M. Lemoine Rémi, Directeur de Recherches, Université

THESE
Pour l’obtention du Grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE POITIERS
(Faculté des Sciences Fondamentales et Appliquées)
(Diplôme national-Arrêté du 25 avril 2002)
Ecole doctorale d’Ingénierie Chimique, Biologique et Géologique
Secteur de recherche : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie
Présentée par
Ludovic PINEAU
Impacts de perturbations de l’homéostasie
lipidique sur la fonctionnalité de la
voie de sécrétion chez la levure
Saccharomyces cerevisiae
Directeurs de Thèse : Thierry Bergès et Thierry Ferreira
Soutenue le 18 décembre 2008 devant la commission d’examen
Rapporteurs :
Mme Friant Sylvie, Chargée de Recherches, Université Louis Pasteur Strasbourg
M. Chevet Eric, Chargé de Recherches, Université Bordeaux 2
Examinateurs :
• M. Beckerich Jean Marie, Directeur de Recherches, Paris Grignon
• M. Lemoine Rémi, Directeur de Recherches, Université de Poitiers
• M. Bergès Thierry, Professeur, Université de Poitiers
• M. Ferreira Thierry, Maître de Conférences, Université de Poitiers

THESE
Pour l’obtention du Grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE POITIERS
(Faculté des Sciences Fondamentales et Appliquées)
(Diplôme national-Arrêté du 25 avril 2002)
Ecole doctorale d’Ingénierie Chimique, Biologique et Géologique
Secteur de recherche : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie
Présentée par
Ludovic PINEAU
Impacts de perturbations de l’homéostasie
lipidique sur la fonctionnalité de la
voie de sécrétion chez la levure
Saccharomyces cerevisiae
Directeurs de Thèse : Thierry Bergès et Thierry Ferreira
Soutenue le 18 décembre 2008 devant la commission d’examen
Rapporteurs :
Mme Friant Sylvie, Chargée de Recherches, Université Louis Pasteur Strasbourg
M. Chevet Eric, Chargé de Recherches, Université Bordeaux 2
Examinateurs :
• M. Beckerich Jean Marie, Directeur de Recherches, Paris Grignon
• M. Lemoine Rémi, Directeur de Recherches, Université de Poitiers
• M. Bergès Thierry, Professeur, Université de Poitiers
M. Ferreira Thierry, Maître de Conférences, Université de Poitiers

En premier lieu je remercie Sylvie Friant et Eric Chevet d’avoir accepté de rapporter
ce travail. Je souhaite également remercier Jean marie Beckerich pour sa présence au sein de
mon jury.
Merci également à Rémi Lemoine de m’avoir accueilli dans son Unité. Avoir un
Grand Chef aussi ouvert et drôle a été une chose très importante pour moi. Le seul bémol
c’est la surveillance omniprésente, y compris durant les vacances en Dordogne…
Thierry (B.), merci d’avoir été le premier à me lancer dans la recherche en juin 2004.
A l’époque je ne comptais pas continuer dans cette voie, mais l’ambiance particulière de
l’équipe, et le plaisir que j’ai eu à la paillasse m’a fait changer d’avis, malgré les risques. Par
contre je n’ai toujours pas compris pourquoi nous n’avions des croissants que le jour de la
Saint Valentin…J’espère que tu ramèneras ton Djembé pour mon pot d’après Thèse pour que
je te voie enfin jouer !
Thierry (F ; TF1). Je ne sais pas si je peux me permettre de te faire une blague dans
MES remerciements. Je ne voudrais pas que ceci soit mal interprété du fait d’un problème de
syntaxe dans ma phrase…Allez soyons fou. Merci. Voilà. Merci pour tout ce que tu m’as
apporté tant professionnellement qu’humainement (même si les couches en coton ce ne sera
pas pour moi). Je pense avoir beaucoup évolué durant ma thèse, et je suis certain que tu y es
pour beaucoup. Reste que l’on ne peut pas être brillant partout et désolé pour ceci mais le
palet c’est MON truc.
« Ecouteees Maman est prêt de toi, il faut lui direeee mamaaaannnn c’est quelqu’un pour tooiiii… »
Merci Thierry et Thierry pour votre co-encadrement.
Matthieu. L’ours. La brute. Le marathonien. Merci pour ton franc parlé, tes échanges
si amicaux et également pour la présence de ton bureau à côté du mien, j’ai ainsi pu profiter
de ton aura…Heureusement que tu étais présent avec moi à Turin sinon je n’aurai jamais pu
boire de bières !
Merci également à Jenny. Je sais que tu vas pleurer quand je vais partir, mais moi
aussi je serai bien triste …Merci pour ta présence dans et en dehors du labo !!! Tu es
3

quelqu’un sur qui on peut vraiment compter et ça c’est super important. Ne changes surtout
pas (sauf peut être quand il s’agit de ta cousine).
Merci pèle mêle à tous les gens du labo : Jean MichMich (qui est presque mon
jumeau) pour sa joie de vivre et sa bonne humeur perpétuelle (je n’oublierai jamais ma
première visite du labo photo. mon Dieu !), Yves pour sa façon d’être et sa richesse culturelle,
Willy (mal aimé, je suis le mal aimé…) pour sa richesse linguistique et sa présence dans le
bureau (sans toi je pense que Thierry serait mort…) puis pour plein d’autre choses (lâcheur, tu
m’abandonnes pour un poste d’IR…je plaisante, bonne route), Virginie, Julien, Manu,
Damien, Anna (bande de concierges !!), tous les membres de l’Unité (enseignants,
personnels) et ceux qui sont déjà docteur (Christophe, Estelle, Thomas) pour les moments
passés ensemble dans la salle café.
Merci aussi à tous ceux qui ont contribué à ce travail : Anne, Florence, Pierrette,
Sébastien et Laurent de Dijon.
Je ne peux bien sûr pas oublier ici mes amis. Honneur aux dames. LaGezz, la fille
possédant la plus grande mauvaise foi au monde mais que j’adore, Nini, un des partenaires de
Picon et un de mes poulains aux palets (il peut aller loin !), de mauvaise foi aussi quand il
s’agit de l’OM, Richard pour avoir été là à un moment où ça n’allait pas du tout (jamais je
n’oublierai mon stage chez toi) et pour ta moustache de cheveux, Juliuss (La femme la plus
classe du monde) pour les Week End et les vacances (notamment) passés en ta compagnie,
Befab pour les apéros Picon fléchettes et pour ton aide le D-Day, et tous les autres dont la
présence, même si elle fût moins importante (attention je parle en terme de temps, pas
d’importance...aïe je m’embrouille…), a beaucoup compté (ouai les Parisiens, ouai les
Poitevins !!).
Enfin je voulais finir ces remerciements en remerciant ma famille. En premier lieu mes
parents qui m’ont permis d’arriver jusque là. Je pense particulièrement à ma mère qui a été et
est toujours présente quand j’ai besoin d’elle. Alors merci...
Puis ma sœur, mon beauf’, Ninice et ma petite filleule de nièce chérie Julia qui sera
incapable de lire ceci avant quelques années. Merci d’avoir été là
sais pas où !
Hé Julia, quand tu lira ces lignes, tu pourra venir en vacances chez tonton euh…..je ne
4

Je pense avoir fait le tour.
Merci !! (avec deux points d’exclamations).
5

Sommaire
Table des Figures 13
Liste des abbréviations 15
Introduction
I. Biogenèse des protéines membranaires : une vue générale 23
II. La voie de sécrétion et les points de contrôle qualité 27
A. Le Réticulum Endoplasmique 27
1. La maturation des protéines 27
a) Insertion dans la membrane 27
b) Le repliement des protéines 28
2. Le contrôle qualité du Réticulum Endoplasmique 30
a) L’Unfolded Protein Response 33
b) L’Endoplasmic Reticulum Associated Degradation 35
3. Connexions entre le contenu lipidique et la sortie du RE 37
B. L’appareil de Golgi. 40
1. Trafic dans l’appareil de Golgi 40
2. Contrôle qualité dans l’appareil de Golgi 41
a) Le transport rétrograde. Cycle appareil de Golgi/RE. 41
b) L’envoi direct appareil de Golgi/voie endosomale 43
Prise en charge de protéines mutées par le contrôle qualité de l’appareil de Golgi 43
Relations entre ubiquitination et contrôle qualité dans l’appareil de Golgi 43
Relations entre lipides et contrôle qualité de l’appareil de Golgi 45
3. La connexion contrôle qualité du RE et contrôle qualité de l'appareil de Golgi 47
C. La membrane plasmique 48
III. Importance des lipides dans la biogenèse des protéines intégrées 51
A. Implication des lipides dans la stabilité des protéines 51
B. Implication des lipides dans l'activité des protéines 56
Les lipides annulaires 56
Les lipides non-annulaires 57
7

IV. Pathologies et autres dysfonctionnements 58
A. Exemples de pathologies liées au trafic de protéines 60
B. Exemples de pathologies associées aux lipides 62
V. Objectifs de l’étude et modèles d’études : 69
A. Générer des perturbations de l’homéostasie lipidique cellulaire : la transition aérobiose
anaérobiose 69
B. Un modèle de protéine membranaire intégrée : la perméase à uracile Fur4p 70
Matériels et Méthodes
A. Matériel biologique 75
1. Souche bactérienne 75
2. Souches de levures 75
3. Plasmides 76
4. Culture 77
a) Culture des bactéries 77
b) Culture des levures 77
c) Estimation de la multiplication des cellules 78
B. Techniques de génétique = obtention des doubles mutants 78
C. Techniques de biologie moléculaire 80
1. Transformation de bactéries 80
2. Extraction et purification d’ADN plasmidique à partir de cultures bactériennes 80
3. Transformation des levures 81
D. Méthodes biochimiques 82
1. Méthode d’analyse des protéines : Western blotting 82
a) Préparation d’extraits de protéines totales de levures 82
b) Electrophorèse des protéines 82
c) Electrotransfert des protéines 83
d) Immuno-révélation des protéines transférées sur membrane de nitrocellulose par
la méthode ECL TM 83
e) Dosage des protéines 83
2. Mesure de l’activité β-galactosidase 84
3. Mesure de l’activité de sécrétion de l’invertase 85
4. Extraction des Detergent Resistant Membranes (DRM) 86
8

5. Purification des fractions microsomales 88
6. Méthodes d’analyse des lipides 89
a) Extraction des lipides totaux 89
b) Préparation des esters méthyliques d’acides gras par transestérification 89
c) Analyse de la quantité de Phosphatidyléthanolamine 90
d) Obtention des extraits stéroliques après saponification 90
e) Analyse par chromatographie en phase gazeuse 91
f) Analyse de la composition phospholipidiques en spectrométrie de masse 91
E. Méthodes de biologie cellulaire 92
1. Coloration au Rouge Nil 92
2. Coloration au FM4-64 92
3. Acquisition des images par microscopie confocale 92
F. Méthodes de biophysique : évaluation de la fluidité membranaire par utilisation de la
sonde Laurdan 93
Résultats 95
Chapitre I : Impacts de perturbations de l’homéostasie lipidique
sur la biogenèse d’une protéine membranaire intégrée
Résumé de la première publication
A lipid-mediated quality control process in the Golgi apparatus in yeast 103
Les carences en ergostérol et en acides gras insaturés induisent la prise en charge de
Fur4p par le contrôle qualité de l’appareil de Golgi 103
Un paramètre de contrôle possible à la sortie de l’appareil de Golgi : le stress de
courbure 104
Résultats complémentaires de la première publication
Impacts du niveau d’hydroxylation des sphingolipides sur la biogenèse de Fur4p 109
La carence en acides gras insaturés entraîne une diminution du niveau
d’hydroxylation des sphingolipides 113
La diminution du taux d’hydroxylation des sphingolipides n’altère pas l’association
de nos protéines modèles aux rafts lipidiques 114
La diminution du taux d’hydroxylation des sphingolipides n’abolit pas l’adressage
de Fur4p à la membrane plasmique 116
9

Chapitre II : Impacts de perturbations de l’homéostasie lipidique
sur la fonctionnalité du Réticulum Endoplasmique
Résumé de la seconde publication
Lipid-induced ER stress: synergistic effects of sterols and saturated fatty acids 125
L’accumulation d’acides gras saturés provoque le déclenchement de l’Unfolded
Protein Response 125
Le 4-PBA, une molécule chaperonne, abolit le déclenchement de l’UPR 126
L’ergostérol agit en synergie avec les acides gras saturés sur le déclenchement de
l’UPR 127
Résultats complémentaires de la seconde publication
Régulation de la voie INO1 en réponse aux perturbations de l’homéostasie lipidique 131
Conclusions et Perspectives
A. Le stress du Réticulum Endoplasmique lipide-médié : un modèle pour l’obésité et
l’athérosclérose 139
B. Le contrôle qualité de l’appareil de Golgi lipide-médié : un modèle pour les
pathologies associées à la biosynthèse des stérols 142
Bibliographie 145
10

Table des Figures
Figure 1: La voie de sécrétion des protéines chez les eucaryotes….. ……………………….20
Figure 2: La formation des domaines liquid ordered (Lo) au niveau de la membrane
plasmique ......................................................................................................................... 22
Figure 3: Mécanisme de translocation des protéines intégrées............................................... 24
Figure 4: Modèle schématique illustrant les actions coordonnées de l’UPR et de l’ERAD... 29
Figure 5: Les différentes voies de l’UPR chez les Eucaryotes ............................................... 30
Figure 6: Principe du fonctionnement de l'ERAD .................................................................. 34
Figure 7: Rôles des compartiments post-RE dans le contrôle qualité de la voie de sécrétion 40
Figure 8: Structure de la bicouche lipidique ........................................................................... 48
Figure 9: L’hydrophobic mismatch......................................................................................... 51
Figure 10: Le stress de courbure ............................................................................................. 52
Figure 11: Le CFTR ................................................................................................................ 57
Figure 12: L'homéostasie du cholestérol chez l'homme.......................................................... 62
Figure 13: La voie de biosynthèse de l'ergostérol................................................................... 66
Figure 14: Modèle topologique de la perméase à uracile Fur4p............................................. 70
Figure 15: Exemple d'élaboration d'un double mutant : Cas de hem1Δ−end3Δ……………..77
Figure 16: Principe de l'induction de la construction Fur4p-GFP ......................................... 96
Figure 17: Le système hem1Δ ................................................................................................. 99
Figure 18: Voie de biosynthèse des sphingolipides .............................................................. 109
Figure 19: L'hydroxylation des sphingolipides..................................................................... 110
Figure 20: Impacts de la carence en acides gras insaturés sur l’association aux DRM de nos
protéines modèles……………………………………………………………………………113
Figure 21: Profil sphingolipidiques dans les mutants sur2Δ et scs7Δ .................................. 115
Figure 22: Effet de l'hydroxylation des sphingolipides sur l'adressage de Fur4p-GFP ........ 117
Figure 23: La connexion entre la voie UPR et la voie INO1 ................................................ 131
Figure 24: Mécanisme de la voie INO1 et impact sur la voie phospholipidique .................. 131
Figure 25: Déclenchement de la réponse INO1 .................................................................... 133
Figure 26: Schéma récapitulatif de l'ensemble des travaux………………………………...136
13

Liste des abbréviations
15

7-DHC 7 déhydrocholestérol
ACAT AcylCoA:cholestérol acyl-transférase
ACK Acétate de potassium
AGI Acides Gras Insaturés
ALA Acide δ-amino-lévulinique
ARN Acide Ribonucléique
CFTR Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
CHX Cycloheximide
CMT Charcot Marie Tooth
CNX Calnexine
COP Complexe de Protéines Manteau (Coat protein)
CQG Contrôle Qualité de l’appareil de Golgi
DGK Diacylglycerol kinase
DHS Dihydro sphingosine
DRM Detregent Resistant Membranes
EDTA Acide éthylène-diamine-tétraacétique
ERAD Endoplasmic Reticulum Associated Degradation
FM 4-64
N-(3-thiethylammoniumpropyl)-4-(p-dethyl-aminophenyl
hexatrienyl) pyridinium dibromide
GDP Guanosine Diphosphate
GFP Green Fluorescent Protein
GP Polarisation Généralisée
GTP Guanosine TriPhosphate
IPC Inositol Phosphoceramide
IPC Inositol-3-phosphate synthase
LB Luria Bertani
LCB Base à Longue Chaîne
Ld Liquid Disordered (Domaines désordonnés)
LDL Low Density Lipoprotein
Lo Liquid Ordered (Domaines ordonnés)
LPA Acide lysophosphatidique
M(IP)2C Mannose-(innositol-P)2-ceramide
MIPC Mannose-inositol-phosphoceramide
17

MVB Multi-Vesicular Body
NBD Nucleotide Binding Domain
NPC Niemann Pick de type C
ONPG Orthonitrophényl-β-D-galactopyrannoside
PA Acide Phosphatidique
PDI Protein Disulfide Isomerase
PEST
Phase G Phase Gel
Séquence riche en résidus Proline (P), Glutamate (E), Sérine (S) et
Thréonine (T)
PHS Phytosphingosine
PI Phosphatidyl Inositol
PMSF Phenylmethanesulphonylfluoride
RER Réticulum Endoplasmique Rugueux
SCAP SREBP cleavage-activating protein
SDS Sodium Dodecyl Sulfate
SDS/PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis
SLOS Smith-Lemli-Optitz Syndrom
SOP Suppresseur du phéotype Pma1-7p
SREBP Sterol-regulatory-element-binding-protein
SRP Signal Recognition Particle
TEMED Tetramethylethylenediamine
TGN Trans Golgi Network
TM Domaine Transmembranaire
TMD Trans Membrane Domain
Tween 40 TM Polyoxyethylene sorbitane monopalmitate
Tween 80 TM Mono-oléate polyoxyéthylène 20 monohydrosorbitol
UPR Unfolded Protein Response
UPRE UPR Element
VPS Vacuolar Protein Sorting
YNB Yeast Nitrogen Base
YPG Yeast Peptone + glucose
18

Introduction
21

Sécrétion
régulée
ou
constitutive
Synthèse et co translocation des protéines
au niveau de la membrane du REr
Figure 1 : La voie de sécrétion des protéines chez les eucaryotes
Adressage depuis l’appareil de
Golgi
vers la vacuole
Fusion des vésicules du RE
pour former le cis Golgi
Les protéines intégrées ayant pour destination finale la membrane plasmique sont synthétisées, comme
l’ensemble des protéines membranaires cellulaires, grâce à des ribosomes associés à la membrane du Réticulum
Endoplasmique rugueux (REr). Cette étape de traduction se déroule à la face cytoplasmique du REr. De façon
concomittante à leur traduction, les protéines membranaires sont transloquées dans la membrane du REr par un
complexe de translocation, dont un constituant essentiel est la protéine Sec61p. A cette étape, les protéines
intégrées vont acquérir une structure tridimensionnelle minimale qui va leur permettre d’échapper au contrôlequalité
du RE et de migrer jusqu’à l’appareil de Golgi via la machinerie COPII. Elles vont ensuite transiter du
cis- au trans-Golgi par un mécanisme nécessitant la machinerie COPI, avant d’être adressées à leur destination
finale par les vésicules de sécrétion qui bourgeonnent à partir du trans-Golgi.
D’après Molecular Cell Biology en ligne (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=mcb.section.4735)
22

I. Biogenèse des protéines membranaires : une vue
générale
La voie de biogenèse des protéines de la membrane plasmique est un processus étudié
depuis de nombreuses années. Après transcription dans le noyau, l’ARN messager est traduit
au niveau du Réticulum Endoplasmique rugueux (REr). La protéine correspondante est
ensuite adressée de cet organelle vers sa destination finale via ce qui est communément appelé
la voie de sécrétion (Behnia and Munro, 2005). Elle subit le long de ce trajet un certain
nombre de modifications post traductionnelles, lui conférant une structure en adéquation avec
sa fonction.
Les protéines intégrées de la membrane plasmique s’insèrent au sein de la bicouche
lipidique dès le Réticulum Endoplasmique. Cette étroite relation entre protéines et lipides
détermine en grande partie le devenir de la protéine, aussi bien structurellement (Lee, 2003b)
que fonctionnellement (Lee, 2004a). Dans certains cas, les lipides peuvent influencer
directement le trafic de la protéine dans la voie de sécrétion. L’exemple le mieux caractérisé
est celui des protéines associées à des sous-domaines lipidiques particuliers, enrichis
notamment en sphingolipides et en stérols, ce qui leur confère des propriétés physico-
chimiques particulières (voir ci-après). Ces domaines, généralement désignés sous le terme de
« rafts » font l’objet de nombreuses revues (Brown and London, 2000; London, 2005), et ont
soulevé dernièrement un certain nombre de controverses (Munro, 2003).
Le long de la voie de sécrétion (Figure 1), les cellules eucaryotes ont développé des
points de contrôle qualité, chargés de repérer, de prendre en charge et le cas échéant de
détruire les protéines mal repliées (Arvan et al., 2002). L’étude de ces différents points de
contrôle est un axe de recherche très développé actuellement, du fait de l’implication directe
de certains d’entre eux dans des pathologies génétiques humaines. On peut citer par exemple
le syndrome de Charcot-Marie-Tooth, la mucoviscidose, ou bien encore le syndrome de Tay-
Sachs (pour revues, voir (Aridor and Hannan, 2000, 2002; Schulein, 2004)).
23

Figure 2:La formation des domaines liquid ordered (Lo) au niveau de la membrane plasmique
En présence de cholestérol, qui est très enrichi au niveau de la membrane plasmique, les lipides présentant une
propension naturelle à se structurer de façon très compacte (lipides formant des phases G, soit les sphingolipides
et les phospholipides à longues chaînes d’acides gras saturés) vont former des phases Lo (ou rafts ; zone grisée).
La migration d’une protéine présentant une forte affinité pour ces domaines pourrait entrainer la coalescence de
petits domaines dispersés pour en former un de taille plus grande (voie A) ou, alternativement, des protéines
libres pourraient migrer vers ces domaines de par leur affinité relative pour les phases Lo (voie B).
D’après Brown et al. (Brown and London, 2000)
24

La levure a depuis une dizaine d’années fortement contribué à la compréhension des
mécanismes qui gèrent ces points de contrôle grâce, en particulier, à l’étude approfondie de
cinq transporteurs de la membrane plasmique : l’ATPase pompe à protons Pma1p, la
perméase à uracile Fur4p, la perméase générale à acides aminés (Gap1p), la perméase à
tryptophane Tat2p et la perméase à arginine Can1p.
Trois approches différentes ont été développées :
• L’étude du trafic de transporteurs présentant des substitutions d’acides aminés
dans leur séquence primaire. Une protéine particulièrement étudiée par cette approche est
Pma1p. L’étude systématique d’un grand nombre de mutants a révélé l’existence de plusieurs
points de contrôle dans la voie de sécrétion (Ferreira et al., 2001; Liu et al., 2006), en
particulier au niveau de l’appareil de Golgi (Chang and Fink, 1995; Luo and Chang, 1997;
Pizzirusso and Chang, 2004) et de la membrane plasmique (Gong and Chang, 2001; Ferreira
et al., 2002; Liu and Chang, 2006).
• L’étude de la relocalisation de transporteurs en réponse à leur substrat. Il a été
montré que la présence de substrat en excès dans le milieu extracellulaire pouvait entraîner
l’adressage direct du transporteur de l’appareil de Golgi vers la vacuole, via la voie
endosomale, pour dégradation. C’est le cas des deux transporteurs d’acides aminés, Gap1p
(Roberg et al., 1997a; Springael and Andre, 1998; Rubio-Texeira and Kaiser, 2006) et Tat2p
(Umebayashi and Nakano, 2003) et de la perméase à uracile Fur4p (Seron et al., 1999;
Blondel et al., 2004b).
• Enfin, l’étude de l’influence du contenu lipidique cellulaire sur la biogenèse de
ces transporteurs. Ces derniers, de par leur intégration dans les membranes, présentent une
sensibilité accrue à des perturbations du contenu lipidique cellulaire, notamment ceux qui sont
ancrés dans des sous domaines lipidiques de type « rafts ». Dans une membrane, les
sphingolipides, constitués d’un acide gras à très longue chaîne (généralement C26 chez la
levure) et d’une base à longue chaîne (Long Chain Base, LCB, voir plus loin), se compactent
et forment des domaines « gel » (phase G) très rigides, qui cohabitent avec des domaines
désordonnés (Ld) constitués par les phospholipides environnants. Dans une telle
configuration, les stérols vont préférentiellement s’insérer dans les domaines gels, diminuant
ainsi les interactions entre les chaînes carbonées des sphingolipides. Ceci entraîne la
formation d’une phase aux propriétés intermédiaires entre les phases G et Ld, appelée phase
ordonnée (Lo) (Figure 2).
25

L’extrémité N-terminale du 1er segment transmembranaire est transloquée
L’extrémité C-terminale du 1er segment transmembranaire est transloquée
Figure 3:Mécanisme de translocation des protéines intégrées
(1a et 1b) Lorsque le premier segment transmembranaire (TM rouge) d’une protéine membranaire a été
intégralement traduit par le ribosome, son extrémité N-terminale peut “flipper” à travers la membrane (flèche), si
le segment transmembranire est suffisamment long et hydrophobe et si le segment N-terminal le prédédent n’est
pas chargé positivement ou intégralement replié (Translocation N-terminale, panneau supèrieur). L’extrémité Nterminale
pourrait être transloquée à travers le canal suite à un léger déplacement du « bouchon » (plug) et le TM
partitionnerait ensuite dans la bicouche lipique de par ses propriétés hydrophobes. (1c et 1d) Le segment
hydrophile suivant émerge dans le cytoplasme en se glissant dans l’espace libre entre le ribosome et le
translocon. Le TM suivant (rouge) s’insère dans le canal de translocation sous la forme d’une boucle, ce qui
entraîne la déstabilisation de la conformation « fermée » du canal. Celui-ci s’ouvre alors par mouvement du
“bouchon” et le second TM partitionne à son tour dans la bicouche lipidique. De façon concommitante, le
segment hydrophile suivant pénètre dans le canal pour être transloqué à la face luminale du RE. (2a et 2b) Dans
le cas des protéines dont le premier TM est trop court ou dont l’extrémité N-terminale est chargée positivement
ou repliée, le premier segment hydrophile reste dans le cytoplasme. Le TM pénètre dans le canal sous forme de
boucle, déstabilisant sa conformation fermée. La traduction se poursuit et l’extrémité C-terminale du TM qui
“flippe” à travers la bicouche (flèche) ce qui permet au TM de partitionner dans la membrane, tout en permettant
à la région hydrophile suivante de transloquer à travers le canal. (2c) L’extrémité N-terminale du TM suivant
pénètre dans le canal et (2d) lorsque suffisamment de résidus hydrophobes ont été traduits, le nouveau TM
partitione dans la bicouche, permettant au « bouchon » de retourner dans la position « canal fermé ».
D’après Osborne et al. (Osborne et al., 2005).
26

Cependant, si la coexistence entre les phases Ld et Lo a clairement été démontrée pour
des membranes modèles (Heberle et al., 2005), ce phénomène reste controversé dans le cas
les membranes cellulaires (Hancock, 2006). La composition des phases Lo leur confère une
résistance accrue aux détergents, dont un détergent non ionique, le Triton X-100, à basse
température (d’où également leur dénomination de DRM, pour Detergent Resistant
Membranes (Brown and London, 2000; London, 2005)). Chez les levures, ces domaines
semblent se former dès le Réticulum Endoplasmique (Bagnat et al., 2000), et constitueraient
des plates-formes (« raft ») pour le tri des protéines intégrées dans la voie de sécrétion
(Bagnat and Simons, 2002). Or, les cinq transporteurs évoqués précédemment sont associés à
de tels domaines (Pma1p (Bagnat et al., 2000; Bagnat et al., 2001), Fur4p (Hearn et al.,
2003b), Tat2p (Umebayashi and Nakano, 2003), Can1p (Malinska et al., 2003) et Gap1p
(Lauwers and Andre, 2006), et l’intégrité de ces domaines apparaît comme essentielle pour
une biogenèse optimale de ces protéines comme l’a montrée l’utilisation de mutants affectés
pour la synthèse des sphingolipides ou des stérols (Hearn et al., 2003a; Umebayashi and
Nakano, 2003; Gaigg et al., 2005b)
II. La voie de sécrétion et les points de contrôle qualité
Nous allons maintenant décrire de façon succincte la voie de sécrétion des protéines
membranaires. A l’exception de quelques exemples spécifiques qui seront précisés dans le
texte, la description qui est réalisée dans ce chapitre correspond à la voie la voie de sécrétion
chez la levure Saccharomyces cerevisiae.
A. Le Réticulum Endoplasmique
1. La maturation des protéines
a) Insertion dans la membrane
Au cours de la traduction, la présence d’un « peptide signal » sur la chaîne
polypeptidique néosynthétisée est reconnue par une particule ribonucléoprotéique, le Signal-
Recognition Particle (SRP), qui s’y lie, ce qui provoque la migration du complexe ribosome-
chaîne naissante-SRP jusqu’au récepteur à SRP situé sur la membrane du Réticulum
Endoplasmique. Cette première étape permet l’interaction entre le ribosome et le complexe
Sec61p, qui catalyse la translocation au sens strict (Figure 3). Dans le cas des protéines
intégrées, la traduction et la translocation sont généralement deux évènements concomitants :
les séquences polypeptidiques correspondant aux domaines transmembranaires de la protéine
27

sont immédiatement transférées au sein du tunnel de translocation du complexe Sec61 dès lors
qu’elles sont synthétisées (Rapoport, 2007). Les domaines cytosoliques et luminaux sont
respectivement retenus dans le cytoplasme au niveau de la jonction ribosome-tunnel, ou
traversent de part en part le tunnel de translocation pour atteindre le lumen du Réticulum
Endoplasmique. Les segments hydrophobes néo synthétisés se déplacent ensuite du tunnel de
translocation vers la bicouche lipidique environnante par une diffusion latérale après une
ouverture du complexe de translocation (Van den Berg et al., 2004). Il est à noter que
l’insertion au sein de la bicouche lipidique ne se déroule pas de la même façon selon que les
extrémités N et C terminales de la protéine sont cytosoliques ou luminales (pour revue, voir
(Rapoport et al., 2004)) (Figure 3).
b) Le repliement des protéines
Une fois insérée dans la bicouche lipidique, la protéine doit acquérir une structure
tertiaire précise, indispensable à sa sortie du RE et, lorsqu’elle aura rejoint sa destination
finale, à sa fonction. Elle subit donc dans ce compartiment un repliement (« folding »)
nécessaire à l’obtention de sa forme native. Cette étape est assurée par des protéines
chaperonnes, localisées majoritairement dans le lumen du RE, mais également dans le
cytoplasme (qui pourront intervenir sur le repliement des protéines transmembranaires). Ce
repliement consiste notamment à faire subir aux protéines des modifications post
traductionnelles (N-glycosylations, formation de ponts disulfure…), et peut aussi aboutir à la
mise en place de complexes multimériques.
Il existe trois groupes majeurs de chaperonnes :
• Les chaperonnes de la famille des protéines « heat shock ». On peut citer parmi
elles la protéine BiP (également appelée Kar2p chez la levure) et ses co-chaperonnes
partenaires, telle que Hsp40 (Johnson and van Waes, 1999). La protéine BiP est également le
point central du contrôle qualité du Réticulum Endoplasmique (voir plus loin).
• Les chaperonnes lectines telles que la calnexine et la calréticuline, protéines
impliquées dans la N-glycosylation des protéines. Ces deux lectines ont un rôle important
dans le contrôle qualité chez l’humain notamment pour la prise en charge des glycoprotéines
(Zhang et al., 1997). Un homologue de la calnexine existe chez la levure (Cne1p), mais son
implication dans la régulation des protéines N-glycosylées n’a pas été clairement démontrée
(Zhang et al., 2008).
• Les chaperonnes PDI pour Protein Disulfide Isomerase, responsables de la
formation des ponts disulfure (Sevier and Kaiser, 2002), et également impliquées dans le
28

contrôle qualité (pour revue de l’implication de ces chaperonnes dans le contrôle qualité, voir
(Ellgaard et al., 1999))
L’intervention des chaperonnes dans le repliement des protéines étant un sujet
particulièrement complexe et très documenté, nous ne développerons pas ces aspects plus
avant. Pour plus de détails, le lecteur pourra se rapporter à plusieurs revues très complètes
traitant cette thématique (Fewell et al., 2001; Trombetta and Parodi, 2003; Saibil, 2008;
Wandinger et al., 2008).
Les protéines correctement repliées au niveau du RE rejoignent ensuite l’appareil de
Golgi. Le transfert est assuré par des vésicules formées à partir de la membrane du RE,
vésiculation catalysée par la machinerie COP II (pour Coat Protein Complex ; (Sato and
Nakano, 2007)).
Cette vésiculation se fait en 3 étapes : la première consiste en la formation du manteau.
Une séquence peptidique spécifique appelée « peptide de destination », portée par la protéine
cargo, se lie à un récepteur présent à la membrane du RE. Ce complexe va alors se concentrer
au niveau d’un site particulier appelé « site de sortie ». Celui-ci est caractérisé par la
formation d'un bourgeon, tapissé du côté cytosolique par une couche protéique complexe
hétérogène : le manteau (« coated vesicle » ou « vésicule tapissée »). Les récepteurs fixant la
protéine cargo font partie intégrante de ce manteau et, avec d'autres partenaires, élaborent la
charpente de la vésicule en formation. Ce principe de vésiculation est retrouvé tout le long de
la voie de sécrétion. Cependant, suivant l’organelle considérée, le manteau sera constitué de
complexes protéiques spécifiques : COP–II (REr), COP–I (Golgi), AP/clathrine (Golgi,
endosomes et membrane plasmique), GGA (Golgi) et cavéoline (Golgi/membrane plasmique).
Selon la nature de la protéine, le type d’ancrage est différent : soit la protéine est
transmembranaire et dans ce cas son « peptide de destination » interagit directement avec le
récepteur du manteau ; soit la protéine est soluble et son « peptide de destination » interagit
avec un adaptateur, lui-même fixé à un récepteur du manteau. La formation du site de sortie
est amorcée par de petites protéines liant le GTP, membres des familles Arf/Sar et Rab.
Quand elles se trouvent en position membranaire (coté cytoplasmique) et liées au GTP, elle
recrutent sélectivement des récepteurs (composant du manteau), des enzymes modifiant les
lipides (phospholipases et PI kinases), des protéines motrices et des golgines (protéines
d'arrimage). Ces protéines, à leur tour, recrutent d'autres partenaires dont les SNAREs (ou
« protéines de fusion »). Intervient ensuite l’étape de fission, au cours de laquelle les
29

ourgeons formés au niveau des sites de sortie se séparent de la membrane du RE. Une fois
formée, la vésicule perd son manteau sous l’action de l’hydrolyse du GTP en GDP, les
composants de ce dernier étant recyclés par le RE pour une nouvelle vésiculation. Enfin,
intervient l’étape de fusion avec la membrane acceptrice. Celle-ci se déroule sous l’action
principale des protéines SNAREs, assistées par des protéines accessoires. Une fois cette
opération terminée, le complexe SNARE est démantelé afin de pouvoir être utilisé à nouveau
pour une nouvelle fusion.
Néanmoins, l’efficacité de repliement des protéines au sein du RE, dont dépend leur
sortie vers l’appareil de Golgi, varie énormément d’une protéine à l’autre. Ainsi, certaines
protéines virales, telle que le « Vesicular Stomatitis Virus Glycoprotein » (VSVG) ont une
efficacité de repliement d’environ 90 %, alors que celle de la protéine CFTR humaine serait
limitée à 20 % seulement. Il est estimé à 30 % environ la quantité de polypeptides ne voyant
pas leur synthèse s’effectuer jusqu’à leur terme (Aridor, 2007). Les protéines mal repliées
présentent une tendance à s’aggréger et, de ce fait, sont susceptibles d’entraîner un
dysfonctionnement de la voie de sécrétion. L’accumulation de ces protéines mal repliées
induit l’activation d’un contrôle qualité au niveau du Réticulum Endoplasmique.
2. Le contrôle qualité du Réticulum Endoplasmique
Le Réticulum Endoplasmique possède un contrôle qualité constitué de deux
mécanismes complémentaires :
• L’Unfolded Protein Response (UPR) qui a pour rôle majeur de prévenir la
surcharge du RE en protéines structurellement non-conformes en favorisant leur repliement
correct. Plusieurs autres facteurs peuvent entraîner cette réponse : la concentration calcique
intraluminale, les problèmes de glycolysation, la carence en nutriment, l’infection par un
pathogène ou bien encore le changement de potentiel redox au sein du RE. Il est à noter que
tous ces phénomènes sont connus comme facteurs de stress du RE (Schröder, 2008). L’UPR a
donc un rôle préventif.
• L’Endoplasmic Reticulum Associated Degradation (ERAD) qui aura pour but
d’éliminer les protéines ne pouvant être correctement repliées suite, notamment, à un échec de
la réponse UPR.
Un schéma représentant l’action conjointe de l’UPR et de l’ERAD est présenté en Figure 4.
30

Non repliée Forme native
Mauvais repliement
Figure 4 : Modèle schématique illustrant les actions coordonnées de l’UPR et de l’ERAD
Après leur translocation dans le lumen du RE, les protéines sécrétées n’ont, pour la plupart, pas acquis leur
structure tridimensionnelle définitive. Dans ce compartiment, elles vont être repliées et éventuellement
oligomérisées grâce à l’intervention de protéines (et de lipides) chaperonnes, puis continuer leur transit dans la
voie de sécrétion. Dans les cas où l’action des chaperonnes n’est pas suffisante pour permettre l’obtention de
cette conformation minimale, les protéines mal-repliées peuvent être prises en charge par la machinerie de
l’ERAD, conduisant à leur dégradation par le protéasome dans le cytoplasme. Parallèlement, l’accumulation de
protéines mal repliées induit le déclenchement de la réponse UPR. L’UPR va agir pour réguler le taux de
protéines mal repliées selon quatre stratégies différentes : 1/ en augmentant le taux de protéines chaperonnes
dans le RE, 2/ en stimulant la sécrétion des protéines hors du RE (par induction de gènes impliquées dans la
formation des vésicules, notamment), 3/ en régulant négativement la synthèse protéique et, 4/ le cas échéant, en
augmentant la capacité de dégradation des protéines mal repliées via l’ERAD.
D’après Travers KJ, et al (Travers et al., 2000).
31

Voie IRE1-XBP1
(conservée des levures à
l’homme)
Induction de gènes
impliqués dans la
maturation des protéines
et dans l’ERAD
Voie ATF6:
Induction de gènes
impliqués dans la
maturation des
protéines
Figure 5 : Les différentes voies de l’UPR chez les Eucaryotes
ERAD
32
Voie PERK:
• Inhibition générale de la traduction
• Augmentation de la traduction de
certains gènes impliqués dans la
maturation
• Déclenchement de la voie
apoptotique
Lorsque les protéines mal repliées s’accumulent dans le RE, elles se lient à la protéine chaperone BiP (pour
immunoglobulin-binding protein), qui était jusque là en interaction avec les trois protéines impliquées dans la
réponse UPR : ATF6, IRE1 et PERK. Par compétition, BiP va donc se dissocier de ces protéines, avec les
conséquences suivantes : 1/ ATF6 (Activating Transcription Factor 6) migre jusqu’à l’appareil de Golgi où elle
est clivée par les protéases site-1 et site-2, provoquant la libération du segment cytoplasmique, qui migre
jusqu’au noyau pour activer la transcription des gènes responsables de la réponse UPR, dont XBP-1 (X-boxbinding
protein-1 (XBP1)) ; 2/ En parallèle, la dissociation de BiP d’IRE1 (inositol-requiring 1) va entraîner la
dimérisation de cette dernière et l’activation de son activité RNAse. IRE1 va alors cliver l’ARNm de XBP1, pour
générer un ARNm mature qui code pour un facteur de transcription intervenant dans la régulation positive des
gènes cibles de l’UPR ; 3/ Enfin, comme dans le cas d’IRE1, PERK (Protein-kinase like endoplasmic reticulum
kinase) va se dimériser, puis phosphoryler le facteur eIF2α, provoquant une baisse générale du niveau de
traduction. Cependant, certains ARNm sont préférentiellement traduits dans ces conditions. C’est notamment le
cas de celui d’ATF4, un facteur de transcription lui-même impliqué dans l’induction de la réponse UPR.
D’après Kaufman RJ (Kaufman, 2004).

a) L’Unfolded Protein Response
La notion d’UPR est apparue dans la littérature en 1992 chez la levure Saccharomyces
cerevisiae, suite à la découverte de séquences cis-régulatrices particulières, nommées par la
suite UPRE (pour UPR Element), sur le promoteur du gène codant pour la chaperonne Kar2p
(BiP) (Mori et al., 1992). Un an plus tard, deux équipes différentes ont réussi, par le biais
d’un crible génétique, à isoler le gène IRE1 (Cox et al., 1993; Mori et al., 1993), puis plus
tard le gène HAC1 (Cox and Walter, 1996b; Mori et al., 1996), tous deux indispensables à la
réponse UPR. L’apport de différentes équipes a ensuite permis de décrire la cascade
d’évènements. Dans des conditions normales, la protéine Ire1p, protéine transmembranaire de
type 1 du RE présentant un domaine cytoplasmique homologue à la ribonucléase RNAseL, est
physiquement liée à la protéine Kar2p, qui est localisée dans le lumen du RE. Dans des
conditions d’accumulation de protéines mal repliées, Kar2p perd son interaction avec Ire1p,
pour remplir sa fonction de chaperonne. Cet évènement entraîne la dimérisation d’Ire1p, son
autophosphorylation, et l’activation de son domaine endonucléase. Sa cible est l’ARNm de
HAC1, qui code un facteur de transcription. Plus spécifiquement, cette activité catalyse le
clivage de 252 bases, et en coordination avec la tRNA-ligase Rgl1p, la formation d’un ARNm
fonctionnel. Hac1p est alors synthétisée, et peut intervenir en tant que facteur de transcription
en se fixant sur la séquence UPRE de ses gènes cibles (dont Kar2p)(pour revue, voir (Shen et
al., 2004)).
Chez Saccharomyces cerevisiae, 381 gènes dont les produits sont impliqués
directement ou indirectement dans la réponse UPR ont été répertoriés (Travers et al., 2000).
Parmi ces gènes, on en retrouve codant pour des chaperonnes, mais également pour des
protéines impliquées dans la prolifération de la membrane du RE (enzymes de certaines voies
de biosynthèse des lipides notamment), ou codant pour des membres de la machinerie de
l’ERAD (Endoplasmic Reticulum Associated Degradation ), tels que HDR1/DER3, HDR3,
DER1, UBC7 (Hampton, 2000), sur lesquels nous nous attarderons un peu plus loin.
Chez les mammifères, le système UPR est plus complexe que chez la levure
(Figure 5) (Shen et al., 2004; Ron and Walter, 2007). Les cellules de mammifères possèdent
deux homologues de Ire1p, nommés IRE1α et IRE1β. De la même façon que chez la levure,
en cas d’une accumulation importante de protéines mal repliées, IRE1 se dimérise et
s’autophosphoryle, avec pour conséquence l’activation de son activité endoribonucléasique
qui catalyse le clivage de l’ARNm de XBP1 (homologue fonctionnel mammifère de HAC1).
33

De la même manière qu’Hac1p, la protéine synthétisée à partir de cet ARNm épissé va activer
la transcription d’un grand nombre de gènes cibles via son interaction avec des séquences
UPRE localisées sur leur promoteur. Le point divergent par rapport au système levure est le
fait que chez les mammifères, l’ARNm non épissé de XBP1 est également traduit en une
forme moins stable que celle obtenue à partir de l’ARNm épissé, mais ayant une fonction de
régulateur négatif des cibles de l’UPR (Yoshida et al., 2006). Il a été proposé que cet effet
négatif pourrait jouer un rôle dans l’arrêt de l’UPR une fois le stress contrôlé (Yoshida et al.,
2006).
Une autre spécificité des mammifères est l’existence de deux autres voies de
régulation de l’UPR, une dirigée par ATF6 et l’autre par PERK.
ATF6 est une protéine du Réticulum Endoplasmique, traduite de façon constitutive,
mais sous forme inactive. Elle possède un domaine transmembranaire et une partie sensible au
stress localisée dans le lumen du RE. Dans des conditions de stress, ATF6 est transportée de
ce compartiment vers l’appareil de Golgi où elle est clivée par deux protéases résidentes, les
protéines S1P et S2P, ce qui provoque la libération de sa partie cytosolique, appelée ATF6f.
Cette dernière migre jusque dans le noyau pour activer l’expression de gènes dont le produit
est impliqué dans l’UPR. De la même façon que pour IRE1, la détection des protéines mal
repliées dans le RE semble se faire de façon indirecte par perte d’association avec BiP (Shen
et al., 2002). Il est à noter qu’un certain nombre de cibles d’ATF6f sont communes à la voie
IRE1-XBP1.
PERK est une protéine qui ressemble à IRE1 d’un point de vue structural et
fonctionnel. Tout comme IRE1, c’est une protéine transmembranaire du RE, présentant un
domaine luminal sensible au stress, et capable de s’oligomériser et de s’autophosphoryler lors
de son activation. Cependant, à la différence d’IRE1, PERK est capable de phosphoryler une
autre protéine, la sous unité α du facteur d’initiation de traduction 2, eIF2α (eukaryotic
translation initiation factor-2). Ceci provoque une inactivation partielle d’eIF2α, avec pour
conséquence une diminution globale du taux de protéines synthétisées qui pourraient
s’accumuler dans le RE déjà saturé (Harding et al., 1999). En outre, cette phosphorylation
d’eIF2α par PERK permet également l’activation de la transcription de certains gènes
impliqués dans la réponse UPR.
34

) L’Endoplasmic Reticulum Associated Degradation
Comme précisé plus haut, l’UPR ne suffit pas toujours à canaliser la surcharge de
protéines mal repliées. La cellule enclenche alors un processus permettant la dégradation
d’une partie de ces protéines : l’ERAD.
La voie ERAD, commune aux levures et à l’homme, repose sur la dégradation par le
protéasome de protéines présentes sous une forme non native. Le protéasome 26S est un
complexe formé de multiples sous-unités, spécialisées dans la reconnaissance, la fixation ou
l’activité de dégradation à proprement parler des protéines mal repliées (Figure 6). Ce
processus opère selon un mécanisme dépendant de l’ubiquitine, un peptide de 76 acides
aminés. Cette petite protéine de 8500 Da est fortement conservée chez les eucaryotes, avec un
taux d’homologie de 96 % entre la levure et l’homme.
Dans un premier temps, les protéines cibles sont renvoyées du RE vers le cytoplasme,
via le translocon Sec61p ou un autre canal formé par la protéine Der1p. Une fois dans le
cytoplasme, une première molécule d’ubiquitine forme une liaison covalente par son
extrémité C-terminale avec la protéine cible, au niveau d’un résidu lysine (liaison
isopeptidique). Cette réaction est catalysée par une ubiquitine ligase. Puis, d’autres
ubiquitines (il faut au moins une queue de 4 ubiquitines pour que la dégradation par le
protéasome s’effectue) vont être greffées les unes à la suite des autres, par liaison covalente
entre l’extrémité C-terminale de l’ubiquitine libre et le résidu lysine 48 de l’ubiquitine
précédente. Le complexe Cdc48 (p97 chez l’homme) catalyse la dislocation de la protéine
(soit son extraction complète de la membrane du RE). Cette dernière, sous forme non native et
étiquetée par une queue ubiquitine, se lie au niveau d’un domaine spécifique de Rad23p et
Dsk2p, qui possèdent également un domaine ubiquitine-like reconnu par une sous-unité du
protéasome. La protéine mal repliée est alors acheminée jusqu’à ce dernier qui va catalyser sa
dégradation (Figure 6) (pour revue, voir (Meusser et al., 2005; Pety de Thozee and Ghislain,
2006)).
35

Figure 6 : Principe du fonctionnement de l'ERAD
Les protéines mal-repliées sont reconnues dans la lumière du RE par les différents mécanismes de contrôle
qualité que nous avons évoqués. Elles vont être « escortées » jusqu’à un complexe d’export putatif (impliquant
les protéines Der1p et/ou Sec61p), qui va catalyser leur translocation hors du RE, vers le cytoplasme. Certains
résidus lysine qui se trouvent exposés à la face cytoplasmiques vont subir des évènements d’ubiquitination,
catalysés par des ubiquitine-ligases. Enfin, la rétrotranslocation (on parle également de dislocation) va être
achevée avec l’aide du complexe Cdc48p/p97, et la protéine sera adressée vers le protéasome pour dégradation
par l’intermédiaire de plusieurs protéines accessoires, dont Rad23p et Dsk2p.
D’après Meusser et al. (Meusser et al., 2005).
36

Dans les cas où les systèmes classiques de réponse à un stress du RE évoqués ci-
dessus ne peuvent subvenir aux besoins de la cellule, cette dernière a recours à un autre mode
de régulation dérivé de l’autophagie : l’ER-phagy (Bernales et al., 2006). Au cours d’une
autophagie classique, une partie du cytoplasme y compris ses organelles se retrouvent inclus
au sein d’une vésicule délimitée par une bicouche lipidique appelée autophagosome. Cette
dernière fusionne avec la vacuole, afin d’y libérer son contenu qui sera dégradé. Certaines
études montrent que des protéines impliquées dans le phénomène d’autophagie ont pour gènes
des cibles de l’UPR. La cellule semble ainsi se préparer à un éventuel échec des chaperonnes.
Cependant, pour l’ER-Phagy, Bernales et al. ont proposé que ce mécanisme n’a pas pour but
de dégrader les protéines mal repliées, mais plutôt de les séquestrer dans des vésicules afin de
contrer la forte expansion du RE due à leur accumulation (Bernales et al., 2006). Ces
vésicules semblent d’ailleurs prendre naissance à partir de la membrane du RE. L’existence
de cette voie a également été démontrée chez l’homme (Ogata et al., 2006; Li et al., 2008).
3. Connexions entre le contenu lipidique et la sortie du RE
Comme évoqué plus haut, du fait de leur ancrage au sein de la bicouche lipidique, les
protéines membranaires sont extrêmement sensibles à la composition lipidique des
membranes biologiques. De nombreuses études ont été menées sur ces relations,
principalement en utilisant des mutants affectés dans la formation de sous-domaines
lipidiques de composition spécifique, tels que les rafts. Les mutants les plus communément
utilisés sont le mutant lcb1-100, un mutant thermosensible qui présente un défaut de synthèse
des sphingolipides à température non-permissive, et des mutants de la voie de biosynthèse de
l’ergostérol (erg3Δ, erg4Δ, erg5Δ, erg6Δ, et erg24Δ). LCB1 code pour l'une des 2 sous-unités
de la sérine palmitoyltransférase essentielle à la synthèse des bases à longues chaînes qui sont
l'un des éléments de l’ossature des sphingolipides ((Buede et al., 1991) ; voir dans la partie
Résultats). Bien que l'essentiel des effets délétères des lipides soit constaté au niveau de
l'appareil de Golgi (voir plus loin), des effets ont également été constatés dès le Réticulum
Endoplasmique.
Il a été démontré que Pma1p, protéine majoritaire de la membrane plasmique,
s’associe aux rafts dès le RE (Lee et al., 2002). C'est également dans ce compartiment qu'elle
va s'oligomériser pour former un complexe de très haut poids moléculaire (1,8 MDa ; (Lee et
al., 2002)). De façon intéressante, dans une cellule lcb1-100 dans laquelle la formation des
rafts est compromise, Pma1p ne peut plus former d'oligomères, suggérant que la formation
37

des rafts est un prérequis pour l’oligomérisation de Pma1p (Lee et al., 2002). Cependant, la
formation d'oligomères ne semble pas essentielle pour permettre la sortie du RE. En effet, des
études menées par l'équipe d'Amy Chang (Université du Michigan) dans des cellules lcb1-100
ont montré que dans une telle souche, à 30 °C, température semi-permissive à laquelle la
synthèse des bases à longues chaînes est déjà partiellement altérée, Pma1p rejoint la
membrane plasmique sous forme de monomère (Chang and Fink, 1995; Wang and Chang,
2002). Cette étude a également montré que le mutant lcb1-100 était un mutant suppresseur de
pma1-D378Np, une forme mutante de Pma1p qui entraîne la rétention de la forme sauvage
dans le RE et sa dégradation par le mécanisme de l’ERAD (Wang and Chang, 2002). Dans
une telle souche, l’incapacité à former des hétéro-oligomères entre la forme sauvage et la
forme mutée de Pma1p permet à la forme sauvage d'échapper à l'ERAD et de rejoindre la
membrane plasmique, où elle est active mais instable, probablement du fait de sa forme
monomérique (Wang and Chang, 2002). Il est également intéressant de noter qu'à 37°C,
température non permissive à laquelle la synthèse des bases à longues chaînes est totalement
interrompue, Pma1p ne peux plus rejoindre la membrane plasmique et est envoyée depuis
l'appareil de Golgi vers la vacuole pour dégradation (Wang and Chang, 2002). Ces différentes
observations semblent indiquer, d'après les auteurs, une implication des sphingolipides à trois
niveaux de la biogénèse de Pma1p : au niveau de la formation des oligomères dans le
Réticulum Endoplasmique, au niveau de la stabilité de la protéine à la membrane plasmique
et, enfin, au niveau du contrôle qualité au sein de l'appareil de Golgi (voir plus loin).
Récemment, l'équipe de Roger Schneiter de l’université de Fribourg a cherché à
comprendre plus précisément quels éléments des sphingolipides étaient mis en jeu dans le
mécanisme de biogénèse de Pma1p (Gaigg et al., 2005b; Gaigg et al., 2006). En utilisant une
souche de levure dans laquelle les sphingolipides sont remplacés par un phospholipide à très
longue chaîne d'acides gras, un phosphatidylinositol (PI) contenant une chaîne d'acides gras
C26 en sn-2, ils ont pu constater que Pma1p se retrouvait de la même manière que dans une
souche sauvage au niveau de la membrane plasmique et associée aux rafts, démontrant que le
paramètre clef était la longueur de l'acide gras du sphingolipide et non le sphingolipide per se
(Gaigg et al., 2006). Une autre constatation étonnante a été réalisée dans des souches mutées
au niveau de la voie de biosynthèse de l'ergostérol (Gaigg et al., 2005b). Dans de telles
souches (erg24Δ, erg3 Δ, erg4 Δ et erg5 Δ), la biogenèse de Pma1p ne semble pas être
affectée. Ces différentes observations nous amènent à dire que ni les sphingolipides, ni les
stérols, ne sont essentiels en tant que tels, mais que leurs propriétés biophysiques spécifiques
jouent un rôle primordial.
38

Cependant, toutes les protéines ne réagissent pas de manière identique aux mêmes
carences. Ainsi, pour une autre protéine associée aux rafts, la perméase à uracile Fur4p, la
biogenèse dans une souche lcb1-100 n'est pas altérée (Dupre and Haguenauer-Tsapis, 2003).
A 30°C comme à 37°C, température non permissive, Fur4p est adressée à la membrane
plasmique, avec un délai à 37°C toutefois. Ce retard semble être dû à une rétention transitoire
dans le Réticulum Endoplasmique (Dupre and Haguenauer-Tsapis, 2003). De plus, à la
membrane plasmique, Fur4p n’est pas instable, contrairement à Pma1p (Wang and Chang,
2002). Ceci pourrait s'expliquer par une association plus faible de Fur4p avec les rafts par
rapport à Pma1p (Dupre and Haguenauer-Tsapis, 2003), et également par son association, au
niveau de la membrane plasmique, à des domaines lipidiques de nature différente que ceux
contenant Pma1p (Malinska et al., 2004).
Can1p, autre protéine membranaire connue comme associée aux rafts (Malinska et al.,
2003), présente un comportement intermédiaire entre Fur4p et Pma1p (Malinska et al., 2003).
En effet, dans des mutants de la voie de biosynthèse de l'ergostérol (erg24Δ et erg6 Δ), Can1p
est retenue dans RE, alors que dans un mutant lcb1-100 la protéine est adressée à la vacuole
(Malinska et al., 2003). Cependant, dans ce cas, les auteurs n'ont pas évalué si elle était
préalablement adressée à la membrane plasmique, ou si elle était directement dirigée vers la
vacuole depuis un compartiment intracellulaire.
Bien que ces protéines soient décrites comme associées aux rafts, l'influence d'autres
lipides non rafts peut avoir des conséquences sur leur biogenèse, et ceci dès le RE. Par
exemple, Opekarova et ses collaborateurs ont étudié l'impact d'un phospholipide, la
phosphatidyléthanolamine (PE), sur la biogénèse de Pma1p et Can1p (Opekarova et al.,
2005). La PE a été décrite comme un élément important dans la stabilité des protéines au sein
des membranes en raison de son rôle dans le phénomène de stress de courbure notamment
(voir plus loin). Dans une souche RY200T, présentant une délétion dans les gènes PSD1,
PSD2 et DPL1, et qui ne peut synthétiser de PE sans apport exogène d'éthanolamine,
Opekarova et al. ont constaté l'absence d'adressage de Can1p et de Pma1p à la membrane
plasmique. Cependant, le phénotype obtenu est différent pour les deux protéines. Dans le cas
de Can1p, la protéine se retrouve bloquée au niveau de l'appareil de Golgi, tandis que Pma1p
est séquestrée dans le RE (Opekarova et al., 2005). Néanmoins, les deux protéines sont
toujours associées aux DRM, sur le critère « classique » de résistance à la solubilisation par le
Triton X-100. Une étude complémentaire de solubilisation menée à l'aide d'un autre détergent
non ionique, le Nonyl Glucoside, a fait apparaître des résultats plus nuancés. En effet, si
Pma1p présente le même comportement vis-à-vis de ce détergent dans une souche dépourvue
39

en PE ou non, Can1p apparaît comme étant plus soluble dans une cellule sans PE que dans
une cellule sauvage en réponse à ce détergent (Opekarova et al., 2005). Ce résultat laisse
supposer que l’environnement lipidique immédiat de Can1p est différent entre l'appareil de
Golgi et la membrane plasmique. Cette différenciation de solubilité de Can1p et Pma1p selon
la nature du détergent utilisé semble appuyer les résultats obtenus par cette équipe en 2003, à
savoir une localisation de Can1p et Pma1p dans des sous-domaines lipidiques différents au
niveau de la membrane plasmique (Malinska et al., 2003). Il est également à noter que deux
autres protéines membranaires, Fur4p et Sur7p, une protéine de la membrane plasmique à la
fonction inconnue, sont également retrouvées dans les mêmes domaines lipidiques que Can1p
(Malinska et al., 2004).
Ainsi, l'influence des lipides au niveau de la biogénèse des protéines membranaires est
constatée dès le RE. Alors que les sphingolipides et l'ergostérol ont une influence qui était
prévisible compte-tenu de leur implication dans la formation des rafts, les phospholipides
constituant l’environnement immédiat des protéines (connus sous le nom de « lipides
annulaires » (Lee, 2003b)) semblent également jouer un rôle primordial (voir plus loin).
B. L’appareil de Golgi.
1. Trafic dans l’appareil de Golgi
L’appareil de Golgi est un organite polarisé, formé par un réseau de « citernes ». Les
protéines arrivant par la machinerie COPII entrent dans ce compartiment au niveau du cis-
Golgi, puis migrent jusqu’au trans-Golgi en « cheminant » le long du réseau. Deux
hypothèses ont été proposées quant aux modalités de ce transport. Le premier modèle repose
sur l’existence de « vésicules navettes ». Pour les défenseurs de ce modèle, les différentes
citernes de l’appareil de Golgi sont des entités stables, et le transport des protéines se fait par
la formation de petites vésicules qui migrent d’une citerne à l’autre, via la machinerie COPI.
Le second modèle s’appuie sur la maturation et la progression des citernes. Dans ce cas, les
vésicules arrivant au niveau de cis-Golgi fusionneraient avec la première citerne de l’appareil
de Golgi puis, alors que les protéines resteraient au sein de la membrane de la citerne, cette
dernière progresserait dans son intégralité vers la face trans-Golgienne, recyclant les enzymes
au fur et à mesure de sa progression par un transport rétrograde catalysé par COPI. Un modèle
intermédiaire a également été proposé, dans lequel les différentes citernes pourraient créer des
40

