ETUDES BIOLOGIQUES ET CHIMIQUES DES METABOLITES ...
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UNIVERSITE D’ANTANANARIVO<br />
****************************<br />
=================<br />
FACULTE <strong>DES</strong> SCIENCES<br />
****************<br />
DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE FONDAMENTALE <strong>ET</strong> APPLIQUEE<br />
*****************<br />
MEMOIRE DE RECHERCHE POUR L’OBTENTION DU<br />
DIPLOME D’<strong><strong>ET</strong>U<strong>DES</strong></strong> APPROFONDIES DE BIOCHIMIE<br />
OPTION : BIOTECHNOLOGIE-MICROBIOLOGIE<br />
<strong><strong>ET</strong>U<strong>DES</strong></strong> <strong>BIOLOGIQUES</strong> <strong>ET</strong> <strong>CHIMIQUES</strong><br />
<strong>DES</strong> M<strong>ET</strong>ABOLITES SECONDAIRES <strong>DES</strong><br />
ACTINOMYC<strong>ET</strong>ES TELLURIQUES<br />
Cas de la forêt d’ANKAFOBE<br />
Présenté par :<br />
ANDRIAMBOLOLONA Tokiniaina<br />
Maître ès-Sciences<br />
Soutenu publiquement le 30 Août 2010 devant la commission d’examen composée de :<br />
Président : Professeur JEANNODA Victor<br />
Rapporteurs : Professeur RAHERIMANDIMBY Marson<br />
Docteur RASOLOMAMPIANINA Rado<br />
Examinateurs : Docteur RANDRIANIERENANA Ando<br />
Docteur RAKOTO Danielle A. Doll
« Grâces soient rendues à Dieu pour son don merveilleux ! »<br />
2 Corinthiens 9. 15<br />
A Seheno, tout mon amour, merci de ta confiance et<br />
de ton soutien.
Remerciements<br />
Remerciements<br />
Remerciements<br />
Remerciements<br />
Je remercie le Seigneur de me guider chaque jour et de me donner la santé et la<br />
détermination à travers son Amour. Que son Nom soit glorifié.<br />
Je souhaite adresser, à travers ces quelques lignes, ma grande reconnaissance envers<br />
l’Université d’Antananarivo, la Faculté des Sciences, particulièrement, le Département de<br />
Biochimie Fondamentale et Appliquée.<br />
jury :<br />
Mes vifs remerciements vont à tous nos enseignants, spécialement, aux membres du<br />
Monsieur JEANNODA Victor, Professeur titulaire, Responsable de la formation<br />
doctorale « Sciences de la vie ». Malgré vos multiples engagements, vous avez accepté<br />
d’apporter vos critiques constructives à mon mémoire. Votre présence en tant que Président du<br />
jury est un grand honneur pour moi.<br />
Madame le Docteur RAKOTO Danielle A. Doll, Chef du Département. Malgré vos<br />
nombreuses responsabilités, vous avez consenti à examiner avec attention mon travail. Il m’est<br />
gratifiant de vous avoir parmi les membres du jury de mon mémoire.<br />
Madame le Docteur RANDRIANIERENANA Ando. En dépit de vos innombrables<br />
occupations, vous avez daigné porter vos considérations à mon mémoire. Votre siège en tant<br />
qu’examinateur m’honore.<br />
Monsieur RAHERIMANDIMBY Marson, Professeur Titulaire. En acceptant<br />
d’être mon encadreur, vous m’avez accordé une grande partie de votre temps. Vos précieux<br />
conseils m’ont beaucoup aidé. Je vous suis très reconnaissante d’être le rapporteur de mon<br />
mémoire.<br />
Docteur RASOLOMAMPIANINA Rado, co-encadreur de ce Mémoire. Pour ses<br />
conseils judicieux et ses encouragements permanents. Vous n’avez pas hésité à me faire part de<br />
votre expérience pour mener à bien ce travail.
Je tiens à remercier vivement<br />
Monsieur RAVELONANDRO Pierre, Directeur du Centre National de Recherche sur<br />
l’Environnement qui m’a accueilli dans ses Laboratoires pour la réalisation de ce travail.<br />
Monsieur RALAMBONDRAH<strong>ET</strong>Y Rahanira, pour la réalisation de la partie chimie<br />
de ce travail dans son laboratoire.<br />
Monsieur le Docteur RATSIMBASON Michel, Directeur du Centre National<br />
d’Application à la Recherche Pharmaceutique, pour la réalisation des tests anti malaria dans<br />
son laboratoire.<br />
Egalement, j’exprime ma sympathie à toute l’équipe du Laboratoire de microbiologie de<br />
l’Environnement du CNRE, chercheurs, techniciens et stagiaires, pour leur conseil, leur soutien et<br />
leur amitié.<br />
toujours.<br />
Je suis redevable envers ma famille qui m’a beaucoup encouragé et soutenu depuis<br />
Mes sincères remerciements à mes amis et à tous ceux qui ont contribués, de près ou de<br />
loin, à la réalisation de ce mémoire.
- TABLE <strong>DES</strong> MATIERES -<br />
Table des matières<br />
GLOSSAIRE .............................................................................................................................. i<br />
LISTE <strong>DES</strong> ABREVIATIONS ...............................................................................................iii<br />
LISTES <strong>DES</strong> FIGURES .......................................................................................................... iv<br />
LISTES <strong>DES</strong> TABLEAUX ...................................................................................................... v<br />
INTRODUCTION .................................................................................................................... 1<br />
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ....................................................................................... 3<br />
I. Le sol ....................................................................................................................................... 3<br />
I.1. La rhizosphère .................................................................................................................. 3<br />
I.2. Les microorganismes rhizospheriques ............................................................................. 4<br />
II. Les Actinomycètes ............................................................................................................... 5<br />
II.1. Définition des Actinomycètes ......................................................................................... 5<br />
II.1.1. Similitude entre Actinomycètes et champignons ..................................................... 5<br />
II.1.2. Similitude entre Actinomycètes et bactéries ............................................................ 5<br />
II.2. Caractéristiques générales ............................................................................................... 6<br />
II.3. Classification des Actinomycètes ................................................................................... 7<br />
II.3.1. Mycobacteriacées .................................................................................................... 7<br />
II.3.2. Actinomycétacées (ou Pro-Actinomycètes) ............................................................. 7<br />
II.3.3. Streptomycétacées .................................................................................................... 7<br />
II.3.4. Actinoplanacées ...................................................................................................... 8<br />
II.4. Ecologie et distribution des Actinomycètes .................................................................... 9<br />
II.4.1. Sols ........................................................................................................................... 9<br />
II.4.2. Eaux douces et marines ............................................................................................ 9<br />
II.4.3. Air .......................................................................................................................... 10<br />
II.4.5. Actinomycètes pathogènes ..................................................................................... 10<br />
III. Particularités des Actinomycètes telluriques ................................................................. 10
Table des matières<br />
III.1. Les facteurs physiques et chimiques ........................................................................... 10<br />
III.2. Rôle des Actinomycètes telluriques ............................................................................ 11<br />
III.2.1. Aptitude à dégrader les substances organiques non biodégradables par les<br />
champignons et les bactéries .................................................................................................... 11<br />
III.2.2. Aptitude à produire des substances pro biotiques, antibiotiques ou toxiques ...... 11<br />
III.3. Les métabolites secondaires des extraits d’Actinomycètes ......................................... 12<br />
III.3.1. La production d’antibiotique chez les Actinomycètes ......................................... 12<br />
III.3.2. Application des antibiotiques issus des Actinomycètes ....................................... 13<br />
III.3.2.1. En santé humaine .......................................................................................... 13<br />
III.3.2.2. En santé animale et élevage .......................................................................... 14<br />
III.3.2.3. En agriculture ............................................................................................... 14<br />
IV-Obtention de nouveaux antibiotiques ............................................................................. 14<br />
MATERIELS <strong>ET</strong> M<strong>ET</strong>HO<strong>DES</strong> ............................................................................................ 15<br />
A-MATERIELS ...................................................................................................................... 15<br />
I. Echantillonnage du sol ........................................................................................................ 15<br />
II. Milieux d’étude .................................................................................................................. 16<br />
II.1. Milieu d’isolement ........................................................................................................ 16<br />
II.2. Milieu de fermentation .................................................................................................. 16<br />
II.3. Milieu d’enrichissement ................................................................................................ 17<br />
II.4. Milieu de rajeunissement .............................................................................................. 17<br />
II.5. Milieu pour le test antibiogramme ................................................................................ 17<br />
III. Stérilisation ....................................................................................................................... 17<br />
B-M<strong>ET</strong>HO<strong>DES</strong> ....................................................................................................................... 18<br />
I-Isolement des souches d’Actinomycètes ............................................................................. 18<br />
I.1. But .................................................................................................................................. 18<br />
I.2. Principe ........................................................................................................................... 18<br />
I.3. Mode opératoire ............................................................................................................. 18
Table des matières<br />
I.3.1 Prétraitement des échantillons de sol ....................................................................... 18<br />
I.3.2 Techniques d’isolement ............................................................................................ 19<br />
I.3.2.1 Sélection par antibiotiques ................................................................................ 19<br />
I.3.2.2. Traitement à haute température ....................................................................... 19<br />
I.3.2.3. Sol aérosolisé .................................................................................................... 20<br />
I.3.3. Identification ........................................................................................................... 20<br />
I.3.4. Conservation des souches d’Actinomycètes ........................................................... 20<br />
I.3.4.1. Conservation sur gélose pente .......................................................................... 20<br />
I.3.4.2. Conservation à -80°C ....................................................................................... 20<br />
II. Production et extraction de métabolites secondaires .................................................... 21<br />
II.1. But ................................................................................................................................. 21<br />
II.2. Principe ......................................................................................................................... 21<br />
II.3. Mode opératoire ............................................................................................................ 21<br />
II.3.1. Culture par fermentation ........................................................................................ 21<br />
II.3.2. Extraction ............................................................................................................... 21<br />
III.Test d’activité antimicrobienne ....................................................................................... 22<br />
III.1.But ................................................................................................................................ 22<br />
III.2.Principe ......................................................................................................................... 22<br />
III.3.Mode opératoire ............................................................................................................ 22<br />
III.3.1.Souche pure à étudier ............................................................................................ 22<br />
III.3.1.1. Caractéristiques des souches ......................................................................... 22<br />
III.3.1.2. Revivification des souches ............................................................................ 23<br />
III.3.1.3. Rajeunissement des souches .......................................................................... 23<br />
III.3.2. Préparation de l’inoculum .................................................................................... 23<br />
III.3.3. Ensemencement .................................................................................................... 23<br />
III.3.4. Dépôt des disques ................................................................................................. 23<br />
III.3.5. Lecture .................................................................................................................. 24
Table des matières<br />
IV. Détermination de la CMI et de la CMB ......................................................................... 25<br />
IV.1. But ............................................................................................................................... 25<br />
IV.2. Principe ........................................................................................................................ 25<br />
IV.3. Mode opératoire .......................................................................................................... 25<br />
IV.3.1. Détermination de la CMI sur milieu solide .......................................................... 25<br />
IV.3.1.1. Préparation de l’inoculum et ensemencement ............................................. 25<br />
IV.3.1.2. Gamme de concentration de l’extrait ............................................................ 25<br />
IV.3.1.3. Dépôt des disques .......................................................................................... 26<br />
IV.3.1.4. Lecture ........................................................................................................... 26<br />
IV.3.2. Détermination de la CMI en milieu liquide .......................................................... 26<br />
IV.3.2.1. Préparation de l’inoculum ............................................................................. 26<br />
IV.3.2.2. Gamme de concentrations de l’extrait ........................................................... 26<br />
IV.3.2.3. Inoculation ..................................................................................................... 26<br />
IV.3.2.4. Lecture des résultats ...................................................................................... 26<br />
IV.3.3. Détermination de la CMB .................................................................................... 27<br />
IV.3.3.1. Ensemencement ............................................................................................. 27<br />
IV.3.3.2.Lecture des résultats ....................................................................................... 27<br />
V. Test anti-malaria ................................................................................................................ 28<br />
V.1. But ................................................................................................................................. 28<br />
V.2. Principe ......................................................................................................................... 28<br />
V.3. Mode opératoire ............................................................................................................ 28<br />
V.3.1. Culture du parasite ................................................................................................. 28<br />
V.3.2. Sélection des extraits ............................................................................................. 28<br />
VI. Etude chimique préliminaire de l’extrait actif .............................................................. 30<br />
VI.1.Obtention des extraits ................................................................................................... 30<br />
VI.1.1. Principe ................................................................................................................. 30<br />
VI.1.2. Mode opératoire ................................................................................................... 30
Table des matières<br />
VI.2. Chromatographie Liquide à Basse Pression (C.L.B.P) ............................................... 30<br />
VI.2.1. Principe ................................................................................................................. 31<br />
VI.2.2. Mode opératoire ................................................................................................... 31<br />
VI.2.2.1.Remplissage de la colonne ............................................................................. 31<br />
VI.2.2.2.Dépôt de l’échantillon .................................................................................... 31<br />
VI.2.2.3.Déroulement de l’élution ................................................................................ 31<br />
VI.3. Chromatographie sur couche mince ............................................................................ 32<br />
VI.3.1. Principe ................................................................................................................. 32<br />
VI.3.2. Mode opératoire ................................................................................................... 32<br />
VI.3.2.1. Dépôt des échantillons ................................................................................... 32<br />
VI.3.2.2. Saturation de la cuve ..................................................................................... 32<br />
VI.3.2.3. Développement du chromatogramme ........................................................... 32<br />
VI.3.2.4. Révélation ...................................................................................................... 33<br />
VI.4.Criblage de fractions actives ........................................................................................ 33<br />
VI.4.1.Principe .................................................................................................................. 33<br />
VI.4.2.Mode opératoire .................................................................................................... 34<br />
VI.4.2.1.Préparation de la plaque de CCM ................................................................... 34<br />
VI.4.2.2.Test d’activité antibacterienne des fractions .................................................. 34<br />
VI.4.2.3.Détection des grandes familles chimiques ..................................................... 35<br />
a. Détection des terpènes .......................................................................................... 35<br />
b. Détection des alcaloïdes ....................................................................................... 35<br />
c. Détection des dérivés anthracéniques et des coumarines ..................................... 35<br />
d. Détection des flavonoïdes ..................................................................................... 35<br />
RESULTATS .......................................................................................................................... 36<br />
I. Isolement des souches d’Actinomycètes ............................................................................ 36<br />
II. Production et extraction de métabolites secondaires ..................................................... 38<br />
II.1.Fermentation sur milieu solide ....................................................................................... 38
Table des matières<br />
II.2. Extraction de métabolites secondaires .......................................................................... 38<br />
III. Test antimicrobien ........................................................................................................... 39<br />
IV. Determination de la CMI et de la CMB ......................................................................... 42<br />
IV.1. CMI de l’extrait 74 sur Staphylococcus aureus sur milieu solide ............................... 42<br />
IV.2. CMI de l’extrait 74 sur Staphylococcus aureus en milieu liquide .............................. 43<br />
IV.3. CMB de l’extrait 74 sur Staphylococcus aureus ........................................................ 43<br />
V. Test anti-malaria ................................................................................................................ 44<br />
VI. Etude chimique de l’extrait 74 ........................................................................................ 45<br />
VI.1. Fractionnement par le méthanol .................................................................................. 45<br />
VI.2. Fractionnement de l’extrait EM par CLBP : ............................................................... 46<br />
VI.3. Bioautographie des fractions ....................................................................................... 47<br />
VI.4. Détection des familles chimiques des fractions actives .............................................. 48<br />
DISCUSSION ......................................................................................................................... 50<br />
CONCLUSION GENERALE <strong>ET</strong> PERSPECTIVES .......................................................... 55<br />
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES<br />
ANNEXES
GLOSSAIRE<br />
Glossaire<br />
Actinomycose : maladie infectieuse très rare, causée par une bactérie vivant dans la<br />
cavité buccale de l'homme.<br />
Antagonisme : destruction, lésion ou inhibition de croissance réciproque que subissent<br />
des organismes différents occupant la même niche écologique.<br />
Bactéricide : qui a le pouvoir de tuer les bactéries.<br />
Bactériostatique : qui a le pouvoir d’inhiber la croissance des bactéries.<br />
Biotique : qualifie un milieu dans lequel la vie peut se développer.<br />
Conidies : spore produit par le mycélium des champignons et des Actinomycètes.<br />
Endophyte : êtres vivants qui vivent à l’intérieur des tissus d’une plante<br />
morphologiquement saine et ne peuvent causer des symptômes<br />
apparents et immédiats à son hôte.<br />
Hétérotrophe : organisme qui utilise des matières organiques préformées provenant<br />
d’autres organismes comme source de carbone et d’énergie pour son<br />
métabolisme.<br />
Humification : décomposition par les microorganismes des matières organiques mortes<br />
complexes en les réduisant en un composant plus simple (humus)<br />
directement assimilable par les plantes.<br />
Hyphe : filament mycélien qui constitue l'appareil végétatif des champignons et<br />
des Actinomycètes.<br />
Mycélium : appareil végétatif du champignon et d’Actinomycète constitué d'un<br />
ensemble de filaments appelés hyphes.<br />
Mycorhize : association, généralement symbiotique, de champignons et des racines<br />
de plantes à graines.<br />
Nocardiose : maladie due à une infection des poumons survenant sur un mode<br />
chronique (s'étalant dans le temps) et due à une bactérie appartenant au<br />
genre Nocardia.<br />
Parasitémie : présence de parasites dans le sang.
Glossaire<br />
Procaryote : organisme unicellulaire dépourvu de noyau délimité par une membrane,<br />
le matériel génétique est localisé dans une région irrégulière appelée<br />
nucleoïde ou région nucléaire.<br />
Propagule : organe de dissémination (propagation) et de reproduction d’un être<br />
vivant (spore)<br />
Saprophyte : organisme qui vit aux dépens de matières organiques inertes et qui n’est<br />
généralement pas pathogènes.<br />
Schizonte : stade évolutif de Plasmodium falciparum correspondant à la division du<br />
noyau de l’élément parasitaire<br />
Spore : cellule isolée ou en amas pluricellulaire pouvant contribuer à la<br />
propagation d’une espèce par voie végétative ou par voie sexuée.<br />
Symbiose : association de deux espèces distinctes dont la vie en commun est<br />
profitable à chacune d'elles.<br />
Ubiquitaire : qui se trouve partout en même temps.
