TP -chromatographie glucides et chlorophylle
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<strong>TP</strong> : CHROMATOGRAPHIE<br />
Chromatographie des pigments de la <strong>chlorophylle</strong><br />
Chromatographie de <strong>glucides</strong> sur plaque de silice<br />
But du <strong>TP</strong> : -m<strong>et</strong>tre en oeuvre une <strong>chromatographie</strong> sur couche mince (CCM)<br />
- séparer les pigments de la <strong>chlorophylle</strong><br />
- séparer <strong>et</strong> identifier les constituants d’un mélange de <strong>glucides</strong><br />
I- Principe de la technique<br />
La <strong>chromatographie</strong> est une technique qui perm<strong>et</strong> de séparer <strong>et</strong> d’identifier les<br />
constituants d’un mélange.<br />
Les solutés sont déposés sur une phase stationnaire (ici une plaque de silice). Il s’établit des<br />
liaisons faibles entre les molécules <strong>et</strong> la surface de la plaque de silice : on dit que les<br />
molécules sont adsorbées <strong>et</strong> on parle de <strong>chromatographie</strong> d’adsorption. Suivant la polarité<br />
des solutés, la fixation sera plus ou moins forte.<br />
Dans un deuxième temps, un solvant (ou éluant), constituant la phase mobile, migre par<br />
capillarité le long de la plaque : il décroche <strong>et</strong> entraîne les solutés en commençant par les<br />
moins fixés. Les vitesses d’entraînement des solutés sont différentes, <strong>et</strong> on peut séparer les<br />
constituants d’un mélange, à condition de bien choisir l’éluant.<br />
II- Chromatographie de substances colorées : séparation des pigments de la<br />
<strong>chlorophylle</strong><br />
On souhaite séparer les principaux pigments de la <strong>chlorophylle</strong> qui nous apparaît verte :<br />
Carotène (jaune):<br />
Chlorophylle a (vert-bleu) <strong>et</strong> <strong>chlorophylle</strong> b (vert-jaune):<br />
1 STL- JPF- LEGTA AURILLAC
Xanthophylles (jaunes):<br />
violaxanthine :<br />
néoxanthine :<br />
Préparation de l’échantillon<br />
Broyer des feuilles de plantes avec du sable de Fontainebleau <strong>et</strong> 20 mL d’acétone. Le liquide<br />
surnageant obtenu doit être vert foncé.<br />
Préparation de l’éluant<br />
On utilise un solvant contenant (en pourcentage volumique) : éther diéthylique : 70% /<br />
cyclohexane : 30%<br />
Verser de ce solvant dans un bécher sur une hauteur de 2-3 mm. Recouvrir le bécher avec une<br />
boite de Pétri. Entourer le bécher avec du papier aluminium, les pigments étant sensibles à la<br />
lumière.<br />
Dépôts<br />
-Prendre la demi-plaque dans le sens vertical<br />
-Tracer au crayon de papier une ligne de dépôt horizontale à environ 1 cm du bas<br />
-Matérialiser 1 croix sur c<strong>et</strong>te ligne.<br />
-Réaliser à l’aide de piques à apéritif en bois (sans appuyer <strong>et</strong> après avoir légèrement écrasé la<br />
pointe), un dépôt de liquide surnageant. Répéter le dépôt une dizaine de fois pour qu’il apparaisse<br />
vert foncé.<br />
Développement<br />
-Placer la plaque de silice dans le bécher <strong>et</strong> laisser migrer l’éluant jusqu’à 1 cm du bord supérieur<br />
Interprétation<br />
-Enlever la plaque <strong>et</strong> repérer tout de suite au crayon à papier le front du solvant.<br />
-Sécher la plaque, éventuellement à l’aide d’un sèche-cheveux.<br />
-Analyser le chromatogramme obtenu <strong>et</strong> calculer le rapport frontal de chaque tache de migration<br />
(Rf= distance parcourue par la substance (au centre de la tache) / distance parcourue par le<br />
solvant).<br />
Le rapport frontal Rf est caractéristique d’une substance donnée dans un solvant donné.<br />
III- Chromatographie de substances incolores : séparation d’un mélange de<br />
<strong>glucides</strong><br />
On souhaite séparer <strong>et</strong> identifier les constituants d’un mélange de <strong>glucides</strong> parmi :<br />
xylose :<br />
1 STL- JPF- LEGTA AURILLAC
lactose :<br />
glucose :<br />
Préparation des plaques<br />
Les plaques de silice sont activées 30 minutes à l’étuve à 105°C.<br />
Préparation de l’éluant<br />
On utilise un solvant contenant (en pourcentage volumique) :éthanol : 20% / acide acétique pur :<br />
20% / butanone :60%<br />
Verser de ce solvant dans un bécher sur une hauteur de 2-3 mm. Recouvrir le bécher avec une<br />
boite de Pétri.<br />
Dépôts<br />
-Prendre la plaque dans le sens vertical<br />
-Tracer au crayon de papier une ligne de dépôt horizontale à environ 1 cm du bas<br />
-Matérialiser 4 croix régulièrement espacées sur c<strong>et</strong>te ligne (à 0,5 cm du bord).<br />
-Réaliser à l’aide de capillaires ou de piques à apéritif en bois (sans appuyer <strong>et</strong> après avoir<br />
légèrement écrasé la pointe), les dépôts de <strong>glucides</strong> (solutions à 2,5 g.L -1 ) :<br />
glucose/ xylose /lactose / mélange d’oses. Sécher au sèche-cheveux entre chaque dépôt.<br />
-Identifier chaque dépôt par une l<strong>et</strong>tre au crayon de papier sous la croix (G-X-L-M)<br />
Développement<br />
-Placer la plaque de silice dans le bécher <strong>et</strong> laisser migrer l’éluant jusqu’à 1cm du bord supérieur<br />
Révélation<br />
Les solutés étant incolores, il faut les faire apparaître par une réaction chimique. On utilise pour<br />
cela le réactif de Molisch (pour 100 mL :0,25 g d’α-naphtol, 50 mL d’éthanol <strong>et</strong> 50 mL d’acide<br />
sulfurique à 20%), qui donne une coloration viol<strong>et</strong>te après réaction avec les <strong>glucides</strong>.<br />
-Sortir la plaque, matérialiser au crayon de papier la ligne de front du solvant.<br />
-Sécher la plaque, éventuellement à l’aide d’un sèche-cheveux.<br />
- Sous la hotte, immerger la plaque dans le réactif de Molisch, sécher, <strong>et</strong> placer la plaque à<br />
l’étuve à 100°C pendant quelques minutes.<br />
-Analyser le chromatogramme obtenu, identifier les constituants du mélange <strong>et</strong> calculer le<br />
rapport frontal de chaque tache de migration (Rf= distance parcourue par la substance (au centre<br />
de la tache) / distance parcourue par le solvant).<br />
Le rapport frontal Rf est caractéristique d’une substance donnée dans un solvant donné.<br />
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