« ponts » entre elles de manière transitoire, permettant ainsi la continuité de leur contenu
luminal (Mironov et al., 2005).
Au niveau du trans-Golgi, les protéines cargo vont finalement rejoindre un réseau bien
organisé, constitué d’un continuum de vésicules s’appuyant sur la structure tubulaire de la
cellule : le Trans Golgi Network (TGN). Néanmoins, ce réseau est particulièrement complexe
du fait de la multiplicité de directions que peuvent prendre les vésicules émergeant du TGN
(membrane plasmique, endosomes et autres compartiments particuliers dans les cellules
spécialisées), et de son rôle d’interface entre la voie exocytaire (vers la membrane plasmique)
et la voie endocytaire (au travers par exemple des endosomes dits recyclés). Pour plus de
détail concernant ces différents aspects du traffic depuis le TGN, le lecteur pourra se référer à
la revue écrite par De Matteis (De Matteis and Luini, 2008).
2. Contrôle qualité dans l’appareil de Golgi
Les contrôles qualité ne sont pas le seul apanage du RE. En effet, lors du
déclenchement de l’UPR, des gènes impliqués dans le transport RE/Golgi, et plus
généralement dans le transport le long de la voie de sécrétion, sont régulés positivement
(Travers et al., 2000). Cette activation permet de libérer le RE d’une surcharge de protéines
mal repliées, en permettant leur « échappement » le long de la voie de sécrétion, hors de ce
compartiment. Néanmoins, les protéines qui échappent de cette façon au contrôle qualité du
RE ne sont pas pour autant correctement repliées, et peuvent alternativement être prises en
charge par le Contrôle Qualité de l’appareil de Golgi (CQG). Celui-ci va s’exercer selon deux
mécanismes bien différenciés, consistant soit en un transport rétrograde de la protéine mal
repliée vers le RE, soit en son adressage direct de l’appareil de Golgi vers la voie endosomale.
Un schéma représentant succinctement ces deux voies de régulation, ainsi que celle
intervenant au niveau de la membrane plasmique (voir plus loin), est donné dans la Figure 7.
a) Le transport rétrograde. Cycle appareil de Golgi/RE.
Ce mécanisme a été démontré en 2001 par Vashsit et al. (Vashist et al., 2001) pour la
protéine KHN dérivée du virus « simian virus 5 hemagglutinin neuraminidase », modifié au
niveau de sa séquence polypeptidique. Cette protéine subit un transport rétrograde du Golgi
vers le RE selon un processus impliquant la machinerie COPI, où elle sera finalement prise en
charge et dégradée par le mécanisme de l’ERAD.
41

Figure 7: Rôles des compartiments post-RE dans le contrôle qualité de la voie de sécrétion
A partir de l’appareil de Golgi, les protéines mal-repliées peuvent : 1/ subir un transport rétrograde vers le RE
pour y être prises en charge par l’ERAD, 2/ être directement envoyées vers le système endosomal pour
dégradation dans la vacuole, ou 3/ (et 4/) être préalablement adressées à la membrane plasmique avant leur
internalisation vers la vacuole via le système endosomal.
D’après Arvan et al. (Arvan et al., 2002).
42

) L’envoi direct appareil de Golgi/voie endosomale
Prise en charge de protéines mutées par le contrôle qualité de l’appareil de Golgi
Une des premières indications d’un contrôle qualité post-RE date de 1995 dans une
étude menée par Amy Chang et ses collaborateurs sur la protéine Pma1p (Chang and Fink,
1995). Ces auteurs ont identifié un mutant thermosensible, le mutant Pma1-7p, portant deux
substitutions d’acides aminés (P434A et G789S), qui est capable d’échapper au contrôle du
RE et à la dégradation par l’ERAD mais est adressé, à température non-permissive,
directement de l’appareil de Golgi dans la voie endosomale, puis dans la vacuole pour
dégradation (Chang and Fink, 1995). Pma1p étant essentielle à la croissance, le
développement d’une souche de levure exprimant le seul allèle pma1-7 est donc compromis à
la température non-permissive de 37°C.
En s’appuyant sur cette propriété, Luo et Chang (1997) ont réalisé le criblage d’une
librairie de mutants d’insertion permettant la croissance de la souche à 37°C et donc le
réadressage de Pma1-7p à la membrane plasmique. De ce criblage, 16 mutants SOP (pour
Suppressor Of Pma1-7) ont été isolés, dont 8 correspondaient à des mutants VPS (Vacuolar
Protein Sorting) déjà caractérisés, impliqués dans la biogenèse des protéines vacuolaires. Bien
que non directement impliqués dans cette biogenèse vacuolaire, 6 autres mutants ont
également un rôle dans le trafic de l’appareil de Golgi vers les endosomes, ou des endosomes
vers la vacuole (Luo and Chang, 1997; Luo and Chang, 2000). Enfin, 2 correspondent à des
protéines résidentes du RE (voir plus loin). Chang et ses collaborateurs ont proposé à la suite
de ces observations l’existence d’une voie alternative d’adressage à la membrane plasmique
depuis le l’appareil de Golgi et via le système endosomal, qui serait empruntée par Pma1-7p
dans ces mutants.
Par la suite, d’autres protéines, notamment des transporteurs d’acides aminés et de
bases azotés ont été décrits comme empruntant la voie Golgi/vacuole, notamment en réponse
à la présence de leur substrat en excès dans le milieu extracellulaire.
Relations entre ubiquitination et contrôle qualité dans l’appareil de Golgi
En effet, en 1997, l’équipe de Chris Kaiser de l’université de Cambridge a démontré
qu’en présence de glutamate, l’un de ses substrats, Gap1p était envoyée directement depuis
l’appareil de Golgi vers la vacuole pour dégradation, sans transiter préalablement par la
membrane plasmique (Roberg et al., 1997a). Trois années plus tard, cette équipe et celle de
43

Bruno André (Université libre de Bruxelles) ont pu mettre en évidence que la prise en charge
de Gap1p par le CQG nécessitait son ubiquitination préalable par le complexe ubiquitine
ligase Rsp5p-Bul1p-Bul2p (Helliwell et al., 2001; Soetens et al., 2001).
En 2004, l’équipe d’Amy Chang a constaté le même phénomène pour le mutant
Pma1-7p, suggérant un contrôle général des protéines membranaires par ubiquitination au
niveau du CQG (Pizzirusso and Chang, 2004). Dans cette étude, les auteurs ont montré que
Pma1-7p subissait l’addition de 1 à 4 résidus d’ubiquitine, après la sortie du RE, mais avant
son entrée dans la voie endosomale (Pizzirusso and Chang, 2004). De manière similaire à
Gap1p en réponse à la présence de l’un de ses substrats dans le milieu, l’ubiquitination de
Pma1-7p est catalysée par le complexe Rsp5p-Bul1p-Bul2p, la dégradation vacuolaire de
Pma1-7p n’ayant plus lieu dans les mutants rsp5 ts ou bul1,bul2 à température non permissive.
Dans le mutant bul1,bul2, Pma1-7p est détectée à la membrane plasmique et est active,
comme le démontre la croissance des cellules à 37°C.
De façon similaire Tat2p, un transporteur de tryptophane, est également redirigé de
l’appareil de Golgi vers la vacuole dans des conditions de forte concentration en tryptophane
dans le milieu extracellulaire. Ce réadressage est aussi observé lorsque Tat2p est exprimée
dans un mutant erg6Δ, mutant tardif de la voie de biosynthèse des stérols, indépendamment
de la concentration en tryptophane (Umebayashi and Nakano, 2003). Il est intéressant de noter
que dans ces conditions, Tat2p n’est pas associée aux rafts lipidiques (voir plus loin) et, que
de la même façon que pour Gap1p ou Pma1-7p, Tat2p est ubiquitinylée par le complexe
Rsp5p-Bul1p-Bul2p. La protéine retrouve partiellement son adressage à la membrane
plasmique dans un mutant bul1Δ en forte concentration en tryptophane, de même que dans
une souche erg6Δ délétée pour le gène BUL1. Cependant, il peut être intéressant de noter que
Tat2p dans des conditions de forte concentration en tryptophane ou dans un mutant erg6Δ
n’est pas ubiquitynilée sur les mêmes résidus. Ceci a pu être démontré par l’utilisation d’un
mutant de Tat2p ayant subi une substitution de 3 lysines, dans la région N-terminale de la
protéine connues comme étant les sites accepteurs d’ubiquitines, par des résidus arginines.
Ainsi, dans une souche erg6Δ, ce mutant de Tat2p conserve un taux d’ubiquitination
important alors qu’il n’est plus du tout ubiquitinylé dans une souche sauvage en forte
concentration en tryptophane, montrant une polyubiquitination de sites différents
(Umebayashi and Nakano, 2003).
44

Ces différents éléments suggèrent que l’ubiquitination intervient comme un signal
pour le tri des protéines par le CQG, permettant le réadressage des protéines retenues via la
voie endosomale vers la vacuole pour dégradation.
Cependant, d’autres études tendent à montrer que cette ubiquitination pourrait
intervenir plus tardivement dans la voie endosomale.
Fur4p, comme Gap1p et Tat2p, a été montrée comme étant également redirigée depuis
l’appareil de Golgi vers la vacuole par la voie endosomale lorsque son substrat, l’uracile, est
présent dans le milieu (Blondel et al., 2004b). Cette prise en charge par le CQG ne nécessite
par l’intervention de Tul1p (Ubiquitine ligase résidente de l’appareil de Golgi), mais est
dépendante de Rsp5p, responsable d’une ubiquitination au niveau des lysines 38 et 41 de
Fur4p, les mêmes résidus déjà impliqués dans son internalisation par endocytose (Galan et al.,
1996; Marchal et al., 2000). En procédant à des analyses détaillées, Blondel et al. ont montré
que dans des conditions de faible ubiquitination, dans un mutant rsp5 ts exposé à la
température non permissive, et de forte concentration en uracile, Fur4p est prise en charge par
le CQG et rejoint la voie endosomale, mais n’est pas internalisée dans le lumen de la vacuole :
elle est retenue dans ce cas au niveau de la membrane de cet organite (Blondel et al., 2004b).
Des observations similaires ont également été rapportées pour Tat2p dans un double mutant
erg6Δ, bul1Δ défaillant pour l’ubiquitination (Umebayashi and Nakano, 2003). L’adressage
d’une protéine dans le lumen de la vacuole nécessite qu’au niveau des endosomes dit
« tardifs » la protéine soit internalisée vers des membranes internes, celles-ci résultant de
l’invagination des membranes endosomales. Cette invagination va donner naissance au
compartiment appelé « Multi-Vesicular Body » (MVB) qui, par fusion avec la membrane
vacuolaire, déversera ses vésicules internes (et les protéines s’y trouvant) dans le lumen de la
vacuole où elles seront dégradées. Or, l’ubiquitination par Rsp5p est un signal essentiel pour
l’internalisation des protéines vers les membranes internes (Morvan et al., 2004a).
Il apparaîtrait donc de ces différentes études que l’ubiquitination ne serait pas un
signal précoce dans le contrôle qualité au niveau de l’appareil de Golgi mais interviendrait
plus tard dans la voie endosomale, permettant l’adressage des protéines dans le lumen de la
vacuole pour leur dégradation.
Relations entre lipides et contrôle qualité de l’appareil de Golgi
Bien que certaines protéines soient associées aux DRMs dès le RE, comme Pma1p et
Fur4p (Lee et al., 2002; Dupre and Haguenauer-Tsapis, 2003), d'autres semblent l'être au
45

niveau de l'appareil de Golgi uniquement. C'est le cas pour Can1p (Bagnat et al., 2000) ou
Tat2p (Umebayashi and Nakano, 2003). Il est cependant nécessaire ici de préciser que pour
les premières citées (Pma1p, Fur4p), cette association dès le RE a été remise en cause (Pma1p
(Bagnat et al., 2000) ; Fur4p, Docteur Danièle Urban-Grimal, Université de Paris XI, source
personnelle).
De ce fait, il est possible que l'appareil de Golgi constitue une plateforme de tri de
protéines sur la base de leurs interactions avec les DRMs.
Pma1p est un premier exemple de protéine répondant à ce contrôle. En 2001, Bagnat
et al ont en effet décrit que le mutant Pma1-7p était exclu des rafts dans les conditions de son
adressage vers la voie endosomale (Bagnat et al., 2001). De plus, la forme sauvage Pma1p est
également adressée depuis le Golgi vers la voie endosomale dans des cellules lcb1-100 à
température non permissive. Ceci laisse à penser que l'association aux rafts est indispensable
pour l'adressage de Pma1p à la membrane plasmique. Un élément renforçant cette hypothèse
provient de l’observation selon laquelle la surexpression de la protéine Ast1p, qui permet le
réadressage de Pma1-7p à la membrane plasmique à température non-permissive, favorise son
association aux domaines rafts dans ces conditions (Bagnat et al., 2001). Ast1p est une
protéine qui interagit physiquement avec Pma1p, favorisant son oligomérisation. Ceci suggère
une relation étroite entre oligomérisation et intégration dans les domaines rafts (Lee et al.,
2002), ce dernier paramètre constituant le pré requis pour l’échappement au CQG et la
stabilité en surface
Tat2p subit également la prise en charge du CQG suite à son exclusion des rafts.
Comme nous l’avons évoqué précédemment, Tat2p est redirigée depuis l'appareil de Golgi
vers la voie endosomale dans le cas d'une forte concentration en tryptophane extracellulaire,
ou dans un mutant erg6Δ (Umebayashi and Nakano, 2003). Il est intéressant de noter que,
dans ces deux cas, Tat2p perd son association aux DRMs (Umebayashi and Nakano, 2003).
Cependant, Pma1-7p et Tat2p peuvent être retrouvées à la membrane plasmique sous
une forme non associée aux rafts, sous certaines conditions : c'est le cas pour Tat2p en
présence d’une forte concentration extracellulaire en tryptophane, lorsqu’elle est exprimée
dans un mutant pep12Δ, présentant un blocage dans le trafic de l’appareil de Golgi vers la
vacuole (Umebayashi and Nakano, 2003) ou pour Pma1-7p à 37°C, exprimée dans un mutant
de l'ubiquitine ligase Rsp5p (voir au dessus) (Pizzirusso and Chang, 2004).
46

Un contre-exemple a récemment été apporté par Lauwers and André (Lauwers and
Andre, 2006). Ces auteurs ont en effet montré que l’adressage à la membrane plasmique de la
protéine Gap1p était intégralement dépendant de son association aux DRMs.
Il apparaît donc « simpliste » de définir la prise en charge des protéines intégrées par
le CQG sur la simple base de leur exclusion des domaines rafts ou de leur ubiquitination. Il
semblerait que ces deux phénomènes interviennent de façon inégale selon les protéines et,
pour une protéine donnée, selon les conditions de culture.
3. La connexion contrôle qualité du RE et contrôle qualité de
l'appareil de Golgi
Plusieurs études suggèrent que les contrôles qualité du RE et le CQG seraient
étroitement connectés et que des événements se produisant dans le RE pourraient influencer le
devenir des protéines membranaires dans l’appareil de Golgi.
Un exemple particulièrement intéressant est celui du gène SOP4. L’inactivation de ce
gène permet au mutant Pma1-7p d’échapper au CQG (Luo et al., 2002). La protéine Sop4p est
une protéine résidente du RE, de fonction inconnue, présentant un segment transmembranaire.
La forme sauvage Pma1p est transitoirement retardée dans le RE dans une souche sop4Δ, ce
qui suggère que Sop4p faciliterait l’export de Pma1p de ce compartiment. Ces observations
ont conduit Luo et al. à postuler que la délétion de SOP4, en retardant Pma1-7p dans le RE,
permettrait à cette dernière d’acquérir une structure tridimensionnelle compatible avec son
échappement, plus loin dans la voie, au CQG. Cette hypothèse est renforcée par le fait que
Pma1-7p est adressée à la membrane plasmique après une rétention transitoire dans le RE, par
utilisation d’un mutant thermosensible sec13-1 (Luo et al., 2002). Sec13p est un composant
essentiel de la machinerie COPII d’export du RE (Barlowe et al., 1994).
De façon similaire, il a été montré que Gap1p était prise en charge par le CQG
lorsqu’elle était exprimée dans le mutant sec13-1 (Roberg et al., 1997b). Ceci suggère que
l’étape d’empaquetage des protéines de la membrane plasmique dans le RE pourrait
influencer l’adressage de l’appareil de Golgi vers la membrane plasmique.
D’autres gènes codant pour des protéines résidentes du RE ont été identifiés comme
suppresseurs de Pma1-7p (Luo and Chang, 1997). Il s’agit en particulier de Bsd2p, une
protéine impliquée dans le maintien de l’homéostasie cellulaire des métaux lourds (Liu et al.,
1997) et l’adaptation de l’ubiquitine ligase Rsp5 sur les protéines transmembranaires
47

(Hettema et al., 2004, Sullivan et al., 2007) et de Alg8p, une Glucosyl transferase impliquée
dans les N-glycosylations (Stagljar et al., 1994). Si les mécanismes de cette suppression sont
encore inconnus, il a cependant été montré dans une étude indépendante que Bsd2p était
également impliquée dans l’adressage de Smf1p, un transporteur de métaux de la membrane
plasmique, dont la plus grande partie de la population est envoyée de façon constitutive dans
la vacuole pour dégradation. Comme dans le cas de Pma1-7p, Smf1p est adressée
préférentiellement à la membrane plasmique dans un mutant bsd2Δ (Liu and Culotta, 1999).
C. La membrane plasmique
Une fois arrivées à la membrane plasmique, les protéines intégrées peuvent subir un
ultime contrôle qualité ayant comme conséquence leur internalisation dans la voie
endosomale. Bien que les conditions pour lesquelles les protéines sont prises en charge par ce
système de contrôle soient diverses, il semblerait que les mécanismes responsables de cette
endocytose soient l'ubiquitination et/ou l'exclusion des domaines rafts.
En 1994, Volland et al. (Volland et al., 1994b) ont étudié ce phénomène pour la
perméase à uracile Fur4p. Ils ont constaté que plusieurs évènements conduisaient à
l'instabilité de Fur4p en surface. En un premier lieu, lorsque les levures sont transférées d’un
milieu complet à un milieu carencé en azote ou en carbone, la protéine Fur4p est
immédiatement envoyée dans la voie endocytaire pour dégradation dans la vacuole (Volland
et al., 1994b). La même instabilité a été observée lorsqu'un inhibiteur de synthèse protéique,
le cycloheximide (CHX), est ajouté au milieu de culture, rejoignant sur ce point les résultats
obtenus par Benito et ses collaborateurs pour Pma1p (Benito et al., 1991). La prise en charge
par le contrôle qualité à la membrane plasmique est également apparue à la transition entre les
phases exponentielle et stationnaire. Dans ces deux derniers cas (inhibition de la synthèse
protéique et entrée en phase stationnaire), un parallèle peut certainement être fait entre la
dégradation de Fur4p et sa fonction à la membrane plasmique. En effet, Fur4p catalysant
l'entrée d'uracile dans la cellule, il semble logique que l'utilité de cette protéine soit fortement
réduite dans des conditions où la synthèse protéique, et donc le besoin d'uracile pour la
transcription, est diminuée. La même équipe a démontré que dans le cas d'une prise en charge
en réponse à une carence en nutriment, l'ubiquitination au niveau des lysines 38 et 41 situés à
proximité d’une séquence PEST (voir plus loin) à l'extrémité N terminale de Fur4p est
l'évènement déclencheur de cette internalisation (Galan et al., 1994; Galan et al., 1996).
Une ubiquitination a également été montrée au niveau des résidus lysines 9 et 16 de la
protéine Gap1p lorsque de l'azote est ajouté au milieu de culture (Lauwers and Andre, 2006),
48

conduisant à une endocytose et à la dégradation de Gap1p dans la vacuole. Dans le cas de
Gap1p, cette prise en charge par le contrôle qualité de la membrane plasmique est également
reliée à l'exclusion des domaines rafts, exclusion qui s'avère plus prononcée lors de la
progression de la protéine dans la voie endosomale (Lauwers and Andre, 2006).
Pour Pma1p, le constat est différent selon la nature de la forme mutante considérée.
Ainsi, le mutant thermosensible Pma1-10p, est instable à la membrane plasmique à la
température non permissive et est rapidement dégradé dans la vacuole après internalisation
par endocytose (Gong and Chang, 2001). Pour cette forme mutée de la protéine, les auteurs
ont démontré que la protéine subit un événement d’hyperphosphorylation (Gong and Chang,
2001) suivi par son ubiquitination (Liu and Chang, 2006) et est exclue des domaines rafts,
suggérant que l'ubiquitination pourrait constituer un signal de reconnaissance par le contrôle
qualité de la membrane plasmique (Liu and Chang, 2006).
Au contraire, le phénotype d’instabilité en surface d’un autre mutant de Pma1p,
Pma1-G381Ap, dans lequel une alanine remplace une glycine à la position 381, n’est pas associé
à son ubiquitination préalable à la membrane plasmique, ni à son exclusion des domaines rafts
(Ferreira et al., 2002), témoignant que l'ubiquitination ne peut être considérée comme un
signal universel de reconnaissance par le contrôle qualité de la membrane plasmique.
Néanmoins, bien que Pma1-G381Ap ne subisse pas d'évènement d'ubiquitination à la
membrane plasmique, il en subit un plus tôt dans sa voie de biogenèse (Ferreira et al., 2002),
ce qui est également le cas pour Pma1-10p (Liu and Chang, 2006). De la même façon, les
deux mutants sont retenus transitoirement dans le RE (Ferreira et al., 2002; Liu and Chang,
2006). Ces constatations laissent supposer que l'ubiquitination pourrait être la cause (ou la
conséquence) du délai au sein du RE. Ceci a amené Liu et Chang à proposer qu'il pourrait
exister une connexion directe entre un délai dans le RE et l'instabilité en surface, connectant
ainsi ces deux contrôles qualité (Liu and Chang, 2006).
49

Figure 8: Structure de la bicouche lipidique
Sur le panneau supérieur est représentée une protéine polytopique (la Bactériorhodopsine) au sein d’une
bicouche composée de Phosphatidylcholine contenant des acides gras monoinsaturés à 16 et 18 atomes de
carbone. Le diagramme du panneau inférieur représente les différentes zones de la bicouche, avec un cœur
hydrophobe constitué des chaînes d’acides gras (à partir du carbone 2 de ces chaînes). La ligne d’interface
correspond grossièrement aux fonctions carbonyles des acides gras. L’interface est constitué du squelette
glycérol et de la choline (ligne rouge) qui interragit de façon très étroite avec des molécules d’eau (ligne bleu),
pour donner une phase polaire très structurée.
D’après Bowie, JU (Bowie, 2005).
50

III. Importance des lipides dans la biogenèse des protéines
intégrées
Comme nous venons de le détailler, les lipides jouent un rôle important dans les
phénomènes de contrôle qualité aux différents niveaux de la voie de biogenèse des protéines
intégrées. Il est probable que la prise en charge par ces mécanismes de contrôle soit
directement liée à des altérations du repliement des protéines dans des conditions de
dérégulation de l’homéostasie lipidique cellulaire. De nombreuses études réalisées in vitro sur
des systèmes simplifiés, comme des protéoliposomes, ont permis d’évaluer directement
l’impact des lipides sur la conformation et/ou l’activité de protéines membranaires modèles.
Les lipides régulent différents paramètres biophysiques des membranes, parmi lesquels
l’épaisseur de la bicouche, la pression latérale ou la fluidité. Ces paramètres vont influencer,
bien que pour des raisons différentes et avec des amplitudes variables en fonction de la
protéine considérée, l’obtention de la structure tridimensionnelle active des protéines
intégrées. Dans les paragraphes qui suivent, nous allons faire un tour d’horizon de la
bibliographie concernant ces aspects.
A. Implication des lipides dans la stabilité des protéines
Typiquement, une membrane biologique est divisée en deux régions : une zone
hydrophobe et une zone d’interface avec l’environnement hydrophile. Le cœur de la bicouche,
d’environ 30 Angström (Ä) d’épaisseur, est constitué par les chaînes aliphatiques des
phospholipides, alors que la zone d’interface d’environ 15 Ä est composée de la tête polaire
des phospholipides ainsi que de molécules d’eau qui y sont associées, conférant à cette zone
un caractère polaire (Figure 8) (Bowie, 2005). De ce fait, il existe un gradient de polarité du
centre de la membrane vers les extrémités, la zone la plus apolaire et hydrophobe se trouvant
au centre.
De cette hydrophobicité découle un des processus déterminant pour le repliement des
protéines : l’hydrophobic mismatch (Figure 9) (Killian, 1998; Bowie, 2005). Si le segment
transmembranaire (donc hydrophobe) d’une protéine est plus long que la bicouche lipidique
n’est épaisse, celui-ci va entrer en contact avec des molécules d’eau de l’environnement
(Figure 9, panneau de gauche). De la même façon, si ce segment transmembranaire est plus
court que la partie aliphatique des phospholipides voisins, ce seront alors les chaînes d’acides
gras des phospholipides qui seront au contact avec l’environnement aqueux (Figure 9,
51

panneau de droite). Dans ces deux cas, le coût énergétique de cet « hydrophobic mismatch »
est tel que des mécanismes compensatoires doivent absolument être mis en place au niveau de
la bicouche : soit la bicouche lipidique se déforme pour adopter l’épaisseur du segment
transmembranaire, soit la protéine ajuste son repliement pour coïncider avec l’épaisseur de la
membrane (Figure 9). Des études in vitro tendent à montrer que pour les protéines
membranaires en tonneau β, ce serait la bicouche lipidique qui aurait principalement tendance
à s’adapter, soit en étirant, soit en contractant les lipides les plus proches de la protéine
(O'Keeffe et al., 2000). Les lipides de type II (voir plus loin), grâce à leur propension à former
des zones de courbures au niveau de la bicouche ont également un rôle dans cette adaptation
(Hong and Tamm, 2004). Pour les protéines intégrées dont les segments transmembranaires
sont constitués par des hélices α, deux mécanismes compensateurs ont été proposés,
consistant en des adaptations des hélices elles-mêmes. Celles-ci pourraient se « contracter »
ou « s’étirer » en faisant sélectivement pivoter leur chaîne latérale autour de la liaison Cα-Cβ
(liant la chaîne latérale au squelette polypeptidique). La rotation d’un résidu Tyrosine autour
d’un tel axe pourrait faire varier la longueur de l’hélice de 3 Ä (Mall et al., 2000). Le second
mécanisme consiste à « basculer » (« tilter ») l’hélice dans sa totalité en cas de diminution de
l’épaisseur de la bicouche (Figure 9, panneau de gauche). Enfin, il a également été proposé
que l'oligomérisation pourrait permettre de minimiser l’hydrophobic mismatch, la surface des
protéines exposées à la bicouche lipidique se trouvant ainsi réduite (Figure 9, panneau de
gauche et de droite) (Killian, 1998; Botelho et al., 2006).
La composition lipidique de la membrane influence également un autre paramètre : le
stress de courbure (Gruner, 1985; Hui and Sen, 1989; Tate et al., 1991). Pour former une
bicouche, les lipides doivent avoir une forme cylindrique, ce qui implique que le rayon de leur
tête polaire soit sensiblement le même que celui de leurs chaînes hydrocarbonées (Figure 10A
et 10C). Cependant, pour certains lipides, ces chaînes hydrocarbonées ont tendance à
s’évaser, compromettant la forme cylindrique du lipide, et lui conférant une forme conique
(Figure 10A et 10C). C’est le cas de la Phosphatidyléthanolamine (PE), du fait de sa petite
tête polaire, et en règle générale des phospholipides possédant une insaturation dans au moins
un de leurs acides gras. Dans des membranes synthétiques comprenant exclusivement ce type
de lipides, ils vont avoir tendance à former une phase hexagonale plutôt qu’une structure en
bicouche, d’où leur désignation de « non bilayer lipids » (on les appelle également « lipides
de type II »).
52

Figure 9: L'hydrophobic mismatch
Lorsqu’ un segment transmembranaire (TM) d’une protéine intégrée est plus long que la zone hydrophobe de la
bicouche (panneau de gauche), plusieurs mécanismes peuvent se mettre en place pour éviter une exposition des
des régions hydrophobes du TM à l’eau environnante : la protéine peut s’agréger afin de minimiser les zones de
contact avec l’eau (1), « tilter », c'est-à-dire changer son orientation par rapport à la membrane (3) ou encore
modifier la structure de son squelette carboné de façon à l’adapter à l’épaisseur de la bicouche (4) (pour plus de
détails, voir le texte). Une membrane qui devient plus ordonnée peut également contrer cette différence de taille
(2). Il est à noter que le recrutement de phospholipides de type II à proximité du TM peut également compenser
ces effets en provoquent un épaississement local de la membrane (non représenté sur le schéma). Dans le cas où
la membrane est plus épaisse que les TMs de la protéine (panneau de droite), ce sont cette fois les chaînes
d’acides gras hydrophobes qui sont en contact avec l’environnement aqueux. Les mêmes mécanismes que
précédemment peuvent intervenir, comme l’aggrégation (1), la réorganisation du squelette carboné du TM (4)
ou une augmentation de la fluidité de la bicouche pour en diminuer l’épaisseur (2). Dans certains cas, le TM, s’il
est amphiphile (une face hydrophile et une face hydrophobe), peut être amené à perdre sa caractéritique
transmembranire pour se disposer parallèlement à la bicouche, dans la zone d’interface (3) : sa face polaire est
alors exposée au solvant alors que sa face hydrophobe entre en contact avec la partie la plus externe des chaînes
d’acides gras.
D’après Killian, JA (Killian, 1998).
53

A/
/
Figure 10: Le stress de courbure
B/
/
C/
+
-
Pression
latérale
-
Taux de lipide conique
A/ Dans un mélange de lipides de type cylindrique et de type II (ou lipides coniques), les deux feuillets de la
membrane vont avoir tendance à s’écarter l’un de l’autre (a). La force nécessaire pour rétablir une bicouche
classique est nommée stress de courbure (b). Ce stress va appliquer sur les protéines présentes au sein de la
membrane une pression latérale au niveau de leur domaines transmembranaires d’autant plus forte que le taux de
phospholipides coniques sera important (B/ et A/ c). Ce phénomène diminue l’efficacité de repliement des
protéines intégrées, mais leur assure en contre partie une meilleure stabilité. C/ Les lipides de type conique, en
association avec les lipides de forme conique inversée, sont également nécessaires pour la formation des
vésicules.
D’après van den Brink-van der Laan et al. et Bowie, JU (van den Brink-van der Laan, Antoinette Killian et al.,
2004 ; Bowie 2005)
+
54

Un mélange de deux lipides, l’un préférant la phase bicouche et l’autre la phase
hexagonale, adopte une phase bicouche s’il contient plus de 20 % de lipides de type
cylindrique (Boni and Hui, 1983). De façon générale, la présence de lipides de type II a
tendance à écarter les deux feuillets lipidiques l’un de l’autre (Figure 10A). La force mise en
place pour maintenir la structure en bicouche donne naissance à une bicouche « frustrée », en
provoquant un « stress de courbure » qui se traduira par une augmentation du compactage (on
parle également de pression latérale ou stress latéral selon les auteurs) dans la région des
chaînes d’acides gras (Figure 10A et 10B). La conséquence de ceci sera une diminution de la
compacité au niveau des têtes polaires des phospholipides. L’équipe de Paula J. Booth
(Université de Bristol, Royaume-Uni) a étudié l’incidence de ce stress de courbure sur divers
processus de maturation de la bactériorhodopsine chez Escherichia coli (Allen et al., 2004).
Ils ont évalué l’insertion ainsi que le repliement et la stabilité de cette protéine au sein de
liposomes constitués de Phosphatidylcholine (PC) contenant des acides gras C18 :1 (18
atomes de carbones et une insaturation) ou C16 :1 (DOPC (DiOléyl-PC) et DPoPC
(DiPalmitoylPC)), ainsi que C14 :0 (DMPC (DiMyristyl-PC)). Ils ont évalué ces mêmes
paramètres en changeant la tête polaire du phospholipide, à savoir en remplaçant la choline
par de l’éthanolamine, pour un contenu en acide gras équivalent dans ces phospholipides. Ils
ont ainsi constaté que l’addition graduelle de phospholipides de forme conique (DOPC,
DPoPC, PE) dans leurs vésicules, et donc l’augmentation du stress de courbure, entraîne une
diminution du taux et de la vitesse de repliement de la bactériorhodopsine, mais permet en
contrepartie une augmentation de sa stabilité au sein de la bicouche (Allen et al., 2004). Dans
le cas du canal potassium de Streptomyces lividans, Kcsa, le stress latéral au niveau de la
partie hydrophobe de la protéine s'avère indispensable pour la stabilisation de la forme
fonctionnelle tétramérique du canal (van den Brink-van der Laan et al., 2004a).
En plus de leur rôle dans la stabilité des protéines via le stress de courbure, les lipides
de type II, associés aux phospholipides présentant une forme conique inversée (tête polaire de
diamètre plus large que celui déterminé par les deux chaînes d’acides gras ; Figure 10C)
jouent également un rôle déterminant dans les phénomènes de vésiculation, en permettant
localement l’établissement de zones de courbure négative et positive, indispensables à la
formation des vésicules (Figure 10C) (van den Brink-van der Laan et al., 2004a). Ces
phénomènes de vésiculation sont également indispensables pour l’endocytose.
La phase physique dans laquelle se trouve la membrane a également une importance
dans l’obtention de structure tridimensionnelle active des protéines. C’est notamment le cas
pour les protéines intégrées à domaines transmembranaires en hélice α formant des dimères
55

ou des oligomères. Dans une bicouche contenant à la fois des domaines désordonnés (Liquid
disordered, Ld) et des phases gels, les domaines transmembranaires en hélice α ségrégent
préférentiellement dans les phases Ld. Ceci pourrait résulter en une augmentation de la
concentration locale en domaines transmembranaires avec pour conséquence une optimisation
de la formation des oligomères (Mall et al., 2001). Comme précisé plus haut dans le texte, en
présence de stérols, et plus précisément de cholestérol, les domaines ordonnés (Liquid
ordered, Lo) sont formés avec des propriétés intermédiaires entre les phases Gel et Ld. Dans
ces Lo, la formation des dimères entre protéines intégrées à hélices α n’est pas inhibée, bien
au contraire, puisque les dimères qui sont formés dans ce cas sont plus stables que dans les
phases Ld (Mall et al., 2001). Ce phénomène pourrait s’expliquer par le fait que les lipides
organisés en phase Lo présentent une capacité plus faible, du part de leur haut degré de
structuration, à s’adapter pour compenser les phénomènes d’hydrophobic mismatch. La
dimérisation serait alors dans ce cas énergiquement moins coûteuse pour limiter ce
phénomène (voir ci-dessus et (Lee, 2003b)).
B. Implication des lipides dans l'activité des protéines
De façon prévisible, l'environnement lipidique immédiat dans lequel la protéine est
insérée va également influencer son activité. Cependant, il convient de distinguer les lipides
entourant la protéine et ceux interagissant de façon très spécifique avec elle. On parle
respectivement des lipides annulaires et des lipides non annulaires.
Les lipides annulaires constituent un « solvant », et interagissent de façon relativement
non-spécifique avec la protéine. Ils forment autour de la protéine une sorte de « coquille » ou
« anneau », qui va l’isoler de l’ensemble de la bicouche (Lee, 2003b). Au contraire, les lipides
non annulaires interagissent avec les protéines très spécifiquement. Ils sont généralement
essentiels à l’activité de la protéine et peuvent être considérés comme des co-facteurs de leur
activité, au sens strict du terme. Ils se lient soit entre les hélices α-transmembranaires d’une
protéine donnée, soit aux interfaces protéine-protéine dans les complexes multiprotéiques
(Lee, 2004b).
Les lipides annulaires
De par le fait qu’ils sont au contact direct des protéines intégrées, les lipides annulaires
vont jouer un rôle capital dans l’adaptation à l'hydrophobic mismatch (voir ci dessus). Ce
56

paramètre, que nous avons déjà évoqué, est critique pour une activité optimale de nombreuses
protéines polytopiques, qui nécessitent une épaisseur précise de la bicouche. L’optimum
d’activité des protéines intégrées est obtenu, pour la majorité des exemples étudiés, dans des
bicouches formées de phospholipides comportant des acides gras à 18 atomes de carbone
(C18), reflétant la moyenne de la longueur des acides gras dans les membranes biologiques
(Lee, 2004a). Cependant, les raisons des variations d’activité en réponse à des modifications
de l’épaisseur de la bicouche ne sont pas systématiquement les mêmes selon la protéine
considérée. Prenons l'exemple de la Ca 2+ -ATPase du réticulum sarcoplasmique et de la
diacylglycerol kinase (DGK) d'Escherichia coli qui ont un profil d'activité similaire avec un
optimum dans une bicouche lipidique composée de phospholipides à acides gras C18. Pour la
Ca 2+ -ATPase, la baisse d'activité en réponse aux variations d’épaisseur est liée à des
modifications de son niveau de phosphorylation, de sa capacité à changer de conformation
durant son cycle catalytique et, enfin, de la stœchiométrie de fixation du Ca 2+ (Starling et al.,
1993; Starling et al., 1994; Starling et al., 1995). Par contre, en ce qui concerne la DGK, cette
baisse d'activité semble essentiellement due à un changement d'affinité de la protéine pour son
substrat (Pilot et al., 2001). Ainsi, l'effet de l'hydrophobic mismatch sur l'activité des
protéines ne peut pas être expliqué par une seule et même cause, mais plutôt par une multitude
d’effets différents selon la protéine considérée.
La phase dans laquelle se trouvent les lipides annulaires peut également influencer
l’activité d’une protéine intégrée, la majorité d’entre-elles présentant une activité accrue dans
les phases Ld, par comparaison aux phases Gel (Lee, 2003b).
Les lipides non-annulaires
Comme énoncé précédemment, les lipides non-annulaires sont considérés comme des
cofacteurs de protéines, essentiels dans certains cas à leur fonction. Leur association aux
protéines est telle qu’ils peuvent être co-purifiés avec celles-ci et apparaître sur les structures
à haute résolution obtenues par cristallographie aux rayons X (Lee, 2003b). Pour donner
quelques exemples de lipides non-annulaires, on peut citer les Phosphatidylglycérols (PG), les
cardiolipines et le cholestérol.
Un exemple de l’implication de ce dernier pour l'activité d'une protéine est rapporté
pour la Na + ,K + -ATPase. L'activité de cette ATPase est maximale dans une membrane
composée de phospholipides à acides gras C22 en absence de cholestérol, et C18 en sa
présence (Cornelius, 2001). Cette différence dans la longueur des chaînes d'acides gras
pourrait refléter le fait que la Na + ,K + -ATPase est localisée à la membrane plasmique où les
57

concentrations élevées de cholestérol pourraient participer à l’épaississement de la membrane,
en comparaison à celle des organites intracellulaires. Cependant, l'activité de la Na + ,K + -
ATPase dans des membranes de di(C18:1)PC en présence de cholestérol est considérablement
plus importante que dans des membranes de di(C22:1)PC en son absence, ce qui semble
démontrer que celui-ci aurait un impact sur l’activité de la Na + ,K + -ATPase indépendamment
de ses conséquences sur l’épaisseur membranaire. Il semble en effet que le cholestérol se fixe
directement sur cette protéine à des sites spécifiques, une caractéristique des cofacteurs.
Il est à noter que l’impact et le rôle des lipides sur la structure et l'activité des protéines
est le sujet de deux revues très complètes écrites par Antony G. Lee (Lee, 2003b; Lee, 2004b).
IV. Pathologies et autres dysfonctionnements
Il apparaît donc que les « contrôles qualité » au niveau du Réticulum Endoplasmique,
de l'appareil de Golgi et de la membrane plasmique constituent autant de « goulots
d’étranglement » au niveau desquels les protéines intégrées peuvent être retardées ou
déroutées, lors de leur transit vers la membrane plasmique. Nous avons vu également que
l’environnement lipidique immédiat de ces protéines participait activement aux processus de
contrôle. Ces mécanismes sont conservés, pour la plupart d’entre eux, des eucaryotes
inférieurs aux eucaryotes supérieurs. Logiquement, des dérégulations de ces mécanismes ont
pu être associés à des pathologies humaines.
exemples.
Dans le paragraphe qui suit, nous allons illustrer ce propos à travers quelques
58

Figure 11: Le CFTR
Le CFTR (pour Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) est un transporteur ABC ayant une
fonction de canal chlorure au niveau de la membrane plasmique de certaines cellules humaines. Il est formé de
deux domaines transmembranaires séparés par une partie cytoplasmique composée d’un site de liaison à des
nucléotides (NBD1) et d’un domaine régulateur. La phénylalanine, qui est délétée chez la forme mutante
ΔF508-CFTR, est localisée dans le NBD1.
59

A. Exemples de pathologies liées au trafic de protéines
De nombreuses pathologies humaines sont associées à des mutations dans des gènes
codant pour des protéines intégrées de la membrane plasmique, ces dernières jouant des rôles
essentiels dans les échanges et les communications entre l’espace intracellulaire et le milieu
environnant. Parmi ces mutations, un certain nombre sont responsables de la prise en charge
des protéines correspondantes par les contrôles qualité de la voie de sécrétion, avec pour
conséquence leur rétention dans un compartiment intracellulaire et/ou leur dégradation.
Le Réticulum Endoplasmique, point d’entrée de la voie de sécrétion, est l'organelle à
travers lequel toutes les protéines intégrées vont transiter. Comme nous l’avons vu dans
l’introduction (paragraphe II] A] 2]), on trouve également dans ce compartiment un système
de contrôle qualité particulièrement efficace. C’est donc logiquement que les exemples de
pathologies génétiques humaines directement associées à la rétention d’une protéine de la
membrane plasmique dans ce compartiment, tendent à s’accumuler. Parmi les nombreux
exemples décrits dans la littérature (pour revue, voir (Aridor and Hannan, 2000, 2002)), nous
avons retenu la mucoviscidose et le syndrome de Charcot-Marie-Tooth (CMT).
La mucoviscidose est une maladie génétique autosomale récessive. La forme la plus
commune provoque chez les patients une obstruction des poumons liée à une inflammation
chronique des bronches accompagnée, dans 90 % des cas, d'une insuffisance pancréatique.
Les malades souffrent de plus d'une augmentation de la production de mucus visqueux au
niveau de l’épithélium pulmonaire favorisant l'apparition d'infections respiratoires sévères. La
mucoviscidose est due à une mutation sur le gène CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane
conductance Regulator), codant pour un canal chlorure. L’allèle défectueux majoritaire,
rencontré chez environ 90 % des patients, code pour une protéine CFTR portant une délétion
de la phénylalanine à la position 508 de la chaîne polypeptidique. La protéine correspondante
est appelée ΔF508-CFTR. Le CFTR est un transporteur ABC constitué de deux domaines
transmembranaires (TMD1 et 2) reliés par une partie cytoplasmique composée d’un premier
domaine de liaison à des nucléotides (NBD1) puis d’un domaine régulateur. Un second
domaine de liaison à des nucléotides (NBD2) se trouve à la suite du TMD2 (Figure 11). Le
résidu 508 est situé dans le NBD1. Chez la forme mutante ΔF508-CFTR, la mutation
entraînerait une déstabilisation de la protéine du fait d'une perturbation de l'interaction entre le
NBD1 et les domaines transmembranaires, modifiant la position du domaine cytoplasmique
par rapport à la membrane du RE. La protéine mutée est retenue dans ce compartiment,
60

transloquée dans le cytoplasme et dégradée par le protéasome, entraînant une perte de la
fonction associée au canal chlorure à la surface des cellules épithéliales, avec les
conséquences physiopathologiques que nous avons évoquées plus haut. Cette rétention dans le
RE, un temps supposée liée à une défaillance du système d’export (perte de la capacité de
reconnaissance par la machinerie COP II d’un peptide d’adressage de la protéine pour la
sortie du RE ; (Chang et al., 1999; Wang et al., 2004), serait en fait liée à une rétention active
par des protéines chaperonnes. Parmi elles, on peut citer Hsp90 et la calnexine (CNX). Ces
conclusions sont basées sur le fait que le silencing d’une cochaperone de Hsp90p (Wang et
al., 2006), et l’utilisation du miglustat, une molécule qui inhibe les interactions entre ΔF508-
CFTR et la CNX (Norez et al., 2006), restaurent l’adressage de ΔF508-CFTR à la surface
cellulaire. Néanmoins, un article récent rapporte que dans une souris CNX knock-out, ΔF508-
CFTR n’échappe pas au contrôle qualité du RE, remettant en cause l’importance de la CNX
dans ce processus de rétention (Okiyoneda et al., 2008). Ces auteurs ont proposé que le rôle
de la CNX pourrait se limiter au repliement de la protéine CFTR sauvage.
Les maladies de Charcot-Marie-Tooth (CMT) constituent un groupe hétérogène de
maladies du nerf périphérique. Ce sont des maladies génétiques que l'on distingue selon
plusieurs critères, en particulier le type de transmission. En effet, si ces maladies sont le plus
souvent à transmission autosomale dominante, certaines formes sont liées au sexe (CMTX) et
d'autres se transmettent sur un mode autosomal récessif (CMT4). Dans la majorité des cas, la
pathologie est associée à une démyélinisation qui va provoquer une dégénérescence
progressive des muscles des pieds, du bas des jambes, des mains et des avant-bras,
accompagnée parfois de pertes de sensibilité au niveau des doigts et des orteils. D’un point de
vue génétique, cette pathologie est majoritairement associée à des mutations affectant le gène
PMP22 (pour Peripheral Myelin Protein 22). La protéine PMP22p est un composant essentiel
de la gaine de myéline chez les mammifères, où elle représente 2 à 5% des protéines totales. Il
s’agit d’une protéine intégrée de Type II (1 seul domaine transmembranaire, extrémité C-
Terminale du côté extracellulaire), existant sous forme dimérique. La grande majorité des
mutations affectant le gène PMP22 résultent dans la rétention de la protéine correspondante
dans le RE (pour revue, voir (Schulein, 2004)). De façon intéressante, ces formes sont non
seulement bloquées dans le RE, mais entraînent également la rétention de la forme sauvage
chez les individus hétérozygotes, d’où la nature dominante des allèles en question. Ce
comportement peut s’expliquer par la propriété de la protéine PMP22p à se dimériser. Nous
pouvons noter ici que ce comportement est très proche du phénotype dominant-létal qui a été
61

décrit chez la levure pour certains allèles de la pompe à proton Pma1p, que nous avons
évoqués dans les paragraphes précédents.
Comme nous l’avons précisé, ces pathologies constituent deux exemples extraits d’une
longue liste de maladies humaines liées à des perturbations du trafic de protéines
membranaires. Pour plus d’informations, le lecteur pourra se rapporter à trois revues rédigées
par Aridor (Aridor and Hannan, 2000, 2002; Aridor, 2007).
B. Exemples de pathologies associées aux lipides
Les pathologies humaines associées aux lipides ont pour origine, soit une altération de
leur métabolisme (biosynthèse, catabolisme..), soit une dérégulation de leur trafic au sein de la
cellule. L’étude de certaines pathologies, comme l’athérosclérose ou le syndrome du
Niemann-Pick, que nous allons évoquer plus loin, a d’ailleurs largement contribué à
l’élaboration des connaissances actuelles sur les mécanismes de transport et le trafic
intracellulaire des lipides.
La dérégulation de l’homéostasie cellulaire de deux espèces lipidiques rendrait
compte, à elle seule, de plusieurs pathologies lipidiques décrites à ce jour. Ces espèces sont le
cholestérol et les acides gras saturés.
Le cholestérol est synthétisé au niveau du RE, avant d’être rapidement distribué dans
les autres organelles par la combinaison de transports vésiculaires et non vésiculaires. La
conséquence de cette distribution est que le cholestérol s’accumule très peu à son site de
synthèse et va être particulièrement enrichi au niveau de la membrane plasmique, où il joue
un rôle prépondérant dans l’établissement et la régulation de certaines propriétés biophysiques
de la bicouche phospholipidique. En particulier, comme nous l’avons déjà évoqué, il a été
proposé que le cholestérol serait essentiel pour réduire la fluidité de la membrane plasmique
et en augmenter l’imperméabilité, renforçant ainsi son rôle de « barrière » aux petites
molécules et ions du milieu extracellulaire. De plus, la faible concentration de cholestérol
dans le RE pourrait permettre l’établissement d’une bicouche plus fluide, compatible avec les
rôles physiologiques de cette organelle, comme la translocation des protéines. On peut donc
aisément comprendre que le métabolisme et le trafic du cholestérol soient étroitement régulés
et qu’une perturbation de son homéostasie se traduise par des effets extrêmement délétères sur
la survie cellulaire.
62

Le taux de cholestérol intracellulaire est régulé par trois mécanismes distincts
(Figure 12). Lorsque la concentration intracellulaire de cholestérol augmente, une réponse
rapide de la cellule consiste à estérifier le cholestérol en excès grâce à l'acylCoA:cholestérol
acyl-transférase (ACAT). Le cholestérylester ainsi formé est stocké dans des structures
particulières du cytoplasme : les gouttelettes lipidiques. Ce stock de cholestérylester peut être
hydrolysé, en fonction des besoins, pour libérer du cholestérol libre. Une seconde façon de
réguler le taux de cholestérol est d'agir sur la biogenèse des protéines SREBP (sterol-
regulatory-element-binding-protein) et SCAP (SREBP cleavage-activating protein), en les
séquestrant au niveau du RE par fixation avec une protéine résidente du RE, l'INSIG. Le
cholestérol, par son interaction directe avec la protéine SCAP, induit la séquestration de cette
dernière par l’INSIG (Adams et al., 2004). Lorsque le taux de cholestérol diminue dans la
cellule, l’INSIG libère le complexe SREBP-SCAP qui, après clivage au niveau de l’appareil
de Golgi, permettra au domaine cytoplasmique de SREBP d'aller réguler la transcription de
certains gènes, dont ceux du récepteur LDL (Low-density protein), responsable de l’entrée de
cholestérol dans la cellule, et de la HMG-CoA réductase, enzyme limitante de sa voie de
biosynthèse. Enfin, un troisième mécanisme de régulation consiste en un système d'efflux du
cholestérol hors de la cellule, mécanisme nécessitant des transporteurs ABC (Maxfield and
Tabas, 2005).
En conditions normales, les lipides qui se trouvent au niveau de la membrane
plasmique vont être délivrés dans les endosomes tardifs puis, depuis ce compartiment, dans le
lysosome, où ils seront hydrolysés par les enzymes locales. Ce processus catabolique est
important pour maintenir une homéostasie lipidique cellulaire, et la perte d'activité d'un des
intervenants de ce processus peut conduire à l'accumulation de lipides (tels que le cholestérol)
dans les endosomes tardifs ou le lysosome. Cette accumulation est la cause de plusieurs
pathologies, comme le syndrome du Niemann-Pick de type C.
63

1/ Vue générale du trafic du cholestérol dans une cellule humaine
Forte
concentration
de cholestérol
Faible
concentration
de cholestérol
RE Golgi
4/
2/ Régulation du système SREBP/SCAP par le cholestérol
2/
3/ Efflux du cholestérol par un transporteur ABC
Figure 12: L'homéostasie du cholestérol chez l'homme
3/
D’après Maxfield et Tabas, 2005
D’après Bengoechea-Alonso et al, 2007
D’après Young et al, 2007
(1) Vue générale du trafic du cholestérol dans la cellule. (2) Lorsque le taux de cholestérol cellulaire est faible, la cellule
mobilise un système de régulation complexe pour compenser cette carence. Au niveau du RE, la voie SREBP/SCAP est
activée avec pour conséquences notamment une augmentation de la production et de l’expression de récepteurs à LDL au
niveau de la membrane plasmique, et une activation de la voie de biosynthèse de cholestérol endogène. (4) Le cholestérol
extracellulaire pourra être internalisé par la voie endocytaire via les récepteurs néo synthétisés. En cas d’accumulation
cellulaire de cholestérol, celui-ci est estérifié dans le RE par une AcylCoA : Cholestérol AcylTransférase (ACAT), puis
stocké sous forme de cholestérylester dans des goutelettes lipidiques. (3) Il peut également être expulsé par l’action de
transporteurs ABC situés à la membrane plasmique.
D’après Young et al., Maxfield et al., Bengoechea-Alonso et al. (Young and Fielding, 1999; Maxfield and Tabas, 2005;
Bengoechea-Alonso and Ericsson, 2007)
64