ADN : Acide Désoxyribonucléique<br />
LISTE <strong>DES</strong> ABREVIATIONS<br />
AFM : Actinomycete fermentation media<br />
BN : Bouillon nutritif<br />
CCM : Chromatographie sur couche mince<br />
CLBP : Chromatographie liquide à basse pression<br />
CMB : Concentration minimale bactéricide<br />
CMI : Concentration minimale inhibitrice<br />
CNARP : Centre National d’Application de Recherche Pharmaceutique<br />
CNRE : Centre National de Recherches sur l’Environnement<br />
DAS : Daw Agros Science<br />
DCM : Dichlorométhane<br />
DMSO : Diméthyle sulfoxyde<br />
DO : Densité optique<br />
ED : eau distillée<br />
G- : Gram négatif<br />
G+ : Gram positif<br />
GAS : Grayson Aerosol Sampler<br />
GN : Gélose nutritive<br />
IC50 : Concentration Inhibant 50%<br />
ISP2 : International Streptomyces project 2<br />
KOH : Hydroxyde de potassium ou potasse<br />
MeOH : Méthanol<br />
MH : Muëller Hinton<br />
NP/PEG: Natural Product/ Polyethylene Glycol<br />
Rf : Référence frontale ou Rapport frontal<br />
RFU : Rate Fluorescence Unit<br />
RPMI : Roswell Park Memorial Institute<br />
Si : Silice<br />
UFC: Unité Formatrice de Colonies<br />
UV : Ultraviolet<br />
v/v : Volume sur volume<br />
Liste des abréviations
LISTES <strong>DES</strong> FIGURES<br />
Liste des figures<br />
Figure 1: Cycle de développement d’un Actinomycète (Streptomyces) sur milieu solide . ...... 6<br />
Figure 2: Une colonie du genre Streptomyces sur milieu solide ............................................... 8<br />
Figure 3: Localisation de la forêt d’Ankafobe dans la réserve de Sohisika ............................ 15<br />
Figure 4: Séchage des échantillons de sol dans un dessiccateur sous vide ............................. 19<br />
Figure 5: Schéma du développement des fractions sur la plaque de CCM ............................. 34<br />
Figure 6: Histogramme montrant le nombre de souches d’Actinomycètes isolées par sites et<br />
par méthodes d’isolement. ........................................................................................................ 36<br />
Figure 7: Souches pures d’Actinomycètes sur milieu ISP2 ..................................................... 37<br />
Figure 8: Variétés de souches d’Actinomycètes isolées sur milieu ISP2. ............................... 37<br />
Figure 9: Cultures par fermentation d’Actinomycètes sur milieu AFM solide. ...................... 38<br />
Figure 10 : Inhibition des bactéries et levure par les extraits d’Actinomycètes. ..................... 42<br />
Figure 11: Effet des différentes concentrations de l’extrait 74 sur Staphylococcus aureus.... 42<br />
Figure 12: Cultures de Staphylococcus aureus après 24 heures d’incubation à 37°C ............. 44<br />
Figure 13: Inhibition de la croissance de Staphylococcus aureus sous l’action de EM et EA 45<br />
Figure 14 : Diagramme de fractionnement de l’extrait méthanolique (EM) ........................... 46<br />
Figure 15: Profil chromatographique des 5 fractions issues de la CLBP. ............................... 47<br />
Figure 16: Effets des fractions testées sur Staphylococcus aureus .......................................... 47<br />
Figure 17: Nature chimique des bandes actives des fractions 2 et 3. ...................................... 49
LISTES <strong>DES</strong> TABLEAUX<br />
Liste des tableaux<br />
Tableau 1: Les principaux genres d’Actinomycètes. ................................................................ 8<br />
Tableau 2: Fréquence des divers genres d’Actinomycète dans le sol. ...................................... 9<br />
Tableau 3: Importance relative des groupes microbiens producteurs d’antibiotiques. ........... 13<br />
Tableau 4 : Echantillonnage. ................................................................................................... 16<br />
Tableau 5: Caractéristiques des souches à tester. .................................................................... 22<br />
Tableau 6 : Normes utilisées dans la méthode des disques ..................................................... 24<br />
Tableau 7: Nombre de souches d’Actinomycètes isolées à partir des 3 sites d’études. .......... 36<br />
Tableau 8: Résumé des caractères morphologiques des souches d’Actinomycètes isolées. ... 37<br />
Tableau 9: Diamètre d’inhibition (mm) des extraits sur les souches testées. .......................... 39<br />
Tableau 10: Détermination de la CMI sur milieu solide de l’extrait 74 sur Staphylococcus<br />
aureus. ...................................................................................................................................... 43<br />
Tableau 11: Détermination de la CMI en milieu liquide de l’extrait 74 sur Staphylococcus<br />
aureus. ...................................................................................................................................... 43<br />
Tableau 12: Détermination de la CMB de l’extrait 74 sur Staphylococcus aureus. ............... 44<br />
Tableau 13: Pourcentage d’inhibition et IC 50 des extraits sur Plasmodium falciparum<br />
FCM29. ..................................................................................................................................... 44<br />
Tableau 14: Fractionnement de l’extrait 74 avec le méthanol. ............................................... 45<br />
Tableau 15: Effets des extraits sur Staphylococcus aureus. .................................................... 45<br />
Tableau 16: Diamètres et Rf des zones d’inhibition des fractions sur Staphylococcus aureus.<br />
.................................................................................................................................................. 48<br />
Tableau 17: Composition chimique des fractions issues de l’extrait 74. ................................ 48
INTRODUCTION
INTRODUCTION<br />
Introduction<br />
Le sol, l’environnement marin, les plantes, sont divers habitats écologiques lesquels<br />
ont été rapportés comme sources potentielles de produits naturels très utiles comme les<br />
antibiotiques (Rakotoniriana, 2006). Depuis l’avènement de ces molécules, une nette<br />
amélioration de la qualité et de la durée de vie a été constatée (Boughachiche et al., 2005).<br />
Cependant, leur utilisation intensive a eu pour conséquence l’adaptation des bactéries à ces<br />
remarquables substances (Desnottes, 1995). En effet, ces dernières années ont été marquées<br />
par une augmentation inquiétante de la multirésistance de bactéries pathogènes, la résurgence<br />
de maladies infectieuses que l’on croyait parfaitement maîtrisées et l’émergence de nouveaux<br />
pathogènes dans le monde et particulièrement dans les pays en voie de développement<br />
(Données OMS, 1997).<br />
Ces constats expliquent l’urgence de disposer de nouvelles molécules d’antibiotiques.<br />
Les Actinomycètes, bactéries à Gram positif à majorité filamenteuses, représentent la<br />
principale source naturelle de métabolites anticellulaires (Higashide, 1984). Environ 75% des<br />
antibiotiques découverts entre 1971 et 1980 appartiennent aux Actinomycètes (Iwai, 1992). Il<br />
y a une quinzaine d’années, six milles antibiotiques avaient été identifiés chez les<br />
Actinomycètes dont 5000 chez les Streptomycètes sur un total de 9000 antibiotiques connus<br />
(Goodfellow, 1992). L'isolement de souches d’Actinomycètes actives à partir d’écosystèmes<br />
non ou peu exploités permet, éventuellement, la découverte de souches rares ou de souches<br />
pouvant avoir un potentiel de production élevé ou inexploité.<br />
Madagascar est connu pour sa richesse en biodiversité en flore et en faune où la<br />
plupart des espèces sont endémiques (Anonyme, 2003). Les produits naturels d’origine<br />
microbienne ne sont pas suffisamment exploités ou encore mal connus à Madagascar en<br />
comparaison aux produits naturels d’origine végétale mis en évidence par le biais de la<br />
phytochimie (Rakotoniriana, 2006). Cela offre donc une probabilité exceptionnelle d’avoir<br />
diverses populations de microorganismes telluriques. Paradoxalement, il n’existe à notre<br />
connaissance aucune référence bibliographique où l’exploitation rationnelle des<br />
microorganismes telluriques dans la production des métabolites secondaires bioactives, a été<br />
décrite.
Introduction<br />
La présente étude a donc pour objectif principal de valoriser les souches<br />
d’Actinomycètes telluriques issues de la forêt de Madagascar et de découvrir de nouvelles<br />
substances naturelles ou des dérivés de substances naturelles à partir de ces microorganismes<br />
pouvant être utilisées pour promouvoir la santé humaine et la productivité agricole.<br />
L’aboutissement de ce travail est de vérifier l’hypothèse suivante :<br />
« De nouvelles substances naturelles à fonction thérapeutique et protectrice des<br />
plantes pourrait en exister dans les extraits microbiens de Madagascar ».<br />
Le présent travail a bénéficié des apports matériels, techniques et scientifiques du<br />
Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement (LME) du Centre National de Recherches<br />
sur l’Environnement (CNRE) et a été réalisé dans le cadre de son programme de recherche en<br />
collaboration avec le Centre National d’Application des Recherches Pharmaceutiques<br />
(CNARP) pour le test d’activité anti-malaria des extraits d’Actinomycètes.<br />
Cette étude se divise en quatre parties : la première partie résumera les données<br />
bibliographiques, la deuxième partie décrira les matériels et méthodes utilisés, la troisième<br />
partie exposera les résultats obtenus et la dernière partie présentera la discussion des résultats<br />
ainsi que la conclusion et les perspectives.
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
I. LE SOL<br />
Synthèse bibliographique<br />
Le sol est un milieu vivant (Kilbertus, 1980). Il figure parmi les habitats les plus<br />
diversifiés et renferme certains des assemblages les plus variés d’organismes vivants. Il<br />
constitue l’un des écosystèmes les plus complexes de la nature. Aucun autre habitat n’abrite<br />
une densité d’espèces aussi élevée que le sol (FAO, 2001). Par exemple, un gramme de sol<br />
peut contenir des millions d’individus et plusieurs milliers d’espèces de bactéries.<br />
Selon Pedro (1996), le sol est un véritable laboratoire biologique où se déroulent des<br />
réactions qu’on ne trouve nulle part ailleurs.<br />
Le sol ne constitue pas un environnement homogène, mais une mosaïque d’habitats<br />
avec pour chacun des populations microbiennes propres, le nombre et le type d’organismes<br />
varient d’un système et d’un milieu à l’autre. Le nombre, la composition et la diversité des<br />
espèces dans un sol donné dépendent de nombreux facteurs, notamment l’aération, la<br />
température, l’acidité, l’humidité, la teneur en éléments nutritifs et en substrat organique. La<br />
rhizosphère représente un compartiment d’intérêt majeur (Marilley et coll, 2007).<br />
I.1. La rhizosphère<br />
Le terme rhizosphère fut utilisé pour la première fois par Lorenz Hiltner en 1904 en<br />
désignant spécifiquement l'interaction entre les bactéries et les racines des Légumineuses<br />
(Soufiane, 1998).<br />
Actuellement, la définition de la rhizosphère est plus précise et elle correspond à la<br />
zone du sol dans laquelle la microflore tellurique est soumise à l’influence des racines<br />
(Campbell et al, 1990 ; Westover, 1997).<br />
Toutes les activités microbiennes, favorables ou non à la vie de la plante, sont<br />
rencontrées dans cette zone. Parmi ces activités, on peut citer la solubilisation ou la<br />
métabolisation des minéraux pour les nutriments, la compétition avec ou sans induction d’une<br />
résistance de la plante aux pathogènes, et aussi la sécrétion de métabolites bioactifs ou les<br />
antibiotiques (Dommergue, 1999).
I.2. Les microorganismes rhizospheriques<br />
Synthèse bibliographique<br />
De manière globale et simplifiée, on peut diviser les microorganismes de la<br />
rhizosphère en trois groupes: les microorganismes bénéfiques pour la plante (les mycorhizes<br />
et les bactéries fixatrices d’azote), les microorganismes qui ne sont pas favorables à la plante<br />
(les bactéries et champignons phytopathogènes), et les microorganismes indifférents à la<br />
plante. Parmi les bénéfiques, on trouve également les antagonistes qui peuvent protéger les<br />
plantes contre les attaques des microorganismes pathogènes.<br />
Les bactéries : Dans la rhizosphère, les bactéries sont les organismes les plus<br />
nombreux (leur densité est de l'ordre de 10 9 par gramme de sol) et les plus variés (Morel,<br />
1996). On y trouve des bactéries pathogènes qui peuvent causer des dégâts aux cultures<br />
comme Erwinia carotovora sur les carottes, Xanthomonas fragariae sur les fraisiers. D’autres<br />
bactéries protègent par contre les plantes contre des agents pathogènes: Pseudomonas<br />
fluorescens, Bacillus subtilis, (Delorme, 2001), d’autres aussi sont capables de fixer l’azote<br />
atmosphérique comme les Azotobacters. On y trouve aussi des espèces symbiotiques comme<br />
les souches de rhizobia s'associant aux Légumineuses.<br />
Les Actinomycètes : Les Actinomycètes ou bactéries filamenteuses sont moins<br />
nombreux que les bactéries mais plus nombreux que les champignons dans le sol et dans la<br />
rhizosphère. Ils peuvent atteindre jusqu’à 10 7 unités par gramme de sol et ils manifestent<br />
souvent un antagonisme vis-à-vis des bactéries et des champignons voisins; cet antagonisme<br />
résulte de la sécrétion de substances antibiotiques. Certaines espèces d’Actinomycètes fixent<br />
l'azote de l'air comme le genre Frankia.<br />
Les champignons : La densité des champignons est estimée à 10 6 par gramme de sol.<br />
Parmi les genres les plus fréquents dans la rhizosphère, on citera Fusarium, Mucor, Rhizopus,<br />
Penicillium, Rhizoctonia, Phoma. Certaines espèces sont antagonistes de champignons<br />
pathogènes, d'autres s'associent aux racines des plantes cultivées comme les mycorhizes<br />
(Dommergue et al, 1970).<br />
Les protozoaires et les algues : Les protozoaires sont les moins nombreux, leur densité<br />
est de l'ordre de 10 3 par gramme de sol. Les algues sont représentées par des espèces de<br />
Chlorophyceae, Cyanophyceae et les Diatomées. Elles sont peu abondantes, soit 10 5 par<br />
gramme de sol, mais fournissent néanmoins de la matière organique, certaines sont fixatrices<br />
d'azote (Morel, 1996).
II. LES ACTINOMYC<strong>ET</strong>ES<br />
Synthèse bibliographique<br />
Les Actinomycètes ont été isolés pour la première fois par Cohn en 1875 à partir de<br />
sources humaines (Williams et al, 1984). Et c’est en 1943 que S. Waksman a pu isoler un<br />
genre Actinomycète à partir du sol.<br />
II.1. Définition des Actinomycètes<br />
Etymologiquement, le mot Actinomycète a été dérivé des mots grecs « Aktis » qui<br />
veut dire rayon et « mykes » qui veut dire champignon. Les Actinomycètes ont été considérés<br />
comme un groupe intermédiaire entre bactérie et champignons. Maintenant, ils sont reconnus<br />
comme des organismes procaryotes. Pourtant, ces microorganismes présentent des similitudes<br />
à la fois avec les bactéries et avec les champignons.<br />
II.1.1. Similitude entre Actinomycètes et champignons (Alexander, 1961)<br />
Il existe trois points qui rapprochent les Actinomycètes des champignons :<br />
Structure mycélienne présentant des ramifications chez les Actinomycètes typiques,<br />
avec toutefois cette différence que les filaments ont un diamètre deux fois plus faible<br />
(0,5 à 1,2Y) que ceux des champignons, d’où le terme de pseudo mycélium parfois<br />
employé pour désigner cette structure ;<br />
Formation fréquente d’un mycélium aérien et de conidies ;<br />
En culture, absence de la turbidité caractéristique des bactéries unicellulaires et<br />
apparition des amas de cellules.<br />
Les analogies entre les Actinomycètes et les champignons sont en fait superficielles ;<br />
il s’agit d’une convergence de forme plutôt que d’une parenté génétique, car une différence<br />
fondamentale les sépare: les Actinomycètes sont procaryotes alors que les champignons sont<br />
eucaryotes.<br />
II.1.2. Similitude entre Actinomycètes et bactéries<br />
D’autres caractères rapprochent les Actinomycètes des bactéries :<br />
Ils sont procaryotes;<br />
La morphologie typiquement bactérienne chez les formes simple<br />
(Mycobacteriacées) ;
La sensibilité aux attaques virales.<br />
II.2. Caractéristiques générales<br />
Synthèse bibliographique<br />
Les Actinomycètes constituent un groupe tout à fait unique de microorganismes<br />
procaryotes. Généralement, ils sont Gram positif à structure végétative de type mycélien et le<br />
taux de G et C de leur ADN est supérieur à 55% (Lacey ,1973). Ils sont hétérotrophes, leur<br />
croissance est plus lente (7 à 28 jours) que celle des autres bactéries (24 heures). La figure 1<br />
montre le cycle de développement d’un Actinomycète.<br />
La plupart des Actinomycètes aérobies sont saprophytes à développement mycélien<br />
significatif parmi lesquels se trouve la majorité des espèces d’intérêt industriel bien qu’il en<br />
existe des formes anaérobies ou sans mycélium évident, généralement pathogènes<br />
(Goodfellow et al, 1983).<br />
La reproduction des Actinomycètes peut s’opérer suivant trois modes : fragmentation<br />
pseudo bactérienne, production de conidies, production de sporanges.<br />
Germination<br />
Induction du mycélium<br />
végétatif<br />
Développement du<br />
mycélium végétatif<br />
Développement du<br />
mycélium aérien<br />
Figure 1: Cycle de développement d’un Actinomycète (Streptomyces) sur milieu solide<br />
(Hosdong, 1992)
II.3. Classification des Actinomycètes<br />
Synthèse bibliographique<br />
En général, on peut subdiviser les Actinomycètes en 4 grandes familles (Tableau 1) :<br />
II.3.1. Mycobacteriacées<br />
Elles renferment les Actinomycètes dont la morphologie est voisine de celle des<br />
bactéries. Les mycobacteriacées diffèrent de toutes les bactéries et autres Actinomycètes par<br />
leur acido-résistance grâce à la présence de substance cireuse présente dans leurs cellules.<br />
Cette famille est représentée par le seul genre Mycobacterium qui renferme plusieurs espèces<br />
pathogènes, dont la plus connue est Mycobacterium tuberculosis, agent de la tuberculose<br />
(Krasilnikov, 1958).<br />
II.3.2. Actinomycétacées (ou Pro-Actinomycètes)<br />
Cette famille est représentée par les genres Nocardia et Actinomyces. Le genre<br />
Nocardia comprend de nombreuses espèces très répandues dans le sol. Les colonies, difficiles<br />
à distinguer des colonies bactériennes, sont souvent confondues avec ces dernières lors des<br />
comptages. Le genre Actinomyces ne présente aucun intérêt en microbiologie du sol.<br />
(Alexander, 1961).<br />
II.3.3. Streptomycétacées<br />
Il existe deux genres dans cette famille : Streptomyces et Micromonospora.<br />
Le genre Streptomyces renferme plusieurs espèces très répandues dans<br />
le sol. Il se reproduit par des conidies en chaine. L’examen des colonies de Streptomyces<br />
permet de discerner :<br />
Le mycélium végétatif très serré, implanté dans le milieu auquel<br />
il adhère (leurs colonies sont difficiles à prélever au fil de platine).<br />
Le mycélium aérien, lâche, d’aspect poudreux, formé d’hyphes<br />
portant à leurs extrémités des conidies (Williams, 1978).
