Les Viroses respiratoires aigues Diagnostic Biologique

Les Viroses respiratoires aigues
Diagnostic Biologique
Pr Abdelhalim Trabelsi
Service de virologie
CHU Sahloul,Sousse
Faculté de pharmacie de Monastir
Tunis le 7 Avril 2011 (13 janvier 2011)

INTRODUCTION
Les viroses respiratoires constituent une préoccupation
majeure surtout dans les âges extrêmes (enfant et personnes
âgés).
• C’est C’ C’est t la l 3è 3ème ème cause d de mortalité t lité i iinfantile infantile. f til
Chez l’adulte, ces infections sont souvent bénignes, mais
elles peuvent aussi devenir graves quand il s’agit d’un terrain
débilité (bronchitique chronique, asthmatique). Les principaux
agents en cause sont les virus grippaux grippaux, le virus respiratoire
syncytial, les virus parainfluenza et les adénovirus.
•D’autres •D autres virus émergents ont été rapportés ces dernières
années.

Les recherches virales traditionnelles (VRS,v. influenza
et parainfluenza, AdV,) montrent que :
40 à 50% des broncho-pneumopathies de l’enfant
étiquetées virales restent sans virus identifié,
de même que 60% des broncho-pneumopathies
de l’adulte….
Les données anciennes réservent peu de place à ces virus
en pathologie respiratoire :
simples agents de rhumes…

Pourquoi un diagnostic
Virologique?
1) P Pour reconnaître, ît traiter t ttraiter it et ett prévenir é i les l
infections sévères chez le sujets hospitalisés
2) Parce qu’il qu il n’y ny nya n’y a aucun parallélisme entre entre: entre entre:
-La La clinique et la virologie
- Certaines infections bactériennes et virales
3) Pour la surveillance épidémiologique de
certaines infections virales telle que la grippe

CONDUITE A TENIR
Devant toute suspicion de pneumopathie virale
Sé Sécrétions é i nasopharyngées h é ou éécouvillonnage ill nasal l
Envoi immédiat au laboratoire ou conservation à +4°C
(Fiche +++)

Quels virus ?
Quand faire le Diagnostic?
Quelle méthode choisir?

Quand Quand ?
IRA débutant par une rhinite et une toux
sèche,une fièvre modérée (durée maximale 2 à 4
jours)virus ++++
IRA débutant débutant par par des des signes signes systémiques :le
syndrome grippal
Fièvre ,malaise malaise ,myalgies myalgies (s (s’accentuent accentuent en 12 à
24h),virus ++++
Ensuite : : rhinite,toux rhinite toux et et autres autres signes (après 1 à
2 jours) virus +++

Cinétique d’évolution de la Grippe: Biologie

Quelle méthode méthode choisir ?
Détection antigénique
Isolement Isolement en culture
Détection génomique
Sérologie

Prélèvements
Sécrétions naso-pharyngées
écouvillonnage nasal
Aspirations bronchiques
LBA

Prélèvement respiratoire
Il faut prélever des secrétions nasales et non
pharyngées (épithélium non respiratoire) ou
t ttrachéo trachéo-bronchiques
hé b bbronchiques. hi
Le plus tôt possible après le début de la maladie maladie.
Par aspiration nasale (ou trachéale) en milieu
hospitalier, ou par écouvillonnage en pratique
communautaire:
communautaire t i
Il faut recueillir suffisamment de cellules
épithéliales( é éépithéliales( ithéli l ( virus i souvent souventt associés ié aux cellules). cellules) ll l )
Pour l’écouvillonnage:
l’écouvillonnage
- Utili Utiliser 2 é écouvillons ill (1 par narine) i )
- Réaliser un frottage appuyé de la muqueuse
- Mettre le contenu dans un milieu de transport transport.

Détection Détection d’antigènes d antigènes viraux
– Immunofluorescence
– ELISA
– Agglutination de particules de latex
– IImmuno Immuno-chromatographie
chromatographie
h t hi

Immunofluorescence:
Ac monoclonaux spécifiques: Inclusions
fluorescentes souvent intracytoplasmiques à
aspect granulaire ou homogène
Avantages:
- Simplicité, rapidité ( 30à 90 min)
- Peu de précautions lors du prélèvement
- Détection de plusieurs virus sur le même
prélèvement
- 90,6 % concordance avec les cultures
cellulaires
- 6,3 % de diagnostic (+) contre des
cultures cellulaires (-) ( )
Inconvénients: Expérience de lecture

Immunofluorescence : prélèvement fixé
sur lame en verre)
IFD : Prélèvements positifs en Virus Influenza A

Immuno Immuno-cytomarquage
cytomarquage
Ag intra intra-cellulaires cellulaires ou membranaires
Ac marqués par une une enzyme enzyme (peroxydase)
Nécessité de cellules intactes
Délai d’exécution 1h
Coût Coût faible
Estimation semi-quantitative
semi quantitative
Lecteur entraîné

Technique Sandwich
Avantages:
ELISA
-ne nécessite pas de cellules intactes
-Délai d’exécution jusqu’à j q 12h
-Pas de nécessité de manipulateur spécialisé
Inconvénients:
-Pas de recherche conjointe de plusieurs virus
- Coût élevé
-Pas P dde réactifs é tif di disponibles ibl pour ttous lles virus
i