La maladie de Niemann-Pick de type C (NPC) est autosomale récessive. Chez les
patients atteints, le cholestérol extracellulaire non estérifié (LDL) qui est capté par la cellule
s’accumule au niveau des lysosomes, provoquant ainsi un délai dans la régulation de
l'homéostasie du cholestérol. En effet, le cholestérol ne rejoignant plus son site
d’estérification (RE), l’inhibition de l’import de cholestérol par la voie SREBP-SCAP ne peut
être enclenchée. Ceci se traduit d’un point de vue physiopathologique par des troubles
pulmonaires, neurologiques et psychiques avec, dans certains cas, une démence progressive.
D'un point de vue génétique, deux gènes sont impliqués : NPC1 (dans 95% des cas) et NPC2.
NPC1p est une protéine membranaire des endosomes tardifs à la fonction inconnue, tandis
que NPC2p est une protéine soluble du même compartiment présentant la propriété de lier le
cholestérol.
Une autre pathologie associée à une dérégulation du taux de cholestérol est
l'athérosclérose. L'athérosclérose est la première cause de mortalité dans le monde. Elle est
liée à une accumulation de cholestérol dans l'intima des artères, provoquant le cas échéant une
obstruction de celles-ci, ce qui perturbe le flux sanguin. Elle est associée à des cas de morts
subites, d'infarctus du myocarde et d'accidents vasculaires cérébraux. Dans le cas où les
artères des membres inférieurs sont concernées, on constate parfois l’apparition d’une
gangrène pouvant nécessiter l’amputation. Il est à noter que le mode de vie occidental
(tabagisme, nourriture grasse, sédentarité...) est un facteur aggravant. L'athérosclérose est une
pathologie qui va progresser au cours des années. A l'origine, l'augmentation de la
perméabilité artérielle, suite à une lésion par exemple, va favoriser l'entrée et l'accumulation
de LDL-Cholestérol dans l'intima, notamment au niveau de la matrice extracellulaire. Ces
LDL font s'agréger pour former des stries lipidiques sur la paroi interne de l'artère,
provoquant l'apparition de lipides oxydés proinflammatoires. Les lipides oxydés, outre leur
implication dans la réponse inflammatoire, vont entraîner le recrutement dans les artères de
monocytes, qui vont se différencier en macrophages. Ces derniers vont alors reconnaître les
LDL, qu’elles soient oxydées ou non, les internaliser en grande quantité et, en conséquence,
accumuler massivement du cholestérol. Selon un mécanisme moléculaire encore mal compris,
mais impliquant vraisemblablement les LDL oxydées, les macrophages vont se transformer en
cellules spumeuses. Ces dernières provoquent une augmentation de l'épaisseur et une
progression des stries lipidiques (qui vont former la plaque athérosclérotique), ainsi qu'une
fragilisation de la matrice extracellulaire, probablement par leur capacité à synthétiser des
cytokines inflammatoires et des métalloprotéinases de la matrice. Il semblerait que ces
65

cellules spumeuses déclenchent également, en seconde intention, une réponse auto-immune
(Maxfield and Tabas, 2005).
L’athérosclérose est une des rares pathologies lipidiques dans laquelle les
conséquences biophysiques des perturbations ont été évaluées. L’équipe d’Ira Tabas, de
l’Université de Columbia, a en effet clairement démontré que le cholestérol tendait à
s’accumuler dans le RE des macrophages, avec pour conséquences une déplétion des stocks
de calcium luminaux de ce RE, le déclenchement de la réponse UPR (on parle aussi de
« stress du RE »), l’activation de la caspase 3 et, de façon ultime, une apoptose des cellules
concernées (Feng et al., 2003). L’accumulation de cholestérol dans la membrane du RE qui,
comme nous l’avons évoqué, est naturellement fluide, tendrait à augmenter l’ordre des
phospholipides de la bicouche, en réduisant par conséquent la fluidité relative de la
membrane. Ces mêmes auteurs ont d’ailleurs démontré que l’activité de la Calcium ATPase-
2b (SERCA-2b) du RE était inhibée lorsqu’elle était reconstituée dans des liposomes
contenant du cholestérol. Ce phénomène pourrait donc rendre compte de la déplétion des
pools de calcium du RE, phénomène précoce du stress du RE provoqué par le cholestérol (Li
et al., 2004b). Cette étude est extrêmement importante, puisqu’elle démontre pour la première
fois que des perturbations de l’homéostasie lipidique associées à une pathologie humaine
peuvent directement influencer l’activité d’une protéine membranaire, cette dernière régulant
en retour une réponse cellulaire globale.
Dans certaines pathologies, ce n’est pas l’accumulation de cholestérol, mais son
absence qui est délétère pour les cellules. Il en est ainsi dans le syndrome de Smith-Lemli-
Optitz (SLOS). Cette maladie autosomale récessive se caractérise au niveau symptomatique et
phénotypique par une hyperactivité, un autisme, un retard de développement, diverses
malformations, notamment au niveau du faciès, etc… La mort de l’enfant survient
généralement dans les premières années. D’un point de vue moléculaire, on retrouve chez les
patients un taux anormalement élevé d’un intermédiaire tardif de la voie de biosynthèse du
cholestérol : le 7 déhydrocholestérol (7-DHC). Cette accumulation résulte d’une mutation
dans le gène DHCR7 codant pour la 7-déhydrocholestérol réductase, enzyme catalysant la
réduction du 7-DHC en cholestérol (Porter, 2008). Cependant, il n’est pas parfaitement établi
si les symptômes sont dus à une diminution du taux de cholestérol, une diminution globale de
la quantité de stérols, à un effet toxique de l’accumulation du 7-DHC ou de ses dérivés (dont
le 8-DHC), ou bien à une combinaison de ces différents facteurs. Ces perturbations de
l’homéostasie stérolique cellulaire ont des répercutions sur les propriétés physicochimiques et
66

les fonctions des membranes cellulaires, notamment au niveau des rafts lipidiques qui voient
ainsi leur stabilité et leur composition protéique évoluer (Keller et al., 2004; Megha et al.,
2006). Il a également été montré que la substitution du cholestérol par le 7-DHC diminue le
stress de courbure dans des membranes artificielles. Ce phénomène pourrait expliquer la
diminution du nombre de granules de sécrétion émergeant de l’appareil de Golgi dans les
cellules du pancréas et des glandes pituitaires et surrénales, un dérèglement associé à
l’étiologie de cette pathologie (Gondre-Lewis et al., 2006).
Deux autres maladies présentées comme des syndromes “SLOS-like” peuvent
également être citées : il s’agit de la lathostérolose et de la desmostérolose qui sont dues à une
déficience de la 3β-hydroxysterol-∆ 24 -reductase et de lathosterol ∆ 5 -desaturase,
respectivement. Dans ces deux syndromes, on retrouve une accumulation d’intermédiaires de
la voie de biosynthèse du cholestérol, avec des symptômes identiques à ceux décrits pour le
SLOS (Porter, 2006).
Comme évoqué précédemment, les acides gras saturés sont également impliqués dans
des pathologies humaines. Par exemple, il a récement été montré qu’ils participaient au
développement de diabètes de type 2 (Ozcan et al., 2004; Karaskov et al., 2006; Ozcan et al.,
2006), qui représentent à eux seuls près de 90 % des cas de diabètes à travers le monde. Le
diabète de type 2 est une maladie à forte incidence, notamment dans les sociétés occidentales.
Il touche près de 2 millions de personnes en France, principalement de plus de 40 ans, et
s’avère être un facteur multipliant les risques cardiovasculaires. Dans le cadre de son
alimentation, l’homme utilise le glucose comme source d’énergie. Ce glucose est assimilé par
les différents organes, muscles et cellules grâce à l’insuline, hormone produite au sein du
pancréas par les cellules béta des îlots de Langherans. Dans les cas de diabète de type 2, les
cellules deviennent progressivement résistante à l’effet de l’insuline, et ne peuvent absorber le
glucose qui s’accumule dans le sang, provoquant une hyperglycémie (le diabète est défini par
une glycémie supérieure à 1,26 g/L de sang). On parle de cellules insulinorésistantes. Obésité
et diabète de type 2 sont intimement liés. Ainsi, chez 80 % des diabétiques de type 2, c’est un
problème de surcharge pondérale qui favorise l’expression de la maladie. En effet, la prise de
poids par le patient stimule les cellules musculaires à utiliser de préférence les acides gras de
l’alimentation, pour la majorité saturés lorsqu’ils proviennent d’une source animale, pour en
tirer de l'énergie, provoquant peu à peu leur insulinorésistance. Ce phénomène va entraîner les
cellules béta des îlots de Langerhans à produire plus d'insuline pour forcer l’entrée de glucose
dans les cellules. Au fur et à mesure de l'évolution de la maladie, les cellules béta vont
67

s'épuiser, c'est-à-dire que leur production d'insuline va diminuer jusqu'à disparaître,
aboutissant à une hyperglycémie. Il a récemment été montré chez des modèles de souris
obèses que cette résistance à l’insuline résulte, de façon très homologue à ce que nous avons
développé dans le cadre de l’athérosclérose, d’un stress du RE (Ozcan et al., 2004; Ozcan et
al., 2006). Il a été proposé que les acides gras saturés de l’alimentation pourraient être
directement responsables de ce stress, bien que les mécanismes moléculaires de ce processus
soient encore largement méconnus (Cunha et al., 2008).
Figure 13 : La voie de biosynthèse de l'ergostérol
Les enzymes soulignées utilisent l’hème comme cofacteur. Une souche en anaérobiose ou altérée dans la
synthèse de l’hème ne produit donc pas d’ergostérol mais accumule des intermédiaires de cette voie de
biosynthèse, principalement du squalène et du lanostérol.
68

V. Objectifs de l’étude et modèles d’études :
Notre objectif a été d’étudier les conséquences cellulaires de perturbations de
l’homéostasie lipidique, et plus particulièrement des stérols et des acides gras saturés, dans un
modèle eucaryote simple mais présentant des similitudes fonctionnelles avec les cellules
humaines : la levure de boulangerie Saccharomyces cerevisiae. En nous appuyant sur des
propriétés physiologiques particulières de la levure, nous avons tenté de nous rapprocher au
plus près des perturbations lipidiques rencontrées dans certaines pathologies humaines. Afin
d’appréhender les mécanismes moléculaires et cellulaires découlant de ces perturbations, nous
avons également bénéficié de la grande variété de mutants disponibles chez la levure
Saccharomyces cerevisiae.
Durant les trois années de ma thèse, je me suis plus particulièrement concentré sur les
conséquence des perturbations lipidiques sur deux processus cellulaires fondamentaux : le
trafic des protéines membranaires et l’intégrité des organelles (RE).
A. Générer des perturbations de l’homéostasie lipidique
cellulaire : la transition aérobiose anaérobiose
Pour induire les perturbations lipidiques nécessaires à l’étude, nous avons travaillé à la
transition aérobiose/anaérobiose.
La levure est un organisme anaérobie facultatif, dans le sens où, en anaérobiose, elle
est incapable de synthétiser l’ergostérol (son stérol majoritaire) et les acides gras insaturés,
dont les principaux sont l’oléate (C18 :1) et le palmitoléate (C16 :1). Ces molécules doivent
être additionnées au milieu de culture pour que la croissance soit possible. En effet, la voie de
biosynthèse des stérols chez la levure comprend un certain nombre d’étapes nécessitant la
présence d’oxygène. L’O2 peut agir directement en tant que cofacteur de certaines étapes de la
voie de biosynthèse de l’ergostérol ou indirectement par son implication dans la synthèse de
l’hème, un des composants du complexe du cytochrome P450, lui-même impliqué dans
certaines réactions de la voie (Figure 13). En anaérobiose, il y a donc blocage de la voie de
biosynthèse des stérols à diverses étapes, aboutissant à l’accumulation de précurseurs
(squalène, lanostérol...), qui s’accompagne d’une forte diminution du taux d’ergostérol. La
levure doit donc importer son ergostérol depuis le milieu extracellulaire dans ces conditions.
Pour ce faire, elle induit l'expression de plusieurs gènes dont les produits sont impliqués dans
ce mécanisme. A l'inverse, ces gènes ne sont pas exprimés en aérobiose, condition dans
69

laquelle la levure est capable de synthétiser de façon endogène son ergostérol : on parle
d'exclusion aérobie des stérols. Le système de régulation de l’homéostasie stérolique chez
Saccharomyces cerevisiae est très différent de celui de l’homme, la levure de boulangerie ne
possédant pas d’homologues à SREBP et à SCAP (Espenshade and Hughes, 2007). Notre
équipe a contribué à la compréhension des mécanismes de cette régulation chez la levure et à
l’identification des intervenants de la machinerie d’import des stérols en anaérobiose. Tout
d’abord, notre équipe a participé à l’identification et la caractérisation de SUT1 (Ness et al.,
2001; Regnacq et al., 2001), un gène hypoxique codant pour un facteur de transcription. Nous
avons pu montrer que deux cibles de ce facteur sont directement responsables de l'import
d'ergostérol : il s’agit d’AUS1, codant pour un transporteur ABC, et de DAN1, codant pour
une protéine de la paroi (Alimardani et al., 2004). La surexpression concomitante de ces deux
gènes permet, à elle seule, l'entrée de stérols en aérobiose et donc la levée de l’exclusion
aérobie des stérols.
De même, la ∆ 9 fatty acid desaturase, protéine codée par le gène OLE1 et responsable
de la désaturation des acides gras (formation d’une double liaison entre les carbones 9 et 10),
nécessite également de l’hème pour fonctionner (Ntambi, 1999).
En travaillant en condition d’anaérobiose, nous pouvons donc modifier le contenu
lipidique de la levure en provoquant une carence spécifique en ergostérol ou en acides gras
insaturés (AGIs) ou, spécifiquement, soit en ergostérol, soit en AGIs, en additionnant dans le
milieu de culture, de l’oléate ou de l’ergostérol, respectivement.
Ce système nous permet donc d’approcher au plus prêt les conditions de certaines
pathologies associées au métabolisme des stérols, comme le SLOS (déplétion en ergostérol),
ou des acides gras, comme le diabète de type 2 (déplétion en AGIs et son corollaire,
l’accumulation d’acides gras saturés) (Introduction, chapitre IV] B]).
B. Un modèle de protéine membranaire intégrée : la perméase
à uracile Fur4p
Afin d’étudier l’implication des lipides dans l’adressage des protéines membranaires,
la protéine modèle que nous avons retenue est la perméase à uracile de la membrane
plasmique Fur4p. Cette perméase est composé de 633 acides aminés. Elle possèderait, d’après
un modèle topologique partiellement validé expérimentalement, 10 segments
70

transmembranaires et des extrémités N- et C-terminales cytoplasmiques (Figure 14, (Garnier
C, 1996)). Cette protéine, dont la biogenèse est très bien documentée, emprunte la voie de
sécrétion et est connue pour s’associer aux rafts lipidiques dès le RE (Dupre and Haguenauer-
Tsapis, 2003). L’un des intérêts particuliers de cette protéine, dans le contexte de notre étude,
est qu’elle est soumise à plusieurs niveaux de régulation le long de la voie de sécrétion, selon
des processus liés, au moins en partie, à son interaction avec la bicouche lipidique et en
particulier avec les domaines rafts. Au niveau de l’appareil de Golgi, Fur4p a été décrite
comme subissant un contrôle qualité capable de provoquer son adressage direct vers la
vacuole via la voie endosomale pour dégradation dans la vacuole (Introduction, chapitre II] B]
2] b]). Ce processus a lieu notamment lorsque son substrat, l’uracile, est présent dans le
milieu de culture (Seron et al., 1999). Dans ces conditions, Fur4p subit deux évènements
d’ubiquitination au niveau des lysines 38 et 41, catalysés par l’ubiquitine ligase Rsp5p et
pourrait être exclue des rafts lipidiques (Marchal et al., 2000; Blondel et al., 2004b). Au
niveau de la membrane plasmique, sous certaines conditions (inhibition de la synthèse
protéique, choc thermique, carence en nutriment, présence du substrat en grande quantité dans
le milieu extracellulaire…), la quantité de Fur4p est régulée via son internalisation par
endocytose, et sa dégradation dans la vacuole (Volland et al., 1994b; Galan et al., 1996; Seron
et al., 1999; Blondel et al., 2004b). Cette internalisation nécessite le même type d’évènements
d’ubiquitination que précédemment, ces derniers étant induits par la phosphorylation
préalable de plusieurs résidus sérines situés sur une séquence PEST à l’extrémité N-Terminale
(Volland et al., 1992; Galan et al., 1996; Marchal et al., 2000). De façon générale, il semble
que Fur4p se dissocie des DRM de façon précoce et graduelle le long de la voie d’endocytose
(Dupre and Haguenauer-Tsapis, 2003). Néanmoins, à notre connaissance, aucune étude n’a
directement relié l’ubiquitination et l’exclusion des DRM dans le phénomène d’endocytose.
Enfin, dans une cellule lcb1-100, dont la voie de biosynthèse des sphingolipides est altérée, et
par conséquent la formation des domaines rafts, Fur4p ne subit pas de réadressage particulier,
mais est retenue de façon transitoire au niveau du Réticulum Endoplasmique (Introduction,
chapitre II] A] 3]) (Dupre and Haguenauer-Tsapis, 2003).
Pour l’ensemble de ces raisons, Fur4p nous est donc apparue comme un excellent
candidat pour évaluer l’impact de perturbations de l’homéostasie lipidique sur la biogenèse
des protéines membranaires.
71

Face extracellulaire
Face cytoplasmique
Figure 14: Modèle topologique de la perméase à uracile Fur4p
Fur4p serait constituée de dix segments transmembranaires, ses extrémités N- et C-terminales étant localisées
dans le cytoplasme. Les cercles indiquent l’emplacement potentiel de sites de N-Glycosylation. La séquence
PEST (riche en résidus Proline (P), Glutamate (E), Sérine (S) et Thréonine (T)) est située sur le premier segment
cytoplasmique constituant l’extrémité N-terminale de la protéine. La phosphorylation de certains résidus Sérine
de cette séquence régule l’endocytose de la protéine en réponse à la présence de son substrat dans le milieu par
exemple. Les sites d’ubiquitination correspondant aux résidus Lysine 38 et 41 sont égalements localisés sur ce
premier segment hydrophile.
D’après Garnier et al. (Garnier C, 1996).
72

Matériels et Méthodes
73

A. Matériel biologique
1. Souche bactérienne
La souche Escherichia coli, DH5α a été utilisée lors de cette étude. Son génotype est :
Ф80lacZ∆M15, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17 (rk-, mk+), Sup44, relA1, deoR,
∆(lacZYA-argF)U169. Cette souche est utilisée pour l’amplification de l’ADN plasmidique.
2. Souches de levures
Les souches utilisées au cours de cette étude appartiennent à l’espèce Saccharomyces
cerevisiae. Cet ascomycète hétérothallique présente un cycle de reproduction
haplodiplophasique, qui permet l’analyse génétique classique. Le génotype des souches
utilisées ainsi que leur origine sont répertoriés dans le tableau ci-dessous :
Souche ORF délété Génotype Origine
TH14 MATa his11∆
TH17 MATα his11∆
FY1679 α MATαααα trp1 his3 ura3 leu2 Descendant de FY 1679
FY1679 a MATa trp1 his3 ura3 leu2 Descendant de FY 1679
FYHO4 MATa trp1 his3 ura3 leu2 hem1::LEU2 (Ness et al., 1998)
Y10000 MATa trp1 his3 ura3 leu2 met15 BY4741 (EUROSCARF)
RY200T
MATαααα trp1-D901 ura3-52 leu 2-3,112 his3-Δ200 lys2-801 suc2-
D9 GAL, psd1 ::TRP1 psd2 ::HIS3 dpl1::KANR
hem1∆ a YDR 232W MATa trp1 his3 ura3 leu2 hem1::LEU2
hem11 α YDR 232W MATαααα trp1 his3 ura3 leu2 hem1::LEU2
75
(Robl et al., 2001)
Descendant de
FY1679 α x FYHO4
Descendant de
FY1679 α x FYHO4
end3∆ YNL 084c MATαααα his3 leu2 lys2 ura3 YNL084c::kanMX4 Y12992 (EUROSCARF)
hem1∆-end3∆ MATαααα his3 leu2 ura3 YNL084c::kanMX4 hem1::LEU2
Cette étude, descendant
de hem1∆a x Y12992
pep4∆ YPL 154c MATαααα his3 leu2 lys2 ura3 YPL154c::kanMX4 Y 12098 (EUROSCARF)
hem1∆-pep4∆ MATαααα his3 leu2 lys2 ura3 YPL154c::kanMX4 hem1::LEU2
Cette étude, descendant
de hem1∆a x Y12098

sp5 ts (MK15)
MATαααα his3- 200 leu2-3,112 ura3-5 lys2-801 trp1-1 rsp5::HA–
rsp5-19
hem1∆-rsp5 ts MATa his3 leu2 ura3 lys2 trp1 rsp5::HA–rsp5-19 hem1::LEU2
76
(Kaliszewski et al., 2006)
Cette étude, descendant
de hem1∆a x MK15
sec7 ts MATαααα ura3-52 leu2,-3,-112 sec7-1 SUC2 (Emr et al., 1984)
hem1∆-sec7 ts MATαααα ura3 lys2 trp1 sec7-1 hem1::LEU2
ole1∆ YGL 055W MATαααα his3 leu2 ura3 YGL055w::kanMX
Cette étude, descendant
de hem1∆a x sec7ts
Descendant de Y24422
(EUROSCARF)
hac1∆ YFL 031W MATαααα his3 leu2 lys2 ura3 YFL031w::kanMX4 Y15650 (EUROSCARF)
hem1∆-hac1∆ MATa his3 ura3 leu2 trp1 hem1::LEU2 YFL031w::kanMX4
Cette étude, descendant
de hem1∆a x Y15650
ire1∆ YHR 079c MATαααα his3 leu2 lys2 ura3 YHR079c::kanMX4 Y11907 (EUROSCARF)
hem1∆-ire1∆ MATαααα his3 ura3 leu2 trp1 lys2 hem1::LEU2 YHR079c::kanMX4
Cette étude, descendant
de hem1∆a x Y11907
MRY4 MATa ura3-52 leu2-312 gal- sec14ts (Regnacq et al., 2002)
sur2Δ YDR 297W MATαααα his3 leu2 lys2 ura3 YDR297w::kanMX4 Y13656 (EUROSCARF)
sur2Δ-end3Δ MATαααα lys2 leu2 his YDR297w::kanMX4 YNL084c::kanMX4
Cette étude, descendant
de hem1Δend3Δa x
sur2Δα
scs7Δ YMR 272c MATαααα his3 leu2 lys2 ura3 YMR272c::kanMX4 Y10858 (EUROSCARF)
Tableau 1: Souches de levure utilisées
Plasmides
3. Plasmides
Sélection dans la
bactérie
pFL38gF-GFP Résistance à l’ampicilline URA3
pPW344
(pJC104)
Résistance à l’ampicilline URA3
Sélection
dans la
levure
Origine Caractéristique
Dérive du plasmide
pUC 19
(Dupre and
Haguenauer-Tsapis,
2001a)
(Cox and Walter,
1996b)
pJH359 Résistance à l’ampicilline URA3 (Scafe et al., 1990)
Tableau 2:Plasmides utilisées
Vecteur navette centromérique
portant la séquence codante de la
protéine de fusion FUR4-GFP sous
contrôle du promoteur inductible
Gal 10
Plasmide multicopie portant 4
domaines d’activation UPRE dans le
promoteur minimal CYC1 fusionné à
lacZ
Plasmide multicopie portant la
promoteur du gène INO1 fusionné à
lacZ

4. Culture
a) Culture des bactéries
Les bactéries E.coli utilisées sont cultivées à 37°C en milieu LB (Luria Bertani) liquide,
ou solide, obtenu par addition d’agar 2% (m/v) (BIOKAR).
Milieu LB :
Tryptone (BIOKAR) 10 g/L, extrait autolytique de levure (BIOKAR) 5 g/L, NaCl 5 g/L.
L’ampicilline est utilisée à une concentration finale de 100 µg/mL. Cet antibiotique
permet la sélection des bactéries préalablement transformées par un plasmide contenant le
gène de résistance à l’ampicilline (gène codant la β-lactamase).
b) Culture des levures
En général, les levures sont cultivées à 27°C, en milieu liquide ou solide (agar
BIOKAR 2% (m/v)). La thermosensibilité des mutants est testée à 37°C.
Milieu YPG (« Yeast Peptone » + glucose) milieu complet standard :
Peptone pepsique de viande (BIOKAR) 10 g/L, extrait autolytique de levure (BIOKAR)
10 g/L, glucose 20 g/L.
Milieu YNB (« Yeast Nitrogen Base ») milieu minimum standard :
« Yeast Nitrogen Base w/o aminoacids and amonium sulfate » (DIFCO) 1,7 g/L, sulfate
d’amonium 5 g/L, glucose 10g/L.
Lorsque ceci est nécessaire, les acides aminés, bases puriques et pyrimidiques sont
ajoutés à une concentration finale de 50 µg/mL.
Milieu ACK (Acétate de potassium) milieu de sporulation :
Acétate de potassium 10 g/L
Milieu YNB sans Inositol :
Réalisé à partir de la composition décrite sur ce lien
(http://openwetware.org/wiki/Composition_of_Yeast_Nitrogen_Base_(YNB)), sans l’Inositol.
Le promoteur GAL10 étant inductible par le galactose, les souches transformées par le
plasmide pFl38gfGFP sont cultivées dans un milieu contenant du raffinose 20 g/L comme
source de carbone durant la pré-culure (YPRaff). Après élimination du milieu de pré-culture,
les souches sont transférées dans un milieu contenant du galactose 40 g/L, permettant la
synthèse de la protéine de fusion Fur4p-GFP. Le choix du Raffinose lors de la préculture
s’explique par le fait que le Glucose exerce un effet répresseur sur le promoteur GAL10, avec
77

pour conséquence un « délai » de l’induction de la protéine de fusion lors du transfert en
milieu Galactose.
L’ergostérol est ajouté à 80 µg/mL. La solution mère est préparée à 4 mg/mL dans un
mélange tergitol/éthanol (1/1 ; v/v). Le Tween 80 TM (mono-oléate polyoxyéthylène 20
monohydrosorbitol) et le Tween 40 TM (Polyoxyethylene sorbitane monopalmitate),
respectivement utilisés par les cellules comme source d’oléate ou de palmitate, sont
classiquement ajoutés à 1 % (v/v). Toutefois ce rapport peut varier comme indiqué pour les
différentes expériences.
L’acide δ-amino-lévulinique (ALA) est ajouté, lorsque indiqué, à une concentration
finale de 40 µg /mL, ou 80 µg/mL. Le G418 TM (Sigma ® ), qui est utilisé pour la sélection des
souches portant le gène kanMX4, est ajouté à une concentration finale de 200 µg/mL.
Les milieux complets YPG, YPRaff et LB sont stérilisés par autoclavage pendant 20
minutes à 120°C et le milieu minimum YNB, durant 15 minutes à 110°C. L’ergostérol, le
Tween 80 TM et le Tween 40 TM , sont ajoutés après autoclavage. Les solutions aqueuses (acides
aminés, bases azotées) sont au préalable filtrées (filtre de 0,45 µm) avant d’être ajoutées après
autoclavage.
c) Estimation de la multiplication des cellules
En milieu liquide, la densité cellulaire est mesurée par spectrophotométrie à une
longueur d’onde de 600 nm. A cette longueur d’onde, une unité de DO correspond soit à 2.10 7
cellules pour les levures haploïdes, soit à 10 9 cellules pour les bactéries.
B. Techniques de génétique = obtention des doubles mutants
L’obtention de doubles mutants nécessite le croisement entre deux souches de levures
portant des mutations individuelles. Un exemple en est donné dans la Figure 15.
Dans un premier temps, les deux souches haploïdes de signe sexuel opposé sont
croisées sur un milieu complet gélosé afin de favoriser la formation d’un diploïde. La
sélection des diploïdes est ensuite réalisée par complémentation des auxotrophies des deux
souches haploïdes (seuls les diploïdes pouvant croître sur le milieu de sélection choisi).
78

Nom de la souche:
Génotype:
Génotype du diploïde:
hem1∆ a
hem1∆::LEU2 ; his3- ; ura- hem1∆ a
hem1∆::LEU2 ; his3 ; Mat a
- ; ura- ; Mat a
Phénotype: G418S , his- , ura- , leu + , lys +
Phénotype: G418S , his- , ura- , leu + , lys +
Mat a
Matα
hem1∆::LEU2
HEM1
END3
79
end3∆
end3∆::KanMX ; his3- ; ura3- ; leu2- ; lys- end3∆
end3∆::KanMX ; his3 ; Mat α
- ; ura3- ; leu2- ; lys- ; Mat α
Obtention du diploïde (24-48h)
his3 -
his3 -
end3∆::KanMX his3- end3∆::KanMX his3- Milieu de sélection des diploïdes: YNB + HIS + URA + G418
Milieu permettant
d’obtenir le phénotype
des spores (haploïdes):
ura3 -
ura3 -
ura3 -
ura3 -
Spores + Diploïdes végétatifs
LYS
lys2 -
lys2 -
LEU2
leu2- leu2- Elimination des haploïdes hem1Δ et end3Δ
Milieu ACK (sporulation, 3-5 jours)
Killing à l’éther
Spores uniquement (striées sur milieu complet + δala, 24h)
Test en goutte
YPG + δala
YNB
YPG
YPG + δala + G418
YNB + δala + HIS + URA + LEU
YNB + δala + HIS + URA + LYS
G418R , his- , ura- , leu- , lys- G418R , his- , ura- , leu- , lys- Analyse des résultats
G418 sensible leu - lys -
G418 sensible leu - lys -
Sélection par recoupement des spores étant à la fois hem1Δ (donc LEU + Sélection par recoupement des spores étant à la fois hem1Δ (donc LEU ) et end3Δ (donc G418 résistant)
+ ) et end3Δ (donc G418 résistant)
Figure 15: Exemple d'élaboration d'un double mutant : Cas de hem1ΔΔΔΔ-end3ΔΔΔΔ
Le gène KanMX confère la résistance à un antibiotique :le G418. L’aminolevulinate (ALA) palie la déficience
causée par la mutation du gène HEM1 (hem1Δ)

Les diploïdes isolés sont ensuite incubés sur milieu de sporulation ACK pendant 3 à 4
jours. Après méiose, un asque contenant quatre spores est obtenu par diploïde. Un traitement à
l’éther permet ensuite de se débarrasser des diploïdes n’ayant pas sporulé et de libérer les
spores des asques (« killing à l’éther » d’après Dawes et Hardie (1974)(Dawes I.W. and I.D.,
1974). Les spores isolées sont étalées sur milieu complet YPG avant d’être analysées par test
en goutte. Pour ce faire, une aliquote de culture du milieu YPG est diluée dans de l’eau stérile
(300 µL) de façon à obtenir une concentration cellulaire de 10 6 cellules/mL. Des gouttes de
10 µL (contenant environ 10 000 cellules) sont alors déposées sur le milieu gélosé approprié.
Les cellules sont cultivées à 28°C pendant deux à trois jours. Ce test va nous permettre de
déterminer avec précision le phénotype et de déduire le génotype de chaque spore, par analyse
sur les milieux adéquats. Les souches d’intérêt sont ensuite conservées à –80°C.
C. Techniques de biologie moléculaire
1. Transformation de bactéries
Toutes les étapes concernant la préparation des bactéries avant la transformation sont
réalisées à 4°C. Des bactéries de la souche DH5α issues d’une culture (milieu LB) en phase
exponentielle de croissance sont lavées à deux reprises dans de l’eau distillée puis dans une
solution de glycérol 10% (v/v), avant d’être re-suspendues dans du glycérol 10% (v/v). La
suspension bactérienne est ensuite aliquotée, congelée rapidement dans de l’azote liquide puis
conservée à -80°C.
Après décongélation, les bactéries sont incubées, sur de la glace, avec l’ADN
plasmidique. Le mélange est soumis à un choc électrique (2,5 kV, 25 µF, 200 Ω). Les
bactéries sont ensuite incubées pendant une heure à 37°C dans 700 µL de milieu LB. Les
cellules transformées sont ensuite sélectionnées sur un milieu LB (solide) additionné
d’ampicilline.
2. Extraction et purification d’ADN plasmidique à partir de
cultures bactériennes
Cette méthode est adaptée de celles de Bimboim, H.C. (1979)(Birnboim and Doly,
1979) et Ish-Horowicz, D. et coll. (1981)(Ish-Horowicz and J.F., 1981).
80

Pour ce faire, une culture de bactéries en milieu LB-Ampicilline liquide (1,5 mL) est
centrifugée durant deux minutes à 10 000 g. Le culot obtenu est récupéré et resuspendu dans
100 μL de solution 1 (Glucose 0,9 %, EDTA 10 mM, Tris HCl 25 mM) auxquels sont ensuite
ajoutés 200 μL de solution de lyse (solution 2) (NaOH 0,2 M, SDS 1 % (m/v)) et enfin, après
10 min à 4°C, 150 μL de solution de neutralisation (solution 3) (acétate de sodium 3 M,
pH=5,2). L’ensemble est incubé 10 min sur la glace. Chaque tube est ensuite centrifugé
durant 5 min à 20 000 g. Le surnageant (400 μL) est récupéré et additionné de 800 μL
d’éthanol pur. Le mélange est centrifugé à 10 000 g durant 10 min à 4°C. Le culot est
resuspendu avec 100 μL de solution 4 (Tris HCl 10 mM, EDTA 1 mM, acétate de sodium
0,15 mM). Après addition de 200 μL d’éthanol absolu le mélange est centrifugé 10 min à
10 000 g à 4°C. Le surnageant est éliminé, et le culot est séché. Enfin, l’ADN est repris dans
20 μL de TE (Tris HCl 10 mM, EDTA 1 mM).
3. Transformation des levures
Cette méthode est utilisée pour transformer des cellules de levures par un plasmide
autonome, c’est à dire portant sa propre origine de réplication.
Une colonie de levures en culture sur milieu complet solide à 28°C depuis moins de
24 h est incubée une heure à 28°C dans 100 μL d’une solution A (Acétate de lithium 100 mM,
Tris HCl 10 mM, EDTA 1 mM, Sorbitol 1 M). Le culot cellulaire obtenu après centrifugation
d’une minute à 9 000 g est repris dans 5 μL d’une solution contenant l’ADN plasmidique
(miniprep). Le mélange est incubé à température ambiante pendant 10 min. 100 μL de
solution B (acétate de lithium 100 mM, polyéthylène glycol 4000 (m/v), EDTA 1 mM, Tris
HCl 10 mM) sont ajoutés. Une incubation de 30 min à 28°C est réalisée, puis les cellules
subissent un choc thermique de 5 minutes à 42°C. Elles sont ensuite centrifugées et
resuspendues dans 100 μL de solution C (Tris HCl10 mM, EDTA 1 mM, Sorbitol 0,6 M). La
suspension cellulaire ainsi obtenue peut être immédiatement mise en culture par étalement sur
le milieu sélectif solide adéquat.
81

D. Méthodes biochimiques
1. Méthode d’analyse des protéines : Western blotting
La méthode d’analyse des protéines par Western blotting comporte quatre étapes
distinctes (Burnette, 1981).
a) Préparation d’extraits de protéines totales de levures
Cette préparation est adaptée de la méthode développée par Volland C. et coll.
(1992)(Volland et al., 1992). Les protéines sont extraites à partir de 2.10 7 cellules (DO600 =
1). Les cellules sont centrifugées 5 min à 3000 g et le culot cellulaire est repris dans 500 µL
d’eau stérile. A cette suspension sont ajoutées 50 µL de soude 1,85 M contenant du β-
mercaptoethanol 3,5 % (v/v), et le tube est incubé à 4°C pendant 10 min. Les protéines sont
ensuite précipitées par addition de 50 µL de TCA à 50 % (m/v). Après incubation pendant
10 min à 4°C et centrifugation à 14 000 g pendant 10 min à température ambiante, le culot
protéique obtenu est remis en solution dans 20 µL de Trizma Base 1M, auxquels sont ajoutés
10 µL de tampon d’échantillon d’électrophorèse contenant du β-mercaptoéthanol 5 %(v/v)
(Laemmli, U.K., 1970). Cette remise en suspension est optimisée par traitement de
l’échantillon pendant 2 min dans un bain à ultrasons ( Vilber Lourmat), et incubation de
10 min à 37°C.
b) Electrophorèse des protéines
Les protéines sont séparées dans un gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes
selon la méthode de Laemmli, U. K. (1970)(Laemmli, 1970). Le gel de séparation est un gel à
12,5 % d’acrylamide/bis-acrylamide (37,5/1) (m/v) dans un tampon Trizma-Base 0,375 M,
pH=8,8, renfermant du SDS 0,1 % (m/v), du TEMED 0,1 % (v/v) et du persulfate
d’ammonium 0,049 % (m/v). Le gel de concentration des échantillons est un gel à 4,5 %
d’acrylamide/bis-acrylamide (37,5/1) (m/v) dans un tampon Trizma Base 0,125 M, pH=6,8,
renfermant du TEMED 0,1 % (v/v), du persulfate d’ammonium 0,06 % (m/v) et du SDS
0,1 % (m/v). L’électrophorèse est effectuée avec un appareil vertical (Polylabo). Le tampon
de migration est un tampon Trizma Base 25 mM contenant de la glycine 0,192 mM et du SDS
0,1 % (m/v).
L’intégralité de chaque échantillon protéique (correspondant à 2.10 7 cellules) ainsi qu’une
aliquote d’un marqueur de masse moléculaire précoloré (InVitrogen ® SeeBlue +2) sont
soumis à l’électrophorèse.
82

La migration est réalisée pendant 12 à 16 h sous une tension constante de 40 mV.
c) Electrotransfert des protéines
L’électrotransfert est réalisé sur une membrane de nitrocellulose Hybond ECL
(Amersham ® ), à l’aide d’un appareil de transfert semi-sec (Whatman Biometra B33 Semi
Dry). Le transfert est effectué pendant 35 min à une intensité maximale de 5 mA/cm 2 de
membrane, dans un tampon Trizma-Base 25 mM, glycine 192 mM, méthanol 10 % (v/v).
d) Immuno-révélation des protéines transférées sur
membrane de nitrocellulose par la méthode ECL TM
La membrane de nitrocellulose est immergée pendant 1 h dans du tampon TBST-L
(tampon Trizma Base 10 mM, pH=8 contenant du NaCl 0,15 M, du Tween 20 à 0,5g/L et du
lait en poudre écrémé à 25 g/L). Les protéines du lait vont saturer les sites non spécifiques sur
la membrane de transfert. Celle-ci est ensuite incubée avec des anticorps polyclonaux de lapin
(anticorps primaires) dirigés spécifiquement contre la GFP (dilution 1/2000, Molecular Probes
A-6455), Pma1p (1/2000 ème ; Dr Carolyn Slayman, New Haven, USA), Kar2p (1/5000 ème ;
Dr Randy Schekman, Berkeley, USA) ou Sec 61p (1/4000 ème , Randy Schekman, Berkeley,
USA) dans du TBST-L, pendant 16 h. La membrane est rincée dans du TBST (sans lait
écrémé) puis incubée durant 1 h dans du TBST-L contenant un anticorps secondaire d’âne,
dirigé contre les immunoglobulines de lapin et couplé à la péroxydase (dilution 1/2000 ème ;
Amersham Bioscience ® NA-934V). La réaction catalysée par cette enzyme permet ainsi de
localiser la protéine ciblée par l’anticorps primaire, après incubation de la membrane avec un
substrat chimioluminescent (ECL TM , Amersham ® ) capable d’impressionner un film
photographique (Kodak ® ). La membrane peut être incubée séquentiellement avec les
différentes anticorps primaires, après avoir été préalablement nettoyée des anticorps primaires
et secondaires par incubation dans une solution de « stripping buffer » (β mercaptoéthanol
100 mM (v/v), SDS 2 % (v/v), Trizma Base pH=6,7 62,5 mM (v/v)), à 50 °C, pendant 30 min,
selon les instructions fournies par le fabricant de la membrane (Amersham ® ).
e) Dosage des protéines
Afin d’évaluer la concentration en protéine dans nos fractions microsomales (voir plus
loin), nous avons utilisé le « Bicinchoninic acid protein assay kit » de Sigma ® . Ce kit est
83

composé de deux solutions : une de sulfate pentahydrate de Cu 2+ et une d’acide
bicinchonique. L’ajout de Cu 2+ dans l’échantillon va provoquer la formation de complexe
Cu 2+ -protéine. Le Cu 2+ peut ensuite être réduit en Cu 1+ en présence de certains acides aminés
comme la cystéine, le tryptophane, la tyrosine ou de liaisons peptidiques (Wiechelman et al.,
1988). L’acide bicinchonique, rajouté par la suite, forme un complexe de couleur violette avec
le Cu 1+ . L’intensité de cette coloration (mesurée à 562 nm) est donc directement
proportionnelle à la quantité de protéines présentes dans l’échantillon.
2. Mesure de l’activité β-galactosidase
Le test de l’activité β−galactosidase a été réalisé dans le but d’observer l’induction de
l’UPR et de la réponse INO1 dans nos différentes conditions de culture. Après un temps de
culture déterminé en milieu liquide, 4x10 7 cellules (2 de DO600 nm) sont centrifugées et le
surnageant est éliminé. Le culot peut être conservé à -80 °C pour analyse ultérieure.
Le jour du test, le culot cellulaire est repris dans 1,5 mL de tampon Z (60 mM
Na2HPO4, 40 mM NaH2PO4, 10 mM KCl, 1 mM MgSO4, 50 mM β-mercaptoéthanol, pH=7).
Afin d’évaluer précisément le nombre de cellules présentes dans l’échantillon, une dilution au
1/10 ème dans de l’eau miliQ (100 µL échantillon + 900 µL eau miliQ) est réalisée, et une
mesure de l’absorbance à 600 nm est effectuée. Les cellules présentes dans les 1,4 mL restant
sont alors lysées par ajouts successifs de 100 µL de SDS 0,1 % (v/v) et 200 µL de
chloroforme, et agitation au vortex durant 30 s. Après décantation de 10 min, 400 µL de la
phase supérieure sont transférés dans un tube à hémolyse, puis additionnés de 600 µL de
tampon Z. Ces 400 µL constitueront le volume d’essai pour la mesure de l’activité β-
galactosidase. La réaction est initiée par addition de 200 µL d’ONPG à 4 mg/mL dans du
tampon Z. Le tube est alors placé dans un bain-marie, à 30 °C, jusqu’à obtention d’une
coloration jaune. La β-galactosidase étant inactive à pH alcalin, la réaction est stoppée par
addition de 500 µL de Na2CO3 1M, et le temps de réaction est relevé. Afin d’éliminer le plus
possible les débris cellulaires restants, l’échantillon est centrifugé à 800 g durant 5 min puis le
surnageant est transféré dans un tube propre. Enfin, deux absorbances sont mesurés, à 420 nm
(DO420nm), correspondant à l’apparition du o-nitrophénol, produit de la réaction, et à 550 nm
(DO550nm) permettant d’estimer la contamination de l’échantillon par les débris cellulaires.
L’activité β-galactosidase est estimée via l’équation suivante :
84

U = (1000 x [DO420 nm – (1,75 x DO550 nm)] / (t x V x DO600 nm),
où t est le temps de réaction, exprimé en minutes et
V, le volume de culture de l’essai, en mL.
3. Mesure de l’activité de sécrétion de l’invertase
Ce test a pour but de vérifier si, dans nos conditions de cultures, la voie de sécrétion de
l’invertase est fonctionnelle.
Après culture des cellules jusqu’à une DO600nm comprise entre 0,2 et 0,5 (début de
phase exponentielle de croissance), 2.10 8 cellules sont prélevées, lavées avec de l’eau
distillée, puis resuspendues dans un milieu pauvre en glucose (0,05 % (m/v) glucose + 2 %
(m/v) saccharose) à 28 °C, afin d’induire l’expression de l’invertase. Toutes les 15 min
suivant le début de l’induction et ceci durant 1 h, l’équivalent de 2 unités DO600nm est prélevé
afin d’évaluer le taux de sécrétion de l’invertase. Le trafic intracellulaire de cette enzyme est
bloqué par addition de NaN3 10 mM final et incubation sur la glace. L’échantillon subit
ensuite deux lavages successifs dans du NaN3 10 mM, et la DO est ajusté à DO600nm = 0,5 à
l’aide de ce même NaN3 10 mM.
A partir de cette étape, chaque échantillon est séparé en deux aliquotes de volume
équivalent (500 μL) : la première aliquote est utilisée pour déterminer la sécrétion d’invertase
dans le milieu extracellulaire (invext), tandis que la seconde est utilisée pour évaluer le taux
d’invertase total dans l’échantillon, correspondant aux activités dans les milieux intra et
extracellulaire (invtot). Ainsi, le taux d’invertase intracellulaire est calculé par simple
soustraction entre ces deux valeurs (invint).
A l’aliquote invext sont additionnés 50 µL d’eau distillé, puis le mélange est déposé sur
glace. Les cellules de fraction invtot sont, quant à elles, perméabilisées par addition de 50 µL
de Triton X-100 10 % (m/v), suivie d’un cycle congélation-décongélation dans de l’azote
liquide. Après cette étape, l’échantillon invtot est également déposé sur la glace.
La mesure d’activité invertase à proprement parler est réalisée selon la méthode de
Munn et al. (Munn et al., 1999) qui est une adaptation du protocole de Goldstein and Lampen
(1975) (Goldstein and Lampen, 1975). A 10 µL des échantillons invext ou invtot sont ajoutés 25
µL d’acétate de sodium 0,2 M pH=4,9 et 12,5 µL de saccharose 0,5 M, puis le mélange est
déposé sur la glace. Une courbe étalon est réalisée en parallèle en substituant aux 10 µL
d’échantillon et aux 12,5 µL de saccharose 22,5 µL d’une solution de glucose de
concentration connue (de sorte à obtenir 0 ; 12,5 ; 25 ; 50 ; 75 ou 112,5 nmol de glucose dans
l’échantillon). Les différents échantillons sont incubés dans un bain marie à 37 °C durant 10
85

min puis redéposés sur glace. L’invertase est inactivée par ajout de 50 µL de tampon
phosphate potassium 100 mM pH=7, suivi d’un choc thermique de 3 min à 90 °C et d’un
refroidissement brutal sur la glace. L’apparition de glucose résultant de l’hydrolyse du
saccharose en présence d’invertase est mesuré par un test colorimétrique utilisant la o-
Dianisidine (3,3'-dimethoxybenzidine), un substrat de peroxydase qui, en présence de cette
enzyme et de peroxyde d’hydrogène génère un produit jaune-orange qui peut être quantifié à
540 nm. Le peroxyde d’hydrogène est obtenu par oxydation du glucose en présence de
glucose oxydase. Dans ce but, à chaque échantillon sont ajoutés 500 µL d’une solution C (50
µg/mL (m/v) de glucose oxydase (Aspergillus niger ; Sigma ® ), 10 µg/mL (m/v) péroxydase
de raifort (horseradish peroxydase, Sigma ® ), 10 mM de tampon phosphate de potassium
pH=7, 300 µg/mL (m/v) d’o-dianisidine (Sigma ® ) et 38 % (m/v) de glycerol) avant une
incubation de 20 min à 30°C. Enfin, 750 µL de HCl 6 M sont additionnés pour stopper la
réaction, et l’absorbance à 540 nm est mesurée.
Comme précisé plus haut, l’activité de l’invertase intracellulaire (invint) est calculée
par différence entre l’activité invertase totale (invtot, cellules lysées) et l’activité invertase de
surface (invent, cellules entières) à chaque point. Ces différentes valeurs sont converties en
nanomoles de glucose formé, en utilisant la pente de notre courbe standard comme facteur de
conversion, sachant qu’habituellement 1 de DO540nm représente environ 100 nmol de glucose
formé.
Enfin, les activités invertase externes et internes pour chaque temps sont exprimées en
micromoles de glucose formées par unité de DO600nm et par minute.
4. Extraction des Detergent Resistant Membranes (DRM)
Ce protocole est une adaptation des méthodes décrites par Bagnat et al. (Bagnat et al.,
2001) et Lauwers et al. (Lauwers and Andre, 2006).
Il est important de noter que l’intégralité de la manipulation doit se faire à 4°C, ou sur
glace. Les échantillons ne doivent jamais être à température ambiante. De même, les solutions
utilisées sont conservées en chambre froide jusqu’à leur utilisation.
La première étape consiste à prélever l’équivalent de 10 unités de DO600nm (soit 2.10 8
cellules) de culture cellulaire. Afin d’avoir un rapport protéines/détergent constant entre les
différentes conditions testées, il est indispensable que ce prélèvement soit fait le plus
précisément possible. Les suspensions cellulaires sont centrifugées (1 700 g, 5 min,
86

Eppendorf 5417r) et le surnageant éliminé. Les culots cellulaires peuvent être conservés à
-80°C durant plusieurs semaines, pour analyse ultérieure.
Le jour de l’isolation des DRM, l’échantillon décongelé est resuspendu dans 250 µL
de tampon TNE (Tris-HCl pH=7,4 50 mM, NaCl 150 mM additionné d’inhibiteurs de
protéases (20 µL de cocktail inhibiteur Sigma ® P 8215 pour 5 mL de tampon TNE + N-éthyl-
maléimide 25 mM (Sigma ® )). Les cellules sont lysées grâce à l’utilisation de billes de verre et
d’un broyeur (billes de 0,6 mm de diamètre, Fischer Scientific Bioblock 100 µL) puis les
débris cellulaires sont éliminés par centrifugation (5 min, 960 g, 4°C). 112,5 µL de surnageant
sont récupérés puis déposés sur glace durant 30 min en présence de Triton X-100 1% (12,5
µL de Triton X-100 10 %). Ce lysat est ensuite ajusté à 40 % d’iodixanol, par ajout de 250 µL
de solution Optiprep TM (Axis-Shield). Sans à-coups, à l’aide d’une pipette Pasteur,
l’échantillon est placé au fond du tube de centrifugation de 4 mL en Polycarbonate (13 x
51 mm Beckman Coulter, (préalablement conservé à 4 °C)), avant d’être recouvert de 600 µL
d’une solution d’iodixanol 30 % (50 % Optiprep TM 50 % TXNE (tampon TNE + Triton X-
100 0,1 %) (v/v)), puis de 100 µL de tampon TXNE. Nous obtenons donc un gradient à trois
niveaux. L’équilibrage des tubes se fait par addition, si besoin est, de TXNE en surface. Une
centrifugation à 200 000 g, (rotor TLA100-2, Beckman Coulter) d’une durée de 2 h, à 4 °C est
alors effectuée.
Au terme de cette centrifugation, six fractions de 175 µL sont récoltées depuis le haut
du gradient (les DRM étant enrichis au sommet du gradient). Il est à noter que les fractions
peuvent être à ce stade conservées quelques jours à –20 °C. Les protéines contenues dans
chacune des six fractions sont précipitées par incubation 30 min sur glace en présence de TCA
10 %, suivi d’une centrifugation de 15 min, à 20 800 g (Eppendorf 5417R) et à 4°C. Le culot
est resuspendu dans 20 µL de tampon (Tris-Base 0,5 M, tampon d’échantillon 2X (Tris-HCl
100 mM pH=6,8, EDTA 4 mM, SDS 4 % (m/v), glycérol 20 % (v/v), bleu de bromophénol
0,02 %) (1/1) (v/v), β-mercaptoéthanol 2 % (v/v)) et les échantillons correspondants aux six
fractions sont incubés 15 min à 37 °C avant analyse par SDS/PAGE et Western blotting
(Matériel et Méthodes, D] 1]). La totalité des échantillons (soit 20 μL) est déposée sur le gel
SDS/PAGE.
87

5. Purification des fractions microsomales
Ce protocole est adapté des méthodes décrites par Katzmann et al.(Katzmann et al.,
1999) et Zinser et al. (Zinser et al., 1993). Comme pour la purification des DRM, l’intégralité
des manipulations doit se faire sur glace ou à 4 °C.
Après 8 h de culture dans les différentes conditions, l’intégralité de la suspension
cellulaire (1 L de culture comprise entre 3 et 4 de DO, soit 6.10 10 et 8.10 10 cellules) est
récoltée par centrifugation à 700 g, 10 min. Le culot cellulaire ainsi obtenu est repris dans 4
mL d’eau distillée additionnés de 250 μL de Tris 0.5 M, 50 μL d’EDTA 0.5 M et 12.5 μL de
PMSF 0.2 M. La suspension cellulaire est transférée dans un tube en verre et des billes en
verre (0,6 mm Fischer Scientific Bioblock) sont ajoutées, de sorte à constituer la moitié du
volume total. Les cellules sont cassées au vortex en 10 cycles de 30 s, en alternant vortex et
immersion dans la glace pendant 30 s. Le broyat est récupéré à la pipette pasteur et transféré
dans un tube de 40 mL. Les billes sont lavées avec 5 mL final de glycérol 20 % (v/v) dans du
TED (Tris Base 10 mM ajusté à pH=7.5, EDTA 10 mM, DTT 0.2 mM), puis le liquide est
transféré dans le tube en verre de 40 mL (Corex TM ) et l’ensemble est centrifugé 10 min à
700 g. Le surnageant est récupéré et transféré dans un tube propre pour être soumis à une
nouvelle centrifugation à 20 000 g pendant 20 min. Le surnageant, contenant les fractions
microsomale et cytosolique, est transféré dans un tube propre dans lequel il pourra être
conservé à -20 °C quelques jours. Après décongélation douce (sur glace) l’échantillon est
soumis à une centrifugation d’1 h à 100 000 g (Sorvall Ultra Pro80, rotor : TFT 50.38,
Sorvall). Le surnageant est éliminé et le culot est resuspendu à l’aide d’un potter dans 5 mL
de Tris-HCl 10 mM, pH=7,4, puis l’échantillon est transféré dans un tube de 40 mL
(Corex TM ). Cette fraction est alors centrifugée à 20 000 g pendant 20 min pour éliminer
l’essentiel des membranes plasmiques et mitochondries contaminantes. Ce surnageant est
soumis à une ultime centrifugation de 100 000 g pendant 1 h. Le culot opaque obtenu
(correspondant majoritairement aux membranes microsomales) est resuspendu, par
potterisation, dans 500 µL de glycérol 20 % (v/v) dans du Tris-HCl 10 mM pH=7,4. Enfin,
avant congélation à – 80°C, 30 µL de la suspension obtenue sont prélevés et congelés
séparément, pour détermination ultérieure de la concentration protéique de notre échantillon.
Pour les analyses par Western-blotting, 1 μg, 10 μg ou 100 μg de protéines sont déposés sur
le gel SDS/PAGE.
88

6. Méthodes d’analyse des lipides
a) Extraction des lipides totaux
Les extraits lipidiques sont préparées à partir de 2.10 9 (pour les stérols), 2.10 8 (pour les
acides gras totaux) ou 10 8 (pour les phospholipides) cellules cultivées dans les conditions
décrites. Après 7 heures de culture, les cellules sont récoltées par centrifugation, lavées avec
de l’eau distillée, resuspendues dans 1 mL d’eau distillée froide et déposées sur glace. Elles
sont ensuite cassées grâce à l’ajout de 500 µL de billes en verre (0,6 mm, Fischer Scientific
Bioblock) et l’utilisation d’un agitateur (Biospec) durant 1 min à 5000 tours/min. Après avoir
transféré le lysat et l’eau de rinçage des billes (1 mL) dans un tube en verre propre de 40 mL
(Corex TM ), les lipides cellulaires seront extraits en utilisant un ratio méthanol :chloroforme
2 :1 (v/v). Dans un premier temps, 6 mL de méthanol sont ajoutés, l’ensemble est vortexé et
incubé à 65°C durant 15 min dans le but d’éliminer l’activité lipase de l’échantillon. Puis,
après avoir laissé refroidir le mélange à température ambiante, 3 mL de chloroforme sont
ajoutés et l’ensemble est vortexé. Les lipides sont extraits sur la nuit entière à température
ambiante. Le lendemain, l’échantillon subit une première centrifugation de 12 min à 10 000 g
et à 4°C. Le surnageant est transféré dans un nouveau tube auquel sont ajoutés 2 mL de
chloroforme et 4 mL d’eau distillée. L’échantillon est alors soumis à une nouvelle
centrifugation de 8 min à 3 000 g et à 4°C. A l’issue de cette centrifugation, l’échantillon se
décante pour laisser apparaître deux phases distinctes. La phase supérieure est éliminée alors
que la phase inférieure (organique) contenant les lipides est évaporée sous azote pour analyse
ultérieure. Selon la classe de lipides étudiée, l’extrait ne sera pas resuspendu dans le même
solvant.
En ce qui concerne les fractions microsomales, les extractions sont réalisées de la
même façon sur des échantillons contenant entre 500 μg et 800 μg de protéines (stérols) ou
100 μg de protéines (phospholipides).
b) Préparation des esters méthyliques d’acides gras par
transestérification
Les acides gras totaux (acides gras libres et contenus dans les lipides complexes (O-
acyl lipides)), sont transestérifiés en les chauffant dans un large excès de méthanol anhydre
contenant un réactif acide comme catalyseur. Les échantillons de lipides obtenus
89

précédemment sont repris dans 200 µL d’hexane contenant 25 µg/mL d’ester méthylique
d’acide heptanoïque (C17:0 ; Sigma @ ), utilisé comme standard interne, et transférés dans des
tubes Chromacol TM . 2 mL de méthanol sec contenant 2 % (v/v) d’acide sulfurique fumant,
sont ajoutés et la transestérification est réalisée à 50°C pendant 16 h. A la fin de cette
incubation, 700 µL d’eau et 2 mL d’hexane sont ajoutés. Après décantation, la phase
organique supérieure, contenant les esters méthyliques d’acides gras, est récupérée et le
solvant (hexane) est évaporé sous azote (1 bar). Le culot est finalement repris dans 100 µL
d’hexane pour analyse par chromatographie en phase gazeuse (voir ci-après). Les différentes
espèces d’acides gras sont identifiées grâce à leur temps relatif d’élution par rapport à l’ester
méthylique d’acide heptanoïque, utilisé comme standard.
c) Analyse de la quantité de Phosphatidyléthanolamine
L’extrait lipidique est resuspendu dans 100 µL de chloroforme/méthanol 1/1 (v/v).
Puis, les phospholipides sont séparés à l’aide d’une plaque de silice LK5 (Whatmann) pré
incubée dans un mélange chloroforme/éthanol/eau/triéthylamine (30 :35 :7 :35, v/v/v/v). Au
terme de la migration, les lipides sont observées sous UV grâce à l’utilisation d’une solution
de primuline (1 mg/mL (m/v) dans de l’acétone/eau 80 :20 (v/v) Sigma ® ). La zone
correspondant à la PE est grattée, transférée dans un tube Chromacol TM , puis la PE est extraite
de la silice par deux élutions successives avec 2 mL de chloroforme/methanol/eau (5/5/1,
v/v). 2 mL d’eau sont alors ajoutés aux surnageants combinés des étapes d’élution dans un
tube Corex TM . La phase inférieure est collectée après une centrifugation de 8 min à 3000 g,
transférée dans un tube Chromacol TM et évaporée sous azote. L’extrait est alors repris dans
200 µL d’hexane contenant 25 µg/mL d’ester méthylique d’acide heptanoïque (C17:0 ;
Sigma ® ) pour transestérification, comme décrit dans le paragraphe précédent.
Le taux de PE est exprimé en nanomoles d’acides gras totaux par 10 9 cellules.
d) Obtention des extraits stéroliques après saponification
Pour l’étude des stérols, l’extrait lipidique est repris dans 200 µL d’hexane. Les
échantillons sont soumis à une saponification, dans 2 mL de méthanol contenant 40 % (m/v)
de KOH, à 90 °C pendant 1 h. 700 µL d’eau sont ajoutés aux échantillons et les stérols sont
enrichis par 3 extractions successives avec 2 mL d’heptane. Les fractions heptaniques sont
passées sur une colonne de sulfate de sodium afin d’éliminer l’eau résiduelle. Enfin,
90

l’échantillon est évaporé sous azote (1 bar), puis resuspendu dans 100 µL d’hexane contenant
50 µg/mL de cholestérol, utilisé comme standard interne.
e) Analyse par chromatographie en phase gazeuse
Les esters méthyliques d’acides gras et les stérols sont séparés et analysés par
chromatographie en phase gazeuse (GC 8000 TOP , CE Instruments), à l’aide d’une colonne
apolaire « 25 m X 0.32 mm AT-1 capillary column (Alltech) ». Pour l’analyse des deux types
d’échantillons, 5 µL d’extraits sont injectés sur la colonne en mode « split » (1/30 ;
température de l’injecteur : 250°C). Cependant, deux gradients de température différents sont
appliqués en fonction des lipides analysés. Pour les esters méthyliques d’acides gras, la
température initiale est de 50°C, puis elle est élevée jusqu’à 230°C (30°C/min). Cette
température est alors maintenue durant 4 min. Pour les stérols, la température initiale est
également de 50°C ; elle est ensuite élevée jusqu’à 220°C (30°C/min), puis jusqu’à 290°C
(2°C/min), où elle est maintenue durant 15 min. Les différentes espèces sont détectées grâce à
un FID (Flame Ionisation Detector ; température : 250°C) et les chromatogrammes
correspondant sont obtenus et analysés grâce au logiciel ChromCard. Les méthyls esters
d’acides gras et les stérols sont identifiés et quantifiés par comparaison avec les standards
internes (C17 :0 et cholestérol, respectivement).
f) Analyse de la composition phospholipidiques en
spectrométrie de masse
Dans ce cas, l’extrait lipidique est resuspendu dans 200 µL de chloroforme/methanol/
eau 16 :16 :5 (v/v/v). L’échantillon est vortexé puis partagé en deux aliquotes de volume
identique. L’une est ajustée à 1% (v/v) d’acide formique pour l’analyse en spray d’ion positifs
et l’autre à 1 % de diéthylamine (v/v) pour l’analyse en spray d’ions négatifs. La composition
phospholipidique est obtenue par analyse de l’échantillon sur spectromètre de masse
(PerkinElmerSciex Instruments API 165). Les spectres obtenus sont traités à l’aide du logiciel
Biomultiview 1.2 (PerkinElmerSciex Instruments), ce qui nous permet d’associer une
intensité à chaque valeur de m/z. Afin de pouvoir les interpréter, une feuille de calcul a été
créée sous Excel au sein du laboratoire. Les données Biomultiview sont copiées dans une
feuille de ce logiciel où elles vont être transformées en pourcentage par rapport au pic de plus
forte intensité (qui correspond à 100 %). Le bruit de fond est éliminé par fixation d’un seuil
91

minimum d’intensité (5 ou 10 % du pic majoritaire). L’identification des pics de
phospholipides (donc des espèces phospholipidiques) est ensuite réalisée par comparaison
automatique des valeurs expérimentales avec celles calculées pour les différents
phospholipides attendus (valeur théorique).
E. Méthodes de biologie cellulaire
1. Coloration au Rouge Nil
La coloration des cellules par le rouge Nil est réalisée sur des cellules non fixées, en
ajoutant 1 µL d’une solution de rouge Nil dilué dans de l’acétone à 1 mg/mL pour 1 mL de
culture de cellules (10 7 cellules environ). Cette étape est suivie d’une incubation de 45
minutes à température ambiante. La suspension cellulaire est ensuite déposée sur lamelle et
observée au microscope confocal.
2. Coloration au FM4-64
Le FM 4-64 (N-(3-thiethylammoniumpropyl)-4-(p-dethyl-aminophenyl hexatrienyl)
pyridinium dibromide) est une molécule fluorescente lipophile qui permet de localiser
successivement, selon le temps d’incubation, la membrane plasmique, les vésicules
d’endocytose ou la membrane vacuolaire de la levure. Pour ceci, 10 7 cellules environ sont
incubées pendant 10 min à 4°C dans 500 µL d’une solution de FM 4-64 à 10 µM (dans l’eau).
Au terme de cette incubation, l’échantillon est centrifugé pendant 1 min à 2000 g, le
surnageant est éliminé, et le culot est resuspendu dans 500 µL d’eau stérile. Les cellules sont
alors incubées à 28°C, à l’obscurité, jusqu’à observation.
3. Acquisition des images par microscopie confocale
Les images de fluorescence ont été obtenues avec un confocal spectral Olympus
(FV1000) monté sur un microscope inversé IX-81. Les images, correspondant à des coupes
optiques des échantillons, ont été obtenues avec un objectif x60 à immersion à eau (Olympus
UplanAPO ON 1.2), nous permettant notamment d’avoir une résolution de 0,5 µm en
épaisseur. Ces images représentent soit la fluorescence verte pour la GFP, soit la fluorescence
rouge pour le rouge Nil ou le FM 4-64, enregistrées de manière séquentielle par l’excitation à
92

