ETUDES BIOLOGIQUES ET CHIMIQUES DES METABOLITES ...

UNIVERSITE D’ANTANANARIVO
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FACULTE DES SCIENCES
****************
DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE
*****************
MEMOIRE DE RECHERCHE POUR L’OBTENTION DU
DIPLOME D’ETUDES APPROFONDIES DE BIOCHIMIE
OPTION : BIOTECHNOLOGIE-MICROBIOLOGIE
ETUDES BIOLOGIQUES ET CHIMIQUES
DES METABOLITES SECONDAIRES DES
ACTINOMYCETES TELLURIQUES
Cas de la forêt d’ANKAFOBE
Présenté par :
ANDRIAMBOLOLONA Tokiniaina
Maître ès-Sciences
Soutenu publiquement le 30 Août 2010 devant la commission d’examen composée de :
Président : Professeur JEANNODA Victor
Rapporteurs : Professeur RAHERIMANDIMBY Marson
Docteur RASOLOMAMPIANINA Rado
Examinateurs : Docteur RANDRIANIERENANA Ando
Docteur RAKOTO Danielle A. Doll

« Grâces soient rendues à Dieu pour son don merveilleux ! »
2 Corinthiens 9. 15
A Seheno, tout mon amour, merci de ta confiance et
de ton soutien.

Remerciements
Remerciements
Remerciements
Remerciements
Je remercie le Seigneur de me guider chaque jour et de me donner la santé et la
détermination à travers son Amour. Que son Nom soit glorifié.
Je souhaite adresser, à travers ces quelques lignes, ma grande reconnaissance envers
l’Université d’Antananarivo, la Faculté des Sciences, particulièrement, le Département de
Biochimie Fondamentale et Appliquée.
jury :
Mes vifs remerciements vont à tous nos enseignants, spécialement, aux membres du
Monsieur JEANNODA Victor, Professeur titulaire, Responsable de la formation
doctorale « Sciences de la vie ». Malgré vos multiples engagements, vous avez accepté
d’apporter vos critiques constructives à mon mémoire. Votre présence en tant que Président du
jury est un grand honneur pour moi.
Madame le Docteur RAKOTO Danielle A. Doll, Chef du Département. Malgré vos
nombreuses responsabilités, vous avez consenti à examiner avec attention mon travail. Il m’est
gratifiant de vous avoir parmi les membres du jury de mon mémoire.
Madame le Docteur RANDRIANIERENANA Ando. En dépit de vos innombrables
occupations, vous avez daigné porter vos considérations à mon mémoire. Votre siège en tant
qu’examinateur m’honore.
Monsieur RAHERIMANDIMBY Marson, Professeur Titulaire. En acceptant
d’être mon encadreur, vous m’avez accordé une grande partie de votre temps. Vos précieux
conseils m’ont beaucoup aidé. Je vous suis très reconnaissante d’être le rapporteur de mon
mémoire.
Docteur RASOLOMAMPIANINA Rado, co-encadreur de ce Mémoire. Pour ses
conseils judicieux et ses encouragements permanents. Vous n’avez pas hésité à me faire part de
votre expérience pour mener à bien ce travail.

Je tiens à remercier vivement
Monsieur RAVELONANDRO Pierre, Directeur du Centre National de Recherche sur
l’Environnement qui m’a accueilli dans ses Laboratoires pour la réalisation de ce travail.
Monsieur RALAMBONDRAHETY Rahanira, pour la réalisation de la partie chimie
de ce travail dans son laboratoire.
Monsieur le Docteur RATSIMBASON Michel, Directeur du Centre National
d’Application à la Recherche Pharmaceutique, pour la réalisation des tests anti malaria dans
son laboratoire.
Egalement, j’exprime ma sympathie à toute l’équipe du Laboratoire de microbiologie de
l’Environnement du CNRE, chercheurs, techniciens et stagiaires, pour leur conseil, leur soutien et
leur amitié.
toujours.
Je suis redevable envers ma famille qui m’a beaucoup encouragé et soutenu depuis
Mes sincères remerciements à mes amis et à tous ceux qui ont contribués, de près ou de
loin, à la réalisation de ce mémoire.

- TABLE DES MATIERES -
Table des matières
GLOSSAIRE .............................................................................................................................. i
LISTE DES ABREVIATIONS ...............................................................................................iii
LISTES DES FIGURES .......................................................................................................... iv
LISTES DES TABLEAUX ...................................................................................................... v
INTRODUCTION .................................................................................................................... 1
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ....................................................................................... 3
I. Le sol ....................................................................................................................................... 3
I.1. La rhizosphère .................................................................................................................. 3
I.2. Les microorganismes rhizospheriques ............................................................................. 4
II. Les Actinomycètes ............................................................................................................... 5
II.1. Définition des Actinomycètes ......................................................................................... 5
II.1.1. Similitude entre Actinomycètes et champignons ..................................................... 5
II.1.2. Similitude entre Actinomycètes et bactéries ............................................................ 5
II.2. Caractéristiques générales ............................................................................................... 6
II.3. Classification des Actinomycètes ................................................................................... 7
II.3.1. Mycobacteriacées .................................................................................................... 7
II.3.2. Actinomycétacées (ou Pro-Actinomycètes) ............................................................. 7
II.3.3. Streptomycétacées .................................................................................................... 7
II.3.4. Actinoplanacées ...................................................................................................... 8
II.4. Ecologie et distribution des Actinomycètes .................................................................... 9
II.4.1. Sols ........................................................................................................................... 9
II.4.2. Eaux douces et marines ............................................................................................ 9
II.4.3. Air .......................................................................................................................... 10
II.4.5. Actinomycètes pathogènes ..................................................................................... 10
III. Particularités des Actinomycètes telluriques ................................................................. 10

Table des matières
III.1. Les facteurs physiques et chimiques ........................................................................... 10
III.2. Rôle des Actinomycètes telluriques ............................................................................ 11
III.2.1. Aptitude à dégrader les substances organiques non biodégradables par les
champignons et les bactéries .................................................................................................... 11
III.2.2. Aptitude à produire des substances pro biotiques, antibiotiques ou toxiques ...... 11
III.3. Les métabolites secondaires des extraits d’Actinomycètes ......................................... 12
III.3.1. La production d’antibiotique chez les Actinomycètes ......................................... 12
III.3.2. Application des antibiotiques issus des Actinomycètes ....................................... 13
III.3.2.1. En santé humaine .......................................................................................... 13
III.3.2.2. En santé animale et élevage .......................................................................... 14
III.3.2.3. En agriculture ............................................................................................... 14
IV-Obtention de nouveaux antibiotiques ............................................................................. 14
MATERIELS ET METHODES ............................................................................................ 15
A-MATERIELS ...................................................................................................................... 15
I. Echantillonnage du sol ........................................................................................................ 15
II. Milieux d’étude .................................................................................................................. 16
II.1. Milieu d’isolement ........................................................................................................ 16
II.2. Milieu de fermentation .................................................................................................. 16
II.3. Milieu d’enrichissement ................................................................................................ 17
II.4. Milieu de rajeunissement .............................................................................................. 17
II.5. Milieu pour le test antibiogramme ................................................................................ 17
III. Stérilisation ....................................................................................................................... 17
B-METHODES ....................................................................................................................... 18
I-Isolement des souches d’Actinomycètes ............................................................................. 18
I.1. But .................................................................................................................................. 18
I.2. Principe ........................................................................................................................... 18
I.3. Mode opératoire ............................................................................................................. 18

Table des matières
I.3.1 Prétraitement des échantillons de sol ....................................................................... 18
I.3.2 Techniques d’isolement ............................................................................................ 19
I.3.2.1 Sélection par antibiotiques ................................................................................ 19
I.3.2.2. Traitement à haute température ....................................................................... 19
I.3.2.3. Sol aérosolisé .................................................................................................... 20
I.3.3. Identification ........................................................................................................... 20
I.3.4. Conservation des souches d’Actinomycètes ........................................................... 20
I.3.4.1. Conservation sur gélose pente .......................................................................... 20
I.3.4.2. Conservation à -80°C ....................................................................................... 20
II. Production et extraction de métabolites secondaires .................................................... 21
II.1. But ................................................................................................................................. 21
II.2. Principe ......................................................................................................................... 21
II.3. Mode opératoire ............................................................................................................ 21
II.3.1. Culture par fermentation ........................................................................................ 21
II.3.2. Extraction ............................................................................................................... 21
III.Test d’activité antimicrobienne ....................................................................................... 22
III.1.But ................................................................................................................................ 22
III.2.Principe ......................................................................................................................... 22
III.3.Mode opératoire ............................................................................................................ 22
III.3.1.Souche pure à étudier ............................................................................................ 22
III.3.1.1. Caractéristiques des souches ......................................................................... 22
III.3.1.2. Revivification des souches ............................................................................ 23
III.3.1.3. Rajeunissement des souches .......................................................................... 23
III.3.2. Préparation de l’inoculum .................................................................................... 23
III.3.3. Ensemencement .................................................................................................... 23
III.3.4. Dépôt des disques ................................................................................................. 23
III.3.5. Lecture .................................................................................................................. 24

Table des matières
IV. Détermination de la CMI et de la CMB ......................................................................... 25
IV.1. But ............................................................................................................................... 25
IV.2. Principe ........................................................................................................................ 25
IV.3. Mode opératoire .......................................................................................................... 25
IV.3.1. Détermination de la CMI sur milieu solide .......................................................... 25
IV.3.1.1. Préparation de l’inoculum et ensemencement ............................................. 25
IV.3.1.2. Gamme de concentration de l’extrait ............................................................ 25
IV.3.1.3. Dépôt des disques .......................................................................................... 26
IV.3.1.4. Lecture ........................................................................................................... 26
IV.3.2. Détermination de la CMI en milieu liquide .......................................................... 26
IV.3.2.1. Préparation de l’inoculum ............................................................................. 26
IV.3.2.2. Gamme de concentrations de l’extrait ........................................................... 26
IV.3.2.3. Inoculation ..................................................................................................... 26
IV.3.2.4. Lecture des résultats ...................................................................................... 26
IV.3.3. Détermination de la CMB .................................................................................... 27
IV.3.3.1. Ensemencement ............................................................................................. 27
IV.3.3.2.Lecture des résultats ....................................................................................... 27
V. Test anti-malaria ................................................................................................................ 28
V.1. But ................................................................................................................................. 28
V.2. Principe ......................................................................................................................... 28
V.3. Mode opératoire ............................................................................................................ 28
V.3.1. Culture du parasite ................................................................................................. 28
V.3.2. Sélection des extraits ............................................................................................. 28
VI. Etude chimique préliminaire de l’extrait actif .............................................................. 30
VI.1.Obtention des extraits ................................................................................................... 30
VI.1.1. Principe ................................................................................................................. 30
VI.1.2. Mode opératoire ................................................................................................... 30

Table des matières
VI.2. Chromatographie Liquide à Basse Pression (C.L.B.P) ............................................... 30
VI.2.1. Principe ................................................................................................................. 31
VI.2.2. Mode opératoire ................................................................................................... 31
VI.2.2.1.Remplissage de la colonne ............................................................................. 31
VI.2.2.2.Dépôt de l’échantillon .................................................................................... 31
VI.2.2.3.Déroulement de l’élution ................................................................................ 31
VI.3. Chromatographie sur couche mince ............................................................................ 32
VI.3.1. Principe ................................................................................................................. 32
VI.3.2. Mode opératoire ................................................................................................... 32
VI.3.2.1. Dépôt des échantillons ................................................................................... 32
VI.3.2.2. Saturation de la cuve ..................................................................................... 32
VI.3.2.3. Développement du chromatogramme ........................................................... 32
VI.3.2.4. Révélation ...................................................................................................... 33
VI.4.Criblage de fractions actives ........................................................................................ 33
VI.4.1.Principe .................................................................................................................. 33
VI.4.2.Mode opératoire .................................................................................................... 34
VI.4.2.1.Préparation de la plaque de CCM ................................................................... 34
VI.4.2.2.Test d’activité antibacterienne des fractions .................................................. 34
VI.4.2.3.Détection des grandes familles chimiques ..................................................... 35
a. Détection des terpènes .......................................................................................... 35
b. Détection des alcaloïdes ....................................................................................... 35
c. Détection des dérivés anthracéniques et des coumarines ..................................... 35
d. Détection des flavonoïdes ..................................................................................... 35
RESULTATS .......................................................................................................................... 36
I. Isolement des souches d’Actinomycètes ............................................................................ 36
II. Production et extraction de métabolites secondaires ..................................................... 38
II.1.Fermentation sur milieu solide ....................................................................................... 38

Table des matières
II.2. Extraction de métabolites secondaires .......................................................................... 38
III. Test antimicrobien ........................................................................................................... 39
IV. Determination de la CMI et de la CMB ......................................................................... 42
IV.1. CMI de l’extrait 74 sur Staphylococcus aureus sur milieu solide ............................... 42
IV.2. CMI de l’extrait 74 sur Staphylococcus aureus en milieu liquide .............................. 43
IV.3. CMB de l’extrait 74 sur Staphylococcus aureus ........................................................ 43
V. Test anti-malaria ................................................................................................................ 44
VI. Etude chimique de l’extrait 74 ........................................................................................ 45
VI.1. Fractionnement par le méthanol .................................................................................. 45
VI.2. Fractionnement de l’extrait EM par CLBP : ............................................................... 46
VI.3. Bioautographie des fractions ....................................................................................... 47
VI.4. Détection des familles chimiques des fractions actives .............................................. 48
DISCUSSION ......................................................................................................................... 50
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES .......................................................... 55
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES

GLOSSAIRE
Glossaire
Actinomycose : maladie infectieuse très rare, causée par une bactérie vivant dans la
cavité buccale de l'homme.
Antagonisme : destruction, lésion ou inhibition de croissance réciproque que subissent
des organismes différents occupant la même niche écologique.
Bactéricide : qui a le pouvoir de tuer les bactéries.
Bactériostatique : qui a le pouvoir d’inhiber la croissance des bactéries.
Biotique : qualifie un milieu dans lequel la vie peut se développer.
Conidies : spore produit par le mycélium des champignons et des Actinomycètes.
Endophyte : êtres vivants qui vivent à l’intérieur des tissus d’une plante
morphologiquement saine et ne peuvent causer des symptômes
apparents et immédiats à son hôte.
Hétérotrophe : organisme qui utilise des matières organiques préformées provenant
d’autres organismes comme source de carbone et d’énergie pour son
métabolisme.
Humification : décomposition par les microorganismes des matières organiques mortes
complexes en les réduisant en un composant plus simple (humus)
directement assimilable par les plantes.
Hyphe : filament mycélien qui constitue l'appareil végétatif des champignons et
des Actinomycètes.
Mycélium : appareil végétatif du champignon et d’Actinomycète constitué d'un
ensemble de filaments appelés hyphes.
Mycorhize : association, généralement symbiotique, de champignons et des racines
de plantes à graines.
Nocardiose : maladie due à une infection des poumons survenant sur un mode
chronique (s'étalant dans le temps) et due à une bactérie appartenant au
genre Nocardia.
Parasitémie : présence de parasites dans le sang.

Glossaire
Procaryote : organisme unicellulaire dépourvu de noyau délimité par une membrane,
le matériel génétique est localisé dans une région irrégulière appelée
nucleoïde ou région nucléaire.
Propagule : organe de dissémination (propagation) et de reproduction d’un être
vivant (spore)
Saprophyte : organisme qui vit aux dépens de matières organiques inertes et qui n’est
généralement pas pathogènes.
Schizonte : stade évolutif de Plasmodium falciparum correspondant à la division du
noyau de l’élément parasitaire
Spore : cellule isolée ou en amas pluricellulaire pouvant contribuer à la
propagation d’une espèce par voie végétative ou par voie sexuée.
Symbiose : association de deux espèces distinctes dont la vie en commun est
profitable à chacune d'elles.
Ubiquitaire : qui se trouve partout en même temps.

