TP -chromatographie glucides et chlorophylle

TP : CHROMATOGRAPHIE
Chromatographie des pigments de la chlorophylle
Chromatographie de glucides sur plaque de silice
But du TP : -mettre en oeuvre une chromatographie sur couche mince (CCM)
- séparer les pigments de la chlorophylle
- séparer et identifier les constituants d’un mélange de glucides
I- Principe de la technique
La chromatographie est une technique qui permet de séparer et d’identifier les
constituants d’un mélange.
Les solutés sont déposés sur une phase stationnaire (ici une plaque de silice). Il s’établit des
liaisons faibles entre les molécules et la surface de la plaque de silice : on dit que les
molécules sont adsorbées et on parle de chromatographie d’adsorption. Suivant la polarité
des solutés, la fixation sera plus ou moins forte.
Dans un deuxième temps, un solvant (ou éluant), constituant la phase mobile, migre par
capillarité le long de la plaque : il décroche et entraîne les solutés en commençant par les
moins fixés. Les vitesses d’entraînement des solutés sont différentes, et on peut séparer les
constituants d’un mélange, à condition de bien choisir l’éluant.
II- Chromatographie de substances colorées : séparation des pigments de la
chlorophylle
On souhaite séparer les principaux pigments de la chlorophylle qui nous apparaît verte :
Carotène (jaune):
Chlorophylle a (vert-bleu) et chlorophylle b (vert-jaune):
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Xanthophylles (jaunes):
violaxanthine :
néoxanthine :
Préparation de l’échantillon
Broyer des feuilles de plantes avec du sable de Fontainebleau et 20 mL d’acétone. Le liquide
surnageant obtenu doit être vert foncé.
Préparation de l’éluant
On utilise un solvant contenant (en pourcentage volumique) : éther diéthylique : 70% /
cyclohexane : 30%
Verser de ce solvant dans un bécher sur une hauteur de 2-3 mm. Recouvrir le bécher avec une
boite de Pétri. Entourer le bécher avec du papier aluminium, les pigments étant sensibles à la
lumière.
Dépôts
-Prendre la demi-plaque dans le sens vertical
-Tracer au crayon de papier une ligne de dépôt horizontale à environ 1 cm du bas
-Matérialiser 1 croix sur cette ligne.
-Réaliser à l’aide de piques à apéritif en bois (sans appuyer et après avoir légèrement écrasé la
pointe), un dépôt de liquide surnageant. Répéter le dépôt une dizaine de fois pour qu’il apparaisse
vert foncé.
Développement
-Placer la plaque de silice dans le bécher et laisser migrer l’éluant jusqu’à 1 cm du bord supérieur
Interprétation
-Enlever la plaque et repérer tout de suite au crayon à papier le front du solvant.
-Sécher la plaque, éventuellement à l’aide d’un sèche-cheveux.
-Analyser le chromatogramme obtenu et calculer le rapport frontal de chaque tache de migration
(Rf= distance parcourue par la substance (au centre de la tache) / distance parcourue par le
solvant).
Le rapport frontal Rf est caractéristique d’une substance donnée dans un solvant donné.
III- Chromatographie de substances incolores : séparation d’un mélange de
glucides
On souhaite séparer et identifier les constituants d’un mélange de glucides parmi :
xylose :
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lactose :
glucose :
Préparation des plaques
Les plaques de silice sont activées 30 minutes à l’étuve à 105°C.
Préparation de l’éluant
On utilise un solvant contenant (en pourcentage volumique) :éthanol : 20% / acide acétique pur :
20% / butanone :60%
Verser de ce solvant dans un bécher sur une hauteur de 2-3 mm. Recouvrir le bécher avec une
boite de Pétri.
Dépôts
-Prendre la plaque dans le sens vertical
-Tracer au crayon de papier une ligne de dépôt horizontale à environ 1 cm du bas
-Matérialiser 4 croix régulièrement espacées sur cette ligne (à 0,5 cm du bord).
-Réaliser à l’aide de capillaires ou de piques à apéritif en bois (sans appuyer et après avoir
légèrement écrasé la pointe), les dépôts de glucides (solutions à 2,5 g.L -1 ) :
glucose/ xylose /lactose / mélange d’oses. Sécher au sèche-cheveux entre chaque dépôt.
-Identifier chaque dépôt par une lettre au crayon de papier sous la croix (G-X-L-M)
Développement
-Placer la plaque de silice dans le bécher et laisser migrer l’éluant jusqu’à 1cm du bord supérieur
Révélation
Les solutés étant incolores, il faut les faire apparaître par une réaction chimique. On utilise pour
cela le réactif de Molisch (pour 100 mL :0,25 g d’α-naphtol, 50 mL d’éthanol et 50 mL d’acide
sulfurique à 20%), qui donne une coloration violette après réaction avec les glucides.
-Sortir la plaque, matérialiser au crayon de papier la ligne de front du solvant.
-Sécher la plaque, éventuellement à l’aide d’un sèche-cheveux.
- Sous la hotte, immerger la plaque dans le réactif de Molisch, sécher, et placer la plaque à
l’étuve à 100°C pendant quelques minutes.
-Analyser le chromatogramme obtenu, identifier les constituants du mélange et calculer le
rapport frontal de chaque tache de migration (Rf= distance parcourue par la substance (au centre
de la tache) / distance parcourue par le solvant).
Le rapport frontal Rf est caractéristique d’une substance donnée dans un solvant donné.
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