488 nm (laser Argon) et 543 nm (laser HeNe) respectivement. L’émission de fluorescence est
détectée par deux détecteurs spectraux entre 500 nm et 530 nm pour la GFP et entre 555 nm et
655 nm pour le rouge Nil et le FM 4-64. Ces images ont été acquises en niveau d’intensité
lumineuse (codage en 12 bits) à l’aide du logiciel FLUOVIEW TM version 1.6 (OLYMPUS).
Elles possèdent une résolution de 0,14 µm/pixel ce qui représente un échantillonnage optimal
pour un maximum de résolution. Pour chaque plan, une image en contraste interférentiel
(transmission) a également été acquise.
F. Méthodes de biophysique : évaluation de la fluidité
membranaire par utilisation de la sonde Laurdan
La sonde Laurdan (6-dodécanoyl-2-diméthylamino naphtalène), en s’insérant au sein
de la bicouche phospholipidique, va permettre d’évaluer le niveau de structuration (ou
d’ordre) des lipides de la membrane, et donc indirectement la fluidité membranaire (Beney et
al., 2007). Quand le Laurdan est inséré dans des membranes en phase Ld, son maximum de
fluorescence est décalé d’environ 50 nm vers le rouge par rapport à la phase gel (G). Cette
différence est due aux réorientations du solvant autour du fluorophore excité, phénomène
pouvant avoir lieu dans une membrane en phase Ld, mais pas (ou peu) en phase G. Le
décalage du spectre ainsi obtenu peut être analysé en terme de GP, le paramètre de
polarisation générale proposé par Parasassi et al. (Parasassi et al., 1990; Parasassi et al., 1991;
Parasassi et al., 1992; Parasassi et al., 1993; Parasassi et al., 1995). Ce GP dépend de la
répartition relative du Laurdan dans des phases Ld et G. Sa valeur est obtenue à partir de
l’intensité de fluorescence aux longueurs d’ondes voisines de l’émission maximale pour
chaque état de la membrane, comme présenté dans l’équation ci-dessous :
GPex = (IG – ILd)/(IG + ILd)
où IG et ILd sont respectivement égaux à l’intensité du spectre d’émission à 440nm et à
490 nm, pour une longueur d’onde d’excitation donnée.
L’analyse de ces échantillons a été faite en collaboration avec le Laboratoire GPMA
de Dijon, dirigé par le Professeur Patrick Gervais, et plus particulièrement avec le Docteur
Laurent Beney et Sébastien Dupont, étudiant en doctorat. Un volume de fraction microsomale
correspondant à environ 400 µg de protéines est mis en suspension dans une solution de
Laurdan à 1,33 µM dans du glycérol 20 % (v/v) Tris-HCl 10 mM, pH=7,4. Après 10 min
d’incubation, l’acquisition des spectres d’émission du Laurdan est réalisée à l’aide d’un
spectrofluorimètre Fluorolog-3 (Jobin Yvon, groupe Horiba, USA), à une excitation de 350
93

nm. Les spectres d’émission compris entre 420 nm et 520 nm sont récupérés et analysées en
utilisant la formule citée plus haut.
Cette analyse a été réalisée à 7, 12, 17, 22 et 27 °C.
94

Résultats
95

Chapitre I : Impacts de perturbations de
l’homéostasie lipidique sur la
biogenèse d’une protéine membranaire
intégrée
97

Gal10 FUR4 GFP
7h
+ Gal
Condition de culture
souhaitée
Figure 16 : Principe de l’induction de la construction Fur4p-GFP
Gal10 FUR4 GFP
Expression de Fur4p -GFP
Lorsque la souche hem1Δ transformée par le plasmide pFl38gfGFP est cultivée dans un milieu contenant les
suppléments désirés (Tableau 3) et du raffinose comme seule source de carbone, la transcription du gène de
fusion GAL10-FUR4-GFP n’est pas induite. Après un temps de culture déterminé (7h dans l’exemple donné ici),
les cellules sont transférées dans un milieu équivalent (i. e. contenant les mêmes suppléments) dans lequel du
galactose est substitué au raffinose. Le promoteur GAL10 est alors induit, permettant l’expression de la protéine
de fusion Fur4p-GFP, qui peut être visualisée par microscopie confocale.
98

Afin d’étudier l’influence du contenu lipidique cellulaire sur l’adressage des protéines
membranaires, notre choix s’est donc porté sur la protéine modèle, Fur4p, dont la biogénèse
(adressage, temps de résidence à la membrane plasmique, internalisation par endocytose,
dégradation…) a été largement étudiée (Volland et al., 1994a; Garnier C, 1996; Dupre and
Haguenauer-Tsapis, 2003; Hearn et al., 2003a; Blondel et al., 2004a). Pour pouvoir suivre la
localisation de cette protéine dans la levure selon l’environnement lipidique, nous nous
sommes servis d’une version de Fur4p étiquetée à la GFP en C-Terminal. Cette protéine de
fusion présente une activité identique à la protéine Fur4p non étiquetée (Dupre and
Haguenauer-Tsapis, 2001b). En outre, cet ensemble est sous le contrôle du promoteur
inductible GAL10. Un promoteur inductible est un promoteur qui est activé uniquement dans
certaines conditions physiologiques, par exemple suite à un choc thermique ou encore en
présence d’un composé spécifique. Dans notre cas, il s’agit du galactose. Ainsi, il nous est
possible d’induire la synthèse de la protéine de fusion Fur4p-GFP en remplaçant simplement
dans le milieu de culture le glucose, ou un autre sucre comme le raffinose, par du galactose
(Figure 16). Cette construction est portée par un plasmide, pFL38F-GFP, grâcieusement
donné par le Docteur Haguenauer-Tsapis (Dupre and Haguenauer-Tsapis, 2001b), et dont les
caractéristiques sont décrites dans la partie Matériels et Méthodes.
Il a également fallu nous rendre capable de provoquer chez la levure Saccharomyces
cerevisiae, notre organisme modèle, des perturbations significatives de l’homéostasie
lipidique. Pour ce faire, nous nous sommes appuyés, comme déjà évoqué dans l’introduction
(Introduction, V] A]), sur son incapacité, en absence d’oxygène, à synthétiser son stérol
majoritaire, l’ergostérol, ainsi que les acides gras insaturés (AGIs) tels que l’oléate (C18 :1) et
le palmitoléate (C16 :1). Il apparaissait ainsi possible de carencer les cellules en ces deux
types de molécules ou, spécifiquement, soit en ergostérol, soit en acides gras insaturés, en
additionnant dans le milieu de culture de l’oléate ou de l’ergostérol, respectivement.
Néanmoins, une anaérobiose stricte étant difficile à mettre en œuvre en laboratoire de façon
contrôlée, nous avons eu recours à une astuce génétique afin de contourner ce problème.
L’hème est un cofacteur du cytochrome P450, enzyme impliqué dans un certain nombre
d’étapes de la voie de biosynthèse de l’ergostérol ainsi que dans le processus assurant la
désaturation des acides gras (Introduction, V] A]). Ainsi, une carence en hème produit le
même résultat qu’une anaérobiose stricte en ce qui concerne le contenu lipidique cellulaire, à
savoir une carence en ergostérol et en acides gras insaturés (Ferreira T, 2004). Dans une
souche de levure sauvage, le gène HEM1, codant pour la protéine Hem1p, catalyse la synthèse
du δ-aminolevulinate (ALA), un intermédiaire de la voie de biosynthèse de l’hème. Notre
99

système consiste à utiliser une souche de levure délétée au niveau du gène HEM1, nommée
hem1Δ, incapable de synthétiser du ALA et, par voie de conséquence de l’hème, et ceci même
en présence d’O2 dans le milieu. La synthèse de l’hème dans une telle souche, peut être
restaurée par simple addition de ALA dans le milieu (Figure 17).
Afin de suivre la protéine Fur4p-GFP dans de telles conditions, la souche hem1∆α a
été transformée par le plasmide pFL38F-GFP, comme décrit dans le chapitre Matériels et
Méthodes, pour obtenir la souche hem1∆ [FUR4-GFP].
Concrètement, lors des précultures en aérobiose (milieu contenant du ALA) et lors de
la mise en place de la carence lipidique, les cellules se trouvent dans un milieu possédant
comme source de carbone du raffinose (YPRaff) ; puis les cellules sont ensuite transférées
dans un milieu dans lequel le galactose a été substitué au raffinose (YPGal), pour induction de
la protéine de fusion Fur4p-GFP, permettant ainsi d’observer sa localisation. Dans ces
milieux, nous faisons varier la composition lipidique en ajoutant différents éléments dans la
culture. Nous nous réfèrerons pour la condition où rien n’est ajouté dans le milieu à la
dénomination « double carence lipidique » (i. e., carence en AGIs et en ergostérol).
Alternativement, de l’ergostérol ou de l’oléate peuvent être additionnés au milieu YPGal pour
générer une simple carence en AGIs ou ergostérol, respectivement.
Les milieux principaux utilisés dans cette étude sont répertoriés dans le Tableau 3.
100

Hem1p
Hem1p
O 2
ALA
ALA
hème
hème
Aérobiose
Aérobiose
Souche sauvage Souche hem1Δ
Hem1p
Hem1p
Sans Sans O O 2
Figure 17: Le système hem1Δ
ALA
ALA
pas pas d’hème
d’hème
Anaérobiose
Anaérobiose
Hem1p
Hem1p
O 2
pas pas ALA
ALA
Pas Pas d’hème
d’hème
« Anaérobiose Anaérobiose »
Hem1p
Hem1p
O 2
ALA
ALA
hème
hème
Aérobiose
Aérobiose
101
ALA
ALA
exogène
exogène
Une souche délétée pour le gène HEM1 ne peut pas synthétiser l’hème, nécessaire pour la désaturation des
acides gras et la synthèse de l’ergostérol, mimant ainsi l’anaérobiose. Nous ferons référence à ces conditions à
l’appellation : « double carence lipidique ». Si du δ-aminolevulinate (ALA) est rajouté dans le milieu, la
synthèse de l’hème est restaurée.
Nom du milieu Carence en Induction de Fur4p-GFP Nom générique
YP Raff + ALA 0 - Aérobiose
YP Raff Ergostérol et acides gras insaturés - Double carence
YP Gal + ALA 0 + Aérobiose
YP Gal Ergostérol et acides gras insaturés + Double carence
YP Gal + Oléate (Ole) Ergostérol +
YP Gal + Ergostérol (Erg) Acides gras insaturés +
YP Gal + Ergostérol (Erg)
+ Oléate (Ole)
0 +
Tableau 3 : Principaux milieux de culture utilisés dans cette étude

102

Résumé de la première publication :
A lipid-mediated quality control process in the Golgi apparatus in
yeast
Molecular Biology of the Cell, Mars 2008; Numéro 19, Volume 3: pages 807-21.
Pineau Ludovic, Bonifait Laetitia, Berjeaud Jean Marc, Alimardani-Theuil Parissa,
Bergès Thierry et Ferreira Thierry
Nous allons faire, dans ce chapitre, référence à des figures provenant de la première
publication issue de ce travail. Elles seront désignées sous l’appellation Fig p1, suivi du
numéro correspondant à la figure en question dans le manuscrit.
Les carences en ergostérol et en acides gras insaturés induisent la prise en charge
de Fur4p par le contrôle qualité de l’appareil de Golgi
Le premier résultat inattendu que nous avons obtenu lors de cette étude est que les
carences en ergostérol ou en acides gras insaturés (AGIs) provoquent chacune, comme la
double carence, un défaut d’adressage de la protéine à sa destination finale, la membrane
plasmique, traduisant la prise en charge de Fur4p-GFP par un système de contrôle qualité
dans la voie de sécrétion. Ce phénomène se traduit par une absence totale de détection de
Fur4p-GFP à la surface cellulaire (Figure p1-2 (double carence) et Figure p1-5 (carences
individuelles)). Le système en question présente toutes les caractéristiques du contrôle qualité
de l’appareil de Golgi (CQG ; voir paragraphe Introduction, chapitre II] B] 2] b)). En effet,
nous avons pu montrer que dans chacune de ces conditions, Fur4p-GFP était directement
adressée vers la vacuole pour dégradation (Figure p1-3 (double carence) et Figure p1-5
(carences individuelles)), sans passage préalable par la membrane plasmique, comme en
atteste l’absence d’accumulation du signal Fur4p-GFP à la périphérie cellulaire en carence
lipidique, lorsque la protéine de fusion est exprimée dans une souche affectée dans
l’endocytose (souche hem1Δ, end3Δ dans ces différentes figures). De plus, la dégradation de
Fur4p-GFP est inhibée dans une souche hem1Δ, sec7 ts dans laquelle la perméase s’accumule
dans l’appareil de Golgi, alors qu’elle ne l’est pas lorsque Fur4p-GFP est exprimée dans la
souche hem1Δ, end3Δ (Figure p1-3 pour la double carence). Ceci démontre que l’adressage de
103

Fur4p-GFP vers la vacuole en double carence lipidique se produit à la sortie de l’appareil de
Golgi et effectivement avant son arrivée à la membrane plasmique.
Enfin, nous avons pu également montrer que l’internalisation de Fur4p-GFP dans le
lumen de la vacuole dépendait de l’ubiquitine ligase Rsp5p. En effet, la perméase s’accumule
dans la membrane vacuolaire à température non-permissive dans le mutant thermosensible
hem1Δ, rsp5 ts (Figure p1-3 (double carence) et Figure p1-5 (carences individuelles)). Comme
nous l’avons déjà évoqué (voir Introduction, chapitre II] B] 2] b)) l’adressage d’une protéine
membranaire dans le lumen de la vacuole nécessite qu’au niveau des endosomes tardifs, la
protéine soit adressée vers les membranes internes qui résultent de l’invagination des
membranes endosomales, pour donner naissance à des structures appelées Multi-Vesicular
Body (MVB (Piper and Luzio, 2001)). Or, il a déjà été montré que l’ubiquitination par Rsp5p
est un signal essentiel pour cette étape d’adressage vers les membranes internes (Morvan et
al., 2004b). L’ensemble de nos résultats montre donc que Rsp5p n’est pas impliquée dans la
reconnaissance de Fur4p-GFP par le CQG en carence lipidique à la sortie de l’appareil de
Golgi, mais jouerait un rôle dans une étape plus tardive de la voie endosomale.
Un paramètre de contrôle possible à la sortie de l’appareil de Golgi : le stress de
courbure
Une question majeure que nous avons formulée à la suite de ces observations était la
suivante : comment les carences en ergostérol et en AGIs, qui ont des impacts très différents
sur la composition lipidique cellulaire, peuvent-elles entraîner des conséquences similaires sur
la biogenèse de Fur4p-GFP ? L’hypothèse la plus raisonnable est que ces deux carences
influencent de la même façon un paramètre biophysique des membranes biologiques.
Les propriétés biophysiques des bicouches lipidiques incluent : i) la fluidité, ii) la
formation de domaines de composition particulière, comme les domaines rafts, iii) l’épaisseur
et iv) le stress de courbure, chacun de ces paramètres pouvant à priori influencer le repliement
des protéines intégrées ( Introduction, chapitre III ] A] ; pour revues, voir (Lee, 2003a; Lee,
2004c)).
L’implication de la fluidité a été écartée car la carence en ergostérol et l’accumulation
d’acides gras saturés en réponse à l’absence d’AGIs provoquent théoriquement des effets
opposés sur ce paramètre. Par contre, en nous basant sur la bibliographie récente, il était
raisonnable d’imaginer que les carences en ergostérol et en AGIs puissent perturber la
formation des domaines rafts, avec pour conséquence l’exclusion de Fur4p-GFP de ces
104

domaines. Ce phénomène aurait pu rendre compte, comme déjà proposé pour Tat2p et Pma1p
(voir Introduction, chapitre II] B] 2] b)), de la prise en charge de Fur4p-GFP par le contrôle
qualité du Golgi. Cependant, nous avons pu montrer que ni la carence en ergostérol, ni la
carence en AGIs n’entraînent l’exclusion de Fur4p des domaines rafts (voir Résultats
complémentaires de la première publication, Figure 20).
Une analyse fine du contenu phospholipidique par spectrométrie de masse en carence
en AGIs a révélé, en plus d’une augmentation générale du degré de saturation des chaînes
d’acides gras dans les phospholipides à laquelle nous nous attendions, l’apparition d’acides
gras à courtes chaînes carbonées au sein des différentes espèces phospholipidiques (Figure
p1-6 et p1-7). La conséquence de ce phénomène est l’accumulation de phospholipides saturés
à chaînes courtes au détriment de formes diinsaturées à chaînes plus longues. Dans une série
d’expériences complémentaires, nous avons pu montrer que la longueur des chaînes
carbonées ne constituait pas un paramètre déterminant pour l’adressage de Fur4p-GFP jusqu’à
la membrane plasmique, mais que c’était le taux d’insaturation, et plus particulièrement la
proportion d’espèces phospholipidiques diinsaturées, qui régulait l’adressage de la perméase à
sa destination finale. Ces observations nous ont amenés à conclure que l’épaisseur de la
bicouche (déterminée par la longueur des chaînes d’acides gras des phospholipidides) n’était
pas déterminante pour la biogenèse de Fur4p-GFP.
La totalité de nos résultats peut être expliquée si l’on considère un paramètre
biophysique particulier des membranes, que nous avons déjà évoqué, le stress de courbure
(curvature stress ; Introduction, chapitre III] A] ; pour revue, voir (van den Brink-van der
Laan et al., 2004b)).
Certains phospholipides comme la phosphatidyl choline (PC) présentent une forme
cylindrique, en particulier quand ils sont estérifiés par des chaînes d’acides gras saturées, et
tendent en conséquence à s’organiser en bicouches. Comme nous l’avons déjà évoqué,
d’autres phospholipides, comme la phosphatidyléthanolamine (PE), ont une forme conique
(lipides de type II) et tendent à former des phases non-lamellaires avec une courbure négative,
comme les phases hexagonales (HII). Lorsqu’ils sont présents dans les bicouches
phospholipidiques, les lipides de type II génèrent des contraintes mécaniques sur la bicouche
(ce qui a été qualifié de stress de courbure) en augmentant en particulier la pression latérale
dans la région des chaînes d’acides gras (voir Introduction, chapitre III] A]). Il a été proposé
que cette pression latérale, en s’exerçant sur les hélices transmembranaires des protéines
intégrées, pourrait favoriser l’obtention de leur structure tridimensionnelle active (Booth,
2003; Lee, 2003a; van den Brink-van der Laan et al., 2004b). L’implication de PE dans le
105

epliement de plusieurs protéines membranaires, dont la perméase au lactose d’E. coli, a
d’ailleurs été clairement démontrée (pour revue, voir (Schneiter and Toulmay, 2007)).
Il a été montré sur des membranes artificielles que la concentration relative de
cholestérol et le niveau d’insaturation des phospholipides, et plus spécifiquement de PC,
influençaient également le stress de courbure en régulant la propension des mélanges
PC/cholestérol à former des phases hexagonales (Chen and Rand, 1997; Epand et al., 2003;
Epand et al., 2005). Ces études sont particulièrement intéressantes dans notre cas. En effet,
Epand et al. (Epand et al., 2003) ont montré que le cholestérol augmentait la courbure
négative de membranes constituées de PC diinsaturée pure (DOPC : dioléyl PC), mais que cet
effet ne se produisait pas si la DOPC était substituée par une forme monoinsaturée de PC
(SOPC : 1-stéaroyl-2-oléyl PC). Par analogie, on peut donc raisonnablement postuler que
dans nos conditions d’absence d’ergostérol ou de diminution de la quantité de formes
diinsaturées de PC en réponse à la carence en AGIs (Figure p1-6 et p1-7), le stress de
courbure serait diminué dans chaque cas.
Afin de tester plus avant l’implication potentielle du stress de courbure dans la
biogenèse de Fur4p-GFP, nous avons également évalué cette biogenèse dans une souche
incapable de synthétiser de la PE. Nous avons pu montrer que dans une telle souche, Fur4p-
GFP n’était pas délivrée à la membrane plasmique, mais s’accumulait dans des structures
intracellulaires (Figure p1-11). De plus, en substituant PE par de la phosphatidyl
propanolamine, un phospholipide artificiel capable de former des phases hexagonales avec
des efficacités équivalentes à PE, l’adressage de Fur4p-GFP à la surface cellulaire était
partiellement restauré (Figure p1-11).
106

Première publication
107

108

Molecular Biology of the Cell
Vol. 19, 807–821, March 2008
A Lipid-mediated Quality Control Process in the Golgi
Apparatus in Yeast
Ludovic Pineau,* Laetitia Bonifait, † Jean-Marc Berjeaud, †
Parissa Alimardani-Theuil, ‡ Thierry Bergès,* and Thierry Ferreira*
*Université de Poitiers, Centre National de la Recherche Scientifique, Unité Mixte de Recherche 6161
“Transport des assimilats” and † Université de Poitiers, Centre National de la Recherche Scientifique, Unité
Mixte de Recherche 6008 “Microbiologie fondamentale et appliquée,” 86022 Poitiers Cedex, France
Submitted June 22, 2007; Revised November 6, 2007; Accepted December 10, 2007
Monitoring Editor: Sean Munro
When heme biosynthesis is disrupted, the yeast Saccharomyces cerevisiae becomes unable to synthesize its major sterol,
ergosterol, and desaturate fatty acids. We took advantage of this physiological peculiarity to evaluate the consequences
of ergosterol and/or unsaturated fatty acid (UFA) depletions on the biogenesis of a model polytopic plasma membrane
protein, the uracil permease Fur4p. We show that under UFA shortage, which results in low amounts of diunsaturated
phospholipid species, and under ergosterol depletion, Fur4p is prematurely routed from the Golgi apparatus to the
vacuolar lumen in a process that requires the ubiquitin ligase Rsp5p. Interestingly, this diversion is not correlated to
Fur4p exclusion from detergent-resistant membranes. In an independent set of experiments, we show that Fur4p targeting
to the plasma membrane depends on phosphatidylethanolamine amounts and more specifically on the propensity of this
phospholipid to form a hexagonal phase. In light of recent literature, we propose a model in which ergosterol and
diunsaturated phospholipid species maintain optimal membrane curvature for Fur4p to evade the Golgi quality control
process and to be properly delivered to its normal destination.
INTRODUCTION
Because they are embedded in the membrane, polytopic
plasma membrane proteins are highly sensitive to the composition
of the lipid bilayer. Among cellular membranes, the
plasma membrane displays a unique composition because,
in addition to phospholipids, it contains two other classes of
lipids to relatively high amounts, namely, sterols and sphingolipids
(Hoekstra and van IJzendoorn, 2000). It has been
proposed that this complex composition may result in lateral
heterogeneity of the bilayer, a parameter that could influence
the function and/or the biogenesis of membrane-anchored
proteins. To give specificity to this broad concept, the
existence of microdomains of specific composition has been
suggested, among which “lipid rafts” have been the most
popular (Jacobson et al., 2007). Lipid rafts are defined as
sterol/sphingolipid enriched domains (Brown and London,
2000), and they display unique biophysical properties. They
are thought to be formed by packing of the long saturated
acyl chains of sphingolipids with cholesterol and to exist in
a liquid-ordered (Lo) phase that can segregate from the bulk
liquid-disordered (Ld) phase (for reviews, see Brown and
This article was published online ahead of print in MBC in Press
(http://www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc.E07–06–0600)
on December 19, 2007.
‡ Present address: Université de Reims, Faculté des Sciences, “Laboratoire
de microbiologie générale et moléculaire,” Moulin de la
Housse, BP 1039, 51687 Reims Cedex 2, France.
Address correspondence to: Thierry Ferreira (thierry.ferreira@univpoitiers.fr).
Abbreviations used: ALA, -aminolevulinate; DRM, detergent-resistant
membrane; UFA, unsaturated fatty acids.
London, 2000; London, 2005). This tight ordering of the
saturated fatty acyl chains results in a relative resistance to
detergent solubilization, hence their designation as detergent-resistant
membrane fractions (DRMs).
In yeast, lipid rafts are proposed to assemble in the endoplasmic
reticulum (ER) where they may serve as sorting
platforms for several polytopic proteins destined for the cell
surface (Bagnat et al., 2000). These include the plasma membrane
ATPase Pma1p (Bagnat et al., 2000), the uracil permease
Fur4p (Hearn et al., 2003), and three amino acid
permeases: the general amino acid permease Gap1p (Lauwers
and Andre, 2006), the tryptophane permease Tat2p
(Umebayashi and Nakano, 2003), and the arginine permease
Can1p (Malinska et al., 2003). Not surprisingly, affecting the
composition of DRMs by depleting the cell of sterol and/or
sphingolipids profoundly alters the biogenesis of raft-associated
proteins (for review, see Helms and Zurzolo, 2004),
albeit in different ways. The most common method to study
the effects of raft disruption is to express the protein of
interest in mutant strains altered in sphingolipid or ergosterol
biosyntheses.
Interestingly, ergosterol depletion induces quite different
behaviors depending on the protein studied. Indeed, when
expressed in erg6 and erg13 cells, the tryptophan permease
Tat2p is addressed to the endosomal pathway for
vacuolar degradation, in a process that requires prior ubiquitylation
by the Rsp5p–Bul1p complex. Under these conditions,
Tat2p displays a loose association to DRMs (Umebayashi
and Nakano, 2003). In contrast, the arginine permease
Can1p is retained in the endoplasmic reticulum in an erg24
mutant and in unidentified intracellular compartments in an
erg6 strain (Malinska et al., 2003), whereas Pma1p seems to
be highly tolerant to ergosterol scarcity, because it is normally
targeted to the plasma membrane in strains blocked at
© 2008 by The American Society for Cell Biology 807

L. Pineau et al.
Table 1. Yeast strains
Strains Characteristics Source
Y10000 MATa his3 leu2 met15 ura3 Euroscarf
hem1 a MATa his3 leu2 trp1 ura3 hem1::LEU2 Ferreira et al. (2004)
hem1 MAT his3 leu2 trp1 ura3 hem1::LEU2 Ferreira et al. (2004)
hem1 end3 MAT his3 leu2 ura3 hem1::LEU2 YNL084c::kanMX4 This study, progeny of Y12992 (Euroscarf) x hem1 a
hem1 rsp5-19ts MAT his3 leu2 ura3 lys2 trp1 hem1::LEU2
rsp5::HA-rsp5–19ts This study, progeny of rsp5-19ts MAT (Kaliszewski
et al., 2006) x hem1 a
hem1 sec7-1ts MAT ura3 lys2 trp1 sec7–1 hem1::LEU2 This study, progeny of sec7-1ts (Emr et al., 1984) x
hem1 a
RY200T MAT ura3-52 leu2-3, 112 his3-200 trp1-D901
lys2-801 suc2-D9, GAL, psd1::TRP1 psd2::HIS3
dpl1:: KANR
Robl et al. (2001)
different levels of the ergosterol biosynthetic pathway
(Gaigg et al., 2005).
A similar discrepancy between membrane proteins is observed
under sphingolipid depletion induced in thermosensitive
mutant lcb1-100. Lcb1p is required for serine palmitoyltransferase
activity, essential for the first step in the
synthesis of ceramide and sphingolipids (Buede et al., 1991).
When expressed in lcb1-100 cells, Pma1p loosens its association
to DRMs and falls prey to a Golgi-based quality control
mechanism to undergo vacuolar degradation (Bagnat et al.,
2001). This may be due to the fact that Pma1p enters DRMs
in an oligomeric form and that loss of sphingolipids in the
lcb1-100 strain compromises oligomer formation (Bagnat et
al., 2001; Lee et al., 2002). Similarly, Can1p has been reported
to be degraded in the vacuole in the lcb1-100 mutant,
whereas Fur4p only displays a delay in ER-to-plasma membrane
targeting when expressed in this same mutant (Dupre
and Haguenauer-Tsapis, 2003).
Recent work has also highlighted the role of fluid-phase
components of the lipid bilayer, i.e., phospholipids, on the
biogenesis of plasma membrane proteins. Indeed, Opekarova
et al. (2005) reported that depleting the cells of phosphatidylethanolamine
(PE) results in Can1p retention in the
Golgi complex and of Pma1p in ER-derived structures. The
authors suggested that the difference in Can1p and Pma1p
behavior could be related to distinct immediate lipid surroundings
of these two proteins, the so-called annular lipids
(Lee, 2003).
Even if lipid raft formation in cells remains controversial
(Munro, 2003; Valdez-Taubas and Pelham, 2003; London
2005; Jacobson et al., 2007), together, these studies clearly
show that the biogenesis of integral proteins is intimately
related to the composition and therefore the biophysical
properties of membranes.
This is of particular significance given that cells often have
to adjust their cellular lipid content in response to environmental
changes. As an example, the yeast Saccharomyces
cerevisiae, as a facultative anaerobe, can grow under low
oxygen, provided that the medium is supplemented with
ergosterol and an exogenous source of unsaturated fatty
acids (UFAs). Indeed, several enzymes of the ergosterol
pathway and Ole1p, the fatty acid desaturase, require heme
as their prosthetic group, the synthesis of which is oxygen
dependent (for review, see Daum et al., 1998). This implies
significant readjustments of lipid homeostasis (Ferreira et al.,
2004).
In the present study, we took advantage of this property
to evaluate the relative consequences of ergosterol and/or
UFA depletion on the biogenesis of a model polytopic
plasma membrane protein, the uracil permease Fur4p.
808
MATERIALS AND METHODS
Strains, Plasmids, and Culture Conditions
The S. cerevisiae strains used in this study are listed in Table 1. Cells bearing
the hem1 mutation were grown aerobically at 28°C in 1% yeast extract
(wt/vol), 1% peptone (wt/vol), and 2% raffinose (wt/vol) (YPRaff) medium
supplemented with 80 g ml1-aminolevulinate (ALA, aerobic-like conditions).
Heme-induced lipid starved conditions (lipid depletion) were obtained
by cultivating the cells in YPRaff medium without supplementation. Alternatively,
YPRaff medium was supplemented with 80 g ml1ergosterol and/or
1% Tween 80 (vol/vol), used as the source of oleic acid. Where indicated,
Tween 80 was replaced by myristoleic (C14:1), palmitoleic (C16:1), or oleic
acid (C18:1) at a final concentration of 2 mM (Sigma, St. Louis, MO).
PE starvation conditions were obtained as described previously (Opekarova
et al., 2002; Opekarova et al., 2005). RY200T cells were cultivated on
YPRaff medium ethanolamine 2 mM and transferred to 1% yeast extract
(wt/vol), 1% peptone (wt/vol), and 4% galactose (wt/vol) (YPGal) medium
supplemented with ethanolamine, choline, or propanolamine at different
concentrations for 16 h.
For Fur4p biogenesis studies, because the concentration of endogenous
permease is too low to allow detection, and to specifically track the fate of
newly synthesized permease under the different conditions, cells were transformed
with the centromeric plasmid pFl38gF-green fluorescent protein
(GFP), carrying a FUR4 fusion gene, encoding Fur4p with a C-terminal GFP
tag under the control of the inducible GAL10 promoter (Marchal et al., 2002).
Fur4p-GFP synthesis was induced by adding galactose to a final concentration
of 4% (wt/vol).
For Pma1p immunolocalization studies, a hemagglutinin (HA)-tagged version
of PMA1 was placed under control of a heat-shock promoter in the
integrative plasmid YIplac204 (TRP1; Yiplac204-2HSEpr-HA-PMA1; Ferreira
et al., 2002). As desired, expression of the tagged PMA1 gene was induced by
incubation of the cells for 15 min at 39°C (Ferreira et al., 2002).
Lipid Analysis and Mass Spectrometry
Lipid extracts were prepared from 2 10 9 (sterols), 2 10 8 (total fatty
acids), or 10 8 (phospholipids) yeast cells, grown as indicated. Cells were
harvested, washed with distilled water, suspended in 1 ml of cold water, and
shock-frozen. They were broken by vigorous shaking with 500 l of glass
beads (diameter 0.3–0.4 mm; Sigma) by using a mini-beadbeater (Biospec
Products, Bartlesville, OK) for 1 min at 5000 revolutions/min. Cellular lipids
were extracted using chloroform:methanol (2:1, vol/vol) as described by
Folch et al. (1957). The final organic phase was evaporated and lipids were
dissolved either in 100 l of hexane (sterols and total fatty acids) or 200 l of
chloroform:methanol:H 2O (16:16:5, vol/vol/vol) (phospholipids).
Fatty acid methyl esters from total fatty acids were obtained as described by
Ferreira et al. (2004). Briefly, lipids extracted from cells were submitted to a
transesterification step, carried out by heating the samples at 50°C for 16 h in
2% (vol/vol) H 2SO 4 in dry methanol. The resulting fatty acid methyl esters
were extracted with hexane and analyzed by gas chromatography by using a
25 m 0.32 mm AT-1 capillary column (Alltech Associates, Deerfield, IL),
with heptadecanoicmethyl ester as standard.
PE levels were determined exactly as described previously (Ferreira et al.,
2004). After resolution on a precoated LK5 silica gel plate (Whatmann, Maidstone,
United Kingdom) by using chloroform:ethanol:water:triethylamine (30:
35:7:35, vol/vol/vol/vol) as the mobile phase, the various phospholipids
species were visualized under UV by using a primuline solution. PE spots
were scrapped from the plate before a transesterification step, as described
above. PE amounts are expressed as nanomoles of fatty acids (FA) per 10 9
cells.
For specific sterol identification and quantification, total lipid extracts were
subjected to saponification as reported previously (Ferreira et al., 2004). The
Molecular Biology of the Cell

different sterol species were then separated by gas chromatography on the
column described above, and identified by means of their retention times
relative to cholesterol, used as a standard. The results are expressed as
micrograms of sterol per 10 9 cells.
For analyses by mass spectrometry (MS), total lipid extracts were reconstituted
at a concentration of 50 g ml 1 of phospholipids in chloroform:
methanol:H 2O (16:16:5, vol/vol/vol), with 1% (vol/vol) formic acid or diethylamine
for analysis in the positive and negative ion modes, respectively. For
routine single-stage MS, samples were analyzed with a triple quadrupole
instrument model API 165 (PerkinElmerSciex Instruments, Boston, MA)
equipped with an ion-spray source. Analysis of spectra was performed using
the Biomultivew 1.2 software (PerkinElmerSciex Instruments), and raw identification
of phospholipid species was done based on their expected m/z by
means of a homemade software program. The various species were unambiguously
identified by tandem MS with a Deca XP Max equipped with an ion
trap source (Thermo Electron, Waltham, MA) by precursor ion scan analysis,
as described previously (Schneiter et al., 1999). Specifically, the molecular
profile of phosphatidylcholine (PC) species was obtained by scanning for the
positive ion precursors of m/z 184, specific for choline phosphate. The molecular
profile of inositol-containing lipids (i.e., phosphatidylinositol [PI] and
inositol phosphoceramide [IPC]) was obtained by scanning for the negative
ion precursors of m/z 241, specific for the dehydration product of inositol
phosphate (Schneiter et al., 1999).
Isolation of Detergent-resistant Membranes
DRMs were isolated largely as described previously (Lauwers and Andre,
2006). Yeast cells (10 8 ) were lysed by vigorous shaking with 100 l of glass
beads (diameter 0.3–0.4 mm; Sigma) by using a mini-beadbeater (Biospec
Products) for 1 min at 5000 revolutions/min in TNE buffer (50 mM Tris-HCl,
pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, and 25 mM N-ethylmaleimide), supplemented
with a cocktail of protease inhibitors (Sigma). The lysate (125 l) was
incubated with 1% Triton X-100 for 30 min on ice and adjusted to 40%
iodixanol by adding 250 l of OptiPrep (Axis-Shield, Oslo, Norway) before
loading at the bottom of a two-step gradient (600 l of 30% iodixanol in TXNE
[50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, and 1% Triton X-100],
100 l of TXNE). The gradient was centrifuged for 2hat200,000 g in a
TLA100-2 rotor (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Six fractions of 175 l were
collected from the top of the gradient, and the proteins were precipitated by
incubation with 10% trichloroacetic acid (TCA) for 30 min on ice. The precipitate
was dissolved in a mix of 12.5 l of 1 M Tris base and 12.5 l of Laemmli
buffer supplemented with 2% -mercaptoethanol. Samples were heated at
37°C for 15 min, and then they were subjected to electrophoresis and analyzed
by Western blot as described below. Signals were quantified using Scion
Image (Scion, Frederick, MD).
Invertase Secretion Assays
The invertase secretion assays were performed according to the method
described by Munn et al. (1999). Yeast cells were grown as indicated to an
OD600 of 0.2–0.5 in selective medium containing 2% glucose. After washing,
10 OD600 units of cells were induced for invertase expression by resuspension
in selective medium containing 0.05% glucose and 2% sucrose. Cell samples
were taken after 0, 15, 30, 45, and 60 min after transfer to low glucose medium.
Invertase activity was determined as described by Munn et al. (1999), by using
an enzyme reporter assay. Intracellular invertase activity was calculated by
deducting extracellular activity, measured from unbroken cells, from total
invertase, determined after prior permeabilization of the cells by freezing in
liquid nitrogen in the presence of 10% Triton X-100.
Total Protein Extracts and Immunoblotting
Total protein extracts were prepared as described by Volland et al. (1994).
Logarithmic phase cells (0.5 OD) were suspended in 500 l of water, broken
by the addition of 50 l 1.85 M NaOH; 3.5% (vol/vol) -mercaptoethanol and
proteins were precipitated by the addition of 50 l of 50% (wt/vol) trichloroacetic
acid. The resulting pellets were resuspended in 10 l of 1 M Trizma
base and 20 l of Laemmli loading buffer, resolved on 10% polyacrylamide
gels (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis [PAGE]), and transferred to a
nitrocellulose membrane for Western blot analysis. Fur4p-GFP was visualized
by immunoblotting with an anti-GFP monoclonal antibody (Roche Diagnostics,
Mannheim, Germany), diluted 1/1000, and enhanced chemiluminescence
(ECL) detection. For quantification of Fur4p-GFP in the OptiPrep gradient
fractions (see above), TCA-precipitated proteins were assayed in the same
manner, but using an anti-GFP polyclonal antibody diluted 1/2000 before
ECL detection; Pma1p was detected in these fractions by means of a polyclonal
antibody (provided by Dr. C. W. Slayman, Yale University School of
Medicine, New Haven, CT) diluted 1/2000.
Fluorescence Microscopy
HA-tagged Pma1p was visualized by immunofluorescence essentially as described
previously (Ferreira et al., 2002). The primary antibodies used were
HA.11 monoclonal 16B12 from raw ascites fluid (BAbCO, Richmond, CA,
University of California at Berkeley, CA), diluted 1:150; and Kar2p polyclonal
Lipid-mediated Quality Control in Yeast
antibody (provided by R. Schekman, University of California at Berkeley, CA),
diluted 1:2500. Goat anti-rabbit fluorescein isothiocyanate (FITC) and goat antimouse
Texas Red IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)
served as fluorescent secondary antibodies and were diluted 1:100.
For staining with N-[3-triethylammoniumpropyl]-4-[p-diethylaminophenylhexatrienyl]
pyridinium dibromide (FM4-64), 10 7 cells were incubated for
10 min at 4°C in 500 l ofa10M FM4-64 solution in water. After washing
to remove remaining soluble unbound stain, cells were incubated at 28°C for
various times to visualize the plasma membrane, endosomes, and/or the
vacuolar membrane.
Cells were observed on a Fluoview FV1000 confocal microscope (Olympus,
Tokyo, Japan) by using dual-channel filters for simultaneous visualization of
GFP signal (associated to the Fur4p–GFP fusion protein) and FM4-64, or FITC
and Texas Red fluorescence. All images were taken with a 63 1.4 numerical
aperture Plan-Apochromat III DIC objective (Olympus). In time course experiments,
or for direct comparison of GFP fluorescence after growth under
different culture conditions, the exact same settings were used throughout the
experiment to obtain a semiquantitative signal. Images were collected with
FV10-ASW software (Olympus) and modified by contrast stretching, by using
Adobe Photoshop 9.0 (Adobe Systems, San Jose, CA).
RESULTS
Under Sterol and UFA Depletion, Fur4p Falls Prey to a
Golgi-based Quality Control Process
Under anaerobiosis, yeast cells are unable to synthesize
UFAs, and their major sterol, ergosterol. Because anaerobiosis
is difficult to achieve under standard laboratory conditions,
we used a knockout mutant of ALA synthase (hem1)
as an experimental model (Verdiere et al., 1991). Such a
strain can grow under standard oxygenated conditions, provided
that the medium is supplemented with ALA (aerobiclike
conditions). When transferred from aerobic-like conditions
to unsupplemented YPD medium, hem1 cells display
growth arrest as early as 5 h after the shift (Figure 1A;
Ferreira et al., 2004). This arrest is related to dramatic
changes in the cellular sterol and fatty acid patterns, compared
with cells grown under aerobic-like conditions (Figure
1, B and C). As expected, ergosterol amounts decrease
under these conditions (2-fold decrease compared with
hem1 cells grown under aerobic-like conditions) and saturated
fatty acids (myristic [C14:0], palmitic [C16:0] and
stearic [C18:0] acids) accumulate at the expense of unsaturated
forms (palmitoleic [C16:1] and oleic [C18:1] acids). This
results in a drop of the fraction of UFA in cellular lipids
(unsaturation ratio, Figure 1D) from 64.6 1.7% to 47.7
2.4%. After 7 h under the same conditions, these tendencies
are amplified: ergosterol displays a fourfold decrease compared
with aerobiosis and the unsaturation ratio falls down
to 38.2 1.6%. However, at this time point, hem1 cells can
still be recuperated if ergosterol and oleic acid are added to
the medium, which results in the restoration of a fatty acid
unsaturation ratio and of ergosterol amounts similar to those
observed for cells grown under aerobic-like conditions (see
below). This shows that, among the various cellular consequences
related to heme depletion, ergosterol and UFA starvation
are the most detrimental for growth. For clarity in the
text, hem1 cells grown in unsupplemented YPD medium
will be referred to as “lipid-depleted.”
We then evaluated the impact of heme-induced lipid depletion
on the biogenesis of our model plasma membrane
protein, the uracil permease Fur4p. To track the fate of
newly synthesized Fur4p, we used a fully functional GFPtagged
version of the permease under the control of the
inducible GAL10 promoter (Marchal et al., 2002). hem1 cells
were cultivated for 5 h (Figure 2A) or 7 h (Figure 2B) under
aerobic-like conditions or under lipid depletion before galactose
addition. After 5 h, fluorescence was detected at the
plasma membrane as early as 60 min after supplementation
of galactose to either growth conditions, and the overall
Vol. 19, March 2008 809

L. Pineau et al.
fluorescence distribution was undistinguishable regardless
of the lipid status of the cells throughout the entire experiment
(Figure 2A). In contrast, when Fur4p-GFP synthesis
was induced after 7 h of growth under lipid depletion,
plasma membrane fluorescence could hardly be detected,
even 120 min after galactose addition (Figure 2B), in contrast
to aerobic-like conditions. In this case, fluorescence showed
A
5 h
Lipid-depleted
Aerobic-like
B
7 h
Lipid-depleted
Aerobic-like
810
30’ 60’ 90’ 120’
30’ 60’ 90’ 120’
30’ 60’ 90’ 120’
30’ 60’ 90’ 120’
C
Lipid-depleted
Lipid-depleted
+ ALA
Lipid-depleted
+ Erg + Ole
D
2 h
17 h
Figure 1. Consequences of heme depletion
for cell growth, ergosterol, and fatty acid content.
hem1 cells were grown to late exponential
phase in YPD ALA and shifted to fresh
YPD medium (lipid-depleted) or YPD ALA
(aerobic-like). (A) Attenuance of the cultures
was determined at the indicated time points
after the shift. In parallel, the ergosterol (B)
and fatty acid (C) content of the cells was
determined 5 or 7 h after shift to fresh medium,
as indicated and as described in Materials
and Methods. Unsaturation ratio (D) corresponds
to the percentage of UFA (C16:1 and
C18:1). Values are means S. D. of at least
three independent determinations.
up as intracellular dot-like structures and as a diffuse disk
that may correspond to the vacuolar lumen. These results
indicate that a critical point is reached after 7 h under
lipid-depleted conditions and that the lipid content of the
cells is not compatible anymore with Fur4p-GFP delivery to
and/or stability at the cell surface. Consistently, Fur4p-GFP
amounts were also dramatically decreased under lipid de-
Fur4p-GFP Trans
Fur4p-GFP FM4-64
Fur4p-GFP FM4-64
Figure 2. Impact of lipid depletion on Fur4p-
GFP delivery to the cell surface. hem1
[pFl38gF-GFP] cells were grown to late exponential
phase in YPRaff ALA and shifted to
fresh YPRaff (lipid-depleted) or YPRaff ALA
(aerobic-like). Fur4p-GFP synthesis was induced
by adding galactose (4% final) to the
medium after 5 h (A) or 7 h (B) after the shift.
The GFP signal was visualized by confocal
microscopy at the time indicated after galactose
addition. (C) hem1 end3 [pFl38gF-GFP]
cells were grown for 7 h under lipid-depleted
conditions (YPRaff) before induction of Fur4p-
GFP synthesis by galactose addition. After 3 h
after Fur4p-GFP induction (i.e., after 10 h
growth under lipid-depleted conditions), ALA
(lipid-depleted ALA), or ergosterol and
Tween 80 (lipid-depleted Erg Ole) were
added to the medium. GFP fluorescence was
observed by confocal microscopy 24 h after
shift to lipid-depleted conditions. The exact
same settings were used throughout the experiment
to obtain a semiquantitative signal.
(D) hem1 [pFl38gF-GFP] cells grown for 7 h
under lipid-depleted conditions as described
in C. The GFP signal and FM4-64 cellular distribution
were observed as described in Materials
and Methods after 2 or 17 h after galactose
addition. Trans, transmission.
Molecular Biology of the Cell

pletion, as judged from Western blot quantification (Supplemental
Figure S1). It should be noted that this situation was
fully reversible, because adding ALA or ergosterol and oleic
acid to the medium restored Fur4p targeting to the plasma
membrane (Figure 2C).
To identify more precisely the compartments of Fur4p-
GFP accumulation under lipid depletion, hem1 cells were
incubated with the lipophilic styryl dye FM4-64 (Figure 2D),
which specifically labels endocytic compartments and the
vacuolar membrane (Vida and Emr, 1995). As shown in
Figure 2D, 120 min after galactose addition (time 2 h),
Fur4p-GFP and FM4-64 colocalized in dot-like structures
corresponding to endosomes and, at the vacuole level, GFP
signal was surrounded by the FM4-64 fluorescence that delineated
the vacuolar membrane. Seventeen hours after induction
of Fur4p-GFP synthesis under these conditions (i.e.,
24 h after the shift to lipid-depleted conditions), the GFP
signal was exclusively detected in the vacuolar lumen (Figure
2D, time 17 h). It was noticed that the lumenal signal was
remarkably increased in hem1 pep4 cells (our unpublished
data), which are defective in vacuolar protease activities
(Woolford et al., 1986). Therefore, it seemed that under lipid
depletion, Fur4p-GFP is delivered to the vacuolar lumen via
the endosomal pathway for subsequent degradation.
We then questioned whether Fur4p-GFP could be sent to
the vacuole after prior delivery to the plasma membrane and
consecutive endocytosis. Endocytosis is a common mechanism
for down-regulation of plasma membrane proteins (for
review, see Dupre et al., 2004). To test this hypothesis, Fur4p-
GFP was expressed in end3 cells, impaired in the internalization
step of endocytosis (Benedetti et al., 1994). hem1
end3 were grown for 7 h under lipid-depleted conditions
and Fur4p-GFP synthesis was induced by galactose addition
(Figure 3A). As shown, no significant difference could be
Figure 3. Characteristics of Fur4p-GFP trafficking
under lipid depletion. (A) hem1
[pFl38gF-GFP] and hem1 end3 [pFl38gF-GFP]
cells were cultivated exactly as in Figure 2B before
visualization of GFP fluorescence. (B)
hem1 [pFl38gF-GFP], hem1 sec7 ts [pFl38gF-
GFP], and hem1 end3 [pFl38gF-GFP] cells were
grown for 7hat23°C under lipid depletion
before transfer at 37°C and induction of Fur4p-
GFP synthesis. After 2 h under these conditions,
cycloheximide was added to the medium at a
final concentration of 100 g ml 1 (t 0). Total
proteins were extracted from cells at the time
indicated and the same amounts of protein were
subjected to SDS-PAGE and Western blot analysis
by using an anti-GFP antibody. (C) hem1
rsp5 ts [pFl38gF-GFP] cells were grown in YPGal
ALA (aerobic-like) or YPGal (lipid-depleted)
at 28°C for 24 h before visualization of GFP
fluorescence by confocal microscopy. Trans,
transmission. (D) hem1 sec7 ts [pFl38gF-GFP]
were grown under aerobic-like or lipid-depleted
conditions for 7hasindicated before induction
of Fur4p-GFP synthesis. After 2 h after induction,
cell lysates were subjected to Triton X-100
extraction and OptiPrep density gradient centrifugation.
Six fractions were collected from the
top of the gradient, TCA-precipitated, and analyzed
by Western blot with anti-GFP and anti-
Pma1p antibodies. (E) Fur4p-GFP signal in the
fractions of the OptiPrep density gradient displayed
in (D) has been quantified using the
Scion Image software.
A
hem1∆ hem1∆
hem1∆ hem1∆ end3∆ end3∆
B
C
D
Fur4p-GFP
Pma1p
Fur4p-GFP
Aerobic-like
observed between hem1 end3 and hem1 cells grown under
the same conditions (Figure 3A), i.e., no plasma membrane
accumulation of the permease could be seen in the
endocytosis defective mutant, whereas fluorescence was still
detected in dot-like structures corresponding to endosomes
and in the vacuolar lumen, as assessed by colocalization
with FM4-64 (data not shown). This suggested that, under
lipid depletion, newly synthesized permease is sent directly
from an intracellular compartment to the vacuole for degradation,
without prior cell surface delivery. This was confirmed
by Western blot analysis of Fur4p-GFP amounts in
hem1 and hem1 end3 cells grown under lipid-depleted
conditions (Figure 3B). In the experiment depicted in this
figure, hem1 and hem1 end3 cells were grown for 7hin
YPRaff medium before galactose addition. After 2 h under
these conditions, cycloheximide was added to inhibit protein
synthesis and Fur4p-GFP was detected by means of
anti-GFP antibodies as a function of time. As shown, the
permease was not protected from degradation in the endocytosis-deficient
mutant, because Fur4p-GFP amounts rapidly
decreased in both cell types.
It has been reported that newly synthesized permeases
may be routed, entirely or in part, to the degradative vacuolar
pathway without routing to the cell surface, depending
on nutritional conditions. Fur4p itself is directly sorted from
the Golgi apparatus to the endosomal system in response to
uracil binding (Blondel et al., 2004). Accordingly, under lipid
depletion, Fur4p was fully protected from degradation
when blocked in the Golgi apparatus in a hem1 sec7-1 ts
double mutant at nonpermissive temperature (Figure 3B).
This demonstrated that vacuolar degradation occurs after
Fur4p exits from the Golgi apparatus, thereby ruling out
ER-associated degradation.
30’ 60’ 90’ 120’ 180’
30’ 60’ 90’ 120’ 180’
0’ 30’ 60’ 90’
hem1∆ hem1∆ hem1∆
hem1∆ rsp5ts hem1∆ rsp5ts 0’ 30’ 60’ 90’
hem1∆ hem1∆ hem1∆ end3∆ end3∆ end3∆
Lipid-depleted
Fur4p-GFP Trans Fur4p-GFP Trans
Aerobic-like Lipid-depleted
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
Lipid-mediated Quality Control in Yeast
hem1∆ sec7ts 0’ 30’ 60’ 90’
hem1∆ sec7ts 0’ 30’ 60’ 90’
hem1∆ sec7ts 0’ 30’ 60’ 90’
E
% Fur4p-GFP
35
30
25
20
15
10
5
0
Aerobic-like
Lipid-depleted
1 2 3 4 5 6
Vol. 19, March 2008 811

L. Pineau et al.
An early step for the delivery of vacuolar proteins to the
lumen of this organelle occurs at the multivesicular body
(MVB) level. MVB sorting begins at an endosomal compartment
where a subset of proteins in the surrounding membrane
is recognized and actively sorted into vesicles that bud
into the lumen of the organelle (for review, see Katzmann et
al., 2002). This process requires prior ubiquitylation by the
ubiquitin ligase Rsp5p (Katzmann et al., 2004). In the case of
uracil-induced diversion from the Golgi apparatus, ubiquitylation
of Fur4p by the ubiquitin ligase Rsp5p also serves as
a specific signal for its sorting to the luminal vesicles of the
MVB (Blondel et al., 2004). As a consequence, Fur4p accumulates
in the vacuolar membrane in the presence of uracil
when expressed in an rsp5-deficient mutant (Blondel et al.,
2004). Therefore, we investigated whether Rsp5p may play a
similar role in Fur4p trafficking under lipid depletion.
Fur4p-GFP was expressed in hem1 rsp5-19 ts cells incubated
under aerobic-like conditions or in YPRaff medium at 28°C
(Figure 3C). rsp5-19 ts displays a point mutation resulting in
a single amino acid change in the ww3 domain of Rsp5p
(Kaliszewski et al., 2006), a domain essential for MVB sorting
of some vacuole lumenal proteins (Morvan et al., 2004). This
allele confers significant growth delay to the cells at 28°C
and complete growth arrest at 37°C (Kaliszewski et al., 2006).
Under aerobic-like conditions, Fur4p-GFP was only detected
at the periphery of the cells (Figure 3C). This is due to the
fact that Rsp5p ubiquitylation of Fur4p is a prerequisite for
its removal from the plasma membrane by endocytosis
(Hein et al., 1995). As expected, the permease could be
detected in the vacuolar membrane under lipid depletion,
showing that, as observed for uracil-induced endosomal
targeting of the permease (Blondel et al., 2004), Rsp5p is
required for Fur4p to enter the intraluminal vesicles of the
MVB. Interestingly, under these conditions, Fur4p-GFP was
also detected at the plasma membrane level (Figure 3C).
Thus, the two fates of Fur4p sorting under lipid limitation,
i.e., the cell surface-targeting defect and the delivery to the
vacuolar lumen, are simultaneously affected in the rsp5defective
mutant. Whether the observed plasma membrane
targeting results from rerouting of Fur4p-GFP to the “normal”
secretory pathway or to an alternative endosomal
route (Gabriely et al., 2007), such as already postulated for
Tat2p (Umebayashi and Nakano, 2003), will require further
investigation.
It has previously been proposed that affecting raft integrity
can induce plasma membrane proteins to undergo a
Golgi-based quality control process (Bagnat et al., 2001;
Wang and Chang, 2002; Umebayashi and Nakano, 2003). A
well-documented example is the tryptophane permease
Tat2p that is diverted from the Golgi apparatus to the endosomal
system under conditions of ergosterol depletion,
i.e., when expressed in a mutant deleted for the ERG6 gene
encoding the Delta(24)-sterol C-methyltransferase (Umebayashi
and Nakano, 2003). In the case of Tat2p, targeting to
the endosomal pathway in erg6 cells was related to a loose
association of the permease with DRMs (Umebayashi and
Nakano, 2003). Detergent insolubility of Fur4p was therefore
examined under aerobic-like and lipid-depleted conditions
by treatment with Triton X-100 followed by a flotation analysis
on an OptiPrep gradient (Figure 3D). It has to be noted
that the experiment displayed in this figure was performed
on sec7 ts cells (see above) grown at a nonpermissive temperature,
i.e., under conditions where Fur4p-GFP is stopped at
the branch line between the endosomal and the plasma
membrane pathways. In these cells, Fur4p is protected from
degradation under lipid depletion (Figure 3B), due to its
retention in the Golgi complex. Surprisingly, the patterns of
812
Fur4p-GFP on the OptiPrep gradient were identical under
both conditions (Figure 3, D and E): at the cell/detergent
ratio used in this experiment (10 9 cell ml 1 incubated with
1% Triton X-100), Fur4p-GFP was detected to significant
levels in fractions 2 and 3 that correspond to DRM associated
forms (15 and 7% of total Fur4p-GFP signal, respectively;
Figure 3E), but also in fractions 4, 5, and 6, corresponding
to solubilized material. Similarly, the plasma
membrane proton ATPase Pma1p, which is a well-established
DRM-associated protein (Bagnat et al., 2000, 2001),
displayed similar behavior under both aerobic-like and lipid-depleted
conditions, but it was almost exclusively detected
in fraction 2, in contrast to Fur4p. The observed
ambivalent distribution of Fur4p suggests that the permease
association to DRMs is not as tight as that of Pma1p. However,
our results clearly show that Fur4p association to
DRMs is not affected under lipid depletion, and that a
weaker association to DRMs can therefore not account for
Fur4p sorting to the endosomal system, in contrast to what
has been proposed for Tat2p.
Fur4p Failure to Reach the Plasma Membrane under Lipid
Depletion Is Not Due to a General Block of the Secretory
Pathway
To assess whether heme-induced lipid depletion could result
in a global defect of the secretory pathway, the secretion
of invertase was measured under the same conditions. Internal
and external invertase activities were determined using
enzyme latency assays, as described previously (Munn et
al., 1999). As a control, invertase secretion was also measured
in cells grown under conditions of normal Fur4p
delivery to the plasma membrane, i.e., under aerobic-like
conditions (Figure 4A). As shown in Figure 4A, lipid depletion
did not significantly alter the kinetics of invertase secretion
because no intracellular accumulation could be detected.
In contrast, the same experiments were performed in
a sec14 thermosensitive mutant, defective in Golgi export of
secreted proteins at nonpermissive temperature (Henneberry
et al., 2001). Such a mutant was unable to secrete
invertase into the periplasm, but rather accumulated intracellular
invertase at 37°C (Figure 4A).
We also evaluated whether lipid depletion could impair
the trafficking of integral plasma membrane proteins in general,
by monitoring the biogenesis of the proton ATPase
Pma1p under these conditions (Figure 4B). For this purpose,
a HA-tagged version of Pma1p under control of a heat-shock
promoter was used (DeWitt et al., 1998; Ferreira et al., 2002),
that allows its synthesis by transient shifting at elevated
temperature. The newly synthesized protein can be tracked
by immunofluorescence using an anti-HA antibody (DeWitt
et al., 1998; Ferreira et al., 2002). In the experiment displayed
in Figure 4B, cells grown for 7 h under aerobiosis-like and
lipid-depleted conditions were shifted to 39°C for 15 min
and Pma1p-HA was visualized after 1 h after the shift.
Interestingly, Pma1p-HA could be detected at the cell periphery
under both conditions, showing that, in contrast to
Fur4p, ergosterol and UFA limitations do not abolish Pma1p
delivery to the plasma membrane. These results were to a
certain extent expected, because Pma1p plasma membrane
delivery and stability at this level seem to be directly coupled
to its association to DRMs (Bagnat et al., 2001; Pizzirusso
and Chang, 2004; Gaigg et al., 2005, 2006) and DRM
association of Pma1p was not impaired under lipid depletion
(Figure 3D).
Therefore, Fur4p-GFP diversion from the Golgi apparatus
to the endosomal pathway under heme-induced lipid limitation
is not due to a blockage of the secretory pathway nor
Molecular Biology of the Cell