Surface de la<br />
gélose<br />
Synthèse bibliographique<br />
Figure 2 : Une colonie du genre Streptomyces sur milieu solide (Dvorak, 1999)<br />
Le genre Mycromonospora renferme plusieurs espèces dont la plupart<br />
sont thermophiles, et se développent surtout dans les fumiers.<br />
II.3.4. Actinoplanacées :<br />
Cette famille est représentée par le genre Actinoplanes qui est aquatique.<br />
Le tableau 1 récapitule les différentes familles et genres d’Actinomycètes.<br />
Tableau 1: Les principaux genres d’Actinomycètes<br />
FAMILLE<br />
MYCOBACTERIACEES<br />
ACTINOMYC<strong>ET</strong>ACEES<br />
STREPTOMYC<strong>ET</strong>ACEES<br />
Développement<br />
mycélien<br />
Transitoire<br />
limité<br />
Extensif<br />
Extensif<br />
ACTINOLPANACEES Extensif<br />
Mode de<br />
reproduction<br />
Acido<br />
résistance<br />
Autres<br />
caractères<br />
Genre<br />
Scission binaire + Mycobacterium<br />
Fragmentation<br />
massive des<br />
hyphes<br />
Fragmentation<br />
massive des<br />
hyphes<br />
Extensif Conidies -<br />
Extensif Conidies -<br />
Sporangispores<br />
mobiles<br />
- Aérobie Nocardia<br />
- Anaérobie Actinomyces<br />
-<br />
Conidies<br />
en<br />
chainettes<br />
Conidies<br />
isolées ou<br />
en groupe<br />
Formation<br />
de<br />
sporanges<br />
Mycélium aérien<br />
Mycélium végétatif<br />
Streptomyces<br />
Micromonospora<br />
Actinoplanes
II.4. Ecologie et distribution des Actinomycètes<br />
Synthèse bibliographique<br />
Les Actinomycètes sont des microorganismes ubiquitaires, on les rencontre sur tous<br />
les substrats naturels courants (Waksman, 1959).<br />
II.4.1. Sols<br />
Les Actinomycètes sont largement répandus dans tous les sols à l’exception des sites<br />
exposés à des conditions trop extrêmes. Ils sont surtout présents dans la couche comprise<br />
entre la surface du sol et jusqu’à 2m de profondeur c'est-à-dire dans la rhizosphère. Le genre<br />
Streptomyces est le plus fréquent dans le sol, il couvre à lui seul 95% des souches<br />
d’Actinomycètes isolées (Nonomura, 1969). Le tableau 2 montre la fréquence des divers<br />
genres d’Actinomycètes dans le sol<br />
Tableau 2: Fréquence des divers genres d’Actinomycètes dans le sol<br />
Genres Pourcentage (%)<br />
Streptomyces 95,34<br />
Nocardia 1,98<br />
Micromonospora 1,40<br />
Thermomonospora 0,22<br />
Actinoplanes 0,20<br />
Microbispora 0,18<br />
Mycobacterium 0,14<br />
Streptosporagium<br />
Actinomadura<br />
Microspolyspora<br />
Pseudonocardia<br />
Microellobosporia<br />
0,10<br />
0,10<br />
0,10<br />
0,06<br />
0,04<br />
II.4.2. Eaux douces et marines<br />
Les Actinomycètes sont bien représentés dans ces milieux d’où l’on peut facilement<br />
isoler des souches de Microspora, d’Actinoplanes et de Streptosporangium. C’est<br />
essentiellement dans les sédiments des fonds fluviaux ou lacustres que ceux-ci sont présents<br />
où ils jouent un rôle important dans la décomposition des débris végétaux et donnent à l’eau<br />
son odeur de terre et sa flaveur.
Synthèse bibliographique<br />
II.4.3. Air<br />
La présence d’Actinomycètes dans l’air, sous forme de propagules, est proportionnelle<br />
aux poussières dispersées par le vent.<br />
II.4.4. Thermophile<br />
Des Actinomycètes ont été isolés entre 40 et 60°C de divers substrats ; sols variés,<br />
fumier, compost, foins, fourrages. Ce sont des souches plutôt thermotolérantes que<br />
thermophiles (Lacey, 1997).<br />
II.4.5. Actinomycètes pathogènes<br />
Certaines espèces d’Actinomycètes sont pathogènes pour les végétaux, les animaux et<br />
l’Homme (Mc Neil, 1994 ; Boiron, 1995). Parmi les exemples les plus connus, on peut citer :<br />
-Streptomyces scables, responsable de la gale de la pomme de terre ;<br />
-Actinomyces bovis, responsable d’une actinomycose chez le bétail ;<br />
-Mycobacterium tuberculosis agent de la tuberculose et Mycobacterium leprae, agent de<br />
la lèpre ;<br />
-Nocardia asteroïdes, responsable de la nocardiose humaine ;<br />
-Micropolyspora faeni, responsable d’une pneumonie allergique chez l’Homme.<br />
III. PARTICULARITES <strong>DES</strong> ACTINOMYC<strong>ET</strong>ES TELLURIQUES<br />
Dans le sol, la densité des Actinomycètes, qui sont généralement représentés par les<br />
genres Nocardia et Streptomyces, est en général 3 à 15 fois plus faible que celle des<br />
bactéries (Khan et Williams, 1975). En valeur absolue, elle varie entre 10 5 et 10 8 unités par<br />
gramme de sol. Ils sont présents sous tous les climats, sur tous les types de résidus, mais leur<br />
nombre et la proportion dans le sol dépendent de nombreux facteurs.<br />
III.1. Les facteurs physiques et chimiques (Mayfield et al, 1972) :<br />
Les principaux facteurs principaux sont :<br />
La nature et l’abondance des matières organiques : l’introduction<br />
d’engrais entraîne une augmentation du nombre d’Actinomycète ; on<br />
remarque l’élévation du nombre d’Actinomycètes à l’automne lorsque<br />
se fait l’addition de résidus végétaux frais ;
Synthèse bibliographique<br />
La profondeur : 2 à 15cm est généralement la profondeur optimale, la<br />
rhizosphère est plus riche en Actinomycètes, leur nombre diminue avec<br />
la profondeur ;<br />
Le pH : les Actinomycètes préfèrent un pH compris entre 7 et 8 ;<br />
L’aération et l’humidité : la plupart des Actinomycètes sont aérobies<br />
et préfèrent des taux d’humidité peu élevés de l’ordre de 10 à 30% ;<br />
La température : la température de croissance des Actinomycètes<br />
telluriques est entre 25°C et 30°C.<br />
III.2. Rôle des Actinomycètes telluriques<br />
Pendant longtemps, on a considéré que leur rôle dans le sol était négligeable, à cause<br />
de la lenteur de leur croissance et de leur faible pouvoir compétitif (Watson, 1974). Il semble,<br />
au contraire, que leur action soit importante en raison de leur double aptitude :<br />
III.2.1. Aptitude à dégrader les substances organiques non biodégradables<br />
par les champignons et les bactéries :<br />
La dégradation des matières organiques fraiches s’effectue progressivement : les<br />
premiers stades correspondent à l’action des bactéries et des champignons ; les derniers<br />
correspondent à l’action des Actinomycètes. Ces microorganismes ne peuvent se développer<br />
dans les premiers stades en raison de leur inaptitude à la compétition ; par contre, ils se<br />
développent relativement bien sur une matière organique partiellement dégradée et inapte à<br />
porter une microflore fongique et bactérienne (Krasilinikov, 1958).<br />
III.2.2. Aptitude à produire des substances pro biotiques, antibiotiques ou<br />
toxiques :<br />
Parmi les substances probiotiques produites par les Actinomycètes, se trouvent : les<br />
vitamines B1, B2, B6, B12, la biotine, l’acide folique (Morel, 1996 ; Dommergue et al,<br />
1970). On admet que les Actinomycètes pourraient aussi intervenir dans le processus<br />
d’humification en produisant des composés dont la structure chimique est proche de celle des<br />
acides humiques (Krassilnikov, 1953). En présence des Actinomycètes, le taux des
Synthèse bibliographique<br />
microorganismes pathogènes se trouve fortement diminué dans le sol par la synthèse des<br />
antibiotiques qui inhibent leur croissance (Morel, 1996).<br />
III.3. Les métabolites secondaires des extraits d’Actinomycètes<br />
Les métabolites secondaires sont définis comme des composés de faible poids<br />
moléculaire, non essentiels à la croissance du microorganisme producteur. La production de<br />
ces métabolites est souvent associée à la croissance des microorganismes correspondant à la<br />
phase stationnaire de la courbe de croissance (Demain, 1995).<br />
Une des propriétés la plus significative des Actinomycètes est leur aptitude à<br />
synthétiser de nombreux métabolites secondaires d'une diversité structurale très vaste et des<br />
milliers d'entre eux sont doués d'un potentiel d'activité biologique important (Higashide,<br />
1984; Vining, 1992). C'est en 1940, après la découverte de l'actinomycine, que les<br />
Actinomycètes sont devenus l'objet de nombreuses recherches et ils ont été exploités durant<br />
les années 80, en conséquence, de nouvelles structures et surtout les antibiotiques sont<br />
continuellement isolés à partir des Actinomycètes. Ainsi, ces microorganismes sont devenus<br />
les premiers fournisseurs de ces métabolites.<br />
III.3.1. La production d’antibiotique chez les Actinomycètes<br />
Un antibiotique (du Grec anti : « contre », et bios : « la vie ») est défini comme une<br />
substance naturelle produite par les microorganismes dont l’action est d’inhiber la croissance<br />
de bactéries (action bactériostatique) ou de les tuer (action bactéricide) (Decre et Courvalin,<br />
1995). Il peut être antibactérien, antifongique, anticancéreux, antiviral ou antiparasitaire. La<br />
synthèse des antibiotiques est largement répandue chez les Actinomycètes, 50 à 75% des<br />
souches isolées en sont productrices et sont à l'origine de 70% des antibiotiques naturels<br />
connus dans le monde (Tableau 3) (Okami, 1988). C’est en 1944 que le microbiologiste<br />
américain S. Waksman a décrit pour la première fois la streptomycine qui est un antibiotique<br />
produit par un Actinomycète tellurique, Streptomyces griseus. Ce fut le premier médicament<br />
qui se révéla efficace contre la tuberculose.
Synthèse bibliographique<br />
Tableau 3: Importance relative des groupes microbiens producteurs d’antibiotiques<br />
Microorganismes producteurs d’antibiotiques % du total des antibiotiques décrits<br />
Lichens et algues 0,8<br />
Champignons<br />
Penicillium<br />
Aspergillus<br />
Bactéries<br />
Fusarium<br />
Cephalosporium<br />
Autres champignons imparfaits<br />
Basidiomycètes et Ascomycètes<br />
Pseudomonadaceae<br />
Bacillaceae<br />
Autres Eubactéries<br />
4,1<br />
3,0<br />
1,2<br />
0,8<br />
5,4<br />
5,0<br />
1,3<br />
7,0<br />
1,7<br />
Actinomycètes 69,7<br />
III.3.2. Application des antibiotiques issus des Actinomycètes<br />
Si les antibiotiques issus des Actinomycètes sont connus d’abord pour leurs<br />
applications médicales, ils présentent un intérêt significatif dans les domaines de la santé<br />
animale, de l’élevage et de l’agriculture (Berdy, 2005).<br />
III.3.2.1. En santé humaine<br />
Parmi les nombreux antibactériens issus d’Actinomycètes, on peut citer comme<br />
exemple :<br />
- Les gentamicines produites par Micromonospora spp. administrées par voie<br />
parentérales pour traiter des infections sévères des germes à Gram-négatif.<br />
- La rifampicine, un dérivé de la rifamicine produite par Nocardia mediterranei,<br />
utilisée dans le traitement de la tuberculose.<br />
Outre les antibactériens, l’activité de ces molécules peut s’exercer vis-à-vis des<br />
champignons. L’antifongique le plus exploité en thérapeutique est la nystamine, un tetraène<br />
extrait de culture de S. noursei (Ouhdouch, 2001).<br />
L’antiparasitaire bien connu est la spiramycine, un macrolide antibactérien de S.<br />
ambofaciens, efficace dans le traitement de la toxoplasmose (Ninet, 1960).
Synthèse bibliographique<br />
L’antivirus qu’on peut mentionner est la 9-Z-arabinofuranosyladine de S.antibiticus,<br />
synthétisé par voie chimique et actif sur le virus de l’herpès (Ninet, 1960).<br />
Plusieurs anthracyclines et quinones dont la daunorubicine de S. coeruleorubidis sont<br />
utilisés dans le traitement de plusieurs types de cancer, dont les leucémies en particulier.<br />
III.3.2.2. En santé animale et élevage :<br />
Les antibiotiques issus des Actinomycètes sont utilisés en élevage comme adjuvants<br />
pour l’alimentation animale en stimulant la croissance et en améliorant le rendement<br />
alimentaire ou en protégeant les jeunes en début d’élevage. C’est le cas des bambermycines<br />
utilisées chez le porc et les volailles.<br />
Les antibiotiques sont aussi largement utilisés en médecine vétérinaire, comme<br />
l’ivermectine produite par Streptomyces avermitilis, qui est un anthelminthique (contre les<br />
nématodes chez les animaux) (Stapley et Woodruff, 1982).<br />
III.3.2.3. En agriculture :<br />
Les activités des antibiotiques destinés à l’agriculture s’étendent à différents<br />
domaines comme le contrôle des maladies des végétaux (insecticides, herbicides et<br />
régulateurs du métabolisme végétal). La blasticidine S est un puissant fongicide de type<br />
nucléotidique, connue pour son activité sur Piricularia oryzae, pathogène chez le riz (Demain,<br />
1995).<br />
IV-OBTENTION DE NOUVEAUX ANTIBIOTIQUES :<br />
L’obtention de nouveaux antibiotiques (antibactériens, antifongiques et<br />
antiparasitaires) est devenue une nécessité après la découverte de souches pathogènes<br />
résistantes. Pour atteindre cet objectif, de nombreuses recherches se sont orientées vers le<br />
criblage de nouvelles souches productrices. L'exploration des écosystèmes où un ou plusieurs<br />
facteurs environnementaux sont extrêmes (température, pH, aération ou stress osmotique) ou<br />
dans des zones inexploitées favorise la détection d’Actinomycètes. La recherche sera plus<br />
prometteuse si on arrive à isoler des variétés de souches d’Actinomycètes pour découvrir de<br />
nouveaux composés d’intérêts pharmaceutiques.
MATERIELS<br />
<strong>ET</strong><br />
M<strong>ET</strong>HO<strong>DES</strong>
A-MATERIELS<br />
I. ECHANTILLONNAGE DU SOL<br />
Matériels et méthodes<br />
Les échantillons de sol ont été collectés dans la rhizosphère à partir de trois sites<br />
différents de la forêt d’Ankafobe située dans la réserve de SOHISIKA (Figure 3). C’est une<br />
forêt de hauts plateaux humides d’une altitude de 1600 mètres localisée au centre de<br />
Madagascar. Les échantillons de sol ont été prélevés au mois de Juin 2009, dans des<br />
conditions d’asepsie rigoureuse.<br />
Figure 3 : Localisation de la forêt d’Ankafobe dans la réserve de Sohisika<br />
Quinze (15) échantillons de sol ont été prélevés à partir des trois (3) sites différents<br />
dans la forêt d’Ankafobe à raison de 5 échantillons par site (Tableau 4).
Tableau 4 : Echantillonnage<br />
Matériels et méthodes<br />
SITE Code des échantillons<br />
Forêt primaire<br />
(Pristing)<br />
Forêt moyennement dégradée<br />
(Medium impact)<br />
Forêt dégradée<br />
(High impact)<br />
Pr1, Pr2, Pr3, Pr2’, Pr3’<br />
AM1, AM2, AM3, AM4, AM5<br />
AH1, AH2, AH3, AH4, AH5<br />
Pour chaque échantillon, 100g de sol rhizosphérique ont été prélevés avec une spatule<br />
stérile à une profondeur située entre 10cm et 20cm. Les échantillons ont été mis dans des<br />
sachets stériles et conservés à température ambiante jusqu’au laboratoire.<br />
II. MILIEUX D’<strong>ET</strong>UDE<br />
II.1. Milieu d’isolement<br />
- Milieu ISP2<br />
C’est un milieu solide utilisé pour isoler et conserver les souches d’Actinomycètes à<br />
partir des échantillons de sol.<br />
Ce milieu est additionné de 3 antibiotiques pour l’isolement des Actinomycètes :<br />
- La triméthoprime (inhibiteur des champignons)<br />
- Le cycloheximide (inhibiteur des bactéries)<br />
- L’acide nalidixique (inhibiteur des bactéries à Gram négatif)<br />
La préparation du milieu ISP2 additionné d’antibiotique est présentée en annexe 1.<br />
II.2. Milieu de fermentation<br />
- Milieu AFM<br />
C’est un milieu solide qui est utilisé pour la fermentation des souches<br />
d’Actinomycètes afin de produire des extraits riches en métabolites secondaires.
II.3. Milieu d’enrichissement<br />
- Bouillon nutritif<br />
Matériels et méthodes<br />
C’est un milieu nutritif liquide dépourvu d’agar. Ce milieu est utilisé pour revivifier<br />
les souches de microorganismes.<br />
II.4. Milieu de rajeunissement<br />
- Milieu gélose nutritif<br />
La gélose nutritive est un milieu habituellement employé pour la culture et l’isolement<br />
des microorganismes, elle permet aussi de détecter la pureté des souches.<br />
II.5. Milieu pour le test antibiogramme<br />
- Milieu Muëller Hinton<br />
C’est un milieu de culture solide utilisé pour mettre en évidence l’activité des extraits<br />
vis-à-vis des germes pathogènes.<br />
La composition de chaque milieu est donnée en annexe 1.<br />
III. STERILISATION<br />
Tous les milieux de culture sont stérilisés à 120°C pendant 20mn dans un autoclave, la<br />
verrerie est stérilisée à 180°C dans une étuve universelle pendant 30mn.<br />
Il est à noter que toutes les manipulations microbiologiques sont effectuées dans des<br />
conditions stériles c'est-à-dire autour de la flamme d’un bec bunsen et sous hotte à flux<br />
laminaire.