ADN : Acide Désoxyribonucléique
LISTE DES ABREVIATIONS
AFM : Actinomycete fermentation media
BN : Bouillon nutritif
CCM : Chromatographie sur couche mince
CLBP : Chromatographie liquide à basse pression
CMB : Concentration minimale bactéricide
CMI : Concentration minimale inhibitrice
CNARP : Centre National d’Application de Recherche Pharmaceutique
CNRE : Centre National de Recherches sur l’Environnement
DAS : Daw Agros Science
DCM : Dichlorométhane
DMSO : Diméthyle sulfoxyde
DO : Densité optique
ED : eau distillée
G- : Gram négatif
G+ : Gram positif
GAS : Grayson Aerosol Sampler
GN : Gélose nutritive
IC50 : Concentration Inhibant 50%
ISP2 : International Streptomyces project 2
KOH : Hydroxyde de potassium ou potasse
MeOH : Méthanol
MH : Muëller Hinton
NP/PEG: Natural Product/ Polyethylene Glycol
Rf : Référence frontale ou Rapport frontal
RFU : Rate Fluorescence Unit
RPMI : Roswell Park Memorial Institute
Si : Silice
UFC: Unité Formatrice de Colonies
UV : Ultraviolet
v/v : Volume sur volume
Liste des abréviations

LISTES DES FIGURES
Liste des figures
Figure 1: Cycle de développement d’un Actinomycète (Streptomyces) sur milieu solide . ...... 6
Figure 2: Une colonie du genre Streptomyces sur milieu solide ............................................... 8
Figure 3: Localisation de la forêt d’Ankafobe dans la réserve de Sohisika ............................ 15
Figure 4: Séchage des échantillons de sol dans un dessiccateur sous vide ............................. 19
Figure 5: Schéma du développement des fractions sur la plaque de CCM ............................. 34
Figure 6: Histogramme montrant le nombre de souches d’Actinomycètes isolées par sites et
par méthodes d’isolement. ........................................................................................................ 36
Figure 7: Souches pures d’Actinomycètes sur milieu ISP2 ..................................................... 37
Figure 8: Variétés de souches d’Actinomycètes isolées sur milieu ISP2. ............................... 37
Figure 9: Cultures par fermentation d’Actinomycètes sur milieu AFM solide. ...................... 38
Figure 10 : Inhibition des bactéries et levure par les extraits d’Actinomycètes. ..................... 42
Figure 11: Effet des différentes concentrations de l’extrait 74 sur Staphylococcus aureus.... 42
Figure 12: Cultures de Staphylococcus aureus après 24 heures d’incubation à 37°C ............. 44
Figure 13: Inhibition de la croissance de Staphylococcus aureus sous l’action de EM et EA 45
Figure 14 : Diagramme de fractionnement de l’extrait méthanolique (EM) ........................... 46
Figure 15: Profil chromatographique des 5 fractions issues de la CLBP. ............................... 47
Figure 16: Effets des fractions testées sur Staphylococcus aureus .......................................... 47
Figure 17: Nature chimique des bandes actives des fractions 2 et 3. ...................................... 49

LISTES DES TABLEAUX
Liste des tableaux
Tableau 1: Les principaux genres d’Actinomycètes. ................................................................ 8
Tableau 2: Fréquence des divers genres d’Actinomycète dans le sol. ...................................... 9
Tableau 3: Importance relative des groupes microbiens producteurs d’antibiotiques. ........... 13
Tableau 4 : Echantillonnage. ................................................................................................... 16
Tableau 5: Caractéristiques des souches à tester. .................................................................... 22
Tableau 6 : Normes utilisées dans la méthode des disques ..................................................... 24
Tableau 7: Nombre de souches d’Actinomycètes isolées à partir des 3 sites d’études. .......... 36
Tableau 8: Résumé des caractères morphologiques des souches d’Actinomycètes isolées. ... 37
Tableau 9: Diamètre d’inhibition (mm) des extraits sur les souches testées. .......................... 39
Tableau 10: Détermination de la CMI sur milieu solide de l’extrait 74 sur Staphylococcus
aureus. ...................................................................................................................................... 43
Tableau 11: Détermination de la CMI en milieu liquide de l’extrait 74 sur Staphylococcus
aureus. ...................................................................................................................................... 43
Tableau 12: Détermination de la CMB de l’extrait 74 sur Staphylococcus aureus. ............... 44
Tableau 13: Pourcentage d’inhibition et IC 50 des extraits sur Plasmodium falciparum
FCM29. ..................................................................................................................................... 44
Tableau 14: Fractionnement de l’extrait 74 avec le méthanol. ............................................... 45
Tableau 15: Effets des extraits sur Staphylococcus aureus. .................................................... 45
Tableau 16: Diamètres et Rf des zones d’inhibition des fractions sur Staphylococcus aureus.
.................................................................................................................................................. 48
Tableau 17: Composition chimique des fractions issues de l’extrait 74. ................................ 48

INTRODUCTION

INTRODUCTION
Introduction
Le sol, l’environnement marin, les plantes, sont divers habitats écologiques lesquels
ont été rapportés comme sources potentielles de produits naturels très utiles comme les
antibiotiques (Rakotoniriana, 2006). Depuis l’avènement de ces molécules, une nette
amélioration de la qualité et de la durée de vie a été constatée (Boughachiche et al., 2005).
Cependant, leur utilisation intensive a eu pour conséquence l’adaptation des bactéries à ces
remarquables substances (Desnottes, 1995). En effet, ces dernières années ont été marquées
par une augmentation inquiétante de la multirésistance de bactéries pathogènes, la résurgence
de maladies infectieuses que l’on croyait parfaitement maîtrisées et l’émergence de nouveaux
pathogènes dans le monde et particulièrement dans les pays en voie de développement
(Données OMS, 1997).
Ces constats expliquent l’urgence de disposer de nouvelles molécules d’antibiotiques.
Les Actinomycètes, bactéries à Gram positif à majorité filamenteuses, représentent la
principale source naturelle de métabolites anticellulaires (Higashide, 1984). Environ 75% des
antibiotiques découverts entre 1971 et 1980 appartiennent aux Actinomycètes (Iwai, 1992). Il
y a une quinzaine d’années, six milles antibiotiques avaient été identifiés chez les
Actinomycètes dont 5000 chez les Streptomycètes sur un total de 9000 antibiotiques connus
(Goodfellow, 1992). L'isolement de souches d’Actinomycètes actives à partir d’écosystèmes
non ou peu exploités permet, éventuellement, la découverte de souches rares ou de souches
pouvant avoir un potentiel de production élevé ou inexploité.
Madagascar est connu pour sa richesse en biodiversité en flore et en faune où la
plupart des espèces sont endémiques (Anonyme, 2003). Les produits naturels d’origine
microbienne ne sont pas suffisamment exploités ou encore mal connus à Madagascar en
comparaison aux produits naturels d’origine végétale mis en évidence par le biais de la
phytochimie (Rakotoniriana, 2006). Cela offre donc une probabilité exceptionnelle d’avoir
diverses populations de microorganismes telluriques. Paradoxalement, il n’existe à notre
connaissance aucune référence bibliographique où l’exploitation rationnelle des
microorganismes telluriques dans la production des métabolites secondaires bioactives, a été
décrite.

Introduction
La présente étude a donc pour objectif principal de valoriser les souches
d’Actinomycètes telluriques issues de la forêt de Madagascar et de découvrir de nouvelles
substances naturelles ou des dérivés de substances naturelles à partir de ces microorganismes
pouvant être utilisées pour promouvoir la santé humaine et la productivité agricole.
L’aboutissement de ce travail est de vérifier l’hypothèse suivante :
« De nouvelles substances naturelles à fonction thérapeutique et protectrice des
plantes pourrait en exister dans les extraits microbiens de Madagascar ».
Le présent travail a bénéficié des apports matériels, techniques et scientifiques du
Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement (LME) du Centre National de Recherches
sur l’Environnement (CNRE) et a été réalisé dans le cadre de son programme de recherche en
collaboration avec le Centre National d’Application des Recherches Pharmaceutiques
(CNARP) pour le test d’activité anti-malaria des extraits d’Actinomycètes.
Cette étude se divise en quatre parties : la première partie résumera les données
bibliographiques, la deuxième partie décrira les matériels et méthodes utilisés, la troisième
partie exposera les résultats obtenus et la dernière partie présentera la discussion des résultats
ainsi que la conclusion et les perspectives.

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I. LE SOL
Synthèse bibliographique
Le sol est un milieu vivant (Kilbertus, 1980). Il figure parmi les habitats les plus
diversifiés et renferme certains des assemblages les plus variés d’organismes vivants. Il
constitue l’un des écosystèmes les plus complexes de la nature. Aucun autre habitat n’abrite
une densité d’espèces aussi élevée que le sol (FAO, 2001). Par exemple, un gramme de sol
peut contenir des millions d’individus et plusieurs milliers d’espèces de bactéries.
Selon Pedro (1996), le sol est un véritable laboratoire biologique où se déroulent des
réactions qu’on ne trouve nulle part ailleurs.
Le sol ne constitue pas un environnement homogène, mais une mosaïque d’habitats
avec pour chacun des populations microbiennes propres, le nombre et le type d’organismes
varient d’un système et d’un milieu à l’autre. Le nombre, la composition et la diversité des
espèces dans un sol donné dépendent de nombreux facteurs, notamment l’aération, la
température, l’acidité, l’humidité, la teneur en éléments nutritifs et en substrat organique. La
rhizosphère représente un compartiment d’intérêt majeur (Marilley et coll, 2007).
I.1. La rhizosphère
Le terme rhizosphère fut utilisé pour la première fois par Lorenz Hiltner en 1904 en
désignant spécifiquement l'interaction entre les bactéries et les racines des Légumineuses
(Soufiane, 1998).
Actuellement, la définition de la rhizosphère est plus précise et elle correspond à la
zone du sol dans laquelle la microflore tellurique est soumise à l’influence des racines
(Campbell et al, 1990 ; Westover, 1997).
Toutes les activités microbiennes, favorables ou non à la vie de la plante, sont
rencontrées dans cette zone. Parmi ces activités, on peut citer la solubilisation ou la
métabolisation des minéraux pour les nutriments, la compétition avec ou sans induction d’une
résistance de la plante aux pathogènes, et aussi la sécrétion de métabolites bioactifs ou les
antibiotiques (Dommergue, 1999).

I.2. Les microorganismes rhizospheriques
Synthèse bibliographique
De manière globale et simplifiée, on peut diviser les microorganismes de la
rhizosphère en trois groupes: les microorganismes bénéfiques pour la plante (les mycorhizes
et les bactéries fixatrices d’azote), les microorganismes qui ne sont pas favorables à la plante
(les bactéries et champignons phytopathogènes), et les microorganismes indifférents à la
plante. Parmi les bénéfiques, on trouve également les antagonistes qui peuvent protéger les
plantes contre les attaques des microorganismes pathogènes.
Les bactéries : Dans la rhizosphère, les bactéries sont les organismes les plus
nombreux (leur densité est de l'ordre de 10 9 par gramme de sol) et les plus variés (Morel,
1996). On y trouve des bactéries pathogènes qui peuvent causer des dégâts aux cultures
comme Erwinia carotovora sur les carottes, Xanthomonas fragariae sur les fraisiers. D’autres
bactéries protègent par contre les plantes contre des agents pathogènes: Pseudomonas
fluorescens, Bacillus subtilis, (Delorme, 2001), d’autres aussi sont capables de fixer l’azote
atmosphérique comme les Azotobacters. On y trouve aussi des espèces symbiotiques comme
les souches de rhizobia s'associant aux Légumineuses.
Les Actinomycètes : Les Actinomycètes ou bactéries filamenteuses sont moins
nombreux que les bactéries mais plus nombreux que les champignons dans le sol et dans la
rhizosphère. Ils peuvent atteindre jusqu’à 10 7 unités par gramme de sol et ils manifestent
souvent un antagonisme vis-à-vis des bactéries et des champignons voisins; cet antagonisme
résulte de la sécrétion de substances antibiotiques. Certaines espèces d’Actinomycètes fixent
l'azote de l'air comme le genre Frankia.
Les champignons : La densité des champignons est estimée à 10 6 par gramme de sol.
Parmi les genres les plus fréquents dans la rhizosphère, on citera Fusarium, Mucor, Rhizopus,
Penicillium, Rhizoctonia, Phoma. Certaines espèces sont antagonistes de champignons
pathogènes, d'autres s'associent aux racines des plantes cultivées comme les mycorhizes
(Dommergue et al, 1970).
Les protozoaires et les algues : Les protozoaires sont les moins nombreux, leur densité
est de l'ordre de 10 3 par gramme de sol. Les algues sont représentées par des espèces de
Chlorophyceae, Cyanophyceae et les Diatomées. Elles sont peu abondantes, soit 10 5 par
gramme de sol, mais fournissent néanmoins de la matière organique, certaines sont fixatrices
d'azote (Morel, 1996).

II. LES ACTINOMYCETES
Synthèse bibliographique
Les Actinomycètes ont été isolés pour la première fois par Cohn en 1875 à partir de
sources humaines (Williams et al, 1984). Et c’est en 1943 que S. Waksman a pu isoler un
genre Actinomycète à partir du sol.
II.1. Définition des Actinomycètes
Etymologiquement, le mot Actinomycète a été dérivé des mots grecs « Aktis » qui
veut dire rayon et « mykes » qui veut dire champignon. Les Actinomycètes ont été considérés
comme un groupe intermédiaire entre bactérie et champignons. Maintenant, ils sont reconnus
comme des organismes procaryotes. Pourtant, ces microorganismes présentent des similitudes
à la fois avec les bactéries et avec les champignons.
II.1.1. Similitude entre Actinomycètes et champignons (Alexander, 1961)
Il existe trois points qui rapprochent les Actinomycètes des champignons :
Structure mycélienne présentant des ramifications chez les Actinomycètes typiques,
avec toutefois cette différence que les filaments ont un diamètre deux fois plus faible
(0,5 à 1,2Y) que ceux des champignons, d’où le terme de pseudo mycélium parfois
employé pour désigner cette structure ;
Formation fréquente d’un mycélium aérien et de conidies ;
En culture, absence de la turbidité caractéristique des bactéries unicellulaires et
apparition des amas de cellules.
Les analogies entre les Actinomycètes et les champignons sont en fait superficielles ;
il s’agit d’une convergence de forme plutôt que d’une parenté génétique, car une différence
fondamentale les sépare: les Actinomycètes sont procaryotes alors que les champignons sont
eucaryotes.
II.1.2. Similitude entre Actinomycètes et bactéries
D’autres caractères rapprochent les Actinomycètes des bactéries :
Ils sont procaryotes;
La morphologie typiquement bactérienne chez les formes simple
(Mycobacteriacées) ;

La sensibilité aux attaques virales.
II.2. Caractéristiques générales
Synthèse bibliographique
Les Actinomycètes constituent un groupe tout à fait unique de microorganismes
procaryotes. Généralement, ils sont Gram positif à structure végétative de type mycélien et le
taux de G et C de leur ADN est supérieur à 55% (Lacey ,1973). Ils sont hétérotrophes, leur
croissance est plus lente (7 à 28 jours) que celle des autres bactéries (24 heures). La figure 1
montre le cycle de développement d’un Actinomycète.
La plupart des Actinomycètes aérobies sont saprophytes à développement mycélien
significatif parmi lesquels se trouve la majorité des espèces d’intérêt industriel bien qu’il en
existe des formes anaérobies ou sans mycélium évident, généralement pathogènes
(Goodfellow et al, 1983).
La reproduction des Actinomycètes peut s’opérer suivant trois modes : fragmentation
pseudo bactérienne, production de conidies, production de sporanges.
Germination
Induction du mycélium
végétatif
Développement du
mycélium végétatif
Développement du
mycélium aérien
Figure 1: Cycle de développement d’un Actinomycète (Streptomyces) sur milieu solide
(Hosdong, 1992)

II.3. Classification des Actinomycètes
Synthèse bibliographique
En général, on peut subdiviser les Actinomycètes en 4 grandes familles (Tableau 1) :
II.3.1. Mycobacteriacées
Elles renferment les Actinomycètes dont la morphologie est voisine de celle des
bactéries. Les mycobacteriacées diffèrent de toutes les bactéries et autres Actinomycètes par
leur acido-résistance grâce à la présence de substance cireuse présente dans leurs cellules.
Cette famille est représentée par le seul genre Mycobacterium qui renferme plusieurs espèces
pathogènes, dont la plus connue est Mycobacterium tuberculosis, agent de la tuberculose
(Krasilnikov, 1958).
II.3.2. Actinomycétacées (ou Pro-Actinomycètes)
Cette famille est représentée par les genres Nocardia et Actinomyces. Le genre
Nocardia comprend de nombreuses espèces très répandues dans le sol. Les colonies, difficiles
à distinguer des colonies bactériennes, sont souvent confondues avec ces dernières lors des
comptages. Le genre Actinomyces ne présente aucun intérêt en microbiologie du sol.
(Alexander, 1961).
II.3.3. Streptomycétacées
Il existe deux genres dans cette famille : Streptomyces et Micromonospora.
Le genre Streptomyces renferme plusieurs espèces très répandues dans
le sol. Il se reproduit par des conidies en chaine. L’examen des colonies de Streptomyces
permet de discerner :
Le mycélium végétatif très serré, implanté dans le milieu auquel
il adhère (leurs colonies sont difficiles à prélever au fil de platine).
Le mycélium aérien, lâche, d’aspect poudreux, formé d’hyphes
portant à leurs extrémités des conidies (Williams, 1978).

