Influence de facteurs biotiques et abiotiques, induits et ... - IRD

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* Electrophorèse : les échantillons sont déposés dans les puits d'un gel de
polyacrylamide à 12 %, chaque puits correspond à une piste; la migration
est réalisée en 5 heures à voltage constant (15 mn à 80 V puis à 180 V).
Le gel de polyacrylamide est découpé en deux selon son épaisseur. Une
moitié sera colorée au bleu de Coomassie pour servir de témoin de
migration. L'autre moitié va servir au transfert.
* Electrotransfert : la feuille de polyacrylamide est déposée sur un film
de nitrocellulose; le transfert se fait par champ électrique (30 V, une
nuit) en tampon tris glycérine pH 8,3, SDS 0,1 %, méthanol 20 %.
* ImmunodétectioD : le gel est découpé afin de séparer les pistes ; celle
qui comprend les marqueurs de P.M. est colorée au noir amido ; deux
autres bandes sont traitées avec des immunsérums :
bande S : immunsérum de souris anti-toxine brute (protéine
native), dilué au 1/1 oooe
bande L : immunsérum de lapin anti-fraction 38 kD de la toxine de
B. sphaericus souche 2775 (anti-protéine dénaturée), dilué au
1/1000 e .
Un conjugué (IgG de chèvre anti-Iapin ou IgG de mouton antisouris)
marqué à la peroxydase est ensuite appliqué. La coloration est
révélée par 0,5 % de diaminobenzidine en solution à 0,1 % de peroxyde
d'hydrogène.