B-M<strong>ET</strong>HO<strong>DES</strong><br />
I-ISOLEMENT <strong>DES</strong> SOUCHES D’ACTINOMYC<strong>ET</strong>ES<br />
I.1. But<br />
Matériels et méthodes<br />
Cette étape a pour but d’isoler et d’avoir le maximum de souches d’Actinomycètes<br />
contenues dans les échantillons de sol. La technique d’isolement des souches<br />
d’Actinomycètes proposée par le Laboratoire de Daw Agro Sciences (DAS) aux Etats Unis a<br />
été appliquée (Don Hann, comm pers., 2007).<br />
I.2. Principe<br />
Les Actinomycètes sont des microorganismes faciles à cultiver. Par ailleurs, leur<br />
croissance lente et leur faible nombre dans les échantillons de sol sont souvent masqués par<br />
les bactéries et les champignons à croissance rapide lors de l’isolement. Par conséquent,<br />
l’utilisation d’un milieu spécifique (ISP2) additionné d’antibiotiques combiné à des<br />
traitements des échantillons de sol facilite l’isolement de ces groupes de microorganismes.<br />
Trois méthodes d’isolement sont utilisées pour isoler les Actinomycètes à partir des<br />
échantillons de sol : la sélection par antibiotiques, le traitement à 100°C et le sol aérosolisé.<br />
Un prétraitement des échantillons de sol a été entrepris avant l’isolement.<br />
I.3. Mode opératoire<br />
I.3.1 Prétraitement des échantillons de sol<br />
Une fois arrivés au laboratoire, les échantillons de sol sont distribués dans des boîtes<br />
de Pétri stériles. Le prétraitement des échantillons de sol est une étape préliminaire permettant<br />
de sélectionner les Actinomycètes dans les échantillons de sol. Cette étape consiste à sécher<br />
les échantillons de sol dans un dessiccateur sous vide contenant du silicagel qui absorbe<br />
l’humidité pendant au moins une semaine (Figure 4).
Dessiccateur<br />
Silicagel<br />
Matériels et méthodes<br />
Figure 4 : Séchage des échantillons de sol dans un dessiccateur sous vide.<br />
I.3.2 Techniques d’isolement<br />
I.3.2.1 Sélection par antibiotiques<br />
Pour chaque échantillon de sol, 1g de sol est pesé puis des dilutions en cascade sont<br />
réalisées. L’échantillon est mis en suspension dans 9ml d’eau distillée stérile. Après agitation<br />
au vortex, 1ml de la solution est prélevé stérilement puis transféré dans un deuxième tube<br />
contenant comme le premier, 9ml d’eau distillée stérile. La dilution ainsi commencée est<br />
continuée jusqu'à 10 -3 .<br />
0,3ml de chacune des dilutions 10 -2 et 10 -3 sont ensuite étalées à l’aide d’un racloir<br />
stérile sur le milieu ISP2 solide contenant les 3 antibiotiques (triméthoprime, cycloheximide,<br />
acide nalidixique). Les boîtes de Pétri sont ensuite incubées à 30°C pendant 7 à 28 jours.<br />
I.3.2.2. Traitement à haute température<br />
Echantillons de sol<br />
Un gramme de chaque échantillon de sol est incubé dans une étuve à 100°C pendant<br />
une heure. Après incubation, l’échantillon de sol est mis en suspension dans 9ml d’eau<br />
distillée stérile des dilutions en cascade (coefficient de dilution égal à 0,1) sont réalisées<br />
jusqu’à dilution 10 -3 . Seulement deux dilutions 10 -2 et 10 -3 sont retenues pour<br />
l’ensemencement. L’ensemencement est effectué en surface du milieu ISP2 additionné<br />
d’antibiotiques par étalement de 0,3ml de chacune des dilutions 10 -2 et 10 -3 . Les boîtes sont<br />
incubées pendant 7 à 30 jours à 28°C.
I.3.2.3. Sol aérosolisé<br />
Matériels et méthodes<br />
Un gramme de l’échantillon de sol est placé dans une Grayson Aerosol Sampler ou<br />
GAS (appareil mis au point par Melody Grayson) stérile. La GAS est ensuite fermée, agitée<br />
vigoureusement et laissée reposer pendant une heure. Après une heure, le couvercle et le<br />
bouchon de la boîte de la GAS sont ensuite enlevés, et la boîte de Pétri qui contient le milieu<br />
ISP2 est placée en position renversée à 1cm de l’ouverture de GAS. De l’air sera produit en<br />
utilisant un petit tuyau et une poire par pompage disséminant ainsi les spores dans la GAS<br />
vers le milieu solide. Les boîtes sont ensuite incubées à 28°C pendant 7 à 28 jours.<br />
La pureté des souches d’Actinomycètes est vérifiée par repiquages successifs sur de<br />
nouveaux milieux ISP2 sans antibiotique.<br />
I.3.3. Identification<br />
L’identification des souches est effectuée avec une culture pure, l’étude des caractères<br />
culturaux permet d’observer macroscopiquement et de différencier les souches par leur<br />
aspect, leur forme, leur taille, la couleur du mycélium végétatif et la couleur du mycélium<br />
aérien ainsi que d’autres caractères comme la production de pigment diffusible.<br />
I.3.4. Conservation des souches d’Actinomycètes<br />
Deux méthodes ont été utilisées pour conserver les souches pures d’Actinomycètes.<br />
I.3.4.1. Conservation sur gélose pente<br />
Dans des tubes à vis contenant le milieu ISP2 incliné, les souches pures obtenues ont été<br />
repiquées par des stries d’épuisement parallèles de manière avoir des colonies abondantes.<br />
Les tubes de collection sont ensuite enveloppés de papier aluminium et conservés à 4°C en<br />
évitant le plus possible tout risque de contamination.<br />
I.3.4.2. Conservation à -80°C<br />
Une colonie d’Actinomycète est prélevée à l’aide d’une anse d’inoculation stérile, puis<br />
ensemencée sur milieu ISP2 liquide. Les cultures sont ensuite incubées pendant 7 jours dans<br />
un bain marie agité à une température de 28°C. Après la semaine d’incubation, 1ml de la<br />
culture d’Actinomycète est prélevé à l’aide d’une micropipette stérile et introduit dans un<br />
cryotube contenant 1ml de glycérol 20% (V/V). Les cryotubes sont immédiatement placés<br />
dans un congélateur -80°C.
Matériels et méthodes<br />
II. PRODUCTION <strong>ET</strong> EXTRACTION DE M<strong>ET</strong>ABOLITES SECONDAIRES<br />
II.1. But<br />
Cette étape a pour but de stimuler et d’inciter les Actinomycètes à synthétiser de<br />
métabolites secondaires bioactif par fermentation dans des conditions bien précises sur milieu<br />
solide et d’extraire la quasi-totalité de métabolites secondaires dans le milieu de fermentation.<br />
II.2. Principe<br />
Une des propriétés significatives des Actinomycètes est leur aptitude à synthétiser des<br />
métabolites secondaires bioactif au cours de leur croissance. Cette étape consiste alors à<br />
effectuer des fermentations sur milieu solide avec des cultures pures d’Actinomycètes pendant<br />
un temps d’incubation de 8 à 14 jours. Les microorganismes synthétisent de métabolites<br />
secondaires dans des conditions de culture adéquates à leur croissance et dans un système<br />
isolé contenant le milieu de culture. Les métabolites synthétisés par les Actinomycètes sont<br />
dispersés dans le milieu de fermentation. La récupération de ces métabolites secondaires<br />
nécessite l’emploi d’un solvant organique (éthanol).<br />
II.3. Mode opératoire<br />
II.3.1. Fermentation sur milieu solide<br />
A partir de la culture pure d’Actinomycète, une colonie est prélevée à l’aide d’un<br />
coton tige stérile, puis ensemencée en surface sur le milieu AFM solide dans le flacon EZ en<br />
faisant des stries serrées qui partent du fond du flacon à l’ouverture. Les cultures sont ensuite<br />
incubées pendant 8 à 14 jours dans une étuve à 28°C.<br />
II.3.2. Extraction<br />
Après 8 jours d’incubation, on procède à l’extraction de métabolites secondaires<br />
produits par les Actinomycètes. Pour cela, trente millilitres (30ml) d’éthanol 50% (V/V) ont<br />
été ajoutés dans chaque flacon EZ contenant les cultures d’Actinomycètes de 8 jours. Les<br />
flacons sont ensuite laissés à température ambiante pendant 2 heures. Les extraits sont filtrés<br />
en éliminant les cellules vivantes, puis distribués dans des tubes en verres stériles et séchés en<br />
utilisant du speedvac.
III.TEST D’ACTIVITE ANTIMICROBIENNE<br />
III.1.But<br />
Matériels et méthodes<br />
Evaluer l’activité des métabolites secondaires extraits au cours de l’étape précédente<br />
sur des souches indicatrices par la méthode de diffusion sur gélose.<br />
III.2.Principe<br />
La méthode de diffusion sur gélose est une méthode préliminaire permettant de repérer<br />
les produits qui sont actifs sur les souches indicatrices et d’évaluer la sensibilité de ces<br />
souches. Elle consiste à déposer, sur une culture de germes indicateurs préalablement<br />
ensemencées, des disques imbibés d’extrait. La diffusion de l’extrait sur le milieu peut inhiber<br />
la croissance des souches à tester. Pour les bactéries et la levure, une zone claire ou zone<br />
d’inhibition est observée lorsque l’extrait est actif, la mesure du diamètre du halo d’inhibition<br />
permet d’évaluer la sensibilité de ces germes qui peut varier en fonction de la souche testée<br />
(Duval et Soussy, 1990 ; Ferron, 1994).<br />
III.3.Mode opératoire<br />
III.3.1.Souche pure à étudier<br />
III.3.1.1. Caractéristiques des souches<br />
Les extraits sont testés sur six souches bactériennes et sur une levure disponibles au<br />
Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement du CNRE. (Tableau 5)<br />
Tableau 5: Caractéristiques des souches à indicatrices.<br />
Souches Coloration de Gram<br />
Bacillus cereus ATCC 13061 +<br />
Staphylococcus aureus ATCC 11632 +<br />
BACTERIES<br />
Streptococcus pneumoniae ATCC 6301<br />
Escherichia coli<br />
+<br />
-<br />
Salmonella enteridis -<br />
Klebsiella oxytoca ATCC 700323 -<br />
LEVURE Candida albicans
III.3.1.2. Revivification des souches<br />
Matériels et méthodes<br />
Chaque souche bactérienne ou la levure est revivifiée dans 9ml de bouillon nutritif<br />
puis incubée à 37°C pendant 18 à 24 heures. La turbidité du bouillon nutritif indique le<br />
développement de souches cultivées.<br />
III.3.1.3. Rajeunissement des souches<br />
A partir des cultures préparées précédemment, les souches sont repiquées. Pour<br />
chaque souche, une ansée de cette culture est ensemencée en stries sur une boîte de Pétri<br />
contenant du milieu gélose nutritif solide. Les cultures sont incubées dans une étuve à 37°C<br />
pendant 24 heures afin d’obtenir des colonies jeunes et isolées.<br />
III.3.2. Préparation de l’inoculum<br />
A partir des jeunes colonies obtenues, une ou deux colonies de bactéries ou de levures<br />
sont prélevées à l’aide d’une anse stérile et diluées dans 10ml d’eau distillée, puis la turbidité<br />
de l’ensemble est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre de manière à obtenir une densité<br />
optique égale à 0,125 (DO= 0,125) à la longueur d’onde à 550nm qui correspond à 10 6<br />
UFC/ml.<br />
III.3.3. Ensemencement<br />
La technique par inondation ou culture en nappe est appliquée pour l’ensemencement.<br />
La surface entière du milieu Muëller Hinton solide est inondée par 10ml de l’inoculum de 10 6<br />
UFC/ml de germe. La culture est incubée dans une étuve à 37°C pendant 15min afin que les<br />
germes puissent adhérer sur le milieu. Puis, l’excès de liquide est aspiré à l’aide d’une pipette<br />
stérile et le milieu est séché pendant 15 minutes dans une étuve à 37°C.<br />
III.3.4. Dépôt des disques<br />
Des disques stériles de 6mm de diamètre sont imprégnés de 10Yl d’extrait à l’aide<br />
d’une micropipette à cône stérile, à une concentration de 20mg/ml dilué dans de l’alcool 50%.<br />
Puis les disques sont séchés pendant 15 minutes dans une étuve à 37°C. Après séchage, les<br />
disques sont déposés sur la culture à l’aide d’une pince stérile. Les boîtes sont incubées à<br />
37°C pendant 24h.
III.3.5. Lecture<br />
Matériels et méthodes<br />
Après 24 heures d’incubation, la présence de zone d’inhibition est observée et le<br />
diamètre d’inhibition est mesuré à l’aide d’une règle graduée millimétrée. Les résultats sont<br />
exprimés suivant les normes ci-après.<br />
Tableau 6 : Normes utilisées dans la méthode des disques (Leipzig, 1996)<br />
Diamètre du halo<br />
d’inhibition (X)<br />
X < 7mm<br />
7 mm < X < 8 mm<br />
8 mm < X < 9 mm<br />
X > 9mm<br />
Sensibilité du germe Résultat<br />
Insensible<br />
Assez sensible<br />
Sensible<br />
Très sensible<br />
-<br />
+<br />
++<br />
+++
IV. D<strong>ET</strong>ERMINATION DE LA CMI <strong>ET</strong> DE LA CMB<br />
IV.1. But<br />
Matériels et méthodes<br />
Déterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI) et la concentration minimale<br />
bactéricide (CMB) de l’extrait le plus actif lors du test d’activité antibactérienne par la<br />
méthode de diffusion sur gélose précédente.<br />
IV.2. Principe<br />
La CMI est la plus faible concentration d’extrait pour laquelle il n’y a pas de<br />
croissance de germe visible. La CMI peut être déterminée par deux méthodes différentes :<br />
En milieu solide, la CMI correspond à la plus faible concentration d’extrait qui<br />
provoque l’apparition d’un spectre d’inhibition ou une zone d’inhibition (Sinot J.,<br />
1985 ; Couvarlin P. et coll, 1985).<br />
En milieu liquide, la CMI correspond à la concentration de l’extrait avec laquelle<br />
l’aspect de la culture reste limpide (Sinot J., 1985 ; Couvarlin P. et coll, 1985).<br />
La CMB est la plus faible concentration d’extrait pour laquelle il n’y a que 0,01% à<br />
0,1% de bactéries survivantes (Sinot J., 1985 ; Couvarlin P. et coll, 1985).<br />
IV.3. Mode opératoire<br />
IV.3.1. Détermination de la CMI sur milieu solide<br />
IV.3.1.1. Préparation de l’inoculum et ensemencement<br />
Le même mode opératoire que lors de la préparation d’inoculum au cours de la<br />
méthode de diffusion sur gélose est adopté (Cf. § III.3.2 p. 23). Ainsi, une suspension<br />
microbienne de 10 6 UFC/ml est préparée à partir d’une culture revivifiée sur milieu liquide de<br />
souche rajeunie. La technique adoptée pour l’ensemencement est la technique par inondation<br />
(Cf. § III.3.3 p. 23).<br />
IV.3.1.2. Gamme de concentrations de l’extrait<br />
Une série de 7 dilutions dans de l’eau distillée (coefficient de dilution égal à 0,5) est<br />
réalisée à partir de l’extrait actif 40mg/ml. Les concentrations sont donc de 20mg/ml,<br />
10mg/ml, 5mg/ml, 2,5mg/ml, 1,125mg/ml, 0,625mg/ml, 0,3125mg/ml.
IV.3.1.3. Dépôt des disques<br />
Matériels et méthodes<br />
Des disques stériles de 6mm de diamètre sont imprégnés de 10Yl de chacun des<br />
extraits de différentes concentrations préparées précédemment. Ils sont ensuite séchés pendant<br />
15min dans une étuve, et déposés sur la culture dans la boîte de Pétri.<br />
IV.3.1.4. Lecture<br />
Après 24h d’incubation à 37°C, la lecture des résultats se fait par observation de la<br />
présence d’halo d’inhibition.<br />
IV.3.2. Détermination de la CMI en milieu liquide<br />
IV.3.2.1. Préparation de l’inoculum<br />
Une colonie isolée de la souche microbienne à tester est prélevée à l’aide d’une anse<br />
stérile et homogénéisée dans le bouillon nutritif. L’homogénat est incubé pendant 24 heures à<br />
37°C pour avoir une pré-culture. Cette pré-culture, diluée de manière à obtenir une D.O égale<br />
à 0,125 à 650nm (correspond à 10 6 cellules/ml), sert d’inoculum.<br />
IV.3.2.2. Gamme de concentrations de l’extrait<br />
La gamme de concentrations utilisée est la même que pour la détermination de la CMI<br />
en milieu solide précédente (Cf. § IV.3.1.2 p. 25).<br />
IV.3.2.3. Inoculation<br />
La pré-culture (inoculée avec le germe à tester) est distribuée dans une série de 7 tubes<br />
à hémolyse appelés « tubes expérimentaux » (numérotés de 1 à 7) à raison de 1ml par tube.<br />
Ensuite, 1ml d’extrait de concentration connue (à partir de la gamme de concentration de<br />
l’extrait) est additionné dans chaque tube.<br />
Deux tubes sont aussi préparés, le premier contient 2ml de milieu non inoculé stérile<br />
qui sert de témoin positif (pour la présence d’activité antibactérienne) et le deuxième a reçu 1<br />
ml de la pré-culture et 1ml de milieu non contaminé mais dépourvu d’extrait servant de<br />
témoin négatif. Les tubes sont ensuite incubés à 37°C pendant 24 heures.<br />
IV.3.2.4. Lecture des résultats<br />
Après une incubation de 24 heures à 37°C, la lecture des résultats est effectuée par<br />
comparaison de la turbidité des tubes expérimentaux avec les tubes témoins. La croissance
Matériels et méthodes<br />
des bactéries se traduit par un aspect trouble du milieu de culture. Par contre, le milieu reste<br />
limpide en cas d’inhibition de la multiplication bactérienne.<br />
IV.3.3. Détermination de la CMB<br />
IV.3.3.1. Ensemencement<br />
La numération sur milieu solide des cellules viables provenant des cultures dans les<br />
tubes à hémolyse en milieu liquide lors de la détermination de la CMI permet d’évaluer la<br />
CMB. Pour chaque tube, la tête de l’anse d’inoculation préalablement stérilisée avec la<br />
flamme est trempée dans la culture, puis on ensemence en trait unique sur le milieu Muëller<br />
Hinton solide dans une boîte de Pétri. Les boîtes sont incubées à 37°C pendant 24 heures.<br />
IV.3.3.2.Lecture des résultats<br />
Après incubation à 37°C pendant 24 heures, les boîtes sont observées. La CMB<br />
correspond à la concentration minimale pour laquelle toutes les bactéries sont mortes et<br />
aucune colonie caractéristique n’est observée sur le milieu.