Surface de la
gélose
Synthèse bibliographique
Figure 2 : Une colonie du genre Streptomyces sur milieu solide (Dvorak, 1999)
Le genre Mycromonospora renferme plusieurs espèces dont la plupart
sont thermophiles, et se développent surtout dans les fumiers.
II.3.4. Actinoplanacées :
Cette famille est représentée par le genre Actinoplanes qui est aquatique.
Le tableau 1 récapitule les différentes familles et genres d’Actinomycètes.
Tableau 1: Les principaux genres d’Actinomycètes
FAMILLE
MYCOBACTERIACEES
ACTINOMYCETACEES
STREPTOMYCETACEES
Développement
mycélien
Transitoire
limité
Extensif
Extensif
ACTINOLPANACEES Extensif
Mode de
reproduction
Acido
résistance
Autres
caractères
Genre
Scission binaire + Mycobacterium
Fragmentation
massive des
hyphes
Fragmentation
massive des
hyphes
Extensif Conidies -
Extensif Conidies -
Sporangispores
mobiles
- Aérobie Nocardia
- Anaérobie Actinomyces
-
Conidies
en
chainettes
Conidies
isolées ou
en groupe
Formation
de
sporanges
Mycélium aérien
Mycélium végétatif
Streptomyces
Micromonospora
Actinoplanes

II.4. Ecologie et distribution des Actinomycètes
Synthèse bibliographique
Les Actinomycètes sont des microorganismes ubiquitaires, on les rencontre sur tous
les substrats naturels courants (Waksman, 1959).
II.4.1. Sols
Les Actinomycètes sont largement répandus dans tous les sols à l’exception des sites
exposés à des conditions trop extrêmes. Ils sont surtout présents dans la couche comprise
entre la surface du sol et jusqu’à 2m de profondeur c'est-à-dire dans la rhizosphère. Le genre
Streptomyces est le plus fréquent dans le sol, il couvre à lui seul 95% des souches
d’Actinomycètes isolées (Nonomura, 1969). Le tableau 2 montre la fréquence des divers
genres d’Actinomycètes dans le sol
Tableau 2: Fréquence des divers genres d’Actinomycètes dans le sol
Genres Pourcentage (%)
Streptomyces 95,34
Nocardia 1,98
Micromonospora 1,40
Thermomonospora 0,22
Actinoplanes 0,20
Microbispora 0,18
Mycobacterium 0,14
Streptosporagium
Actinomadura
Microspolyspora
Pseudonocardia
Microellobosporia
0,10
0,10
0,10
0,06
0,04
II.4.2. Eaux douces et marines
Les Actinomycètes sont bien représentés dans ces milieux d’où l’on peut facilement
isoler des souches de Microspora, d’Actinoplanes et de Streptosporangium. C’est
essentiellement dans les sédiments des fonds fluviaux ou lacustres que ceux-ci sont présents
où ils jouent un rôle important dans la décomposition des débris végétaux et donnent à l’eau
son odeur de terre et sa flaveur.

Synthèse bibliographique
II.4.3. Air
La présence d’Actinomycètes dans l’air, sous forme de propagules, est proportionnelle
aux poussières dispersées par le vent.
II.4.4. Thermophile
Des Actinomycètes ont été isolés entre 40 et 60°C de divers substrats ; sols variés,
fumier, compost, foins, fourrages. Ce sont des souches plutôt thermotolérantes que
thermophiles (Lacey, 1997).
II.4.5. Actinomycètes pathogènes
Certaines espèces d’Actinomycètes sont pathogènes pour les végétaux, les animaux et
l’Homme (Mc Neil, 1994 ; Boiron, 1995). Parmi les exemples les plus connus, on peut citer :
-Streptomyces scables, responsable de la gale de la pomme de terre ;
-Actinomyces bovis, responsable d’une actinomycose chez le bétail ;
-Mycobacterium tuberculosis agent de la tuberculose et Mycobacterium leprae, agent de
la lèpre ;
-Nocardia asteroïdes, responsable de la nocardiose humaine ;
-Micropolyspora faeni, responsable d’une pneumonie allergique chez l’Homme.
III. PARTICULARITES DES ACTINOMYCETES TELLURIQUES
Dans le sol, la densité des Actinomycètes, qui sont généralement représentés par les
genres Nocardia et Streptomyces, est en général 3 à 15 fois plus faible que celle des
bactéries (Khan et Williams, 1975). En valeur absolue, elle varie entre 10 5 et 10 8 unités par
gramme de sol. Ils sont présents sous tous les climats, sur tous les types de résidus, mais leur
nombre et la proportion dans le sol dépendent de nombreux facteurs.
III.1. Les facteurs physiques et chimiques (Mayfield et al, 1972) :
Les principaux facteurs principaux sont :
La nature et l’abondance des matières organiques : l’introduction
d’engrais entraîne une augmentation du nombre d’Actinomycète ; on
remarque l’élévation du nombre d’Actinomycètes à l’automne lorsque
se fait l’addition de résidus végétaux frais ;

Synthèse bibliographique
La profondeur : 2 à 15cm est généralement la profondeur optimale, la
rhizosphère est plus riche en Actinomycètes, leur nombre diminue avec
la profondeur ;
Le pH : les Actinomycètes préfèrent un pH compris entre 7 et 8 ;
L’aération et l’humidité : la plupart des Actinomycètes sont aérobies
et préfèrent des taux d’humidité peu élevés de l’ordre de 10 à 30% ;
La température : la température de croissance des Actinomycètes
telluriques est entre 25°C et 30°C.
III.2. Rôle des Actinomycètes telluriques
Pendant longtemps, on a considéré que leur rôle dans le sol était négligeable, à cause
de la lenteur de leur croissance et de leur faible pouvoir compétitif (Watson, 1974). Il semble,
au contraire, que leur action soit importante en raison de leur double aptitude :
III.2.1. Aptitude à dégrader les substances organiques non biodégradables
par les champignons et les bactéries :
La dégradation des matières organiques fraiches s’effectue progressivement : les
premiers stades correspondent à l’action des bactéries et des champignons ; les derniers
correspondent à l’action des Actinomycètes. Ces microorganismes ne peuvent se développer
dans les premiers stades en raison de leur inaptitude à la compétition ; par contre, ils se
développent relativement bien sur une matière organique partiellement dégradée et inapte à
porter une microflore fongique et bactérienne (Krasilinikov, 1958).
III.2.2. Aptitude à produire des substances pro biotiques, antibiotiques ou
toxiques :
Parmi les substances probiotiques produites par les Actinomycètes, se trouvent : les
vitamines B1, B2, B6, B12, la biotine, l’acide folique (Morel, 1996 ; Dommergue et al,
1970). On admet que les Actinomycètes pourraient aussi intervenir dans le processus
d’humification en produisant des composés dont la structure chimique est proche de celle des
acides humiques (Krassilnikov, 1953). En présence des Actinomycètes, le taux des

Synthèse bibliographique
microorganismes pathogènes se trouve fortement diminué dans le sol par la synthèse des
antibiotiques qui inhibent leur croissance (Morel, 1996).
III.3. Les métabolites secondaires des extraits d’Actinomycètes
Les métabolites secondaires sont définis comme des composés de faible poids
moléculaire, non essentiels à la croissance du microorganisme producteur. La production de
ces métabolites est souvent associée à la croissance des microorganismes correspondant à la
phase stationnaire de la courbe de croissance (Demain, 1995).
Une des propriétés la plus significative des Actinomycètes est leur aptitude à
synthétiser de nombreux métabolites secondaires d'une diversité structurale très vaste et des
milliers d'entre eux sont doués d'un potentiel d'activité biologique important (Higashide,
1984; Vining, 1992). C'est en 1940, après la découverte de l'actinomycine, que les
Actinomycètes sont devenus l'objet de nombreuses recherches et ils ont été exploités durant
les années 80, en conséquence, de nouvelles structures et surtout les antibiotiques sont
continuellement isolés à partir des Actinomycètes. Ainsi, ces microorganismes sont devenus
les premiers fournisseurs de ces métabolites.
III.3.1. La production d’antibiotique chez les Actinomycètes
Un antibiotique (du Grec anti : « contre », et bios : « la vie ») est défini comme une
substance naturelle produite par les microorganismes dont l’action est d’inhiber la croissance
de bactéries (action bactériostatique) ou de les tuer (action bactéricide) (Decre et Courvalin,
1995). Il peut être antibactérien, antifongique, anticancéreux, antiviral ou antiparasitaire. La
synthèse des antibiotiques est largement répandue chez les Actinomycètes, 50 à 75% des
souches isolées en sont productrices et sont à l'origine de 70% des antibiotiques naturels
connus dans le monde (Tableau 3) (Okami, 1988). C’est en 1944 que le microbiologiste
américain S. Waksman a décrit pour la première fois la streptomycine qui est un antibiotique
produit par un Actinomycète tellurique, Streptomyces griseus. Ce fut le premier médicament
qui se révéla efficace contre la tuberculose.

Synthèse bibliographique
Tableau 3: Importance relative des groupes microbiens producteurs d’antibiotiques
Microorganismes producteurs d’antibiotiques % du total des antibiotiques décrits
Lichens et algues 0,8
Champignons
Penicillium
Aspergillus
Bactéries
Fusarium
Cephalosporium
Autres champignons imparfaits
Basidiomycètes et Ascomycètes
Pseudomonadaceae
Bacillaceae
Autres Eubactéries
4,1
3,0
1,2
0,8
5,4
5,0
1,3
7,0
1,7
Actinomycètes 69,7
III.3.2. Application des antibiotiques issus des Actinomycètes
Si les antibiotiques issus des Actinomycètes sont connus d’abord pour leurs
applications médicales, ils présentent un intérêt significatif dans les domaines de la santé
animale, de l’élevage et de l’agriculture (Berdy, 2005).
III.3.2.1. En santé humaine
Parmi les nombreux antibactériens issus d’Actinomycètes, on peut citer comme
exemple :
- Les gentamicines produites par Micromonospora spp. administrées par voie
parentérales pour traiter des infections sévères des germes à Gram-négatif.
- La rifampicine, un dérivé de la rifamicine produite par Nocardia mediterranei,
utilisée dans le traitement de la tuberculose.
Outre les antibactériens, l’activité de ces molécules peut s’exercer vis-à-vis des
champignons. L’antifongique le plus exploité en thérapeutique est la nystamine, un tetraène
extrait de culture de S. noursei (Ouhdouch, 2001).
L’antiparasitaire bien connu est la spiramycine, un macrolide antibactérien de S.
ambofaciens, efficace dans le traitement de la toxoplasmose (Ninet, 1960).

Synthèse bibliographique
L’antivirus qu’on peut mentionner est la 9-Z-arabinofuranosyladine de S.antibiticus,
synthétisé par voie chimique et actif sur le virus de l’herpès (Ninet, 1960).
Plusieurs anthracyclines et quinones dont la daunorubicine de S. coeruleorubidis sont
utilisés dans le traitement de plusieurs types de cancer, dont les leucémies en particulier.
III.3.2.2. En santé animale et élevage :
Les antibiotiques issus des Actinomycètes sont utilisés en élevage comme adjuvants
pour l’alimentation animale en stimulant la croissance et en améliorant le rendement
alimentaire ou en protégeant les jeunes en début d’élevage. C’est le cas des bambermycines
utilisées chez le porc et les volailles.
Les antibiotiques sont aussi largement utilisés en médecine vétérinaire, comme
l’ivermectine produite par Streptomyces avermitilis, qui est un anthelminthique (contre les
nématodes chez les animaux) (Stapley et Woodruff, 1982).
III.3.2.3. En agriculture :
Les activités des antibiotiques destinés à l’agriculture s’étendent à différents
domaines comme le contrôle des maladies des végétaux (insecticides, herbicides et
régulateurs du métabolisme végétal). La blasticidine S est un puissant fongicide de type
nucléotidique, connue pour son activité sur Piricularia oryzae, pathogène chez le riz (Demain,
1995).
IV-OBTENTION DE NOUVEAUX ANTIBIOTIQUES :
L’obtention de nouveaux antibiotiques (antibactériens, antifongiques et
antiparasitaires) est devenue une nécessité après la découverte de souches pathogènes
résistantes. Pour atteindre cet objectif, de nombreuses recherches se sont orientées vers le
criblage de nouvelles souches productrices. L'exploration des écosystèmes où un ou plusieurs
facteurs environnementaux sont extrêmes (température, pH, aération ou stress osmotique) ou
dans des zones inexploitées favorise la détection d’Actinomycètes. La recherche sera plus
prometteuse si on arrive à isoler des variétés de souches d’Actinomycètes pour découvrir de
nouveaux composés d’intérêts pharmaceutiques.

MATERIELS
ET
METHODES

A-MATERIELS
I. ECHANTILLONNAGE DU SOL
Matériels et méthodes
Les échantillons de sol ont été collectés dans la rhizosphère à partir de trois sites
différents de la forêt d’Ankafobe située dans la réserve de SOHISIKA (Figure 3). C’est une
forêt de hauts plateaux humides d’une altitude de 1600 mètres localisée au centre de
Madagascar. Les échantillons de sol ont été prélevés au mois de Juin 2009, dans des
conditions d’asepsie rigoureuse.
Figure 3 : Localisation de la forêt d’Ankafobe dans la réserve de Sohisika
Quinze (15) échantillons de sol ont été prélevés à partir des trois (3) sites différents
dans la forêt d’Ankafobe à raison de 5 échantillons par site (Tableau 4).