Figure 4. Consequences of lipid depletion on
invertase secretion and Pma1p plasma membrane
targeting. (A) hem1 cells (top) were
grown as described in the legend of Figure 1
for7hinYPDALA (aerobic-like) or YPD
(lipid-depleted) before invertase induction.
sec14 ts cells (bottom) were grown to exponential
phase at 28°C and invertase was induced
by glucose limitation in cells maintained under
permissive conditions (28°C) or transferred
to nonpermissive temperature (37°C).
Samples were removed at the time points indicated
and the activity of internal and secreted
invertase was determined as described
in Materials and Methods. Closed symbols, extracellular
invertase activities (e); open symbols,
intracellular invertase activities (i). (B)
hem1 [Yiplac204–2HSE pr -HA-PMA1] cells
were grown under aerobic-like or lipid-depleted
conditions for 7 h before incubation for
15 min at 39°C for induction of Pma1p-HA
synthesis. Sixty minutes after the heat shock,
the cells were fixed and processed for immunofluorescence
with antibodies to HA (left).
Anti-Kar2p antibodies were used as nonspecific
markers to visualize the cells in the microscope
field (right).
A
0.2
0.1
to a nonspecific effect on the biogenesis of plasma membrane
proteins.
Individual Sterol and UFA Depletions Result in Direct
Targeting of Fur4p to the Endosomal Pathway
In a next step, we questioned the individual contributions of
ergosterol and UFA shortage on Fur4p recognition by the
Golgi quality control process. To answer this question,
Fur4p-GFP trafficking was analyzed under conditions of
heme-induced ergosterol or UFA starvation, by selectively
adding oleate to the medium, as the source of UFA (ergosterol
depletion; Figure 5A, Ole), or ergosterol (UFA depletion;
Figure 5A, Erg). As a control, heme-depleted cells
were also incubated with both lipid molecules (Figure 5A,
Erg Ole). As expected, adding both ergosterol and UFAs
to the medium allowed targeting of Fur4p-GFP to the cell
surface (Figure 5A, bottom, time 180 min). Surprisingly,
individual depletion of ergosterol or UFAs both prevented
Fur4p delivery to the plasma membrane (Figure 5A). Instead,
the fluorescence was mainly detected in the vacuolar
lumen, as determined via colocalization with FM4-64 (Figure
5B). As in the case of dual depletion, plasma membrane
µ mol glucose/min/OD 600nm
µ mol glucose/min/OD 600nm
B
Aerobic-like (e)
Aerobic-like (i)
0.0
0 10 20 30 40 50 60
0.4
0.3
0.2
0.1
Time (min)
sec14 ts sec14 28°C (e)
ts 28°C (e)
sec14 ts sec14 28°C (i)
ts 28°C (i)
0.0
0 10 20 30 40 50 60
Aerobic-like
Time (min)
Lipid-depleted
µ mol glucose/min/OD 600nm
µ mol glucose/min/OD 600nm
0.2
0.1
Lipid-depleted (e)
Lipid-depleted (i)
0.0
0 10 20 30
Time (min)
40 50 60
0.4
0.3
0.2
0.1
Pma1p-HA Kar2p
Lipid-mediated Quality Control in Yeast
sec14 ts sec14 37°C (e)
ts 37°C (e)
sec14 ts sec14 37°C (i)
ts 37°C (i)
0.0
0 10 20 30 40 50 60
Time (min)
accumulation was not observed in hem1 end3 when UFA
or ergosterol were omitted (Figure 5C), and the permease
was detected in the vacuolar membrane in hem1 rsp5-19 ts at
nonpermissive temperature in both cases (Figure 5D). Altogether,
these experiments show that individual depletion of
ergosterol or UFA results in Fur4p channeling to the Golgibased
quality control process.
UFA Depletion Induces the Accumulation of Short
Saturated Fatty Acyl Chains in Phospholipids
Given the similar consequences of ergosterol and UFA shortage
on Fur4p-GFP trafficking, it was important to evaluate
the precise impact of these depletions on the overall lipid
composition of the cells. In a first step, the ergosterol cellular
content was analyzed under the different conditions (Figure
6A). As expected, when heme synthesis was inhibited, the
absence of an exogenous source of sterol resulted in ergosterol
scarcity (Figure 6A, lipid-depleted and Ole), whereas
cellular ergosterol pools were fully replenished when this
molecule was added to the medium, regardless of the presence
or the absence of exogenously supplied UFA (Figure
6A, compare Erg and Erg Ole).
Vol. 19, March 2008 813

L. Pineau et al.
A
+ Erg
+ Ole
+ Erg + Ole
C
+ Erg
+ Ole
+ Erg + Ole
30’ 60’ 90’ 120’ 180’
30’ 60’ 90’ 120’ 180’
30’ 60’ 90’ 120’ 180’
hem1∆ hem1∆ end3∆ end3∆
Fur4p-GFP Trans
+ Erg
+ Ole
hem1∆ rsp5ts hem1∆ rsp5ts Subsequently, phospholipid species were analyzed by
mass spectrometry as described in Materials and Methods. A
comparison of positive ion mode spectra is displayed in
Figure 6B. For peak assignment, ions were subjected to ion
scan analyses as described previously (Schneiter et al., 1999).
In this figure, the main peaks corresponding to molecular
species of PC are indicated. As shown, cells grown under
UFA depletion (lipid-depleted and Erg) displayed very
similar patterns, with the accumulation of low m/z PC molecular
species, corresponding to PC molecules bearing short
saturated acyl chains (PC 24:0, 26:0, 28:0, and 30:0). Interestingly,
these species were hardly detectable under aerobiclike
conditions or when oleate was added to the medium
( Ole and Erg Ole, Figure 6), showing a direct correlation
between the accumulation of short fatty acyl chains
and UFA scarcity. Such an accumulation of short chains was
also observed for other phospholipid species, i.e., PE, phosphatidylserine
(PS) and PI under UFA depletion (unpublished
data).
Detailed analysis of PC species under the different conditions
is displayed in Figure 7A. As shown, significant differences
can be observed in PC composition between the
treatments. Overall, these rearrangements of PC species can
be visualized by the monitoring of three parameters, namely
the unsaturation ratio (Figure 7B), the average number of
carbons in the acyl chains (average chain length; Figure 7C)
and the relative quantities of saturated, monounsaturated
and diunsaturated species (Figure 7D).
As shown in these figures, UFA depletion (lipid-depleted
and Erg) modified all three parameters compared with
cells grown under aerobic-like conditions, with a decrease in
the average length of fatty acyl chains (Figure 7C) and a
reduction of the unsaturation ratio (Figure 7B) related to an
increase in saturated species at the expense of diunsaturated
814
D
+ Erg
+ Ole
+ Erg + Ole
B
Fur4p-GFP Trans
Fur4p-GFP FM4-64
Figure 5. Relative impacts of ergosterol and
UFA shortage on Fur4p-GFP biogenesis. (A)
hem1 [pFl38gF-GFP] cells were cultivated to
late exponential phase in YPRaff ALA before
shift to fresh YPRaff ergosterol ( Erg),
YPRaff Tween 80 ( Ole), or YPRaff ergosterol
Tween 80 ( Erg Ole). After 7 h under
these conditions, Fur4p-GFP synthesis was induced
and cellular GFP distribution was observed
at the time indicated after induction. (B)
After growth as described in A and 180 min after
Fur4p-GFP induction, cells were incubated with
FM4-64 before visualization by confocal microscopy.
hem1 end3 [pFl38gF-GFP] (C) and
hem1 rsp5 ts [pFl38gF-GFP] (D) cells were
grown as described in Figure 3C. Erg, YPGal
ergosterol; Ole, YPGal Tween 80; and
Erg Ole, YPGal ergosterol Tween 80.
Trans, transmission.
forms (Figure 7D). These modifications are the consequence
of the accumulation of PC species bearing short saturated
chains (PC 24:0, 26:0, 28:0, and 30:0) at the expense of diunsaturated
species (PC 32:2 and 34:2), that are predominant in
cells grown under aerobic-like conditions (Figure 7A).
Interestingly, oleate supplementation ( Ole and Erg
Ole) not only restored the unsaturation ratio, but all three
parameters, albeit PC species in cells grown under these
conditions tended to display longer fatty acyl chains than PC
species extracted from aerobically grown cells (Figure 7C).
This ought to be related to the accumulation of PC 34:1 and
PC 36:1 species at the expense of PC 32:2 under these conditions,
due to increased incorporation of oleate (C18:1) in
phospholipids (Figure 7A). However, because all three parameters
are nearly identical in UFA competent cells, whatever
the origin of the UFA source (i.e., endogenous or exogenous),
one may assume that the biophysical properties of
the phospholipid bilayer might be very similar, at least in
terms of width and relative fluidity. This may explain why
normal growth and plasma membrane delivery of Fur4p
were observed under haem depletion when oleate and ergosterol
were added to the medium (Figure 5A, Erg
Ole).
It was shown recently that the synthesis of sphingolipids
up to IPC was essential for Pma1p association to DRMs and
its subsequent delivery and/or stability at the plasma membrane
level (Gaigg et al., 2005). The core of sphingolipids are
ceramides that are constituted in yeast by a long chain base
(mainly phytosphingosine), condensed with a C26 very long
chain fatty acid (for recent review, see Dickson et al., 2006).
More specifically, Gaigg et al. (2006) have demonstrated that
the fatty acyl chain length of IPC was crucial for Pma1p
biogenesis, rather than the polar head groups of the sphingolipid
molecule.
Molecular Biology of the Cell

Figure 6. Lipid composition of hem1 cells
under the different conditions. hem1 cells
were grown in YPD (lipid-depleted), YPD
ALA (aerobic-like), YPD ergosterol ( Erg),
YPD Tween 80 ( Ole) or YPD ergosterol
Tween 80 ( Erg Ole). After 7 h under these
conditions, lipids were extracted from the cells
for analysis. (A) Ergosterol amounts were
quantified as described in Materials and Methods
and are expressed as g ergosterol/10 9
cells. Values are means S. D. of at least three
independent measurements. (B) Positive ion
mass spectra of the m/z range 600–800. The
total carbon chain length (x) and number of
carbon–carbon double bonds (y) of PC molecular
species is indicated (x:y). A.U., arbitrary
units.
100
Although unlikely, because Pma1p was effectively targeted
to the plasma membrane and Fur4p and Pma1p were
normally associated to DRMs, we wondered whether short
fatty acyl chain accumulation could occur in sphingolipids
as in phospholipids, and whether it may have accounted, at
least in part, for Fur4p mislocalization. To address this question,
lipids extracted from cells cultured under the different
conditions were analyzed by mass spectrometry in the negative
ion mode. The obtained spectra are displayed in Figure
8. Under these conditions, PI species could be visualized as
well as the mature sphingolipid forms IPC-C and IPC-B/B
that differ from each other by one hydroxyl group. PI and
IPC species were unambiguously identified by negative precursor
scans for m/z 241, specific for the dehydration product
of inositol phosphate (Schneiter et al., 1999). Interestingly,
whatever the condition tested, the main IPC-B/B and
IPC-C species detected displayed the same m/z, i.e., 936 and
952 Da respectively, which correspond to C26 fatty acid
containing species. Moreover, the intensities of the corre-
A
B
Relative Intensity (A. U.)
Relative Intensity (A. U.)
Relative Intensity (A. U.)
µg ergosterol/109 µg ergosterol/10 cells 9 cells
30
25
20
15
10
5
0
80
60
40
20
Aerobic-like
30:1
32:2
34:2
0
600 650 700 750 800
100
80
60
40
20
100
80
60
40
20
Aerobic-like
+ Ole
Lipid-depleted
+ Erg + Ole
+ Erg
30:1
30:1
+ Ole
32:1
32:1
34:2
34:2
+ Erg + Ole
36:1
0
600 650 700 750 800
36:1
0
600 650 700 750 800
Relative Intensity (A. U.)
Relative Intensity (A. U.)
100
80
60
40
20
Lipid-depleted
26:0
28:0
30:0
24:0
32:1
34:1
0
600 650 700 750 800
m/z m/z
m/z
m/z
Lipid-mediated Quality Control in Yeast
100
80
60
40
20
+ Erg
24:0
26:0
28:0 30:0
32:1
34:1
0
600 650 700 750 800
m/z
sponding peaks were significantly higher, relative to the
ones of PI species, for cells cultivated under UFA depletion
(Figure 8, lipid-depleted and Erg). Because PI
amounts were similar for cells grown under haem deficiency,
whatever the supplement added to the medium
(lipid-depleted, Erg, Ole, Erg Ole; data not
shown), these results showed that UFA starvation did not
result in decreased IPC amounts. Therefore, we conclude
that Fur4p mistargeting to the endosomal system under
UFA depletion (Figure 5, lipid-depleted, Erg) cannot be
due to low IPC amounts nor to a shortening of the fatty
acyl component of sphingolipids.
The Unsaturation Ratio of Fatty Acyl Chains of
Phospholipids, but Not Their Length, Is Crucial for Fur4p
to Evade the Golgi Quality Control Process
UFA depletion induces both a shortening of fatty acyl chains
in phospholipids and a decrease in their unsaturation level
(Figure 7). To evaluate the respective consequences of these
Vol. 19, March 2008 815

L. Pineau et al.
parameters for Fur4p-GFP trafficking, hem1 cells were
grown in media supplemented with fatty acids of increasing
chain length, namely, myristoleic (C14:1), palmitoleic (C16:
1), and oleic acid (C18:1). As shown in Figure 9A, Fur4p-GFP
could be detected at the plasma membrane level regardless
of the length of the exogenously supplied UFAs. The Fur4p-
GFP signal at the plasma membrane in the presence of C14:1
was even more visible when permease molecules that escaped
the Golgi quality control process were stabilized at
the cell periphery in the endocytosis-defective hem1 end3
strain (Figure 9B). This suggested that fatty acyl chain length
was not a determinant parameter of the lipid-mediated
Golgi quality control process. To rule out the possibility that
exogenous fatty acids could have been further elongated by
cellular elongases before their incorporation in phospholipids,
phospholipids extracted from cells grown on ergosterol
816
Figure 7. PC species under the different culture conditions. (A) hem1 were
grown in the media indicated for 7 h, as described in the legend of Figure 6,
before lipid extraction and MS analysis of PC species in the positive ion
mode. The relative abundance of each molecular PC species was determined
as described in Materials and Methods. Values are means S.D. of at least
three independent determinations. The unsaturation ratio (B), the average
chain length (C), and the relative percentage of saturated versus monounsaturated
and diunsaturated species (D) were calculated from data displayed
in A. As an example, PC 32:1 was considered as a monounsaturated specie
with an average chain length of 16 carbons.
and C14:1 ( Erg 14:1) were analyzed by electrospray
ionization-mass spectrometry (ESI-MS). The results obtained
for PC under these conditions and under UFA depletion
( Erg) are displayed in Figure 10A. As shown, growth on
C14:1 induced the accumulation of short diunsaturated species,
such as C28:2 and C30:2. As a result, the unsaturation
ratio was restored to normal by the addition of C14:1 compared
with cells grown under UFA depletion, because an
identical value was obtained with aerobically grown cells
(Figure 10B), whereas the average chain length was maintained
at 15.5 carbon atoms (Figure 10C). Because unsaturated
phospholipids generate bilayers of smaller width than
saturated phospholipids, due to loose packing of unsaturated
fatty acyl chains, we conclude that growth on C14:1
does not compensate for the global shortening of fatty acyl
chain length induced by UFA depletion. Rather, C14:1 likely
Molecular Biology of the Cell

Figure 8. Inositol phosphoceramide species
under the various culture conditions. hem1
cells were grown in the media indicated for
7 h before lipid extraction, and MS analysis in
the negative ion mode. The main PI, IPC-B/B
(m/z 936 Da), and IPC-C (m/z 952 Da)
species are indicated. A.U., arbitrary units.
100 Aerobic-like
100 + Ole
corrects Fur4p targeting to the plasma membrane by restoring
a high unsaturation level of fatty acids in phospholipids,
A
+ Erg
+ Erg + C14:1
+ Erg + C16:1
+ Erg + C18:1
hem1∆ hem1∆
Fur4p-GFP Trans
B
+ Erg
+ Erg + C14:1
Relative Intensity (A. U.)
Relative Intensity (A. U.)
Relative Intensity (A. U.)
80
60
40
20
0
800 850 900 950 1000
80
60
40
20
0
800 850 900 950 1000
100 + Erg + Ole
80
60
40
20
PI 32:1
PI 32:1
PI 32:1
PI 34:1
PI 34:1
PI 34:1
PI 36:1
PI 36:1
PI 36:1
936
952
936
952
936
952
0
800 850 900 950 1000
hem1∆ hem1∆ end3∆ end3∆
Fur4p-GFP Trans
Figure 9. Impact of fatty acid chain length of Fur4p-GFP plasma
membrane delivery. hem1 [pFl38gF-GFP] (A) or hem1 end3
[pFl38gF-GFP] (B) cells were grown for 24 h in YPGal medium
ergosterol eventually supplemented with myristoleic acid (C14:1),
palmitoleic acid (C16:1), or oleic acid (C18:1) as indicated, before
visualization of GFP fluorescence. Trans, transmission.
Relative Intensity (A. U.)
Relative Intensity (A. U.)
100 Lipid-depleted
80
60
40
20
936
952
0
800 850 900 950 1000
m/z m/z
100 + Erg
80
60
40
20
936
952
0
800 850 900 950 1000
m/z m/z
m/z
Lipid-mediated Quality Control in Yeast
PI 32:1
PI 32:1
and more specifically by restoring elevated levels of diunsaturated
species (Figure 10D), equivalent to that observed
under aerobic-like conditions.
Hexagonal Phase Propensity of Phosphatidylethanolamine
Is Required for Fur4p Delivery to the Plasma Membrane
Cholesterol and diunsaturated forms of phospholipids have
been shown to favor hexagonal H II phase formation in
model membranes (Chen and Rand, 1997; Epand et al., 2003,
2005). The presence of H II promoting lipids results in curvature
stress, a biophysical parameter of membranes that
has been reported to regulate the folding and/or activity of
integral proteins (for reviews, see Lee, 2003; van den Brinkvan
der Laan et al., 2004). Therefore, we wondered whether
hexagonal H II phase formation could be an important parameter
for normal Fur4p delivery to the plasma membrane.
To test this hypothesis, Fur4p biogenesis was evaluated in a
strain depleted of PE, a nonbilayer forming phospholipid
with a high propensity to form a hexagonal H II phase. For
this purpose, Fur4p was expressed in the psd1 psd2 dpl1
triple mutant strain RY200T. This strain is unable to synthesize
PE except if the medium is supplemented with ethanolamine
(Robl et al., 2001). In the PE depletion protocol used
(Opekarova et al., 2005), RY200T cells were cultivated in
YPRaff medium containing 2 mM ethanolamine and were
transferred to YPGal 2 mM ethanolamine (PE-competent
cells) or YPGal 4 mM choline (PE-depleted cells) for 16 h.
Then, the cellular distribution of the Fur4p-GFP signal was
observed by confocal microscopy. As shown in Figure 11A,
whereas Fur4p-GFP was detected at the cell periphery in
PE-competent cells, it accumulated in intracellular compart-
Vol. 19, March 2008 817
PI 34:1
PI 34:1

L. Pineau et al.
% PC molecular species
% UFA
30
25
20
15
10
5
0
90
80
70
60
50
40
30
20
(24:0) (26:0) (28:0) (28:1) (28:2) (30:0) (30:1) (30:2) (32:0) (32:1) (32:2) (34:0) (34:1) (34:2) (36:0) (36:1) (36:2)
+ Erg
+ Erg
+ Erg + C14:1
+ Erg + C14:1
Aerobic-like
B C
Unsaturation Ratio Average chain length
Average number of carbons
in the acyl chains
16,5
15,5
14,5
ments under PE depletion. To check whether Fur4p-GFP
delivery to the plasma membrane was directly connected to
the nonbilayer propensity of PE, the same experiment was
performed in a medium in which ethanolamine was replaced
by propanolamine (Prn). Indeed, Prn can be metabolized
to phosphatidylpropanolamine in a psd1 psd2
strain, a phospholipid that cannot compensate fully for PE,
because Prn cannot restore the growth of the RY200T psd1
psd2 dpl1 triple mutant strain, but that promotes hexagonal
phase formation almost as efficiently as PE (Storey et al.,
2001). As shown in Figure 11A, Fur4p-GFP was detected at
the cell periphery in most of the RY200T cells grown on Prn,
suggesting that hexagonal H II phase formation is indeed a
critical parameter for Fur4p targeting to its final destination.
To provide some definition of the minimal PE levels required
for plasma membrane sorting of Fur4p, the same
experiment was performed with different concentrations of
ethanolamine (0, 10 M, 50 M, 100 M, 250 M, 500 M, 1
818
17
16
15
14
+ Erg
+ Erg + C14:1
Aerobic-like
% % PC PC molecular molecular species species
80
70
60
50
40
30
20
10
0
+ Erg
+ Erg + C14:1
Aerobic-like
Saturated Mono
unsaturated
A
D
Di
unsaturated
Figure 10. PC composition of hem1 grown
in myristoleic acid-supplemented medium.
hem1 cells were grown in the media indicated
for 7 h before lipid extraction and MS
analysis of PC species in the positive ion
mode. (A) Relative abundance of molecular
PC species. (B) Unsaturation ratio. (C) Average
chain length. (D) Relative percentage of
saturated versus monounsaturated and diunsaturated
species. See legend of Figure 7 and
text for details. Values are means S. D. of at
least three independent measurements.
mM, or 2 mM ethanolamine). Interestingly, Fur4p-GFP
could hardly be detected at the plasma membrane for ethanolamine
concentrations below 250 M (Figure 11B). In
agreement with our previous observations (Figure 11A),
addition of 2 mM propanolamine fully restored Fur4p-GFP
sorting to the cell periphery under limiting ethanolamine
concentrations (100 M ethanolamine; Figure 11B). Direct
determination of PE levels revealed a strict connection between
the concentrations of exogenously supplied ethanolamine
and cellular PE amounts (Figure 11C). The minimal
PE concentration for efficient Fur4p-GFP delivery to the cell
surface was estimated to 7.9 1.0 nmol FA/10 9 cells, a
concentration obtained under addition of 250 M ethanolamine
to the medium. This concentration corresponds to
approximately one fourth of the PE levels detected in the
RY2000T strain grown under optimal conditions (i.e., in the
presence of 2 mM ethanolamine, 31.3 1.8 nmol FA/10 9
cells; Figure 11C) and 1/14 of PE amounts in the reference
Figure 11. Phosphatidylethanolamine is required
for optimal delivery of Fur4p-GFP to
the plasma membrane. RY200T [pFl38gF-GFP]
cells were grown for 16 h in YPGal medium
supplemented (A) with ethanolamine (2 mM),
choline (4 mM) or propanolamine (2 mM) and
(B) with ethanolamine (250 M), ethanolamine
(50 M) or ethanolamine (100 M) propanolamine
(2 mM). Visualization of GFP fluorescence
was performed by confocal microscopy.
Trans, transmission. (C) RY200T cells were
grown as in A, in the presence of the indicated
supplements. PE concentrations as nanomoles
of FA/10 9 cells were determined as described
in Materials and Methods. Values are means
S.D. of at least three independent determinations.
Molecular Biology of the Cell

Y10000 wild-type strain, grown in YPGal medium without
addition (110.4 7.2 nmol FA/10 9 cells; data not shown).
DISCUSSION
In the present study, we have evaluated the impact of ergosterol
or UFA depletion on the biogenesis of the model
polytopic membrane protein Fur4p. In the dynamic system
used, Fur4p fails to be delivered to the plasma membrane
when sterol amounts decrease below a critical concentration
of 4.5 1.2 g ergosterol/109 cells (Figures 1B and 6A).
Under these conditions, Fur4p falls prey to a quality control
system that displays all the characteristics of the Golgi-based
quality control process: 1) Fur4p is sorted to the endosomal
pathway without prior targeting to the plasma membrane
(Figures 2D and 3A), 2) Fur4p is protected from degradation
when accumulated in the Golgi apparatus (Figure 3B), and
3) is internalized in the vacuolar lumen in a Rsp5p-dependent
manner (Figure 3C). This is a new example of the
influence of sterols on the biogenesis of a membrane-associated
protein.
Another important finding of this study is that the fatty
acyl content of phospholipids influences Fur4p biogenesis.
Indeed, as observed upon ergosterol scarcity, heme-induced
UFA shortage resulted in Fur4p sorting to the endosomal
pathway. To our knowledge, this is the first time that such
an effect of cellular fatty acyl composition on the biogenesis
of an integral protein is reported. ESI-MS analysis of phospholipid
species revealed that UFA starvation induced two
distinct responses on the fatty acyl content, i.e., a decrease in
the unsaturation ratio and a shortening of the chain length
(Figure 7). These effects are not related to an indirect consequence
of heme depletion, but they are rather directly connected
to the impaired fatty acid desaturation. Indeed, all
three phenomena, i.e., Fur4p failure to reach the cell surface,
a decrease in the unsaturation ratio, and the shortening of
fatty acyl chains, were observed in an ole1 strain when
grown without supplementation with an exogenous UFA
source (unpublished data).
Shortening of the fatty acyl chains in phospholipids may
represent an adaptation process to impaired desaturation.
Yeast has already been reported to adjust its unsaturation
level and the length of its phospholipid fatty acyl chains in
response to various stresses such as temperature variations
(Suutari et al., 1997) or conditions of PC depletion (Boumann
et al., 2006). If one considers the potential effects of saturated
fatty acid (SFA) accumulation in phospholipids under haem
deficiency, one may expect a dramatic decrease in membrane
fluidity, which is not compatible with most of the
cellular processes that require high membrane dynamics.
Shortening the acyl chains in phospholipids under these
conditions may contribute to maintaining the membranes in
the Ld state. This may explain why essential cellular processes
such as secretion are still fully functional under lipid
depletion, as judged by invertase secretion assays and
Pma1p biogenesis studies (Figure 4).
A major question that arose from our observations was
how depleting the cells of ergosterol or UFA, which were
found to differently impact the overall lipid composition
(Figures 6 and 7), could have the same effects on the biogenesis
of a plasma membrane protein, such as Fur4p. The most
reasonable hypothesis is that they influence a specific physical
parameter of the lipid bilayer in the same way, e.g.,
domain formation, such as Lo/DRMs/raft domains, membrane
fluidity, thickness, or intrinsic curvature.
Based on recent literature, we initially hypothesized that the
disruption of raft domains could account for Fur4p recognition
Lipid-mediated Quality Control in Yeast
by the Golgi quality control process. However, this is obviously
not the case, because the pattern of Fur4p association to DRMs
was identical under aerobic-like and lipid-depleted conditions
(Figure 3D). This was confirmed for individual ergosterol and
UFA depletions (our unpublished data). Moreover, the association
of another protein, Pma1p, to DRMs was also shown not
to be impaired under the various lipid depletions (Figure 3D;
our unpublished data). Pma1p association to DRMs has been
proposed to be a prerequisite for plasma membrane delivery
and stability (Bagnat et al., 2001; Pizzirusso and Chang, 2004;
Gaigg et al., 2005, 2006). Accordingly, Pma1p targeting to the
cell periphery was not abolished under ergosterol and UFA
shortage (Figure 4).
If ergosterol scarcity and short saturated fatty acyl chain
accumulation in phospholipids upon UFA depletion were
not compatible with unidirectional changes in membrane
fluidity, they may influence membrane width in the same
way, by reducing bilayer thickness. Thickness of the hydrophobic
membrane-spanning regions of an integral protein
should match the thickness of the bilayer to avoid exposure
of hydrophobic residues to water, a phenomenon known as
hydrophobic-mismatch (for review, see Lee, 2003). However,
such a phenomenon cannot account for our results
with Fur4p. Indeed, we could show that the permease escapes
the Golgi quality control process when grown in the
presence of a short unsaturated fatty acid, myristoleic acid
(Figure 9, Erg C14:1). Such an addition restored the
phospholipid unsaturation ratio to a level equivalent to
what was observed under aerobiosis-like conditions (Figure
10B), but it maintained a low average fatty acyl chain length
(Figure 10C). Therefore, the unsaturation ratio of phospholipids
seems to be a more critical parameter for Fur4p cell
surface delivery than membrane width.
A model that fully accounts for our results is membrane
curvature (van den Brink-van der Laan et al., 2004; de Kroon,
2007). Some phospholipids such as PC display an overall
cylindrical shape and tend to organize themselves in bilayers.
In contrast, other phospholipids such as PE display
conical shapes (type II lipids), and they tend to form nonlamellar
phases with a negative curvature such as the hexagonal
phase H II. When present in phospholipid bilayers, hexagonal
phase-promoting lipids result in curvature stress, an
overall property of the membrane that can influence the
structure and activity of membrane-anchored proteins (for
reviews, see Booth, 2003; van den Brink-van der Laan et al.,
2004). It has been proposed that the presence of nonbilayer
lipids may result in increased lateral pressure in the acyl
chain region that could favor the packing of transmembrane
helices (van den Brink-van der Laan et al., 2004). Interestingly,
increasing the amount of diunsaturated PC species
and the relative cholesterol concentration augments the propensity
of PC/cholesterol mixtures to form an H II phase in
model membranes (Epand et al., 2003, 2005; Tenchov et al.,
2006). Moreover, the accumulation of short saturated fatty
acid chains in PE in yeast has been shown to remarkably
decrease its H II phase propensity due to a reduction of its
overall conical shape (Boumann et al., 2006). Therefore,
based on these observations, one may expect that ergosterol
and UFA shortage, through a decrease in diunsaturated PC
(Figure 7D) and PE (unpublished data) species in favor of
saturated forms, induce unidirectional changes in membrane
curvature, i.e., a decrease in curvature stress. The
hypothesis for such a direct connection between curvature
stress and optimal Fur4p delivery to the plasma membrane
is strengthened by the observed deleterious effects of PE
depletion on Fur4p biogenesis (Figure 11), effects that can be
rescued in part by replacing PE with the H II hexagonal
Vol. 19, March 2008 819

L. Pineau et al.
phase promoter phosphatidylpropanolamine (Figure 11;
Storey et al., 2001).
Finally, the results presented in this study point to the
Golgi apparatus being a major compartment for lipid-mediated
controlled cell surface delivery of plasma membrane
proteins. In this respect, the fact that Pma1p trafficking to the
cell periphery is not abolished under lipid depletion (Figure
4) suggests that Fur4p and Pma1p are not equally sensitive
to changes in the lipid environment. This may be related to
unique immediate lipid surroundings that may account for
their different sensitivities to Triton X-100 solubilization
(Figure 3D), or a different oligomerization status of these
two proteins. Lipid-mediated early segregation at the Golgi
level could account, at least in part, for Fur4p and Pma1p
localizations to distinct plasma membrane subdomains (Malinska
et al., 2004; Grossmann et al., 2007). In this context,
modifying curvature stress may be a way to regulate the
delivery of selective plasma membrane proteins to their final
destination.
ACKNOWLEDGMENTS
We thank Jenny Colas for excellent technical assistance, Dr. Anne Cantereau
for precious advice regarding confocal microscopy imaging, Dr. Patrick
Mazellier for help and comments with phospholipid analysis by tandem mass
spectrometry. We thank Drs. Randy Schekman, Carolyn Slayman, Miroslava
Opekarova (Institute of Microbiology, Prague, Czech Republic), Teresa
Zoladek (Institute of Biochemistry and Biophysics, Warsaw, Poland), and
Rosine Haguenauer-Tsapis (Institut Jacques Monod, Paris, France) for strains,
plasmids, and antibodies. Drs. Danièle Urban-Grimal and Elsa Lauwers are
also acknowledged for protocols concerning DRM preparation and for sharing
preliminary results. Dr. Manilduth Ramnath provided helpful comments
concerning the manuscript and Dr. Elizabeth Pilon-Smits improved the language.
This work was supported by the French MENRT (with a grant to L.P),
the Conseil Général de la Région Poitou-Charente and the CNRS.
REFERENCES
Bagnat, M., Chang, A., and Simons, K. (2001). Plasma membrane proton
ATPase pma1p requires raft association for surface delivery in yeast. Mol.
Biol. Cell 12, 4129–4138.
Bagnat, M., Keranen, S., Shevchenko, A., and Simons, K. (2000). Lipid rafts
function in biosynthetic delivery of proteins to the cell surface in yeast. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 97, 3254–3259.
Benedetti, H., Raths, S., Crausaz, F., and Riezman, H. (1994). The END3 gene
encodes a protein that is required for the internalization step of endocytosis
and for actin cytoskeleton organization in yeast. Mol. Biol. Cell 5, 1023–1037.
Blondel, M.-O., Morvan, J., Dupre, S., Urban-Grimal, D., Haguenauer-Tsapis,
R., and Volland, C. (2004). Direct sorting of the yeast uracil permease to the
endosomal system is controlled by uracil binding and Rsp5p-dependent
ubiquitylation. Mol. Biol. Cell 15, 883–895.
Booth, P. J. (2003). The trials and tribulations of membrane protein folding in
vitro. Biochim. Biophys. Acta 1610, 51–56.
Boumann, H. A., Gubbens, J., Koorengevel, M. C., Oh, C.-S., Martin, C. E.,
Heck, A.J.R., Patton-Vogt, J., Henry, S. A., de Kruijff, B., and de Kroon,
A.I.P.M. (2006). Depletion of phosphatidylcholine in yeast induces shortening
and increased saturation of the lipid acyl chains: evidence for regulation of
intrinsic membrane curvature in a eukaryote. Mol. Biol. Cell 17, 1006–1017.
Brown, D. A., and London, E. (2000). Structure and function of sphingolipidand
cholesterol-rich membrane rafts. J. Biol. Chem. 275, 17221–17224.
Buede, R., Rinker-Schaffer, C., Pinto, W. J., Lester, R. L., and Dickson, R. C.
(1991). Cloning and characterization of LCB1, a Saccharomyces gene required
for biosynthesis of the long-chain base component of sphingolipids. J. Bacteriol.
173, 4325–4332.
Chen, Z., and Rand, R. P. (1997). The influence of cholesterol on phospholipid
membrane curvature and bending elasticity. Biophys. J. 73, 267–276.
Daum, G., Lees, N. D., Bard, M., and Dickson, R. (1998). Biochemistry, cell
biology and molecular biology of lipids of Saccharomyces cerevisiae. Yeast 14,
1471–1510.
de Kroon, A.I.P.M. (2007). Metabolism of phosphatidylcholine and its implications
for lipid acyl chain composition in Saccharomyces cerevisiae. Biochim.
Biophys. Acta 1771, 343–352.
820
DeWitt, N. D., dos Santos, C.F.T., Allen, K. E., and Slayman, C. W. (1998).
Phosphorylation region of the yeast plasma-membrane H-ATPase. role in
protein folding and biogenesis. J. Biol. Chem. 273, 21744–21751.
Dickson, R. C., Sumanasekera, C., and Lester, R. L. (2006). Functions and
metabolism of sphingolipids in Saccharomyces cerevisiae. Prog. Lipid Res. 45,
447–465.
Dupre, S., and Haguenauer-Tsapis, R. (2003). Raft partitioning of the yeast
uracil permease during trafficking along the endocytic pathway. Traffic 4,
83–96.
Dupre, S., Urban-Grimal, D., and Haguenauer-Tsapis, R. (2004). Ubiquitin
and endocytic internalization in yeast and animal cells. Biochim. Biophys.
Acta 1695, 89–111.
Epand, R. M., Epand, R. F., Hughes, D. W., Sayer, B. G., Borochov, N., Bach,
D., and Wachtel, E. (2005). Phosphatidylcholine structure determines cholesterol
solubility and lipid polymorphism. Chem. Physics Lipids 135, 39–53.
Epand, R. M., Hughes, D. W., Sayer, B. G., Borochov, N., Bach, D., and
Wachtel, E. (2003). Novel properties of cholesterol-dioleoylphosphatidylcholine
mixtures. Biochim. Biophys. Acta 1616, 196–208.
Ferreira, T., Mason, A. B., Pypaert, M., Allen, K. E., and Slayman, C. W. (2002).
Quality control in the yeast secretory pathway. A misfolded PMA1 H-
ATPase reveals two checkpoints. J. Biol. Chem. 277, 21027–21040.
Ferreira, T., Regnacq, M., Alimardani, P., Moreau-Vauzelle, C., and Berges, T.
(2004). Lipid dynamics in yeast under haem-induced unsaturated fatty acid
and / or sterol depletion. Biochem. J. 378, 899–908.
Folch, J., Lees, M., and Stanley, G.H.S. (1957). A simple method for the
isolation and purification of total lipides from animal tissues. J. Biol. Chem.
226, 497–509.
Gabriely, G., Kama, R., and Gerst, J. E. (2007). Involvement of specific COPI
subunits in protein sorting from the late endosome to the vacuole in yeast.
Mol. Cell. Biol. 27, 526–540.
Gaigg, B., Timischl, B., Corbino, L., and Schneiter, R. (2005). Synthesis of
sphingolipids with very long chain fatty acids but not ergosterol is required
for routing of newly synthesized plasma membrane ATPase to the cell surface
of yeast. J. Biol. Chem. 280, 22515–22522.
Gaigg, B., Toulmay, A., and Schneiter, R. (2006). Very long-chain fatty acidcontaining
lipids rather than sphingolipids per se are required for raft association
and stable surface transport of newly synthesized plasma membrane
ATPase in yeast. J. Biol. Chem. 281, 34135–34145.
Grossmann, G., Opekarova, M., Malinsky, J., Weig-Meckl, I., and Tanner, W.
(2007). Membrane potential governs lateral segregation of plasma membrane
proteins and lipids in yeast. EMBO J. 26, 1–8.
Hearn, J. D., Lester, R. L., and Dickson, R. C. (2003). The uracil transporter
Fur4p associates with lipid rafts. J. Biol. Chem. 278, 3679–3686.
Hein, C., Springael, J. Y., Volland, C., Haguenauer-Tsapis, R., and Andre, B.
(1995). NPl1, an essential yeast gene involved in induced degradation of Gap1
and Fur4 permeases, encodes the Rsp5 ubiquitin-protein ligase. Mol. Microbiol.
18, 77–87.
Helms, J. B., and Zurzolo, C. (2004). Lipids as targeting signals: lipid rafts and
intracellular trafficking. Traffic 5, 247–254.
Henneberry, A. L., Lagace, T. A., Ridgway, N. D., and McMaster, C. R. (2001).
Phosphatidylcholine synthesis influences the diacylglycerol homeostasis required
for SEC14p-dependent Golgi function and cell growth. Mol. Biol. Cell
12, 511–520.
Hoekstra, D., and van IJzendoorn, S. C. (2000). Lipid trafficking and sorting:
how cholesterol is filling gaps. Curr. Opin. Cell Biol. 12, 496–502.
Jacobson, K., Mouritsen, O. G., and Anderson, R.G.W. (2007). Lipid rafts: at a
crossroad between cell biology and physics. Nat. Cell. Biol. 9, 7–14.
Kaliszewski, P., Ferreira, T., Gajewska, B., Szkopinska, A., Berges, T., and
Zoladek, T. (2006). Enhanced levels of Pis1p (phosphatidylinositol synthase)
improve the growth of Saccharomyces cerevisiae cells deficient in Rsp5 ubiquitin
ligase. Biochem. J. 395, 173–181.
Katzmann, D. J., Odorizzi, G., and Emr, S. D. (2002). Receptor downregulation
and multivesicular-body sorting. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 893–905.
Katzmann, D. J., Sarkar, S., Chu, T., Audhya, A., and Emr, S. D. (2004).
Multivesicular body sorting: ubiquitin ligase Rsp5 is required for the modification
and sorting of carboxypeptidase S. Mol. Biol. Cell 15, 468–480.
Lauwers, E., and Andre, B. (2006). Association of yeast transporters with
detergent-resistant membranes correlates with their cell-surface location.
Traffic 7, 1045–1059.
Lee, A. G. (2003). Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural
perspective. Biochim. Biophys. Acta 1612, 1–40.
Molecular Biology of the Cell

Lee, M. C., Hamamoto, S., and Schekman, R. (2002). Ceramide biosynthesis is
required for the formation of oligomeric H-ATPase, Pma1p, in the yeast
endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 11, 22395–22401.
London, E. (2005). How principles of domain formation in model membranes
may explain ambiguities concerning lipid raft formation in cells. Biochim.
Biophys. Acta 1746, 203–220.
Malinska, K., Malinsky, J., Opekarova, M., and Tanner, W. (2003). Visualization
of protein compartmentation within the plasma membrane of living yeast
cells. Mol. Biol. Cell 14, 4427–4436.
Malinska, K., Malinsky, J., Opekarova, M., and Tanner, W. (2004). Distribution
of Can1p into stable domains reflects lateral protein segregation within the
plasma membrane of living S. cerevisiae cells. J. Cell Sci. 117, 6031–6041.
Marchal, C., Dupre, S., and Urban-Grimal, D. (2002). Casein kinase I controls
a late step in the endocytic trafficking of yeast uracil permease. J. Cell Sci. 115,
217–226.
Morvan, J., Froissard, M., Haguenauer-Tsapis, R., and Urban-Grimal, D.
(2004). The ubiquitin ligase Rsp5p is required for modification and sorting of
membrane proteins into multivesicular bodies. Traffic 5, 383–392.
Munn, A. L., Heese-Peck, A., Stevenson, B. J., Pichler, H., and Riezman, H.
(1999). Specific sterols required for the internalization step of endocytosis in
yeast. Mol. Biol. Cell 10, 3943–3957.
Munro, S. (2003). Lipid rafts: elusive or illusive? Cell 115, 377–388.
Opekarova, M., Malinska, K., Novakova, L., and Tanner, W. (2005). Differential
effect of phosphatidylethanolamine depletion on raft proteins: further
evidence for diversity of rafts in Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys.
Acta 1711, 87–95.
Opekarova, M., Robl, I., and Tanner, W. (2002). Phosphatidyl ethanolamine is
essential for targeting the arginine transporter Can1p to the plasma membrane
of yeast. Biochim. Biophys. Acta 1564, 9–13.
Pizzirusso, M., and Chang, A. (2004). Ubiquitin-mediated targeting of a
mutant plasma membrane ATPase, Pma1–7, to the endosomal/vacuolar system
in yeast. Mol. Biol. Cell 15, 2401–2409.
Robl, I., Grassl, R., Tanner, W., and Opekarova, M. (2001). Construction of
phosphatidylethanolamine-less strain of Saccharomyces cerevisiae. Effect on
amino acid transport. Yeast 18, 251–260.
Schneiter, R. et al. (1999). Electrospray ionization tandem mass spectrometry
(ESI-MS/MS) analysis of the lipid molecular species composition of yeast
subcellular membranes reveals acyl chain-based sorting/remodeling of dis-
Lipid-mediated Quality Control in Yeast
tinct molecular species en route to the plasma membrane. J. Cell Biol. 146,
741–754.
Storey, M. K., Clay, K. L., Kutateladze, T., Murphy, R. C., Overduin, M., and
Voelker, D. R. (2001). Phosphatidylethanolamine has an essential role in
Saccharomyces cerevisiae that is independent of its ability to form hexagonal
phase structures. J. Biol. Chem. 276, 48539–48548.
Suutari, M., Rintamaki, A., and Laakso, S. (1997). Membrane phospholipids in
temperature adaptation of Candida utilis: alterations in fatty acid chain length
and unsaturation. J. Lipid Res. 38, 790–794.
Tenchov, B. G., MacDonald, R. C., and Siegel, D. P. (2006). Cubic phases in
phosphatidylcholine-cholesterol mixtures: cholesterol as membrane “Fusogen.”
Biophys. J. 91, 2508–2516.
Umebayashi, K., and Nakano, A. (2003). Ergosterol is required for targeting of
tryptophan permease to the yeast plasma membrane. J. Cell Biol. 161, 1117–
1131.
Valdez-Taubas, J., and Pelham, H. R. (2003). Slow diffusion of proteins in the
yeast plasma membrane allows polarity to be maintained by endocytic cycling.
Curr. Biol. 13, 1636–1640.
van den Brink-van der Laan, E., Antoinette Killian, J., and de Kruijff, B. (2004).
Nonbilayer lipids affect peripheral and integral membrane proteins via
changes in the lateral pressure profile. Biochim. Biophys. Acta 1666, 275–288.
Verdiere, J., Gaisne, M., and Labbe-Bois, R. (1991). CYP1 (HAP1) is a determinant
effector of alternative expression of heme-dependent transcribed
genes in yeast. Mol. Gen. Genet. 228, 300–306.
Vida, T. A., and Emr, S. D. (1995). A new vital stain for visualizing vacuolar
membrane dynamics and endocytosis in yeast. J. Cell Biol. 128, 779–792.
Volland, C., Urban-Grimal, D., Geraud, G., and Haguenauer-Tsapis, R. (1994).
Endocytosis and degradation of the yeast uracil permease under adverse
conditions. J. Biol. Chem. 269, 9833–9841.
Wang, Q., and Chang, A. (2002). Sphingoid base synthesis is required for
oligomerization and cell surface stability of the yeast plasma membrane
ATPase, Pma1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 20, 12853–12858.
Woolford, C. A., Daniels, L. B., Park, F. J., Jones, E. W., Van Arsdell, J. N., and
Innis, M. A. (1986). The PEP4 gene encodes an aspartyl protease implicated in
the posttranslational regulation of Saccharomyces cerevisiae vacuolar hydrolases.
Mol. Cell. Biol. 6, 2500–2510.
Vol. 19, March 2008 821

E07-06-0600 Ferreira
Figure S1 : Quantification of Fur4p-GFP amounts under aerobic-like and lipiddepleted
conditions.
hem1Δ [pFl38gF-GFP] cells were grown to late exponential phase in YPRaff + ALA and shifted to fresh
YPRaff (lipid-depleted) or YPRaff + ALA (aerobic-like). Fur4p-GFP synthesis was induced by adding
galactose (4 % final) to the medium after 7 h following shift. (A) Total proteins were extracted from
cells at the time indicated following Fur4p-GFP induction and the same amounts of total protein were
subjected to SDS-PAGE and Western blot analysis using an anti-Pma1p antibody or an anti-GFP
antibody for Fur4p-GFP detection. (B) The intensities of the bands corresponding to Fur4p-GFP under
the conditions and times indicated have been quantified using the Scion image software. A. U.: Arbitrary
Units.

A
Pma1p
Fur4p-GFP
B
Relative intensity of Fur4p-GFP signal
(A. U.)
15000
12500
10000
7500
5000
2500
Aerobic-like
Lipid-depleted
Figure S1
0’ 30’ 60’ 90’ 120’
0’ 30’ 60’ 90’ 120’
0
0 20 40 60 80 100 120
Time (min)
0’ 30’ 60’ 90’ 120’
0’ 30’ 60’ 90’ 120’

Résultats complémentaires de la
première publication :
Impacts du niveau d’hydroxylation des sphingolipides sur la
biogenèse de Fur4p
Dans cette partie, nous allons développer des résultats complémentaires concernant la
connexion entre les sphingolipides, et plus précisément leur niveau d’hydroxylation, et la
biogenèse de Fur4p.
Les sphingolipides, outre leurs effets sur certains paramètres biophysiques des
membranes biologiques (voir plus loin), ont également un rôle en tant que messagers
secondaires dans la régulation de certaines voies de signalisation. Ils ont été référencés,
notamment leur partie « Base à Longue Chaîne » (LCB, voir plus bas), comme étant des
molécules « signal » pour la régulation de la croissance cellulaire, la réponse aux chocs
thermiques, la synthèse et la réparation des parois cellulaires, l’endocytose et la dynamique du
cytosquelette d’actine en réponse aux stress (pour référence voir (Dickson et al., 2006;
Dickson, 2008)). Les sphingolipides sont également impliqués dans le trafic des protéines et
notamment l’exocytose, la formation des rafts lipidiques (voir Introduction, chapitre I]),
l’homéostasie calcique, le vieillissement cellulaire, l’entrée de nutriments dans la cellule, la
régulation de la voie de biosynthèse des stérols et l’action de certains agents antifongiques
(pour revue, voir (Dickson et al., 2006; Dickson, 2008)).
Un sphingolipide est composé de trois éléments : une Base à Longue Chaîne (LCB),
un acide gras à très longue chaîne et une tête polaire. Il existe deux types de LCB, la dihydro
sphingosine (DHS) et son dérivé hydroxylé au niveau du carbone 4, la phytosphingosine
(PHS) (Figure 19). Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, l’acide gras présente
généralement une chaîne carbonée saturée à 26 atomes de carbone (C26). Elle peut,
cependant, contenir 0, 1 ou 2 groupements hydroxyles comme nous allons le voir plus loin.
La voie de biosynthèse des sphingolipides est une voie complexe (Figure 18). Elle
commence dans le Réticulum Endoplasmique où la sérine palmitoyltransférase catalyse la
condensation d’une sérine avec un acyl-CoA (il s’agit d’un palmitoyl CoA, chez la levure)
109

pour former la 3-cétodihydrosphingosine (ou cétosphinganine), qui sera ensuite réduite en
DHS. La dihydrosphingosine peut alors subir deux modifications : soit un acide gras C26 est
lié au niveau du C2 de la LCB pour former un dihydrocéramide (céramide A ; Figure 18 et
19), par l’intervention de la céramide synthase ; soit la DHS est hydroxylée au niveau de son
C4 par la protéine Sur2p pour donner une phytosphingosine (PHS), un C26 venant ensuite se
fixer sur la PHS (toujours par la céramide synthase) pour former un phytocéramide
(céramide B ; Figure 18 et 19). A partir du dihydrocéramide (céramide A), on peut obtenir un
phytocéramide (céramide B) par hydroxylation de la LCB par Sur2p, mais également un
céramide B’ par hydroxylation de l’acide gras à très longue chaîne par Scs7p. Le céramide B
pourra également subir un ou deux évènements d’hydroxylation sur son acide gras à très
longue chaîne, successivement par Scs7p et Ccc2p, en donnant respectivement le céramide C
et le céramide D (Figure 18 et 19). Ces céramides migrent ensuite jusqu’à l’appareil de Golgi
où ils subissent l’addition d’une tête polaire. Ce transport entre le RE et l’appareil de Golgi a
été décrit comme pouvant être vésiculaire ou non vésiculaire (Funato and Riezman, 2001).
Après avoir subi un évènement de flip flap lui permettant de passer du feuillet externe au
feuillet interne de la membrane de l’appareil de Golgi, le céramide subit l’addition d’un
groupement inositol phosphate au niveau du C1 de la LCB, groupement provenant d’un
phospholipide particulier chez la levure, le phophatidylinositol. Ainsi est formé l’Inositol
Phosphocéramide (IPC) (Figure 18). Le second sphingolipide complexe est le mannose-
inositol-phosphoceramide (MIPC), qui est obtenu par le transfert d’un mannose du GDP-
mannose sur l’inositol de l’IPC (Figure 18). Enfin, le troisième et le plus complexe des
sphingolipides chez la levure est le mannose-(inositol-P)2-céramide (M(IP)2C), qui résulte de
l’addition d’un second groupement inositol phosphate sur le mannose du MIPC (Figure 18).
L’hydroxylation de ces sphingolipides a une importance primordiale dans
l’établissement de certaines propriétés biophysiques des membranes biologiques et régule, en
conséquence, différentes voies de signalisation. Par exemple, il a été montré que le taux
d’hydroxylation des sphingolipides est significativement plus élevé dans les carcinomes
humains. En effet, l’accumulation de céramides non hydroxylées au niveau du C4 (dérivant
des céramides A et B’) a été directement reliée à l’induction de l’apoptose (qui est dite, dans
ce cas précis, céramide-dépendante) (Hannun and Luberto, 2000). Dans le cas d’un
carcinome, leur taux diminue (du fait de l’augmentation du taux d’hydroxylation), conduisant
à une inhibition de l’apoptose pouvant alors favoriser une prolifération des cellules malignes
(Hakomori et al., 1984).
110

Figure 18 : Voie de biosynthèse des sphingolipides
111
Réticulum
endoplasmique
Appareil de
Golgi
Schéma simplifié des différentes étapes de la voie de biosynthèse des sphingolipides chez la levure
Saccharomyces cerevisiae. Voir le texte pour les détails.
D’après Kolaczkowski et al. (Kolaczkowski et al., 2004).