V. TEST ANTI-MALARIA<br />
V.1. But<br />
Matériels et méthodes<br />
Déterminer l’activité antiplasmodiale des extraits sur la phase asexuée intra-<br />
érythrocytaire du cycle biologique de la souche de Plasmodium (présenté en annexe 5)<br />
résistante à la chloroquine Plasmodium falciparum FCM29. Les tests ont été effectués à<br />
l’unité Malaria du Centre National d’Application de Recherches Pharmaceutiques (CNARP).<br />
V.2. Principe<br />
La croissance du parasite est évaluée au moyen du Sybr Green I, une substance<br />
fluorescente spécifique à l’ADN viable : l’ADN double brin. La fluorescence émise par le<br />
complexe ADN/Sybr green est proportionnelle à la quantité d’ADN. Cette fluorescence est<br />
évaluée à l’aide d’un lecteur de microplaque à fluorescence (Flx-800).<br />
V.3. Mode opératoire<br />
V.3.1. Culture du parasite<br />
Les cultures sont maintenues dans un milieu composé de globules rouges (GR) Opositif<br />
à 2% d’hématocrite dans du milieu RPMI 1640 (Sigma) (la composition du milieu<br />
RPMI est présentée en annexe 3). Les flacons de 25ml sont incubés à 37°C dans une cloche à<br />
bougie. La parasitémie est maintenue entre 0.5% à 4%. Tous les trois jours, les érythrocytes<br />
parasités sont transférés dans un nouveau milieu de culture. La culture est synchronisée par la<br />
méthode du sorbitol 5%. Après 96 heures, la parasitémie est évaluée au microscope en<br />
comptant au minimum 500 érythrocytes sur un frottis coloré au Giemsa. Les parasites<br />
devraient être majoritairement aux stades trophozoïtes et de ring, sans schizontes notables.<br />
Pour l’essai, la culture est ramenée à 2% d’hématocrite et 1% de parasitémie.<br />
V.3.2. Sélection des extraits<br />
La culture de Plasmodium falciparum conditionnée pour l’essai est répartie dans les<br />
puits d’une microplaque de 96 puits et mise en contact avec les extraits à tester à la<br />
concentration finale de 50Yg/ml. Le volume total du milieu d’incubation et des extraits est de<br />
200Yl. Les essais sont en duplicate. Des puits sont réservés pour le contrôle positif : milieu de<br />
culture avec des GR parasités, sans extrait ; et pour le contrôle négatif : milieu de culture sans<br />
GR parasité et sans extrait. L’incubation est de 48 heures pour assurer un cycle biologique<br />
complet du parasite. A la fin de l’incubation, dans chaque puits, 50Yl d’une solution de Sybr
Matériels et méthodes<br />
Green I est ajoutée et mélangée. Le volume de Sybr Green est de 0,1% du volume total. La<br />
lecture est effectuée à une longueur d’onde de 518nm, après 30 minutes supplémentaires<br />
d’incubation à 37°C et dans l’obscurité. Le taux d’inhibition est calculé selon la formule<br />
suivante :<br />
Pourcentage inhibition = x 100<br />
Avec: RFU = Rate Fluorescence Unit<br />
RFUNGTV = RFU du puits de contrôle négatif<br />
RFUPSTV = RFU du puits du contrôle positif<br />
RFUEXTRAIT = RFU de l’extrait testé<br />
Les extraits qui présentent un taux d’inhibition supérieur ou égal à 75% sont<br />
sélectionnés pour la détermination de l’IC50, la concentration capable d’inhiber de moitié la<br />
croissance du parasite.<br />
Une gamme de 8 concentrations de l’extrait sélectionné, allant de 50Yg/ml à<br />
0,39Yg/ml est préparée par une dilution en cascade de coefficient égal à 0,5 de l’extrait initial.<br />
Les pourcentages d’inhibition correspondant à chaque concentration permettent l’évaluation<br />
graphique de l’IC50.<br />
(RFUextrait – RFUNGTV)<br />
(RFUPSTV – RFUNGTV)
VI. <strong>ET</strong>UDE CHIMIQUE PRELIMINAIRE DE L’EXTRAIT ACTIF<br />
Matériels et méthodes<br />
L’extrait le plus actif lors du test d’activité antimicrobienne par la méthode de<br />
diffusion sur gélose est utilisé pour la détection des grandes familles chimiques. La technique<br />
de fractionnement bioguidé a été utilisée.<br />
VI.1.Obtention des extraits<br />
VI.1.1. Principe<br />
La macération, une méthode d’extraction solide-liquide, qui un procédé discontinu, a<br />
été mise à profit. Elle consiste à laisser tremper le solide (Extrait) dans un solvant (Méthanol)<br />
à température ambiante pour en extraire le maximum de constituants solubles. Après<br />
filtration, le résidu est remis dans un récipient d’extraction avec une nouvelle portion de<br />
solvant. Le processus est répété plusieurs fois. Les portions réunies d’extrait sont évaporées à<br />
sec.<br />
VI.1.2. Mode opératoire<br />
Huit grammes de l’extrait actif (obtenu à partir de l’éthanol 50%) ont été additionné de<br />
20ml de méthanol, le mélange est homogénéisé, puis centrifugé pendant 5 minutes à 3000<br />
tours/min. On obtient alors 2 phases : le surnageant ou extrait méthanolique (ce qui est soluble<br />
dans le méthanol) et le culot (insoluble). La fraction méthanolique est recueillie, concentrée à<br />
l’évaporateur rotatif sous pression réduite à 35°C avant d’être séchée dans un dessiccateur à la<br />
température ambiante.<br />
Un test d’activité antimicrobienne sur le germe sensible à l’extrait de départ est<br />
effectué avec les 2 fractions obtenues afin de déterminer laquelle de ces 2 fractions est la plus<br />
active. Puis la fraction la plus active est de nouveau fractionnée par CLBP.<br />
VI.2. Chromatographie Liquide à Basse Pression (C.L.B.P)<br />
Le C.L.B.P est une méthode courante de fractionnement, de séparation et aussi de<br />
purification des constituants d’un mélange.
VI.2.1. Principe<br />
Matériels et méthodes<br />
Le CLBP repose sur la séparation des composants, d’une part, les substances polaires<br />
sont fortement retenues par l’adsorbant dans la colonne ; d’autre part les solvants polaires<br />
entrainent facilement les composés moins polaires (Nagel et al., 1969). Lorsque l’échantillon<br />
est déposé au sommet de la colonne, il est aussitôt adsorbé en une zone cylindrique de faible<br />
épaisseur. L’écoulement continu d’éluant dans la colonne provoque alternativement<br />
l’adsorption et la désorption des molécules de l’échantillon. Les molécules sont entrainées<br />
vers le bas à des vitesses variables selon leur affinité pour l’adsorbant et leur solubilité dans<br />
l’éluant (Chavanne et al., 1986).<br />
VI.2.2. Mode opératoire<br />
VI.2.2.1.Remplissage de la colonne<br />
Le remplissage de la colonne par la phase fixe est une opération délicate, car de son<br />
homogénéité dépend la qualité de la séparation. Eviter les bulles d’air est une condition<br />
importante pour la réussite de la manipulation. Il existe deux modes de remplissage :<br />
Par voie sèche : l’adsorbant est mis directement dans la colonne utilisée.<br />
Par voie humide : l’adsorbant est d’abord mélangé avec un volume d’éluant, le tout<br />
bien homogénéisé et versé dans la colonne.<br />
VI.2.2.2.Dépôt de l’échantillon<br />
L’échantillon à analyser est déposé au sommet de la colonne en bande étroite, sous<br />
forme de :<br />
dépôt liquide : l’échantillon est dissous dans un minimum de volume de solvant.<br />
dépôt solide : l’échantillon est mélangé avec une petite quantité d’absorbant.<br />
VI.2.2.3.Déroulement de l’élution<br />
L’élution est réalisée avec un gradient discontinu du système de solvants employé<br />
(Dichlorométhane/Méthanol). Les fractions récoltées sont ensuite analysées par<br />
chromatographie sur couche mince. Elles sont rassemblées suivant leur comportement<br />
chromatographique.
VI.3. Chromatographie sur couche mince<br />
Matériels et méthodes<br />
La chromatographie sur couche mince (C.C.M) est fréquemment utilisée pour des<br />
analyses exploratoires et pour la caractérisation des produits.<br />
VI.3.1. Principe<br />
La CCM repose principalement sur des phénomènes d’absorption, la phase mobile est<br />
un solvant ou un mélange de solvants, qui progresse le long d’une phase stationnaire fixée sur<br />
une plaque de verre ou sur une feuille en plastique ou en aluminium. Chaque composant de<br />
l’échantillon se déplace à sa propre vitesse derrière le front du solvant. Chaque tache détectée<br />
ou révélée est caractérisée par sa référence frontale donnée par la relation<br />
suivante (Randerath, 1971 ; Vernin, 1970) :<br />
VI.3.2. Mode opératoire<br />
X<br />
Rf =<br />
Y<br />
VI.3.2.1. Dépôt des échantillons<br />
Une ligne de dépôt des extraits est tracée à environ 1cm du bord inférieur de la plaque.<br />
Puis les échantillons en solution sont déposés sous forme de trait sur la ligne de dépôt à l’aide<br />
d’un capillaire. Ils sont espacés de 1cm. Les dépôts sont séchés immédiatement puis vérifiés<br />
sous UV pour s’assurer que la quantité déposée est bien suffisante.<br />
VI.3.2.2. Saturation de la cuve<br />
Le système de solvants est versé dans la cuve (à une hauteur de 0,5cm) 15 minutes<br />
avant l’élution. Ceci a pour effet de saturer l’atmosphère de la cuve.<br />
Rf : Référence frontale.<br />
X : Distance parcourue par le produit.<br />
Y: Distance parcourue par le solvant<br />
VI.3.2.3. Développement du chromatogramme<br />
La plaque est placée en position presque verticale dans la cuve contenant le solvant de<br />
chromatographie, puis la cuve est fermée et le solvant migre par capillarité vers le haut le long<br />
de la plaque. Lorsque le front de solvant se trouve à environ 1cm de l’extrémité supérieure de<br />
la plaque, cette dernière est retirée de la cuve et séchée à l’aide d’un séchoir.
VI.3.2.4. Révélation<br />
Matériels et méthodes<br />
La plaque est d’abord observée sous lumière UV aux longueurs d’onde 254nm et<br />
365nm. Les produits qui absorbent les UV apparaissent sous forme de taches sombres.<br />
Les produits sont révélés par pulvérisation de la plaque à la vanilline sulfurique (la<br />
préparation de la vanilline sulfurique est représentée en annexe 3). Après séchage de la plaque<br />
dans l’étuve 120°C, des taches colorées (violet, bleu, rose) apparaissent.<br />
VI.4.Criblage de fractions actives<br />
Cette étape à pour objectif de déterminer la nature chimique des fractions actives par<br />
la combinaison des deux méthodes : méthode de colorimétrie par CCM et méthode<br />
bioautographique sur CCM.<br />
VI.4.1.Principe<br />
La bioautographie sur CCM consiste à faire migrer les fractions sur une plaque<br />
chromatographique. La plaque est ensuite déposée sur une culture de souche à tester sur<br />
milieu solide. La technique est la même que dans le test antibiogramme mais au lieu de disque<br />
imbibé de produit à tester, on utilise directement des plaques chromatographiques. Une zone<br />
d’inhibition est aperçue autour de(s) bande(s) active(s) sur la plaque. La Rf de(s) bande(s)<br />
active(s) est déterminée.<br />
La colorimétrie par CCM consiste d’abord à séparer les différentes fractions d’un<br />
extrait sur une plaque de silice dans un système de solvant adéquat. Les différentes fractions<br />
sont ensuite révélées à la lumière UV aux longueurs d’ondes de 254nm et 365nm puis<br />
marquées sur la plaque avec leurs références frontales respectives. La nature des différentes<br />
fractions actives est ensuite révélée avec des réactifs chimiques spécifiques comme<br />
l’anisaldéhyde sulfurique à 5% qui détecte les terpènes et les saponines, le réactif de<br />
Dragendorff qui justifie la présence des alcaloïdes, la solution éthanolique de KOH à 5% qui<br />
discerne les dérivés anthracéniques et les coumarines et la solution de NP/PEG qui démontre<br />
la présence des flavonoïdes (Merck, 1975).<br />
La comparaison des résultats des deux méthodes permet de déterminer la nature<br />
chimique de(s) fraction(s) active(s) à partir des Rf.
VI.4.2.Mode opératoire<br />
VI.4.2.1.Préparation de la plaque de CCM<br />
Matériels et méthodes<br />
Cinq plaques chromatographiques (6cm x 6cm) sont préparées (une plaque par<br />
fraction). Pour chaque plaque, le dépôt de la fraction se fait par un trait continu d’environ 5cm<br />
sur la ligne de dépôt. Après séchage à l’air libre, la plaque est placée dans une cuve<br />
chromatographique contenant 15ml de solvant correspondant pour chaque fraction. Dès que le<br />
solvant arrive à 0,5cm du bord supérieur de la plaque celle-ci est retirée et séchée. Les<br />
différentes bandes sont ensuite révélées à la lumière UV aux longueurs d’ondes 254nm et<br />
365nm puis marquées et les références frontales (Rf) sont calculées.<br />
La plaque est découpée en 7 portions à raison de 6mm par portion suivant le sens de<br />
migration du solvant (Figure 5).<br />
Portion<br />
6mm<br />
Figure 5 : Schéma du développement des fractions sur la plaque de CCM.<br />
Les portions 1 et 7 sont révélées par pulvérisation avec la vanilline sulfurique, ce sont<br />
des portions témoins. La portion 2 est destinée au test microbiologique et les portions 3, 4, 5<br />
et 6 sont utilisées pour la détection des grandes familles chimiques.<br />
VI.4.2.2.Test d’activité antibactérienne des fractions<br />
L’activité de chaque fraction est appréciée par un test antibactérien des portions de<br />
plaque de CCM. Le mode opératoire est le même que celui de la technique de diffusion sur<br />
gélose mais au lieu d’employer des disques de 6mm imprégnés de l’extrait, on utilise<br />
directement les portions de plaque de CCM (6mm de largueur et 6cm de longueur) après<br />
migration.<br />
Front de migration<br />
Plaque<br />
chromatographique<br />
Sens de migration<br />
du solvant.<br />
Zone de dépôt<br />
0,5cm<br />
1 2 3 4 5 6 7<br />
5cm 0,5 cm<br />
0,5cm<br />
5,5cm<br />
1cm
VI.4.2.3.Détection des grandes familles chimiques<br />
Matériels et méthodes<br />
Les portions de plaques préparées précédemment sont pulvérisées avec des réactifs<br />
spécifiques pour la détection de la nature chimique de ces différentes fractions (les<br />
préparations des réactifs sont présentées en annexe 3).<br />
a. Détection des terpènes<br />
La plaque est pulvérisée par une solution d’anisaldéhyde sulfurique à 5% puis<br />
chauffée à l’étuve à 120°C pendant 15 minutes. La présence d’une coloration bleue, bleu vert,<br />
rouge marron ou rouge violet ou violette ou jaunâtre sur les fractions est observée. Ces<br />
colorations déterminent la présence de terpènes et de saponines.<br />
b. Détection des alcaloïdes<br />
Le réactif de Dragendorff est pulvérisé sur la plaque. L’observation directe d’une<br />
coloration marron ou orange des fractions révèle la présence d’alcaloïdes.<br />
c. Détection des dérivés anthracéniques et des coumarines<br />
La plaque est révélée par une solution éthanolique de KOH à 5% puis à la lumière UV<br />
à la longueur d’onde 365nm. L’apparition des colorations rouge ou jaune fluorescent et bleu<br />
fluorescent démontrent respectivement la présence de dérivés anthracéniques et de<br />
coumarines.<br />
d. Détection des flavonoïdes<br />
La solution de NP/PEG est pulvérisée sur la plaque, puis après environ 15 minutes, la<br />
préparation est observée sous une lumière UV à 365nm de longueur d’onde. L’observation<br />
d’une fluorescence jaune ou verte sur les fractions indique la présence des flavonoïdes.