Tableau 4 : Echantillonnage
Matériels et méthodes
SITE Code des échantillons
Forêt primaire
(Pristing)
Forêt moyennement dégradée
(Medium impact)
Forêt dégradée
(High impact)
Pr1, Pr2, Pr3, Pr2’, Pr3’
AM1, AM2, AM3, AM4, AM5
AH1, AH2, AH3, AH4, AH5
Pour chaque échantillon, 100g de sol rhizosphérique ont été prélevés avec une spatule
stérile à une profondeur située entre 10cm et 20cm. Les échantillons ont été mis dans des
sachets stériles et conservés à température ambiante jusqu’au laboratoire.
II. MILIEUX D’ETUDE
II.1. Milieu d’isolement
- Milieu ISP2
C’est un milieu solide utilisé pour isoler et conserver les souches d’Actinomycètes à
partir des échantillons de sol.
Ce milieu est additionné de 3 antibiotiques pour l’isolement des Actinomycètes :
- La triméthoprime (inhibiteur des champignons)
- Le cycloheximide (inhibiteur des bactéries)
- L’acide nalidixique (inhibiteur des bactéries à Gram négatif)
La préparation du milieu ISP2 additionné d’antibiotique est présentée en annexe 1.
II.2. Milieu de fermentation
- Milieu AFM
C’est un milieu solide qui est utilisé pour la fermentation des souches
d’Actinomycètes afin de produire des extraits riches en métabolites secondaires.

II.3. Milieu d’enrichissement
- Bouillon nutritif
Matériels et méthodes
C’est un milieu nutritif liquide dépourvu d’agar. Ce milieu est utilisé pour revivifier
les souches de microorganismes.
II.4. Milieu de rajeunissement
- Milieu gélose nutritif
La gélose nutritive est un milieu habituellement employé pour la culture et l’isolement
des microorganismes, elle permet aussi de détecter la pureté des souches.
II.5. Milieu pour le test antibiogramme
- Milieu Muëller Hinton
C’est un milieu de culture solide utilisé pour mettre en évidence l’activité des extraits
vis-à-vis des germes pathogènes.
La composition de chaque milieu est donnée en annexe 1.
III. STERILISATION
Tous les milieux de culture sont stérilisés à 120°C pendant 20mn dans un autoclave, la
verrerie est stérilisée à 180°C dans une étuve universelle pendant 30mn.
Il est à noter que toutes les manipulations microbiologiques sont effectuées dans des
conditions stériles c'est-à-dire autour de la flamme d’un bec bunsen et sous hotte à flux
laminaire.

B-METHODES
I-ISOLEMENT DES SOUCHES D’ACTINOMYCETES
I.1. But
Matériels et méthodes
Cette étape a pour but d’isoler et d’avoir le maximum de souches d’Actinomycètes
contenues dans les échantillons de sol. La technique d’isolement des souches
d’Actinomycètes proposée par le Laboratoire de Daw Agro Sciences (DAS) aux Etats Unis a
été appliquée (Don Hann, comm pers., 2007).
I.2. Principe
Les Actinomycètes sont des microorganismes faciles à cultiver. Par ailleurs, leur
croissance lente et leur faible nombre dans les échantillons de sol sont souvent masqués par
les bactéries et les champignons à croissance rapide lors de l’isolement. Par conséquent,
l’utilisation d’un milieu spécifique (ISP2) additionné d’antibiotiques combiné à des
traitements des échantillons de sol facilite l’isolement de ces groupes de microorganismes.
Trois méthodes d’isolement sont utilisées pour isoler les Actinomycètes à partir des
échantillons de sol : la sélection par antibiotiques, le traitement à 100°C et le sol aérosolisé.
Un prétraitement des échantillons de sol a été entrepris avant l’isolement.
I.3. Mode opératoire
I.3.1 Prétraitement des échantillons de sol
Une fois arrivés au laboratoire, les échantillons de sol sont distribués dans des boîtes
de Pétri stériles. Le prétraitement des échantillons de sol est une étape préliminaire permettant
de sélectionner les Actinomycètes dans les échantillons de sol. Cette étape consiste à sécher
les échantillons de sol dans un dessiccateur sous vide contenant du silicagel qui absorbe
l’humidité pendant au moins une semaine (Figure 4).

Dessiccateur
Silicagel
Matériels et méthodes
Figure 4 : Séchage des échantillons de sol dans un dessiccateur sous vide.
I.3.2 Techniques d’isolement
I.3.2.1 Sélection par antibiotiques
Pour chaque échantillon de sol, 1g de sol est pesé puis des dilutions en cascade sont
réalisées. L’échantillon est mis en suspension dans 9ml d’eau distillée stérile. Après agitation
au vortex, 1ml de la solution est prélevé stérilement puis transféré dans un deuxième tube
contenant comme le premier, 9ml d’eau distillée stérile. La dilution ainsi commencée est
continuée jusqu'à 10 -3 .
0,3ml de chacune des dilutions 10 -2 et 10 -3 sont ensuite étalées à l’aide d’un racloir
stérile sur le milieu ISP2 solide contenant les 3 antibiotiques (triméthoprime, cycloheximide,
acide nalidixique). Les boîtes de Pétri sont ensuite incubées à 30°C pendant 7 à 28 jours.
I.3.2.2. Traitement à haute température
Echantillons de sol
Un gramme de chaque échantillon de sol est incubé dans une étuve à 100°C pendant
une heure. Après incubation, l’échantillon de sol est mis en suspension dans 9ml d’eau
distillée stérile des dilutions en cascade (coefficient de dilution égal à 0,1) sont réalisées
jusqu’à dilution 10 -3 . Seulement deux dilutions 10 -2 et 10 -3 sont retenues pour
l’ensemencement. L’ensemencement est effectué en surface du milieu ISP2 additionné
d’antibiotiques par étalement de 0,3ml de chacune des dilutions 10 -2 et 10 -3 . Les boîtes sont
incubées pendant 7 à 30 jours à 28°C.

I.3.2.3. Sol aérosolisé
Matériels et méthodes
Un gramme de l’échantillon de sol est placé dans une Grayson Aerosol Sampler ou
GAS (appareil mis au point par Melody Grayson) stérile. La GAS est ensuite fermée, agitée
vigoureusement et laissée reposer pendant une heure. Après une heure, le couvercle et le
bouchon de la boîte de la GAS sont ensuite enlevés, et la boîte de Pétri qui contient le milieu
ISP2 est placée en position renversée à 1cm de l’ouverture de GAS. De l’air sera produit en
utilisant un petit tuyau et une poire par pompage disséminant ainsi les spores dans la GAS
vers le milieu solide. Les boîtes sont ensuite incubées à 28°C pendant 7 à 28 jours.
La pureté des souches d’Actinomycètes est vérifiée par repiquages successifs sur de
nouveaux milieux ISP2 sans antibiotique.
I.3.3. Identification
L’identification des souches est effectuée avec une culture pure, l’étude des caractères
culturaux permet d’observer macroscopiquement et de différencier les souches par leur
aspect, leur forme, leur taille, la couleur du mycélium végétatif et la couleur du mycélium
aérien ainsi que d’autres caractères comme la production de pigment diffusible.
I.3.4. Conservation des souches d’Actinomycètes
Deux méthodes ont été utilisées pour conserver les souches pures d’Actinomycètes.
I.3.4.1. Conservation sur gélose pente
Dans des tubes à vis contenant le milieu ISP2 incliné, les souches pures obtenues ont été
repiquées par des stries d’épuisement parallèles de manière avoir des colonies abondantes.
Les tubes de collection sont ensuite enveloppés de papier aluminium et conservés à 4°C en
évitant le plus possible tout risque de contamination.
I.3.4.2. Conservation à -80°C
Une colonie d’Actinomycète est prélevée à l’aide d’une anse d’inoculation stérile, puis
ensemencée sur milieu ISP2 liquide. Les cultures sont ensuite incubées pendant 7 jours dans
un bain marie agité à une température de 28°C. Après la semaine d’incubation, 1ml de la
culture d’Actinomycète est prélevé à l’aide d’une micropipette stérile et introduit dans un
cryotube contenant 1ml de glycérol 20% (V/V). Les cryotubes sont immédiatement placés
dans un congélateur -80°C.

Matériels et méthodes
II. PRODUCTION ET EXTRACTION DE METABOLITES SECONDAIRES
II.1. But
Cette étape a pour but de stimuler et d’inciter les Actinomycètes à synthétiser de
métabolites secondaires bioactif par fermentation dans des conditions bien précises sur milieu
solide et d’extraire la quasi-totalité de métabolites secondaires dans le milieu de fermentation.
II.2. Principe
Une des propriétés significatives des Actinomycètes est leur aptitude à synthétiser des
métabolites secondaires bioactif au cours de leur croissance. Cette étape consiste alors à
effectuer des fermentations sur milieu solide avec des cultures pures d’Actinomycètes pendant
un temps d’incubation de 8 à 14 jours. Les microorganismes synthétisent de métabolites
secondaires dans des conditions de culture adéquates à leur croissance et dans un système
isolé contenant le milieu de culture. Les métabolites synthétisés par les Actinomycètes sont
dispersés dans le milieu de fermentation. La récupération de ces métabolites secondaires
nécessite l’emploi d’un solvant organique (éthanol).
II.3. Mode opératoire
II.3.1. Fermentation sur milieu solide
A partir de la culture pure d’Actinomycète, une colonie est prélevée à l’aide d’un
coton tige stérile, puis ensemencée en surface sur le milieu AFM solide dans le flacon EZ en
faisant des stries serrées qui partent du fond du flacon à l’ouverture. Les cultures sont ensuite
incubées pendant 8 à 14 jours dans une étuve à 28°C.
II.3.2. Extraction
Après 8 jours d’incubation, on procède à l’extraction de métabolites secondaires
produits par les Actinomycètes. Pour cela, trente millilitres (30ml) d’éthanol 50% (V/V) ont
été ajoutés dans chaque flacon EZ contenant les cultures d’Actinomycètes de 8 jours. Les
flacons sont ensuite laissés à température ambiante pendant 2 heures. Les extraits sont filtrés
en éliminant les cellules vivantes, puis distribués dans des tubes en verres stériles et séchés en
utilisant du speedvac.

III.TEST D’ACTIVITE ANTIMICROBIENNE
III.1.But
Matériels et méthodes
Evaluer l’activité des métabolites secondaires extraits au cours de l’étape précédente
sur des souches indicatrices par la méthode de diffusion sur gélose.
III.2.Principe
La méthode de diffusion sur gélose est une méthode préliminaire permettant de repérer
les produits qui sont actifs sur les souches indicatrices et d’évaluer la sensibilité de ces
souches. Elle consiste à déposer, sur une culture de germes indicateurs préalablement
ensemencées, des disques imbibés d’extrait. La diffusion de l’extrait sur le milieu peut inhiber
la croissance des souches à tester. Pour les bactéries et la levure, une zone claire ou zone
d’inhibition est observée lorsque l’extrait est actif, la mesure du diamètre du halo d’inhibition
permet d’évaluer la sensibilité de ces germes qui peut varier en fonction de la souche testée
(Duval et Soussy, 1990 ; Ferron, 1994).
III.3.Mode opératoire
III.3.1.Souche pure à étudier
III.3.1.1. Caractéristiques des souches
Les extraits sont testés sur six souches bactériennes et sur une levure disponibles au
Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement du CNRE. (Tableau 5)
Tableau 5: Caractéristiques des souches à indicatrices.
Souches Coloration de Gram
Bacillus cereus ATCC 13061 +
Staphylococcus aureus ATCC 11632 +
BACTERIES
Streptococcus pneumoniae ATCC 6301
Escherichia coli
+
-
Salmonella enteridis -
Klebsiella oxytoca ATCC 700323 -
LEVURE Candida albicans

III.3.1.2. Revivification des souches
Matériels et méthodes
Chaque souche bactérienne ou la levure est revivifiée dans 9ml de bouillon nutritif
puis incubée à 37°C pendant 18 à 24 heures. La turbidité du bouillon nutritif indique le
développement de souches cultivées.
III.3.1.3. Rajeunissement des souches
A partir des cultures préparées précédemment, les souches sont repiquées. Pour
chaque souche, une ansée de cette culture est ensemencée en stries sur une boîte de Pétri
contenant du milieu gélose nutritif solide. Les cultures sont incubées dans une étuve à 37°C
pendant 24 heures afin d’obtenir des colonies jeunes et isolées.
III.3.2. Préparation de l’inoculum
A partir des jeunes colonies obtenues, une ou deux colonies de bactéries ou de levures
sont prélevées à l’aide d’une anse stérile et diluées dans 10ml d’eau distillée, puis la turbidité
de l’ensemble est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre de manière à obtenir une densité
optique égale à 0,125 (DO= 0,125) à la longueur d’onde à 550nm qui correspond à 10 6
UFC/ml.
III.3.3. Ensemencement
La technique par inondation ou culture en nappe est appliquée pour l’ensemencement.
La surface entière du milieu Muëller Hinton solide est inondée par 10ml de l’inoculum de 10 6
UFC/ml de germe. La culture est incubée dans une étuve à 37°C pendant 15min afin que les
germes puissent adhérer sur le milieu. Puis, l’excès de liquide est aspiré à l’aide d’une pipette
stérile et le milieu est séché pendant 15 minutes dans une étuve à 37°C.
III.3.4. Dépôt des disques
Des disques stériles de 6mm de diamètre sont imprégnés de 10Yl d’extrait à l’aide
d’une micropipette à cône stérile, à une concentration de 20mg/ml dilué dans de l’alcool 50%.
Puis les disques sont séchés pendant 15 minutes dans une étuve à 37°C. Après séchage, les
disques sont déposés sur la culture à l’aide d’une pince stérile. Les boîtes sont incubées à
37°C pendant 24h.

III.3.5. Lecture
Matériels et méthodes
Après 24 heures d’incubation, la présence de zone d’inhibition est observée et le
diamètre d’inhibition est mesuré à l’aide d’une règle graduée millimétrée. Les résultats sont
exprimés suivant les normes ci-après.
Tableau 6 : Normes utilisées dans la méthode des disques (Leipzig, 1996)
Diamètre du halo
d’inhibition (X)
X < 7mm
7 mm < X < 8 mm
8 mm < X < 9 mm
X > 9mm
Sensibilité du germe Résultat
Insensible
Assez sensible
Sensible
Très sensible
-
+
++
+++

IV. DETERMINATION DE LA CMI ET DE LA CMB
IV.1. But
Matériels et méthodes
Déterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI) et la concentration minimale
bactéricide (CMB) de l’extrait le plus actif lors du test d’activité antibactérienne par la
méthode de diffusion sur gélose précédente.
IV.2. Principe
La CMI est la plus faible concentration d’extrait pour laquelle il n’y a pas de
croissance de germe visible. La CMI peut être déterminée par deux méthodes différentes :
En milieu solide, la CMI correspond à la plus faible concentration d’extrait qui
provoque l’apparition d’un spectre d’inhibition ou une zone d’inhibition (Sinot J.,
1985 ; Couvarlin P. et coll, 1985).
En milieu liquide, la CMI correspond à la concentration de l’extrait avec laquelle
l’aspect de la culture reste limpide (Sinot J., 1985 ; Couvarlin P. et coll, 1985).
La CMB est la plus faible concentration d’extrait pour laquelle il n’y a que 0,01% à
0,1% de bactéries survivantes (Sinot J., 1985 ; Couvarlin P. et coll, 1985).
IV.3. Mode opératoire
IV.3.1. Détermination de la CMI sur milieu solide
IV.3.1.1. Préparation de l’inoculum et ensemencement
Le même mode opératoire que lors de la préparation d’inoculum au cours de la
méthode de diffusion sur gélose est adopté (Cf. § III.3.2 p. 23). Ainsi, une suspension
microbienne de 10 6 UFC/ml est préparée à partir d’une culture revivifiée sur milieu liquide de
souche rajeunie. La technique adoptée pour l’ensemencement est la technique par inondation
(Cf. § III.3.3 p. 23).
IV.3.1.2. Gamme de concentrations de l’extrait
Une série de 7 dilutions dans de l’eau distillée (coefficient de dilution égal à 0,5) est
réalisée à partir de l’extrait actif 40mg/ml. Les concentrations sont donc de 20mg/ml,
10mg/ml, 5mg/ml, 2,5mg/ml, 1,125mg/ml, 0,625mg/ml, 0,3125mg/ml.

