± 0.02 0.30 ± 0.06
(%) Contrôle 0.25 ± 0.02 0.32 ± 0.02 0.29 ± 0.02 0.37 ± 0.04 0.19 ± 0.01 0.17 ± 0.03
Fraction d’excrétion du potassium AA 7.99 ± 0.17 7.75 ± 0.42 ** 12.5 ± 0.8 12.6 ± 0.71 8.36 ± 0.55 15.4 ± 2.4 **
(%) Contrôle 8.57 ± 0.02 10.2 ± 0.5 11.0 ± 0.7 12.1 ± 1.5 7.81 ± 0.79 7.80 ± 0.47
Fraction d’excrétion du glucose AA 0.025 ± 0.002 0.029 ± 0.005 0.047 ± 0.007 * 0.040 ± 0.009 0.027 ± 0.006 0.203 ± 0.118
(%) Contrôle 0.020 ± 0.003 0.025 ± 0.003 0.026 ± 0.004 0.036 ± 0.005 0.027 ± 0.007 0.042 ± 0.004
pH urinaire AA 8,4 ± 0,1 8,1 ± 0,2 8,0 ± 0,4 * 8,1 ± 0,1 * 8,0 ± 0,1 7,3 ± 0,1
Contrôle 8,5 ± 0,1 8,4 ± 0,1 8,6 ± 0,1 8,6 ± 0,1 8,2 ± 0,1 8,0 ± 0,3
pH plasmatique AA 8,3 ± 0,1 8,1 ± 0,1 * 8,6 ± 0,4 8,6 ± 0,1 8,6 ± 0,1 8,6 ± 0,1
Contrôle 8,2 ± 0,1 8,4 ± 0,0 8,5 ± 0,1 8,5 ± 0,1 8,7 ± 0,1 8,6 ± 0,1
Les valeurs représentent la moyenne ± SEM (n = 6). La signification correspond à * P < 0.05 et ** P < 0.01 par comparaison aux valeurs
contrôles.
110

Le schéma du protocole de 35 jours est présenté à la figure 2.1 et détaillé
dans le chapitre méthodologie § 2.2.1 (page 77).
2.1.1. Paramètres biologiques
Le poids moyen des 2 groupes de rats est obtenu avant chaque sacrifice et
présente une évolution croissante au cours du temps (Tableau. 2.1). Néanmoins bien
que les rats contrôles aient un poids équivalent à celui des rats traités aux AA du jour
3 au jour 18, une diminution significative est observée au jour 35 pour les rats
injectés aux AA par rapport aux rats contrôles.
2.1.1.1. Créatinine plasmatique
Le dosage de créatinine plasmatique est effectué afin d’évaluer la fonction
rénale. Chez les rats traités aux AA pendant 35 jours, la créatinine plasmatique
moyenne reste stable jusqu’au jour 18 et augmente de manière significative au jour
35 (Tableau 2.1), reproduisant les résultats décrits précédemment [Debelle F.D. et
al., 2002].
2.1.1.2. Protéines et enzymes urinaires
En vue d’obtenir des informations sur la fonction tubulaire, plusieurs
paramètres urinaires sont mesurés. Le débit urinaire augmente significativement
chez les rats traités aux AA à partir du 7 ème jour et persiste jusqu’au jour 35,
indiquant que les rats sont devenus polyuriques (Tableau 2.1).
Protéinurie et albuminurie
Une protéinurie significative est observée dès le jour 7 et s’intensifie jusqu’au
jour 35 reflétant une altération de la réabsorption des protéines (Fig. 2.2A).
L’albuminurie augmente, atteint la signification statistique dès le 3 ème jour et reste
111

élevée jusqu’au jour 35 (Fig. 2.2B). Le taux d’albumine plasmatique est normal tout
au long du protocole. Le rapport albuminurie/protéinurie totale reste constant à tous
les temps pour les rats contrôles, alors que chez les rats traités aux AA, une
augmentation significative de ce rapport n’est observée qu’aux jours 3 et 35. Cette
élévation est moindre aux autres jours (Fig. 2.2C). Ces observations suggèrent que
des protéines autres que l’albumine sont excrétées dans les urines, probablement
suite à un défaut précoce de réabsorption tubulaire. Il s’agit donc bien d’une
protéinurie dite tubulaire.
Protéinurie totale (mg/mmol créatinine)
A B
500 500
400 400
300 300
200 200
100 100
0
Contrôle
AA
**
3 7 10 14 18 35
C
**
**
Temps (jours)
Rapport albuminurie/protéinurie totale (%)
35
30
25
20
15
10
5
0
**
**
Contrôle
AA
*
3 7 10 14 18 35
Temps (jours)
3 7 10 14 18 35
Figure 2.2. Protéinurie totale (A), albuminurie (B) et rapport albuminurie/protéinurie totale (C)
déterminés chez les rats contrôles (colonne grise) et les rats traités aux AA (colonne noire)
aux jours 3, 7, 10, 14, 18 et 35. Les résultats représentent la moyenne ± SEM (n = 6). Les
significations statistiques correspondent à * P < 0,05 et ** P < 0,01 par comparaison aux
valeurs contrôles.
Afin d’identifier les protéines excrétées dans les urines des rats traités aux AA,
les protéines contenues dans les échantillons urinaires sont précipitées avant d’être
séparées par électrophorèse. Pour chaque temps, les profils d’électrophorèse de
Albuminurie (mg/mmol créatinine)
120
100
80
60
40
20
0
Contrôle
AA
**
**
***
Temps (jours)
*
**
112

deux rats contrôles et de deux rats traités aux AA sont présentés à la figure 2.3. Aux
jours 3 (Fig. 2.3A) et 35 (Fig. 2.3C), l’intensité des bandes correspondant à
l’albumine et à la transferrine (positionnée juste au-dessus) augmente nettement
pour les deux rats traités aux AA. Par contre, aux jours 7, 10, 14 et 18, les bandes de
ces deux protéines sont plus intenses pour un seul des deux rats (Fig. 2.3A-C).
A
250
150
100
75
50
37
25
20
15
10
AA Contrôle AA Contrôle
Jour 3 Jour 7
C
250
150
100
75
50
37
25
20
15
10
AA Contrôle AA Contrôle
AA Contrôle AA Contrôle
Jour 10 Jour 14
Transferrine
Albumine
DBP
α 2 -microglobuline
β 2 -microglobuline
Jour 18 Jour 35
Figure 2.3. Séparation des protéines urinaires par électrophorèse pour deux rats contrôles
et deux rats traités aux AA (AA). La partie A correspond aux jours 3 et 7, la partie B aux jours
10 et 14 et la partie C aux jours 18 et 35. Le standard de poids moléculaire est annoté à
gauche des gels et l’identification de certaines protéines à droite. (Gels Tris-HCl 4-20%).
La variation d’intensité étant difficilement décelable pour les bandes
correspondant aux protéines de faible poids moléculaire dont la protéine de liaison à
la vitamine D, l’α2-microglobuline et la β2-microglobuline, une analyse semi-
quantitative de ces profils d’électrophorèse est réalisée en considérant 3 catégories :
les protéines de haut poids moléculaire correspondant aux protéines de taille
supérieure à l’albumine, l’albumine et les protéines de faible poids moléculaire (dites
microprotéines). Cette analyse semi-quantitative de l’électrophorèse des protéines
urinaires montre une augmentation significative de la quantité de protéines de haut
poids moléculaire aux jours 3, 7, et 35 ainsi que de l’albumine aux jours 3, 14 et 35
(Tableau 2.2). Le taux urinaire de protéines de faible poids moléculaire double au
jour 10 et s’élève progressivement à partir du jour 10 jusqu’au jour 35, suggérant une
B
Immunoglobuline
Transferrine
Albumine
DBP
α α2-microglobuline 2-microglobuline
2-microglobuline
β 2 -microglobuline
113

altération de la fonction de réabsorption des cellules tubulaires proximales (Tableau
2.2).
Tableau 2.2. Analyse semi-quantitative des électrophorèses de protéines urinaires
réalisées chez les rats traités aux AA et les rats contrôles
Jour Rats
3
7
10
14
18
35
mg/mmol créatinine
HMWP Albumine LMWP
AA 12,9 ± 1,1 ** 19,5 ± 4,0 * 58,9 ± 7,4
Contrôle 7,3 ± 0,8 8,6 ± 1,3 57,3 ± 5,1
AA 9,0 ± 1,0 ** 14,2 ± 4,3 95,1 ± 3,1
Contrôle 4,3 ± 0,5 6,1 ± 0,8 67,6 ± 10,6
AA 13,7 ± 6,3 25,0 ± 10,0 184,8 ± 8,4 **
Contrôle 6,5 ± 1,2 7,7 ± 0,8 92,7 ± 10,2
AA 15,7 ± 9,2 53,4 ± 22,3 * 249,1 ± 22,4 **
Contrôle 2,9 ± 0,4 4,8 ± 0,8 146,9 ± 10,1
AA 6,6 ± 3,1 15,7 ± 6,6 182,0 ± 12,9 **
Contrôle 3,5 ± 1,0 5,7 ± 0,9 112,4 ± 11,2
AA 27,3 ± 13,9 ** 79,9 ± 13,8 ** 251,5 ± 14,8 **
Contrôle 1,7 ± 0,2 4,7 ± 1,0 140,5 ± 8,7
Les valeurs pour les protéines de haut poids moléculaire (HMWP : High Molecular Weight
Proteins), l’albumine et les protéines de faible poids moléculaire (LMWP : Low Molecular
Weight Proteins) représentent la moyenne ± SEM (n = 6). La signification statistique
correspond à * P < 0 ,05 et ** P < 0,01 par comparaison aux valeurs contrôles.
Enzymurie NAG
L’excrétion urinaire de la NAG, enzyme localisée dans les lysosomes des
cellules épithéliales rénales, principalement proximales, est déterminée à chaque
temps du protocole. L’enzymurie NAG augmente à partir du jour 3, atteint la
signification statistique au jour 10 et s’intensifie progressivement jusqu’au jour 35,
reflétant ainsi une perte d’intégrité d’un nombre croissant de cellules rénales
(Tableau 2.1).
114

Autres analyses
D’autres paramètres biologiques sont dosés afin de calculer la fraction
d’excrétion du sodium, du potassium et du glucose (Tableau 2.1). La fraction
d’excrétion du sodium pour les rats traités aux AA est comparable à celle des rats
contrôles. La fraction d’excrétion du potassium diminue significativement au jour 7 et
augmente au jour 35 chez les rats injectés aux AA. La fraction d’excrétion du glucose
est significativement élevée au jour 10 et augmente sans être statistiquement
significative au jour 35.
De même, les mesures de pH urinaire et plasmatique montrent que le pH
reste constant chez les rats traités aux AA par rapport aux contrôles, excepté aux
jours 10 et 14 pour le pH urinaire et au jour 7 pour le pH plasmatique (Tableau 2.1).
A
Protéinurie totale (mg/mmol (mg/mmol créatinine) créatinine)
500
400
300
200
100
0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
NAG urinaire (mU/mmol créatinine)
C
Créatinine plasmatique (µmol/l)
40 40
30 30
20 20
10 10
r = 0.80 (Spearman)
P < 0.0001
0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
NAG urinaire (mU/mmol créatinine)
r = 0.65 (Spearman)
P < 0.0001
Figure 2.4. Corrélations structure-fonction entre l’enzymurie NAG et la protéinurie totale (A),
l’albuminurie (B) et la créatinine plasmatique (C) chez les rats traités aux AA (n = 36).
Albuminurie (mg/mmol créatinine)
B
100
80
60
40
20
0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
NAG urinaire (mU/mmol créatinine)
r = 0.54 (Spearman)
P = 0.0007
115

2.1.1.3. Relations structure-fonction
Des corrélations structure-fonction sont déterminées sur base des données
biochimiques individuelles pour chaque temps afin d’établir des liens entre les
différents paramètres d’atteinte tubulaire structurelle et fonctionnelle. Les plus
représentatives sont : l’enzymurie NAG est étroitement corrélée avec la protéinurie
totale (Fig. 2.4A), avec l’albuminurie (Fig.2.4B) et avec le taux de créatinine
plasmatique (Fig. 2.4C).
2.1.2. Observations histologiques
2.1.2.1. Histologie conventionnelle
Les lésions morphologiques sont étudiées à l’aide de différentes colorations
permettant d’approfondir l’une ou l’autre anomalie du secteur tubulo-interstitiel.
Aucune lésion n’est décelée dans les glomérules. Les altérations morphologiques
sont exclusivement observées dans la partie externe de la médullaire externe ainsi
qu’au niveau de la strie médullaire. Ces zones correspondant à la localisation des
tubules proximaux du segment S3 sont les plus sensibles à l’hypoxie.
Hématoxyline-éosine
La coloration hématoxyline-éosine sur les coupes de tissu rénal des rats
traités aux AA met en évidence des anomalies précoces et évolutives au cours du
temps au niveau des tubules proximaux. En effet, un gonflement des cellules
tubulaires proximales ainsi que l’apparition de cellules nécrotiques dans la lumière
des tubules sont observés dès le jour 3 (Fig. 2.5B). Ensuite, des foyers de nécrose
tubulaire sont présents aux jours 7 et 10 (Fig. 2.5C-D). Ces altérations de l’épithélium
tubulaire évoluent vers l’atrophie tubulaire, laquelle se développe progressivement à
partir du jour 10 jusqu’au jour 35 (Fig. 2.5D-G). Notons également la présence et le
développement de l’infiltrat inflammatoire de cellules mononuclées à partir du jour 3
jusqu’au jour 35 (Fig. 2.5B-G).
116