RESULTATS
RESULTATS<br />
I. ISOLEMENT <strong>DES</strong> SOUCHES D’ACTINOMYC<strong>ET</strong>ES<br />
Résultats<br />
A partir des 15 échantillons de sol rhizospherique collectés sur les 3 sites différents<br />
dans la forêt d’Ankafobe, 82 souches d’Actinomycètes sont isolées. Les souches sont<br />
numérotées de 1 à 82, et sur les 82 souches d’Actinomycètes :<br />
- 33 souches sont isolées à partir des échantillons de forêt primaire ;<br />
- 26 souches obtenues à partir des échantillons de forêt moyennement dégradée ;<br />
- 23 souches à partir des échantillons de sol de la forêt dégradée.<br />
Le tableau 7 montre le nombre de souches isolées à partir des 3 méthodes d’isolement<br />
dans les 3 sites d’études.<br />
Tableau 7: Nombre de souches d’Actinomycètes isolées à partir des 3 sites d’études<br />
Traitement<br />
Site<br />
Séléction par<br />
antibiotique<br />
Traitement à 100°C Sol aerosolisé<br />
Forêt primaire 13 11 9<br />
Forêt moyennement<br />
dégradéee<br />
8 4 14<br />
Forêt dégradée 4 4 15<br />
Figure 6 : Histogramme montrant le nombre de souches d’Actinomycètes isolées par<br />
sites et par méthodes d’isolement
Résultats<br />
Les 82 souches d’Actinomycètes isolées sont morphologiquement identiques c'est-à-<br />
dire les colonies sont opaques, de formes arrondies, à bords irréguliers et incrustées dans le<br />
milieu de culture (Figure 7). Mais ce qui differencie les souches c’est la couleur du mycélium<br />
aérien, celle du mycélium végetatif, leurs tailles et la production de pigments (Figure 8). Les<br />
caractéristiques de chaque souche d’Actinomycètes sont presentées en annexe 6. Le tableau 8<br />
résume les différents caractères morphologiques des souches d’Actinomycètes isolées.<br />
Figure 7: Souches pures d’Actinomycètes sur milieu ISP2<br />
Souches d’Actinomycètes<br />
produisant des pigments<br />
Figure 8 : Variétés de souches d’Actinomycètes isolées sur milieu ISP2<br />
Tableau 8: Résumé des caractères morphologiques des souches d’Actinomycètes isolées<br />
Taille des colonies mûres<br />
(D= diamètre de la colonie)<br />
Couleur du mycélium<br />
végétatif<br />
Couleur du mycélium aérien<br />
Couleur du pigment<br />
Souches d’Actinomycètes<br />
de différentes couleurs<br />
Petite (D < 0,5mm)<br />
Moyenne (0,5mmb D c 10mm)<br />
Grande (10mm < D)<br />
Jaune, Marron, Gris, Vert<br />
Rose, Rouge, Jaune<br />
Gris, Marron, Orange<br />
Rouge, Jaune<br />
Gris, Marron
II. PRODUCTION <strong>ET</strong> EXTRACTION DE M<strong>ET</strong>ABOLITES SECONDAIRES<br />
II.1. Fermentation sur milieu solide<br />
Résultats<br />
Les 82 souches d’Actinomycètes sont cultivées par fermentation sur le milieu AFM<br />
solide pour la production de métabolites secondaires pendant une période d’incubation de 8<br />
jours à 28°C (Cf. materiels et methodes. § II.3.1 p. 21). Après incubation, une couche très<br />
dense et homogène de colonies d’Actinomycètes incrustées dans la gélose s’est développée<br />
sur le milieu de fermentation (Figure 9).<br />
Figure 9 : Cultures d’Actinomycètes par fermentation sur milieu AFM solide<br />
II.2. Extraction de métabolites secondaires<br />
Les métabolites secondaires produits par les souches d’Actinomycètes, lors de la<br />
fermentation pendant une incubation de 8 jours sur milieu solide, ont été récupérés avec le<br />
solvant organique. Nous avons utilisé comme solvant d’extraction l’éthanol 50%, pour<br />
extraire la quasi-totalité des métabolites secondaires contenus dans le milieu de culture.<br />
Pour chaque culture, en utilisant 30ml d’éthanol 50%, 300mg à 500mg d’extraits sont<br />
obtenus selon la souche d’Actinomycète. Les extraits obtenus (82 extraits) sont de couleur<br />
marron (le poids de chaque extrait est présenté en annexe 6).
III. TEST ANTIMICROBIEN<br />
Résultats<br />
Après 24 heures d’incubation, les observations montrent que 42 extraits sont actifs au<br />
moins sur un germe testé. Cette activité est mise en évidence par la présence d’une zone<br />
d’inhibition autour des disques imbibés d’extrait à une concentration de 20mg/ml. Par contre,<br />
les 40 autres extraits, aucune zone d’inhibition n’est observée. Les résultats des tests<br />
antibiogrammes des extraits sont montrés dans le tableau 9.<br />
Tableau 9: Diamètre d’inhibition (mm) des extraits sur les souches testées<br />
Souches<br />
Extraits<br />
Bactéries à Gram+ Bactéries à Gram- Levure<br />
B.cereus S.aureus S.pneumoniae E.coli S.enteridis K.oxytoca C.albicans<br />
1 0 0 9 0 0 0 0<br />
8 9 8 8 0 0 0 0<br />
19 0 0 0 0 12 0 0<br />
20 0 0 0 7 7 0 0<br />
21 0 0 0 0 7 0 0<br />
22 0 0 0 0 7 0 0<br />
23 0 0 0 0 8 0 0<br />
24 0 0 0 0 8 7 0<br />
28 0 0 0 0 9 0 0<br />
29 0 7 0 0 0 0 0<br />
30 0 8 0 0 0 9 0<br />
33 0 7 0 0 0 0 0<br />
34 7 0 0 0 8 0 0<br />
35 0 0 0 9 10 7 0<br />
36 0 7 0 10 0 0 0<br />
37 0 0 8 8 0 0 0<br />
38 0 0 0 7 0 0 0<br />
39 7 0 0 0 7 0 0<br />
40 7 0 7 0 9 0 0<br />
41 7 0 8 0 9 0 0<br />
42 0 0 8 0 8 0 0<br />
43 7 0 7 0 0 0 0<br />
44 7 0 0 0 9 0 0
Résultats<br />
45 0 0 7 7 8 0 0<br />
51 0 0 8 0 0 0 0<br />
53 0 0 0 0 0 7 0<br />
57 0 0 0 0 0 0 13<br />
58 7 0 0 7 0 0 0<br />
59 0 7 0 7 0 0 0<br />
62 7 0 0 7 0 0 17<br />
63 8 0 0 8 0 0 0<br />
66 0 7 0 0 0 0 0<br />
68 0 0 0 0 0 0 18<br />
69 0 0 0 0 0 0 12<br />
70 0 7 7 0 0 0 0<br />
71 0 7 0 0 0 0 0<br />
74 8 19 18 0 0 0 0<br />
76 0 9 0 0 0 0 0<br />
78 7 11 10 0 0 0 8<br />
79 10 11 9 0 0 0 0<br />
80 10 9 9 0 0 0 13<br />
82 8 9 9 0 0 0 9<br />
Par ailleurs, certains extraits semblent être plus actifs que d’autres, comme le cas de :<br />
- l’extrait 74 sur Staphylococcus aureus et Streptococcus pneumoniae avec un<br />
diamètre de zone d’inhibition respectivement de 19mm et 18mm,<br />
- l’extrait 79 sur Bacillus cereus (10mm),<br />
- l’extrait 36 sur Escherichia coli (10mm),<br />
- l’extrait 30 sur Klebsiella oxytoca (9mm),<br />
- l’extrait 19 sur Salmonella enteridis (12mm)<br />
- l’extrait 68 sur Candida albicans (18mm).<br />
Les zones d’inhibition provoquées par ces extraits sur les germes testés sont présentées<br />
sur la figure 10.
79<br />
Inhibition de l’extrait 79 sur<br />
Bacillus cereus<br />
Inhibition de l’extrait 74 sur<br />
Streptococcus pneumoniae<br />
19<br />
74<br />
Inhibition de l’extrait 19 sur<br />
Salmonella enteridis<br />
74<br />
Inhibition de l’extrait 74 sur<br />
Staphylococcus aureus<br />
36<br />
35<br />
Inhibition de l’extrait 35 sur<br />
Escherichia coli<br />
30<br />
Inhibition de l’extrait 30 sur<br />
Klebsiella oxytoca<br />
Résultats
Inhibition de l’extrait 68 sur<br />
Candida albicans<br />
Figure 10 : Inhibition des bactéries et levure par les extraits d’Actinomycètes<br />
IV. D<strong>ET</strong>ERMINATION DE LA CMI <strong>ET</strong> DE LA CMB<br />
Résultats<br />
La CMI et la CMB de l’extrait 74 (l’extrait le plus actif par la méthode de diffusion<br />
sur gélose) a été déterminée sur Staphylococcus aureus (germe le plus sensible à l’extrait).<br />
IV.1. CMI de l’extrait 74 sur Staphylococcus aureus sur milieu solide<br />
Sur milieu solide, des disques imbibés de différentes concentrations de l’extrait 74<br />
sont déposés sur la culture de Staphylococcus aureus. La figure 11 montre l’effet des<br />
différentes doses de l’extrait 74 sur Staphylococcus aureus après 24 heures d’incubation à<br />
37°C. Les résultats sont donnés par le tableau10.<br />
6<br />
1<br />
68<br />
7<br />
5 4<br />
2<br />
3<br />
: Diamètre de la zone d’inhibition.<br />
Concentration d’extrait par disque<br />
1 : 20mg/ml<br />
2: 10mg/ml<br />
3: 5mg/ml<br />
4: 2,5mg/ml<br />
5: 1,25mg/ml<br />
6: 0,625mg/ml<br />
7: 0,3125mg/ml<br />
Figure 11: Effets des différentes concentrations de l’extrait 74 sur Staphylococcus aureus
Résultats<br />
Tableau 10: Détermination de la CMI sur milieu solide de l’extrait 74 sur Staphylococcus<br />
aureus<br />
Disques 1 2 3 4 5 6 7<br />
Concentration<br />
de l’extrait 74<br />
(mg/ml)<br />
20 10 5 2,5 1,25 0,62 0,31<br />
Observation + + + + + - -<br />
+ : présence de zone d’inhibition ; - : absence de zone d’inhibition<br />
D’après ces résultats, la valeur de la CMI en milieu solide de l’extrait 74 est égale à<br />
1,25mg/ml.<br />
IV.2. CMI de l’extrait 74 sur Staphylococcus aureus en milieu liquide<br />
En milieu liquide, les résultats de la culture de Staphylococcus aureus additionnée de<br />
l’extrait 74 à différentes concentrations sont donnés dans le tableau 11.<br />
Tableau 11: Détermination de la CMI en milieu liquide de l’extrait 74 sur Staphylococcus<br />
aureus<br />
Tube T+ 1 2 3 4 5 6 7 T-<br />
Extrait 74<br />
(mg/ml)<br />
0 20 10 5 2,5 1,25 0,62 0,31 0<br />
Aspect de<br />
la culture<br />
LIMPIDE CMI TROUBLE<br />
T+ : témoin positif ; T- : témoin négatif<br />
D’après ces résultats, la valeur de la CMI en milieu liquide de l’extrait 74 sur<br />
Staphylococcus aureus est estimée à 1,25mg/ml.<br />
IV.3. CMB de l’extrait 74 sur Staphylococcus aureus<br />
La CMB de l’extrait 74 est déterminée à partir des cultures en milieu liquide pour la<br />
détermination de la CMI (la méthode est décrite au paragraphe IV.3.3 p. 27). Les cultures de<br />
Staphylococcus aureus sur le milieu Muëller Hinton après 24 heures d’incubation à 37°C sont<br />
rapportées dans la figure 12. Les résultats sont présentés dans le tableau 12.
Figure 12: Cultures de Staphylococcus aureus après 24 heures d’incubation à 37°C<br />
Tableau 12: Détermination de la CMB de l’extrait 74 sur Staphylococcus aureus<br />
Résultats<br />
Tubes T+ 1 2 3 4 5 6 7 T-<br />
Extrait<br />
(mg/ml)<br />
0 20 10 5 2,5 1,25 0,62 0,31 0<br />
observation - - - + + + + + +<br />
+ : survie des microorganismes ; - : mort des microorganismes<br />
D’après les résultats réunis dans le tableau 12, la CMB de l’extrait 74 sur<br />
Staphylococcus aureus est égale à 10mg/ml.<br />
V. TEST ANTI-MALARIA<br />
Concernant le test anti malaria des extraits d’Actinomycètes, réalisé sur Plasmodium<br />
falciparum résistant à la chloroquine FCM29, seulement 3 extraits sur les 82 testés inhibent<br />
la croissance de Plasmodium falciparum à une concentration de 50Yg/ml c'est-à-dire l’extrait<br />
78, 80 et 82 à des pourcentages d’inhibition respectivement 88,07%, 100% et 100%. L’IC 50<br />
(concentration inhibant 50% de Plasmodium) à été déterminée pour les 3 extraits actifs.<br />
Les résultats sont donnés dans le tableau 13.<br />
Tableau 13: Pourcentage d’inhibition et IC 50 des extraits sur Plasmodium falciparum<br />
FCM29<br />
EXTRAITS<br />
Pourcentage d’inhibition<br />
pour 50Qg/ml d’extrait<br />
IC 50 (Qg/ml)<br />
78 88,07 1,87 ± 0,04<br />
80 100 1,79 ± 0,06<br />
82 100 7,99 ± 0,23
VI. <strong>ET</strong>UDE CHIMIQUE DE L’EXTRAIT 74<br />
Résultats<br />
L’extrait 74 qui s’est avéré le plus actif sur Staphylococcus aureus lors du test<br />
d’activité antibacterienne est utilisé pour l’étude chimique.<br />
VI.1. Fractionnement par le méthanol<br />
Après macération de 8g de l’extrait 74 avec le méthanol, deux (02) parties sont<br />
obtenus : le surnageant qui constitue l’extrait méthanosoluble (EM) et le culot (EA). Les deux<br />
(02) extraits obtenus sont évaporés à sec, les résultats sont rapportés dans le tableau 14<br />
suivant.<br />
Tableau 14: Fractionnement de l’extrait 74 avec le méthanol<br />
Extrait Poids de l’extrait obtenu (g) Rendement (%)<br />
EM (extrait méthanolique) 3,16 39,56<br />
EA (culot) 3,78 47,36<br />
L’activité des deux (02) extraits est appréciée sur Staphylococcus aureus par un test<br />
d’activité antibacterienne (Figure 13). Les résultats sont donnés dans le tableau15.<br />
EM<br />
Extrait 74<br />
Figure 13: Inhibition de la croissance de Staphylococcus aureus sous l’action de EM et EA<br />
Tableau 15: Effets des extraits sur Staphylococcus aureus<br />
Extraits solvant Concentration de<br />
l’extrait (mg/ml)<br />
Diamètre de la zone<br />
d’inhibition (mm)<br />
Extrait 74 Ethanol 50% 20 19<br />
EM Méthanol 20 24<br />
EA Eau 20 12<br />
EA
Résultats<br />
D’après ces résultats, l’activité antibactérienne de l’extrait méthanolique (EM) avec un<br />
diamètre de zone d’inhibition de 24mm vis-à-vis de Staphylococcus aureus, est plus<br />
importante comparée à celle de l’extrait EA (12mm).<br />
VI.2. Fractionnement de l’extrait EM par CLBP<br />
750mg de l’extrait méthanolique (EM) a été fractionné par CLPB en utilisant comme<br />
phase fixe la silice, un gradient de solvant de dichlorométhane et du méthanol comme phase<br />
mobile (Cf. matériels et méthodes. § VI.2 p.30). Après fractionnement, 82 fractions sont<br />
recueillies dans des tubes à essais d’un volume de 10ml. Après analyse des fractions par<br />
CCM, les fractions sont rassemblées suivant leur comportement chromatographique.<br />
Finalement, 5 fractions ont été retenues.<br />
Les différentes étapes de fractionnement par CLBP de l’extrait méthanolique sont<br />
rassemblées dans le diagramme ci-après et les profils chromatographiques sur couche mince<br />
des 5 fractions sont présentés dans la figure15.<br />
Fraction 1<br />
Système :<br />
DCM/MetOH<br />
[90/10]<br />
37,2mg<br />
Fraction 2<br />
Système :<br />
DCM/MetOH<br />
[85/15]<br />
28.8mg<br />
EXRAIT<br />
M<strong>ET</strong>HANOLIQUE<br />
750mg<br />
CLBP<br />
CCM<br />
82 FRACTIONS<br />
Fraction 3<br />
Système :<br />
DCM/MetOH<br />
[80/20]<br />
73,2mg<br />
-Colonne : Ø intérieur de 2,3cm<br />
Ø extérieur de 2,5cm<br />
Hauteur de 50cm<br />
Hauteur effective de 17cm<br />
-Silice normal 0,060-0,200 mm<br />
Ø 6nm ACROS ORGANICS<br />
-Système DCM…DCM/MeOH…...MeOH<br />
100%..........50/50..............100%<br />
-Fractions : 10ml<br />
-Adsorbant : Silice 60 F254<br />
sur feuille d’aluminium<br />
-Détection : UV 254 et 365 nm<br />
-Révélation : Vanilline sulfurique<br />
Fraction 4<br />
Système :<br />
DCM/MetOH<br />
[65/35]<br />
44.5mg<br />
Fraction 5<br />
Système :<br />
DCM/MetOH<br />
[55/45]<br />
515mg<br />
Figure 14 : Diagramme de fractionnement de l’extrait méthanolique (EM)
F1 F2 F3 F4 F5<br />
Figure 15: Profil chromatographique des 5 fractions issues de la CLBP<br />
VI.3. Bioautographie des fractions<br />
Résultats<br />
Après 24 heures d’incubation à 37°C, des zones claires correspondant à des zones<br />
d’inhibition ont été observées autour des portions de plaques de CCM (6mm de diamètre) sur<br />
la culture de Staphylococcus aureus. Ces zones d’inhibition ont des références frontales<br />
distinctes et de diamètres différents selon la fraction testée (Tableau 16).<br />
La figure 16 montre l’activité de chaque fraction sur Staphylococcus aureus après 24<br />
heures d’incubation à 37°C.<br />
F3 F2 F1<br />
Portion de<br />
F5 F4<br />
plaque de CCM<br />
Zone d’inhibition<br />
-Support : Silice 60 F254 sur feuille d’aluminium<br />
-Système de solvant : DCM/ MetOH [80/20]<br />
-Observation : UV 254nm et 365nm<br />
-Révélateur : Vanilline sulfurique<br />
Figure 16: Effets des fractions testées sur Staphylococcus aureus
Résultats<br />
Tableau 16: Diamètres et Rf des zones d’inhibition des fractions sur Staphylococcus aureus<br />
FRACTIONS<br />
Diamètre du halo<br />
d’inhibition (mm)<br />
Référence frontale de la<br />
bande active (Rf)<br />
Fraction 1 (F1) 15 0,05<br />
Fraction 2 (F2) 22 0,56<br />
Fraction 3 (F3) 16 0,54<br />
Fraction 4 (F4) 24 0,61<br />
Fraction 5 (F5) 21 0,83<br />
VI.4. Détection des familles chimiques des fractions actives<br />
Après les révélations de chaque portion de plaque par les réactifs chimiques<br />
spécifiques, les observations de la couleur des fractions sont dressées dans le tableau 17.<br />
Tableau 17: Composition chimique des fractions issues de l’extrait 74<br />
Famille chimique<br />
TERPENES<br />
ALCALOI<strong>DES</strong><br />
COMPOSE<br />
ANTHRACENIQUE<br />
Réactif<br />
spécifique<br />
Anisaldehyde<br />
sulfurique à<br />
5%<br />
Réactif de<br />
Dragendorff<br />
Solution<br />
éthanolique<br />
de KOH à<br />
5%<br />
Fractions<br />
Observations<br />
Colorations Résultats<br />
F1 - -<br />
F2<br />
F3<br />
Rf<br />
Coloration violette + 0,51*<br />
Coloration jaunâtre + 0,56*<br />
Coloration verte + 0,55*<br />
Coloration violette + 0,58*<br />
F4 - -<br />
F5 - -<br />
F1 Pas de coloration rouge marron -<br />
F2 Pas de coloration rouge marron -<br />
F3 Coloration orange + 0,9<br />
F4 Pas de coloration rouge marron -<br />
F5 Pas de coloration rouge marron -<br />
F1 Pas de coloration -<br />
F2 Pas de coloration -<br />
F3 Jaune fluorescente + 0,32<br />
F4 Rouge brique + 0,69<br />
F5 Pas de coloration
COUMARINES<br />
FLAVONOI<strong>DES</strong><br />
Solution<br />
éthanolique<br />
de KOH à<br />
5%<br />
Solution de<br />
NP/PEG<br />
F1 Pas de coloration -<br />
F2 Pas de coloration -<br />
F3 Pas de coloration -<br />
F4 Pas de coloration -<br />
F5 Pas de coloration -<br />
F1 Pas de coloration -<br />
F2 Pas de coloration -<br />