IV.3.1.3. Dépôt des disques
Matériels et méthodes
Des disques stériles de 6mm de diamètre sont imprégnés de 10Yl de chacun des
extraits de différentes concentrations préparées précédemment. Ils sont ensuite séchés pendant
15min dans une étuve, et déposés sur la culture dans la boîte de Pétri.
IV.3.1.4. Lecture
Après 24h d’incubation à 37°C, la lecture des résultats se fait par observation de la
présence d’halo d’inhibition.
IV.3.2. Détermination de la CMI en milieu liquide
IV.3.2.1. Préparation de l’inoculum
Une colonie isolée de la souche microbienne à tester est prélevée à l’aide d’une anse
stérile et homogénéisée dans le bouillon nutritif. L’homogénat est incubé pendant 24 heures à
37°C pour avoir une pré-culture. Cette pré-culture, diluée de manière à obtenir une D.O égale
à 0,125 à 650nm (correspond à 10 6 cellules/ml), sert d’inoculum.
IV.3.2.2. Gamme de concentrations de l’extrait
La gamme de concentrations utilisée est la même que pour la détermination de la CMI
en milieu solide précédente (Cf. § IV.3.1.2 p. 25).
IV.3.2.3. Inoculation
La pré-culture (inoculée avec le germe à tester) est distribuée dans une série de 7 tubes
à hémolyse appelés « tubes expérimentaux » (numérotés de 1 à 7) à raison de 1ml par tube.
Ensuite, 1ml d’extrait de concentration connue (à partir de la gamme de concentration de
l’extrait) est additionné dans chaque tube.
Deux tubes sont aussi préparés, le premier contient 2ml de milieu non inoculé stérile
qui sert de témoin positif (pour la présence d’activité antibactérienne) et le deuxième a reçu 1
ml de la pré-culture et 1ml de milieu non contaminé mais dépourvu d’extrait servant de
témoin négatif. Les tubes sont ensuite incubés à 37°C pendant 24 heures.
IV.3.2.4. Lecture des résultats
Après une incubation de 24 heures à 37°C, la lecture des résultats est effectuée par
comparaison de la turbidité des tubes expérimentaux avec les tubes témoins. La croissance

Matériels et méthodes
des bactéries se traduit par un aspect trouble du milieu de culture. Par contre, le milieu reste
limpide en cas d’inhibition de la multiplication bactérienne.
IV.3.3. Détermination de la CMB
IV.3.3.1. Ensemencement
La numération sur milieu solide des cellules viables provenant des cultures dans les
tubes à hémolyse en milieu liquide lors de la détermination de la CMI permet d’évaluer la
CMB. Pour chaque tube, la tête de l’anse d’inoculation préalablement stérilisée avec la
flamme est trempée dans la culture, puis on ensemence en trait unique sur le milieu Muëller
Hinton solide dans une boîte de Pétri. Les boîtes sont incubées à 37°C pendant 24 heures.
IV.3.3.2.Lecture des résultats
Après incubation à 37°C pendant 24 heures, les boîtes sont observées. La CMB
correspond à la concentration minimale pour laquelle toutes les bactéries sont mortes et
aucune colonie caractéristique n’est observée sur le milieu.

V. TEST ANTI-MALARIA
V.1. But
Matériels et méthodes
Déterminer l’activité antiplasmodiale des extraits sur la phase asexuée intra-
érythrocytaire du cycle biologique de la souche de Plasmodium (présenté en annexe 5)
résistante à la chloroquine Plasmodium falciparum FCM29. Les tests ont été effectués à
l’unité Malaria du Centre National d’Application de Recherches Pharmaceutiques (CNARP).
V.2. Principe
La croissance du parasite est évaluée au moyen du Sybr Green I, une substance
fluorescente spécifique à l’ADN viable : l’ADN double brin. La fluorescence émise par le
complexe ADN/Sybr green est proportionnelle à la quantité d’ADN. Cette fluorescence est
évaluée à l’aide d’un lecteur de microplaque à fluorescence (Flx-800).
V.3. Mode opératoire
V.3.1. Culture du parasite
Les cultures sont maintenues dans un milieu composé de globules rouges (GR) Opositif
à 2% d’hématocrite dans du milieu RPMI 1640 (Sigma) (la composition du milieu
RPMI est présentée en annexe 3). Les flacons de 25ml sont incubés à 37°C dans une cloche à
bougie. La parasitémie est maintenue entre 0.5% à 4%. Tous les trois jours, les érythrocytes
parasités sont transférés dans un nouveau milieu de culture. La culture est synchronisée par la
méthode du sorbitol 5%. Après 96 heures, la parasitémie est évaluée au microscope en
comptant au minimum 500 érythrocytes sur un frottis coloré au Giemsa. Les parasites
devraient être majoritairement aux stades trophozoïtes et de ring, sans schizontes notables.
Pour l’essai, la culture est ramenée à 2% d’hématocrite et 1% de parasitémie.
V.3.2. Sélection des extraits
La culture de Plasmodium falciparum conditionnée pour l’essai est répartie dans les
puits d’une microplaque de 96 puits et mise en contact avec les extraits à tester à la
concentration finale de 50Yg/ml. Le volume total du milieu d’incubation et des extraits est de
200Yl. Les essais sont en duplicate. Des puits sont réservés pour le contrôle positif : milieu de
culture avec des GR parasités, sans extrait ; et pour le contrôle négatif : milieu de culture sans
GR parasité et sans extrait. L’incubation est de 48 heures pour assurer un cycle biologique
complet du parasite. A la fin de l’incubation, dans chaque puits, 50Yl d’une solution de Sybr

Matériels et méthodes
Green I est ajoutée et mélangée. Le volume de Sybr Green est de 0,1% du volume total. La
lecture est effectuée à une longueur d’onde de 518nm, après 30 minutes supplémentaires
d’incubation à 37°C et dans l’obscurité. Le taux d’inhibition est calculé selon la formule
suivante :
Pourcentage inhibition = x 100
Avec: RFU = Rate Fluorescence Unit
RFUNGTV = RFU du puits de contrôle négatif
RFUPSTV = RFU du puits du contrôle positif
RFUEXTRAIT = RFU de l’extrait testé
Les extraits qui présentent un taux d’inhibition supérieur ou égal à 75% sont
sélectionnés pour la détermination de l’IC50, la concentration capable d’inhiber de moitié la
croissance du parasite.
Une gamme de 8 concentrations de l’extrait sélectionné, allant de 50Yg/ml à
0,39Yg/ml est préparée par une dilution en cascade de coefficient égal à 0,5 de l’extrait initial.
Les pourcentages d’inhibition correspondant à chaque concentration permettent l’évaluation
graphique de l’IC50.
(RFUextrait – RFUNGTV)
(RFUPSTV – RFUNGTV)

VI. ETUDE CHIMIQUE PRELIMINAIRE DE L’EXTRAIT ACTIF
Matériels et méthodes
L’extrait le plus actif lors du test d’activité antimicrobienne par la méthode de
diffusion sur gélose est utilisé pour la détection des grandes familles chimiques. La technique
de fractionnement bioguidé a été utilisée.
VI.1.Obtention des extraits
VI.1.1. Principe
La macération, une méthode d’extraction solide-liquide, qui un procédé discontinu, a
été mise à profit. Elle consiste à laisser tremper le solide (Extrait) dans un solvant (Méthanol)
à température ambiante pour en extraire le maximum de constituants solubles. Après
filtration, le résidu est remis dans un récipient d’extraction avec une nouvelle portion de
solvant. Le processus est répété plusieurs fois. Les portions réunies d’extrait sont évaporées à
sec.
VI.1.2. Mode opératoire
Huit grammes de l’extrait actif (obtenu à partir de l’éthanol 50%) ont été additionné de
20ml de méthanol, le mélange est homogénéisé, puis centrifugé pendant 5 minutes à 3000
tours/min. On obtient alors 2 phases : le surnageant ou extrait méthanolique (ce qui est soluble
dans le méthanol) et le culot (insoluble). La fraction méthanolique est recueillie, concentrée à
l’évaporateur rotatif sous pression réduite à 35°C avant d’être séchée dans un dessiccateur à la
température ambiante.
Un test d’activité antimicrobienne sur le germe sensible à l’extrait de départ est
effectué avec les 2 fractions obtenues afin de déterminer laquelle de ces 2 fractions est la plus
active. Puis la fraction la plus active est de nouveau fractionnée par CLBP.
VI.2. Chromatographie Liquide à Basse Pression (C.L.B.P)
Le C.L.B.P est une méthode courante de fractionnement, de séparation et aussi de
purification des constituants d’un mélange.

VI.2.1. Principe
Matériels et méthodes
Le CLBP repose sur la séparation des composants, d’une part, les substances polaires
sont fortement retenues par l’adsorbant dans la colonne ; d’autre part les solvants polaires
entrainent facilement les composés moins polaires (Nagel et al., 1969). Lorsque l’échantillon
est déposé au sommet de la colonne, il est aussitôt adsorbé en une zone cylindrique de faible
épaisseur. L’écoulement continu d’éluant dans la colonne provoque alternativement
l’adsorption et la désorption des molécules de l’échantillon. Les molécules sont entrainées
vers le bas à des vitesses variables selon leur affinité pour l’adsorbant et leur solubilité dans
l’éluant (Chavanne et al., 1986).
VI.2.2. Mode opératoire
VI.2.2.1.Remplissage de la colonne
Le remplissage de la colonne par la phase fixe est une opération délicate, car de son
homogénéité dépend la qualité de la séparation. Eviter les bulles d’air est une condition
importante pour la réussite de la manipulation. Il existe deux modes de remplissage :
Par voie sèche : l’adsorbant est mis directement dans la colonne utilisée.
Par voie humide : l’adsorbant est d’abord mélangé avec un volume d’éluant, le tout
bien homogénéisé et versé dans la colonne.
VI.2.2.2.Dépôt de l’échantillon
L’échantillon à analyser est déposé au sommet de la colonne en bande étroite, sous
forme de :
dépôt liquide : l’échantillon est dissous dans un minimum de volume de solvant.
dépôt solide : l’échantillon est mélangé avec une petite quantité d’absorbant.
VI.2.2.3.Déroulement de l’élution
L’élution est réalisée avec un gradient discontinu du système de solvants employé
(Dichlorométhane/Méthanol). Les fractions récoltées sont ensuite analysées par
chromatographie sur couche mince. Elles sont rassemblées suivant leur comportement
chromatographique.

VI.3. Chromatographie sur couche mince
Matériels et méthodes
La chromatographie sur couche mince (C.C.M) est fréquemment utilisée pour des
analyses exploratoires et pour la caractérisation des produits.
VI.3.1. Principe
La CCM repose principalement sur des phénomènes d’absorption, la phase mobile est
un solvant ou un mélange de solvants, qui progresse le long d’une phase stationnaire fixée sur
une plaque de verre ou sur une feuille en plastique ou en aluminium. Chaque composant de
l’échantillon se déplace à sa propre vitesse derrière le front du solvant. Chaque tache détectée
ou révélée est caractérisée par sa référence frontale donnée par la relation
suivante (Randerath, 1971 ; Vernin, 1970) :
VI.3.2. Mode opératoire
X
Rf =
Y
VI.3.2.1. Dépôt des échantillons
Une ligne de dépôt des extraits est tracée à environ 1cm du bord inférieur de la plaque.
Puis les échantillons en solution sont déposés sous forme de trait sur la ligne de dépôt à l’aide
d’un capillaire. Ils sont espacés de 1cm. Les dépôts sont séchés immédiatement puis vérifiés
sous UV pour s’assurer que la quantité déposée est bien suffisante.
VI.3.2.2. Saturation de la cuve
Le système de solvants est versé dans la cuve (à une hauteur de 0,5cm) 15 minutes
avant l’élution. Ceci a pour effet de saturer l’atmosphère de la cuve.
Rf : Référence frontale.
X : Distance parcourue par le produit.
Y: Distance parcourue par le solvant
VI.3.2.3. Développement du chromatogramme
La plaque est placée en position presque verticale dans la cuve contenant le solvant de
chromatographie, puis la cuve est fermée et le solvant migre par capillarité vers le haut le long
de la plaque. Lorsque le front de solvant se trouve à environ 1cm de l’extrémité supérieure de
la plaque, cette dernière est retirée de la cuve et séchée à l’aide d’un séchoir.

VI.3.2.4. Révélation
Matériels et méthodes
La plaque est d’abord observée sous lumière UV aux longueurs d’onde 254nm et
365nm. Les produits qui absorbent les UV apparaissent sous forme de taches sombres.
Les produits sont révélés par pulvérisation de la plaque à la vanilline sulfurique (la
préparation de la vanilline sulfurique est représentée en annexe 3). Après séchage de la plaque
dans l’étuve 120°C, des taches colorées (violet, bleu, rose) apparaissent.
VI.4.Criblage de fractions actives
Cette étape à pour objectif de déterminer la nature chimique des fractions actives par
la combinaison des deux méthodes : méthode de colorimétrie par CCM et méthode
bioautographique sur CCM.
VI.4.1.Principe
La bioautographie sur CCM consiste à faire migrer les fractions sur une plaque
chromatographique. La plaque est ensuite déposée sur une culture de souche à tester sur
milieu solide. La technique est la même que dans le test antibiogramme mais au lieu de disque
imbibé de produit à tester, on utilise directement des plaques chromatographiques. Une zone
d’inhibition est aperçue autour de(s) bande(s) active(s) sur la plaque. La Rf de(s) bande(s)
active(s) est déterminée.
La colorimétrie par CCM consiste d’abord à séparer les différentes fractions d’un
extrait sur une plaque de silice dans un système de solvant adéquat. Les différentes fractions
sont ensuite révélées à la lumière UV aux longueurs d’ondes de 254nm et 365nm puis
marquées sur la plaque avec leurs références frontales respectives. La nature des différentes
fractions actives est ensuite révélée avec des réactifs chimiques spécifiques comme
l’anisaldéhyde sulfurique à 5% qui détecte les terpènes et les saponines, le réactif de
Dragendorff qui justifie la présence des alcaloïdes, la solution éthanolique de KOH à 5% qui
discerne les dérivés anthracéniques et les coumarines et la solution de NP/PEG qui démontre
la présence des flavonoïdes (Merck, 1975).
La comparaison des résultats des deux méthodes permet de déterminer la nature
chimique de(s) fraction(s) active(s) à partir des Rf.