Techniques immunoenzymatiques : plaque ELISA avec micropuits
après è révélation
é él ti

Technique Immuno Immuno-chromatographique
chromatographique
Simple
Rapide
Ne nécessite pas de cellules intactes
Sensibilité faible

Technique immuno immuno-chromatographique
immuno chromatographique

Isolement des virus
pneumotropes sur cultures
cellulaires

Isolement du virus
Cellules en lignée continue (Hep2)
fibroblastes humains (MRC5)
Inconvénients: ECP lent (3 à 10 j), discret
(syncytium, foyer peu dégénératif)
virus fragiles ⇒ milieu de transport
Inadapté pour de nombreux virus
émergents
Avantages: a ages Amplification p ca o de la a ccharge a ge virale. ae Elle e
demeure la seule méthode de diagnostic direct
dans 2,8 % des cas.

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Diagnostic moléculaire

- L’utilisation L utilisation des outils moléculaires trouve
surtout son intérêt dans la détection des
virus émergents et/ou difficiles à cultiver .
- Le typage moléculaire des souches isolées
permet de tracer le profil épidémiologique
des souches circulantes ⇒ indispensable
pour p une meilleure compréhension p
de la
pathogénie de la maladie, son immunité et
par conséquent les moyens de lutte contre
sa diff diffusion.
i

Laboratoires spécialisés
Pl Plusieurs i PCR simples i l ou multiplex lti l en
parallèle p
Peu de trousses commercialisés
Résultats en 2jou ou 4h (PCR en temps
réel)

Simultaneous typing and HA/NA subtyping of
influenza A A and and B B viruses viruses including including the the pandemic pandemic influenza
influenza
A/H1N1 2009 by multiplex real real-time time RT-PCR RT PCR
Yaowu Yanga J Virol Methods. 2010 Jul;167(1):37
Jul;167(1):37-44. 44. Epub 2010 Mar 19.
Real time RT-PCR RT PCR Multiplex.
Distinguer les virus de la grippe saisonnière /Grippe
AH1N1 2009.
Typage des souches saisonnières simultanément.
Sensibilité 10 10-10 104 copies/réaction.
copies/réaction
p

Etude des facteurs de risque q liés
à l’hôte et au virus

Performances des techniques

Les éléments de choix de la méthode
1) simplicité et rapidité de la technique
Tests IF et ELISA
2) Efficacité:
3) Coût :
performance des techniques de détection virale
en général PCR > IF > culture
coût matériel et temps
En général IF Naso-pharynx
Naso pharynx
Prélèvement précoce p
Recueil des cellules respiratoires

Diagnostic sérologique

Peu d’intérêt pour le diagnostic
-Apparition Apparition tardive des Anticorps(10 jours)
-Ascension lente (20 jours)
-Élaboration inconstante chez les enfants de
moinsde6mois
moins de 6 mois
-Difficulté d’interprétation ⇒ Ac maternels
IgM trouvés dans 60 à 70 % des cas
Tit Titres faibles f ibl
très ès peu de réactifs éac s co commercialisés e c a sés

Diagnostic de La grippe

DIAGNOSTIC
Signes g cliniques q souvent évocateurs mais p parfois
absents
Nécessité Nécessité d dd’isoler d’isoler isoler et d’identifier d identifier le virus
Multiplication dans la cavité allanto allantoïde de d’œufs
embryonnés
Test d’hémagglutination des hématies de volaille
Techniques rapides
Techniques q sérologiques g q
Techniques moléculaires

Oeuf embryonné de 11 jours

Inhibition de l’hémagglutination gg ( (IHA) ) : utilisation
préalable d’anti-sérums sur le surnageant de
culture (Ac ( spécifiques p q capables p d’inhiber
l’hémagglutination en présence du virus
initialement hémagglutinant) gg )
virus exprimant une HA
Ac anti-HA1
GR
A : culture cellulaire +
anti-sérum spécifique
Sédimentation sans
hémagglutination
B : culture cellulaire
sans anti-sérum
spécifique
Hémagglutination

Interêt d’un diagnostic g rapide p de la
grippe
Maîtrisedel’épidémie
Maîtrise Maîtrisedel’épidémie
de l épidémie
Réduction des examens complémentaires
Réduction de la fréquence et de la durée
des des hospitalisations
La mise en route rapide du traitement anti-
viral
i l

CONCLUSION

-Les infections respiratoires constituent la majeure cause de
consultation et d’hospitalisation,surtout pendant les mois
froids
-Elles sont responsables d’une réduction énorme du
rendement de la population active (absentéisme professionnel
et scolaire)
-Les es techniques tec ques rapides ap des de détection détect o des PNEUMOVIRUS
N U OV US
ont facilité le diagnostic des infections respiratoires virales.
-Ce Ce diagnostic est très utile voire indispensable pour la
surveillance épidémiologique ainsi que pour la prise en
charge et la prévention
-Les études épidémiologiques et virologiques sont encore
iinsuffisantes ffi en TTunisie i i

L’examen virologique virologique, même s’il est
cher,et cher,et si si la demande est justifiée,
Ne doit plus être perçu comme un
luxe inutile