F3 Pas de coloration -<br />
F4 Pas de coloration -<br />
F5 Pas de coloration -<br />
(*) :Rf active sur Staphylococcus aureus<br />
Résultats<br />
En comparant les résultats obtenus de la bioautographie directe des chromatogrammes<br />
des 5 fractions sur Staphylococcus aureus (Tableau 16) et la révélation des portions de plaque<br />
des fractions (Tableau 17), il a été constaté que les responsables de l’activité des fractions 2 et<br />
3 sont des terpènes car pour la fraction 2, la zone d’inhibition se situe à la Rf=0,56 et la<br />
pulvérisation de la portion de plaque avec l’anisaldehyde sulfurique à 5% révèle des bandes<br />
de couleur verte (Rf=0,51) et violette (Rf=0,56) montrant la présence des terpènes. De même<br />
que pour la fraction 3, la révélation avec l’anisaldehyde sulfurique à 5% révèle la présence<br />
des composés terpéniques aux Rf 0,55 et 0,58 correspondant à la zone d’inhibition qui se<br />
trouve à la Rf égale à 0,54. Ceci confirme que les molécules responsables de l’activité des<br />
fractions 2 et 3 sur Staphylococcus aureus sont des terpènes (Figure 17).<br />
Fraction 2 Fraction 3<br />
Terpènes<br />
Zone d’inhibition<br />
(a) (b) (c) (c) (b) (a)<br />
a : révélation avec la vanilline sulfurique<br />
b : CCM-bioautographie sur Staphylococcus aureus<br />
c : révélation avec l’anisaldehyde sulfurique à 5%<br />
Figure 17: Nature chimique des bandes actives des fractions 2 et 3
DISCUSSION
DISCUSSION<br />
Discussion<br />
Un total de 15 échantillons de sol rhizosphérique répartis dans 3 localités différentes<br />
de la forêt d’Ankafobe a été utilisé pour isoler les souches d’Actinomycètes. En utilisant 3<br />
méthodes d’isolement (sélection par antibiotiques, traitement à haute température et sol<br />
aérosolisé), 82 variétés de souches d’Actinomycètes ont été isolés. Le prétraitement de sol<br />
c'est-à-dire le séchage des échantillons de sol permet déjà de sélectionner les Actinomycètes,<br />
car ces derniers sont plus résistants à la dessiccation par rapport aux autres microorganismes<br />
présents dans le sol.<br />
L’utilisation du milieu ISP2 additionné des antibiotiques antibactériens et<br />
antifongiques est ainsi une des méthodes sélectives pour l’isolement des Actinomycètes. Ces<br />
antibiotiques, comme l’acide nalidixique inhibe totalement la croissance des bactéries Gram<br />
négatif (Hayakawa et Nonomura, 1989), les autres agents sélectifs comme la triméthoprime<br />
(inhibiteur des bactéries à croissance rapide) (Labeda et Shearer, 1990) et le cycloheximide<br />
(inhibiteur fongique) (Wang et al, 1990) avaient été décrits pour l’isolement des colonies<br />
d’Actinomycètes du sol. Par conséquent, les antibiotiques ont été utilisés pour augmenter le<br />
nombre d’Actinomycètes isolés qui peut être masqué par les bactéries et les champignons<br />
présents dans les échantillons de sol. Parallèlement à l’utilisation des inhibiteurs, le traitement<br />
à haute température des échantillons de sol à 100°C pendant une heure permet aussi la<br />
sélection des Actinomycètes. Ils sont plus résistants à la chaleur que les autres<br />
microorganismes, par conséquent le nombre des bactéries trouvé communément dans les<br />
échantillons de sol est fortement réduit (Pisano et al., 1986).<br />
Sur les 82 souches d’Actinomycètes isolées, 33 souches sont issues des échantillons de<br />
sol de la forêt primaires, 26 souches ont été isolées à partir des échantillons de sol de forêt<br />
moyennement dégradée et 23 sont isolées de la forêt dégradée. Le grand nombre de souches<br />
d’Actinomycètes dans la forêt primaire peut s’expliquer par l’abondance des matières<br />
organiques sur ce site. Ce phénomène a été observé par Landerkin et al. (1950) en étudiant la<br />
diversité d’Actinomycètes et la propriété antibactérienne des souches isolées sur la côte Ouest<br />
de l’Inde où ils ont montré que la nature de la végétation qui se produit aux sites de<br />
l'échantillonnage influence le nombre et la variété de la population d’Actinomycètes.<br />
Les 82 souches pures d’Actinomycètes sont mises en culture pour produire des<br />
métabolites secondaires. La culture par fermentation sur milieu solide a été adoptée en<br />
utilisant le milieu AFM solide.
Discussion<br />
La fermentation solide est généralement définie comme une croissance microbienne<br />
sur des particules solides humides en l'absence d'eau libre (Durand, 2003 ; Gervais et al.,<br />
2003 ; Rahardjo et al., 2006). L’absence d'eau libre dans le milieu AFM solide permet de<br />
réduire considérablement les contaminations bactériennes (Raimbault, 1998).<br />
Les métabolites secondaires sont définis comme des composés de faible poids<br />
moléculaire de différentes natures non essentiels à la croissance des microorganismes. La<br />
synthèse de ces métabolites suit la phase de croissance active du microorganisme producteur.<br />
Plusieurs paramètres peuvent conditionner la croissance des Actinomycètes tels que la<br />
composition du milieu de culture, la température et le temps d’incubation. Les Actinomycètes<br />
exigent une source de carbone pour leur croissance. Le milieu AFM utilisé contient du<br />
glucose et de la mélasse comme source de carbone et la présence des inducteurs (ZnSO4, Mg<br />
SO4, CoCl2, CaCO3) permet d’amplifier la production des métabolites secondaires. Ces<br />
inducteurs déstabilisent les souches en culture qui produisent des métabolites secondaires<br />
dans des conditions de stress (Allah Antoine, 2009).<br />
L’incubation de la fermentation est conduite à une température de 28°C car la<br />
température convenable pour les Actinomycètes est de 28 à 30°C permettant alors une<br />
meilleure croissance des Actinomycètes cultivés. La durée d’incubation est aussi très<br />
importante car la synthèse des métabolites secondaires par les Actinomycètes suit la phase de<br />
croissance active qui dure 7 jours, il faut alors prolonger le temps d’incubation pour que les<br />
microorganismes puissent synthétiser les métabolites secondaires.<br />
Les Actinomycètes en culture synthétisent alors des substances dites « métabolites<br />
secondaires » après 8 à 14 jours d’incubation à 28°C. Ces substances sont dispersées dans le<br />
milieu de culture et sont extraites avec le solvant organique. Puis la culture par fermentation a<br />
été macérée avec 30ml d’éthanol 50% pendant 2 heures. La filtration de l’extrait est<br />
indispensable pour débarrasser les microorganismes présents dans l’extrait.<br />
L’étude de l’activité des extraits des Actinomycètes porté sur des souches de<br />
références composé de 3 bactéries Gram positif (Staphylococcus aureus ATCC 11632,<br />
Streptococcus pneumoniae ATCC 6301, Bacillus cereus ATCC 13061), 3 bactéries Gram<br />
négatifs (Escherichia coli, Salmonella enteridis, Klebsiella oxytoca ATCC 100323) et une<br />
levure (Candida albicans) par la méthode de diffusion sur gélose.<br />
Cette méthode permet de démontrer si un extrait est actif ou non par l’observation des<br />
zones d’inhibition autour des disques. L’extrait imprégné dans les disques se propage sur la<br />
gélose de façon radiale inhibant ainsi la croissance des germes. L’inhibition est représentée
Discussion<br />
sous forme de zone claire (ou zone d’inhibition) sur la culture microbienne. Elle permet<br />
également de déterminer la sensibilité d’une souche à un extrait donné par la mesure des<br />
diamètres de ces zones d’inhibition. La sensibilité du germe à l’égard de l’extrait est d’autant<br />
plus importante que le diamètre de la zone d’inhibition est grand.<br />
La plupart des extraits testés sont actifs au moins sur un microorganisme. Par contre<br />
certains extraits n’ont pas montré d’activité sur tous les microorganismes testés. D’après les<br />
résultats, nous avons constaté que les bactéries à Gram positif tels que Staphylococcus aureus<br />
et Streptococcus pneumoniae sont plus sensibles aux extraits d’Actinomycètes que les<br />
bactéries à Gram négatifs et la levure. C’est probablement la structure de leur paroi cellulaire,<br />
constituée principalement de peptidoglycane, qui rend ce groupe de bactéries plus sensible<br />
aux extraits. Par contre la paroi des bactéries à Gram négatif est formée d’une couche externe<br />
composée d’un complexe lipopolysaccharides, des phospholipides et des protéines. Cette<br />
couche est une barrière sélective ce qui les rend moins vulnérables aux extraits que les<br />
bactéries à Gram positif. Les résultats obtenus lors de cette étude ont aussi montré une action<br />
et un degré de sensibilité variables des germes vis-à-vis de ces extraits. Cette différence de<br />
sensibilité des micro-organismes vis-à-vis des extraits d’Actinomycètes pourrait être en<br />
rapport avec la composition de ces derniers qui varie selon la souche productrice.<br />
Il existe des extraits qui ne sont actifs que sur un groupe de microorganismes comme<br />
l’extrait 35, qui n’est actif que sur les bactéries à Gram positif. L’extrait 35 n’a pas d’effet sur<br />
la levure et les bactéries à Gram négatif, alors que les extraits 8 et 74, par exemple, sont actifs<br />
seulement sur les bactéries à Gram positif mais inactifs sur les bactéries à Gram négatif. Les<br />
extraits 57, 68, et 69 ne sont actifs que sur la levure. Tous ces extraits sont donc des extraits à<br />
spectre étroit c'est-à-dire que leurs activités sont limitées seulement à un groupe de<br />
microorganismes. Par contre, l’extrait 62 est un extrait à large spectre c'est-à-dire actif sur les<br />
bactéries à Gram positif, les bactéries à Gram négatif et la levure.<br />
Les extraits d’Actinomycètes ont révélé une très forte activité antimicrobienne sur les<br />
deux groupes de bactéries étudiées, soit sur les bactéries à Gram positif comme l’extrait 74<br />
sur Streptococcus pneumoniae (18mm) et l’extrait 80 sur Bacillus cereus (10mm),soit sur les<br />
bactéries à Gram négatif comme l’extrait 19 sur Salmonella enteridis (12mm) et l’extrait 36<br />
sur Escherichia coli (10mm), ainsi que l’extrait 68 sur la levure Candida albicans avec un<br />
diamètre de zone d’inhibition égal à 18mm. Cependant la plus grande valeur d’inhibition<br />
enregistrée est de 19mm sur Staphylococcus aureus par l’extrait 74.
La CMI et CMB de l’extrait 74 sur Staphylococcus aureus ont été déterminées.<br />
Discussion<br />
Deux méthodes ont été utilisées pour déterminer la CMI de l’extrait 74 mais aussi pour<br />
confirmer l’activité de l’extrait vis-à-vis de Staphylococcus aureus. Nous avons constaté que<br />
quelle que soit la méthode utilisée, la valeur de la CMI est toujours la même. Il est donc<br />
confirmé que la CMI de l’extrait 74 sur Staphylococcus aureus est égale à 1,25mg/ml. Cette<br />
valeur caractérise l’effet bactériostatique de l’extrait 74. La CMB de l’extrait 74 est estimée à<br />
10mg/ml. Cette valeur caractérise l’effet bactéricide de l’extrait 74 sur Staphylococcus<br />
aureus.<br />
L’extrait 74 inhibe alors la croissance de Staphylococcus aureus à une concentration<br />
de 1,25mg/ml mais il ne tue le germe qu’à une concentration supérieure ou égale à 10mg/ml.<br />
A l’issue du test antimalaria effectué sur Plasmodium falciparum FCM29 résistant à la<br />
chloroquine, trois extraits (78, 80, 82) sur les 82 extraits testés ont une activité inhibitrice<br />
notable sur Plasmodium falciparum FCM29 à la concentration 50Yg/ml. L’extrait 78 avec un<br />
pourcentage d’inhibition égale à 88,07%, les extraits 80 et 82 qui ont un pourcentage<br />
d’inhibition égale à 100%. Les autres extraits semblent inactifs sur Plasmodium falciparum<br />
même s’ils se sont avérés très actifs sur les bactéries et la levure comme le cas de l’extrait 74<br />
qui est très actif sur les bactéries à Gram positif mais n’a aucun effet sur Plasmodium. Par<br />
comparaison aux résultats obtenus sur le test antimicrobien de l’extrait 82, ce dernier semble<br />
plus actif préférentiellement sur Plasmodium falciparum que sur les microorganismes<br />
pathogènes avec un pourcentage d’inhibition élevé égal à 100 %. Nous avons noté que l’effet<br />
de l’extrait 82 sur les bactéries et la levure est très faible. Les extraits 78 et 80 sont tous les<br />
deux actifs sur Plasmodium falciparum et aussi sur les microorganismes pathogènes.<br />
L’IC50 des extraits qui ont une activité antipaludique supérieure à 75% d’inhibition a<br />
été déterminée. D’après les résultats, les extraits 78, 80 et 82 ont une IC50 respectivement 1,87<br />
± 0,04Yg/ml, 1,79 ± 0,06Yg/ml et 7,99 ± 0,23Yg/ml. L’extrait 80 avec une IC50 égale à 1,79 ±<br />
0,06Yg/ml est l’extrait le plus actif vis-à-vis de Plasmodium falciparum.<br />
Concernant l’étude préliminaire chimique de l’extrait 74 (l’extrait le plus actif lors du<br />
test antibiogramme), le fractionnement de 8g de l’extrait 74 avec le méthanol a donné 2<br />
extraits : le surnageant ou l’extrait méthanolique (EM) et le culot (EA).<br />
Le test antibiogramme, effectué sur Staphylococcus aureus, des 2 produits montre que<br />
l’extrait méthanolique (EA) est 2 fois plus actif avec un diamètre de zone d’inhibition égal à
Discussion<br />
24mm que l’extrait aqueux (EA) qui a un diamètre de zone d’inhibition égal à 12mm. Ce qui<br />
signifie que la majorité des substances responsables de l’activité de l’extrait 74 est<br />
probablement entrainée dans le surnageant qui est constitué par l’extrait méthanolique (EA)<br />
lors du fractionnement.<br />
Ces résultats nous ont permis de bioguider la détection de la grande famille de<br />
composés responsables de l’activité de l’extrait 74. En effet, l’extrait méthanolique (EM) issu<br />
du fractionnement de l’extrait 74 avec le méthanol a été fractionné par CLBP afin de bien<br />
séparer les composés qui y sont présents. Le suivi de la séparation a été fait par CCM. Les 5<br />
fractions obtenues présentent toutes une activité vis-à-vis de Staphylococcus aureus. La<br />
présence des composés comme les terpènes (fraction 2 et 3), les dérivées anthracéniques et les<br />
alcaloïdes a été révélé lors de la pulvérisation des portions de plaques de CCM des fractions<br />
par des réactifs spécifiques.<br />
La comparaison des résultats obtenus lors de la CCM-bioautographie sur<br />
Staphylococcus aureus et de la révélation des plaques par des réactifs spécifiques (Figure17) a<br />
montré que les molécules responsables de l’activité des fractions 2 et 3 sont des terpènes.<br />
Quant aux autres, la famille des molécules actives n’a pas encore été déterminée, il est<br />
probable que ces molécules appartiennent à des grandes familles autre que les alcaloïdes, les<br />
terpènes, les composés anthracéniques, les coumarines et les flavonoïdes.<br />
Le pouvoir antimicrobien de l’extrait 74 peut être attribué à ses composants<br />
majoritaires, mais il ne faut pas négliger les constituants mineurs qui peuvent avoir une action<br />
significative sur l’activité antimicrobienne de l’extrait.
CONCLUSION<br />
<strong>ET</strong><br />
PERSPECTIVES
CONCLUSION GENERALE <strong>ET</strong> PERSPECTIVES<br />
Conclusion et perspectives<br />
Le présent travail portant sur « études biologiques et chimiques des métabolites<br />
secondaires de souches d’Actinomycètes telluriques isolées dans la forêt d’Ankafobe de<br />
Madagascar », nous a permis de :<br />
Maîtriser des techniques usuelles en microbiologie et de nous initier à techniques<br />
employées en chimie organique.<br />
Isoler des souches d’Actinomycètes par différentes méthodes d’isolement et de<br />
purification.<br />
Apporter des informations sur la distribution et l’abondance des Actinomycètes dans<br />
le sol.<br />
Disposer d’une collection de souches d’Actinomycètes telluriques utilisable dans les<br />
recherches à venir.<br />
Mettre en évidence l’activité des extraits des métabolites secondaires des<br />
Actinomycètes sur des bactéries pathogènes et sur des parasites.<br />
Déterminer les familles chimiques de l’extrait actif.<br />
Nous avons montré dans cette étude que les souches d’Actinomycètes telluriques<br />
provenant d’une forêt malgache ont des activités aussi bien sur les microorganismes<br />
pathogènes que sur les parasites comme Plasmodium falciparum. Aussi, l’extrait doué de<br />
pouvoir antibactérien renferme diverses substances chimiques. Cependant, cette étude est loin<br />
d’être finie. Dans l’avenir, nous envisageons d’entreprendre des travaux de recherches sur :<br />
La caractérisation moléculaire des souches d’Actinomycètes isolées par PCR des<br />
gènes 16S ribosomal.<br />
L’isolement et l’identification structurale des substances actives.<br />
La valorisation des autres souches qui ont produit des extraits actifs sur d’autres agents<br />
pathogènes.<br />
L’élargissement des études des activités des Actinomycètes sur d’autres<br />
microorganismes pathogènes comme les phytopathogènes.