VI.4.2.Mode opératoire
VI.4.2.1.Préparation de la plaque de CCM
Matériels et méthodes
Cinq plaques chromatographiques (6cm x 6cm) sont préparées (une plaque par
fraction). Pour chaque plaque, le dépôt de la fraction se fait par un trait continu d’environ 5cm
sur la ligne de dépôt. Après séchage à l’air libre, la plaque est placée dans une cuve
chromatographique contenant 15ml de solvant correspondant pour chaque fraction. Dès que le
solvant arrive à 0,5cm du bord supérieur de la plaque celle-ci est retirée et séchée. Les
différentes bandes sont ensuite révélées à la lumière UV aux longueurs d’ondes 254nm et
365nm puis marquées et les références frontales (Rf) sont calculées.
La plaque est découpée en 7 portions à raison de 6mm par portion suivant le sens de
migration du solvant (Figure 5).
Portion
6mm
Figure 5 : Schéma du développement des fractions sur la plaque de CCM.
Les portions 1 et 7 sont révélées par pulvérisation avec la vanilline sulfurique, ce sont
des portions témoins. La portion 2 est destinée au test microbiologique et les portions 3, 4, 5
et 6 sont utilisées pour la détection des grandes familles chimiques.
VI.4.2.2.Test d’activité antibactérienne des fractions
L’activité de chaque fraction est appréciée par un test antibactérien des portions de
plaque de CCM. Le mode opératoire est le même que celui de la technique de diffusion sur
gélose mais au lieu d’employer des disques de 6mm imprégnés de l’extrait, on utilise
directement les portions de plaque de CCM (6mm de largueur et 6cm de longueur) après
migration.
Front de migration
Plaque
chromatographique
Sens de migration
du solvant.
Zone de dépôt
0,5cm
1 2 3 4 5 6 7
5cm 0,5 cm
0,5cm
5,5cm
1cm

VI.4.2.3.Détection des grandes familles chimiques
Matériels et méthodes
Les portions de plaques préparées précédemment sont pulvérisées avec des réactifs
spécifiques pour la détection de la nature chimique de ces différentes fractions (les
préparations des réactifs sont présentées en annexe 3).
a. Détection des terpènes
La plaque est pulvérisée par une solution d’anisaldéhyde sulfurique à 5% puis
chauffée à l’étuve à 120°C pendant 15 minutes. La présence d’une coloration bleue, bleu vert,
rouge marron ou rouge violet ou violette ou jaunâtre sur les fractions est observée. Ces
colorations déterminent la présence de terpènes et de saponines.
b. Détection des alcaloïdes
Le réactif de Dragendorff est pulvérisé sur la plaque. L’observation directe d’une
coloration marron ou orange des fractions révèle la présence d’alcaloïdes.
c. Détection des dérivés anthracéniques et des coumarines
La plaque est révélée par une solution éthanolique de KOH à 5% puis à la lumière UV
à la longueur d’onde 365nm. L’apparition des colorations rouge ou jaune fluorescent et bleu
fluorescent démontrent respectivement la présence de dérivés anthracéniques et de
coumarines.
d. Détection des flavonoïdes
La solution de NP/PEG est pulvérisée sur la plaque, puis après environ 15 minutes, la
préparation est observée sous une lumière UV à 365nm de longueur d’onde. L’observation
d’une fluorescence jaune ou verte sur les fractions indique la présence des flavonoïdes.

RESULTATS

RESULTATS
I. ISOLEMENT DES SOUCHES D’ACTINOMYCETES
Résultats
A partir des 15 échantillons de sol rhizospherique collectés sur les 3 sites différents
dans la forêt d’Ankafobe, 82 souches d’Actinomycètes sont isolées. Les souches sont
numérotées de 1 à 82, et sur les 82 souches d’Actinomycètes :
- 33 souches sont isolées à partir des échantillons de forêt primaire ;
- 26 souches obtenues à partir des échantillons de forêt moyennement dégradée ;
- 23 souches à partir des échantillons de sol de la forêt dégradée.
Le tableau 7 montre le nombre de souches isolées à partir des 3 méthodes d’isolement
dans les 3 sites d’études.
Tableau 7: Nombre de souches d’Actinomycètes isolées à partir des 3 sites d’études
Traitement
Site
Séléction par
antibiotique
Traitement à 100°C Sol aerosolisé
Forêt primaire 13 11 9
Forêt moyennement
dégradéee
8 4 14
Forêt dégradée 4 4 15
Figure 6 : Histogramme montrant le nombre de souches d’Actinomycètes isolées par
sites et par méthodes d’isolement

Résultats
Les 82 souches d’Actinomycètes isolées sont morphologiquement identiques c'est-à-
dire les colonies sont opaques, de formes arrondies, à bords irréguliers et incrustées dans le
milieu de culture (Figure 7). Mais ce qui differencie les souches c’est la couleur du mycélium
aérien, celle du mycélium végetatif, leurs tailles et la production de pigments (Figure 8). Les
caractéristiques de chaque souche d’Actinomycètes sont presentées en annexe 6. Le tableau 8
résume les différents caractères morphologiques des souches d’Actinomycètes isolées.
Figure 7: Souches pures d’Actinomycètes sur milieu ISP2
Souches d’Actinomycètes
produisant des pigments
Figure 8 : Variétés de souches d’Actinomycètes isolées sur milieu ISP2
Tableau 8: Résumé des caractères morphologiques des souches d’Actinomycètes isolées
Taille des colonies mûres
(D= diamètre de la colonie)
Couleur du mycélium
végétatif
Couleur du mycélium aérien
Couleur du pigment
Souches d’Actinomycètes
de différentes couleurs
Petite (D < 0,5mm)
Moyenne (0,5mmb D c 10mm)
Grande (10mm < D)
Jaune, Marron, Gris, Vert
Rose, Rouge, Jaune
Gris, Marron, Orange
Rouge, Jaune
Gris, Marron

II. PRODUCTION ET EXTRACTION DE METABOLITES SECONDAIRES
II.1. Fermentation sur milieu solide
Résultats
Les 82 souches d’Actinomycètes sont cultivées par fermentation sur le milieu AFM
solide pour la production de métabolites secondaires pendant une période d’incubation de 8
jours à 28°C (Cf. materiels et methodes. § II.3.1 p. 21). Après incubation, une couche très
dense et homogène de colonies d’Actinomycètes incrustées dans la gélose s’est développée
sur le milieu de fermentation (Figure 9).
Figure 9 : Cultures d’Actinomycètes par fermentation sur milieu AFM solide
II.2. Extraction de métabolites secondaires
Les métabolites secondaires produits par les souches d’Actinomycètes, lors de la
fermentation pendant une incubation de 8 jours sur milieu solide, ont été récupérés avec le
solvant organique. Nous avons utilisé comme solvant d’extraction l’éthanol 50%, pour
extraire la quasi-totalité des métabolites secondaires contenus dans le milieu de culture.
Pour chaque culture, en utilisant 30ml d’éthanol 50%, 300mg à 500mg d’extraits sont
obtenus selon la souche d’Actinomycète. Les extraits obtenus (82 extraits) sont de couleur
marron (le poids de chaque extrait est présenté en annexe 6).

III. TEST ANTIMICROBIEN
Résultats
Après 24 heures d’incubation, les observations montrent que 42 extraits sont actifs au
moins sur un germe testé. Cette activité est mise en évidence par la présence d’une zone
d’inhibition autour des disques imbibés d’extrait à une concentration de 20mg/ml. Par contre,
les 40 autres extraits, aucune zone d’inhibition n’est observée. Les résultats des tests
antibiogrammes des extraits sont montrés dans le tableau 9.
Tableau 9: Diamètre d’inhibition (mm) des extraits sur les souches testées
Souches
Extraits
Bactéries à Gram+ Bactéries à Gram- Levure
B.cereus S.aureus S.pneumoniae E.coli S.enteridis K.oxytoca C.albicans
1 0 0 9 0 0 0 0
8 9 8 8 0 0 0 0
19 0 0 0 0 12 0 0
20 0 0 0 7 7 0 0
21 0 0 0 0 7 0 0
22 0 0 0 0 7 0 0
23 0 0 0 0 8 0 0
24 0 0 0 0 8 7 0
28 0 0 0 0 9 0 0
29 0 7 0 0 0 0 0
30 0 8 0 0 0 9 0
33 0 7 0 0 0 0 0
34 7 0 0 0 8 0 0
35 0 0 0 9 10 7 0
36 0 7 0 10 0 0 0
37 0 0 8 8 0 0 0
38 0 0 0 7 0 0 0
39 7 0 0 0 7 0 0
40 7 0 7 0 9 0 0
41 7 0 8 0 9 0 0
42 0 0 8 0 8 0 0
43 7 0 7 0 0 0 0
44 7 0 0 0 9 0 0

Résultats
45 0 0 7 7 8 0 0
51 0 0 8 0 0 0 0
53 0 0 0 0 0 7 0
57 0 0 0 0 0 0 13
58 7 0 0 7 0 0 0
59 0 7 0 7 0 0 0
62 7 0 0 7 0 0 17
63 8 0 0 8 0 0 0
66 0 7 0 0 0 0 0
68 0 0 0 0 0 0 18
69 0 0 0 0 0 0 12
70 0 7 7 0 0 0 0
71 0 7 0 0 0 0 0
74 8 19 18 0 0 0 0
76 0 9 0 0 0 0 0
78 7 11 10 0 0 0 8
79 10 11 9 0 0 0 0
80 10 9 9 0 0 0 13
82 8 9 9 0 0 0 9
Par ailleurs, certains extraits semblent être plus actifs que d’autres, comme le cas de :
- l’extrait 74 sur Staphylococcus aureus et Streptococcus pneumoniae avec un
diamètre de zone d’inhibition respectivement de 19mm et 18mm,
- l’extrait 79 sur Bacillus cereus (10mm),
- l’extrait 36 sur Escherichia coli (10mm),
- l’extrait 30 sur Klebsiella oxytoca (9mm),
- l’extrait 19 sur Salmonella enteridis (12mm)
- l’extrait 68 sur Candida albicans (18mm).
Les zones d’inhibition provoquées par ces extraits sur les germes testés sont présentées
sur la figure 10.

79
Inhibition de l’extrait 79 sur
Bacillus cereus
Inhibition de l’extrait 74 sur
Streptococcus pneumoniae
19
74
Inhibition de l’extrait 19 sur
Salmonella enteridis
74
Inhibition de l’extrait 74 sur
Staphylococcus aureus
36
35
Inhibition de l’extrait 35 sur
Escherichia coli
30
Inhibition de l’extrait 30 sur
Klebsiella oxytoca
Résultats

Inhibition de l’extrait 68 sur
Candida albicans
Figure 10 : Inhibition des bactéries et levure par les extraits d’Actinomycètes
IV. DETERMINATION DE LA CMI ET DE LA CMB
Résultats
La CMI et la CMB de l’extrait 74 (l’extrait le plus actif par la méthode de diffusion
sur gélose) a été déterminée sur Staphylococcus aureus (germe le plus sensible à l’extrait).
IV.1. CMI de l’extrait 74 sur Staphylococcus aureus sur milieu solide
Sur milieu solide, des disques imbibés de différentes concentrations de l’extrait 74
sont déposés sur la culture de Staphylococcus aureus. La figure 11 montre l’effet des
différentes doses de l’extrait 74 sur Staphylococcus aureus après 24 heures d’incubation à
37°C. Les résultats sont donnés par le tableau10.
6
1
68
7
5 4
2
3
: Diamètre de la zone d’inhibition.
Concentration d’extrait par disque
1 : 20mg/ml
2: 10mg/ml
3: 5mg/ml
4: 2,5mg/ml
5: 1,25mg/ml
6: 0,625mg/ml
7: 0,3125mg/ml
Figure 11: Effets des différentes concentrations de l’extrait 74 sur Staphylococcus aureus

Résultats
Tableau 10: Détermination de la CMI sur milieu solide de l’extrait 74 sur Staphylococcus
aureus
Disques 1 2 3 4 5 6 7
Concentration
de l’extrait 74
(mg/ml)
20 10 5 2,5 1,25 0,62 0,31
Observation + + + + + - -
+ : présence de zone d’inhibition ; - : absence de zone d’inhibition
D’après ces résultats, la valeur de la CMI en milieu solide de l’extrait 74 est égale à
1,25mg/ml.
IV.2. CMI de l’extrait 74 sur Staphylococcus aureus en milieu liquide
En milieu liquide, les résultats de la culture de Staphylococcus aureus additionnée de
l’extrait 74 à différentes concentrations sont donnés dans le tableau 11.
Tableau 11: Détermination de la CMI en milieu liquide de l’extrait 74 sur Staphylococcus
aureus
Tube T+ 1 2 3 4 5 6 7 T-
Extrait 74
(mg/ml)
0 20 10 5 2,5 1,25 0,62 0,31 0
Aspect de
la culture
LIMPIDE CMI TROUBLE
T+ : témoin positif ; T- : témoin négatif
D’après ces résultats, la valeur de la CMI en milieu liquide de l’extrait 74 sur
Staphylococcus aureus est estimée à 1,25mg/ml.
IV.3. CMB de l’extrait 74 sur Staphylococcus aureus
La CMB de l’extrait 74 est déterminée à partir des cultures en milieu liquide pour la
détermination de la CMI (la méthode est décrite au paragraphe IV.3.3 p. 27). Les cultures de
Staphylococcus aureus sur le milieu Muëller Hinton après 24 heures d’incubation à 37°C sont
rapportées dans la figure 12. Les résultats sont présentés dans le tableau 12.

Figure 12: Cultures de Staphylococcus aureus après 24 heures d’incubation à 37°C
Tableau 12: Détermination de la CMB de l’extrait 74 sur Staphylococcus aureus
Résultats
Tubes T+ 1 2 3 4 5 6 7 T-
Extrait
(mg/ml)
0 20 10 5 2,5 1,25 0,62 0,31 0
observation - - - + + + + + +
+ : survie des microorganismes ; - : mort des microorganismes
D’après les résultats réunis dans le tableau 12, la CMB de l’extrait 74 sur
Staphylococcus aureus est égale à 10mg/ml.
V. TEST ANTI-MALARIA
Concernant le test anti malaria des extraits d’Actinomycètes, réalisé sur Plasmodium
falciparum résistant à la chloroquine FCM29, seulement 3 extraits sur les 82 testés inhibent
la croissance de Plasmodium falciparum à une concentration de 50Yg/ml c'est-à-dire l’extrait
78, 80 et 82 à des pourcentages d’inhibition respectivement 88,07%, 100% et 100%. L’IC 50
(concentration inhibant 50% de Plasmodium) à été déterminée pour les 3 extraits actifs.
Les résultats sont donnés dans le tableau 13.
Tableau 13: Pourcentage d’inhibition et IC 50 des extraits sur Plasmodium falciparum
FCM29
EXTRAITS
Pourcentage d’inhibition
pour 50Qg/ml d’extrait
IC 50 (Qg/ml)
78 88,07 1,87 ± 0,04
80 100 1,79 ± 0,06
82 100 7,99 ± 0,23

VI. ETUDE CHIMIQUE DE L’EXTRAIT 74
Résultats
L’extrait 74 qui s’est avéré le plus actif sur Staphylococcus aureus lors du test
d’activité antibacterienne est utilisé pour l’étude chimique.
VI.1. Fractionnement par le méthanol
Après macération de 8g de l’extrait 74 avec le méthanol, deux (02) parties sont
obtenus : le surnageant qui constitue l’extrait méthanosoluble (EM) et le culot (EA). Les deux
(02) extraits obtenus sont évaporés à sec, les résultats sont rapportés dans le tableau 14
suivant.
Tableau 14: Fractionnement de l’extrait 74 avec le méthanol
Extrait Poids de l’extrait obtenu (g) Rendement (%)
EM (extrait méthanolique) 3,16 39,56
EA (culot) 3,78 47,36
L’activité des deux (02) extraits est appréciée sur Staphylococcus aureus par un test
d’activité antibacterienne (Figure 13). Les résultats sont donnés dans le tableau15.
EM
Extrait 74
Figure 13: Inhibition de la croissance de Staphylococcus aureus sous l’action de EM et EA
Tableau 15: Effets des extraits sur Staphylococcus aureus
Extraits solvant Concentration de
l’extrait (mg/ml)
Diamètre de la zone
d’inhibition (mm)
Extrait 74 Ethanol 50% 20 19
EM Méthanol 20 24
EA Eau 20 12
EA