A: Contrôle – Jour 3 B: AA – Jour 3
E: AA – Jour 14
#
*
F: AA – Jour 18
#
#
C: AA – Jour 7
#
*
Figure 2.5. Coloration hématoxyline-éosine des coupes de tissu rénal des rats contrôles aux
jours 3 et 35 (A & H) ainsi que des rats traités aux AA aux jours 3, 7, 10, 14, 18 et 35 (B-G).
Les lésions morphologiques représentatives du secteur tubulo-interstitiel sont observées :
gonflement de la cellule tubulaire (flèche), nécrose tubulaire (*), atrophie tubulaire (tête de
flèche) et infiltrat inflammatoire de cellules mononuclées (#). Grossissement 400 ×.
Trichrome de Goldner
Sur les coupes colorées au trichrome de Goldner, la fibrose interstitielle,
consistant en un dépôt de matrice extracellulaire constituée de fibres de collagène,
est observée au jour 10 et s’intensifie graduellement jusqu’au jour 35 (Fig. 2.6B-E).
A: Contrôle – Jour 10
Figure 2.6. Coloration au trichrome de Goldner des coupes de tissu rénal des rats contrôles
aux jour 10 et 35 (A & F) ainsi que des rats traités aux AA aux jours 10, 14, 18 et 35 (B-E).
Cette coloration montre le développement de la fibrose interstitielle (vert clair).
Grossissement 400 ×.
#
*
*
*
G: AA – Jour 35
B: AA – Jour 10 C: AA – Jour 14
D: AA – Jour 10
*
#
*
H: Contrôle – Jour 35
D: AA – Jour 18 E: AA – Jour 35
F: Contrôle – Jour 35
117

Acide periodique Schiff (PAS)
La coloration acide periodique Schiff (PAS) permet d’examiner plus en détails
la bordure en brosse de l’épithélium tubulaire proximal et les membranes basales.
Cette coloration montre l’intégrité de la bordure en brosse à la membrane apicale
des tubules proximaux et de la membrane basale pour les rats contrôles (Fig. 2.7A
& H). Par contre, chez les rats traités aux AA, dès le jour 3, une désorganisation de
la bordure en brosse est visible (Fig. 2.7B). Une perte progressive de la bordure en
brosse des tubules proximaux est ainsi observée du jour 7 jusqu’au jour 35 (Fig.
2.7C-G). Les tubules proximaux ayant perdu leur bordure en brosse apparaissent
dilatés, leurs cellules sont aplaties avec un cytoplasme réduit (Fig. 2.7C-F). Les
tubules deviennent atrophiques et leur membrane basale résiduelle est épaissie au
jour 35 (Fig. 2.7G). Des cellules nécrotiques ainsi que des débris cellulaires sont
présents dans la lumière des tubules proximaux aux jours 7, 10, 14 et 18 (Fig. 2.7C-
F).
A: Contrôle – Jour 3 B: AA – Jour 3
C: AA – Jour 7 D: AA – Jour 10
E: AA – Jour 14 F: AA – Jour 18
G: AA – Jour 35
H: Contrôle – Jour 35
Figure 2.7. Coloration à l’acide periodique de Schiff (PAS) des coupes de tissu rénal des
rats contrôles aux jours 3 et 35 (A & H) ainsi que des rats traités aux AA aux jours 3, 7, 10,
14, 18 et 35 (B-G). Grossissement 400 ×.
2.1.2.2. Immunomarquage de l’endopeptidase neutre
Pour confirmer les atteintes de la bordure en brosse observées au PAS, un
immunomarquage de la NEP, enzyme ancrée dans la membrane apicale des cellules
tubulaires proximales, est réalisé. L’observation des coupes de tissu rénal des rats
contrôles montre que la NEP est localisée à la bordure en brosse de l’épithélium du
118

tubule proximal (Fig. 2.8A & H). Par contre, chez les rats exposés aux AA, une perte
ponctuelle du marquage est observée au jour 3 (Fig. 2.8B). Ensuite, une disparition
partielle ou totale du marquage de la NEP à la bordure en brosse est observée aux
jours 7, 10, 14, 18 et 35 (Fig. 2.8C-G). Ainsi, le nombre de tubules proximaux ayant
perdu leur bordure en brosse augmente au cours du temps d’exposition aux AA. Les
observations du PAS et du marquage de la NEP sont comparables et indiquent donc
que les altérations structurelles des tubules proximaux se caractérisent par une
disparition progressive de la bordure en brosse.
A: Contrôle – Jour 3 B: AA – Jour 3
C: AA – Jour 7 D: AA – Jour 10
E: AA – Jour 14 F: AA – Jour 18
G: AA – Jour 35
H: Contrôle – Jour 35
Figure 2.8. Marquage immunohistochimique de l’endopeptidase neutre (NEP) sur les
coupes de tissu rénal des rats contrôles aux jours 3 et 35 (A & H) ainsi que des rats traités
aux AA aux jours 3, 7, 10, 14, 18 et 35 (B-G). Grossissement 400 ×.
2.1.2.3. Evaluation semi-quantitative des lésions morphologiques
L’évaluation semi-quantitative des lésions morphologiques décrites ci-dessus
est effectuée au départ des coupes de tissu rénal des rats traités aux AA colorées à
l’hématoxyline-éosine et au trichrome de Goldner. Les scores allant de 0 à 3 sont
établis pour la nécrose tubulaire, la fibrose interstitielle et l’atrophie tubulaire (pour
plus de détails voir le chapitre méthodologie § 2.12, page 85). Cette évaluation,
présentée à la figure 2.9, montre que la présence de foyers de nécrose tubulaire est
maximale au jour 7 et fortement diminuée à partir du jour 10. Ensuite, l’atrophie
tubulaire apparaît au jour 7, évolue progressivement, elle est la plus intense au jour
35. Parallèlement, la fibrose interstitielle faiblement présente au jour 7 se développe
graduellement jusqu’au jour 35 où elle est maximale. Ces résultats confortent les
119

observations histologiques décrites précédemment et indiquent que les tubules
proximaux sont précocement altérés suite aux injections d’AA.
Score
3
2
1
0
Nécrose tubulaire
Atrophie tubulaire
Fibrose interstitielle
3 7 10 14 18 35
Temps (jours)
Figure 2.9. Evaluation semi-quantitative des lésions morphologiques observées chez les
rats traités aux AA aux jours 3, 7, 10, 14, 18 et 35: nécrose tubulaire (colonne noire),
atrophie tubulaire (colonne grise) et fibrose interstitielle (colonne hachurée). Les résultats
représentent la moyenne ± SEM (n = 6).
2.1.3. Détection des adduits d’ADN spécifiques aux acides
aristolochiques dans le cortex rénal
Les adduits d’ADN spécifiques aux AA sont détectés dans des échantillons de
cortex rénal issus des rats traités aux AA. Par contre, aucun adduit n’est décelé chez
les rats contrôles. Pour rappel, l’image caractéristique des adduits d’ADN spécifiques
aux AA, présentée à la Fig. 2.10A, se compose de trois spots majeurs d’adduits : 7-
(déoxyadénosine-N 6 -yl)-aristolactame I (dA-AAI, spot 1), 7-(déoxyguanosine-N 2 -yl)aristolactame
I (dG-AAI, spot 2) et 7-(déoxyadénosine-N 6 -yl)-aristolactame II (dA-
AAII, spot 3) [Bieler C.A. et al., 1997; Stiborova M. et al., 1994].
L’analyse quantitative révèle qu’une quantité constante d’adduits d’ADN est
atteinte dès le jour 3 et se maintient jusqu’au jour 35 (Fig. 2.10B). Une légère
augmentation du taux d’adduits d’ADN est observée au jour 18 mais n’est pas
statistiquement significative. La quantité totale des adduits d’ADN spécifiques aux AA
120

chez les rats est donc stable et comprise entre 800 et 1000 adduits par 10 8
nucléotides comme rapporté dans un protocole précédent [Debelle F. et al., 2003].
A B
2
Figure 2.10. A : Autoradiographie des adduits d’ADN spécifiques aux AA dans le cortex
rénal des rats traités aux AA. B : Quantité d’adduits d’ADN spécifiques aux AA formés dans
le cortex rénal des rats traités aux AA aux jours 3, 7, 10, 14, 18 et 35. Les résultats
représentent la moyenne ± SEM (n = 4). Chaque échantillon d’ADN est post-marqué une
seule fois. Spot 1 : 7-déoxyadénosine-N 6 -yl)-aristolactame I (dA-AAI : colonne noire), spot 2 :
7-(déoxyguanosine-N 2 -yl)-aristolactame I (dG-AAI : colonne hachurée) et spot 3 : 7-
(déoxyadénosine-N 6 -yl)-aristolactame II (dA-AAII : colonne grise).
2.2. Protocole de suivi des paramètres urinaires: rats
traités pendant 35 jours
Acclimatation
J -7
3
1
Adduits par 10 8 Adduits par 10 nucléotides normaux
8 nucléotides normaux
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
Spot 1 (dA-AAI)
Spot 2 (dG-AAI)
Spot 3 (dA-AAII)
3 7 10 14 18 35
Temps (jours)
PERIODE D’INJECTION
(10 mg/kg AA ou solvant, 7 jours/ semaine)
0 3 5 7 10 13 15 18 22 24 27 31
Jours de récolte d’urines
(n = 4 rats traités et 3 rats contrôles)
Figure 2.11. Schéma de la procédure suivie durant le protocole expérimental de suivi des
paramètres urinaires (rats traités pendant 35 jours).
35
121

L’analyse des résultats obtenus dans le protocole précédent montre que le
dosage des paramètres urinaires permet de détecter, dès le 3 ème jour, les atteintes
structurelles et fonctionnelles de l’épithélium tubulaire proximal développées suite à
l’administration des AA. Dès lors, un protocole de suivi plus rapproché des
paramètres urinaires est effectué afin d’étudier l’évolution individuelle au cours du
temps des altérations structurelles et fonctionnelles occasionnées chez des rats
intoxiqués aux AA pendant 35 jours (Fig. 2.11, protocole détaillé dans le chapitre
méthodologie § 2.2.1 page 77).
2.2.1. Paramètres reflétant l’atteinte fonctionnelle
Chez un rat contrôle représentatif du groupe, l’excrétion urinaire des protéines
totales et de l’albumine n’est pas différente de la valeur basale correspondant au jour
0 (Fig. 2.12A). Par contre, chez quatre rats traités aux AA, la protéinurie augmente
rapidement entre le jour 3 et 7, retourne à une valeur basale au jour 10 et ensuite
s’élève progressivement (Fig. 2.13). L’albuminurie augmente autour du jour 5 (du
jour 3 au jour 7), et présente ensuite une évolution variable en fonction des rats (Fig.
2.13). Le suivi de ces deux paramètres biologiques indique que l’atteinte
fonctionnelle de l’épithélium tubulaire proximal semble se développer en deux
phases.
2.2.2. Paramètres reflétant l’atteinte structurelle
Dans le groupe des rats contrôles, aucune modification par rapport aux
valeurs du jour 0 n’est observée pour la NAG, l’α-GST, la LAP et la NEP (Fig. 2.12B-
C). Afin d’étudier l’intégrité des cellules tubulaires, deux enzymes cytosoliques, la
NAG et l’α-GST sont dosées. Comme observé précédemment pour la protéinurie et
l’albuminurie, l’enzymurie NAG ainsi que l’enzymurie α-GST augmentent rapidement
au cours des premiers jours d’injection des rats aux AA, avec un maximum aux jours
5 et 7. Ensuite, elles diminuent et finalement s’élèvent plus progressivement au cours
des derniers jours (Fig. 2.14).
122

De même, les enzymuries LAP et NEP évoluent selon un profil semblable à
celui de la NAG et de l’α-GST. En effet, dans le groupe des rats traités aux AA, une
libération précoce de la LAP et de la NEP s’observe dans un premier temps aux
jours 3 et 7, elle est suivie par une excrétion progressive dans un deuxième temps
(Fig. 2.15).
Ces enzymes, marqueurs de l’intégrité cellulaire et de la bordure en brosse,
suggèrent donc que la structure tubulaire est altérée par le traitement aux AA et que
ces lésions structurelles évoluent en deux phases distinctes.
Paramètres urinaires (mg/mmol créatinine)
A
500
400
300
200
100
0
Protéines urinaires
Albumine urinaire
0 5 10 15 20 25 30 35
C
Temps (jours)
Activité LAP urinaire
(µmol AMC produit/mmol créatinine/h)
200
150
100
50
0
LAP urinaire
NEP urinaire
NAG urinaire (mU/mmol créatinine)
0 5 10 15 20 25 30 35
Temps (jours)
Figure 2.12. Evolution au cours du temps de paramètres urinaires chez un même rat
contrôle représentatif aux jours 0, 3, 5, 7, 10, 13, 15, 18, 22, 24, 27, 31 et 35. A : Protéinurie
totale (cercle noir) et albuminurie (cercle gris). B : N-acetyl-β-D-glucosaminidase (NAG, carré
noir) et alpha-glutathione S-transférase (α-GST, carré gris). C : Leucine aminiopeptidase
(LAP, triangle noir) et endopeptidase neutre (NEP, triangle gris). AMC: 7-amino-4-méthylcoumarine.
B
5000
4000
3000
2000
1000
0
Temps (jours)
NAG urinaire
α-GST urinaire
0 5 10 15 20 25 30 35
250
200
150
100
50
0
NEP urinaire (µg/mmol créatinine)
140
120
100
80
60
40
20
0
αα-GST αα-GST urinaire (µg/mmol créatinine)
123

Paramètres urinaires (mg/mmol créatinine)
Paramètres urinaires (mg/mmol créatinine)
500
400
300
200
100
0
500
400
300
200
100
0
0 5 10 15 20 25 30 35
Temps (jours)
0 5 10 15 20 25 30 35
Temps (jours)
Protéines urinaires
Albumine urinaire
Rat 1 Rat 2
Paramètres urinaires (mg/mmol créatinine)
Paramètres urinaires (mg/mmol créatinine)
0 5 10 15 20 25 30 35
Temps (jours)
Rat 3 Rat 4
Figure 2.13. Evolution au cours du temps de la protéinurie totale (cercle noir) et de
l’albuminurie (cercle gris) chez quatre rats traités aux AA.
NAG urinaire (mU/mmol créatinine)
NAG urinaire (mU/mmol créatinine)
5000
120
4000
alpha-GST
100
3000
80
urinaire
60
2000
(µg/mmol
40
1000
20
créatinine)
0
0 5 10 15 20 25 30 35
Temps (jours)
5000 250
4000
200
alpha-GST
3000
150
urinaire
2000
100
(µg/mmol
1000
50
créatinine)
0
0 5 10 15 20 25 30 35
Temps (jours)
140
0
0
Figure 2.14. Evolution au cours du temps des enzymuries NAG (carré noir) et alpha-GST
(carré gris) chez quatre rats traités aux AA.
500
400
300
200
100
0
500
400
300
200
100
0
NAG urinaire
alpha-GST urinaire
NAG urinaire (mU/mmol créatinine)
NAG urinaire (mU/mmol créatinine)
0 5 10 15 20 25 30 35
0
Temps (jours)
Rat 1 Rat 2
5000
120
4000
alpha-GST
100
3000
80
urinaire
60
2000
(µg/mmol
40
1000
20
créatinine)
0
0 5 10 15 20 25 30 35
Temps (jours)
Rat 3 Rat 4
5000 140
120
4000
alpha-GST
100
3000
80
urinaire
60
2000
(µg/mmol
40
1000
20
créatinine)
0 5 10 15 20 25 30 35
Temps (jours)
140
0
0
124