Figure 19 : L'hydroxylation des sphingolipides
Les sphingolipides sont constitués de la « fusion » d’une base à longue chaîne (LCB : dihydrosphingosine ou
phytosphingosine) avec un acide gras à très longue chaîne, en une étape catalysée par une céramide synthase. La
protéine Sur2p est responsable de l’hydroxylation de la sphingosine au niveau du C4, pour donner la
phytosphingosine. Lorsque Sur2p est inactivée, la levure n’est capable de synthétiser que des sphingolipides
complexes contenant des céramide A ou B’. La protéine Scs7p est, quant à elle, responsable de l’hydroxylation
de l’acide gras à très longue chaîne au niveau de son C2. Il est à noter que Sur2p peut également hydroxyler la
LCB du Céramide A, donnant ainsi un Céramide B (cette étape n’apparaît pas sur le schéma).
D’après Swain et al (Swain et al., 2002).
112

Il a également été démontré que le niveau d’hydroxylation des sphingolipides pouvait
directement impacter sur la formation des rafts lipidiques (Brown, 1998). En effet,
l’hydroxylation en C4 des sphingolipides contribue à leur capacité à élaborer des liaisons
hydrogènes entre eux, favorisant leur agrégation, et par conséquent la formation des domaines
liquid ordered (rafts) dans les membranes biologiques (Brown, 1998).
La carence en acides gras insaturés entraîne une diminution du niveau
d’hydroxylation des sphingolipides
Dans le cadre de ce travail, nous avons été amenés à nous intéresser aux
sphingolipides du fait, en particulier, que l’adressage à la membrane plasmique de Pma1p
avait été démontré comme intimement lié à ces molécules (Gaigg et al., 2005a; Gaigg et al.,
2006). Plus spécifiquement, l’équipe de Roger Schneiter de l’Université de Fribourg avait
démontré, avant que nous ne commencions notre étude, que la longueur de l’acide gras à très
longue chaîne des sphingolipides était un élément déterminant pour la stabilité de Pma1p à la
surface cellulaire. Sachant, comme nous venons de le développer dans la partie précédente,
que des acides gras à chaîne courte tendent à s’accumuler dans les phospholipides dans nos
conditions de carence en AGIs, il semblait donc raisonnable d’évaluer si, de la même façon, la
longueur moyenne des acides gras des sphingolipides pouvait être diminuée dans ces
conditions, pouvant rendre compte, au moins en partie, du réadressage de Fur4p-GFP vers la
vacuole. Dans ce contexte, nous avons donc analysé le contenu en sphingolipides des cellules
hem1Δ cultivées dans les différentes conditions de croissance, par spectrométrie de masse en
mode négatif (Matériels et Méthodes, Figure p1-8). Dans ces conditions, les formes IPC
peuvent être visualisées (Figure p1-8). Chez la levure, les formes IPC majoritaires sont IPC-
B/B’ et IPC-C, de rapport m/z 936 et 952 Da, respectivement, qui correspondent à des espèces
contenant un acide gras à 26 atomes de carbone. Comme on peut l’observer sur la Figure p1-
8, ces deux formes sont détectées quelles que soient les conditions de culture. De plus, aucune
espèce correspondant à des IPC constitués d’acides gras à chaîne plus courte n’est détectée
dans les conditions de carence en AGIs (Figure p1-8 ; Lipid-depleted et + Erg). Cette
expérience nous a donc permis de démontrer que l’adressage direct de Fur4p-GFP vers la
vacuole ne pouvait pas être expliqué par un raccourcissement des chaînes d’acides gras des
sphingolipides. Néanmoins, nous avons pu observer dans cette expérience que l’intensité
relative des pics de rapport m/z 936 et 952 Da variait en fonction des conditions. Le pic de
m/z 936 correspond aux IPC portant deux hydroxylations (soit sur la LCB et l’acide gras à
113

très longue chaîne (IPC-B’), soit uniquement sur la LCB (IPC-B) ; Figure 18 et 19) et le pic à
m/z 952, à l’espèce IPC-C possédant une hydroxylation de plus (2 sur la LCB et une sur
l’acide gras à très longue chaîne ; Figure 18 et 19). Il est important de préciser que la présente
analyse ne nous permet pas de discriminer entre les espèces IPC-B et IPC-B’. Nous
engloberons donc, dans ce qui suit, ces deux espèces sous la dénomination IPC-B (B’). Les
rapports entre le pic correspondant à l’IPC-C et celui correspondant à l’IPC-B (B’) dans les
différentes conditions de culture ont été calculés d’après les spectres de masse présentés sur la
Figure p1-8 (Figure 20A). Sur cette Figure, on peut constater que dans les deux conditions de
carence en AGIs (Lipid depleted, Erg), le rapport IPC-C/IPC-B(B’) est significativement
diminué par rapport aux conditions dans lesquelles les AGIs sont synthétisés de façon
endogène (Aerobic-like), ou importés du milieu extérieur (Ole et Erg + Ole). Il apparaît donc
d’après ces résultats que la diminution du taux d’insaturation des acides gras provoque
l’accumulation de formes hypo-hydroxylées des sphingolipides.
La diminution du taux d’hydroxylation des sphingolipides n’altère pas
l’association de nos protéines modèles aux rafts lipidiques
La carence en acides gras insaturés semble donc s’accompagner d’une augmentation
de la population sphingolipidique peu hydroxylée. Or, comme nous l’avons évoqué plus haut,
l’hydroxylation des sphingolipides est impliquée dans certaines propriétés des DRM/rafts
lipidiques (Brown, 1998; Idkowiak-Baldys et al., 2004). Nous avons donc évalué si
l’association de nos protéines intégrées modèles Fur4p et Pma1p à ces domaines était affectée
dans les conditions de carence en acides gras insaturés (Figure 20B et 20C). Comme montré
sur les Figures 20B et 20C, le profil d’association aux DRM est similaire, quelles que soient
les conditions testées, que l’on soit en carence en AGIs (YPD + Erg), ou non (YPD + Ole ;
YPD + Erg + Ole), la majorité de la population de Fur4p-GFP étant détectée dans les fractions
solubles (fractions 4 à 6). Le taux d’hydroxylation des sphingolipides ne semble donc pas être
un élément déterminant pour l’association de Fur4p-GFP au sein des DRM dans nos
conditions. La protéine Pma1p a également un profil d’association similaire dans toutes les
conditions (Figure 20C), rejoignant ainsi les résultats obtenus par Idkowiak-Baldys et al.
(Idkowiak-Baldys et al., 2004) avec une souche délétée pour SUR2, gène codant pour la
sphinganine C4-hydroxylase, responsable de l’hydroxylation des DHS (Figure 19).
114

A/
B/
Fur4p-GFP
Pma1p
C/
%
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
IPC-C/IPC-B (ou B')
Aerobic-like Lipid-depleted + Erg + Ole + Erg + Ole
+ Erg + Ole
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
+ Erg
+ Ole
+ Erg + Ole
1 2 3 4 5 6
Fur4p
%
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Pma1p
+Erg + Ole
1 2 3 4 5 6
115
1 2 3 4 5 6
+ Erg
+ Ole
+ Erg + Ole
1 2 3 4 5 6
Figure 20 : Impacts de la carence en acides gras insaturés sur l’association aux DRM de nos protéines
modèles
A/ Les rapports des IPC-C/IPC B (ou B’) ont été calculés dans les différentes conditions à partir des données
obtenues par spectrométrie de masse en mode négatif, présentées dans la Figure p1-8. B/ La souche hem1Δ,
sec7 ts [pFl38gF-GFP] a été cultivée dans les conditions indiquées pendant 7h avant induction de la synthèse de
Fur4p-GFP par addition de galactose et transfert à température non-permissive (37°C). Après 2 h dans ces
conditions, les lysats cellulaires ont été soumis à une extraction au Triton X-100 et à une séparation sur gradient
de densité Optiprep TM , comme décrit dans la partie « Matériels et Méthodes ». Six fractions ont été collectées
depuis le haut du gradient (fractions 1 à 6), et les protéines ont été précipitées au TCA avant analyse par Western
Blot à l’aide d’anticorps anti-GFP et anti Pma1p. Les fractions 1 à 3 correspondent aux DRM. C/ L’intensité des
bandes obtenues en B dans les diffréntes fractions, et correspondant à Fur4p-GFP ou Pma1p, a été quantifiée en
utilisant le logiciel ImageJ. Les résultats sont exprimés en %.

La diminution du taux d’hydroxylation des sphingolipides n’abolit pas
l’adressage de Fur4p à la membrane plasmique
Si une baisse du taux d’hydroxylation des sphingolipides ne modifie pas l’association
de Fur4p avec les DRM, il a néanmoins été démontré que l’absence totale d’hydroxylation en
C4 dans une souche sur2Δ provoquait un changement des propriétés physiques et structurelles
de ces DRM (Idkowiak-Baldys et al., 2004). Plus spécifiquement, dans une souche sur2Δ, ces
domaines forment des fragments membranaires linéaires à la différence des DRMs obtenus à
partir d’une souche sauvage qui présentent, dans ce cas, un aspect courbé, voire vésiculaire
(Idkowiak-Baldys et al., 2004).
Nous nous sommes demandés si de telles modifications structurelles pouvaient
interférer sur l’adressage de Fur4p. Pour ceci, nous avons donc réalisé l’étude de l’adressage
de Fur4p-GFP dans une souche sur2Δ. Dans cette souche, on observe plus spécifiquement une
diminution des sphingolipides dérivés de la PHS, au profit des espèces provenant de la DHS
(Figure 21A, (Idkowiak-Baldys et al., 2004)). Cette même expérience a été réalisée dans la
souche mutée pour le gène SCS7, dans laquelle l’espèce IPC-C est complètement absente
(Figure 21B, (Guan and Wenk, 2006)). Il est important de préciser que le blocage de
l’hydroxylation est total dans ces souches, alors que ce phénotype est très discret dans nos
conditions de carence en AGIs. Comme on peut le constater sur la Figure 22, dans la souche
sur2Δ, comme dans la souche scs7Δ, Fur4p-GFP est détectée à la membrane plasmique et
dans des structures intracellulaires, selon un profil très similaire à ce qui peut être observé
dans la souche Y10000 sauvage de référence, avec cependant un marquage périphérique
moins intense pour les souches affectées dans l’étape d’hydroxylation (Figure 22). Nous
pouvons donc conclure de ces expériences que l’inhibition complète des étapes
d’hydroxylation n’abolit pas l’adressage de Fur4p-GFP à la membrane plasmique. Ces
résultats ont été confirmés dans une souche sur2Δ, end3Δ. Dans une telle souche, en effet, le
blocage de l’endocytose résulte en une intensité plus forte du marquage périphérique associé à
Fur4p-GFP que dans la souche sur2 Δ (Figure 22). L’ensemble de ces résultats suggère donc
que le réadressage complet de Fur4p-GFP vers la voie endosomale dans les conditions de
carence en AGIs (Figure 22) ne peut être, du moins intégralement, expliquée par la faible
baisse du niveau d’hydroxylation des sphingolipides dans ces conditions (Figure 20).
116

A /
B /
sur2ΔΔΔΔ sur2ΔΔΔΔ
Cellules
totales
Souche
sauvage
Cellules
DRM DRM
totales
Souche
sauvage
m/z
Figure 21 : Profil sphingolipidiques dans les mutants sur2Δ et scs7Δ
scs7ΔΔΔΔ scs7ΔΔΔΔ
A / Autoradiographie révélant les espèces sphingolipidiques (préalablement séparées par chromatographie sur
couche mince) obtenues à partir d’une souche de levure sauvage et d’une souche délétée pour le gène SUR2
(sur2Δ). Les auteurs ont évalué les quantités relatives des différents sphingolipides dans des cellules totales ou
au sein des DRM. IPC A, B, B ′ , C, D : Inositol PhosphoCeramides ; MIPC A, B, B ′ , C : Mannosyl Inositol
PhosphoCeramides ; M(IP)2C A, B, B ′ , C : Mannosyl diInositol PhosphoCeramides. On peut constater la forte
diminution des espèces hydroxylées dans la souche sur2Δ (Idkowiak-Baldys et al., 2004). B / Spectres de masse
obtenus à partir d’une souche sauvage et une souche délétée pour le gène SCS7 (scs7Δ). On constate, au niveau
des IPC l’apparition d’un pic de forte intensité à m/z 936 (IPC-B/B’) dans la souche mutante, au détriment du pic
à m/z 952 (IPC-C), qui est majoritaire dans la souche sauvage (Guan and Wenk, 2006).
m/z
117

Néanmoins, nous nous sommes interrogés sur l’origine du marquage intracellulaire
observé dans la souche sur2Δ, end3Δ (Figure 22). Pour expliquer ce marquage, deux
hypothèses peuvent être envisagées : soit la diminution du taux d’hydroxylation des
sphingolipides provoque un ralentissement du trafic de Fur4p-GFP en route vers la membrane
plasmique (et sa rétention transitoire dans un ou plusieurs organites de la voie de sécrétion),
soit elle résulte en un réadressage d’une partie de la population Fur4p-GFP depuis une
organelle intracellulaire vers la vacuole pour dégradation. Dans le contexte que nous venons
d’évoquer, nous pouvons notamment imaginer qu’une partie de la population soit prise en
charge par le CQG. Si nos résultats actuels ne nous permettent pas de discriminer entre ces
deux hypothèses, nous pouvons néanmoins imaginer quelques expériences complémentaires.
Pour évaluer si Fur4p-GFP est adressée en partie vers la vacuole pour dégradation, nous
pourrons avoir recours à un triple mutant affecté dans les étapes d’hydroxylation,
d’endocytose et de dégradation vacuolaire (sur2Δ, end3Δ, pep4Δ). En effet, dans un tel
mutant, en cas de dégradation de Fur4p-GFP dans le lumen de la vacuole, nous devrions
visualiser l’accumulation du signal GFP dans cette organelle. Si tel est le cas, nous pourrons
alors déterminer si le réadressage vers la voie endosomale s’effectue à partir de l’appareil de
Golgi en effectuant les mêmes expériences dans un triple mutant sur2Δ, end3Δ, sec7 ts . Si
aucun signal associé à la GFP n’est détecté dans la vacuole dans ce cas, cela confirmera
qu’une partie de la population Fur4p-GFP est effectivement prise en charge par le CQG
lorsque l’étape d’hydroxylation des sphingolipides est totalement inhibée.
Quoi qu’il en soit, l’ensemble des résultats rapportés dans ce chapitre suggère que le
niveau d’hydroxylation des sphingolipides joue effectivement un rôle dans la régulation de la
biogenèse de Fur4p-GFP, que ce soit en terme de délai de transit ou de réadressage d’une
partie de la population.
L’étude des mécanismes moléculaires sera l’objet d’une étude plus approfondie dans
les mois à venir par un étudiant en M2R.
118

Y10000
sur2Δ sur2Δ
scs7Δ scs7Δ
sur2Δ,end3Δ
sur2Δ,end3Δ
Fur4p-GFP Transmission
Figure 22 : Effet de l'hydroxylation des sphingolipides sur l'adressage de Fur4p-GFP
Les différentes souches utilisées ont été transformées par le plasmide pFl38gfGFP, cultivées dans un milieu
contenant du galactose comme source de carbone durant 16 heures, puis observées par microscopie confocale
comme indiqué dans la partie « Matériels et Méthodes ».
119

120

Chapitre II : Impacts de perturbations
de l’homéostasie lipidique sur la
fonctionnalité du Réticulum
Endoplasmique
121

122

L’augmentation de la quantité d’acides gras saturés (AGS) au sein de phopholipides a
donc comme conséquence un réadressage de Fur4p depuis l’appareil de Golgi vers la voie
endosomale.
Comme nous l’avons déjà évoqué dans l’introduction, il a également été montré dans
plusieurs modèles de cellules de mammifères que l’accumulation intracellulaire d’AGS
pouvait avoir des impacts sur l’intégrité des organelles, et en particulier sur la fonctionnalité
du RE. Plus spécifiquement, les AGS entraînent le déclenchement d’un processus, appelé
stress du RE, qui résulte dans l’induction de la réponse UPR (Introduction, chapitre II] A] 2]
a)) et finalement en une mort cellulaire par lipoapoptose (Karaskov et al., 2006; Cunha et al.,
2008). Ce mécanisme pourrait être impliqué dans l’étiologie de plusieurs pathologies, comme
le diabète de type II que l’on rencontre chez certains patients souffrant d’obésité. L’exposition
chronique des cellules β du pancréas aux AGS de l’alimentation pourrait rendre compte de
l’insulino-résistance observée dans ces conditions (Ozcan et al., 2004).
Nous avons donc voulu évaluer si l’accumulation d’AGS pouvait provoquer le même
type de conséquences chez notre organisme modèle. Pour mesurer ce phénomène, nous avons
utilisé des souches de levures transformées avec le plasmide centromérique pJC104 (Cox and
Walter, 1996a). Ce plasmide contient le gène lacZ, codant pour la β-galactosidase, sous
contrôle de 4 séquences UPRE (Unfolded Protein Response Element) sur lequelles peut se lier
le facteur de transcription mature Hac1p (Introduction, chapitre II] A] 2] a) ; Figure 5). Ainsi,
dans des conditions où la réponse UPR est induite, l’intensité de cette réponse peut être
estimée par simple détermination de l’activité β-galactosidase. Comme pour le précédent
article, pour induire les modifications du contenu lipidique cellulaire, nous avons eu recours
en première instance à une souche hem1Δ cultivée sur les milieux répertoriés dans le
Tableau 3.
Nous allons faire, dans ce chapitre, référence à des figures provenant de la seconde
publication. Elles seront désignées sous l’appellation Figure p2, suivi du numéro
correspondant à la figure en question dans le manuscrit.
123

124

Résumé de la seconde publication :
Lipid-induced ER stress: synergistic effects of sterols and
saturated fatty acids
Article en révision dans la revue “Traffic”.
Ludovic Pineau, Jenny Colas, Sébastien Dupont, Laurent Beney, Jean-Marc Berjeaud,
Thierry Bergès et Thierry Ferreira
L’accumulation d’acides gras saturés provoque le déclenchement de l’Unfolded
Protein Response
Le premier résultat que nous avons obtenu est que dans la souche hem1Δ, la carence
en AGIs provoque un déclenchement de l’UPR, alors que ce n’est pas le cas en ce qui
concerne la carence en ergostérol (Figure p2-1). Cet effet a pu être confirmé dans une souche
de levure ole1Δ, délétée au niveau du gène codant pour la désaturase à acides gras Ole1p
(Figure p2-2). Dans une telle souche, la synthèse des acides gras insaturés est inhibée, et seul
l’apport exogène d’AGIs permet de restaurer la croissance des cellules. L’analyse du profil
phospholipidique par spectrométrie de masse dans cette souche a révélé que, de façon très
similaire à ce que nous avions observé avec la souche hem1Δ, la carence en AGIs résulte en
une accumulation de courtes chaînes d’acides gras saturées au sein des phospholipides (Figure
p2-2). Des expériences complémentaires (Figure p2-3) nous ont permis de démontrer que
c’était le niveau d’insaturation des chaînes d’acides gras des phospholipides et non leur
longueur qui était le paramètre déterminant pour le déclenchement de l’UPR.
Afin de nous approcher au plus près des conditions rencontrées dans des situations
pathologiques (où la source d’AGS provient de l’alimentation), nous avons ensuite évalué
l’effet de l’apport d’AGS exogènes sur le déclenchement de l’UPR. Comme montré dans la
Figure p2-4, dans notre modèle cellulaire, l’apport exogène d’AGS provoque effectivement
une réponse UPR, qui est d’autant plus importante que la concentration en AGS est élevée.
Une fois encore, une corrélation très forte existe entre l’intensité de la réponse UPR et le
niveau d’insaturation des phospholipides (Figure p2-4).
Le niveau d’insaturation des phospholipides influençant la fluidité membranaire, nous
avons alors postulé que ce paramètre biophysique pourrait directement réguler le
125

déclenchement de l’UPR dans nos conditions. En effet, il semblait raisonnable d’imaginer que
l’augmentation du niveau de saturation des phospholipides puisse provoquer une
augmentation de la rigidité membranaire au niveau du RE, conduisant à un
dysfonctionnement de cet organite, voire à une destructuration globale de son organisation.
Ce type de conséquence a d’ailleurs été rapporté dans un modèle de cellules murines par
Borradaile et al. en 2006 (Borradaile et al., 2006). L’accumulation d’AGS au sein des
phospholipides du RE ayant été vérifiée par spectrométrie de masse (Figure p2-6), nous avons
tenté d’évaluer le niveau de fluidité de ces membranes dans les conditions de déclenchement
de l’UPR, par l’utilisation de la sonde Laurdan (voir la partie Matériels et Méthodes, pour
plus de détails concernant cette sonde et son utilisation). De façon assez surprenante, nous
n’avons pas observé de modification globale de l’état de fluidité des membranes
microsomales entre des cellules non carencées et des cellules accumulant des AGS
(Figure p2-6). Ces expériences nous ont donc amenés à conclure qu’une augmentation globale
de l’ordre de la bicouche phospholipidique au sein du RE ne pouvait pas rendre compte, à
elle-seule, du déclenchement de l’UPR, comme cela avait été postulé dans plusieurs
études ( pour exemple, voir (Borradaile et al., 2006)). Ces résultats sont compatibles avec le
fait que dans nos conditions de carence en AGIs la fonctionnalité du RE est maintenue, au
moins si l’on en juge par le fait que la sécrétion d’une enzyme du périplasme, l’invertase,
ainsi que l’adressage à la membrane plasmique de Pma1p ne sont pas significativement
affectées dans ces conditions (Figure p2-S1). Néanmoins, le Laurdan ne permettant pas de
visualiser des modifications locales de fluidité, l’impact de telles perturbations n’a pas pu être
évalué.
Le 4-PBA, une molécule chaperonne, abolit le déclenchement de l’UPR
L’idée que des perturbations locales de l’environnement lipidique puissent rendre
compte du déclenchement de la réponse UPR dans nos conditions est renforcée par les
résultats que nous avons obtenus suite à une série d’expériences réalisées avec le 4-phényl
butyrate (4-PBA).
Comme évoqué dans l’introduction, l’environnement lipidique immédiat d’une
protéine joue un rôle primordial pour l’obtention de sa structure tridimensionnelle active. Par
exemple, la phase (et donc la fluidité relative) dans laquelle se trouve la bicouche peut
influencer la formation d’agrégats. Ainsi, il a été démontré que les protéines intégrées tendent
à s’agréger dans un environnement très structuré, rigide, comme les phases G (Lee, 2003b).
126

Afin d’évaluer si l’accumulation d’AGS pouvaient directement influencer le repliement de
certaines protéines, nous avons donc eu recours au 4-PBA. Cette molécule présente des
propriétés de chaperonne in vitro, en prévenant, en particulier les phénomènes d’agrégation
(Kubota et al., 2006; de Almeida et al., 2007). Comme il est possible de le voir sur la Figure
p2-8, le 4-PBA abolit complètement le déclenchement de l’UPR dans nos conditions (Figure
p2-8). L’hypothèse que nous favorisons donc pour l’instant est que l’augmentation du taux de
saturation des phospholipides impacte sur le repliement de certaines protéines et que c’est
l’accumulation de ces dernières qui constitue le signal d’induction de l’UPR. Néanmoins les
causes précises de ces perturbations restent à élucider. Si un effet de l’état de fluidité locale
sur les phénomènes d’agrégation semble une hypothèse raisonnable, on peut également
imaginer des effets plus spécifiques sur certains processus caractéristiques du RE, comme la
translocation des protéines, qui nécessitent une bicouche peu ordonnée. L’effet de la fluidité
sur le mécanisme de translocation a d’ailleurs été clairement démontré (Nilsson et al., 2001).
L’ergostérol agit en synergie avec les acides gras saturés sur le déclenchement de
l’UPR
Une autre observation importante de notre étude est que l’induction de l’UPR est
significativement plus importante dans des cellules accumulant des AGS lorsqu’elles sont
cultivées en présence d’ergostérol (Figure p2-1 : comparer YPD et Erg sur le panneau B). Ces
effets synergiques entre l’ergostérol et les AGS sur la réponse UPR sont en outre observables
que les AGS aient une origine endogène (par inhibition de l’étape de désaturation ; Figure
p2-1) ou exogène (Figure p2-4).
Un des phénomènes précoces de l’athérosclérose, est une accumulation intracellulaire
de cholestérol dans les macrophages, principalement au niveau du RE. Ce phénomène
provoque un stress du RE dans ces cellules, puis leur apoptose, ce qui serait à l’origine de la
progression des plaques athérosclérotiques (Introduction, IV] D] ; (Feng et al., 2003)). Nous
avons pu montrer dans nos cellules que l’ergostérol tend à s’accumuler dans les fractions
microsomales, et ceci de façon d’autant plus importante que le taux de saturation des
phospholipides est élevé (Figure p2-7). Il apparaît donc que l’ergostérol se trouve « piégé »
dans le RE dans les conditions d’accumulation en AGS, soit lorsque le contenu
phospholipidique de cette organelle est anormalement saturé. Il a été montré dans des
systèmes artificiels que le cholestérol présente une affinité plus élevé pour les phospholipides
saturés que pour les phopholipides portant une ou plusieurs insaturations dans leurs chaînes
127

d’acides gras (Brzustowicz et al., 2002; Epand et al., 2004). Pour rendre compte de nos
résultats, l’hypothèse que nous privilégions donc pour l’instant est que l’ergostérol pourrait
être retenu dans le RE pour un simple problème d’affinité relative pour les phospholipides
saturés qui s’accumulent en réponse à l’apport excessifs d’AGS.
Quoiqu’il en soit, cette observation est importante dans le contexte actuel, puisque
plusieurs études suggèrent qu’il pourrait exister un lien métabolique entre l’obésité et
l’athérosclérose (Stein and Stein, 2007). Les effets synergiques que nous rapportons
pourraient fournir un début d’explication à ce phénomène.
Dans cette étude, nous avons donc pu « reconstituer » dans notre système modèle le
stress du RE en réponse aux dérégulations de l’homéostasie lipidique. Ce travail ouvre de
nombreuses perspectives en particulier en ce qui concerne l’utilisation de la levure pour le
criblage à haut-débit de molécules thérapeutiques, dans le domaine des pathologies associées
au stress du RE.
128

Seconde Publication
129

130

Lipid-induced ER stress: synergistic effects of sterols and saturated fatty
acids
For Peer Review
Journal: Traffic
Manuscript ID: TRA-08-0283
Manuscript Type: Original Research Article
Date Submitted by the
Author: 03-Sep-2008
Complete List of Authors: Pineau, Ludovic; Université de Poitiers, FRE-CNRS 3091
Colas, Jenny; Université de Poitiers, FRE-CNRS 3091
Dupont, Sébastien; Université de Bourgogne, ENSBANA
Beney, Laurent; Université de Bourgogne, ENSBANA
Berjeaud, Jean-Marc; Université de Poitiers, UMR CNRS 6008
Bergès, Thierry; Université de Poitiers, FRE-CNRS 3091
Ferreira, Thierry; Université de Poitiers, FRE-CNRS 3091
Key Words:
Traffic
molecular chaperone , Unfolded Protein Response (UPR), quality
control , 4-phenyl butyrate , yeast, ER-stress, Sterol, phospholipid,
saturated fatty acids
10550 North Torrey Pines Road La Jolla, CA 92037 Telephone: 1 (858) 784-8661

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Lipid-induced ER stress: synergistic effects of sterols and saturated fatty acids
Ludovic Pineau 1 , Jenny Colas 1 , Sébastien Dupont 2 , Laurent Beney 2 , Jean-Marc Berjeaud 3 , Thierry
Bergès 1 and Thierry Ferreira 1*
1 Université de POITIERS, FRE CNRS 3091 “Physiologie moléculaire du Transport des Sucres
(PhyMoTS)” and 3 UMR CNRS 6008 “Microbiologie fondamentale et appliquée”, 40 avenue du
Recteur Pineau, 86022 Poitiers, France
2 « Laboratoire de Génie des Procédés Microbiologiques et Alimentaires », ENSBANA, 1, Esplanade
Érasme, Domaine Universitaire, 21000 Dijon, France
For Peer Review
Corresponding author: thierry.ferreira@univ-poitiers.fr
Abstract
Stress within the endoplasmic reticulum (ER)
induces a coordinated response, namely the
Unfolded Protein Response (UPR), devoted at
helping the ER to cope with the accumulation of
misfolded proteins. Dysfunction (or overwhelming)
of the UPR plays an important role in several human
diseases. Recent studies report that intracellular
accumulation of Saturated Fatty Acids (SFA) and
cholesterol, which are observed in high-occurrence
diseases such as obesity or atherosclerosis, result
in ER stress. In the present study, we evaluated the
impacts of perturbations of lipid homeostasis on ER-
stress/UPR induction in the model eukaryote
Saccharomyces cerevisiae. We show that SFA
originating from both endogenous (fatty acid
desaturation preclusion) or exogenous sources
(feeding with extracellular SFA) trigger ER-stress in
yeast and that ergosterol, its major sterol, acts
synergistically with SFA on this process. This latter
effect is connected to ergosterol accumulation within
microsomal fractions from SFA-accumulating cells,
which display highly saturated phospholipid content.
Moreover, treating the cells with the molecular
chaperone 4-phenyl butyrate abolishes UPR
induction, suggesting that lipid-induced ER-stress
results in misfolded protein overload, that acts, in
Traffic
turn, as the molecular signal of the UPR response.
The present data are discussed in the context of
human diseases related to lipid deregulations.
Introduction
Endoplasmic reticulum (ER) consists in a
network of intracellular membranes devoted to
crucial cellular functions, including lipid synthesis,
storage and regulated release of calcium, and
biosynthesis of proteins destined to intracellular
organelles or to the cell surface. ER is also the site
where secretory proteins are primarily assembled
and folded. Accordingly, eukaryotic cells have
developed quality control processes aimed at
evaluating the proper folding of ER-borne proteins,
a process that one generally refers to as “ER quality
control”. When the ER fails to cope with misfolded
or unfolded proteins, a complex cellular response,
called the Unfolded Protein Response (UPR), is
triggered (for recent reviews, see 1-3). UPR
provides multiple strategies to avoid ER stress and
help to maintain ER integrity and functionality of the
secretory pathway. In higher eukaryotes, UPR
consists in three distinct pathways controlled by
transmembrane proteins that act as sensors,
namely IRE1, PERK and ATF6. The IRE1 regulated
pathway is conserved from yeast to humans. In the
yeast Saccharomyces cerevisiae, accumulation of
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1

unfolded proteins results in the dimerization of
Ire1p, a process that activates its cytosolic
endoribonuclease function. Kar2p, an ER-resident
member of the HSP70 family, is an important
regulator of the UPR both in yeast and mammalian
cells (Kar2p mammalian orthologue is known as
BiP). In the current model, it is proposed that, in
non-stressed cells, Kar2p associates with Ire1p to
repress its activation. In response to accumulation
of unfolded proteins in the ER, Kar2p dissociates
from Ire1p, resulting in Ire1p dimerization and
subsequent activation of its endoribonucelase
For Peer Review
function (3). The substrate for Ire1p endonuclease
activity is the transcript of Hac1p (the yeast
orthologue of mammalian XBP1), a transcription
factor that binds to promoter UPR elements (UPRE)
and regulates the transcription of more than 380
genes in yeast, i. e. approximately 5% of total yeast
genes (4).
Failing to handle ER stress may ultimately
result in cell death (for reviews, see 5,6). Relevantly,
ER stress and subsequent UPR induction have
been observed in many human diseases including
cancer, diabetes, atherosclerosis and late-onset
neurological diseases, such as Alzheimer,
Huntington, Parkinson and familial amyotrophic
lateral sclerosis (1,7). However, if ER stress clearly
contributes to the aetiology of these disorders,
whether it is the direct cause of the disease
remains, in most cases, under debate.
The large diversity of ER-related human
pathologies also suggests that the origins of ER
stress may vary in kind. Particular attention has
recently been given to the impact of perturbations of
lipid homeostasis on this process. Indeed, ER-
stress has been reported in mammalian cells in
response to various lipotoxic conditions. More
specifically, ER-stress is induced under chronic non-
Traffic
esterified saturated fatty acid exposure in pancreatic
β-cells, a process that could account for insulin-
resistant Type 2 diabetes in obese individuals (8).
ER-stress in macrophages has also been reported
in response to free cholesterol accumulation in the
ER (9). This phenomenon has been considered as a
contributor to plaque destabilization in advanced
atherosclerotic lesions. Interestingly, cell transient
adaptation to these lipid-stress conditions requires a
functional UPR (8,10). Altogether, these
observations suggest that maintenance of lipid
homeostasis in the ER is an absolute requisite for
cell survival.
Unicellular organisms can experience
massive rearrangement of their lipid composition
when they are confronted to changes of their
environment. As an example, the yeast
Saccharomyces cerevisiae, as a facultative
anaerobe, can grow under low oxygen, but loses in
this case its ability to synthesise ergosterol, its
major sterol, and to desaturate its fatty acids. This is
due to the fact that several enzymes of the
ergosterol pathway and Ole1p, the fatty acid
desaturase (which is homologous to the mammalian
SCD1), require haem as their prosthetic group, the
synthesis of which is oxygen-dependent (for review,
see (11). Therefore, under oxygen or haem-
deprivation, yeast cells are confronted to
intracellular accumulation of saturated fatty acids
(SFA) and ergosterol depletion, except if the
medium is supplemented with exogenous sources
of unsaturated fatty acids and sterols (12)
In the present study, we took advantage of this
physiological peculiarity to evaluate the impacts of
perturbations of lipid homeostasis on ER-stress
induction in yeast, with a main focus on the relative
contributions of SFA and sterol to this process.
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Results
Low unsaturated fatty acid levels induce ER
stress
To evaluate the consequences of
perturbations in lipid homeostasis on UPR induction,
we first used a knock-out mutant of the δ–
For Peer Review
aminolevulinate (ALA) synthase (hem1∆, 13). Such
a strain can synthesize haem only if the medium is
supplemented with ALA. In yeast, several enzymes
of the ergosterol pathway and Ole1p, the fatty acid
desaturase, require haem as a their prosthetic
group (for a review, see 11). As a consequence,
when grown in the absence of ALA, the hem1∆
strain is confronted to double-lipid depletion, i. e.,
ergosterol and unsaturated fatty acid (UFA) scarcity
(12,14). When transferred from ALA-supplemented
to unsupplemented YPD medium, hem1∆ cells
display growth arrest as early as 5 hours after the
shift (14). This arrest correlates with a progressive
drop in ergosterol amounts (2-fold decrease after 5
hours and 4-fold decrease after 7 hours), and an
accumulation of saturated fatty acids (mainly
myristic (C14:0), palmitic (C16:0) and stearic
(C18:0) acids) at the expense of unsaturated forms
(palmitoleic (C16:1) and oleic (C18:1) acids) (12).
Since hem1∆ cells can still be recuperated after 8
hours under heam scarcity by ergosterol and oleic
acid addition to the medium, this shows that, among
the various cellular consequences related to haem
depletion, ergosterol and UFA starvation are the
most detrimental for growth. For clarity in the text,
hem1∆ cells grown in unsupplemented YPD
medium will be referred to as “lipid-depleted”. By
contrast, hem1∆ cells grown under ALA
supplemented conditions will be referred to as “lipid-
competent” cells.
Traffic
To evaluate ER-stress in response to UFA and
ergosterol scarcities, activation of the UPR in the
hem1∆ cells grown under lipid-depleted conditions
(Figure 1A) was assayed using a UPRE-CYC-LacZ
reporter gene (15), as described under Materials
and Methods. As shown, significant levels of UPRE
induction could be observed as soon as 5 h after
shifting to lipid-depleted conditions. This expression
increased gradually up to 8 hours following the shift.
To give some elements of comparison, UPRE
expression was determined in parallel under
conditions which are known to induce ER-stress
(16), i. e. upon addition of 2 mM dithiotreitol (DTT),
a strong reducing agent which prevents disulfide
bond formation and therefore perturbs protein
folding in the ER (Figure 1A). As shown, both lipid-
depletion and DTT addition resulted in UPRE
inductions of the same orders of magnitude (9.5 ±
0.5 and 20.1 ± 2.9 β-galactosidase units,
respectively), confirming the physiological relevancy
of UPR induction under lipid-depleted conditions.
In the next step, in order to evaluate the relative
contributions of ergosterol and UFA depletions to
UPR induction, the same experiments were
conducted on hem1∆ cells grown in the presence of
an exogenous source of ergosterol (UFA depletion)
or of oleate (ergosterol depletion). Indeed, in
contrast to haem-competent cells, when
hem1∆ cells are grown in the absence of ALA, i. e.
when sterol biosynthesis is compromised, they
become capable of importing these essential
molecules, provided that they are present in the
medium. As shown on Figure 1 B, UFA depletion
could account by itself for full-fledged induction of
UPRE-CYC-LacZ expression. Noteworthy, the
addition of an exogenous ergosterol source under
these conditions resulted in an even stronger UPR than
what observed for double-lipid depletion (YPD,
Figure 1B), suggesting synergistic effects of
ergosterol supplementation and UFA scarcity (see
below).
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β−−galactosidase activity (A. U.)
β-galactosidase activity (A. U.)
25
20
15
10
5
30
25
20
15
10
For Peer Review
0
5
0
ALA
YPD
ALA + DTT 2 mM
Traffic
Figure 1
A
4 h 5 h 6 h 7 h 8 h
B
ALA YPD Ole Erg Erg + Ole
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Altogether, these results pointed at UFA cellular
levels being a crucial parameter for the regulation of
UPR induction. To confirm this hypothesis, UPRE-
CYC-LacZ expression was also monitored in a
knock-out mutant of the fatty acyl desaturase
(ole1∆) grown in the presence or in the absence of
an exogenous source of oleic acid (Figure 2A).
Consistent with previous observations, ole1∆ cells
grown in the absence of UFAs showed elevated
UPRE activation, and this response was completely
abolished when UFAs were added to the medium
(Figure 2A). In a previous study, we reported that
For Peer Review
hem1∆ cells grown under UFA depletion resulted in
the accumulation of short saturated fatty acyl chains
within phospholipids (12). Therefore, it seemed of
particular interest to determine whether such a
phenomenon could be observed under other UPR-
activating conditions, i. e. in ole1∆ cells grown in the
absence of an exogenous UFA source. To test this
hypothesis, lipids were extracted from ole1∆ cells
grown for 5 h in YPD medium, an incubation time
sufficient to obtain maximal UPRE activation
(Figure 2A), before analysis of phospholipids by
mass spectrometry, as described in Materials and
Methods. As a control, the same experiments were
driven on ole1∆ cells grown in oleic acid-
supplemented medium. Figure 2B shows the
relative distribution of phosphatidylcholine (PC)
species under both culture conditions, obtained from
comparison of positive ion mode spectra, as already
described (12). As shown, growth in
unsupplemented YPD medium resulted in a
decrease in the amount of PC species bearing long
unsaturated chains (36:2, 36:1, 34:2, 34:1, 32:2 and
32:1), in favor of species with shorter saturated acyl
chains (32:0, 30:0, 28:0, 26:0 and 24:0), as
compared to growth in oleate-supplemented
medium. Such rearrangements of the fatty acyl
chain content could be observed in other
phospholipids species (not shown). Overall, these
rearrangements of PC species can be visualized by
the monitoring of two parameters, namely the
unsaturation ratio (Figure 2C) and the average
Traffic
number of carbons in the acyl chain (average chain
length; Figure 2D). Consistently, growth of the
ole1∆ cells in the absence of exogenously supplied
UFAs resulted in a dramatic decrease of the
unsaturation ratio and a small but significant
decrease of the average chain length. As expected,
these results were very comparable to what has
already been reported under conditions of haem-
induced UFA scarcity (12).
To evaluate the respective contributions of
chain length and unsaturation level on UPRE
activation, β-galactosidase activities were
determined on hem1∆ cells grown in the presence
of myristoleic acid (C14:1) in place of oleic acid
(Figure 3). Cells grown under these conditions bear
phospholipids with short (15.5 carbon atoms versus
16.8 carbon atoms for oleate-grown cells; 12) but
highly unsaturated (74 % and 68 % UFA for
myristoleate and oleate grown cells, respectively;
12) fatty acyl chains. As shown in Figure 3,
myristoleic acid supplementation fully abolished β-
galactosidase induction, showing that the
unsaturation ratio of fatty acids within phospholipids
rather than their length is the crucial parameter of
UPRE activation.
Exogenously supplied saturated fatty acids also
induce ER stress
It has been reported in previous studies
that exogenously supplied saturated fatty acids can
generate ER-stress in various types of mammalian
cells, ranging from Chineese Hamster Ovary Cells
(17) to human pancreatic β-cells (8) and liver cells
(18,19). In these latter cases, it has been suggested
that ER-stress could be the central feature of
peripheral insulin resistance and type 2 diabetes in
obese patients (18,19). In this context, it was
tempting to evaluate whether exogenously supplied
SFA could also induce ER-stress in yeast, as in
under conditions of endogenous preclusion of fatty
acid desaturation. To test this hypothesis, we
referred to a previous study from our group (20). In
this report, the growth of hem1∆ cells was evaluated
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β-galactosidase activity (A. U.)
% PC molecular species
% UFA
160
140
120
100
80
60
40
20
0
30
25
20
15
10
5
0
40
35
30
25
20
15
10
A
For Peer Review
0 h 1 h 2 h 3 h 4 h 5 h 6 h 7 h
B
YPD
YPD + Ole
Figure 2
(24:0) (26:0) (28:0) (30:0) (30:1) (30:2) (32:0) (32:1) (32:2) (34:0) (34:1) (34:2) (36:0) (36:1) (36:2)
C D
YPD YPD
+ Ole
Average number of carbons
in the acyl chain
18
17
16
15
14
13
12
Traffic
YPD YPD
+ Ole
YPD
YPD + Ole
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ββ-galactosidase activity (A. U.)
25
20
15
10
5
0
Erg
Erg + C14:1
Traffic
Figure 3
For Peer Review
4 h 5 h 6 h 7 h 8 h
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for various ratios of Tween 80 (as a source of oleic
acid) to Tween 40 (as a source of palmitate; C16:0).
To avoid working with high concentrations of
Tween 40 that might impair growth by indirect
detergent-related effects, Tween 80 amounts were
decreased down to 0.1 ‰ (v/v), as compared to 1 %
(v/v) under our standard culture conditions. As
shown in Figure 4A, decreasing Tween 80 to 0.1 ‰
(Erg + Ole 0.1 ‰) already induced significant UPRE
induction compared to 1 % supplementation (Erg +
Ole 1 %). Again, this induction correlated with the
accumulation of short saturated fatty acyl chains
For Peer Review
within PC (Figure 4B) with, as a corollary, a
decrease in the average acyl chain length
(Figure 4C) and unsaturation ratio (Figure 4D).
Consistently, gradual addition of palmitate from 0 to
0.6 ‰ resulted in increased UPR responses.
Interestingly, omitting ergosterol in a medium
supplemented with palmitate 0.6 ‰ (Ole 0.1 ‰ +
Pal 0.6 ‰), resulted in a 2-fold decrease of UPR
induction compared to the same culture conditions
in the presence of Erg (Erg + Ole 0.1 ‰ + Pal
0.6 ‰). As already observed under conditions of
endogenous preclusion of fatty acid desaturation
(Figure 1B), this result demonstrated that ergosterol
and exogenously supplied SFA act synergistically
on UPR induction. If one compares the profiles of
PC species (Figure 4B), one may notice that
palmitate addition (Erg + Ole 0.1 ‰ + Pal 0.6 ‰)
most significantly resulted in an increase of 32:0
species that correspond to PC molecules bearing
two C16:0 acyl chains, consistent with the
incorporation of these exogenously supplied FAs
within phospholipids. On a global point of view,
palmitate supplementation poorly impacted the
average fatty acyl chain length, but resulted in a
significant decrease of the unsaturation ratio
(Figure 4D).
Altogether, these results show that
exogenously supplied palmitate induces UPRE
activation in yeast and that it impacts on the
composition of PC species, in such a way that it
provokes a decrease in their unsaturation ratio.
Relevantly, increasing palmitate amounts impacts
proportionally on yeast growth, showing a strict
Traffic
connection between the level of UPR induction and
cell survival (20).
Again, these results point at the
unsaturation ratio of phospholipids being a crucial
determinant of the UPR response, whatever the
origin (endogenous or exogenous) of the
perturbation.
UPR-induction under lipotoxic conditions
depends on the Ire1p/Hac1p pathway and is
required for viability
As already mentioned, the main pathway
for UPR induction in yeast originates at the ER-
resident transmembrane protein
kinase/endoribonuclease Ire1p that regulates the
splicing of HAC1 mRNA. To evaluate the role of the
UPR in yeast adaptation to lipid-induced ER stress,
double mutant hem1∆, ire1∆ and hem1∆,
hac1∆ were constructed. Results obtained with the
double hem1∆, ire1∆ mutant are displayed in
Figure 5. As expected, UPRE activation under lipid-
depletion was fully abolished in both double mutant
strain (Figure 5A), showing that the observed lipid-
mediated UPR induction is dependent on the
canonical Ire1p/Hac1p pathway. The exact same
results were obtained with the double hem1∆,
hac1∆ mutant (data not shown). Interestingly,
whether the growth of the hem1∆, ire1∆ strain was
not discernable from those of the wild-type under
lipid-competent conditions (i. e. ALA and Erg +
Ole 1 %; Figure 5B), it was significantly affected
under conditions of SFA accumulation that resulted
from both endogenous preclusion of fatty acid
desaturation (Erg) and exogenous addition (Erg +
Ole 0.01% + Pal 0,06%). Altogether, these results
demonstrated that the UPR response that is
induced under lipid-stress is required for transient
adaptation of yeast cells to SFA accumulation.
Composition and organization of microsomal
fractions from Lipid-depleted cells
10550 North Torrey Pines Road La Jolla, CA 92037 Telephone: 1 (858) 784-8661
5

β-galactosidase activity (A. U.)
% PC molecular species
Average number of carbons
in the acyl chain
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
30
25
20
15
10
5
0
16,5
16
15,5
15
14,5
14
A
Erg
+ Ole 1 %
B
Figure 4
For Peer Review
Erg
+ Ole 0.1 ‰
Erg
+ Ole 0.1 ‰
+ Pal 0.2 ‰
Erg
+ Ole 0.1 ‰
+ Pal 0.6 ‰
+ Ole 0.1 ‰
+ Pal 0.6 ‰
(24:0) (26:0) (28:0) (30:0) (30:1) (30:2) (32:0) (32:1) (32:2) (34:0) (34:1) (34:2) (36:0) (36:1) (36:2)
C
Erg + Ole 1 %
Erg + Ole 0.1 ‰
Erg + Ole 0.1 ‰
+ Pal 0.6 ‰
Traffic
% UFA
60
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
D
Erg + Ole 1 %
Erg + Ole 0.1 ‰
Erg + Ole 0.1 ‰
+ Pal 0.6 ‰
Erg + Ole 1 %
Erg + Ole 0.1 ‰
Erg + Ole 0.1 ‰
+ Pal 0.6 ‰
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Page 24 of 29

Page 25 of 29
β-galactosidase activity (A. U.)
Attenuance (600 nm)
Attenuance (600 nm)
30
25
20
15
10
5
0
-5
-10
10
8
6
4
2
14
12
10
8
6
4
2
B
hem1ΔΔΔΔ
ALA
hem1ΔΔΔΔ, ire1ΔΔΔΔ ALA
hem1ΔΔΔΔ ALA
Figure 5
For Peer Review
0
0 4 8 12 16 20 24
hem1ΔΔΔΔ, ire1ΔΔΔΔ Erg + Ole 1%
hem1ΔΔΔΔ Erg + Ole 1%
hem1ΔΔΔΔ
YPD
Time (h)
0
0 10 20
Time (h)
hem1ΔΔΔΔ
Erg
Traffic
Attenuance (600 nm)
Attenuance (600 nm)
hem1ΔΔΔΔ,
ire1ΔΔΔΔ
ALA
6
4
2
A
0
0 4 8 12 16 20 24
8
6
4
2
hem1ΔΔΔΔ, ire1ΔΔΔΔ Erg
hem1ΔΔΔΔ Erg
hem1ΔΔΔΔ,
ire1ΔΔΔΔ
YPD
Time (h)
hem1ΔΔΔΔ, ire1ΔΔΔΔ Erg + Ole 0.1 ‰ + Pal 0.6 ‰
hem1Δ Δ Δ Δ Erg + Ole 0.1 ‰ + Pal 0.6 ‰
0
0 4 8 12 16 20 24
Time (h)
hem1ΔΔΔΔ,
ire1ΔΔΔΔ
Erg
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Since UPR originates from the
Endoplasmic Reticulum, it was important to assess
whether the perturbations of lipid composition
observed on total cells were also effective in
Endoplamic Reticulum enriched fractions. For this
purpose, microsomal fractions were prepared from
hem1∆ cells grown under lipid-competent and lipid-
depleted conditions, according to the protocol from
Zinser et al. (1993) and as described in the
Materials and Methods section. As assayed by
Western-blotting, the microsomal fractions obtained
displayed a 10.7-fold enrichment of ER resident
For Peer Review
protein Sec61p, relative to the plasma-membrane
marker Pma1p, compared to total extracts
(unpublished data). These results are quite similar
to the relative enrichment obtained by Zinser and
coworkers (21).
As shown in Figure 6A, the pattern of PC
species from microsomal fractions were very similar
to what has already been reported for total cells
(12): lipid-depletion (YPD) resulted in the
accumulation of PC species with short fatty acyl
chains (24:0, 26:0, 28:0 and 30:0) at the expense of
species bearing longer unsaturated chains (most
significantly 32:2 and 34:2). This behavior resulted
in decreases of both the average fatty acyl chain
length (Figure 6B) and unsaturation ratio
(Figure 6C).
It is well known that the length and
unsaturation level of the acyl chains of
phospholipids can influence the general
organization of biological membranes. Specifically,
in the physiological temperature range,
phospholipids can be in the fluid state (or Liquid
disordered: Ld) or in the solid-liquid gel state (G),
with a preference of phospholipids with long
saturated chain for the G state (for review, see (22).
Laurdan (6-Lauryl-2-dimethylaminophtalene)
fluorescence offers the unique property of displaying
well resolvable spectral parameters in the two
phases and can therefore be used for the detection
and relative quantification of Ld and G phases
(23,24). More specifically, in G-phase membranes
with reduced molecular mobility in the hydrophobic
region, the dipolar relaxation is too slow to change
Traffic
the properties of fluorescent emission; thus, the
emission spectra only displays one major peak at
440 nm. However, in Ld membranes where the
interior is fluid allowing the movement of lipid
molecules, dipolar relaxation of water molecules
occurs. This event leads to a red shift of about 50
nm (490 nm), in the emission spectra of Laurdan
(23). Parassassi et al. (23) have developed the
concept of general polarization (GP) of Laurdan
fluorescence. The definition of general polarization
is:
GP = (Ig – If) / (Ig + If)
where Ig and If are the fluorescence intensity at the
emission maxima of Laurdan in gel (440 nm) and
fluid phase (490 nm), respectively. Higher GP
values therefore indicate a membrane in the G
phase or a more tightly packed structure, with a low
rate of solvent relaxation.
Emission spectra of Laurdan obtained
upon excitation at 350 nm on microsomal fractions
from lipid-competent (ALA) and lipid-depleted (YPD)
cells are displayed in Figure 6D. The spectra were
obtained at low (7°C) and physiological (27°C)
temperatures and were normalized to the emission
at 440 nm. In each case, the corresponding GP
values are indicated. Interestingly, spectra obtained
with YPD microsomes were fully undistinguishable
from the ones obtained with ALA microsomes,
whatever the temperature tested. In both cases, a
shift to low temperature resulted in a characteristic
raise of GP that corresponds to temperature-related
increase of membrane order (25).
Fluorescence polarization of DPH in
microsomal membranes was used to confirm the
results obtained with Laurdan. DPH is known to
label the core of the phospholipid bilayer of
membranes, where its quantum yield is greatly
enhanced. Thus, it allows monitoring the degree of
fluidity in the membrane lipid core. DPH anisotropy
values at 27 °C were 0.194 ± 0.006 and 0.194 ±
0.008 for microsomal fractions from lipid-competent
(ALA) and lipid-depleted (YPD) cells, respectively,
showing no significant difference in fluidity between
the two fractions. This therefore confirmed the
results obtained with Laurdan.
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6
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% PC molecular species
Average number of carbons
in the acyl chain
Intensity (Normalized)
40
35
30
25
20
15
10
5
0
16,5
16
15,5
15
14,5
14
13,5
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
A
0
420 440 460 480 500 520 540
Figure 6
For Peer Review
(24:0) (26:0) (28:0) (30:0) (30:1) (30:2) (32:0) (32:1) (32:2) (34:0) (34:1) (34:2) (36:0) (36:1) (36:2)
D
ALA
YPD
7°C 27°C
AL A
Y P D
GP = 0,46
GP = 0,44
% UFA
Traffic
Intensity (Normalized)
90
B 80
C
70
60
50
40
30
20
10
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
ALA
YPD
ALA
YPD
ALA
YPD
GP = 0,34
GP = 0,33
0
420 440 460 480 500 520 540
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Page 7 of 29
Altogether, we conclude from these
experiments that UPR induction under lipid-
depletion cannot be simply correlated to a global
change of ER membrane organization at
physiological temperature.
Ergosterol accumulates in microsomal fractions
from UFA-depleted cells
Another intriguing observation was the
overinduction of UPR under addition of ergosterol to
lipid-depleted cells (see above; Figure 1B). We
For Peer Review
wondered whether this effect could be related to
ergosterol accumulation within the microsomal
fractions. Indeed, in human macrophages,
cholesterol overload in microsomes has been
shown to induce ER-stress, a phenomenon that is
likely to promote progression of atherosclerosis
(26).
Ergosterol amounts in microsomal fractions
obtained from cells grown under the various culture
conditions are displayed in Figure 7. As shown,
microsomal fractions from cells grown under lipid-
competent conditions (ALA), lipid depleted (YPD)
and UFA supplemented (+ Ole) conditions displayed
similar amounts of ergosterol, i. e. 1,5 ± 0.8 µg
ergosterol.mg proteins -1 . These amounts are very
close to what has already been reported by Zinser
et al. (21). This result confirmed the purity of our
microsomal fractions since, even if ER is the site of
ergosterol synthesis, it is known to accumulate
mainly at the plasma-membrane level (21).
Interestingly, ergosterol addition to UFA depleted-
cells resulted in a 100-fold accumulation of
ergosterol in microsomal fractions (140 ± 22 µg
ergosterol.mg proteins -1 ; Erg, Figure 7). An addition
of an exogenous source of UFA resulted in
decreased accumulation of ergosterol, but amounts
still remained significantly higher than in
microsomes obtained from cells cultivated in the
absence of an exogenous source of ergosterol (7.2
± 0.8 µg ergosterol.mg proteins -1 ; Erg + Ole,
Figure 7). It has to be noticed that these increased
amounts of ergosterol correlate very well with the
amplitude of UPRE activation (Figure 1B).
Traffic
4-PBA, a molecular chaperone, prevents UPR
induction in cells subjected to lipid-induced ER
stress
In a next step, we questioned how the
observed perturbations of lipid-homeostasis could
induce ER-stress and UPR induction. A reasonable
hypothesis was that lipid perturbations in the ER
may reduce the overall ER-protein folding capacity
with, as a corollary, triggering of misfolded protein
overload in this organelle.
4-phenyl butyrate (4-PBA) is a chemical
chaperone that is known to stabilize protein
conformation, improve ER folding capacity, and
facilitate the trafficking of mutant proteins (27). It
has recently been shown that 4-PBA possesses
chaperone activity in vitro, which prevents
aggregation of misfolded proteins (28,29).
Relevantly, 4-PBA has been shown to restore the
growth of yeast ire1∆ cells that had been pretreated
with the cytotoxic agent tunicamycin, a molecule
which is known to induce accumulation of misfolded
proteins by inhibiting N-glycosylation (28).
Therefore, we evaluated whether 4-PBA addition
could prevent UPR induction under our lipid-stress
conditions.
As shown in Figure 8A, 4-PBA completely
abolished UPRE activation, driven by intracellular
accumulation of SFA, in the absence (YPD) and in
the presence (Erg) of an extra source of exogenous
ergosterol in the hem1∆ background. The exact
same observations could be made in response to
SFA accumulation in the ole1∆ strain (Figure 8B).
As a control, the same experiments were carried out
in the presence of tunicamycin. As previously
reported (30), addition of 1µg.mL -1 tunicamycin
triggered strong UPRE activation (Figure 8C), and
this response was significantly decreased (5-fold
reduction) when cells were concomitantly incubated
with 4-PBA. The same results were obtained with
DTT, another ER-stressing agent (data not shown).
Altogether, these results suggest that the observed
UPR inductions under the different conditions are
indeed related to ER overload with misfolded
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7