Résultats
D’après ces résultats, l’activité antibactérienne de l’extrait méthanolique (EM) avec un
diamètre de zone d’inhibition de 24mm vis-à-vis de Staphylococcus aureus, est plus
importante comparée à celle de l’extrait EA (12mm).
VI.2. Fractionnement de l’extrait EM par CLBP
750mg de l’extrait méthanolique (EM) a été fractionné par CLPB en utilisant comme
phase fixe la silice, un gradient de solvant de dichlorométhane et du méthanol comme phase
mobile (Cf. matériels et méthodes. § VI.2 p.30). Après fractionnement, 82 fractions sont
recueillies dans des tubes à essais d’un volume de 10ml. Après analyse des fractions par
CCM, les fractions sont rassemblées suivant leur comportement chromatographique.
Finalement, 5 fractions ont été retenues.
Les différentes étapes de fractionnement par CLBP de l’extrait méthanolique sont
rassemblées dans le diagramme ci-après et les profils chromatographiques sur couche mince
des 5 fractions sont présentés dans la figure15.
Fraction 1
Système :
DCM/MetOH
[90/10]
37,2mg
Fraction 2
Système :
DCM/MetOH
[85/15]
28.8mg
EXRAIT
METHANOLIQUE
750mg
CLBP
CCM
82 FRACTIONS
Fraction 3
Système :
DCM/MetOH
[80/20]
73,2mg
-Colonne : Ø intérieur de 2,3cm
Ø extérieur de 2,5cm
Hauteur de 50cm
Hauteur effective de 17cm
-Silice normal 0,060-0,200 mm
Ø 6nm ACROS ORGANICS
-Système DCM…DCM/MeOH…...MeOH
100%..........50/50..............100%
-Fractions : 10ml
-Adsorbant : Silice 60 F254
sur feuille d’aluminium
-Détection : UV 254 et 365 nm
-Révélation : Vanilline sulfurique
Fraction 4
Système :
DCM/MetOH
[65/35]
44.5mg
Fraction 5
Système :
DCM/MetOH
[55/45]
515mg
Figure 14 : Diagramme de fractionnement de l’extrait méthanolique (EM)

F1 F2 F3 F4 F5
Figure 15: Profil chromatographique des 5 fractions issues de la CLBP
VI.3. Bioautographie des fractions
Résultats
Après 24 heures d’incubation à 37°C, des zones claires correspondant à des zones
d’inhibition ont été observées autour des portions de plaques de CCM (6mm de diamètre) sur
la culture de Staphylococcus aureus. Ces zones d’inhibition ont des références frontales
distinctes et de diamètres différents selon la fraction testée (Tableau 16).
La figure 16 montre l’activité de chaque fraction sur Staphylococcus aureus après 24
heures d’incubation à 37°C.
F3 F2 F1
Portion de
F5 F4
plaque de CCM
Zone d’inhibition
-Support : Silice 60 F254 sur feuille d’aluminium
-Système de solvant : DCM/ MetOH [80/20]
-Observation : UV 254nm et 365nm
-Révélateur : Vanilline sulfurique
Figure 16: Effets des fractions testées sur Staphylococcus aureus

Résultats
Tableau 16: Diamètres et Rf des zones d’inhibition des fractions sur Staphylococcus aureus
FRACTIONS
Diamètre du halo
d’inhibition (mm)
Référence frontale de la
bande active (Rf)
Fraction 1 (F1) 15 0,05
Fraction 2 (F2) 22 0,56
Fraction 3 (F3) 16 0,54
Fraction 4 (F4) 24 0,61
Fraction 5 (F5) 21 0,83
VI.4. Détection des familles chimiques des fractions actives
Après les révélations de chaque portion de plaque par les réactifs chimiques
spécifiques, les observations de la couleur des fractions sont dressées dans le tableau 17.
Tableau 17: Composition chimique des fractions issues de l’extrait 74
Famille chimique
TERPENES
ALCALOIDES
COMPOSE
ANTHRACENIQUE
Réactif
spécifique
Anisaldehyde
sulfurique à
5%
Réactif de
Dragendorff
Solution
éthanolique
de KOH à
5%
Fractions
Observations
Colorations Résultats
F1 - -
F2
F3
Rf
Coloration violette + 0,51*
Coloration jaunâtre + 0,56*
Coloration verte + 0,55*
Coloration violette + 0,58*
F4 - -
F5 - -
F1 Pas de coloration rouge marron -
F2 Pas de coloration rouge marron -
F3 Coloration orange + 0,9
F4 Pas de coloration rouge marron -
F5 Pas de coloration rouge marron -
F1 Pas de coloration -
F2 Pas de coloration -
F3 Jaune fluorescente + 0,32
F4 Rouge brique + 0,69
F5 Pas de coloration

COUMARINES
FLAVONOIDES
Solution
éthanolique
de KOH à
5%
Solution de
NP/PEG
F1 Pas de coloration -
F2 Pas de coloration -
F3 Pas de coloration -
F4 Pas de coloration -
F5 Pas de coloration -
F1 Pas de coloration -
F2 Pas de coloration -
F3 Pas de coloration -
F4 Pas de coloration -
F5 Pas de coloration -
(*) :Rf active sur Staphylococcus aureus
Résultats
En comparant les résultats obtenus de la bioautographie directe des chromatogrammes
des 5 fractions sur Staphylococcus aureus (Tableau 16) et la révélation des portions de plaque
des fractions (Tableau 17), il a été constaté que les responsables de l’activité des fractions 2 et
3 sont des terpènes car pour la fraction 2, la zone d’inhibition se situe à la Rf=0,56 et la
pulvérisation de la portion de plaque avec l’anisaldehyde sulfurique à 5% révèle des bandes
de couleur verte (Rf=0,51) et violette (Rf=0,56) montrant la présence des terpènes. De même
que pour la fraction 3, la révélation avec l’anisaldehyde sulfurique à 5% révèle la présence
des composés terpéniques aux Rf 0,55 et 0,58 correspondant à la zone d’inhibition qui se
trouve à la Rf égale à 0,54. Ceci confirme que les molécules responsables de l’activité des
fractions 2 et 3 sur Staphylococcus aureus sont des terpènes (Figure 17).
Fraction 2 Fraction 3
Terpènes
Zone d’inhibition
(a) (b) (c) (c) (b) (a)
a : révélation avec la vanilline sulfurique
b : CCM-bioautographie sur Staphylococcus aureus
c : révélation avec l’anisaldehyde sulfurique à 5%
Figure 17: Nature chimique des bandes actives des fractions 2 et 3

DISCUSSION

DISCUSSION
Discussion
Un total de 15 échantillons de sol rhizosphérique répartis dans 3 localités différentes
de la forêt d’Ankafobe a été utilisé pour isoler les souches d’Actinomycètes. En utilisant 3
méthodes d’isolement (sélection par antibiotiques, traitement à haute température et sol
aérosolisé), 82 variétés de souches d’Actinomycètes ont été isolés. Le prétraitement de sol
c'est-à-dire le séchage des échantillons de sol permet déjà de sélectionner les Actinomycètes,
car ces derniers sont plus résistants à la dessiccation par rapport aux autres microorganismes
présents dans le sol.
L’utilisation du milieu ISP2 additionné des antibiotiques antibactériens et
antifongiques est ainsi une des méthodes sélectives pour l’isolement des Actinomycètes. Ces
antibiotiques, comme l’acide nalidixique inhibe totalement la croissance des bactéries Gram
négatif (Hayakawa et Nonomura, 1989), les autres agents sélectifs comme la triméthoprime
(inhibiteur des bactéries à croissance rapide) (Labeda et Shearer, 1990) et le cycloheximide
(inhibiteur fongique) (Wang et al, 1990) avaient été décrits pour l’isolement des colonies
d’Actinomycètes du sol. Par conséquent, les antibiotiques ont été utilisés pour augmenter le
nombre d’Actinomycètes isolés qui peut être masqué par les bactéries et les champignons
présents dans les échantillons de sol. Parallèlement à l’utilisation des inhibiteurs, le traitement
à haute température des échantillons de sol à 100°C pendant une heure permet aussi la
sélection des Actinomycètes. Ils sont plus résistants à la chaleur que les autres
microorganismes, par conséquent le nombre des bactéries trouvé communément dans les
échantillons de sol est fortement réduit (Pisano et al., 1986).
Sur les 82 souches d’Actinomycètes isolées, 33 souches sont issues des échantillons de
sol de la forêt primaires, 26 souches ont été isolées à partir des échantillons de sol de forêt
moyennement dégradée et 23 sont isolées de la forêt dégradée. Le grand nombre de souches
d’Actinomycètes dans la forêt primaire peut s’expliquer par l’abondance des matières
organiques sur ce site. Ce phénomène a été observé par Landerkin et al. (1950) en étudiant la
diversité d’Actinomycètes et la propriété antibactérienne des souches isolées sur la côte Ouest
de l’Inde où ils ont montré que la nature de la végétation qui se produit aux sites de
l'échantillonnage influence le nombre et la variété de la population d’Actinomycètes.
Les 82 souches pures d’Actinomycètes sont mises en culture pour produire des
métabolites secondaires. La culture par fermentation sur milieu solide a été adoptée en
utilisant le milieu AFM solide.

Discussion
La fermentation solide est généralement définie comme une croissance microbienne
sur des particules solides humides en l'absence d'eau libre (Durand, 2003 ; Gervais et al.,
2003 ; Rahardjo et al., 2006). L’absence d'eau libre dans le milieu AFM solide permet de
réduire considérablement les contaminations bactériennes (Raimbault, 1998).
Les métabolites secondaires sont définis comme des composés de faible poids
moléculaire de différentes natures non essentiels à la croissance des microorganismes. La
synthèse de ces métabolites suit la phase de croissance active du microorganisme producteur.
Plusieurs paramètres peuvent conditionner la croissance des Actinomycètes tels que la
composition du milieu de culture, la température et le temps d’incubation. Les Actinomycètes
exigent une source de carbone pour leur croissance. Le milieu AFM utilisé contient du
glucose et de la mélasse comme source de carbone et la présence des inducteurs (ZnSO4, Mg
SO4, CoCl2, CaCO3) permet d’amplifier la production des métabolites secondaires. Ces
inducteurs déstabilisent les souches en culture qui produisent des métabolites secondaires
dans des conditions de stress (Allah Antoine, 2009).
L’incubation de la fermentation est conduite à une température de 28°C car la
température convenable pour les Actinomycètes est de 28 à 30°C permettant alors une
meilleure croissance des Actinomycètes cultivés. La durée d’incubation est aussi très
importante car la synthèse des métabolites secondaires par les Actinomycètes suit la phase de
croissance active qui dure 7 jours, il faut alors prolonger le temps d’incubation pour que les
microorganismes puissent synthétiser les métabolites secondaires.
Les Actinomycètes en culture synthétisent alors des substances dites « métabolites
secondaires » après 8 à 14 jours d’incubation à 28°C. Ces substances sont dispersées dans le
milieu de culture et sont extraites avec le solvant organique. Puis la culture par fermentation a
été macérée avec 30ml d’éthanol 50% pendant 2 heures. La filtration de l’extrait est
indispensable pour débarrasser les microorganismes présents dans l’extrait.
L’étude de l’activité des extraits des Actinomycètes porté sur des souches de
références composé de 3 bactéries Gram positif (Staphylococcus aureus ATCC 11632,
Streptococcus pneumoniae ATCC 6301, Bacillus cereus ATCC 13061), 3 bactéries Gram
négatifs (Escherichia coli, Salmonella enteridis, Klebsiella oxytoca ATCC 100323) et une
levure (Candida albicans) par la méthode de diffusion sur gélose.
Cette méthode permet de démontrer si un extrait est actif ou non par l’observation des
zones d’inhibition autour des disques. L’extrait imprégné dans les disques se propage sur la
gélose de façon radiale inhibant ainsi la croissance des germes. L’inhibition est représentée

Discussion
sous forme de zone claire (ou zone d’inhibition) sur la culture microbienne. Elle permet
également de déterminer la sensibilité d’une souche à un extrait donné par la mesure des
diamètres de ces zones d’inhibition. La sensibilité du germe à l’égard de l’extrait est d’autant
plus importante que le diamètre de la zone d’inhibition est grand.
La plupart des extraits testés sont actifs au moins sur un microorganisme. Par contre
certains extraits n’ont pas montré d’activité sur tous les microorganismes testés. D’après les
résultats, nous avons constaté que les bactéries à Gram positif tels que Staphylococcus aureus
et Streptococcus pneumoniae sont plus sensibles aux extraits d’Actinomycètes que les
bactéries à Gram négatifs et la levure. C’est probablement la structure de leur paroi cellulaire,
constituée principalement de peptidoglycane, qui rend ce groupe de bactéries plus sensible
aux extraits. Par contre la paroi des bactéries à Gram négatif est formée d’une couche externe
composée d’un complexe lipopolysaccharides, des phospholipides et des protéines. Cette
couche est une barrière sélective ce qui les rend moins vulnérables aux extraits que les
bactéries à Gram positif. Les résultats obtenus lors de cette étude ont aussi montré une action
et un degré de sensibilité variables des germes vis-à-vis de ces extraits. Cette différence de
sensibilité des micro-organismes vis-à-vis des extraits d’Actinomycètes pourrait être en
rapport avec la composition de ces derniers qui varie selon la souche productrice.
Il existe des extraits qui ne sont actifs que sur un groupe de microorganismes comme
l’extrait 35, qui n’est actif que sur les bactéries à Gram positif. L’extrait 35 n’a pas d’effet sur
la levure et les bactéries à Gram négatif, alors que les extraits 8 et 74, par exemple, sont actifs
seulement sur les bactéries à Gram positif mais inactifs sur les bactéries à Gram négatif. Les
extraits 57, 68, et 69 ne sont actifs que sur la levure. Tous ces extraits sont donc des extraits à
spectre étroit c'est-à-dire que leurs activités sont limitées seulement à un groupe de
microorganismes. Par contre, l’extrait 62 est un extrait à large spectre c'est-à-dire actif sur les
bactéries à Gram positif, les bactéries à Gram négatif et la levure.
Les extraits d’Actinomycètes ont révélé une très forte activité antimicrobienne sur les
deux groupes de bactéries étudiées, soit sur les bactéries à Gram positif comme l’extrait 74
sur Streptococcus pneumoniae (18mm) et l’extrait 80 sur Bacillus cereus (10mm),soit sur les
bactéries à Gram négatif comme l’extrait 19 sur Salmonella enteridis (12mm) et l’extrait 36
sur Escherichia coli (10mm), ainsi que l’extrait 68 sur la levure Candida albicans avec un
diamètre de zone d’inhibition égal à 18mm. Cependant la plus grande valeur d’inhibition
enregistrée est de 19mm sur Staphylococcus aureus par l’extrait 74.