Activité LAP urinaire
Activité LAP urinaire
(µmol AMC produit/mmol créatinine/h)
(µmol AMC produit/mmol créatinine/h)
200
150
100
50
0
200
150
100
50
0
0 5 10 15 20 25 30 35
Temps (jours)
0 5 10 15 20 25 30 35
Temps (jours)
Figure 2.15. Evolution au cours du temps des enzymuries LAP (triangle noir) et NEP
(triangle gris) chez quatre rats traités aux AA.
2.3. Protocole court : rats traités pendant 5 jours
Acclimatation
J -7
250
200
150
100
50
0
LAP urinaire
NEP urinaire
Rat 1 Rat 2
NEP urinaire (µg/mmol créatinine)
Activité LAP urinaire
0 5 10 15 20 25 30 35
Temps (jours)
Rat 3 Rat 4
250
200
150
100
50
0
NEP urinaire (µg/mmol créatinine)
Activité LAP urinaire
0 1 2 3 4 5
Jours de sacrifice (n = 6 rats / groupe)
Figure 2.16. Schéma de la procédure suivie durant le protocole expérimental court (rats
traités pendant 5 jours).
Les résultats des deux protocoles précédents montrent que l’administration
des AA induit des altérations structurelles et fonctionnelles de l’épithélium tubulaire
proximal dès le 3 ème jour d’injection. Par conséquent, un protocole de plus courte
(µmol AMC produit/mmol créatinine/h)
(µmol AMC produit/mmol créatinine/h)
200
150
100
50
0
200
150
100
50
0
0 5 10 15 20 25 30 35
Temps (jours)
PERIODE D’INJECTION
(10 mg/kg AA ou solvant, 1 fois/ jour)
250
200
150
100
50
0
250
200
150
100
50
0
NEP urinaire (µg/mmol créatinine)
NEP urinaire (µg/mmol créatinine)
125

durée est réalisé afin d’étudier les premiers changements structurels et/ou
fonctionnels de l’épithélium tubulaire proximal après l’intoxication aux AA (Fig. 2.16,
protocole détaillé dans le chapitre méthodologie § 2.2.2. page 77).
2.3.1. Paramètres biologiques
La mesure du poids des rats avant chaque sacrifice montre que les rats traités
aux AA et les rats contrôles ont un poids moyen équivalent et stable sur la période
de 5 jours (Fig. 2.17). Pour réaliser ce protocole court, les rats choisis ont un poids
plus élevé (± 100 g) que ceux des protocoles longs, afin de se situer en dehors de
leur phase de croissance.
Figure 2.17. Poids moyen des rats contrôles (colonne grise) et traités aux AA (colonne
noire) aux jours 1, 2, 3, 4 et 5. Les résultats représentent la moyenne ± SEM (n = 6).
2.3.1.1. Créatinine plasmatique
Poids des rats (g)
400
300
200
100
0
Contrôle
AA
0 1 2 3 4 5
Temps (jours)
La créatinine plasmatique augmente significativement aux jours 1 et 3 pour les
rats traités aux AA et évolue jusqu’au jour 5 (Fig. 2.18). Cette élévation du taux de
créatinine plasmatique suggère que les rats injectés aux AA ont développé une
insuffisance rénale aiguë transitoire.
126

Créatinine plasmatique (µmol/l)
Figure 2.18. Créatinine plasmatique des rats contrôles (colonne grise) et des rats traités aux
AA (colonne noire) aux jours 1, 2, 3, 4 et 5. Les résultats représentent la moyenne ± SEM (n
= 6). Les significations statistiques correspondent à * P < 0,05 et ** P < 0,01 par
comparaison aux valeurs contrôles.
2.3.1.2. Protéines et enzymes urinaires
Protéinurie et albuminurie
Les rats traités aux AA et les rats contrôles ont un débit urinaire comparable
durant les 5 jours (Fig. 2.19). Par contre, l’excrétion urinaire de protéines totales
augmente significativement pour les rats traités aux AA dès le 1 er jour et évolue
rapidement jusqu’au jour 5 (Fig. 2.20A). Cette protéinurie indique donc qu’une seule
injection d’AA suffit à induire des altérations de l’épithélium tubulaire proximal.
Débit urinaire (µl/min)
60
50
40
30
20
10
0
20
15
10
5
0
Contrôle
AA
*
1 2 3 4 5
Contrôle
AA
*
Temps (jours)
0 1 2 3 4 5
Figure 2.19. Débit urinaire des rats contrôles (colonne grise) et des rats traités aux AA
(colonne noire) aux jours 1, 2, 3, 4 et 5. Les résultats représentent la moyenne ± SEM (n = 6,
excepté au jour 3 dans le groupe des rats traités aux AA n = 5). La signification statistique
correspond à * P < 0,05 par comparaison aux valeurs contrôles.
**
Temps (jours)
127

Protéinurie totale (mg/ mmol créatinine)
A B
600
500
400
300
200
100
0
Contrôle
AA
*
0 1 2 3 4 5
C
**
Temps (jours)
Rapport albuminurie/protéinurie totale (%)
**
100
80
60
40
20
0
**
**
Contrôle
AA
0 1 2 3 4 5
Temps (jours)
Figure 2.20. Protéinurie totale (A), albuminurie (B) et rapport albuminurie/protéinurie totale
(C) chez les rats contrôles (colonne grise) et les rats traités aux AA (colonne noire) aux jours
1, 2, 3, 4 et 5. Les résultats représentent la moyenne ± SEM (n = 6, excepté au jour 3 dans
le groupe des rats traités aux AA n = 5). Les significations statistiques correspondent à * P <
0,05 et ** P < 0,01 par comparaison aux valeurs contrôles.
De même, l’excrétion urinaire d’albumine augmente de manière significative à
partir du jour 2 jusqu’au jour 5 et présente un niveau maximal très élevé au jour 4
(Fig. 2.20B). Le taux d’albumine plasmatique des rats traités et des rats contrôles est
comparable et stable sur la durée de ce protocole court. L’albuminurie résulte donc
d’un défaut précoce de la réabsorption tubulaire.
Le rapport albumine urinaire/protéines urinaires totales est constant pendant
les 5 jours pour les rats contrôles (Fig. 2.20C). Par contre, pour les rats traités aux
AA, une augmentation significative de ce rapport albuminurie/protéinurie totale est
observée dès le jour 2 jusqu’au jour 5 ; cette élévation est doublée au jour 4
atteignant un niveau d’environ 80%.
Albuminurie (mg/mmol créatinine)
600
500
400
300
200
100
**
0
**
Contrôle
AA
0 1 2 3 4 5
**
**
**
**
Temps (jours)
**
**
128

Afin d’identifier les protéines urinaires excrétées, les échantillons urinaires
sont séparés par gel d’électrophorèse. Les profils électrophorétiques obtenus ne
montrent aucune différence entre les rats contrôles et traités aux AA au jour 1 (Fig.
2.21A). Par contre, l’intensité des bandes correspondant à l’albumine et à la
transferrine est augmentée chez les rats traités aux AA pour les autres temps du
protocole (Fig. 2.21B-E). Aux jours 1, 2 et 3, tous les rats injectés aux AA n’ont pas
les mêmes profils protéiques, reflétant une hétérogénéité dans la réponse des rats
aux AA. Cependant, aux jours 4 et 5, les rats semblent être intoxiqués par les AA
avec la même intensité. Les résultats obtenus sur les gels d’électrophorèse
confirment les dosages décrits précédemment. L’α2-microglobuline et la β2-
microglobuline sont présentes dans les rats contrôles et traités aux AA.
250
150
100
75
50
37
25
20
15
10
A B
AA Contrôle
Figure 2.21. Electrophorèses des protéines urinaires de 2 ou 3 rats contrôles et de 6 rats
traités aux AA aux jours 1 (A), 2 (B), 3 (C), 4 (D) et 5 (E). Le standard de poids moléculaire
est annoté à la gauche des gels et certaines protéines sont indiquées à droite. (Gels Tris-HCl
4-20%).
36
28
17
84
AA Contrôle
C AA Contrôle
AA Contrôle D
250
150
100
75
50
37
25
20
15
10
E
250
150
100
75
50
37
25
20
15
10
AA Contrôle
Transferrine
Albumine
Transferrine
Albumine
α 2 -microglobuline
β 2 -microglobuline
α 2 -microglobuline
β 2 -microglobuline
129

Enzymurie NAG
L’excrétion urinaire de la NAG est significativement élevée aux jours 2, 4 et 5
(Fig. 2.22). Cette augmentation s’intensifie aux jours 4 et 5. L’activité urinaire NAG
présente la même évolution que l’albuminurie (Fig. 2.20B), le rapport
albumine/protéines urinaires totales (Fig. 2.20C) et la créatinine plasmatique (Fig.
2.18). Ces données indiquent que la perte d’intégrité des cellules tubulaires induit
d’une part, une excrétion urinaire de protéines (principalement de l’albumine) et
d’autre part, une altération de la fonction rénale menant à une insuffisance rénale
aiguë transitoire.
NAG urinaire (mU/mmol créatinine)
2000
1800
1600
1400
1200
1000
0 1 2 3 4 5
Temps (jours)
Figure 2.22. Enzymurie NAG pour les rats contrôles (colonne grise) et les rats traités aux AA
(colonne noire) aux jours 1, 2, 3, 4 et 5. Les résultats représentent la moyenne ± SEM (n = 6,
excepté au jour 3 pour les rats traités aux AA n = 5). La signification statistique correspond à
** P < 0,01 par comparaison aux valeurs contrôles.
2.3.1.3. Relations structure-fonction
800
600
400
200
0
Contrôle
AA
**
Les corrélations entre la structure et la fonction sont établies à l’aide des
données biochimiques individuelles pour chaque temps. L’enzymurie NAG est
étroitement corrélée à la protéinurie (Fig. 2.23A), l’albuminurie (Fig. 2.23B) ainsi que
la créatinine plasmatique (Fig. 2.23C). Ces résultats sont similaires à ceux observés
dans le protocole de 35 jours (voir le chapitre résultats § 2.1.1.3 page 115-116).
**
**
130

Protéinurie totale (mg/mmol créatinine)
A B
600
500
400
300
200
100
0
0 500 1000 1500 2000 2500
NAG urinaire (mU/mmol créatinine)
C
r = 0.7084 (Spearman)
P < 0.0001
Figure 2.23. Corrélations structure-fonction entre l’enzymurie NAG et la protéinurie totale
(A), l’albuminurie (B) et la créatinine plasmatique (C) pour les rats traités aux AA (n = 30).
2.3.2. Observations histologiques
2.3.2.1. Histologie conventionnelle
Créatinine plasmatique (µmol/l)
100
80
60
40
20
100
r = 0.81 (Spearman)
0
P < 0.0001
0 500 1000 1500 2000 2500
0
r = 0.50 (Spearman)
P = 0.0044
0 500 1000 1500 2000
NAG urinaire (mU/mmol créatinine)
NAG urinaire (mU/ mmol créatinine)
La coloration au PAS des coupes de tissu rénal des rats contrôles montre que
la bordure en brosse est préservée au niveau de la membrane apicale des tubules
proximaux et que la membrane basale est bien délimitée (Fig. 2.24A). Dès le premier
jour d’exposition aux AA, un gonflement des cellules tubulaires proximales est
observé (Fig. 2.24B). Ensuite, dès le deuxième jour de traitement aux AA, la
déstructuration de l’épithélium proximal progresse rapidement, la bordure en brosse
apicale disparaît partiellement et les débris cellulaires ainsi que les cellules
nécrotiques sont observées dans la lumière des tubules proximaux (Fig. 2.24C).
Albuminurie (mg/mmol créatinine)
800
700
600
500
400
300
200
131

Finalement, la perte de bordure en brosse est partielle ou complète au jour 3 (Fig.
2.24D) et devient complète aux jours 4 et 5 (Fig. 2.24E-F). L’épithélium tubulaire
proximal est totalement détruit, quelques cellules ou noyaux seulement restent
attachés à la membrane basale et la lumière tubulaire est remplie de débris
cellulaires et cellules nécrotiques provocant l’obstruction des tubules proximaux (Fig.
2.24E-F).
Ces observations sont compatibles avec une nécrose tubulaire aiguë précoce
décelée dès le deuxième jour d’administration des AA, devenant massive aux jours 4
et 5.
A: Contrôle – Jour 1 B: AA – Jour 1 C: AA – Jour 2
D: AA – Jour 3
#
#
*
E: AA – Jour 4
Figure 2.24. Coloration à l’acide periodique de Schiff (PAS) des coupes de rein de rats
contrôles au jour 1 (A) ainsi que de rats traités aux AA aux jours 1, 2, 3, 4 et 5 (B-F).
Gonflement de la cellule tubulaire (flèche), cellules nécrotiques (*), fragments cellulaires (#).
Grossissement 400 × pour A-F et 80 × pour G-H.
2.3.2.2. Immunomarquage de l’endopeptidase neutre
#
G: AA – Jour 4 (80 ×)
H: AA – Jour 5 (80 ×)
Afin d’examiner plus précisément la bordure en brosse des tubules proximaux,
le marquage immunohistochimique de la NEP est effectué sur les coupes de tissu
#
*
*
*
F: AA – Jour 5
#
*
#
*
*
132