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Ergosterol amounts (μμg.mg proteins -1 )
175
Figure 7
For Peer Review
150
125
100
75
15
10
5
0
Traffic
ALA YPD Ole Erg Erg + Ole
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ββ-galactosidase activity (A. U.) β-galactosidase activity (A. U.)
30
25
20
15
10
5
0
800
700
600
500
400
300
200
100
0
hem1ΔΔΔΔ
Figure 8
For Peer Review
ALA YPD YPD + 4-PBA Erg Erg + 4-PBA
hem1ΔΔΔΔ
C
Ala Ala Tunicamycin Ala Tunicamycin
+ 4-PBA
β-galactosidase activity (A. U.)
Traffic
1200
1000
800
600
400
200
0
A
kar2-1
ββ-galactosidase activity (A. U.)
300
250
200
150
100
50
YPD YPD + 4-PBA
0
ole1ΔΔΔΔ
D
B
+ Ole - Ole - Ole + 4-PBA
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proteins, a process that can be attenuated by 4-PBA
treatment.
However, one could argue that the
observed 4-PBA shut-down of UPRE activation is
related to some unspecific effects on the UPR
signalling pathway rather than to direct action as a
molecular chaperone. To test this hypothesis, we
used a mutant strain that bears a mutated allele of
KAR2 (kar2-1; 31). The kar2-1 mutant belongs to a
sub-class of kar2 mutants that display constitutive
induction of the UPR cascade (Type S mutants;
(31). It has been proposed that the kar2-1p protein
For Peer Review
loses its ability to bind Ire1p with, as a result,
constitutive dimerization of this latest (31).
Interestingly, 4-PBA did not significantly decrease
UPRE constitutive induction in this strain
(Figure 8D), ruling out indirect effects of 4-PBA on
this process.
Discussion
An increasing number of reports relate the
connections between cellular lipid homeostasis and
organelle function and/or integrity, and their
relevance to the aetiology of several human
pathologies. More specifically, the fact that elevated
saturated fatty acids (namely palmitate (8,17) and
cholesterol levels (26)) can trigger a so-called ER
stress that could, in turn, promote the progression of
diseases with high occurrence and morbidity (as in
obesity-related insulin resistance and
atherosclerosis), has shed new light on these
complex, intricate processes.
A first objective of the present study was to
evaluate whether a simple unicellular eukaryote,
such as Saccharomyces cerevisaie, which is not
routinely confronted to high-fat diets, could also
experience ER-stress under lipotoxic conditions and
therefore, whether the relevant signalization
pathways may be conserved from yeast to humans,
independently of the specific function of the cell type
considered. A way to evaluate this phenomenon is
to monitor the induction of the Unfolded Protein
Response (UPR), an ER-borne signal-cascade that
Traffic
has been shown to be stimulated under lipotoxic
conditions in mammalian cells (19)
Interestingly, we could show at that time
that yeast indeed experiences ER-stress when
faced to intracellular accumulation of saturated fatty
acids (SFA). These conditions include feeding of the
cells with extracellular SFA (Figure 4) and
preclusion of endogenous fatty acid desaturation,
that results from down-regulation of the activity of
Ole1p, the unique yeast fatty acid desaturase
(haem-depletion, Figure 1 or use of an
ole1∆ mutant, Figure 2). As already suggested for
mammalian cells (19), UPR helps yeast cells to
handle the lipid-mediated ER-stress triggered by
SFA originating from endogenous and exogenous
origins, since cells bearing deletions in the IRE1 or
HAC1 genes, both essential for the UPR cascade,
stop growth prematurely (Figure 5).
If such an effect of SFA feeding has
already been described in mammalian cells
(8,17,32), this is, to our knowledge, the first time
that ER-stress triggering by disruption of
endogenous fatty acid desaturation is reported.
These observations ought to be related to recent
data concerning stearoyl-CoA desaturase 1, SCD1,
the rate-limiting enzyme in monounsaturated fatty
acid synthesis in humans, that displays a high
degree of similarity with Ole1p (for review, see 33).
Indeed, it has been shown that SCD1 is upregulated
in obesity and may particularly protect from obesity-
induced insulin resistance (34,35) and that
expression of SCD protects pancreatic β-cell from
lipoapoptosis (36). Since pancreatic β-cell death in
obesity has been demonstrated to be directly
related to ER-stress (18,19), these data, together
with our findings, suggest that Ole1p/SCD1 activity
may be a crucial determinant to avoid ER stress and
consequent cell death by preventing intracellular
SFA accumulation.
Another important finding of the present
study is that excess SFA from endogenous or
exogenous origin have a profound impact on cellular
phospholipids species, albeit in slight different ways.
Indeed, endogenous preclusion of fatty acid
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8
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desaturation induces a decrease in the unsaturation
of PC species as a result of SFA accumulation
within this phospholipid at the expense of
unsaturated forms (as monitored by mass
spectrometry), but also an unexpected decrease of
the average length of fatty acyl chains (Figure 2 and
(12)). In contrast, exogenously added palmitate
does not significantly impact the average acyl chain
length (compare Erg + Ole 0.1 ‰ and Erg + Ole
0.1 ‰ + Pal 0.6 ‰; Figure 4). This difference may
have profound implications on the relative sensitivity
of cells to SFA that originate from the two different
For Peer Review
sources. Indeed, we already proposed that the
appearance of short chain fatty acids may
compensate for the accumulation of longer
saturated chains (12). Data reported in the present
study confirm this hypothesis. Indeed, we first
postulated that the decrease of the unsaturation
ratio of phospholipids may affect the overall fluidity
in microsomal fractions, a phenomenon that could
have accounted for UPR induction under preclusion
of fatty acid desaturation. We directly tested this
hypothesis by measuring the general fluorescence
(GP) of Laurdan in microsomal fractions obtained
from lipid-competent and lipid-depleted cells
(Figure 6D). However, no significant differences in
GP could be observed between the two samples.
This result suggests that, indeed, shortening of the
acyl chain may help at maintaining the overall
fluidity of the ER in a range compatible with cell
survival, at least transiently. These compensatory
effects probably account for the maintenance of
efficient secretory capacity of the cells under
desaturation preclusion, since we could show that
the secretion of invertase and the cell surface
delivery of the plasma-membrane proton-ATPase
PMA1p were largely unaffected under lipid-
mediated ER-stress conditions (Figure S1).
ER has a characteristic lipid composition as
compared to other organelles. First, it displays the
highest proportion of PC as compared to other
phospholipids species (37), a phospholipid that is
highly unsaturated under normal conditions (12;
Figure 6). Second, ergosterol amounts are very low
in this organelle (21; Figure 7). Altogether, this
Traffic
suggests that ER membranes display relative low
lipid chain order, a parameter that may be essential
for specialized ER-based processes, such as
protein translocation (38). In this context, shortening
of fatty acyl chains may be a crucial counterpart to
saturated fatty acid accumulation, and especially in
this compartment. If SFA import from the
extracellular medium is not counteracted by the
generation of short fatty acids (Figure 4), this may
explain why exogenous SFA are so detrimental to
the cells. Relevantly, feeding of CHO cells with
exogenous palmitate results in disruption of ER
structure and integrity (17).
However, if global order of microsomal fractions
is not significantly modified under desaturation
preclusion, there may be some local impacts on lipid
chain packing in response to decrease of
phopholipid unsaturation level, which could result in
protein misfolding. Some elements that straighten
this hypothesis come from the experiments
conducted with 4-PBA. In our hands, 4-PBA almost
fully abolished the UPR induction that is triggered by
SFA accumulation (Figure 8). 4-PBA has been
shown to act as a chemical chaperone in vitro, since
it prevents protein aggregation (28,29). We
therefore postulate from these results that lipid-
related UPR induction is probably connected to the
accumulation of misfolded proteins in the ER. It is
known that integral proteins in artificial systems tend
to partition preferentially to lipid bilayers in the Ld
phase rather than in the G phase (for review, see
39). Interestingly, in the G phase, polytopic proteins
tend to form aggregates (39). Moreover, protein
translocation across the ER bilayer has also been
shown to be highly sensitive to lipid composition
(38,40). One may therefore postulate that local
increase of membrane order may interfere with the
folding and/or translocation of client proteins, a
phenomenon that could account directly for the
observed UPR induction.
Another important finding is that ergosterol
displays a synergistic effect with SFA on UPR
induction (Figure 1B and Figure 4A). It has already
been reported that cholesterol accumulation in the
ER of human macrophages induces ER-stress, a
10550 North Torrey Pines Road La Jolla, CA 92037 Telephone: 1 (858) 784-8661
9

process that has been proposed to account for
cholesterol-induced apoptosis of macrophages
(9,41). We could show here that ergosterol also
induces ER-stress in yeast and that it occurs via the
same pathway as SFA-induced ER-stress since: i) it
involves the IRE1/HAC1 pathway (Figure 5) and ii)
UPR induction is abolished by 4-PBA under both
conditions (Figure 8). This latter observation also
suggests that ergosterol induction of UPR probably
relies on the accumulation of misfolded proteins in
the ER, such as already proposed for SFA.
Interestingly, the level of UPRE activation correlates
For Peer Review
with the amounts of ergosterol that accumulate in
the microsomal fractions: this level raises
dramatically in cells where desaturation is precluded
compared with the same cells grown in the
presence of an exogenous source of UFA (140 ±
21 µg ergosterol.mg protein -1 and 7,2 ± 0,8 µg
ergosterol.mg protein -1 , respectively; Erg and Erg +
Ole, Figure 7). Moreover, this accumulation in
microsomes (100-fold) is very high compared to
what is observed for total cells, since we could show
elsewhere that ergosterol amounts are very similar
in cells grown in hem1∆ cells grown under the
various conditions (12). This suggests that
ergosterol is somehow “glued” in the ER in SFA
accumulating cells. It has to be noted that,
surprisingly, yeast cells can accommodate
transiently to these huge ergosterol amounts, since
their secretory capacity is not impaired (Figure S1)
and lipid-deficient cells grown in the presence of
ergosterol can even make an additional division as
compared to the same cells grown in the absence of
ergosterol (our unpublished data). However, they
rely in this case on an efficient UPR, since deletion
of the IRE1 gene confers to the cells an increased
sensitivity to exogenous ergosterol (Figure 6). To
account for the high ergosterol accumulation in
microsomes from UFA-depleted cells as compared
to the same cells grown in the presence of
exogenous oleate, we first hypothesized that this
may be related to different capacities for excess
ergosterol storage as ergosterylesters in lipid
bodies, a process that is known to help cells to cope
with harmful accumulation of cholesterol in
Traffic
mammalian cells (41,42). Since sterols are
preferentially esterified as sterylesters with UFA
(14), it might have been a reasonable explanation.
However, it has already been reported that
exogenous ergosterol is not esterified in yeast, even
in the presence of UFA (43), and we could confirm
that, indeed, no detectable amounts of
ergosterylesters were synthestized even in the
presence of an extracellular source of UFA (data not
shown), conditions where ergosterol accumulation
in microsomes is lower (Erg + Ole; Figure 7). The
hypothesis we favor is that ergosterol trapping in the
ER is probably related to the phospholipid
composition. Indeed, it has been shown in artificial
membranes that cholesterol displays a much better
affinity for saturated phospholipids than for
unsaturated ones (44,45). This observation can be
of general importance since genetic links between
obesity and atherosclerosis have already been
reported (for recent review, see 46). We propose
here that high saturation levels of phospholipids that
occur in response of decreased desaturation
capacity (decreased SCD1/ole1p activity), may
render the cell more permissive to sterol toxic
effects by favoring their sequestration in the ER.
Finally, the present study points out that
molecular chaperones such as 4-PBA, which
potential therapeutic applications in the treatment of
obesity-related insulin resistance have already been
proposed (18), may act as possible regulators of
sterol induced ER-stress. Testing macrophage
protection from free cholesterol-induced apoptosis
(26) by 4-PBA should bring additional information on
the possible use of such molecules to delay, or
optimally to avoid, progression of atherosclerotic
lesions. In this context, yeast may emerge as an
excellent tool for the development of new high
throughput screening strategies for the identification
of therapeutic molecules in the field of lipid-induced
ER-stress diseases.
Materials and Methods
Yeast strains and culture conditions─ The S.
cerevisiae strains used in this study are listed in
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Table 1. Cells bearing the hem1∆ mutation were
grown aerobically at 28°C in YPD medium (1 %
Yeast extract (w/v), 1 % Peptone (w/v), 2 %
Glucose (w/v)) supplemented with 80 µg.mL -1 δ-
aminolevulinate (ALA, referred to as lipid-competent
conditions). Haem-induced ergosterol and
unsaturated fatty acid depletions (referred to as lipid
depletion) were obtained by cultivating the cells in
YPD medium without supplementation.
Alternatively, YPD medium was supplemented with
80.µg mL -1 ergosterol and/or 1 % Tween 80 (v/v),
used as the source of oleic acid (C18:1). Where
For Peer Review
indicated, Tween 80 was replaced by myristoleic
(C14:1) at a final concentration of 2 mM (Sigma).
For competition experiments, Tween 80 amounts
were set at 0.1 ‰ (v/v) and Tween 40, as a source
of palmitate (C16:0), was added at 0.2 ‰ (v/v) or
0.6 ‰ (v/v), as indicated. ole1∆ cells were grown in
YPD medium with or without supplementation with
1% Tween 80 (v/v) as the source of oleic acid, as
indicated. The KMY81 strain bearing the kar2-1
mutation (31) was grown in YPD + Adenine (50
µg.mL -1 ) at 23°C to stationary phase before transfer
at the non-permissive temperature of 37°C for 8 h.
When indicated, 4-phenylbutyric acid (4-PBA; Alfa
Aesar), dithiotreitol (DTT; Sigma) and tunicamycin
(Sigma) were added from stock solutions prepared
in water (equilibrated to pH 7.4 with Na0H for the 4-
PBA stock) at the final concentrations indicated.
β-galactosidase assays─To assay UPR induction,
cells were transformed with plasmid pJC104 bearing
a UPRE-CYC-LacZ gene fusion, provided by Dr.
Peter Walter (University of California, USA; (15). β-
galactosidase assays were performed at 30°C as
previously described (47) by measuring the increase
in absorbance at 420 nm with o-nitrophenyl-β-D-
galactoside as the substrate, after permeabilization
of the cells with chloroform and sodium dodecyl
sulfate.
Preparation of microsomal fractions-Microsomal
fractions were prepared as described by Zinser et
Traffic
al. (21) with slight modifications. Briefly,
approximately 2.10 10 cells grown under the
indicated conditions were harvested, washed twice
with water before disruption with glass beads
(diameter 0.3–0.4 mm; Sigma) in 5 mL 250 mM Tris,
5 mM EDTA, 500 µM phenylsulfonyl fluoride,
containing 20 µL of protease inhibitor cocktail
(Sigma). After the addition of 5 mL glycerol 20 %
(v/v), the homogenate was centrifuged for 10 min at
700 g to remove cellular debris and the supernatant
further centrifuged for 20 min at 20,000 g. The
20,000 g supernatant was centrifuged for 1 h at
100,000 g (TFT 50.38 rotor; Beckmann). The
resulting pellet was suspended in 10 mM Tris HCl,
pH 7.4, in a 10 mL potter with a tightly fitting pestle.
The suspension was then centrifuged at 20,000 g
for 20 min to remove most of the remaining
contaminating plasma membrane and mitochondria.
The resulting supernatant was centrifuged at
100,000 x g for 1 h, yielding a colorless, opaque
pellet consisting mostly of microsomal membranes.
This pellet was resuspended in 500 µL GTH buffer
(glycerol 20 % (v/v), 10 mM Tris-HCl, pH 7.4). The
amount of total proteins ranks typically between 2 to
3 mg per sample, as determined by the
Bicinchoninic acid kit (Sigma). Purity of the
microsomal fractions was evaluated by measuring
the relative enrichment of the ER-resident protein
Sec61p versus Pma1p, as a canonical marker of
plasma-membranes, in crude homogenate and in
the microsomal fractions. The relative amounts of
each protein were estimated by Western-blotting
using polyclonal antibodies against Sec61p (Dr.
Randy Schekman; University of California, USA)
and Pma1p (Dr Carolyn Slayman; Yale University,
USA) in 10 µg and 100 µg protein samples, with the
ImageJ 1.40 g software (NIH).
Lipid analysis and Mass spectrometry-Lipid extracts
were prepared from ≈ 2 × 10 9 (sterols), or 10 8
(phospholipids) total yeast cells grown as indicated,
or approximately 1 mg (sterols) and 200 µg
(phospholipids) of proteins from microsomal
fractions. Cells were harvested, washed with
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distilled water, suspended in 1 mL of cold water and
shock-frozen. They were broken by vigorous
shaking with 500 µL of glass beads (diameter 0.3–
0.4 mm; Sigma) using a mini-beadbeater TM (Biospec
Products) for 1 min at 5000 rev/min. Cellular lipids
were extracted using chloroform/methanol (2:1, v:v)
as described by Folch et al. (48). The final organic
phase was evaporated and lipids were dissolved
either in 100 µL hexane (sterols) or 200 µL
chloroform/methanol/H2O (16:16:5, v:v:v)
(phospholipids).
For specific sterol identification and
For Peer Review
quantification, total lipid extracts were subjected to
saponification as previously reported (14). The
different sterol species were then separated by gas
chromatography using a 25 m × 0.32 mm AT-1
capillary column (Alltech), and identified by means
of their retention times relative to cholesterol, used
as a standard. The results are expressed as µg of
sterol per 10 9 cells.
In order to analyze phospholipids species
by mass spectrometry (MS), total lipid extracts were
reconstituted at a concentration of approximately
50 µg.mL -1 of phospholipids in
chloroform/methanol/H2O (16:16:5, v:v:v), with 1%
(v/v) formic acid for analysis in the positive ion
mode. For routine single-stage MS, samples were
analyzed with a triple quadrupole instrument model
API 165 (Perkin Elmer Sciex) equipped with an ion-
spray source. Analysis of spectra was performed
using the Biomultivew 1.2 software (Perkin Elmer
Sciex) and raw identification of phospholipid species
was carried out based on their expected m/z by
means of a home-made software program. The
various species were unambiguously identified by
tandem MS with a Deca XP Max equipped with an
ion trap source (Thermo Electron) by precursor ion
scan analysis, as previously described (49). The
molecular profile of PC species was specifically
obtained by scanning for the positive ion precursors
of m/z 184, characteristic of choline phosphate.
Laurdan and DPH labeling of microsomal
membranes- The concentration of microsomal
Traffic
preparations was adjusted to 140 µg.mL -1 in GTH
buffer. The probe, Laurdan (Sigma), was prepared
in DMSO to give a 2 mM stock solution. 3 mL of
microsomal preparations in GTH buffer were
transferred to a quartz cuvette before labelling with
2 µL of the Laurdan stock solution in the dark at
27 °C for 10 min. This time allows correct staining of
the microsomes. A Fluorolog-3 spectrometer (Jobin
Yvon, Horiba group, USA) was used for the
fluorescence measurements. During
measurements, samples were stirred and
equilibrated in a temperature-controlled chamber
using a thermoelectric Peltier junction. The
excitation wavelength used during this study was
350 nm and emission spectra were acquired
between 420 and 550 nm at 7°C and 27 °C. Blank
spectra were obtained with unlabeled microsomes
and were subtracted from the spectra of the labelled
microsomes.
Membrane fluidity was assessed by the
steady-state fluorescence polarization of 1,6-
diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH) (50). DPH (Sigma)
was prepared in tetrahydrofuran (Sigma) to obtain a
1 mM stock solution. Before labeling of microsomal
membranes, DPH was dispersed by injection of
4 µL from the stock solution into 2 mL of GTH
buffer. After 15 min stirring, 1 mL of microsomes in
GTH buffer (400 µg.mL -1 ) was added to the
suspension before incubation for 30 min at 27 °C.
Steady-state anisotropy of DPH was measured in a
Fluorolog-3 spectrometer (Jobin-Yvon, Horiba
Group, USA), using T-Format fluorescence
polarizers. The excitation and emission wavelengths
were 360 nm (5 nm bandwidth) and 431 nm (5
nm bandwidth), respectively. Steady-state
fluorescence anisotropy (r) was calculated as:
r = (Ivv – GIvh)/(Ivv + 2GIvh)
where G = Ihv/Ihh is a correction factor for the
monochromator’s transmission efficiency for
vertically and horizontally polarized light.
Online supplemental material
Supplemental Figure S1 shows the secretion of
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invertase and the cell-surface delivery of the proton
pump Pma1p under conditions of ergosterol and
unsaturated fatty acid depletions. Online
supplemental material is available at …
Acknowledgements: We are very grateful to
Daniel Guillonet for excellent technical assistance
with Electrospray Mass Spectrometry and Dr. Anne
Cantereau (Confocal Microscopy facility of UMR-
CNRS 6187, Poitiers) for her precious advice
regarding confocal microscopy imaging. We thank
Dr. Peter Walter (University of California, USA), Dr.
Traffic
For Peer Review
Kenji Kohno (Nara Institute of Science and
Technology, Ikoma, Japan), Dr Carolyn Slayman
(Yale University, USA) and Dr. Randy Schekman
(University of California, USA) for strains, plasmids
and antibodies. Miss Lucy Mills is acknowledged for
her help in writing this manuscript in English. This
work was supported by the French MENRT (with a
grant to LP), the Conseil Général de la Région
Poitou-Charente and the CNRS.
Abbreviations: ALA: δ–aminolevulinate; DPH: 1,6-
diphenyl-1,3,5-hexatriene; 4-PBA: 4-phenyl butyrate
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13

References
1. Kincaid MM, Cooper AA. ERADicate ER Stress
or Die Trying. Antioxid Redox Signal 2007;
9(12):2373-2387.
2. Back SH, Schroder M, Lee K, Zhang K,
Kaufman RJ. ER stress signaling by regulated
splicing: IRE1/HAC1/XBP1. Methods
Glycosylation, Glycoprotein Quality Control,
and Stress Responses In The Endoplasmic
Reticulum 2005;35(4):395-416.
3. Zhang K, Kaufman RJ. The unfolded protein
response: a stress signaling pathway critical for
health and disease. Neurology 2006;66(2 Suppl
1):S102-9.
For Peer Review
4. Travers KJ, Patil CK, Wodicka L, Lockhart DJ,
Weissman JS, Walter P. Functional and
genomic analyses reveal an essential
coordination between the unfolded protein
response and ER-associated degradation. Cell
2000;101(3):249-58.
5. Faitova J, Krekac D, Hrstka R, Vojtesek B.
Endoplasmic reticulum stress and apoptosis.
Cellular & Molecular Biology Letters
2006;11(4):488-505.
6. Eizirik DL, Cardozo AK, Cnop M. The Role for
Endoplasmic Reticulum Stress in Diabetes
Mellitus. Endocr Rev 2007.
7. Marciniak SJ, Ron D. Endoplasmic reticulum
stress signaling in disease. Physiol Rev
2006;86(4):1133-49.
8. Karaskov E, Scott C, Zhang L, Teodoro T,
Ravazzola M, Volchuk A. Chronic palmitate but
not oleate exposure induces endoplasmic
reticulum stress, which may contribute to INS-1
pancreatic beta-cell apoptosis. Endocrinology
2006;147(7):3398-407.
9. Feng B, Yao PM, Li Y, Devlin CM, Zhang D,
Harding HP, Sweeney M, Rong JX, Kuriakose
G, Fisher EA and others. The endoplasmic
reticulum is the site of cholesterol-induced
cytotoxicity in macrophages. Nat Cell Biol
2003;5(9):781-92.
10. DeVries-Seimon T, Li Y, Yao PM, Stone E,
Wang Y, Davis RJ, Flavell R, Tabas I.
Cholesterol-induced macrophage apoptosis
requires ER stress pathways and engagement
of the type A scavenger receptor. J. Cell Biol.
2005;171(1):61-73.
11. Daum G, Lees ND, Bard M, Dickson R.
Biochemistry, cell biology and molecular
biology of lipids of Saccharomyces cerevisiae.
Yeast 1998;14(16):1471-510.
12. Pineau L, Bonifait L, Berjeaud J-M, Alimardani-
Theuil P, Berges T, Ferreira T. A Lipidmediated
Quality Control Process in the Golgi
Apparatus in Yeast. Mol. Biol. Cell
2008;19(3):807-821.
13. Verdiere J, Gaisne M, Labbe-Bois R. CYP1
(HAP1) is a determinant effector of alternative
expression of heme-dependent transcribed
genes in yeast. Mol Gen Genet 1991;228(1-
2):300-6.
Traffic
14. Ferreira T, Regnacq M, Alimardani P, Moreau-
Vauzelle C, Berges T. Lipid dynamics in yeast
under haem-induced unsaturated fatty acid and
/ or sterol depletion. Biochem J
2004;378(Pt3):899-908.
15. Cox JS, Walter P. A Novel Mechanism for
Regulating Activity of a Transcription Factor
That Controls the Unfolded Protein Response.
Cell 1996;87(3):391-404.
16. Travers KJ, Patil CK, Wodicka L, Lockhart DJ,
Weissman JS, Walter P. Functional and
Genomic Analyses Reveal an Essential
Coordination between the Unfolded Protein
Response and ER-Associated Degradation.
Cell 2000;101(3):249-258.
17. Borradaile NM, Han X, Harp JD, Gale SE, Ory
DS, Schaffer JE. Disruption of endoplasmic
reticulum structure and integrity in lipotoxic cell
death. J. Lipid Res. 2006;47(12):2726-2737.
18. Ozcan U, Yilmaz E, Ozcan L, Furuhashi M,
Vaillancourt E, Smith RO, Gorgun CZ,
Hotamisligil GS. Chemical chaperones reduce
ER stress and restore glucose homeostasis in a
mouse model of type 2 diabetes. Science
2006;313(5790):1137-40.
19. Ozcan U, Cao Q, Yilmaz E, Lee AH, Iwakoshi
NN, Ozdelen E, Tuncman G, Gorgun C,
Glimcher LH, Hotamisligil GS. Endoplasmic
reticulum stress links obesity, insulin action,
and type 2 diabetes. Science
2004;306(5695):457-61.
20. Desfougeres T, Ferreira T, Berges T, Regnacq
M. SFH2 regulates fatty acid synthase activity
in the yeast Saccharomyces cerevisiae and is
critical to prevent saturated fatty acid
accumulation in response to haem and oleic
acid depletion. Biochem J 2008;409(1):299-
309.
21. Zinser E, Paltauf F, Daum G. Sterol
composition of yeast organelle membranes and
subcellular distribution of enzymes involved in
sterol metabolism. J Bacteriol
1993;175(10):2853-8.
22. London E. How principles of domain formation
in model membranes may explain ambiguities
concerning lipid raft formation in cells.
Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -
Molecular Cell Research 2005;1746(3):203-
220.
23. Parasassi T, De Stasio G, d'Ubaldo A, Gratton
E. Phase fluctuation in phospholipid
membranes revealed by Laurdan fluorescence.
Biophys. J. 1990;57(6):1179-1186.
24. Parasassi T, De Stasio G, Ravagnan G, Rusch
RM, Gratton E. Quantitation of lipid phases in
phospholipid vesicles by the generalized
polarization of Laurdan fluorescence. Biophys.
J. 1991;60(1):179-189.
25. Parasassi T, Di Stefano M, Loiero M, Ravagnan
G, Gratton E. Influence of cholesterol on
phospholipid bilayers phase domains as
detected by Laurdan fluorescence. Biophys. J.
1994;66(1):120-132.
26. Feng B, Yao PM, Li Y, Devlin CM, Zhang D,
Harding HP, Sweeney M, Rong JX, Kuriakose
G, Fisher EA and others. The endoplasmic
reticulum is the site of cholesterol-induced
10550 North Torrey Pines Road La Jolla, CA 92037 Telephone: 1 (858) 784-8661
14
Page 14 of 29

Page 15 of 29
cytotoxicity in macrophages. 2003;5(9):781-
792.
27. Welch WJ, Brown CR. Influence of molecular
and chemical chaperones on protein folding.
Cell Stress Chaperones 1996;1(2):109-15.
28. Kubota K, Niinuma Y, Kaneko M, Okuma Y,
Sugai M, Omura T, Uesugi M, Uehara T, Hosoi
T, Nomura Y. Suppressive effects of 4phenylbutyrate
on the aggregation of Pael
receptors and endoplasmic reticulum stress. J
Neurochem 2006;97(5):1259-68.
29. de Almeida SF, Picarote G, Fleming JV,
Carmo-Fonseca M, Azevedo JE, de Sousa M.
Chemical Chaperones Reduce Endoplasmic
Reticulum Stress and Prevent Mutant HFE
Aggregate Formation. J. Biol. Chem.
2007;282(38):27905-27912.
30. Schroder M, Clark R, Kaufman RJ. IRE1- and
HAC1-independent transcriptional regulation in
For Peer Review
the unfolded protein response of yeast. Mol
Microbiol 2003;49(3):591-606.
31. Kimata Y, Kimata YI, Shimizu Y, Abe H,
Farcasanu IC, Takeuchi M, Rose MD, Kohno K.
Genetic evidence for a role of BiP/Kar2 that
regulates Ire1 in response to accumulation of
unfolded proteins. Mol Biol Cell
2003;14(6):2559-69.
32. Maedler K, Oberholzer J, Bucher P, Spinas GA,
Donath MY. Monounsaturated fatty acids
prevent the deleterious effects of palmitate and
high glucose on human pancreatic beta-cell
turnover and function. Diabetes
2003;52(3):726-33.
33. Aguilar PS, de Mendoza D. Control of fatty acid
desaturation: a mechanism conserved from
bacteria to humans. Molecular Microbiology
2006;62(6):1507-1514.
34. Pinnamaneni SK, Southgate RJ, Febbraio MA,
Watt MJ. Stearoyl CoA desaturase 1 is
elevated in obesity but protects against fatty
acid-induced skeletal muscle insulin resistance
in vitro. Diabetologia 2006;49(12):3027-37.
35. Stefan N, Peter A, Cegan A, Staiger H,
Machann J, Schick F, Claussen C, Fritsche A,
Häring H-U, Schleicher E. Low hepatic
stearoyl-CoA desaturase 1 activity is
associated with fatty liver and insulin resistance
in obese humans. Diabetologia 2008;51(4):648-
656.
36. Busch AK, Gurisik E, Cordery DV, Sudlow M,
Denyer GS, Laybutt DR, Hughes WE, Biden TJ.
Increased Fatty Acid Desaturation and
Enhanced Expression of Stearoyl Coenzyme A
Desaturase Protects Pancreatic {beta}-Cells
from Lipoapoptosis. Diabetes
2005;54(10):2917-2924.
37. Zinser E, Sperka-Gottlieb CD, Fasch EV,
Kohlwein SD, Paltauf F, Daum G. Phospholipid
synthesis and lipid composition of subcellular
membranes in the unicellular eukaryote
Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol
1991;173(6):2026-34.
Traffic
38. Nilsson I, Ohvo-Rekila H, Slotte JP, Johnson
AE, von Heijne G. Inhibition of Protein
Translocation across the Endoplasmic
Reticulum Membrane by Sterols. J. Biol. Chem.
2001;276(45):41748-41754.
39. Lee AG. Lipid-protein interactions in biological
membranes: a structural perspective.
Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -
Biomembranes 2003;1612(1):1-40.
40. Romisch K, Collie N, Soto N, Logue J, Lindsay
M, Scheper W, Cheng C-HC. Protein
translocation across the endoplasmic reticulum
membrane in cold-adapted organisms. J Cell
Sci 2003;116(14):2875-2883.
41. Maxfield FR, Tabas I. Role of cholesterol and
lipid organization in disease.
2005;438(7068):612-621.
42. Kim H-J, Miyazaki M, Ntambi JM. Dietary
cholesterol opposes PUFA-mediated
repression of the stearoyl-CoA desaturase-1
gene by SREBP-1 independent mechanism. J.
Lipid Res. 2002;43(10):1750-1757.
43. Valachovic M, Klobucnikova V, Griac P, Hapala
I. Heme-regulated expression of two yeast acyl-
CoA:sterol acyltransferases is involved in the
specific response of sterol esterification to
anaerobiosis. FEMS Microbiol Lett
2002;206(1):121-5.
44. Epand RM, Epand RF, Bain AD, Sayer BG,
Hughes DW. Properties of polyunsaturated
phosphatidylcholine membranes in the
presence and absence of cholesterol. Magn
Reson Chem 2004;42(2):139-47.
45. Brzustowicz MR, Cherezov V, Zerouga M,
Caffrey M, Stillwell W, Wassall SR. Controlling
Membrane Cholesterol Content. A Role for
Polyunsaturated (Docosahexaenoate)
Phospholipids. Biochemistry
2002;41(41):12509-12519.
46. Stein O, Stein Y. Resistance to obesity and
resistance to atherosclerosis: Is there a
metabolic link? Nutrition, Metabolism and
Cardiovascular Diseases 2007;17(7):554-559.
47. Sambrook J, Fritsch, EF and Maniatis T.
Molecular cloning, a laboratory manual: Cold
Spring Harbor Laboratory Press; 1989. 17.35 p.
48. Folch J, Lees M, Stanley GHS. A simple
method for the isolation and purification of total
lipides from animal tissues. J Biol Chem
1957;226:497-509.
49. Schneiter R, Brugger B, Sandhoff R, Zellnig G,
Leber A, Lampl M, Athenstaedt K, Hrastnik C,
Eder S, Daum G and others. Electrospray
ionization tandem mass spectrometry (ESI-
MS/MS) analysis of the lipid molecular species
composition of yeast subcellular membranes
reveals acyl chain-based sorting/remodeling of
distinct molecular species en route to the
plasma membrane. J Cell Biol 1999;146(4):741-
54.
50. Shinitzky M, Barenholz Y. Fluidity parameters
of lipid regions determined by fluorescence
polarization. Biochim Biophys Acta
1978;515(4):367-94.
10550 North Torrey Pines Road La Jolla, CA 92037 Telephone: 1 (858) 784-8661
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Figure Legends
Figure 1: Activation of the UPR under conditions
of lipid depletion.
(A) hem1∆ cells transformed with pJC104 (UPRE-
CYC-LacZ) (hem1∆[pJC104]) were grown to
stationary phase in YPD medium supplemented with
80 µg.mL -1 ALA, before transfer to early exponential
For Peer Review
phase (2.10 6 cells.mL -1 ) in fresh YPD medium with
(open bars) or without (black bars) ALA. The times
following the shift are indicated. UPRE activation
was monitored by measuring β-galactosidase
activities, as described under Materials and
Methods. The grey bar represents UPRE activation
measured from cells grown in YPD + ALA in the
presence of 2 mM DTT for 8 h. (B) Cells were grown
to stationary phase as in (A) before transfer to YPD
+ ALA (ALA), YPD (YPD), YPD + 1 % Tween 80
(v/v) (Ole), YPD + Erg 80 µg.mL -1 (Erg) or YPD +
1 % Tween 80 (v/v) + Erg 80 µg.mL -1 (Erg + Ole). β-
galactosidase activity was defined as
OD420.min -1 .mL -1 . Values are means ± SD of at least
three independent determinations.
Figure 2: Impacts of desaturation preclusion on
UPR activation and cellular PC content.
ole1∆[pJC104] cells were grown to stationary phase
in YPD medium supplemented with 1 % Tween 80
(v/v) (YPD + Ole) before shift to early exponential
phase (2.10 6 cells.mL -1 ) in fresh YPD medium with
(open bars; YPD + Ole) or without (black bars; YPD)
1 % Tween 80 (v/v). (A) UPRE activation was
monitored by measuring β-galactosidase activities,
as described under Materials and Methods. Times
following the shift to fresh media are indicated. (B)
After 5 h growth in YPD (black bars) or YPD + Ole
(open bars), lipids were extracted from
ole1∆[pJC104] cells and PC species were analyzed
by MS in the positive ion mode, as described in
Materials and Methods. The total carbon chain
Traffic
length (x) and the number of carbon-carbon double
bonds of PC molecular species are indicated (x:y).
The unsaturation ratio (C) and the average chain
length (D) were calculated from data displayed in B.
Values are means ± SD of at least three
independent determinations.
Figure 3: Supplementation with short
unsaturated fatty acids prevents UPR induction
in hem1∆∆∆∆ cells.
hem1∆[pJC104] cells were grown to stationary
phase in YPD medium supplemented with
80 µg.mL -1 ALA, before transfer to early exponential
phase (2.10 6 cells.mL -1 ) in fresh YPD + Erg medium
(black bars; Erg), or in YPD + Erg medium
supplemented with 2 mM myristoleic acid (open
bars; Erg + C14:1). The times following the shift are
indicated. UPRE activation was monitored by
measuring β-galactosidase activities, as described
under Materials and Methods. Values are means ±
SD of at least three independent determinations.
Figure 4: Effects of exogenously supplied
saturated fatty acids on UPR activation and
cellular PC content.
hem1∆[pJC104] cells were grown to stationary
phase as in the legend of Figure 3 before transfer to
YPD + 1 % Tween 80 (v/v) + Erg µg.mL -1 (Erg + Ole
1 %), YPD + 0.1 ‰ Tween 80 (v/v) + Erg 80 µg.mL -1
(Erg + Ole 0.1 ‰), YPD + 0.1 ‰ Tween 80 (v/v) +
0.2 ‰ Tween 40 (v/v) + Erg 80 µg.mL -1 (Erg + Ole
0.1 ‰ + Pal 0.2 ‰), YPD + 0.1 ‰ Tween 80 (v/v) +
0.6 ‰ Tween 40 (v/v) + Erg 80 µg.mL -1 (Erg + Ole
0.1 ‰ + Pal 0.6 ‰) or YPD + 0.1 ‰ Tween 80 (v/v)
+ 0.6 ‰ Tween 40 (v/v) (Ole 0.1 ‰ + Pal 0.6 ‰).
(A) UPRE activation was monitored by measuring β-
galactosidase activities, 8 h after shift to the
indicated medium. (B) After 8 h growth in Erg + Ole
1 % (open bars), Erg + Ole 0.1 ‰ (black bars) or
Erg + Ole 0.1 ‰ + Pal 0.6 ‰ (grey bars), lipids were
extracted from cells and PC species were analyzed
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by MS in the positive ion mode, as described in
Materials and Methods. The average chain length
(C) and the unsaturation ratio (D) were calculated
from data displayed in B. Values are means ± SD of
at least three independent determinations.
Figure 5: The UPR pathway is required for
optimal growth under lipid-induced ER-stress.
hem1∆[pJC104] and hem1∆, , ire1∆[pJC104] cells
were grown in YPD + ALA to stationary phase
before transfer to YPD, YPD + ALA (ALA), YPD +
Erg 80 µg.mL -1 (Erg), YPD + 1 % Tween 80 (v/v) +
For Peer Review
Erg 80 µg.mL -1 (Erg + Ole 1%) or YPD + 0.1 ‰
Tween 80 (v/v) + 0.6 ‰ Tween 40 (v/v) + Erg
80 µg.mL -1 (Erg + Ole 0.1 ‰ + Pal 0.6 ‰) as in the
legend of Figure 4. (A) UPRE activation was
monitored by measuring β-galactosidase activities,
8 h after shift to the indicated medium. Values are
means ± SD of at least three independent
determinations. (B) Attenuance of the cultures was
determined at the indicated time points after shift to
the corresponding media.
Figure 6: PC composition and Generalized
Polarization of Laurdan in microsomes from
lipid-competent and lipid-depleted cells.
Microsomes were prepared, as described in
Materials and Methods, from hem1∆ cells grown for
8 h in YPD or YPD + ALA (ALA) medium. Lipids
were extracted from 1 mg of microsomal fractions
before analysis of PC species by MS, in the positive
ion mode (A). The average chain length (B) and the
unsaturation ratio (C) were calculated from data
displayed in A. Values are means ± SD of at least
three independent determinations. (D) Normalized
emission spectra of Laurdan at 7°C (left panel) and
27°C (right panel), using excitation at 350 nm.
Generalized Polarization (GP) values are indicated.
See text for details.
Traffic
Figure 7: Ergosterol content in microsomal
fractions from hem1∆∆∆∆ cells grown on different
lipid supplemented media.
Microsomes were prepared from hem1∆ cells grown
for 8 h in YPD + ALA (ALA), YPD, YPD + 1 % Tween 80
(v/v) (Ole), YPD + Erg 80 µg.mL -1 (Erg) and YPD + 1 %
Tween 80 (v/v) + Erg 80 µg.mL -1 (Erg + Ole). After
lipid extraction, ergosterol amounts were
determined by Gas-Chromatography using
cholesterol as a standard, as described in Materials
and Methods.
Figure 8: 4-PBA decreases UPRE activation
under lipid-induced ER stress.
(A) hem1∆[pJC104] cells were grown for 8 h in YPD
+ ALA (ALA), YPD or YPD + Erg 80 µg.mL -1 (Erg)
for 8 h before determination of β-galactosidase
activity, as in the legend of Figure 1. When
indicated, 4-PBA was added to the culture at a final
concentration of 5 mM. (B) ole1∆[pJC104] cells
were grown to stationary phase in YPD + 1 %
Tween 80 (v/v) and shifted for 5 h in YPD (- Ole),
YPD + 1 % Tween 80 (v/v) (+ Ole) or YPD + 5 mM
4-PBA (- Ole + 4-PBA) before determination of β-
galactosidase activity. (C) hem1∆[pJC104] cells
were grown in YPD + ALA (ALA) as in A, in the
presence of 1 µg.mL -1 Tunicamycin and 5 mM 4-
PBA, as indicated. (D) KMY81[pJC104] cells
bearing the kar2-1 thermosensitive mutation were
grown at 23°C in YPD + 50 µg.mL -1 adenine before
shift to non-permissive temperature (37°C). After 8 h
under these conditions, UPRE activation was
monitored by measuring β-galactosidase activity.
Values are means ± SD of at least three
independent determinations.
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17

Tables
Table 1
For Peer Review 18
Strain Characteristics Source
hem1∆ a MATa trp1 his3 ura3 leu2 hem1::LEU2 Progeny of FY1679 α x FYHO4 (Ferreira et al., 2004)
hem1∆ α MATα trp1 his3 ura3 leu2 hem1::LEU2 Progeny of FY1679 α x FYHO4 (Ferreira et al., 2004)
Traffic
ole1∆ MATα his3 leu2 ura3 YGL055w::kanMX Progeny of diploid Y24422 (EUROSCARF)
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hac1∆ MATα his3 leu2 lys2 ura3 YFL031w::kanMX4 Y15650 (EUROSCARF)
hem1∆, hac1∆ MATa his3 ura3 leu2 trp1 hem1::LEU2 YFL031w::kanMX4 This study, progeny of hem1∆ a x Y15650
ire1∆ MATα his3 leu2 lys2 ura3 YHR079c::kanMX4 Y11907 (EUROSCARF)
hem1∆, ire1∆ MATα his3 ura3 leu2 trp1 lys2 hem1::LEU2 YHR079c::kanMX4 This study, progeny of hem1∆ a x Y11907
KMY81 MATa his3-11 his4115 ura3-1 leu2-3,112 leu1 ade2-1 can1-100 kar2-1 Kimata et al. (2003)
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Invertase secretion assays-The invertase secretion
assays were performed according to the method
described by Munn et al. (52). Yeast cells were
grown as indicated to an OD600 of 0.2–0.5 in the
indicated medium containing 2% glucose. After
washing, 10 OD600 units of cells were induced for
invertase expression by resuspension in selective
medium containing 0.05 % glucose and 2 %
sucrose. Cell samples were taken after 0, 15, 30,
45, and 60 min after transfer to low glucose
medium. Invertase activity was determined as
described by Munn et al. (52), using an enzyme
For Peer Review
reporter assay. Intracellular invertase activity was
calculated by deducting extracellular activity,
measured from unbroken cells, from total invertase,
determined after prior permeabilization of the cells
by freezing in liquid nitrogen in the presence of
10 % Triton X-100.
Supplemental Figure
Figure S1: Consequences of lipid-depletions on
invertase secretion and Pma1p plasma-
membrane delivery.
(A) hem1∆ cells (upper panels) were grown as
described in the legend of Figure 1 to stationary
phase in YPD + ALA before shift and further
incubation for 7 h in fresh YPD + 1 % Tween 80
(v/v) (Ole), YPD + Erg 80 µg.mL -1 (Erg) or YPD +
1 % Tween 80 (v/v) + Erg 80 µg.mL -1 (Erg + Ole).
Invertase was induced by glucose limitation in cells
as described in the Supplemental Materials and
Methods section. Samples were removed at the
time points indicated and the activity of internal and
secreted invertase was determined as described in
Supplemental Materials and Methods. Closed
symbols, extracellular invertase activities (e); Open
symbols, intracellular invertase activities (i). (B)
hem1∆ [Yiplac204-2HSE pr -HA-PMA1] cells were
grown in the indicated media as described in A for
7 h, before incubation for 15 min at 39°C for
induction of Pma1p-HA synthesis. 60 min after the
Traffic
heat-shock, the cells were fixed and processed for
immunofluorescence with antibodies to HA.
Supplemental references
51. Chang HJ, Jesch SA, Gaspar ML, Henry SA.
Role of the Unfolded Protein Response
Pathway in Secretory Stress and Regulation of
INO1 Expression in Saccharomyces cerevisiae.
Genetics 2004;168(4):1899-1913.
52. Munn AL, Heese-Peck A, Stevenson BJ,
Pichler H, Riezman H. Specific sterols required
for the internalization step of endocytosis in
yeast. Mol Biol Cell 1999;10(11):3943-57.
53. DeWitt ND, dos Santos CFT, Allen KE,
Slayman CW. Phosphorylation Region of the
Yeast Plasma-membrane H+-ATPase. ROLE
IN PROTEIN FOLDING AND BIOGENESIS. J.
Biol. Chem. 1998;273(34):21744-21751.
54. Ferreira T, Mason AB, Pypaert M, Allen KE,
Slayman CW. Quality Control in the Yeast
Secretory Pathway. A MISFOLDED PMA1 H+-
ATPase REVEALS TWO CHECKPOINTS. J
Biol Chem 2002;277(23):21027-40.
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Supplemental Material
UPR induction is not related to a global
secretory stress
It has already been proposed that
intracellular accumulation of SFA may induce
disruption of ER function and structure both in
lipotoxic CHO (8, 17) and pancreatic β-cells (8), and
that this disruption may be responsible for the
triggering of ER-stress and UPR response.
Moreover, in yeast, secretory stress that results
For Peer Review
from disruption of the secretory pathway in sec
mutants is also associated to UPRE activation (51).
To assess whether UPR induction could
result from a global defect of the secretory pathway,
the secretion of invertase was measured under
conditions of high UPR induction (+ Erg;
Figure S1A). Internal and external invertase
activities were determined using enzyme latency
assays, as described elsewhere (52; Supplemental
Materials and Methods). As controls, invertase
secretion was also measured in cells grown under
conditions where no significant UPRE activation
was detected (+ Ole; Figure S1A), and under
conditions of low UPRE activation and normal
growth (+Erg + Ole; Figure S1A). As shown in this
figure, the kinetics of invertase secretion were very
similar under all conditions. More specifically, no
intracellular accumulation of invertase could be
detected under lipid stress, as would have been
expected in the case of a general block of the
secretory pathway, as observed with sec mutants
(12).
We also evaluated whether ER-stress
could be correlated with a defect of the trafficking of
integral plasma membrane proteins, by monitoring
the biogenesis of the proton ATPase Pma1p under
these conditions (Figure S1B). For this purpose, a
HA-tagged version of Pma1p under control of a
heat-shock promoter was used (53,54), that allows
its synthesis by transient shifting at elevated
temperature. The newly synthesized protein can be
tracked by immunofluorescence using an anti-HA
Traffic
antibody (53, 54; Supplemental Materials and
Methods). In the experiment displayed in Figure
S1B, cells grown for 7 h under ER-stress conditions
(+ Erg) and control conditions (+ Ole and + Erg +
Ole) were shifted to 39°C for 15 min and Pma1p-HA
was visualized after 2 hours following the shift.
Interestingly, Pma1p-HA could be detected at the
cell periphery under all conditions, showing that ER-
stress is not correlated with the abolition of Pma1p
delivery to the plasma membrane.
Therefore, we conclude from these
experiments that ER stress is not related to a global
block of the secretory pathway.
Supplemental Materials and Methods
Fluorescence microscopy-For Pma1p
immunolocalization studies, a HA-tagged version of
PMA1 was placed under control of a heat-shock
promoter in the integrative plasmid YIplac204
(TRP1; Yiplac204-2HSE pr -HA-PMA1; 54). As
desired, expression of the tagged PMA1 gene was
induced by incubation of the cells for 15 min at 39ºC
(54). HA-tagged Pma1p was essentially visualized
by immunofluorescence as previously described
(54). The primary antibodies used were HA.11
monoclonal 16B12 from raw ascites fluid (Babco),
diluted 1:150. Goat anti-mouse Texas Red IgG
(Jackson Immunoresearch) served as fluorescent
secondary antibodies and were diluted 1:100.
Samples were examined by confocal laser scanning
microscopy using a Biorad MRC 1024 equiped with
a 15mW argon-krypton gas laser. The confocal unit
was attached to an inverted microscope (Olympus
IX70). Images were obtained with Olympus plan apo
x60 water, 1.3 numerical aperture objective lens.
Fluorescence signal collection was performed
through the control software (Lasersharp 3.2; Bio-
Rad). The Texas Red fluorochrome was excited
with the 568 nm yellow line and emission of the dye
was collected via a photomultiplier through a 605
nm pass band filter (35nm width).
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μmol glucose/min/OD 600nm
μmol glucose/min/OD 600nm
0.3
0.2
0.1
+ Erg + Ole (e)
+ Erg + Ole (i)
0.0
0 10 20 30 40 50 60
0.3
0.2
0.1
A
For Peer Review
Time (min)
0.0
0 10 20 30 40 50 60
B
+ Ole (e)
+ Ole (i)
Time (min)
Traffic
Supplemental Figure 1
μmol glucose/min/OD 600nm
0.3
0.2
0.1
+ Erg (e)
+ Erg (i)
0.0
0 10 20 30 40 50 60
Time (min)
Erg + Ole Erg Ole
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Résultats complémentaires de la
seconde publication :
Régulation de la voie INO1 en réponse aux perturbations de
l’homéostasie lipidique
L’UPR est une réponse complexe qui, comme nous venons de le voir, peut être induite
en réponse à de nombreux facteurs. Elle est en outre connectée avec plusieurs voies
métaboliques dont la voie de biosynthèse de phospholipides. Dans le contexte de notre étude,
qui établissait un lien direct entre les perturbations de l’homéostasie lipidique et la réponse
UPR, nous nous sommes donc logiquement intéressés aux connections entre ces deux voies.
Une des premières équipes à évoquer le lien entre la voie UPR et la biosynthèse des
phospholipides est celle de Peter Walter (Université de Californie) en 1997 (Cox et al., 1997).
Ces auteurs ont en effet pu démontrer que certains gènes de biosynthèse des phospholipides
portant un élément de régulation INO1 dans leurs séquences promotrices étaient régulés de
façon concertée avec les gènes de l’UPR. Plus spécifiquement, en étudiant le déclenchement
de la voie INO1 et celui de la voie UPR sous différentes conditions (absence d’inositol,
présence de tunicamycine…), Walter et ses collaborateurs ont postulé que les connections
entre les voies UPR et INO1 pourraient permettre d’adapter la synthèse des membranes à
l’accumulation de protéines mal repliées de sorte à limiter la surchage de ces protéines dans le
RE et, en conséquence le stress qui lui est associé. La Figure 23 représente cette connexion
établie par Walter et al. en 1997 (Cox et al., 1997). Bien que la voie INO1 n’était pas bien
comprise à l’époque de ces travaux, ce mécanisme semble encore de nos jours faire
l’unanimité.
INO1 est un gène codant pour l’inositol-3-phosphate synthase (IPS), protéine
impliquée dans la voie de biosynthèse de l’inositol (Figure 24B). Ce gène est régulé au
niveau transcriptionnel par ses précurseurs, l’inositol et la choline. Il possède une expression
maximale en absence d’inositol, et une répression maximale en présence d’inositol et de
choline dans le milieu. Son système de régulation est assez complexe, et pour des raisons
pratiques, nous avons choisi de ne présenter sa voie que très succintement (Figure 24A). Le
gène INO1 possède sur son promoteur 9 séquences répétées nommées UASINO (pour Upstream
Activating Sequence), dont 2 seulement sont fonctionnelles dans le cadre de la régulation par
131

la choline et l’inositol. Ces éléments UASINO sont des séquences de 10 paires de bases
reconnues par le complexe activateur formé par les facteurs de transcription Ino2p et Ino4p.
Lors d’une carence en inositol, le complexe se fixe sur ces séquences, provoquant une cascade
d’évènements aboutissant à la transcription d’INO1. Cette cascade n’est possible que si une
protéine répresseur, Opi1p (pour Over Production of Inositol) n’est pas fixée sur le promoteur.
En absence d’inositol, Opi1p est séquestrée au niveau de la membrane du RE par son
interaction avec un phospholipide particulier, l’acide phosphatidique (PA), interaction qui est
probablement médiée par la protéine Scs2p (Figure 24A). Lorsque de l’Inositol est rajouté
dans le milieu, le taux de PA diminue dans la cellule (Figure 24C), provoquant la libération
d’Opi1p qui va être rapidement transloquée dans le noyau (dans une échelle de temps de
l’ordre de la minute) où elle va inhiber la transcription en se fixant avec Ino2p sur les
séquences UASINO. De nombreux gènes impliqués dans la biosynthèse des phospholipides
paraissent ainsi régulés par l’inositol chez Saccharomyces cerevisiae (Figure 24B ; (Loewen
et al., 2004)).
Afin d’évaluer la régulation de la voie INO1 dans nos conditions, les cellules hem1Δ
ont été transformées avec un plasmide multicopie pJH359 portant un gène artificiel constitué
du promoteur du gène INO1 positionné en amont du gène rapporteur lacZ (voir les
caractéristiques dans la partie Matériels et Méthodes ; (Scafe et al., 1990)). Pour contrôle,
nous avons déterminé l’activité β-galactosidase dans ces cellules cultivées dans un milieu
synthétique contenant du ALA, mais pas d’inositol (Figure 25). Comme nous pouvons le voir
sur cette Figure, l’induction de la réponse INO1 est, comme nous nous y attendions, très
élevée dans ces conditions (de l’ordre de 50 unités Miller) ; Figure 25), alors que cette
activité est faible pour les mêmes cellules cultivées en milieu complet (contenant donc de
l’inositol) supplémenté en ALA (5 unités Miller environ). De façon intéressante, aucune
induction significative de la réponse INO1 n’est observée en double carence lipidique, et ceci
jusqu’à huit heures de culture, conditions dans lesquelles la réponse UPR est maximale
(Figure p2-1). Ces expériences nous amènent donc à conclure que le déclenchement de la
réponse UPR dans nos conditions de stress lipidiques n’est pas connecté à une adaption du
flux métabolique de la biosynthèse des phospholipides médié par la voie INO1.
132

Figure 23 : Connexions entre la voie UPR et la voie INO1
Voir le texte pour plus de détails.
D’après Cox et al. (Cox et al., 1997).
A/ B/
Opi1p
Sans inositol
Opi1p
Ino2p-Ino4p
UAS INO
UAS INO
PA
Noyau
Noyau
INO1
Avec inositol
INO1
Scs2p
Scs2p
C/
Figure 24 : Mécanisme de la voie INO1 et impact sur la voie phospholipidique
A/ Mécanisme de régulation de la voie INO1. D’après http://www.mbg.cornell.edu/cals/mbg/research/henrylab/index.cfm.
B/ et C/ Effets de l’Inositol sur la régulation de la voie de biosynthèse des phospholipides.
D’après Loewen et al. (Loewen et al., 2004). Pour plus de détails, voir le texte.
133

Bien que pouvant paraître surprenants de prime abord, ces résultats sont néanmoins
cohérents si l’on considère les mécanismes moléculaires de la régulation de la voie INO1 ainsi
que certains résultats préalablement obtenus par notre équipe. En effet, comme décrit au début
de ce chapitre, la régulation d’INO1 implique la séquestration d’Opi1p par le PA au niveau du
Réticulum Endoplasmique. Le niveau de PA pourrait donc être considéré comme la pierre
angulaire de cette voie de régulation. Or, des travaux réalisés dans l’équipe en 2004 (Ferreira
et al., 2004) ont montré que le taux de PA n’est pas significativement modifié en conditions
de double carence lipidique et ceci jusqu’à 24h de culture dans ces conditions. Il est donc
raisonnable de postuler que le taux de PA étant identique, la séquestration d’Opi1p n’est pas
modifiée entre ces deux conditions, et qu’Opi1p présente alors une activité de répression de la
réponse INO1 équivalente dans ces deux cas.
134

Activité β-galactosidase (Unité Miller)
60
50
40
30
20
10
0
5h 6h 7h 8h
Figure 25 : Déclenchement de la réponse INO1
ALA
YPD
Témoin +
La souche hem1Δ a été transformée par le plasmide multicopie pJH359 (Scafe et al., 1990) puis cultivée dans un
milieu complet contenant de l’inositol et supplémenté en ALA (barres noires) ou non (double carence lipidique ;
milieu YPD, barres blanches). Le témoin + (barres grisées) correspond à la même souche cultivée dans un milieu
supplémenté en ALA, mais ne contenant pas d’inositol. L’activité β-galactosidase, exprimée en unités Miller, a
été déterminée comme décrit dans la partie « Matériels et Méthodes ».
135

136

Conclusion et Perspectives
137

MP
Voie
endosomale
V
Dégradation des protéines
Internalisation luminale RSP5 dépendante
N
Transcription
RE
AdG
Machinerie COP II fonctionnelle
Test invertase
Localisation Fur4p-GFP
Accumulation d’AGS
Accumulation d’ergostérol
?
Homéostasie
calcique ??
Figure 26: Schéma récapitulatif de l'ensemble des travaux
?
?
Accumulation d’AGS,
Carence en Ergostérol
Vésiculation
partielle ?
Fur4p-GFP
Stress de courbure (vésiculation partielle ?)
?
Prise en charge par le CQG,
DRM indépendante
Envoi direct dans la voie endosomale
Pma1p
Invertase
Changement local des propriétés de la membrane
(Repliement ? Translocation ?)
?
Accumulation de protéines mal repliées
Stress du RE et réponse UPR
Exemples de pathologies associées :
• Athérosclérose
• Obésité
• Diabète de type 2
• Mucoviscidose
138
Hydroxylation
des
sphingolipides
Exemples de pathologies associées :
• SLOS
• Lathostérolose
• Desmostérolose
Voie INO1
MP : Membrane plasmique ; AdG : Appareil de Golgi ; V : Vacuole ; R : Réticulum Endoplasmique ; N : Noyau.