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ANNEXES
ANNEXES<br />
Annexe 1 : Composition des milieux de culture<br />
Milieu d’isolement des Actinomycètes<br />
ISP2 (International Streptomyces project) :<br />
Annexes<br />
Extrait de levure 4g/l<br />
Extrait de malt 10g/l<br />
Glucose 4g/l<br />
NaCl 20g/l<br />
Agar 20g/l<br />
Les antibiotiques<br />
Pour 500ml de milieu ISP2, on ajoute :<br />
- 5ml de Cycloheximide (0,01g dilué dans 5ml de DMSO)<br />
- 5ml de Triméthoprime (0,25g dilué dans 5ml d’ED)<br />
- 5ml d’acide nalidixique (0,25g dilué dans 5ml d’ED)<br />
Milieu de fermentation<br />
AFM :<br />
Glucose 40g/l<br />
Mélasse de canne 17,5g/l<br />
Pastone 12,5g/l<br />
CaCo 34g/l<br />
KCl 2,5g/l<br />
MgSO4 2,5g/l<br />
ZnSO4 4,6mg/l<br />
CoCl2 10mg/l<br />
Agar 15g/l
Annexes<br />
Milieu utilisé pour le test antibiogramme<br />
Muëller Hinton<br />
Extrait de bœuf 3g/l<br />
Hydrolysat de caséine 17,5g/l<br />
Amidon 1,5g/l<br />
Agar 15g/l<br />
pH 7,2 ± 0,2<br />
Milieu pour la purification des souches à tester<br />
Gélose nutritive :<br />
Extrait de viande 3g/l<br />
Peptone 5g/l<br />
Agar 15g/l<br />
pH 7,4<br />
Milieu pour la revivification des souches à tester<br />
Bouillon nutritif :<br />
Peptone 15g/l<br />
Extrait de levure 5g/l<br />
NaCl l5g/l<br />
pH 7,4
Composition RPMI 1640 (sigma)<br />
Composants mg/l<br />
Sels inorganiques Nitrate de calcium x 4H2O 100<br />
Sulfate de magnésium sec 48,84<br />
Chlorure de potassium 400<br />
Chlorure de sodium 6000<br />
Phosphate de di-sodium hydrogéné 800<br />
Autres composants D(+) Glucose anhydre 2000<br />
Glutathione (red.) 1,00<br />
Hepes 5958<br />
Rouge de phénol 5<br />
Acides aminés L-Arginine x HCl 241,86<br />
L-Asparagine x H2O 50<br />
Acide L-aspartique 20<br />
L-Cystine 65,19<br />
L-Glutamine 300<br />
Acide L-glutamique 20<br />
Glycine 10<br />
L-Histidine x HCl x H2O 20.27<br />
L-Hydroxyproline 20<br />
L-Isoleucine 50<br />
L-Leucine 50<br />
L-Lysine x HCl 40<br />
L-Méthionine 15<br />
L-Phénylalanine 15<br />
L-Proline 20<br />
L-Sérine 30<br />
L-Théeonine 20<br />
L-Tryptophane 5<br />
L-Tyrosine x 2Na 28,83<br />
L-Valine 20<br />
Vitamines Acide p-aminobenzoïque 1<br />
D(+)-Biotine 0,20<br />
D-Calcium pantothénate 0,25<br />
Chlorure de choline 3<br />
Acide folique 1<br />
Myo-Inositol 35<br />
Nicotinamide 1<br />
Pyridoxol x HCl 1<br />
Riboflavine 0,20<br />
Thiamine x HCl 1<br />
Vitamine B12 0,005<br />
Annexes
Annexe 2 : Liste des matériels et équipements<br />
Agitateur EDMOND BUHLER,<br />
Autoclave Sanyo MLS-3780,<br />
Bain ultrason SONOCLEAN,<br />
Balance M<strong>ET</strong>TLER,<br />
Balance SARTORIUS,<br />
Bec bunsen,<br />
Boîtes de Pétri de 90 mm de diamètre,<br />
Centrifugeuse H<strong>ET</strong>TICH ROTANTA/R.,<br />
Cuve chromatographique CAMAG,<br />
Dessiccateur sous vide<br />
Eprouvettes graduées,<br />
Erlenmeyers gradués,<br />
Etuve MEMERT,<br />
Filtre millipore,<br />
Fioles jaugées,<br />
Flacon EZ<br />
Grayson aérosol sampler (GAS)<br />
Hotte à flux laminaire FLUFRANCE,<br />
Incubateur NAPCO,<br />
Incubateur SANYO,<br />
Micropipettes avec embouts plastiques,<br />
Pipettes,<br />
Plaque chauffante avec agitateur magnétique HB 450,<br />
Plaque de silice F1500/SL254,<br />
Réfrigérateur PHILIPS,<br />
Rotavapor,<br />
Shaker orbital C-1 CLASSIC,<br />
Spectrophotomètre AWARENESS TECHNOLOGY INC,<br />
Speedvac,<br />
Tubes à essai.<br />
Annexes
Annexe 3: Les réactifs<br />
Composition du réactif pour la révélation des chromatogrammes<br />
Réactif à la vanilline sulfurique<br />
0,5g de vanilline<br />
100ml d’acide sulfurique concentré<br />
Composition des réactifs utilisés pour le criblage chimique<br />
Solution anisaldéhyde sulfurique à 5%<br />
85ml de méthanol.<br />
10ml d’acide acétique glacial.<br />
5ml d’acide sulfurique.<br />
0,5ml anisaldéhyde.<br />
Réactif de Dragendorff<br />
Mélange à volume égal des deux solutions suivantes :<br />
Annexes<br />
Solution 1 : 1,7g de nitrate de bismuth basique et 20g acide tartrique<br />
dans 80ml d’eau.<br />
Solution 2 : 16g d’iodure de potassium dans 50ml d’eau.<br />
Solution éthanolique de KOH à 5%<br />
5g de KOH.<br />
100ml d’éthanol.<br />
Solution NP/PEG<br />
Mélange des deux solutions suivantes :<br />
Solution NP : Diphénylboryloxyethylamine 1%, 10ml.<br />
Solution PEG : polyéthylèneglycol-4000 5%, 8ml.
Annexe 4 : Caractéristiques des souches testées<br />
Noms Caractéristiques Maladies causées<br />
Bacillus cereus - Bacille.<br />
- Gram positif.<br />
Candida albicans - Levure<br />
filamenteuse<br />
(Champignon<br />
imparfait).<br />
Escherichia coli - Bacille.<br />
- Gram négatif.<br />
Klebsiella oxytoca - Bacille.<br />
- Gram négatif.<br />
Salmonella enteridis - Cocci.<br />
- Gram négatif.<br />
Staphylococcus<br />
aureus<br />
Streptococcus<br />
pneumoniae<br />
- Cocci.<br />
- Gram positif.<br />
- Cocci.<br />
- Gram positif.<br />
- Infection alimentaire toxique.<br />
- Mycose au niveau de la peau, des<br />
appareils génitaux, urinaires et<br />
respiratoires.<br />
- Méningite.<br />
- Muguet orale et vulvo-vaginale.<br />
- Gastro-entérite.<br />
- Diarrhée.<br />
- Infection urinaire<br />
- Septicémie.<br />
- Fièvre typhoïde.<br />
- Abcès.<br />
- Conjonctivites.<br />
- Folliculites.<br />
- Furoncles.<br />
- Otites.<br />
- Pneumonies.<br />
Annexes<br />
- Bactérie invasive qui peut entrainer une<br />
pneumonie franche lobaire aiguë<br />
- Septicémie<br />
- Otites, sinusite<br />
- Méningite<br />
- Pleurésies<br />
- conjonctivites
Annexe 5 : Développement de Plasmodium falciparum lors de son cycle intra<br />
érythrocytaire<br />
Annexes<br />
Lors de son développement dans les globules rouges, Plasmodium évolue en trois<br />
étapes. Le stade mérozoïte, issu de la prolifération initiale du parasite dans le foie, est<br />
capable d’infecter un érythrocyte. Il va s’enfermer dans une vacuole parasitophore (stade<br />
anneau ou ring). Au stade trophozoïte, la néosynthèse de ses protéines est intense et leur<br />
trafic efficace via de nombreux compartiments membranaires que le parasite étend dans le<br />
cytosol du globule rouge. Le parasite se développe ensuite en schizonte, et celui-ci se divise<br />
pour donner de nombreux mérozoïtes, lesquels, après rupture de la membrane érythrocytaire,<br />
vont pouvoir infecter d’autres érythrocytes.
N°<br />
des<br />
Souches<br />
Annexe 6 : Caractères morphologiques des souches d’Actinomycètes isolées<br />
Site<br />
d’isolement<br />
Taille des<br />
colonies<br />
Couleur du<br />
mycélium aérien<br />
Couleur du mycélium<br />
de substrat<br />
Pigmentation<br />
Annexes<br />
Poids des<br />
extraits<br />
(mg)<br />
1 Site 3 Moyenne Blanche Blanche - 425<br />
2 Site 2 Petite Orange Orange Jaune orangé 425<br />
3 Site 3 Moyenne Orange Jaune orangé - 300<br />
4 Site 2 Petite Blanche Blanche - 325<br />
5 Site 1 Petite Rouge Orange - 325<br />
6 Site 1 Moyenne Grise Grise - 450<br />
7 Site 1 Petite Marron Marron - 500<br />
8 Site 1 Moyenne Jaune Jaune jaune 325<br />
9 Site 1 Grande Jaune orangé Orange - 425<br />
10 Site 3 Grande Jaune poussin Jaune - 475<br />
11 Site 2 Moyenne Rouge Rouge - 425<br />
12 Site 1 Petite Verte Grise - 500<br />
13 Site 3 Moyenne Marron Marron - 475<br />
14 Site 2 Grande Blanche Jaune - 475<br />
15 Site 3 Petite Orange Orange -- 425<br />
16 Site 1 Moyenne Blanche Orange - 375<br />
17 Site 3 Moyenne Rose Rose - 425<br />
18 Site 2 Grande Jaune Jaune - 425<br />
19 Site 1 Petite Marron Marron claire - 375<br />
20 Site 2 Grande Jaune pale Jaune - 325<br />
21 Site 2 Moyenne Blanche Blanche - 325<br />
22 Site 1 Petite Marron claire Marron - 500<br />
23 Site 1 Moyenne Marron Marron - 525<br />
24 Site 1 Petite Grise Gris foncé - 425<br />
25 Site 1 Moyenne Jaune pale Jaune - 375<br />
26 Site 1 Moyenne Jaune Jaune foncé - 375<br />
27 Site 2 Moyenne Blanche Blanche - 425<br />
28 Site 2 Petite Jaune Jaune - 425<br />
29 Site 3 Petite Marron Marron Marron claire 425
Annexes<br />
30 Site 1 Moyenne Jaune Blanche - 500<br />
31 Site 3 Grande Orange Rouge orangé rouge 375<br />
32 Site 2 Moyenne Verte Verte - 400<br />
33 Site 3 Grande Orange Orange - 475<br />
34 Site 2 Moyenne Grise Verte - 525<br />
35 Site 3 Petite Jaune Jaune - 425<br />
36 Site 1 Moyenne Marron Marron - 375<br />
37 Site 1 Petite Blanche Blanche - 475<br />
38 Site 3 Moyenne Rouge Rouge Rouge 500<br />
39 Site 1 Petite Marron Grise - 525<br />
40 Site 1 Petite Marron Grise Marron 350<br />
41 Site 1 Grande Rouge Rouge - 350<br />
42 Site 2 Moyenne Grise Grise - 400<br />
43 Site 2 Petite Jaune poussin Jaune - 425<br />
44 Site 3 Grande Jaune Blanche - 525<br />
45 Site 1 Grande Rose Rouge - 350<br />
46 Site 2 Grande Jaune Jaune - 375<br />
47 Site 1 Moyenne Jaune Jaune - 425<br />
48 Site 3 Moyenne Grise Verte - 375<br />
49 Site 2 Petite Jaune Jaune - 475<br />
50 Site 2 Moyenne Jaune Jaune - 500<br />
51 Site 3 Petite Rouge Violette - 500<br />
52 Site 1 Petite Blanche Marron Marron 375<br />
53 Site 2 Petite Blanche Marron Marron 350<br />
54 Site 2 Moyenne Marron Marron Marron 475<br />
55 Site 1 Petite Jaune Jaune - 450<br />
56 Site 1 Petite Jaune poussin Jaune - 550<br />
57 Site 1 Moyenne Rouge Rouge - 475<br />
58 Site 3 Moyenne Blanche Jaune jaune 425<br />
59 Site 3 Petite Marron Orange - 375<br />
60 Site 2 Grande Rouge Rouge - 375<br />
61 Site 3 Moyenne Blanche Jaune - 500<br />
62 Site 2 Grande Marron Marron - 350<br />
63 Site 3 Moyenne Jaune poussin Jaune - 475
Annexes<br />
64 Site 1 Moyenne Jaune Jaune - 475<br />
65 Site 3 Petite Verte Verte - 425<br />
66 Site 2 Moyenne Marron Marron - 375<br />
67 Site 1 Grande Marron Marron foncé Marron 425<br />
68 Site 2 Moyenne Jaune Jaune - 500<br />
69 Site 3 Petite Rouge Rose - 525<br />
70 Site 2 Moyenne Grise Verte - 475<br />
71 Site 1 Moyenne Blanche Blanche - 375<br />
72 Site 2 Petite Marron Marron - 425<br />
73 Site 2 Moyenne Violette Violette - 375<br />
74 Site 1 Moyenne Marron Marron - 475<br />
75 Site 1 Petite Blanche Blanche - 375<br />
76 Site 3 Moyenne Rose Rose - 425<br />
77 Site 1 Grande Rouge Rouge - 375<br />
78 Site 2 Grande Jaune Jaune - 475<br />
79 Site 3 petite Jaune Jaune - 375<br />
80 Site 1 Petite Blanche Blanche - 500<br />
81 Site 3 Petite Rouge Rose - 425<br />
82 Site 1 Grande Violette Violette - 425<br />
Site 1 : forêt primaire, Site 2 : forêt moyennement dégradée, Site 3 : forêt dégradée.
Name : ANDRIAMBOLOLONA<br />
Firstname : Tokiniaina<br />
Title : Biological and chemical studies of secondary metabolites from telluric<br />
Actinomycetes of Ankafobe forest.<br />
ABSTRACT<br />
A total of 82 strains with distinct characteristics of telluric Actinomycetes was isolated<br />
from 15 rhisospheric soil samples collected in different sites of Ankafobe forest by three<br />
isolation methods. Of these isolates, 33 were isolated from soil samples of pristing forest ; 26<br />
from medium impact and 23 from high impact.<br />
These isolates were fermented in solid media to product extracts rich in secondary<br />
metabolites. Extraction was carried out with the ethanol to 50%. Antimicrobial activity of<br />
these extracts was detected using agar diffusion method against pathogenic strains of bacteria<br />
and yeast. 42 among 82 tested extracts were found to be active against test organisms<br />
selectively against Gram-positive organisms than Gram-negative organisms. Antimalaria<br />
activity showed that only 3 extracts out of 82 inhibited the growth of Plasmodium falciparum.<br />
The extract 74 (from strain 74) presenting a board spectrum of activity against<br />
Staphylococcus aureus (with MIC value 1.25mg/ml and MBC 10mg/ml), was the subject of<br />
chemical study. Bioguided fractionation of the extract 74 was allowed to obtain 5 active<br />
fractions against Staphylococcus aureus. The combination of the two techniques (TLC-<br />
biautography and revelation of the plates with specific chemicals) showed that molecules<br />
responsible of extract 74’s activity are terpenic nature associated with undetermined<br />
compounds.<br />
Keys words : telluric Actinomycetes, secondary metabolites, antimicrobial activity,<br />
antimalaria.<br />
Advisors : Pr RAHERIMANDIMBY Marson<br />
Dr RASOLOMAMPIANINA Rado
Nom : ANDRIAMBOLOLONA<br />
Prénom : Tokiniaina<br />
Titre : Etudes biologiques et chimiques des métabolites secondaires<br />
d’Actinomycètes telluriques : cas de la forêt d’Ankafobe.<br />
RESUME<br />
Un total de 82 souches se rapprochant par leurs aspects macroscopiques des<br />
Actinomycètes telluriques a été isolé à partir de 15 échantillons de sols rhizospheriques de<br />
différents sites de la forêt d’Ankafobe en utilisant trois méthodes d’isolement. Parmi ces<br />
isolats, 33 ont été isolés à partir des échantillons de sol de forêt primaire, 26 à partir de forêt<br />
moyennement dégradée et 23 autres à partir de la forêt dégradée.<br />
Ces souches ont été cultivées par fermentation solide afin de produire des extraits<br />
riches en métabolites secondaires. L’extraction a été effectuée avec de l’éthanol à 50%.<br />
L’activité antibactérienne des extraits de métabolites secondaires a été mise en évidence par<br />
un test antibiogramme, en utilisant la technique de diffusion sur gélose sur des souches de<br />
bactéries et de levure pathogènes. La plupart des extraits (42 sur les 82 testés) ont présenté<br />
une activité inhibitrice à l'égard des souches bactériennes testées. Les extraits semblent être<br />
plus actifs sur les bactéries à Gram positifs que sur les bactéries à Gram négatifs. Le test<br />
antimalaria a montré que 3 extraits sur les 82 inhibent le développement de Plasmodium<br />
falciparum.<br />
L’extrait 74 (issu de la souche 74), présentant une activité importante sur<br />
Staphylococcus aureus avec une CMI égale à 1,25mg/ml et une CMB proche de 10mg/ml, a<br />
fait l’objet d’étude chimique. Le fractionnement bioguidé de l’extrait 74 a permis d’avoir 5<br />
fractions actives sur Staphylococcus aureus. La combinaison des deux techniques (CCM-<br />
bioautographie et révélation des plaques avec des réactifs spécifiques) permet de montrer que<br />
les molécules responsables de l’activité de l’extrait 74 sont de nature terpénique associée à<br />
des composés non déterminés.<br />
Mots-clés : Actinomycètes telluriques, métabolites secondaires, activité antibactérienne,<br />
antimalaria.<br />
Encadreurs : Pr RAHERIMANDIMBY Marson<br />
Dr RASOLOMAMPIANINA Rado