énal. La NEP est présente sous forme granulaire à la bordure en brosse de la
membrane apicale des tubules proximaux chez les rats contrôles (Fig. 2.25A). De
même, la NEP est localisée de manière similaire chez les rats traités aux AA pendant
1 jour (Fig. 2.25B). Par contre, une disparition partielle ou totale du marquage de la
NEP s’observe aux jours 2 et 3 (Fig. 2.25C-D). Cette perte de NEP à la bordure en
brosse est complète aux jours 4 et 5 (Fig. 2.25E-F). Ces résultats confirment les
observations des coupes de tissu rénal colorées au PAS indiquant l’altération
morphologique de l’épithélium tubulaire proximal.
A: Contrôle – Jour 1 B: AA – Jour 1 C: AA – Jour 2
D: AA – Jour 3
E: AA – Jour 4
F: AA – Jour 5
G: AA – Jour 4 (200 ×)
H: AA – Jour 5 (200 ×)
Figure 2.25. Marquage immunohistochimique de l’endopeptidase neutre (NEP, flèche) sur
des coupes de rein de rats contrôles au jour 1 (A) ainsi que des coupes de rein de rats
traités aux AA aux jours 1, 2, 3, 4 et 5 (B-F). Grossissement 400 × pour A-F et 200 × pour G-
H.
Parallèlement à ces observations histologiques, la semi-quantification de ce
marquage est réalisée. Les tubules proximaux présentant le marquage de la NEP à
la bordure en brosse apicale sont considérés comme positifs. Par champ, les tubules
proximaux positifs pour la NEP sont comptés et leur nombre est rapporté à la
quantité totale de tubules. Cette analyse montre que le nombre de tubules proximaux
positifs pour le marquage NEP est significativement diminué à partir du 2 ème jour
d’exposition aux AA et évolue graduellement jusqu’au 5 ème jour (Fig. 2.26).
133

Tubules proximaux NEP positifs (%)
100
80
60
40
20
0
Contrôle
AA
1 2 3
Temps (jours)
4 5
Figure 2.26. Evaluation semi-quantitative du nombre de tubules proximaux positifs pour le
marquage de la NEP à la bordure en brosse pour les rats contrôles (colonne grise) et traités
aux AA (colonne noire) aux jours 1, 2, 3, 4 et 5. Les résultats représentent la moyenne ±
SEM (n = 6). La signification statistique correspond à *** P < 0,0001 par comparaison aux
valeurs contrôles.
2.3.3. Détection des adduits d’ADN spécifiques aux acides
aristolochiques dans le cortex rénal
***
L’analyse quantitative des adduits d’ADN spécifiques aux AA montre que les
trois spots majeurs d’adduits d’ADN sont détectés dès le premier jour d’exposition
aux AA et leur quantité est doublée au 2 ème jour (Fig. 2.27). Le taux total de ces
adduits atteint un niveau maximum à partir du 2 ème jour et reste stable au cours de ce
protocole. Le taux total maximum des adduits d’ADN spécifiques aux AA correspond
à celui observé dans le protocole de 35 jours (Fig. 2.10).
Les corrélations entre le taux total (somme des 3 spots) d’adduits d’ADN
spécifiques aux AA et les paramètres biologiques sont établies à l’aide des données
biochimiques individuelles pour chaque temps. La quantité d’adduits d’ADN est
corrélée avec l’enzymurie NAG. Cette corrélation est également étroite avec la
protéinurie totale, l’albuminurie et la créatinine plasmatique (Fig. 2.28). Ces résultats
suggèrent que le dysfonctionnement de la cellule tubulaire et, dans une moindre
mesure, l’intégrité de la cellule sont étroitement corrélés au degré d’intoxication induit
par les AA.
***
***
***
134

Adduits par 10 8 Adduits par 10 nucléotides normaux
8 nucléotides normaux
1200
1000
800
600
400
200
0
Spot 1 (dA-AAI)
Spot 2 (dG-AAI)
Spot 3 (dA-AAII)
**
1 2 3 4 5
Temps (jours)
Figure 2.27. Quantité d’adduits d’ADN spécifiques aux AA détectés dans le cortex rénal des
rats traités aux AA aux jours 1, 2, 3, 4 et 5. Les résultats représentent la moyenne ± SEM (n
= 6). Chaque échantillon d’ADN est post-marqué une seule fois. Spot 1 : 7-déoxyadénosine-
N 6 -yl)-aristolactame I (dA-AAI : colonne noire), spot 2 : 7-(déoxyguanosine-N 2 -yl)aristolactame
I (dG-AAI : colonne hachurée) et spot 3 : 7-(déoxyadénosine-N 6 -yl)aristolactame
II (dA-AAII : colonne grise). La signification statistique correspond à ** P < 0,01
par comparaison aux valeurs du jour 1.
NAG urinaire (mU/mmol créatinine)
Albumine urinaire (mg/mmol créatinine)
3000
2500
2000
1500
1000 1000
500
r = 0.61 (Spearman)
P = 0.0004
0
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
800
700
600
500
400
300
200
100
Adduits totaux par 10 8 Adduits totaux par 10 nucléotides normaux
8 nucléotides normaux
Figure 2.28. Corrélations entre la quantité totale (somme des 3 spots) d’adduits d’ADN
spécifiques aux AA et l’enzymurie NAG (A), la protéinurie totale (B), l’albuminurie (C) et la
créatinine plasmatique (D) pour les rats traités aux AA (n = 30).
**
Protéines urinaires (mg/mmol créatinine)
Créatinine plasmatique (µmol/l)
800
A B
C
r = 0,75 (Spearman)
P < 0.0001
0
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
Adduits totaux par 10 8 Adduits totaux par 10 nucléotides normaux
8 nucléotides normaux
600
400
200
** **
r = 0.68 (Spearman)
P < 0.0001
0
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
120
100
80
60
40
D
Adduits totaux par 10 8 Adduits totaux par 10 nucléotides normaux
8 nucléotides normaux
20
0
r = - 0.69 (Spearman)
P < 0.0001
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
Adduits totaux par 10 8 Adduits totaux par 10 nucléotides normaux
8 nucléotides normaux
135

2.4. Protocole destiné à des études histologiques
particulières : rats traités pendant 10 jours
Les données biologiques et histologiques présentées montrent que la
structure et la fonction de l’épithélium apical des tubules proximaux sont altérées. Un
protocole destiné à récolter des échantillons histologiques est réalisé afin d’une part
d’étudier en immunohistochimie l’effet des AA sur l’expression de la mégaline et de
la cubiline, deux protéines impliquées dans le processus d’endocytose médiée par
récepteur et d’autre part d’observer en microscopie électronique les premières
modifications cellulaires induites par les AA (Fig. 2.29).
Acclimatation
J -7
Figure 2.29. Schéma de la procédure suivie durant le protocole destiné à des études
histologiques particulières (rats traités pendant 10 jours).
2.4.1. Paramètres biologiques
PERIODE D’INJECTION
(10 mg/kg AA ou solvant, 1 fois/ jour)
0 1 2 3
4 7 10
Jours de sacrifice (n = 3 rats / groupe)
La mesure de l’excrétion des protéines urinaires confirme les résultats
obtenus précédemment. En effet, la protéinurie totale augmente à partir du jour 2
jusqu’au jour 4 et finalement diminue jusqu’au jour dix chez les rats traités aux AA.
Par contre, chez les rats contrôles, la quantité des protéines urinaires excrétées
reste stable au cours du temps. Les données obtenues correspondent aux
observations précédentes et indiquent que les échantillons prélevés pour l’histologie
sont représentatifs des altérations tubulaires proximales induites par les AA.
136

2.4.2. Immunomarquages de la mégaline et de la cubiline
Les marquages de la mégaline et de la cubiline sont réalisés afin d’obtenir des
informations complémentaires concernant l’atteinte fonctionnelle des tubules
proximaux.
Le marquage de la mégaline s’observe à la bordure en brosse des tubules
proximaux pour les rats contrôles. Ce marquage est plus intense au niveau des
tubules proximaux des segments S1 et S2 que du segment S3 (Fig. 2.30A & I). Chez
les rats traités aux AA, l’expression de la mégaline au niveau du tissu rénal est
partiellement ou totalement diminuée uniquement pour les tubules proximaux du
segment S3 à partir du jour 2 jusqu’au jour 10 (Fig. 2.30 B-D). Par contre, le
marquage de la mégaline n’est pas altéré pour les segments S1 et S2.
A: Contrôle – Jour 4
Mégaline
B: AA – Jour 2 C: AA – Jour 4
D: AA – Jour 10
E: Contrôle – Jour 4 F: AA – Jour 2 G: AA – Jour 4
H: AA – Jour 10
I: Contrôle – Jour 4
Mégaline
Cubiline
J: Contrôle – Jour 4
Cubiline
Figure 2.30. Marquages immunohistochimiques de la mégaline (A-D & I) et de la cubiline (E-
H & J) chez les rats contrôles (A & E, flèche) et les rats traités aux AA aux jours 2 (B & F), 4
(C & G) et 10 (D & H). Grossissement 400 × de A à H et 80 × de I à J.
137

Le marquage de la cubiline est également plus intense à la membrane apicale
des tubules proximaux des segments S1 et S2 qu’au niveau du segment S3 chez les
rats contrôles (Fig. 2.30E & J). L’expression de la cubiline chez les rats exposés aux
AA est réduite au niveau de l’épithélium apical de quelques ou plusieurs tubules
proximaux du segment S3 à partir du jour 2 jusqu’au jour 10. Par contre, le
marquage n’est pas modifié pour les segments tubulaires proximaux S1 et S2 (Fig.
2.30F-H).
Ces résultats indiquent donc que l’altération de la réabsorption des protéines
est notamment liée à l’absence de la mégaline et de la cubiline au niveau de
l’épithélium apical des tubules proximaux du segment S3.
2.4.3. Microscopie électronique : résultats préliminaires
L’étude en microscopie électronique est réalisée afin d’obtenir des
informations sur les premières lésions cellulaires induites par les AA. Tenant compte
des résultats obtenus dans les protocoles précédents, le jour 2 est choisi pour les
observations en microscopie électronique.
Chez un rat contrôle, l’ultrastructure d’une partie du cortex rénal montre la
présence de trois tubules proximaux et d’un tube distal. Le tube distal se distingue
des tubules proximaux par l’absence de bordure en brosse, une lumière plus large et
un contenu en organites cytoplasmiques moins important (Fig. 2.31A). L’organisation
du contenu cytoplasmique et de la structure de la bordure en brosse permettent de
différencier les 3 segments proximaux (voir le chapitre introduction § 2.1, pages 21-
22 et Fig. 7). Dans le segment S1, les mitochondries sont plus grandes et plus
nombreuses et la bordure en brosse est plus longue que dans le segment S2. Dans
le segment S3, les mitochondries sont beaucoup plus dispersées et moins
nombreuses que dans les segments S1 et S2 (Fig. 2.31A).
Chez ce rat contrôle, les tubes proximaux présentent une membrane basale
régulière et une bordure en brosse à la membrane apicale. La bordure en brosse des
cellules tubulaires proximales est constituée de microvillosités qui remplissent la
lumière des tubules. Un grand nombre de vacuoles d’endocytose sont présentes au
138

niveau de l’épithélium apical. Ces vacuoles sont vides (de couleur blanche) ou
remplies de matériel protéique. Au niveau de la membrane basale, des petites
vacuoles s’observent également. Les lysosomes, contenus dans le cytoplasme, se
distinguent par leur couleur noire ou grise en fonction du matériel qu’ils renferment
(Fig. 2.31). Une cellule du segment S3 est présentée à la figure 2.31B ainsi qu’une
bordure en brosse à la figure 2.31C.
A (× 1100)
BB
S1
D
S2
BB
S3
B (× 4400)
Figure 2.31. Microscopie électronique obtenue chez un rat contrôle au jour 2.
A: Trois tubules proximaux (segment S1, S2 et S3) et un tube distal (D). B: Cellule tubulaire
proximale du segment S3. C: Microvillosités de la bordure en brosse (BB).
Les grossissements sont indiqués entre parenthèses.
Chez un rat traité pendant 2 jours aux AA, les cellules tubulaires proximales
sont désorganisées, elles possèdent une membrane basale moins régulière que
celle du rat contrôle. La membrane basale apparaît dénudée à certains endroits (Fig.
2.32A). La perte totale ou partielle des microvillosités de l’épithélium apical s’observe
au niveau des tubules proximaux endommagés (Fig. 2.32A-B). Les vacuoles
d’endocytose sont moins nombreuses et plus petites pour l’ensemble des tubules
proximaux par comparaison avec le contrôle. La lumière tubulaire contient du
matériel protéique, des débris cellulaires et des cellules desquamées en apparence
viable (Fig. 2.32C). La figure 2.32D montre une cellule tubulaire qui déverse son
contenu cellulaire dans la lumière tubulaire.
BB
C (× 7000)
BB
139

A (× 1100)
C (× 3000)
BB
BB
DC
DC
B (× 4400)
D (× 3000)
Figure 2.32. Microscopie électronique obtenue chez un rat traité aux AA pendant 2 jours.
A: Tubules proximaux altérés avec perte de bordure en brosse (BB) et présence de débris
cellulaires (DC) dans la lumière du tubule. B: Cellules tubulaires désorganisées avec perte
de la bordure en brosse. C: Cellules tubulaires contenant des débris cellulaires dans la
lumière tubulaire. D: Cellule tubulaire éclatée avec perte de son contenu dans la lumière. Les
grossissements sont indiqués entre parenthèses.
Ces résultats préliminaires obtenus en microscopie électronique confirment
que la structure cellulaire des tubules proximaux est déjà altérée après 2 jours
d’intoxication aux AA. Ces données authentifient donc les anomalies structurelles et
fonctionnelles observées dans les protocles précédents.
BB
DC
BB
BB
140