Au cours de ces trois ans, nous avons évalué les impacts directs et indirects de
perturbations de l’homéostasie lipidique sur divers processus cellulaires chez un modèle
cellulaire eucaryote simple, la levure de boulangerie Saccharomyces cerevisiae.
Nous nous sommes tout d’abord intéressés aux conséquences de ces dérégulations sur
le trafic d’une protéine intégrée de la membrane plasmique, la perméase à uracile Fur4p, ce
qui nous a permis de mettre en évidence un nouveau mécanisme de contrôle qualité, médié
par les lipides, au niveau de l’appareil de Golgi (CQG). Dans un second temps, nous avons
évalué l’impact de ces perturbations sur la fonctionnalité d’un organite clé de la voie de
sécrétion : le Réticulum Endoplasmique.
Ces différents aspects nous ont permis de démontrer de nombreuses similitudes entre
les systèmes de contrôle développés par la levure et par les cellules humaines ouvrant, de ce
fait, des perspectives d’études de pathologies humaines dans un modèle cellulaire simple et
facilement manipulable.
Dans cette conclusion, nous allons donc revenir sur certains de nos résultats
expérimentaux, en les inscrivant et en les discutant dans le contexte de pathologies humaines.
Nous avons tenté de compiler l’ensemble de ces données dans un schéma récapitulatif,
présenté dans la Figure 26.
A. Le stress du Réticulum Endoplasmique lipide-médié : un
modèle pour l’obésité et l’athérosclérose
Le RE est le premier compartiment de la voie de sécrétion. Il est l’organite à travers
lequel transitent la totalité des protéines sécrétées, des protéines intégrées et la plupart des
protéines résidentes des organites intracellulaires. Chez l’homme, certaines cellules
spécialisées présentent une forte activité de sécrétion. C’est le cas, par exemple des cellules
β des îlots de Langherans du pancréas, dont la fonction est, entre autres, de sécréter l’insuline.
Comme nous l’avons évoqué à plusieurs reprises, il a été clairement démontré que
l’accumulation d’acides gras saturés (AGS) dans ces cellules provoquait un stress du RE,
corrélé à une induction de réponse UPR, et que cette dernière se révélait être directement
impliquée dans la cascade d’évènements menant à l’apoptose des cellules β−pancréatiques
(Borradaile et al., 2006; Karaskov et al., 2006; Cunha et al., 2008). Il a été proposé que ce
mécanisme de lipotoxicité pourrait rendre compte des diabètes de type 2 rencontrés chez
certains patients souffrant d’obésité (par déclenchement d’une insulino-résistance), les AGS
provenant dans ce cas de l’alimentation excessive, particulièrement d’origine animale.
139

Nous avons pu démontrer chez la levure que, comme dans les cellules humaines, les
AGS provenant d’une source exogène (apports d’AGS dans le milieu extracellulaire)
pouvaient générer un stress du RE. De plus, dans des cas où les cellules présentent une
incapacité à gérer ce stress (soit des souches affectées dans la réponse UPR : souches hac1Δ
ou ire1Δ) la croissance est significativement affectée, suggérant que la réponse UPR est
essentielle à la survie cellulaire, au moins de façon transitoire, dans ces conditions de
lipotoxicité. Ces similitudes avec les cellules humaines sont particulièrement intéressantes
dans le contexte de l’identification de nouvelles molécules thérapeutiques pour le traitement
de pathologies liées au stress du RE. En effet, nous pouvons envisager d’utiliser la levure pour
le criblage à haut débit de telles molécules. Nous pourrions par exemple imaginer de
transformer nos cellules hem1Δ avec un plasmide portant un promoteur artificiel contenant
des séquences UPRE en amont du gène de la GFP. Cette approche devrait nous permettre de
sélectionner des molécules capables d’inhiber le stress du RE dans nos conditions de
lipotoxicité sur un simple critère d’extinction de la fluorescence associée à la GFP.
Un second point important de notre étude est que le blocage de l’étape de désaturation
des acides gras (par inhibition d’Ole1p), qui résulte en une accumulation intracellulaire
d’AGS, conduit, selon un mécanisme identique à l’ajout d’AGS exogènes, à un stress du RE.
Ces observations sont décrites, à notre connaissance, pour la première fois. Ole1p présente un
homologue chez l’homme : il s’agit la protéine SCD1. Dans le contexte de pathologies
humaines, il est intéressant de rapporter ici qu’une étude récente a montré que des variants
alléliques de SCD1 chez l’homme (présentant des « Single Nucleotide Polymorphims » ou
SNPs) pouvaient affecter la distribution des matières grasses dans l’organisme, ainsi que la
sensibilité à l’insuline (Warensjo et al., 2007). Par analogie avec les résultats que nous avons
obtenus, il est donc tentant de postuler que SCD1 pourrait être directement impliquée dans les
phénomènes de stress du RE lipide-médié, en régulant le taux d’AGS intracellulaires et, par
conséquent, le niveau de saturation des phospholipides, en particulier au niveau de cette
organelle.
Les conséquences des perturbations du contenu phospholipidique sur l’intégrité du RE
restent néanmoins à éclaircir. Deux équipes indépendantes travaillant sur des cellules
animales ont rapporté que la morphologie du RE était clairement affectée en présence d’AGS,
de même que celles du Golgi et des mitochondries (Borradaile et al., 2006; Karaskov et al.,
2006). Ces auteurs ont proposé que ces phénomènes pourraient être directement à l’origine du
déclenchement de la cascade apoptotique. Ce que nous pouvons dire, à cette étape de notre
140

travail, c’est que la voie de sécrétion, et à fortiori la formation des vésicules COPII à la sortie
du RE, ne sont pas complètement annulées dans nos conditions de stress lipidique, si l’on en
juge par les mesures de sécrétion de l’invertase et d’adressage de la protéine intégrée Pma1p à
la membrane plasmique. Un second point est que nous n’avons pas observé de modifications
significatives de l’état de fluidité des membranes microsomales par utilisation de la sonde
Laurdan. L’ensemble de ces données suggère que le déclenchement de l’UPR dans nos
conditions n’est pas corrélé à des perturbations massives et globales de l’intégrité du RE, tant
d’un point de vue biophysique que fonctionnel. Néanmoins, des impacts locaux sur les
membranes peuvent se produire, sans que le Laurdan ne nous permette de les visualiser. Des
perturbations locales peuvent avoir des conséquences sur les phénomènes de translocation des
protéines ou sur leur repliement dans le RE. Des études de microscopie électronique visant à
évaluer des modifications locales de la structure du RE sont actuellement en cours.
Cependant, l’observation d’une inhibition de la réponse UPR dans nos conditions par le 4-
PBA, molécule chaperonne, suggère qu’en effet les perturbations de l’homéostasie lipidique
que nous induisons affectent le repliement et/ou la fonctionnalité de certaines protéines dans
le RE. Une fois encore, notre système s’avère être un bon modèle de pathologie humaine,
puisqu’il a été rapporté que le 4-PBA pouvait efficacement diminuer les phénomènes
d’insulino-résistance et de diabète dans des modèles de souris obèses ou soumises à une
alimentation riche en lipides (Nakatani et al., 2005; Kubota et al., 2006; Ozcan et al., 2006).
Des phénomènes de stress du RE ont également été observés dans des macrophages en
réponse à une accumulation de cholestérol libre dans cette organelle (Feng et al., 2003). Ce
processus pourrait être directement impliqué dans l’athérosclérose, en favorisant, par une
apoptose des macrophages circulant et le dépôt des débris cellulaires résultant à la surface des
artères, la progression de la plaque athérosclérotique. Nous avons pu démontrer dans notre
système que la levure, dans des conditions préalables d’accumulation d’AGS, peut également
séquestrer de l’ergostérol dans son RE, ce qui conduit à une surinduction de l’UPR. Il apparaît
donc que l’ergostérol agit de façon synergique avec les AGS. L’hypothèse que nous
privilégions est que l’ergostérol est séquestré dans le RE dans ces conditions, car il présente
une affinité accrue pour les phospholipides à chaînes d’acides gras saturées, comme cela a pu
être démontré pour le cholestérol dans des membranes artificielles (Brzustowicz et al., 2002;
Epand et al., 2004). Comme nous l’avons déjà discuté dans le chapitre correspondant, ces
observations pourraient rendre compte, au moins en partie, des liens métaboliques qui ont
récemment été établis entre l’obésité et l’athérosclérose (Stein and Stein, 2007), le
141

métabolisme des acides gras et des stérols et leur impact sur le stress du RE étant alors, pour
des raisons biophysiques d’affinité relative des uns pour les autres, intimement liés.
Enfin, dans le cas de l’athérosclérose comme dans celui du diabète de type 2, il a
également été constaté que la lipotoxicité était corrélée à un problème de maintien de
l’homéostasie calcique cellulaire (Feng et al., 2003; Li et al., 2004a). Dans le cas spécifique
de l’athérosclérose, il a été montré que le taux de cholestérol pouvait directement réguler
l’activité de la pompe à calcium SERCA2b, responsable de l’entrée de Ca 2+ dans le RE (Li et
al., 2004a). En conséquence, il a été proposé qu’un excès de cholestérol pourrait provoquer un
relargage massif de Ca 2+ depuis cette organelle par inhibition directe de la pompe (Feng et al.,
2003; Li et al., 2004a). Bien que le système SERCA2b n’existe pas chez la levure, il pourrait
être néanmoins pertinent d’évaluer les effets sur l’homéostasie calcique en réponse à nos
différentes conditions de lipotoxicité.
B. Le contrôle qualité de l’appareil de Golgi lipide-médié : un
modèle pour les pathologies associées à la biosynthèse des
stérols
Malgré le déclenchement de l’UPR dans certaines de nos conditions (accumulation
d’AGS et/ou d’ergostérol), notre protéine membranaire modèle Fur4p-GFP n’est pas retenue
dans le RE : elle tombe sous le coup d’un contrôle qualité de l’appareil de Golgi (CQG) qui
l’adresse de cette organelle vers la vacuole pour dégradation, via la voie endosomale.
L’ensemble des résultats que nous avons obtenus suggère que le paramètre biophysique
déterminant pour l’adressage de Fur4p-GFP à la membrane plasmique serait le stress de
courbure, la diminution du taux d’insaturation des phospholipides et une baisse de la quantité
d’ergostérol induisant théoriquement toutes deux une diminution de ce paramètre.
Nous avons vu dans l’introduction que le stress de courbure peut influencer la
formation de vésicules mais également le repliement de protéines intégrées. Récemment,
l’équipe de Bruno Antonny (Université de Nice Sofia Antipolis) a également montré que la
composition des hélices amphiphiles pouvait influencer le recrutement des protéines intégrées
dans des membranes de courbure variable (Drin et al., 2007). Plus spécifiquement, des hélices
amphipatiques présentant une face riche en résidus hydroxylés auraient tendance à s’associer
à des vésicules de phospholipidides présentant une forte courbure.
142

Prenant l’ensemble de ces données bibliographiques en considération, nous pouvons
proposer plusieurs hypothèses pour rendre compte de la prise en charge de Fur4p-GFP par le
CQG.
La première est qu’une diminution du stress de courbure pourrait directement affecter
le repliement de Fur4p-GFP, par une diminution de la pression latérale dans la région des
chaînes d’acides gras. La pression latérale a en effet été proposée comme facilitant le
« packing » des hélices transmembranaires des protéines polytopiques (Lee, 2003b). Fur4p-
GFP pourrait alors devenir substrat d’un contrôle qualité « classique », associé à une
machinerie protéique basée sur le modèle du contrôle qualité du RE. Néanmoins, nous avons
pu montrer que l’ubiquitination, qui est activement impliquée dans le contrôle qualité du RE,
ne semble intervenir que tardivement dans l’adressage de Fur4p-GFP vers la vacuole, à savoir
dans son étape d’internalisation dans le lumen de cette organelle.
Une seconde hypothèse serait qu’une diminution du stress de courbure affecte la
formation d’une sous population de vésicules, à forte courbure, dans l’appareil de Golgi, à
destination de la membrane plasmique. Il pourrait être imaginé alors que Fur4p-GFP ne puisse
plus emprunter cette voie et soit envoyée, par défaut, vers la voie endosomale. Dans ce
contexte, il est intéressant de noter que plusieurs hélices de Fur4p sont amphiphiles et
présentent des faces riches en résidus hydroxylés. Si l’on se réfère aux travaux de l’équipe de
Bruno Antonny, on pourrait imaginer que ces hélices agissent comme senseurs du stress de
courbure, jouant un rôle direct dans le recrutement de Fur4p-GFP au sein de ces vésicules à
forte courbure.
Un certain nombre d’éléments nous poussent à penser que cette hypothèse est
raisonnable. Tout d’abord, il a été démontré l’existence de sous populations différentes de
vésicules de sécrétion capables d’acheminer les protéines cargos vers la membrane plasmique
(Harsay and Bretscher, 1995). Une deuxième observation est que Fur4p et Pma1p ne
coexistent pas dans les mêmes domaines au niveau de la membrane plasmique (Malinska et
al., 2003). Nos propres résultats démontrent que l’adressage de Pma1p à la surface cellulaire
n’est pas significativement affecté dans nos conditions de carence lipidique. Cet ensemble
d’éléments nous amène donc à postuler que la discrimination entre Fur4p et Pma1p pourrait
s’exercer dès l’appareil de Golgi par leur recrutement différentiel dans des sous-populations
de vésicules émergeant de cette organelle.
Enfin, des problèmes de vésiculation au niveau de l’appareil de Golgi ont été rapportés
dans certaines pathologies humaines caractérisées par une déplétion en cholestérol : il s’agit
du Syndrome de Smith-LemLi-Opitz (SLOS) et des maladies SLOS-like. Dans le cas du
143

SLOS, une mutation au niveau d’un gène de la voie de biosynthèse du cholestérol entraîne
une forte diminution du taux de cholestérol cellulaire, avec augmentation des intermédiaires,
notamment le 7-déhydrocholestérol (7-DHC), très proche structurellement du cholestérol,
mais aux propriétés physico-chimiques différentes. Dans la lathostérolose, une maladie
SLOS-like, c’est le lathostérol qui s’accumule dans les cellules, au dépend du cholestérol. Ces
auteurs ont connecté le taux de formation de granules au niveau de l’appareil de Golgi à la
propension de chacun de ces stérols à engendrer un stress de courbure. La propension à
générer ce stress diminue selon l’ordre suivant : cholestérol > 7-déhydrocholestérol >
lathostérol. De façon concordante, la formation des DCG (pour Dense Core Granules) depuis
l’appareil de Golgi est diminuée de 30 % dans le SLOS, et de près de 40 % pour la
lathostérolose.
Dans le contexte de l’adressage de Fur4p-GFP vers la voie endosomale dans nos
conditions de déplétion en ergostérol, les impacts du 7-déhydrocholestérol et du lathostérol
sur le stress de courbure nous semblent particulièrement intéressants. Nous envisageons dans
les mois à venir d’évaluer l’effet du cholestérol et de ces intermédiaires sur la biogenèse de
Fur4p-GFP, son intégration au sein des DRM, mais également sur le déclenchement de
l’UPR. Le recours à la microscopie électronique devrait également nous amener des
informations sur la capacité des cellules contenant ces différents stérols à former
efficacement des vésicules à la sortie de l’appareil de Golgi.
144

Bibliographie
145

Adams, C.M., Reitz, J., De Brabander, J.K., Feramisco, J.D., Li, L., Brown, M.S., and
Goldstein, J.L. (2004). Cholesterol and 25-Hydroxycholesterol Inhibit Activation of
SREBPs by Different Mechanisms, Both Involving SCAP and Insigs, vol. 279, 52772-
52780.
Alimardani, P., Regnacq, M., Moreau-Vauzelle, C., Ferreira, T., Rossignol, T., Blondin,
B., and Berges, T. (2004). SUT1-promoted sterol uptake involves the ABC transporter
Aus1 and the mannoprotein Dan1 whose synergistic action is sufficient for this process.
Biochem J 381, 195-202.
Allen, S.J., Curran, A.R., Templer, R.H., Meijberg, W., and Booth, P.J. (2004).
Controlling the folding efficiency of an integral membrane protein. Journal of molecular
biology 342, 1293-1304.
Aridor, M. (2007). Visiting the ER: the endoplasmic reticulum as a target for
therapeutics in traffic related diseases. Advanced drug delivery reviews 59, 759-781.
Aridor, M., and Hannan, L.A. (2000). Traffic jam: a compendium of human diseases
that affect intracellular transport processes. Traffic 1, 836-851.
Aridor, M., and Hannan, L.A. (2002). Traffic jams II: an update of diseases of
intracellular transport. Traffic 3, 781-790.
Arvan, P., Zhao, X., Ramos-Castaneda, J., and Chang, A. (2002). Secretory pathway
quality control operating in Golgi, plasmalemmal, and endosomal systems. Traffic 3,
771-780.
Bagnat, M., Chang, A., and Simons, K. (2001). Plasma membrane proton ATPase
Pma1p requires raft association for surface delivery in yeast. Mol Biol Cell 12, 4129-
4138.
Bagnat, M., Keranen, S., Shevchenko, A., Shevchenko, A., and Simons, K. (2000). Lipid
rafts function in biosynthetic delivery of proteins to the cell surface in yeast. Proc Natl
Acad Sci U S A 97, 3254-3259.
Bagnat, M., and Simons, K. (2002). Lipid rafts in protein sorting and cell polarity in
budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Biological chemistry 383, 1475-1480.
Barlowe, C., Orci, L., Yeung, T., Hosobuchi, M., Hamamoto, S., Salama, N., Rexach,
M.F., Ravazzola, M., Amherdt, M., and Schekman, R. (1994). COPII: A membrane coat
formed by Sec proteins that drive vesicle budding from the endoplasmic reticulum. Cell
77, 895-907.
Behnia, R., and Munro, S. (2005). Organelle identity and the signposts for membrane
traffic. Nature 438, 597-604.
Beney, L., Simonin, H., Mille, Y., and Gervais, P. (2007). Membrane physical state as
key parameter for the resistance of the gram-negative Bradyrhizobium japonicum to
hyperosmotic treatments. Archives of microbiology 187, 387-396.
Bengoechea-Alonso, M.T., and Ericsson, J. (2007). SREBP in signal transduction:
cholesterol metabolism and beyond. Current opinion in cell biology 19, 215-222.
Benito, B., Moreno, E., and Lagunas, R. (1991). Half-life of the plasma membrane
ATPase and its activating system in resting yeast cells. Biochimica et biophysica acta
1063, 265-268.
146

Bernales, S., McDonald, K.L., and Walter, P. (2006). Autophagy counterbalances
endoplasmic reticulum expansion during the unfolded protein response. PLoS biology 4,
e423.
Birnboim, H.C., and Doly, J. (1979). A rapid alkaline extraction procedure for screening
recombinant plasmid DNA. Nucl. Acid. Res. 7, 1513-1523.
Blondel, M.-O., Morvan, J., Dupre, S., Urban-Grimal, D., Haguenauer-Tsapis, R., and
Volland, C. (2004a). Direct Sorting of the Yeast Uracil Permease to the Endosomal
System Is Controlled by Uracil Binding and Rsp5p-dependent Ubiquitylation. Mol. Biol.
Cell 15, 883-895.
Blondel, M.O., Morvan, J., Dupre, S., Urban-Grimal, D., Haguenauer-Tsapis, R., and
Volland, C. (2004b). Direct sorting of the yeast uracil permease to the endosomal system
is controlled by uracil binding and Rsp5p-dependent ubiquitylation. Molecular biology
of the cell 15, 883-895.
Boni, L.T., and Hui, S.W. (1983). Polymorphic phase behaviour of
dilinoleoylphosphatidylethanolamine and palmitoyloleoylphosphatidylcholine mixtures.
Structural changes between hexagonal, cubic and bilayer phases. Biochim Biophys Acta
731, 177-185.
Booth, P.J. (2003). The trials and tribulations of membrane protein folding in vitro.
Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes 1610, 51-56.
Borradaile, N.M., Han, X., Harp, J.D., Gale, S.E., Ory, D.S., and Schaffer, J.E. (2006).
Disruption of endoplasmic reticulum structure and integrity in lipotoxic cell death. J
Lipid Res 47, 2726-2737.
Botelho, A.V., Huber, T., Sakmar, T.P., and Brown, M.F. (2006). Curvature and
Hydrophobic Forces Drive Oligomerization and Modulate Activity of Rhodopsin in
Membranes, vol. 91, 4464-4477.
Bowie, J.U. (2005). Solving the membrane protein folding problem. Nature 438, 581-589.
Brown, D.A., and London, E. (2000). Structure and function of sphingolipid- and
cholesterol-rich membrane rafts. J Biol Chem 275, 17221-17224.
Brown, R.E. (1998). Sphingolipid organization in biomembranes: what physical studies
of model membranes reveal, vol. 111, 1-9.
Brzustowicz, M.R., Cherezov, V., Zerouga, M., Caffrey, M., Stillwell, W., and Wassall,
S.R. (2002). Controlling membrane cholesterol content. A role for polyunsaturated
(docosahexaenoate) phospholipids. Biochemistry 41, 12509-12519.
Buede, R., Rinker-Schaffer, C., Pinto, W.J., Lester, R.L., and Dickson, R.C. (1991).
Cloning and characterization of LCB1, a Saccharomyces gene required for biosynthesis
of the long-chain base component of sphingolipids. J Bacteriol 173, 4325-4332.
Burnette, W. (1981). "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from
sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and
radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 112,
195-203.
Chang, A., and Fink, G.R. (1995). Targeting of the yeast plasma membrane
[H+]ATPase: a novel gene AST1 prevents mislocalization of mutant ATPase to the
vacuole. The Journal of cell biology 128, 39-49.
147

Chang, X.-b., Cui, L., Hou, Y.-x., Jensen, T.J., Aleksandrov, A.A., Mengos, A., and
Riordan, J.R. (1999). Removal of Multiple Arginine-Framed Trafficking Signals
Overcomes Misprocessing of [Delta]F508 CFTR Present in Most Patients with Cystic
Fibrosis. Molecular cell 4, 137-142.
Chen, Z., and Rand, R.P. (1997). The influence of cholesterol on phospholipid
membrane curvature and bending elasticity. Biophys J 73, 267-276.
Cornelius, F. (2001). Modulation of Na,K-ATPase and Na-ATPase Activity by
Phospholipids and Cholesterol. I. Steady-State Kinetics, vol. 40, 8842-8851.
Cox, J., and Walter, P. (1996a). A novel mechanism for regulating activity of a
transcription factor that controls the unfolded protein response. Cell 87, 391-404.
Cox, J.S., Chapman, R.E., and Walter, P. (1997). The unfolded protein response
coordinates the production of endoplasmic reticulum protein and endoplasmic
reticulum membrane [In Process Citation], vol. 8, 1805-1814.
Cox, J.S., Shamu, C.E., and Walter, P. (1993). Transcriptional induction of genes
encoding endoplasmic reticulum resident proteins requires a transmembrane protein
kinase. Cell 73, 1197-1206.
Cox, J.S., and Walter, P. (1996b). A novel mechanism for regulating activity of a
transcription factor that controls the unfolded protein response. Cell 87, 391-404.
Cunha, D.A., Hekerman, P., Ladriere, L., Bazarra-Castro, A., Ortis, F., Wakeham,
M.C., Moore, F., Rasschaert, J., Cardozo, A.K., Bellomo, E., Overbergh, L., Mathieu,
C., Lupi, R., Hai, T., Herchuelz, A., Marchetti, P., Rutter, G.A., Eizirik, D.L., and Cnop,
M. (2008). Initiation and execution of lipotoxic ER stress in pancreatic {beta}-cells, vol.
121, 2308-2318.
Dawes I.W., and I.D., H. (1974). Selective killing of vegetative cells in sporulated yeast
cultures by exposure to diethyl ether. Mol Gen Genet. 131, 281-289.
de Almeida, S.F., Picarote, G., Fleming, J.V., Carmo-Fonseca, M., Azevedo, J.E., and de
Sousa, M. (2007). Chemical chaperones reduce endoplasmic reticulum stress and
prevent mutant HFE aggregate formation. J Biol Chem 282, 27905-27912.
De Matteis, M.A., and Luini, A. (2008). Exiting the Golgi complex. Nature reviews 9,
273-284.
Dickson, R.C. (2008). Thematic Review Series: Sphingolipids. New insights into
sphingolipid metabolism and function in budding yeast, vol. 49, 909-921.
Dickson, R.C., Sumanasekera, C., and Lester, R.L. (2006). Functions and metabolism of
sphingolipids in Saccharomyces cerevisiae. Progress in Lipid Research 45, 447-465.
Drin, G., Casella, J.F., Gautier, R., Boehmer, T., Schwartz, T.U., and Antonny, B.
(2007). A general amphipathic alpha-helical motif for sensing membrane curvature.
Nature structural & molecular biology 14, 138-146.
Dupre, S., and Haguenauer-Tsapis, R. (2001a). Deubiquitination step in the endocytic
pathway of yeast plasma membrane proteins: crucial role of Doa4p ubiquitin
isopeptidase. Molecular and cellular biology 21, 4482-4494.
Dupre, S., and Haguenauer-Tsapis, R. (2001b). Deubiquitination Step in the Endocytic
Pathway of Yeast Plasma Membrane Proteins: Crucial Role of Doa4p Ubiquitin
Isopeptidase. Mol. Cell. Biol. 21, 4482-4494.
148

Dupre, S., and Haguenauer-Tsapis, R. (2003). Raft partitioning of the yeast uracil
permease during trafficking along the endocytic pathway. Traffic 4, 83-96.
Ellgaard, L., Molinari, M., and Helenius, A. (1999). Setting the standards: quality
control in the secretory pathway. Science 286, 1882-1888.
Emr, S.D., Schauer, I., Hansen, W., Esmon, P., and Schekman, R. (1984). Invertase betagalactosidase
hybrid proteins fail to be transported from the endoplasmic reticulum in
Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 4, 2347-2355.
Epand, R.M., Epand, R.F., Bain, A.D., Sayer, B.G., and Hughes, D.W. (2004). Properties
of polyunsaturated phosphatidylcholine membranes in the presence and absence of
cholesterol. Magn Reson Chem 42, 139-147.
Epand, R.M., Epand, R.F., Hughes, D.W., Sayer, B.G., Borochov, N., Bach, D., and
Wachtel, E. (2005). Phosphatidylcholine structure determines cholesterol solubility and
lipid polymorphism. Chemistry and Physics of Lipids 135, 39-53.
Epand, R.M., Hughes, D.W., Sayer, B.G., Borochov, N., Bach, D., and Wachtel, E.
(2003). Novel properties of cholesterol-dioleoylphosphatidylcholine mixtures. Biochimica
et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes 1616, 196-208.
Espenshade, P.J., and Hughes, A.L. (2007). Regulation of Sterol Synthesis in
Eukaryotes, vol. 41, 401-427.
Feng, B., Yao, P.M., Li, Y., Devlin, C.M., Zhang, D., Harding, H.P., Sweeney, M., Rong,
J.X., Kuriakose, G., Fisher, E.A., Marks, A.R., Ron, D., and Tabas, I. (2003). The
endoplasmic reticulum is the site of cholesterol-induced cytotoxicity in macrophages.
Nat Cell Biol 5, 781-792.
Ferreira, T., Mason, A.B., Pypaert, M., Allen, K.E., and Slayman, C.W. (2002). Quality
control in the yeast secretory pathway: a misfolded PMA1 H+-ATPase reveals two
checkpoints. J Biol Chem 277, 21027-21040.
Ferreira, T., Mason, A.B., and Slayman, C.W. (2001). The yeast Pma1 proton pump: a
model for understanding the biogenesis of plasma membrane proteins. J Biol Chem 276,
29613-29616.
Ferreira, T., Regnacq, M., Alimardani, P., Moreau-Vauzelle, C., and Berges, T. (2004).
Lipid dynamics in yeast under haem-induced unsaturated fatty acid and/or sterol
depletion. Biochem J 378, 899-908.
Ferreira T, R.M., Alimardani P, Moreau-Vauzelle C, Berges T. (2004). Lipid dynamics
in yeast under haem-induced unsaturated fatty acid and/or sterol depletion. Biochem. J.
378, (899–908).
Fewell, S.W., Travers, K.J., Weissman, J.S., and Brodsky, J.L. (2001). The action of
molecular chaperones in the early secretory pathway. Annual review of genetics 35, 149-
191.
Funato, K., and Riezman, H. (2001). Vesicular and nonvesicular transport of ceramide
from ER to the Golgi apparatus in yeast. The Journal of cell biology 155, 949-959.
Gaigg, B., Timischl, B., Corbino, L., and Schneiter, R. (2005a). Synthesis of
sphingolipids with very long-chain fatty acids but not ergosterol is required for routing
of newly synthesized plasma membrane ATPase to the cell surface of yeast. J. Biol.
Chem., M413472200.
149

Gaigg, B., Timischl, B., Corbino, L., and Schneiter, R. (2005b). Synthesis of
Sphingolipids with Very Long Chain Fatty Acids but Not Ergosterol Is Required for
Routing of Newly Synthesized Plasma Membrane ATPase to the Cell Surface of Yeast
10.1074/jbc.M413472200. J. Biol. Chem. 280, 22515-22522.
Gaigg, B., Toulmay, A., and Schneiter, R. (2006). Very Long-chain Fatty Acidcontaining
Lipids rather than Sphingolipids per se Are Required for Raft Association
and Stable Surface Transport of Newly Synthesized Plasma Membrane ATPase in
Yeast. J Biol Chem 281, 34135-34145.
Galan, J.M., Moreau, V., Andre, B., Volland, C., and Haguenauer-Tsapis, R. (1996).
Ubiquitination mediated by the Npi1p/Rsp5p ubiquitin-protein ligase is required for
endocytosis of the yeast uracil permease. J Biol Chem 271, 10946-10952.
Galan, J.M., Volland, C., Urban-Grimal, D., and Haguenauer-Tsapis, R. (1994). The
yeast plasma membrane uracil permease is stabilized against stress induced degradation
by a point mutation in a cyclin-like "destruction box". Biochemical and biophysical
research communications 201, 769-775.
Garnier C, B.M., Haguenauer-Tsapis R. (1996). Membrane topology of the yeast uracil
permease. Mol Microbiol. 21, 1061-1073.
Goldstein, A., and Lampen, J.O. (1975). Beta-D-fructofuranoside fructohydrolase from
yeast. Methods in enzymology 42, 504-511.
Gondre-Lewis, M.C., Petrache, H.I., Wassif, C.A., Harries, D., Parsegian, A., Porter,
F.D., and Loh, Y.P. (2006). Abnormal sterols in cholesterol-deficiency diseases cause
secretory granule malformation and decreased membrane curvature
10.1242/jcs.02906. J Cell Sci 119, 1876-1885.
Gong, X., and Chang, A. (2001). A mutant plasma membrane ATPase, Pma1-10, is
defective in stability at the yeast cell surface. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 9104-9109.
Gruner, S.M. (1985). Intrinsic curvature hypothesis for biomembrane lipid composition:
a role for nonbilayer lipids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America 82, 3665-3669.
Guan, X.L., and Wenk, M.R. (2006). Mass spectrometry-based profiling of
phospholipids and sphingolipids in extracts from Saccharomyces cerevisiae. Yeast 23,
465-477.
Hakomori, S., Nudelman, E., Levery, S.B., and Kannagi, R. (1984). Novel fucolipids
accumulating in human adenocarcinoma. I. Glycolipids with di- or trifucosylated type 2
chain, vol. 259, 4672-4680.
Hampton, R.Y. (2000). ER stress response: getting the UPR hand on misfolded proteins.
Curr Biol 10, R518-521.
Hancock, J.F. (2006). Lipid rafts: contentious only from simplistic standpoints. Nature
reviews 7, 456-462.
Hannun, Y.A., and Luberto, C. (2000). Ceramide in the eukaryotic stress response.
Trends in Cell Biology 10, 73-80.
Harding, H.P., Zhang, Y., and Ron, D. (1999). Protein translation and folding are
coupled by an endoplasmic-reticulum-resident kinase. Nature 397, 271-274.
150

Harsay, E., and Bretscher, A. (1995). Parallel secretory pathways to the cell surface in
yeast. The Journal of cell biology 131, 297-310.
Hearn, J.D., Lester, R.L., and Dickson, R.C. (2003a). The Uracil Transporter Fur4p
Associates with Lipid Rafts. J. Biol. Chem. 278, 3679-3686.
Hearn, J.D., Lester, R.L., and Dickson, R.C. (2003b). The Uracil Transporter Fur4p
Associates with Lipid Rafts
10.1074/jbc.M209170200. J. Biol. Chem. 278, 3679-3686.
Heberle, F.A., Buboltz, J.T., Stringer, D., and Feigenson, G.W. (2005). Fluorescence
methods to detect phase boundaries in lipid bilayer mixtures. Biochim Biophys Acta
1746, 186-192.
Helliwell, S.B., Losko, S., and Kaiser, C.A. (2001). Components of a ubiquitin ligase
complex specify polyubiquitination and intracellular trafficking of the general amino
acid permease. The Journal of cell biology 153, 649-662.
Hong, H., and Tamm, L.K. (2004). Elastic coupling of integral membrane protein
stability to lipid bilayer forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America 101, 4065-4070.
Hui, S.W., and Sen, A. (1989). Effects of lipid packing on polymorphic phase behavior
and membrane properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America 86, 5825-5829.
Idkowiak-Baldys, J., Grilley, M.M., and Takemoto, J.Y. (2004). Sphingolipid C4
hydroxylation influences properties of yeast detergent-insoluble glycolipid-enriched
membranes. FEBS Letters 569, 272-276.
Ish-Horowicz, D., and J.F., B. (1981). Rapid and efficient cosmid cloning. Nucl. Acid.
Res. 9, 2989-2998.
Johnson, A.E., and van Waes, M.A. (1999). The translocon: a dynamic gateway at the
ER membrane. Annual review of cell and developmental biology 15, 799-842.
Kaliszewski, P., Ferreira, T., Gajewska, B., Szkopinska, A., Berges, T., and Zoladek, T.
(2006). Enhanced levels of Pis1p (phosphatidylinositol synthase) improve the growth of
Saccharomyces cerevisiae cells deficient in Rsp5 ubiquitin ligase. Biochem J 395, 173-
181.
Karaskov, E., Scott, C., Zhang, L., Teodoro, T., Ravazzola, M., and Volchuk, A. (2006).
Chronic palmitate but not oleate exposure induces endoplasmic reticulum stress, which
may contribute to INS-1 pancreatic beta-cell apoptosis. Endocrinology 147, 3398-3407.
Katzmann, D.J., Epping, E.A., and Moye-Rowley, W.S. (1999). Mutational disruption of
plasma membrane trafficking of Saccharomyces cerevisiae Yor1p, a homologue of
mammalian multidrug resistance protein. Molecular and cellular biology 19, 2998-3009.
Kaufman, R.J. (2004). Regulation of mRNA translation by protein folding in the
endoplasmic reticulum. Trends Biochem Sci 29, 152-158.
Keller, R.K., Arnold, T.P., and Fliesler, S.J. (2004). Formation of 7-dehydrocholesterolcontaining
membrane rafts in vitro and in vivo, with relevance to the Smith-Lemli-Opitz
syndrome, vol. 45, 347-355.
Killian, J.A. (1998). Hydrophobic mismatch between proteins and lipids in membranes.
Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Biomembranes 1376, 401-415.
151

Kolaczkowski, M., Kolaczkowska, A., Gaigg, B., Schneiter, R., and Moye-Rowley, W.S.
(2004). Differential regulation of ceramide synthase components LAC1 and LAG1 in
Saccharomyces cerevisiae. Eukaryotic cell 3, 880-892.
Kubota, K., Niinuma, Y., Kaneko, M., Okuma, Y., Sugai, M., Omura, T., Uesugi, M.,
Uehara, T., Hosoi, T., and Nomura, Y. (2006). Suppressive effects of 4-phenylbutyrate
on the aggregation of Pael receptors and endoplasmic reticulum stress. J Neurochem 97,
1259-1268.
Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head
of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.
Lauwers, E., and Andre, B. (2006). Association of yeast transporters with detergentresistant
membranes correlates with their cell-surface location. Traffic 7, 1045-1059.
Lee, A.G. (2003a). Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural
perspective. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes 1612, 1-40.
Lee, A.G. (2003b). Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural
perspective. Biochim Biophys Acta 1612, 1-40.
Lee, A.G. (2004a). How lipids affect the activities of integral membrane proteins.
Biochim Biophys Acta 1666, 62-87.
Lee, A.G. (2004b). How lipids affect the activities of integral membrane proteins.
Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes 1666, 62-87.
Lee, A.G. (2004c). How lipids affect the activities of integral membrane proteins.
Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes
Lipid-Protein Interactions 1666, 62-87.
Lee, M.C., Hamamoto, S., and Schekman, R. (2002). Ceramide biosynthesis is required
for the formation of the oligomeric H+-ATPase Pma1p in the yeast endoplasmic
reticulum. J Biol Chem 277, 22395-22401.
Li, J., Ni, M., Lee, B., Barron, E., Hinton, D.R., and Lee, A.S. (2008). The unfolded
protein response regulator GRP78//BiP is required for endoplasmic reticulum integrity
and stress-induced autophagy in mammalian cells. Cell Death Differ.
Li, Y., Ge, M., Ciani, L., Kuriakose, G., Westover, E.J., Dura, M., Covey, D.F., Freed,
J.H., Maxfield, F.R., Lytton, J., and Tabas, I. (2004a). Enrichment of endoplasmic
reticulum with cholesterol inhibits sarcoplasmic-endoplasmic reticulum calcium
ATPase-2b activity in parallel with increased order of membrane lipids: implications for
depletion of endoplasmic reticulum calcium stores and apoptosis in cholesterol-loaded
macrophages. J Biol Chem 279, 37030-37039.
Li, Y., Ge, M., Ciani, L., Kuriakose, G., Westover, E.J., Dura, M., Covey, D.F., Freed,
J.H., Maxfield, F.R., Lytton, J., and Tabas, I. (2004b). Enrichment of Endoplasmic
Reticulum with Cholesterol Inhibits Sarcoplasmic-Endoplasmic Reticulum Calcium
ATPase-2b Activity in Parallel with Increased Order of Membrane Lipids:
IMPLICATIONS FOR DEPLETION OF ENDOPLASMIC RETICULUM CALCIUM
STORES AND APOPTOSIS IN CHOLESTEROL-LOADED MACROPHAGES
10.1074/jbc.M405195200. J. Biol. Chem. 279, 37030-37039.
Liu, X.F., and Culotta, V.C. (1999). Post-translation Control of Nramp Metal Transport
in Yeast. ROLE OF METAL IONS AND THE BSD2 GENE
152

10.1074/jbc.274.8.4863. J. Biol. Chem. 274, 4863-4868.
Liu, X.F., Supek, F., Nelson, N., and Culotta, V.C. (1997). Negative Control of Heavy
Metal Uptake by the Saccharomyces cerevisiae BSD2 Gene
10.1074/jbc.272.18.11763. J. Biol. Chem. 272, 11763-11769.
Liu, Y., and Chang, A. (2006). Quality control of a mutant plasma membrane ATPase:
ubiquitylation prevents cell-surface stability. Journal of cell science 119, 360-369.
Liu, Y., Sitaraman, S., and Chang, A. (2006). Multiple degradation pathways for
misfolded mutants of the yeast plasma membrane ATPase, Pma1. J Biol Chem 281,
31457-31466.
Loewen, C.J., Gaspar, M.L., Jesch, S.A., Delon, C., Ktistakis, N.T., Henry, S.A., and
Levine, T.P. (2004). Phospholipid metabolism regulated by a transcription factor sensing
phosphatidic acid. Science 304, 1644-1647.
London, E. (2005). How principles of domain formation in model membranes may
explain ambiguities concerning lipid raft formation in cells. Biochim Biophys Acta 1746,
203-220.
Luo, W., and Chang, A. (1997). Novel genes involved in endosomal traffic in yeast
revealed by suppression of a targeting-defective plasma membrane ATPase mutant. J
Cell Biol 138, 731-746.
Luo, W., and Chang, A. (2000). An endosome-to-plasma membrane pathway involved in
trafficking of a mutant plasma membrane ATPase in yeast. Molecular biology of the cell
11, 579-592.
Luo, W.J., Gong, X.H., and Chang, A. (2002). An ER Membrane Protein, Sop4,
Facilitates ER Export of the Yeast Plasma Membrane [H+]ATPase, Pma1. Traffic 3,
730-739.
Malinska, K., Malinsky, J., Opekarova, M., and Tanner, W. (2003). Visualization of
protein compartmentation within the plasma membrane of living yeast cells. Mol Biol
Cell 14, 4427-4436.
Malinska, K., Malinsky, J., Opekarova, M., and Tanner, W. (2004). Distribution of
Can1p into stable domains reflects lateral protein segregation within the plasma
membrane of living S. cerevisiae cells. Journal of cell science 117, 6031-6041.
Mall, S., Broadbridge, R., Sharma, R.P., East, J.M., and Lee, A.G. (2001). Selfassociation
of model transmembrane alpha-helices is modulated by lipid structure.
Biochemistry 40, 12379-12386.
Mall, S., Broadbridge, R., Sharma, R.P., Lee, A.G., and East, J.M. (2000). Effects of
aromatic residues at the ends of transmembrane alpha-helices on helix interactions with
lipid bilayers. Biochemistry 39, 2071-2078.
Marchal, C., Haguenauer-Tsapis, R., and Urban-Grimal, D. (2000). Casein kinase Idependent
phosphorylation within a PEST sequence and ubiquitination at nearby
lysines signal endocytosis of yeast uracil permease. J Biol Chem 275, 23608-23614.
Maxfield, F.R., and Tabas, I. (2005). Role of cholesterol and lipid organization in
disease. Nature 438, 612-621.
Megha, Bakht, O., and London, E. (2006). Cholesterol Precursors Stabilize Ordinary
and Ceramide-rich Ordered Lipid Domains (Lipid Rafts) to Different Degrees:
153

IMPLICATIONS FOR THE BLOCH HYPOTHESIS AND STEROL BIOSYNTHESIS
DISORDERS, vol. 281, 21903-21913.
Meusser, B., Hirsch, C., Jarosch, E., and Sommer, T. (2005). ERAD: the long road to
destruction. Nat Cell Biol 7, 766-772.
Mironov, A.A., Beznoussenko, G.V., Polishchuk, R.S., and Trucco, A. (2005). Intra-
Golgi transport: a way to a new paradigm? Biochimica et biophysica acta 1744, 340-350.
Mori, K., Kawahara, T., Yoshida, H., Yanagi, H., and Yura, T. (1996). Signalling from
endoplasmic reticulum to nucleus: transcription factor with a basic-leucine zipper motif
is required for the unfolded protein-response pathway. Genes Cells 1, 803-817.
Mori, K., Ma, W., Gething, M.J., and Sambrook, J. (1993). A transmembrane protein
with a cdc2+/CDC28-related kinase activity is required for signaling from the ER to the
nucleus. Cell 74, 743-756.
Mori, K., Sant, A., Kohno, K., Normington, K., Gething, M.J., and Sambrook, J.F.
(1992). A 22 bp cis-acting element is necessary and sufficient for the induction of the
yeast KAR2 (BiP) gene by unfolded proteins. The EMBO journal 11, 2583-2593.
Morvan, J., Froissard, M., Haguenauer-Tsapis, R., and Urban-Grimal, D. (2004a). The
ubiquitin ligase Rsp5p is required for modification and sorting of membrane proteins
into multivesicular bodies. Traffic 5, 383-392.
Morvan, J., Froissard, M., Haguenauer-Tsapis, R., and Urban-Grimal, D. (2004b). The
Ubiquitin Ligase Rsp5p is Required for Modification and Sorting of Membrane Proteins
into Multivesicular Bodies. Traffic 5, 383-392.
Munn, A.L., Heese-Peck, A., Stevenson, B.J., Pichler, H., and Riezman, H. (1999).
Specific sterols required for the internalization step of endocytosis in yeast. Mol Biol
Cell 10, 3943-3957.
Munro, S. (2003). Lipid rafts: elusive or illusive? Cell 115, 377-388.
Nakatani, Y., Kaneto, H., Kawamori, D., Yoshiuchi, K., Hatazaki, M., Matsuoka, T.A.,
Ozawa, K., Ogawa, S., Hori, M., Yamasaki, Y., and Matsuhisa, M. (2005). Involvement
of endoplasmic reticulum stress in insulin resistance and diabetes. J Biol Chem 280, 847-
851.
Ness, F., Achstetter, T., Duport, C., Karst, F., Spagnoli, R., and Degryse, E. (1998).
Sterol uptake in Saccharomyces cerevisiae heme auxotrophic mutants is affected by
ergosterol and oleate but not by palmitoleate or by sterol esterification. J Bacteriol 180,
1913-1919.
Ness, F., Bourot, S., Regnacq, M., Spagnoli, R., Berges, T., and Karst, F. (2001). SUT1 is
a putative Zn[II]2Cys6-transcription factor whose upregulation enhances both sterol
uptake and synthesis in aerobically growing Saccharomyces cerevisiae cells. European
journal of biochemistry / FEBS 268, 1585-1595.
Nilsson, I., Ohvo-Rekila, H., Slotte, J.P., Johnson, A.E., and von Heijne, G. (2001).
Inhibition of Protein Translocation across the Endoplasmic Reticulum Membrane by
Sterols, vol. 276, 41748-41754.
Norez, C., Noel, S., Wilke, M., Bijvelds, M., Jorna, H., Melin, P., DeJonge, H., and Becq,
F. (2006). Rescue of functional delF508-CFTR channels in cystic fibrosis epithelial cells
by the [alpha]-glucosidase inhibitor miglustat. FEBS Letters 580, 2081-2086.
154

Ntambi, J.M. (1999). Regulation of stearoyl-CoA desaturase by polyunsaturated fatty
acids and cholesterol. J. Lipid Res. 40, 1549-1558.
O'Keeffe, A.H., East, J.M., and Lee, A.G. (2000). Selectivity in Lipid Binding to the
Bacterial Outer Membrane Protein OmpF, vol. 79, 2066-2074.
Ogata, M., Hino, S., Saito, A., Morikawa, K., Kondo, S., Kanemoto, S., Murakami, T.,
Taniguchi, M., Tanii, I., Yoshinaga, K., Shiosaka, S., Hammarback, J.A., Urano, F., and
Imaizumi, K. (2006). Autophagy is activated for cell survival after endoplasmic
reticulum stress. Molecular and cellular biology 26, 9220-9231.
Okiyoneda, T., Niibori, A., Harada, K., Kohno, T., Michalak, M., Duszyk, M., Wada, I.,
Ikawa, M., Shuto, T., Suico, M.A., and Kai, H. (2008). Role of calnexin in the ER quality
control and productive folding of CFTR; differential effect of calnexin knockout on
wild-type and [Delta]F508 CFTR. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell
Research 1783, 1585-1594.
Opekarova, M., Malinska, K., Novakova, L., and Tanner, W. (2005). Differential effect
of phosphatidylethanolamine depletion on raft proteins: further evidence for diversity of
rafts in Saccharomyces cerevisiae. Biochim Biophys Acta 1711, 87-95.
Osborne, A.R., Rapoport, T.A., and van den Berg, B. (2005). Protein translocation by
the Sec61/SecY channel. Annual review of cell and developmental biology 21, 529-550.
Ozcan, U., Cao, Q., Yilmaz, E., Lee, A.H., Iwakoshi, N.N., Ozdelen, E., Tuncman, G.,
Gorgun, C., Glimcher, L.H., and Hotamisligil, G.S. (2004). Endoplasmic reticulum stress
links obesity, insulin action, and type 2 diabetes. Science 306, 457-461.
Ozcan, U., Yilmaz, E., Ozcan, L., Furuhashi, M., Vaillancourt, E., Smith, R.O., Gorgun,
C.Z., and Hotamisligil, G.S. (2006). Chemical chaperones reduce ER stress and restore
glucose homeostasis in a mouse model of type 2 diabetes. Science 313, 1137-1140.
Parasassi, T., De Stasio, G., Miccheli, A., Bruno, F., Conti, F., and Gratton, E. (1990).
Abscisic acid-induced microheterogeneity in phospholipid vesicles. A fluorescence study.
Biophysical chemistry 35, 65-73.
Parasassi, T., De Stasio, G., Ravagnan, G., Rusch, R.M., and Gratton, E. (1991).
Quantitation of lipid phases in phospholipid vesicles by the generalized polarization of
Laurdan fluorescence. Biophysical journal 60, 179-189.
Parasassi, T., Di Stefano, M., Ravagnan, G., Sapora, O., and Gratton, E. (1992).
Membrane aging during cell growth ascertained by Laurdan generalized polarization.
Experimental cell research 202, 432-439.
Parasassi, T., Giusti, A.M., Raimondi, M., and Gratton, E. (1995). Abrupt modifications
of phospholipid bilayer properties at critical cholesterol concentrations. Biophysical
journal 68, 1895-1902.
Parasassi, T., Ravagnan, G., Rusch, R.M., and Gratton, E. (1993). Modulation and
dynamics of phase properties in phospholipid mixtures detected by Laurdan
fluorescence. Photochemistry and photobiology 57, 403-410.
Pety de Thozee, C., and Ghislain, M. (2006). ER-associated degradation of membrane
proteins in yeast. TheScientificWorldJournal 6, 967-983.
Pilot, J.D., East, J.M., and Lee, A.G. (2001). Effects of bilayer thickness on the activity of
diacylglycerol kinase of Escherichia coli. Biochemistry 40, 8188-8195.
155

Piper, R.C., and Luzio, J.P. (2001). Late endosomes: sorting and partitioning in
multivesicular bodies. Traffic 2, 612-621.
Pizzirusso, M., and Chang, A. (2004). Ubiquitin-mediated targeting of a mutant plasma
membrane ATPase, Pma1-7, to the endosomal/vacuolar system in yeast. Molecular
biology of the cell 15, 2401-2409.
Porter, F.D. (2006). Cholesterol precursors and facial clefting. The Journal of clinical
investigation 116, 2322-2325.
Porter, F.D. (2008). Smith-Lemli-Opitz syndrome: pathogenesis, diagnosis and
management. Eur J Hum Genet 16, 535-541.
Rapoport, T.A. (2007). Protein translocation across the eukaryotic endoplasmic
reticulum and bacterial plasma membranes. Nature 450, 663-669.
Rapoport, T.A., Goder, V., Heinrich, S.U., and Matlack, K.E. (2004). Membrane-protein
integration and the role of the translocation channel. Trends in cell biology 14, 568-575.
Regnacq, M., Alimardani, P., Moudni, B.E., and Berges, T. (2001). Sut1p interaction
with Cyc8p(Ssn6p) relieves hypoxic genes from Cyc8p-Tup1p repression in
Saccharomyces cerevisiae, vol. 40, 1085-1096.
Regnacq, M., Ferreira, T., Puard, J., and Berges, T. (2002). SUT1 suppresses sec14-1
through upregulation of CSR1 in Saccharomyces cerevisiae. FEMS microbiology letters
216, 165-170.
Roberg, K.J., Rowley, N., and Kaiser, C.A. (1997a). Physiological regulation of
membrane protein sorting late in the secretory pathway of Saccharomyces cerevisiae.
The Journal of cell biology 137, 1469-1482.
Roberg, K.J., Rowley, N., and Kaiser, C.A. (1997b). Physiological Regulation of
Membrane Protein Sorting Late in the Secretory Pathway of Saccharomyces cerevisiae
10.1083/jcb.137.7.1469. J. Cell Biol. 137, 1469-1482.
Robl, I., Grassl, R., Tanner, W., and Opekarova, M. (2001). Construction of
phosphatidylethanolamine-less strain of Saccharomyces cerevisiae. Effect on amino acid
transport. Yeast 18, 251-260.
Ron, D., and Walter, P. (2007). Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded
protein response. Nature reviews 8, 519-529.
Rubio-Texeira, M., and Kaiser, C.A. (2006). Amino acids regulate retrieval of the yeast
general amino acid permease from the vacuolar targeting pathway. Molecular biology of
the cell 17, 3031-3050.
Saibil, H.R. (2008). Chaperone machines in action. Current Opinion in Structural
Biology 18, 35-42.
Sato, K., and Nakano, A. (2007). Mechanisms of COPII vesicle formation and protein
sorting. FEBS letters 581, 2076-2082.
Scafe, C., Chao, D., Lopes, J., Hirsch, J.P., Henry, S., and Young, R.A. (1990). RNA
polymerase II C-terminal repeat influences response to transcriptional enhancer signals.
Nature 347, 491-494.
Schneiter, R., and Toulmay, A. (2007). The role of lipids in the biogenesis of integral
membrane proteins. Applied Microbiology and Biotechnology V73, 1224-1232.
156

Schröder, M. (2008). Endoplasmic reticulum stress responses. Cellular and Molecular
Life Sciences (CMLS) 65, 862-894.
Schulein, R. (2004). The early stages of the intracellular transport of membrane
proteins: clinical and pharmacological implications. Reviews of physiology, biochemistry
and pharmacology 151, 45-91.
Seron, K., Blondel, M.O., Haguenauer-Tsapis, R., and Volland, C. (1999). Uracilinduced
down-regulation of the yeast uracil permease. J Bacteriol 181, 1793-1800.
Sevier, C.S., and Kaiser, C.A. (2002). Formation and transfer of disulphide bonds in
living cells. Nature reviews 3, 836-847.
Shen, J., Chen, X., Hendershot, L., and Prywes, R. (2002). ER stress regulation of ATF6
localization by dissociation of BiP/GRP78 binding and unmasking of Golgi localization
signals. Developmental cell 3, 99-111.
Shen, X., Zhang, K., and Kaufman, R.J. (2004). The unfolded protein response--a stress
signaling pathway of the endoplasmic reticulum. J Chem Neuroanat 28, 79-92.
Soetens, O., De Craene, J.O., and Andre, B. (2001). Ubiquitin is required for sorting to
the vacuole of the yeast general amino acid permease, Gap1. J Biol Chem 276, 43949-
43957.
Springael, J.Y., and Andre, B. (1998). Nitrogen-regulated ubiquitination of the Gap1
permease of Saccharomyces cerevisiae. Molecular biology of the cell 9, 1253-1263.
Stagljar, I., te Heesen, S., and Aebi, M. (1994). New Phenotype of Mutations Deficient in
Glucosylation of the Lipid-Linked Oligosaccharide: Cloning of the ALG8 Locus
10.1073/pnas.91.13.5977. PNAS 91, 5977-5981.
Starling, A.P., East, J.M., and Lee, A.G. (1993). Effects of phosphatidylcholine fatty acyl
chain length on calcium binding and other functions of the (Ca(2+)-Mg2+)-ATPase.
Biochemistry 32, 1593-1600.
Starling, A.P., East, J.M., and Lee, A.G. (1995). Effects of phospholipid fatty acyl chain
length on phosphorylation and dephosphorylation of the Ca(2+)-ATPase. Biochem J 310
( Pt 3), 875-879.
Starling, A.P., Khan, Y.M., East, J.M., and Lee, A.G. (1994). Characterization of the
single Ca(2+)-binding site on the Ca(2+)-ATPase reconstituted with short- or long-chain
phosphatidylcholines. Biochem J 304 ( Pt 2), 569-575.
Stein, O., and Stein, Y. (2007). Resistance to obesity and resistance to atherosclerosis: is
there a metabolic link? Nutr Metab Cardiovasc Dis 17, 554-559.
Sullivan, James A., Lewis, Michael J., Nikko, Elina, Pelham, Hugh R. B. (2007) Multiple
Interactions Drive Adaptor-Mediated Recruitment of the Ubiquitin Ligase Rsp5 to
Membrane Proteins In Vivo and In Vitro, MBC, 18, 2429-2440
Swain, E., Baudry, K., Stukey, J., McDonough, V., Germann, M., and Nickels, J.T., Jr.
(2002). Sterol-dependent Regulation of Sphingolipid Metabolism in Saccharomyces
cerevisiae, vol. 277, 26177-26184.
Tate, M.W., Eikenberry, E.F., Turner, D.C., Shyamsunder, E., and Gruner, S.M. (1991).
Nonbilayer phases of membrane lipids. Chemistry and Physics of Lipids 57, 147-164.
157

Travers, K.J., Patil, C.K., Wodicka, L., Lockhart, D.J., Weissman, J.S., and Walter, P.
(2000). Functional and Genomic Analyses Reveal an Essential Coordination between the
Unfolded Protein Response and ER-Associated Degradation. Cell 101, 249-258.
Trombetta, E.S., and Parodi, A.J. (2003). Quality control and protein folding in the
secretory pathway. Annual review of cell and developmental biology 19, 649-676.
Umebayashi, K., and Nakano, A. (2003). Ergosterol is required for targeting of
tryptophan permease to the yeast plasma membrane. The Journal of cell biology 161,
1117-1131.
Van den Berg, B., Clemons, W.M., Jr., Collinson, I., Modis, Y., Hartmann, E., Harrison,
S.C., and Rapoport, T.A. (2004). X-ray structure of a protein-conducting channel.
Nature 427, 36-44.
van den Brink-van der Laan, E., Antoinette Killian, J., and de Kruijff, B. (2004a).
Nonbilayer lipids affect peripheral and integral membrane proteins via changes in the
lateral pressure profile. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes 1666,
275-288.
van den Brink-van der Laan, E., Antoinette Killian, J., and de Kruijff, B. (2004b).
Nonbilayer lipids affect peripheral and integral membrane proteins via changes in the
lateral pressure profile. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes
Lipid-Protein Interactions 1666, 275-288.
Vashist, S., Kim, W., Belden, W.J., Spear, E.D., Barlowe, C., and Ng, D.T. (2001).
Distinct retrieval and retention mechanisms are required for the quality control of
endoplasmic reticulum protein folding. The Journal of cell biology 155, 355-368.
Volland, C., Garnier, C., and Haguenauer-Tsapis, R. (1992). In vivo phosphorylation of
the yeast uracil permease. J. Biol. Chem. 267, 23767-23771.
Volland, C., Urban-Grimal, D., Geraud, G., and Haguenauer-Tsapis, R. (1994a).
Endocytosis and degradation of the yeast uracil permease under adverse conditions. J.
Biol. Chem. 269, 9833-9841.
Volland, C., Urban-Grimal, D., Geraud, G., and Haguenauer-Tsapis, R. (1994b).
Endocytosis and degradation of the yeast uracil permease under adverse conditions. J
Biol Chem 269, 9833-9841.
Wandinger, S.K., Richter, K., and Buchner, J. (2008). The Hsp90 Chaperone
Machinery, vol. 283, 18473-18477.
Wang, Q., and Chang, A. (2002). Sphingoid base synthesis is required for
oligomerization and cell surface stability of the yeast plasma membrane ATPase, Pma1.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99,
12853-12858.
Wang, X., Matteson, J., An, Y., Moyer, B., Yoo, J.-S., Bannykh, S., Wilson, I.A.,
Riordan, J.R., and Balch, W.E. (2004). COPII-dependent export of cystic fibrosis
transmembrane conductance regulator from the ER uses a di-acidic exit code, vol. 167,
65-74.
Wang, X., Venable, J., LaPointe, P., Hutt, D.M., Koulov, A.V., Coppinger, J., Gurkan,
C., Kellner, W., Matteson, J., Plutner, H., Riordan, J.R., Kelly, J.W., Yates Iii, J.R., and
Balch, W.E. (2006). Hsp90 Cochaperone Aha1 Downregulation Rescues Misfolding of
CFTR in Cystic Fibrosis. Cell 127, 803-815.
158

Warensjo, E., Ingelsson, E., Lundmark, P., Lannfelt, L., Syvanen, A.C., Vessby, B., and
Riserus, U. (2007). Polymorphisms in the SCD1 gene: associations with body fat
distribution and insulin sensitivity. Obesity (Silver Spring, Md 15, 1732-1740.
Wiechelman, K.J., Braun, R.D., and Fitzpatrick, J.D. (1988). Investigation of the
bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color
formation. Analytical biochemistry 175, 231-237.
Yoshida, H., Oku, M., Suzuki, M., and Mori, K. (2006). pXBP1(U) encoded in XBP1 premRNA
negatively regulates unfolded protein response activator pXBP1(S) in
mammalian ER stress response. The Journal of cell biology 172, 565-575.
Young, S.G., and Fielding, C.J. (1999). The ABCs of cholesterol efflux. Nature genetics
22, 316-318.
Zhang, H., He, J., Ji, Y., Kato, A., and Song, Y. (2008). The effect of calnexin deletion on
the expression level of PDI in Saccharomyces cerevisiae under heat stress conditions.
Cellular & Molecular Biology Letters 13, 38-48.
Zhang, J.X., Braakman, I., Matlack, K.E., and Helenius, A. (1997). Quality control in
the secretory pathway: the role of calreticulin, calnexin and BiP in the retention of
glycoproteins with C-terminal truncations. Molecular biology of the cell 8, 1943-1954.
Zinser, E., Paltauf, F., and Daum, G. (1993). Sterol composition of yeast organelle
membranes and subcellular distribution of enzymes involved in sterol metabolism.
Journal of bacteriology 175, 2853-2858.
159

160

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Résumé :
Les protéines intégrées de la membrane plasmique des cellules doivent emprunter la
voie de sécrétion pour atteindre leur destination finale. Des points de contrôles, localisés tout
au long de cette voie, sont capables de repérer les protéines mal repliées et de prendre en
charge leur dégradation. De nombreuses études suggèrent que ces points de contrôles sont
impliqués dans l’étiologie de plusieurs pathologies génétiques humaines. De plus, des
données bibliographiques récentes suggèrent que la régulation de l’homéostasie lipidique
cellulaire pourrait également influencer l’efficacité de ces différents points de contrôle.
Au cours de ce doctorat, nous avons développé une approche nous permettant
d’évaluer l’impact de perturbations de l’homéostasie lipidique sur la biogénèse d’une protéine
membranaire modèle chez la levure Saccharomyces cerevisiae, ainsi que sur l’intégrité
physique d’un compartiment clef de la voie de sécrétion : le Reticulum Endoplasmique (RE).
La levure est un microorganisme anaérobie facultatif, dans le sens où elle peut se développer
en absence d’oxygène. Néanmoins, elle est alors incapable de synthétiser ses acides gras
saturés ainsi que son stérol majoritaire, l’ergostérol. En nous appuyant sur cette propriété
physiologique, unique dans le monde vivant, nous avons induit chez la levure des carences
lipidiques contrôlées (acides gras et/ou ergostérol), et nous en avons évalué les conséquences
sur la biogenèse de Fur4p, une perméase à uracile de la membrane plasmique. Nous avons
démontré que les carences lipidiques résultaient en une prise en charge de la protéine par un
contrôle qualité au niveau de l’appareil de Golgi, résultant en son adressage direct depuis cette
organelle, via la voie endosomale, vers la vacuole pour dégradation. Un ensemble de données
suggèrent que le paramètre biophysique qui contrôle la sortie de Fur4p de l’appareil de Golgi
serait le stress de courbure. Parallèlement à ceci, nous avons également évalué l’effet de ces
différentes carences lipidiques sur la fonctionnalité du RE et plus particulièrement sur le
déclenchement de l’Unfolded Protein Response (UPR), un mécanisme permettant la prise en
charge des protéines mal repliées dans ce compartiment. Nous avons constaté que
l’accumulation d’acides gras saturés au sein des phospholipides provoque le déclenchement
de cette réponse UPR, un phénomène amplifié par la présence d’ergostérol. Il apparaît donc
que le contenu lipidique cellulaire peut directement affecter le repliement des protéines dans
le RE et, en conséquence, réguler la réponse UPR.
L’ensemble de ces résultats expérimentaux, obtenus chez un organisme modèle, est
discuté dans le contexte de pathologies humaines, notamment associées à des dérégulations de
l’homéostasie lipidique et à forte incidence, comme l’athérosclérose et l’obésité.
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