CHAPITRE 5 : DISCUSSION ET CONCLUSIONS
Les approches in vitro et in vivo de ce travail permettent d’explorer les
évènements précoces de l’intoxication des cellules tubulaires par les AA.
1. Discussion et conclusion de l’approche in vitro
Endocytose de protéines médiée par récepteur dans les cellules OK
L’étude sur la lignée cellulaire de rein d’opossum confirme que l’albumine et la
β2-microglobuline sont réabsorbées dans les cellules OK par endocytose médiée par
récepteur (Fig. 1.1 et Tableau 1.1) [Gekle M. et al., 1996; Schwegler J.S. et al.,
1991]. Ces deux protéines sont en compétition pour le même récepteur membranaire
(Fig. 1.3) ; de plus, l’endocytose d’albumine entre également en compétition avec
plusieurs autres protéines (Fig. 1.2). La majorité des protéines testées sont décrites
comme des ligands de la mégaline et de la cubiline (Tableau 2). Ceci suggère que la
réabsorption de ces différentes protéines dans les cellules OK s’effectue par
l’intermédiaire d’un complexe impliquant la mégaline et la cubiline, complexe localisé
au niveau de la bordure en brosse des cellules épithéliales du tubule proximal [Birn
H. et al., 2000a; Christensen E.I. et al., 1998; Cui S. et al., 1996] mais également
présent dans les cellules OK [Zhai X.Y. et al., 2000]. L’analyse immunoblot ainsi que
l’observation de l’immunomarquage confirment que la mégaline est exprimée dans
les cellules OK et localisée à la membrane cellulaire (Fig. 1.17 et Fig. 1.18). De plus,
les observations en microscopie confocale réalisées après incubation en présence
d’albumine-FITC montrent que l’albumine est colocalisée avec la mégaline dans un
premier temps à la membrane plasmique des cellules et ensuite dans les vésicules
intracellulaires (Fig. 1.17).
141

Inhibition de la réabsorption des protéines et réversibilité de l’inhibition
Comme le but recherché était d’obtenir spécifiquement les premiers signes de
la toxicité des AA dans des cellules en culture sans une exposition prolongée à
l’agent toxique, les cellules OK ont été exposées à des doses assez fortes d’AA
pendant 24 h. Par conséquent, la dose d’AA utilisée dans cette étude est
approximativement de l’ordre d’une fois plus élevée que celle absorbée
quotidiennement par les patientes atteintes de la CHN [Vanherweghem J.L. et al.,
1993]. Cette exposition est reflétée par la détection d’adduits d’ADN spécifiques aux
AA. D’autres indications semblent suggérer que les AA se concentrent dans la cellule
tubulaire proximale par l’intermédiaire d’un transporteur d’anions organiques au
niveau de la membrane basale (OAT1) qui échange des anions organiques comme
le PAH (et AA) avec l’α-kétoglutarate [Hosoyamada M. et al., 1999]. Ce mécanisme
de transport est lié au cotransport Na + /α-kétoglutarate localisé en parallèle et
concentre les AA dans la cellule tubulaire proximale.
L’exposition des monocouches de cellules OK pendant 24 h aux AA ou au
CdCl2 inhibe la réabsorption d’albumine (Fig. 1.9) ; le mécanisme d’endocytose de la
réabsorption des protéines est altéré de la même manière pour les deux conditions
expérimentales (Fig. 1.4 et Fig. 1.7).
Les effets observés suite à l’exposition des cellules aux AA ou au CdCl2 ne
proviennent pas d’une toxicité non spécifique puisque la morphologie cellulaire n’est
apparemment pas modifiée (Fig. 1.11) ; de même, la viabilité cellulaire (Fig. 1.12 et
Fig. 1.13) et la synthèse des protéines (Fig. 1.14) semblent ne pas être altérées.
De plus, l’absence d’inhibition du co-transport Na + /glucose (Fig. 1.15 et Tableau 1.2)
suggère que la faible concentration intracellulaire de Na + est maintenue, dès lors la
Na + /K + -ATPase reste certainement active dans les cellules OK qui ont été exposées
aux AA ou au CdCl2.
L’inhibition de la réabsorption d’albumine pourrait provenir d’une altération de
l’interaction entre le ligand et le récepteur à la surface cellulaire, d’une formation
réduite de vésicules recouvertes d’un manteau de clathrine, d’anomalies de la
circulation des vésicules intracellulaires, d’une réduction de la dissociation entre le
ligand et le récepteur dans l’endosome, ou de changements dans le processus de
fusion entre l’endosome et le lysosome. Les inhibitions induites par les AA et le
142

CdCl2 sont caractérisées par une réduction de la vitesse maximale (Vmax) sans
modification des valeurs de l’affinité apparente (Km), indiquant que les AA et le CdCl2
diminuent le nombre de récepteurs recyclés capables d’internaliser les protéines de
faible poids moléculaire. Ceci correspond en réalité à une réduction de la quantité de
récepteurs à la membrane plasmique, de leur internalisation ou de leur recyclage,
sans changement de leur affinité (Tableau 1.1).
Cependant, une différence frappante entre les AA et le CdCl2 est observée
lorsque la réversibilité de l’inhibition est examinée (Fig.1.10). Quand les AA sont
retirés du milieu de culture et que la période d’incubation est prolongée jusqu’à 6
jours, la réabsorption d’albumine reste inhibée, suggérant une altération permanente
du mécanisme d’endocytose. Par contre, le retrait du CdCl2 conduit à une
récupération progressive, mais incomplète de la réabsorption des protéines pendant
la période de récupération de 6 jours. Donc, contrairement aux AA, le CdCl2 n’induit
pas une altération permanente de la réabsorption des protéines dans les cellules OK.
Comme les cellules tubulaires concentrent et excrètent des xénobiotiques par
différents mécanismes [Burckhardt G. et al., 2000], d’autres médicaments pris
simultanément par les patientes atteintes de la CHN pourraient éventuellement
influencer l’accumulation intracellulaire des AA. Cependant, les principaux composés
contenus dans les gélules amaigrissantes (fenfluramine, diéthylproprion,
acétazolamide), en présence ou non d’AA, ne modifient pas la réabsorption
d’albumine (Fig. 1.19), suggérant que seuls les AA altèrent l’endocytose des
protéines dans les cellules OK.
Néphrotoxicité du cadmium et inhibition transitoire de l’endocytose
Une caractéristique principale de la néphropathie induite par le cadmium est la
réduction de la capacité de réabsorption du tubule proximal, se manifestant par une
protéinurie, une phosphaturie, une glucosurie, une aminoacidurie et une polyurie
hyperosmolaire [Adams R.G. et al., 1969; Ahn D.W. et al., 1995; Herak-Kramberger
C.M. et al., 1996; Herak-Kramberger C.M. et al., 1998; Kim K.R. et al., 1990; Lee
H.Y. et al., 1991; Thevenod F. et al., 1999]. Le cadmium interfère avec différents
composés de cellules épithéliales incluant la dépolymérisation des microtubules
[Sabolic I. et al., 2001; Sabolic I. et al., 2002] et l’inhibition de la Na + /K + -ATPase
143

[Thevenod F. et al., 1999]. De plus, le cadmium diminue fortement l’activité et la
quantité de H + -ATPase vacuolaire à la membrane apicale du tubule proximal, et
dissipe les gradients de pH transmembranaires dans les vésicules d’endocytose du
cortex rénal de rat. Ces effets peuvent induire une diminution de l’endocytose ainsi
qu’une perte des invaginations d’endocytose et des vésicules subapicales dans les
cellules tubulaires proximales. L’altération du processus d’endocytose peut être à
l’origine d’une diminution de la réabsorption des microprotéines filtrées. Il en résulte
une protéinurie tubulaire, et/ou une perturbation du recyclage des vésicules
intracellulaires, conduisant à une perte de certains transporteurs spécifiques au
niveau de la bordure en brosse [Herak-Kramberger C.M. et al., 1998].
L’inhibition de l’acidification intravésiculaire induite par le cadmium dans les
vésicules d’endocytose est complètement restaurée, suggérant un effet réversible du
cadmium sur la H + -ATPase vacuolaire [Herak-Kramberger C.M. et al., 1998].
Une autre étude réalisée par Choi et collaborateurs montre qu’une exposition
des monocouches de cellules OK à 100 µM de CdCl2 pendant 1 h inhibe
l’endocytose de l’albumine médiée par récepteur en réduisant le nombre de sites de
liaison sans changement d’affinité pour la liaison du ligand, ni de dépendance au pH.
Ces résultats suggèrent que l’inhibition est probablement due à une atteinte de
l’acidification des endosomes et à une diminution de la dissociation entre le ligand et
le récepteur, altérant le recyclage du récepteur et l’efficacité globale du processus
d’endocytose [Choi J.S. et al., 1999].
Inhibition irréversible de l’endocytose induite par les acides aristolochiques
L’absence de récupération suite à l’exposition aux AA suggère que l’effet
toxique est lié à une diminution prolongée d’une ou plusieurs protéines impliquées
dans l’endocytose médiée par récepteur. Une telle toxicité pourrait être mise en
évidence en mesurant la synthèse totale des protéines. Néanmoins, cet effet ne
représenterait qu’un faible pourcentage de la quantité totale des protéines mesurées.
Toutefois, l’évaluation de l’expression de la mégaline par analyse immunoblot dans
les cellules exposées aux AA présente une diminution significative (~ 70 %) par
rapport aux cellules exposées au DMSO (Fig. 1.18). Notons qu’une étude
préliminaire montre que l’effet des AA sur l’expression de la mégaline s’observerait
également pour d’autres protéines impliquées dans le processus d’endocytose
144

médiée par récepteur comme la cubiline et le canal chlore ClC-5 localisé dans les
endosomes. L’expression de ces deux protéines est diminuée après exposition aux
AA (voir Annexe 2, page 164) [Lebeau C. et al., 2003]. Par contre, les AA ne
semblent pas modifier l’expression de la H + -ATPase vacuolaire [Lebeau C. et al.,
2002].
Adduits d’ADN spécifiques aux acides aristolochiques
Les 3 spots caractéristiques des adduits d’ADN spécifiques aux AA sont
observés dans les cellules OK exposées aux AA (Fig. 1.16), mais pas dans les
cellules contrôles, ni celles exposées au CdCl2. Le taux d’adduits d’ADN spécifiques
aux AA augmente avec la concentration d’AA, reste stable 24 h après le retrait des
AA et est toujours élevé après la période de 6 jours de récupération (Tableau 1.3).
Ces observations sont en accord avec la persistance des adduits d’ADN spécifiques
des AA dans différents organes de rats exposés aux AA [Bieler C.A. et al., 1997] et
dans les tissus de patientes atteintes de CHN terminale [Nortier J.L. et al., 2000].
L’inhibition de la réabsorption de protéines par les monocouches de cellules
OK nécessite une incubation prolongée en présence des AA pendant au moins 14 h ;
les adduits d’ADN spécifiques aux AA sont déjà détectés à ce temps. De plus, ces
deux altérations sont dose-dépendantes de manière similaire et persistent pendant la
période de récupération en absence des AA. Pour cette raison, il est tentant de
suggérer l’existence d’une relation causale entre l’exposition aux AA, les dommages
spécifiques de l’ADN, et les altérations cellulaires spécifiques au taux de
transcription, particulièrement au niveau de la diminution de la synthèse de la
mégaline.
Le métabolisme des AA est différent selon les espèces comme décrit pour les
mammifères [Krumbiegel G. et al., 1987]. Chez l’homme, les métabolites urinaires
sont l’aristolactame I et II, correspondant respectivement à l’AAI et AAII, provenant
de la formation d’un cycle monoamide (lactame). Notons que les adduits d’ADN
spécifiques aux AA, dérivés des aristolactames I et II, sont semblables chez l’homme
et les cellules OK, suggérant un métabolisme comparable dans les cellules
tubulaires proximales et OK.
145

Conclusion
Une exposition transitoire des cellules OK, utilisées en tant que modèle des
cellules épithéliales tubulaires proximales, aux AA ou au CdCl2 inhibe le mécanisme
d’endocytose de réabsorption des protéines. Cependant, alors que l’exposition au
CdCl2 mène à un effet transitoire, l’exposition aux AA aboutit à une altération
permanente de l’endocytose d’albumine sans signe de récupération même après six
jours de retrait. Les AA induisent également dans les cellules OK la formation
d’adduits d’ADN spécifiques aux AA ainsi qu’une diminution significative de
l’expression de la mégaline, un récepteur impliqué dans l’endocytose d’albumine.
Cependant, le lien entre ces deux phénomènes n’est pas établi.
En conclusion, ces résultats suggèrent que la diminution de l’expression de la
mégaline explique, du moins en partie, l’inhibition de la réabsorption des protéines à
la bordure en brosse des cellules tubulaires proximales.
146

2. Discussion et conclusion de l’approche in vivo
Modèles expérimentaux animaux de la néphropathie aux acides
aristolochiques
L’établissement d’un modèle expérimental de néphropathie aux AA
reproduisant la CHN chez l’animal ne fut pas évident. Précédemment, la
néphrotoxicité aiguë aux AA a été induite expérimentalement par voie orale ou
intraveineuse. Après l’administration d’une seule dose d’AA (oral : 120-300 mg/kg et
intraveineux : 38-110 mg/kg) à des rats, une nécrose tubulaire sévère a été observée
en quelques jours [Mengs U., 1987]. Des rats traités par les AA (oral : 10-100 mg/kg)
présentent endéans les 3 jours une augmentation du taux de créatinine plasmatique,
de protéines urinaires et de l’enzymurie NAG [Mengs U. et al., 1993]. L’insuffisance
rénale chronique et la fibrose interstitielle en association à l’altération de l’épithélium
tubulaire proximal ont été induites pour la première fois chez des lapins blancs New
Zealand par l’injection intra-péritonéale d’AA (0,1 mg/kg, 5 jours/semaines, pendant
17-21 mois) [Cosyns J.P. et al., 2001]. Dans le modèle de rat utilisé dans ce travail,
les lésions caractéristiques de la CHN, à savoir l’insuffisance rénale, l’atrophie
tubulaire et la fibrose interstitielle, ont été reproduites par l'injection sous-cutanée
d’AA (10 mg/kg/jour) pendant 35 jours à des rats Wistar mâles [Debelle F.D. et al.,
2002]. Etant donné les altérations tubulaires proximales précoces dans les modèles
expérimentaux, les auteurs suggèrent la possibilité que la fibrose interstitielle rénale
soit précédée d’un dysfonctionnement tubulaire aigu [Cosyns J.P. et al., 2001;
Debelle F.D. et al., 2002].
Modèle de rat de la néphropathie aux acides aristolochiques : dose et études
préliminaires
La pertinence du modèle ainsi que la dose d’AA utilisée sont déjà explicitées
dans l’étude expérimentale initiale [Debelle F.D. et al., 2002]. Le choix de la dose
d’AA est basé sur l’observation clinique des patientes atteintes de la CHN [Nortier
J.L. et al., 2000; Vanhaelen M. et al., 1994; Vanherweghem J.L. et al., 1993]. La
quantité totale d’AA ingérée par certaines patientes était de 10 mg/kg de poids
corporel, représentant une dose journalière de 0,29 mg d’AA/kg de poids corporel
pendant 35 jours. La dose d’AA choisie dans le modèle expérimental est dès lors 30
147

fois supérieure à celle des patientes atteintes de la CHN. La dose utilisée semble
cruciale au développement de la néphrotoxicité. En effet, l’injection aux rats de 1
mg/kg d’AA à la place de 10 mg/kg n’induit pas le développement de l’insuffisance
rénale et de la fibrose interstitielle [Debelle F.D. et al., 2002].
Au moment d’établir le modèle de rat de la néphropathie aux AA, des
expériences préliminaires montraient déjà une augmentation progressive des
paramètres urinaires et de la créatinine plasmatique dans les rats contrôles [Debelle
F.D. et al., 2002]. Ces observations peuvent être mises en relation avec la
croissance des animaux plutôt qu’à une toxicité éventuelle de la solution utilisée pour
dissoudre les AA. En effet, les rats qui ont reçu des injections d’eau ou de la solution
de PEG ne présentent pas d’altération des paramètres biochimiques et les
échantillons de tissus rénaux sont normaux du point de vue histologique.
Rats traités aux acides aristolochiques pendant 35 jours
L’étude des atteintes tubulaires proximales dans le modèle expérimental de
rat de la néphropathie aux AA montre que les AA induisent une augmentation de la
créatinine plasmatique au jour 35 (Tableau 2.1), suggérant le développement d’une
insuffisance rénale comme décrit précédemment [Debelle F.D. et al., 2002].
Dès le jour 3, l’enzymurie NAG est augmentée et devient significative au jour
10, reflétant une perte de l’intégrité des cellules rénales (Tableau 2.1). De même, à
partir du jour 7, les rats deviennent polyuriques (Tableau 2.1) ; parallèlement, une
protéinurie de type tubulaire est observée, reflétant une altération de la réabsorption
des protéines (Figure 2.2). L’analyse des protéines urinaires indique que l’albumine
ainsi que des protéines de haut poids moléculaire sont excrétées durant les premiers
jours, suivies de la libération de protéines de faible poids moléculaire à partir du jour
10, suggérant l’altération de la fonction des cellules tubulaires proximales (Tableau
2.2 et Figure 2.3).
Dans des conditions physiologiques normales, la filtration et la réabsorption
d’albumine sont en équilibre et moins de 1% de l’albumine filtrée se retrouve dans
l’urine définitive. Les états pathologiques caractérisés par une augmentation de
l’excrétion d’albumine peuvent provenir de deux dysfonctionnements distincts (mise
à part une surproduction pathologique de protéines) : soit une augmentation de la
quantité filtrée par hyperperméabilité glomérulaire avec capacité de liaison à la
membrane de la bordure en brosse dépassée (albuminurie d’origine glomérulaire),
148

soit une capacité de réabsorption réduite sans changement de la quantité d’albumine
filtrée (albumiurie d’origine tubulaire).
Des corrélations sont établies entre un paramètre structurel, l’enzymurie NAG,
et des données fonctionnelles, comme la protéinurie, l’albuminurie et la créatinine
plasmatique (Fig. 2.4). Cette relation structure-fonction est confirmée par les
corrélations existantes entre les scores histologiques de l’atteinte tubulo-interstitielle
et les paramètres biochimiques fonctionnels comme la protéinurie (r = 0,77 ; n = 36 ;
P < 0,0001), la créatinine plasmatique (r = 0,68 ; n = 36 ; P < 0,0001) et structurels
comme l’enzymurie NAG (r = 0,66 ; n = 36 ; P < 0,0001). Les scores d’atrophie
tubulaire sont aussi en étroite corrélation avec la protéinurie (r = 0,76 ; n = 36 ; P <
0,0001), la créatinine plasmatique (r = 0,69 ; n = 36 ; P < 0,0001) et l’enzymurie NAG
(r = 0,52 ; n = 36 ; P = 0,0002). Ces observations suggèrent que la perte d’intégrité
cellulaire reflète l’atrophie progressive de l’épithélium tubulaire et que les atteintes
structurelles des cellules tubulaires entraînent des altérations fonctionnelles.
Les observations histologiques (PAS, Fig. 2.7 et immunomarquage NEP, Fig.
2.8) montrent une perte de la bordure en brosse de l’épithélium tubulaire proximal du
jour 7 au jour 35. Ces résultats suggèrent que les altérations tubulaires proximales
sont donc liées à la disparition de la bordure en brosse. Les lésions morphologiques
commencent par une phase de nécrose, suivie par l’apparition progressive d’une
atrophie tubulaire accompagnée par une fibrose interstitielle (Fig. 2.9).
L’ensemble des résultats histologiques et biochimiques indiquent que
l’administration des AA induit une altération précoce de l’épithélium tubulaire
proximal.
L’analyse plus détaillée des paramètres urinaires suivis pendant 35 jours
montre que la protéinurie totale ainsi que les enzymuries NAG, α-GST, LAP et NEP
augmentent déjà durant les 3 premiers jours de l’intoxication aux AA, retournent à
des taux de base, et finalement s’élèvent à nouveau (Fig. 2.13-2.15). Ces résultats
suggèrent que les atteintes tubulaires fonctionnelles et structurelles se déroulent en
deux phases : une phase aiguë précoce et une phase d’installation des lésions
chroniques.
149

Les différences dans la conception des deux protocoles longs (rats traités
pendant 35 jours) doivent être prises en considération pour expliquer l’absence
d’évolution biphasique dans le premier protocole long. Dans une première série
d’expériences, les échantillons d’urines sont récoltés à des temps fixes avant le
sacrifice de l’animal (jours : 3, 5, 7, 10, 14, 18 et 35 ; Fig. 2.1). Par contre, dans une
deuxième série d’expériences, les récoltes d’urines individuelles sont analysées plus
régulièrement tout au long du protocole (jours : 0, 3, 5, 7, 10, 13, 15, 18, 22, 24, 27,
31 et 35 ; Fig. 2.11). En plus de l’hétérogénéité entre les échantillons provenant
d’animaux différents d’un temps à l’autre, la probabilité de manquer des pics
d’enzymurie et microprotéinurie est beaucoup plus grande aux temps déterminés du
protocole long que lors du suivi de l’évolution individuelle au cours du temps.
Rats traités aux acides aristolochiques pendant 5 jours
Le dysfonctionnement précoce de l’épithélium tubulaire proximal est reflété
par la mise en évidence d’une protéinurie tubulaire (Fig. 2.20A) et d’une albuminurie
(Fig. 2.20B) après un seul jour d’administration des AA. De même, l’altération
structurelle se décèle dès le 2 ème jour de traitement aux AA par l’augmentation de
l’enzymurie NAG (Fig. 2.22). L’enzymurie NAG est en étroite corrélation avec la
protéinurie, l’albuminurie et la créatinine plasmatique (Fig. 2.23).
En accord avec les données biochimiques, les observations histologiques
consistent en un gonflement des cellules après le premier jour d’injection des AA,
une perte progressive de la bordure en brosse dès le 2 ème jour, suivi 3 jours plus tard
d’une nécrose (Fig. 2.24). La nécrose tubulaire provoque l’obstruction transitoire des
tubules proximaux laquelle induit probablement une rétro-filtration entraînant
l’augmentation de la pression au niveau du filtre glomérulaire avec passage
d’albumine en grande quantité. Une réduction de l’immunomarquage de la NEP
s’observe au niveau du segment S3 du tubule proximal (Fig. 2.25-2.26). Cet enzyme
est, en effet, localisée dans la partie droite (pars recta) du tubule proximal [Ronco P.
et al., 1988]. De plus, l’expression de la mégaline et de la cubiline, deux récepteurs
impliqués dans l’endocytose médiée par récepteur, sont également réduites
précocement (au jour 2) au niveau de l’épithélium apical du segment S3 (Fig. 2.30).
La progression du processus d’atrophie tubulaire est tellement sévère que des
150

études par immunomarquage de la mégaline et de la cubiline au-delà du jour 10 ne
sont pas justifiées.
La présence de lésions structurelles précoces est également confirmée par
l’altération de la structure cellulaire des tubules proximaux observée en microscopie
électronique après 2 jours d’intoxication aux AA (Fig. 2.32).
Nos observations histologiques sont en accord avec les descriptions faites
dans la littérature. D’un point de vue histologique, les lésions structurelles de
l’épithélium tubulaire proximal associées à une insuffisance rénale aiguë sont
connues pour être d’origine ischémique ou toxique. Les cellules épithéliales du
tubule proximal appartenant au segment S3 présentent des changements
morphologiques précoces caractéristiques incluant la formation de vésicules à la
membrane apicale, avec perte de la bordure en brosse [Bonventre J.V. et al., 2003].
Adduits d’ADN spécifiques aux acides aristolochiques
Les signes précoces d’atteintes sont liés à une intoxication rapide et intense
des cellules. En effet, les adduits d’ADN spécifiques aux AA sont détectés dès le 1 er
jour et atteignent un niveau maximum à partir du 2 ème jour (Fig. 2.27), lequel reste
constant jusqu’au jour 35 (Fig. 2.10). La différence d’intensité des spots d’adduits
d’ADN (spot 1 : dA-AAI et spot 3 : dA-AAII) observés sur le profil chromatographique
des rats (Fig. 2.10) et des cellules OK (Fig. 1.16) s’explique par le métabolisme
propre à chaque espèce mais également par les proportions différentes d’acides
aristolochiques I et II contenus dans la préparation d’acides aristolochiques utilisée
pour l’étude in vivo (AAI 40 % et AAII 60 %) et l’étude in vitro (AAI 69 % et AAII 19
%).
Au cours des premiers jours d’intoxication, une augmentation significative de la
créatinine plasmatique est observée, suggérant un dysfonctionnement rénal précoce
(Fig. 2.18). De même, le taux d’adduits d’ADN spécifiques aux AA est corrélé avec
l’enzymurie NAG, la protéinurie, l’albuminurie et la créatinine plasmatique (Fig. 2.28).
Ces adduits d’ADN attestent de l’intoxication aux AA, et sont à mettre en parallèle
avec la sévérité des atteintes fonctionnelles et structurelles des cellules tubulaires
proximales.
151

Progression de l’atteinte rénale dans la néphropathie aux acides
aristolochiques
Une étude récente réalisée chez les rats montre qu’une insuffisance rénale
aiguë est présente après 5 jours de traitement par voie orale aux AA (4 mg/jour).
Cependant, une récupération de la fonction rénale s’observe après le retrait des AA
pendant 14 jours [Liu M.C. et al., 2003]. Des signes de régénération tubulaire sont
présents mais les dilatations tubulaires restent sévères. Dans une autre étude
utilisant des souris FVB, les injections intra-péritonéales quotidiennes d’AA (5 mg/kg
de poids corporel) pendant 2 semaines induisent une dégénérescence tubulaire et
une insuffisance rénale. La régénération de l’épithélium tubulaire accompagnée
d’une fibrose péri-tubulaire modérée s’observe 4 semaines après l’arrêt du traitement
aux AA [Okada H. et al., 2003].
Dans le modèle d’intoxication aux AA présenté dans ce travail, la progression vers
une insuffisance rénale chronique et la fibrose interstitielle observée après une
phase aiguë précoce est probablement liée à la poursuite des injections souscutanées
d’AA aux rats pendant 35 jours.
De manière intéressante, des observations similaires de nécrose tubulaire aiguë et
d’une insuffisance rénale aiguë ont été décrites récemment chez un patient après
l’ingestion d’AA pendant 10 jours [Lo S.H. et al., 2004].
L’évolution biphasique des altérations structurelles et fonctionnelles induites
par l’intoxication aux AA est en accord avec la capacité intrinsèque des cellules
épithéliales tubulaires survivantes à s’adapter à la perte de cellules adjacentes par
dédifférenciation et prolifération [Bonventre J.V., 2003]. En effet, contrairement à
d’autres organes comme le cœur ou le cerveau, le rein peut récupérer complètement
d’une atteinte aiguë d’origine ischémique ou toxique susceptible de conduire à la
défaillance totale et définitive de l’organe entier. Après une altération sévère, les
cellules viables et non viables sont desquamées, laissant la membrane basale
comme seule barrière entre l’ultrafiltrat et l’interstitium péritubulaire. Les débris
cellulaires s’accumulant dans la lumière tubulaire, induisent une obstruction
intratubulaire responsable de l’augmentation de la pression intratubulaire, processus
à l’origine de la rétro-filtration glomérulaire.
152

Conclusion
L’intoxication aux AA induit dans le modèle de rat de la néphropathie aux AA
une évolution biphasique des atteintes morphologiques et fonctionnelles au niveau
de l’épithélium tubulaire proximal. Les défauts de réabsorption par endocytose
médiée par récepteur et les anomalies structurelles du segment S3 du tubule
proximal sont précoces (dès les 3 premiers jours d’exposition aux AA), reflétant une
phase aiguë d’atteinte tubulaire proximale.
Ces observations pourraient expliquer le syndrome de Fanconi décrit dans certaines
formes d’intoxication aux AA chez l’homme [Krumme B. et al., 2001].
153

3. Conclusion générale et perspectives
Les deux approches, in vivo et in vitro, sont complémentaires mais comportent
chacune des limitations. Les cellules OK possèdent de nombreuses propriétés
communes avec le transport tubulaire ; cependant, elles présentent une très faible
quantité de microvillosités et n’expriment pas ou peu d’enzymes de la bordure en
brosse. Le modèle de rat de la néphropathie aux AA ne reste qu’un modèle animal,
et ne permet pas d’établir une correspondance stricte avec le tableau clinique
complexe présenté par les patientes atteintes de la CHN. Pour se rapprocher un peu
plus de l’homme, il serait intéressant de passer de la lignée de rein d’opossum à une
lignée tubulaire proximale humaine. Toutefois, il faudrait s’assurer que les cellules
humaines en culture possèdent les caractéristiques des cellules tubulaires
proximales, à savoir les différents systèmes de transport et la réponse aux
hormones, ainsi que le mécanisme d’endocytose médiée par récepteur impliquant la
mégaline et la cubiline.
Le seul mécanisme capable de médier la réabsorption de l’albumine est
l’endocytose. Dans le tubule proximal, l’albumine est réabsorbée de manière quasi
équivalente par le tubule proximal contourné et le tubule proximal droit ; la
réabsorption d’albumine s’effectue par endocytose médiée par les puits recouverts
d’un manteau de clathrine et non par d’autres voies comme l’endocytose médiée par
les cavéoles ou l’endocytose indépendante de la clathrine et des cavéoles
[Christensen E.I. et al., 1998].
L’altération de l’acidification des endosomes peut avoir des conséquences sur
la réabsorption d’albumine par endocytose. En effet, dans la maladie de Dent’s, une
déficience de la conductance du contre-ion vésiculaire ClC-5 conduit à une
protéinurie [Piwon N. et al., 2000; Wang S.S. et al., 2000]. Ce mécanisme semble
responsable de la protéinurie induite par le cadmium ou le cisplatine [Choi J.S. et al.,
1999; Herak-Kramberger C.M. et al., 1998; Takano M. et al., 2002]. Des changement
de la cinétique tubulaire peuvent également survenir dans la maladie rénale
polykystique autosomale dominante (ADPKD) où une perte de la machinerie
d’endocytose est observée [Obermuller N. et al., 2001]. En cas de contamination
alimentaire par l’ochratoxine A, une réduction du nombre de sites de liaison de
154

l’albumine à la membrane apicale ainsi qu’une augmentation de l’exocytose ont été
rapportées [Gekle M. et al., 1994]. Sur base d’études animales, le TGF-β1
(transforming growth factor β1) contribuerait à la protéinurie dans l’hypertension ou le
diabète, probablement en altérant l’activité lysosomale [Russo L.M. et al., 2002]. Sur
des cultures cellulaires, le TGF-β1 inhibe l’endocytose d’albumine en réduisant
l’expression de la mégaline et de la cubiline, ainsi qu’en diminuant l’internalisation et
la dégradation [Gekle M. et al., 2003].
Tout comme dans les cellules OK où l’expression de la mégaline est réduite
après exposition aux AA, l’administration des AA aux rats induit une diminution de
l’expression de la mégaline et de la cubiline. L’implication de la mégaline et de la
cubiline dans le processus d’endocytose concorde avec les études effectuées sur
des souris dont le gène pour la mégaline a été invalidé et sur des chiens déficients
en cubiline. Ces animaux présentent une réduction importante de la réabsorption
rénale des protéines [Birn H. et al., 2000a; Christensen E.I. et al., 2002].
L’ultrastructure des cellules tubulaires proximales des souris déficientes en mégaline
est caractérisée par une réduction significative du nombre de compartiments
cellulaires constituant l’appareillage d’endocytose au niveau apical (puits recouverts
d’un manteau de clathrine, vésicules d’endocytose et lysosomes), suggérant que la
mégaline est essentielle au maintien de l’activité normale d’endocytose tubulaire
proximale [Leheste J.R. et al., 1999]. Par contre, les chiens déficients en cubiline
semblent posséder des tubules proximaux normaux d’un point de vue de
l’ultrastructure incluant l’appareillage d’endocytose. Chez ces animaux, seule
l’albuminurie semblerait se développer [Abbate M. et al., 2001].
Les altérations du processus d’endocytose médiée par récepteur et donc les
atteintes fonctionnelles précoces induites par les AA pourraient s’expliquer par la
perte du phénotype différencié des cellules épithéliales du segment S3 du tubule
proximal. Cette perte du phénotype différencié se caractérise par la perturbation de
la bordure en brosse, le gonflement de la membrane apicale, la fragmentation et
l’internalisation, ainsi qu’un changement rapide de la polarité cellulaire [Molitoris B.A.
et al., 1988]. Des anomalies sont présentes dans le cytosquelette apical cortical :
délocalisation de l’actine de la membrane cellulaire apicale à la membrane latérale
155

[Brown D. et al., 1997; Molitoris B.A. et al., 1992]. La réduction de l’ATP cellulaire
lors d’atteintes tubulaires conduit à une augmentation de la concentration de calcium
cytosolique dans la cellule. En plus de son effet vasoconstricteur, le calcium peut
contribuer à la toxicité épithélium-cellule en induisant l’activation des protéases et
phospholipases, la rupture du cytosquelette et la perturbation du métabolisme de
l’énergie mitochondriale [Bonventre J.V., 1993]. La réduction d’ATP du segment S3
du tubule proximal conduit également à la perturbation des complexes de jonction
cellule-cellule [Abbate M. et al., 1994; Brown D. et al., 1997]. L’interruption des
jonctions serrées altère la perméabilité paracellulaire ainsi que la polarité cellulaire.
Le changement de polarité cellulaire a de multiples effets induisant un adressage
incorrect des protéines membranaires (Na + /K + -ATPase, intégrines).
La récupération rénale se déroule en étapes successives incluant la
prolifération des cellules épithéliales, dites pluripotentes, susceptibles de recouvrir
les zones dénudées de la membrane basale. La dédifférenciation et la prolifération
cellulaires permettent de rétablir le nombre de cellules. Ensuite, la différenciation
conduit au rétablissement de l’intégrité fonctionnelle du néphron [Thadhani R. et al.,
1996]. Lors de la dédifférenciation, la cellule épithéliale tubulaire proximale passe
d’un phénotype différencié à un phénotype moins différencié. Cette étape est très
importante pour la reconstruction de l’architecture tubulaire proximale. Cette phase
de récupération reprend beaucoup d’aspects du développement rénal : un grand
nombre de protéines fortement exprimées lors du développement du mésenchyme
métanéphrique (transition mésenchymale-épithéliale) sont exprimées en grande
quantité au cours de la phase de récupération rénale [Witzgall R. et al., 1994].
D’autres acteurs peuvent jouer un rôle important lors de la progression des
atteintes tubulaires proximales. Vingt-quatre heures après la phase de nécrose
tubulaire aiguë et jusqu’au jour 35 du protocole d’administration des AA, l’interstitium
rénal est infiltré par des monocytes/macrophages ED1 positifs [Debelle F.D. et al.,
2004]. Les macrophages activés stimulent la réponse immune adaptative
(lymphocytes T CD4+ et CD8+ objectivés par immunomarquage). L’atrophie
tubulaire est intense dans les zones préalablement riches en macrophages activés et
lymphocytes CD8+ potentiellement toxiques envers les cellules tubulaires. Le
développement et la caractérisation de l’infiltrat inflammatoire (macrophages et
156

lymphocytes) font l’objet d’une étude en cours de réalisation par le Dr. Agnieszka
Pozdzik et ne sont pas abordés dans ce travail. De façon intéressante, le modèle de
néphropathie toxique étudié illustre en 35 jours le concept physiopathologique
suivant : nécrose tubulaire précoce, afflux interstitiel de cellules immunocompétentes
contribuant au développement de la fibrose interstitielle via le TGF-β actif d’origine
tubulaire et interstitielle [Pozdzik A. et al., 2005] [Nortier J. et al., 2005]. Dans cette
optique, l’implication du processus de différenciation épithélio-mésenchymateuse au
niveau des cellules tubulaires proximales reste à investiguer.
Les deux approches expérimentales, in vitro et in vivo de ce travail montrent
que l’épithélium tubulaire proximal est la cible principale de l’intoxication aux AA. Ces
deux approches constituent de bons modèles pour explorer plus en détails : le
mécanisme d’endocytose médiée par récepteur intervenant dans la réabsorption des
protéines ; le processus de régénération et/ou différenciation de la cellule tubulaire
proximale à l’origine de signaux profibrosants pour le secteur interstitiel ainsi que la
ou les voie(s) d’entrée des AA dans la cellule tubulaire proximale. De plus, l’atteinte
tubulaire proximale très précoce dans le modèle animal représente un avantage
majeur pour explorer les mécanismes conduisant à la nécrose tubulaire aiguë,
souvent présente dans les atteintes d’origine toxique ou ischémique, ainsi que ceux
favorisant la réparation de l’épithélium.
Il est primordial de rappeler que le pronostic fonctionnel des maladies rénales
est déterminé histologiquement par la sévérité des lésions du compartiment tubulointerstitiel
(intensité de l’infiltrat inflammatoire, de l’atrophie tubulaire et de la fibrose
interstitielle) [Bohle A. et al., 1977]. En conséquence, l’étude approfondie des
mécanismes physiopathologiques de l’atteinte tubulaire proximale et de la
progression de cette atteinte conduisant au développement de la fibrose interstitielle
est une voie de recherche prometteuse car elle fournirait des informations utiles pour
le développement ultérieur de stratégies préventives de progression des
néphropathies aiguës et/ou chroniques.
157

ANNEXE 1 : Sécrétion et réabsorption tubulaires des
drogues et xénobiotiques
Les transports tubulaires sont classés en fonction de la spécificité du substrat
anionique ou cationique et de la localisation apicale ou basolatérale au niveau de
l’épithélium tubulaire rénal. L’efficacité et la toxicité de nombreux médicaments ou
toxiques environnementaux sont ainsi déterminées par leurs interactions avec les
systèmes de transport organique anionique et cationique rénaux [Pritchard J.B. et al.,
1993; Ullrich K.J., 1994].
A.1. Transporteurs tubulaires anioniques (OAT)
De nombreux transporteurs tubulaires anioniques ont été décrits et deux
systèmes indépendants individualisés : les transporteurs du para-aminohippurate
(PAH) liés au sodium et un système indépendant du sodium. Deux transports
couplés en série sont impliqués dans tous les cas : passage des composés véhiculés
par le sang dans la cellule tubulaire au travers de la membrane basolatérale puis de
la cellule tubulaire à la lumière tubulaire à travers la membrane apicale (Fig. 15,
Tableau annexe 1.1).
Transport basolatéral
La famille OAT : OAT1 ou l’échangeur PAH/dicarboxylate
L’entrée basolatérale des anions se fait contre un gradient électrochimique
puisque le milieu intracellulaire de la cellule est chargé négativement. En effet, la
Na + /K + -ATPase en maintenant un gradient sodium, favorise le co-transport entrant
de sodium/dicarboxylate dans la cellule et permet ainsi la réabsorption des anions en
échange d’un ion α-cétoglutarate sortant [Martinez F. et al., 1990; Pritchard J.B.,
1995; Shimada H. et al., 1987]. L’ α-cétoglutarate, principalement généré par le
métabolisme mitochondrial, est le contre-ion de l’ion dicarboxylate dans la cellule
tubulaire rénale.
158

Tableau annexe 1.1. Transporteurs associés à la sécrétion d’anions organiques par les cellules tubulaires proximales rénales
[Wright S.H. et al., 2004].
Transporteurs Localisation Description Références
Na + /K + -ATPase basolatérale
NaDC-3 basolatérale
OAT1, OAT3 basolatérale
Maintien du gradient K + associé au potentiel de membrane
ainsi que le gradient Na + . Ces deux gradients représentent
la force motrice associée à la captation active des anions
organiques (OA) à la membrane basale
Co-transporteur sodium-dicarboxylate qui génère un
gradient α-cétoglutarate (α-KG)
Responsable du transport secondaire actif des anions
organiques de type I par l’intermédiaire d’un transporteur
échangeant l’α-cétoglutarate intracellulaire contre un anion
organique extracellulaire
[Wang H. et al., 2000]
[Burckhardt G. et al., 2000; Inui K.I. et al.,
2000; Sekine T. et al., 2000]
OAT2 ? Pas de description précise [Burckhardt G. et al., 2000]
MRP2 apicale
Sortie active dépendante de l’ATP des anions organiques [Borst P. et al., 2000; Klein I. et al., 1999]
de type II
URAT1 apicale
Réabsorption d’urate en échange d’un anion organique
intracellulaire de type I
OAT4 apicale Flux sortant sélectif d’anions organiques de type I
Oatp1, OAT-K1/K2 apicale Flux entrant d’anions organiques de type I et II
[Lu R. et al., 1996; Masuda S. et al.,
1999b; Masuda S. et al., 1999a]
OATV1, NPT1 apicale Flux sortant sélectif d’anions organiques de type I [Busch A.E. et al., 1996]
Echangeur OA/OA apicale Echangeur physiologique
Les anions organiques de type I ont en général un poids moléculaire inférieur à 400 et sont des composés typiquement monovalents comme le PAH, le
probénécide et la fluorescéine.
Les anions organiques de type II ont un poids moléculaire supérieur à 500 et sont souvent polyvalents comme, par exemple : la calcéine et l’estradiol-17β-Dglucoronide.
159

L’OAT3 est peut-être l’autre système de transport basolatéral indépendant du
sodium.
Transport apical
La sortie des anions organiques au travers de la membrane apicale est sous
la dépendance d’un échange anionique de faible affinité ou par diffusion facilitée, et
d’un transport indépendant du transport de sodium mais nécessitant de l’ATP. Les
transporteurs récemment clonés comme OAT-K1/K2, OAT4 et NPT1 pourraient être
responsables de ces mouvements.
Le co-transporteur Na + -phosphate, NaPi-1 ou NPT1 est responsable du transport
électrogénique des anions organiques [Busch A.E. et al., 1996; Uchino H. et al.,
2000], un homologue de NPT1, OATV1, a été récemment cloné [Jutabha P. et al.,
2003].
Oatp ou la famille des transporteurs d’anions organiques polypeptidiques
Ces transporteurs de sodium sont indépendants de la sulfobrophtaléine, des
acides biliaires conjugués et non conjugués. Dans le tubule proximal, oatp1 sert de
voie de sortie physiologique apicale préférentielle pour les stéroïdes, en particulier le
17-β-D-glucuronide [Kanai N. et al., 1996] ainsi que les oestrogènes [Lu R. et al.,
1996]. Oatp3 est également exprimé dans le rein et transporte le taurocholate ainsi
que des hormones thyroïdiennes [Abe T. et al., 1998]. Oatp2 est un transporteur
spécifique du foie et n’est pas exprimé dans le rein [Abe T. et al., 1998].
OAT-K1 et OAT-K2, deux transporteurs homologues d’anions organiques, sont
spécifiques du rein [Masuda S. et al., 1999b; Masuda S. et al., 1999a]. OAT-K1
semble être le site d’interaction entre les anti-inflammatoires non stéroïdiens
(indométhacine, képrofène, ibuprofène, flufenamate, phénylbutazone) et le
méthotrexate [Masuda S. et al., 1997].
MRP membre de la famille des protéines associées à la résistance aux
médicaments
Ces transporteurs, appartenant à la super famille des ABC transporteurs, sont
impliqués dans le transport d’une large variété de substrats protéiques, peptidiques,
de sucres ou d’ions inorganiques ainsi que de médicaments comme les
antibiotiques. Les membres les plus importants de cette famille sont la P-
160

glycoprotéine (P-gp) et la protéine associée à la résistance aux médicaments (MRP).
Elles sont impliquées dans la sortie des médicaments anticancéreux de la cellule
tumorale, et le régulateur transmembranaire de la conductance de la fibrose kystique
(CFTR). MRP est un transporteur anionique tandis que la P-gp est un transporteur
cationique.
Dans le rein, MRP2, une isoforme de la protéine associée à la résistance aux
médicaments, est localisée à la membrane apicale du tubule proximal chez l’homme
et le rat [Schaub T.P. et al., 1999]. Les substrats sont des conjugués anioniques du
glutathion (leukotriène C4) ou du glucuronide (estradiol-17-β-D-glucuronide) ainsi
que des substrats non-conjugués comme le probénécide, le sulfinpyrazone,
l’indométhacine, le furosémide et la pénicilline [Bakos E. et al., 2000]. La MRP1, une
autre protéine associée à la résistance aux médicaments dans les cellules
cancéreuses, est exprimée dans très peu de segments tubulaires rénaux et pas dans
le tubule proximal [Peng K.C. et al., 1999].
A.2. Transporteurs tubulaires cationiques (OCT)
Dans le rein, les transporteurs des cations organiques interviennent dans les
phénomènes physiologiques et pharmacologiques de réabsorption et d’excrétion de
cations organiques endogènes (guanine, choline, les monoamines bioactives comme
la dopamine, l’épinéphrine et l’histamine), des médicaments cationiques (cimétidine,
procaïnamide et quinine) et des toxines cationiques. Ces transporteurs sont localisés
dans les segments proximaux et distaux du tubule rénal ainsi que dans les canaux
collecteurs. Un transport facilité par la différence de potentiel à la membrane
basolatérale est combiné à un transport induit par le gradient en ion H + transmembranaire
dans la bordure en brosse tubulaire, lequel est entretenu par l’activité
de l’échangeur sodium/proton et/ou de la pompe à proton vacuolaire (Fig. 16,
Tableau annexe 1.2).
161

Tableau annexe 1.2. Transporteurs associés à la sécrétion de cations organiques par les cellules tubulaires proximales rénales [Wright S.H. et
al., 2004].
Transporteurs Localisation Description Références
Na + /K + -ATPase basolatérale
OCT1, OCT2,
OCT3
basolatérale
MDR1 apicale
Maintien du gradient K + associé au potentiel de membrane
(négatif à l’intérieur) ainsi que le gradient Na + . Ces deux
gradients représentent la force motrice associée à la
sécrétion active des cations organiques (OC) à la
membrane basale
Diffusion facilitée électrogénique associée à la captation
des cations organiques de type I.
Semblent également assurer l’échange électroneutre
OC/OC
Sortie active dépendante de l’ATP des cations organiques
de type II
[Karbach U. et al., 2000; Koepsell H. et al.,
1999; Okuda M. et al., 1999; Sugawara-
Yokoo M. et al., 2000; Wu X. et al., 2000]
[de Lannoy I.A. et al., 1994; Ford J.M. et
al., 1990; Horio M. et al., 1990; Koren G.,
1987; Schramm U. et al., 1995; Speeg
K.V. et al., 1992]
NHE3 apicale
Echangeur Na + /H + qui maintient le gradient électrochimique
de l’hydrogène nécessaire à l’activité de l’échangeur OC/H +
et OCTN1
Echangeur OC/H + apicale Echangeur physiologique OC de type I/H +
OCTN1 apicale Echange électroneutre OC/H + . [Yabuuchi H. et al., 1999]
OCTN2 apicale
Assure le co-transporteur Na + Voie électrogénique
-carnitine ainsi que la [Wu X. et al., 1999]
captation électrogénique de TEA et certains substrats de
type I
de réabsorption de
la choline
apicale Voie physiologique
Les cations organiques de type I ont en général un poids moléculaire inférieur à 400 et sont des composés monovalents comme le tétraéthylammonium
(TEA), le tributylméthylammonium (TBuMA) et la procainamide éthobromide.
Les anions organiques de type II ont un poids moléculaire généralement supérieur à 500 et sont souvent polyvalents comme, par exemple : la d-tubocurarine,
le vercuronium et l’hexafluorenium.
162

Transport basolatéral
La famille des transporteurs organiques cationiques : OCT
Le premier transporteur de cations organiques OCT1 a été cloné chez le rat
[Grundemann D. et al., 1994]; depuis, plusieurs transporteurs de cations homologues
ont été identifiés [Koepsell H. et al., 1999].
Les isoformes OCT1 et OCT2 possèdent des affinités pour un grand nombre
de substrats et sont des transports voltage dépendant. Chez le rat, OCT1 et OCT2
sont principalement exprimés dans le rein, localisés à la membrane basolatérale du
tubule proximal [Karbach U. et al., 2000; Sugawara-Yokoo M. et al., 2000]. Ils jouent
probablement un rôle dans la sécrétion des cations organiques [Okuda M. et al.,
1999]. Le taux d’expression du mRNA et de la protéine OCT2 de rat chez les mâles
est beaucoup plus élevé que chez les femelles ; cette observation est en corrélation
avec le transport de tétraéthylammonium plus important chez les mâles dans des
vésicules de la membrane basolatérale et sur les coupes de cortex [Urakami Y. et
al., 1999]. Comme aucune différence de sexe n’est observée pour l’expression
rénale de OCT1 de rat, l’OCT2 de rat et non l’OCT1 peut constituer le principal
transporteur rénal de cations organiques chez le rat.
Une autre isoforme, OCT3 de rat qui transporte le tétraéthylammonium et la
guanidine est exprimée dans plusieurs organes dont le rein [Wu X. et al., 2000].
Transport apical
Transporteur multi-médicament/P-glycoprotéine (MDR ou P-gp)
La MDR/P-glycoprotéine (« transporteur multi-médicament ») est une protéine
transmembranaire qui agit comme une pompe énergie dépendante responsable de
l’efflux d’une grande variété de médicaments au travers de la membrane plasmique
de différents types de cellules [Ford J.M. et al., 1990]. La MDR/P-gp est exprimée
dans les tissus sains et plus particulièrement dans les organes intervenant dans le
devenir cinétique des médicaments. La membrane apicale des tubules proximaux est
particulièrement riche en MDR/P-gp. La MDR/P-gp peut expulser un grand nombre
de composés organiques comme la vinblastine, la vincristine, la colchicine, les
analogues de la cyclosporine hors de la cellule proximale rénale [de Lannoy I.A. et
al., 1994; Schramm U. et al., 1995; Speeg K.V. et al., 1992]. Certaines substances
sont transportées aussi bien par la MDR/P-gp que par le transport organique de
cations incluant la daunomycine, la colchicine, le verapamil, la quinidine et la
163

vinblastine [Horio M. et al., 1990]; cependant la digoxine, qui n’est pas un cation
organique, se limite uniquement à la P-gp [Koren G., 1987].
Transporteurs de cations organiques apicaux
Les deux transporteurs de cations organiques OCTN1 et OCTN2 sont
identifiés dans le rein et d’autres organes chez le rat, la souris, le lapin et l’humain
[Wu X. et al., 1999; Yabuuchi H. et al., 1999].
L’OCTN1 est un transporteur de cations organiques multi-spécifique,
bidirectionnel et dépendant du pH et probablement stimulé par un mécanisme
antiport de protons. L’OCTN1 semble être impliqué dans la sécrétion des cations
organiques à la membrane apicale.
Dans le rein, l’OCTN2 est principalement exprimé dans les cellules des
tubules proximaux et distaux ainsi que dans les glomérules. L’OCTN2 possède les
mêmes caractéristiques fonctionnelles que OCTN1 mais les affinités pour les
substrats sont différentes pour les deux transporteurs [Wu X. et al., 1999]. L’OCTN2
semble jouer un rôle dans la sécrétion des cations organiques et dans la
réabsorption de la carnitine par un co-transport sodium carnitine.
164

ANNEXE 2 : Effets des acides aristolochiques sur
l’expression de protéines impliquées dans l’endocytose
médiée par récepteur
Dans deux expériences préliminaires indépendantes, les cellules OK sont
exposées aux AA 20 µmol/l pendant 24 h suivi ou non d’une récupération en milieu
de culture pendant 2 ou 6 jours. Les lysats cellulaires sont séparés par
électrophorèse et transférés sur membrane de nitrocellulose. La membrane est
incubée successivement avec l’anticorps de mouton anti-mégaline, l’anticorps
humain anti-cubiline, l’anticorps humain anti-ClC-5 et l’anticorps monoclonal β-actine.
Les densités optiques relatives sont obtenues en double et normalisées par rapport à
la β-actine.
L’analyse semiquantitative, normalisée par rapport à la β-actine, montre que
l’expression endogène de la mégaline dans les cellules OK est diminuée de 33 %
après 24 h d’exposition aux AA, de 45 % et 91 % respectivement après 2 et 6 jours
de récupération. Parallèlement, l’expression endogène du ClC-5 est également
réduite de 19 %, 72 % et 85 %, respectivement après 0, 2 et 6 jours de récupération.
Par contre, l’expression endogène de la cubiline est légèrement augmentée de 14 %
après 24 h d’exposition aux AA et ensuite diminuée de 43 % et 72 % respectivement
après 2 et 6 jours de récupération (Fig. annexe 2) [Lebeau C. et al., 2002; Lebeau C.
et al., 2003].
L’exposition aux AA induit une inhibition progressive et permanente de
l’expression de ces trois protéines impliquées dans le processus d’endocytose
médiée par récepteur.
Densité optique relative (% du contrôle)
120
100
80
60
40
20
0
AA (20 µmol/l)
AA + 2 jours de récupération
AA + 6 jours de récupération
Mégaline Cubiline ClC-5
Figure annexe 2 : Effet des AA sur l’expression endogène de la mégaline, de la cubiline et
du ClC-5 dans les cellules OK : analyse densitométrique.
165

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Early proximal tubule injury in experimental
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213

THESE ANNEXE
Les ochratoxines (A, B, C) sont des mycotoxines structurellement proches
impliquées dans la contamination de divers aliments destinés à l’homme ou aux
animaux d’élevage. L’ochratoxine A, la plus étudiée et toxique des trois, est
cancérigène et impliquée dans le développement de néphropathies chroniques. Une
étude récente montre que l’ochratoxine A induit la nécrose, l’apoptose,
l’inflammation, la fibrose et la transition épithélio-mésenchymateuse dans des lignées
de cellules tubulaires proximales d’origine animale. De plus, l’exposition à
l’ochratoxine A conduit à l’activation des protéines kinases activées par un mitogène
(MAPK) : la kinase régulée par un signal extracellulaire 1 et 2 (ERK1/2), la kinase
amino-terminale c-jun (JNK) et la protéine kinase 38 à régulation extracellulaire (p38)
[Sauvant C. et al., 2005b]. Cependant, l’inhibition de ERK1/2 amplifie les effets de
l’ochratoxine A et induit même une toxicité à des concentrations normalement nontoxiques
[Sauvant C. et al., 2005a]. En général, ERK1/2 est supposée intervenir dans
la mitogénèse et la différenciation cellulaire, alors que JNK et p38 agiraient en faveur
de l’apoptose, l’inflammation et la fibrose [Tian W. et al., 2000].
Dès lors, ce projet a pour objectif d’étudier de façon comparative l’effet des
ochratoxines A, B et C sur la nécrose, l’apoptose, l’inflammation, la fibrose et les
voies de signalisations des MAPK (ERK1/2, JNK et p38) dans les lignées de cellules
tubulaires proximales humaines immortalisées (IHEK) et normales (RPTEC).
Dans un premier temps, l’effet des ochratoxines A, B et C sera testé sur la
nécrose par dosage de la libération de lactate déshydrogènase ainsi que l’apoptose
par mesure de l’activité de la caspase-3. Différents paramètres intervenant dans le
développement des néphropathies tubulo-interstitielles seront également mesurés :
l’inflammation par mesure de l’activité du facteur nucléaire-kB (NF-κB); la fibrose par
dosage spécifique des collagènes I, III et IV ; la transformation épithélioméssenchymateuse
par mesure de l’expression de l’ARN de l’«α-smooth muscle
actin». De même que l’activation des MAPK (ERK1/2, JNK et p38) est mesurée par
la quantification des MAPK phosphorylées. La comparaison des effets obtenus pour
l’ochratoxine A, B et C permettrait d’établir une corrélation entre la structure et la
toxicité des ochratoxines.
Dans un deuxième temps, l’implication plus précise des voies de signalisation
des MAPK dans la toxicité rénale aux ochratoxines A, B et C sera explorée à l’aide
d’inhibiteurs spécifiques: U0126 pour la voie ERK1/2, SP600125 pour la voie JNK et
SB203580 pour la voie p38. Les paramètres décrits précédemment seront mesurés.
Les résultats obtenus devraient fournir des informations comparatives sur le(s)
mécanisme(s) de la toxicité tubulaire induite par les ochratoxines A, B, C.
Ultérieurement, ces données permettraient d’élaborer une stratégie thérapeutique en
vue de ralentir ou empêcher la progression de la néphropathie tubulo-interstitielle.
Sauvant C., Holzinger H. and Gekle M. Proximal tubular toxicity of ochratoxin A is amplified by simultaneous
inhibition of the extracellular signal-regulated kinases 1/2. J. Pharmacol. Exp. Ther. 313: 234-241,
2005a.
Sauvant C., Holzinger H. and Gekle M. The nephrotoxin ochratoxin A induces key parameters of chronic
interstitial nephropathy in renal proximal tubular cells. Cell Physiol Biochem. 15 : 125-134, 2005b.
Tian W., Zhang Z. and Cohen D.M. MAPK signaling and the kidney. Am. J. Physiol Renal Physiol 279: F593-
F604, 2000.
214