La CMI et CMB de l’extrait 74 sur Staphylococcus aureus ont été déterminées.
Discussion
Deux méthodes ont été utilisées pour déterminer la CMI de l’extrait 74 mais aussi pour
confirmer l’activité de l’extrait vis-à-vis de Staphylococcus aureus. Nous avons constaté que
quelle que soit la méthode utilisée, la valeur de la CMI est toujours la même. Il est donc
confirmé que la CMI de l’extrait 74 sur Staphylococcus aureus est égale à 1,25mg/ml. Cette
valeur caractérise l’effet bactériostatique de l’extrait 74. La CMB de l’extrait 74 est estimée à
10mg/ml. Cette valeur caractérise l’effet bactéricide de l’extrait 74 sur Staphylococcus
aureus.
L’extrait 74 inhibe alors la croissance de Staphylococcus aureus à une concentration
de 1,25mg/ml mais il ne tue le germe qu’à une concentration supérieure ou égale à 10mg/ml.
A l’issue du test antimalaria effectué sur Plasmodium falciparum FCM29 résistant à la
chloroquine, trois extraits (78, 80, 82) sur les 82 extraits testés ont une activité inhibitrice
notable sur Plasmodium falciparum FCM29 à la concentration 50Yg/ml. L’extrait 78 avec un
pourcentage d’inhibition égale à 88,07%, les extraits 80 et 82 qui ont un pourcentage
d’inhibition égale à 100%. Les autres extraits semblent inactifs sur Plasmodium falciparum
même s’ils se sont avérés très actifs sur les bactéries et la levure comme le cas de l’extrait 74
qui est très actif sur les bactéries à Gram positif mais n’a aucun effet sur Plasmodium. Par
comparaison aux résultats obtenus sur le test antimicrobien de l’extrait 82, ce dernier semble
plus actif préférentiellement sur Plasmodium falciparum que sur les microorganismes
pathogènes avec un pourcentage d’inhibition élevé égal à 100 %. Nous avons noté que l’effet
de l’extrait 82 sur les bactéries et la levure est très faible. Les extraits 78 et 80 sont tous les
deux actifs sur Plasmodium falciparum et aussi sur les microorganismes pathogènes.
L’IC50 des extraits qui ont une activité antipaludique supérieure à 75% d’inhibition a
été déterminée. D’après les résultats, les extraits 78, 80 et 82 ont une IC50 respectivement 1,87
± 0,04Yg/ml, 1,79 ± 0,06Yg/ml et 7,99 ± 0,23Yg/ml. L’extrait 80 avec une IC50 égale à 1,79 ±
0,06Yg/ml est l’extrait le plus actif vis-à-vis de Plasmodium falciparum.
Concernant l’étude préliminaire chimique de l’extrait 74 (l’extrait le plus actif lors du
test antibiogramme), le fractionnement de 8g de l’extrait 74 avec le méthanol a donné 2
extraits : le surnageant ou l’extrait méthanolique (EM) et le culot (EA).
Le test antibiogramme, effectué sur Staphylococcus aureus, des 2 produits montre que
l’extrait méthanolique (EA) est 2 fois plus actif avec un diamètre de zone d’inhibition égal à

Discussion
24mm que l’extrait aqueux (EA) qui a un diamètre de zone d’inhibition égal à 12mm. Ce qui
signifie que la majorité des substances responsables de l’activité de l’extrait 74 est
probablement entrainée dans le surnageant qui est constitué par l’extrait méthanolique (EA)
lors du fractionnement.
Ces résultats nous ont permis de bioguider la détection de la grande famille de
composés responsables de l’activité de l’extrait 74. En effet, l’extrait méthanolique (EM) issu
du fractionnement de l’extrait 74 avec le méthanol a été fractionné par CLBP afin de bien
séparer les composés qui y sont présents. Le suivi de la séparation a été fait par CCM. Les 5
fractions obtenues présentent toutes une activité vis-à-vis de Staphylococcus aureus. La
présence des composés comme les terpènes (fraction 2 et 3), les dérivées anthracéniques et les
alcaloïdes a été révélé lors de la pulvérisation des portions de plaques de CCM des fractions
par des réactifs spécifiques.
La comparaison des résultats obtenus lors de la CCM-bioautographie sur
Staphylococcus aureus et de la révélation des plaques par des réactifs spécifiques (Figure17) a
montré que les molécules responsables de l’activité des fractions 2 et 3 sont des terpènes.
Quant aux autres, la famille des molécules actives n’a pas encore été déterminée, il est
probable que ces molécules appartiennent à des grandes familles autre que les alcaloïdes, les
terpènes, les composés anthracéniques, les coumarines et les flavonoïdes.
Le pouvoir antimicrobien de l’extrait 74 peut être attribué à ses composants
majoritaires, mais il ne faut pas négliger les constituants mineurs qui peuvent avoir une action
significative sur l’activité antimicrobienne de l’extrait.

CONCLUSION
ET
PERSPECTIVES

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Conclusion et perspectives
Le présent travail portant sur « études biologiques et chimiques des métabolites
secondaires de souches d’Actinomycètes telluriques isolées dans la forêt d’Ankafobe de
Madagascar », nous a permis de :
Maîtriser des techniques usuelles en microbiologie et de nous initier à techniques
employées en chimie organique.
Isoler des souches d’Actinomycètes par différentes méthodes d’isolement et de
purification.
Apporter des informations sur la distribution et l’abondance des Actinomycètes dans
le sol.
Disposer d’une collection de souches d’Actinomycètes telluriques utilisable dans les
recherches à venir.
Mettre en évidence l’activité des extraits des métabolites secondaires des
Actinomycètes sur des bactéries pathogènes et sur des parasites.
Déterminer les familles chimiques de l’extrait actif.
Nous avons montré dans cette étude que les souches d’Actinomycètes telluriques
provenant d’une forêt malgache ont des activités aussi bien sur les microorganismes
pathogènes que sur les parasites comme Plasmodium falciparum. Aussi, l’extrait doué de
pouvoir antibactérien renferme diverses substances chimiques. Cependant, cette étude est loin
d’être finie. Dans l’avenir, nous envisageons d’entreprendre des travaux de recherches sur :
La caractérisation moléculaire des souches d’Actinomycètes isolées par PCR des
gènes 16S ribosomal.
L’isolement et l’identification structurale des substances actives.
La valorisation des autres souches qui ont produit des extraits actifs sur d’autres agents
pathogènes.
L’élargissement des études des activités des Actinomycètes sur d’autres
microorganismes pathogènes comme les phytopathogènes.

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ANNEXES

ANNEXES
Annexe 1 : Composition des milieux de culture
Milieu d’isolement des Actinomycètes
ISP2 (International Streptomyces project) :
Annexes
Extrait de levure 4g/l
Extrait de malt 10g/l
Glucose 4g/l
NaCl 20g/l
Agar 20g/l
Les antibiotiques
Pour 500ml de milieu ISP2, on ajoute :
- 5ml de Cycloheximide (0,01g dilué dans 5ml de DMSO)
- 5ml de Triméthoprime (0,25g dilué dans 5ml d’ED)
- 5ml d’acide nalidixique (0,25g dilué dans 5ml d’ED)
Milieu de fermentation
AFM :
Glucose 40g/l
Mélasse de canne 17,5g/l
Pastone 12,5g/l
CaCo 34g/l
KCl 2,5g/l
MgSO4 2,5g/l
ZnSO4 4,6mg/l
CoCl2 10mg/l
Agar 15g/l

Annexes
Milieu utilisé pour le test antibiogramme
Muëller Hinton
Extrait de bœuf 3g/l
Hydrolysat de caséine 17,5g/l
Amidon 1,5g/l
Agar 15g/l
pH 7,2 ± 0,2
Milieu pour la purification des souches à tester
Gélose nutritive :
Extrait de viande 3g/l
Peptone 5g/l
Agar 15g/l
pH 7,4
Milieu pour la revivification des souches à tester
Bouillon nutritif :
Peptone 15g/l
Extrait de levure 5g/l
NaCl l5g/l
pH 7,4

Composition RPMI 1640 (sigma)
Composants mg/l
Sels inorganiques Nitrate de calcium x 4H2O 100
Sulfate de magnésium sec 48,84
Chlorure de potassium 400
Chlorure de sodium 6000
Phosphate de di-sodium hydrogéné 800
Autres composants D(+) Glucose anhydre 2000
Glutathione (red.) 1,00
Hepes 5958
Rouge de phénol 5
Acides aminés L-Arginine x HCl 241,86
L-Asparagine x H2O 50
Acide L-aspartique 20
L-Cystine 65,19
L-Glutamine 300
Acide L-glutamique 20
Glycine 10
L-Histidine x HCl x H2O 20.27
L-Hydroxyproline 20
L-Isoleucine 50
L-Leucine 50
L-Lysine x HCl 40
L-Méthionine 15
L-Phénylalanine 15
L-Proline 20
L-Sérine 30
L-Théeonine 20
L-Tryptophane 5
L-Tyrosine x 2Na 28,83
L-Valine 20
Vitamines Acide p-aminobenzoïque 1
D(+)-Biotine 0,20
D-Calcium pantothénate 0,25
Chlorure de choline 3
Acide folique 1
Myo-Inositol 35
Nicotinamide 1
Pyridoxol x HCl 1
Riboflavine 0,20
Thiamine x HCl 1
Vitamine B12 0,005
Annexes

Annexe 2 : Liste des matériels et équipements
Agitateur EDMOND BUHLER,
Autoclave Sanyo MLS-3780,
Bain ultrason SONOCLEAN,
Balance METTLER,
Balance SARTORIUS,
Bec bunsen,
Boîtes de Pétri de 90 mm de diamètre,
Centrifugeuse HETTICH ROTANTA/R.,
Cuve chromatographique CAMAG,
Dessiccateur sous vide
Eprouvettes graduées,
Erlenmeyers gradués,
Etuve MEMERT,
Filtre millipore,
Fioles jaugées,
Flacon EZ
Grayson aérosol sampler (GAS)
Hotte à flux laminaire FLUFRANCE,
Incubateur NAPCO,
Incubateur SANYO,
Micropipettes avec embouts plastiques,
Pipettes,
Plaque chauffante avec agitateur magnétique HB 450,
Plaque de silice F1500/SL254,
Réfrigérateur PHILIPS,
Rotavapor,
Shaker orbital C-1 CLASSIC,
Spectrophotomètre AWARENESS TECHNOLOGY INC,
Speedvac,
Tubes à essai.
Annexes

Annexe 3: Les réactifs
Composition du réactif pour la révélation des chromatogrammes
Réactif à la vanilline sulfurique
0,5g de vanilline
100ml d’acide sulfurique concentré
Composition des réactifs utilisés pour le criblage chimique
Solution anisaldéhyde sulfurique à 5%
85ml de méthanol.
10ml d’acide acétique glacial.
5ml d’acide sulfurique.
0,5ml anisaldéhyde.
Réactif de Dragendorff
Mélange à volume égal des deux solutions suivantes :
Annexes
Solution 1 : 1,7g de nitrate de bismuth basique et 20g acide tartrique
dans 80ml d’eau.
Solution 2 : 16g d’iodure de potassium dans 50ml d’eau.
Solution éthanolique de KOH à 5%
5g de KOH.
100ml d’éthanol.
Solution NP/PEG
Mélange des deux solutions suivantes :
Solution NP : Diphénylboryloxyethylamine 1%, 10ml.
Solution PEG : polyéthylèneglycol-4000 5%, 8ml.

Annexe 4 : Caractéristiques des souches testées
Noms Caractéristiques Maladies causées
Bacillus cereus - Bacille.
- Gram positif.
Candida albicans - Levure
filamenteuse
(Champignon
imparfait).
Escherichia coli - Bacille.
- Gram négatif.
Klebsiella oxytoca - Bacille.
- Gram négatif.
Salmonella enteridis - Cocci.
- Gram négatif.
Staphylococcus
aureus
Streptococcus
pneumoniae
- Cocci.
- Gram positif.
- Cocci.
- Gram positif.
- Infection alimentaire toxique.
- Mycose au niveau de la peau, des
appareils génitaux, urinaires et
respiratoires.
- Méningite.
- Muguet orale et vulvo-vaginale.
- Gastro-entérite.
- Diarrhée.
- Infection urinaire
- Septicémie.
- Fièvre typhoïde.
- Abcès.
- Conjonctivites.
- Folliculites.
- Furoncles.
- Otites.
- Pneumonies.
Annexes
- Bactérie invasive qui peut entrainer une
pneumonie franche lobaire aiguë
- Septicémie
- Otites, sinusite
- Méningite
- Pleurésies
- conjonctivites

Annexe 5 : Développement de Plasmodium falciparum lors de son cycle intra
érythrocytaire
Annexes
Lors de son développement dans les globules rouges, Plasmodium évolue en trois
étapes. Le stade mérozoïte, issu de la prolifération initiale du parasite dans le foie, est
capable d’infecter un érythrocyte. Il va s’enfermer dans une vacuole parasitophore (stade
anneau ou ring). Au stade trophozoïte, la néosynthèse de ses protéines est intense et leur
trafic efficace via de nombreux compartiments membranaires que le parasite étend dans le
cytosol du globule rouge. Le parasite se développe ensuite en schizonte, et celui-ci se divise
pour donner de nombreux mérozoïtes, lesquels, après rupture de la membrane érythrocytaire,
vont pouvoir infecter d’autres érythrocytes.

N°
des
Souches
Annexe 6 : Caractères morphologiques des souches d’Actinomycètes isolées
Site
d’isolement
Taille des
colonies
Couleur du
mycélium aérien
Couleur du mycélium
de substrat
Pigmentation
Annexes
Poids des
extraits
(mg)
1 Site 3 Moyenne Blanche Blanche - 425
2 Site 2 Petite Orange Orange Jaune orangé 425
3 Site 3 Moyenne Orange Jaune orangé - 300
4 Site 2 Petite Blanche Blanche - 325
5 Site 1 Petite Rouge Orange - 325
6 Site 1 Moyenne Grise Grise - 450
7 Site 1 Petite Marron Marron - 500
8 Site 1 Moyenne Jaune Jaune jaune 325
9 Site 1 Grande Jaune orangé Orange - 425
10 Site 3 Grande Jaune poussin Jaune - 475
11 Site 2 Moyenne Rouge Rouge - 425
12 Site 1 Petite Verte Grise - 500
13 Site 3 Moyenne Marron Marron - 475
14 Site 2 Grande Blanche Jaune - 475
15 Site 3 Petite Orange Orange -- 425
16 Site 1 Moyenne Blanche Orange - 375
17 Site 3 Moyenne Rose Rose - 425
18 Site 2 Grande Jaune Jaune - 425
19 Site 1 Petite Marron Marron claire - 375
20 Site 2 Grande Jaune pale Jaune - 325
21 Site 2 Moyenne Blanche Blanche - 325
22 Site 1 Petite Marron claire Marron - 500
23 Site 1 Moyenne Marron Marron - 525
24 Site 1 Petite Grise Gris foncé - 425
25 Site 1 Moyenne Jaune pale Jaune - 375
26 Site 1 Moyenne Jaune Jaune foncé - 375
27 Site 2 Moyenne Blanche Blanche - 425
28 Site 2 Petite Jaune Jaune - 425
29 Site 3 Petite Marron Marron Marron claire 425

Annexes
30 Site 1 Moyenne Jaune Blanche - 500
31 Site 3 Grande Orange Rouge orangé rouge 375
32 Site 2 Moyenne Verte Verte - 400
33 Site 3 Grande Orange Orange - 475
34 Site 2 Moyenne Grise Verte - 525
35 Site 3 Petite Jaune Jaune - 425
36 Site 1 Moyenne Marron Marron - 375
37 Site 1 Petite Blanche Blanche - 475
38 Site 3 Moyenne Rouge Rouge Rouge 500
39 Site 1 Petite Marron Grise - 525
40 Site 1 Petite Marron Grise Marron 350
41 Site 1 Grande Rouge Rouge - 350
42 Site 2 Moyenne Grise Grise - 400
43 Site 2 Petite Jaune poussin Jaune - 425
44 Site 3 Grande Jaune Blanche - 525
45 Site 1 Grande Rose Rouge - 350
46 Site 2 Grande Jaune Jaune - 375
47 Site 1 Moyenne Jaune Jaune - 425
48 Site 3 Moyenne Grise Verte - 375
49 Site 2 Petite Jaune Jaune - 475
50 Site 2 Moyenne Jaune Jaune - 500
51 Site 3 Petite Rouge Violette - 500
52 Site 1 Petite Blanche Marron Marron 375
53 Site 2 Petite Blanche Marron Marron 350
54 Site 2 Moyenne Marron Marron Marron 475
55 Site 1 Petite Jaune Jaune - 450
56 Site 1 Petite Jaune poussin Jaune - 550
57 Site 1 Moyenne Rouge Rouge - 475
58 Site 3 Moyenne Blanche Jaune jaune 425
59 Site 3 Petite Marron Orange - 375
60 Site 2 Grande Rouge Rouge - 375
61 Site 3 Moyenne Blanche Jaune - 500
62 Site 2 Grande Marron Marron - 350
63 Site 3 Moyenne Jaune poussin Jaune - 475

Annexes
64 Site 1 Moyenne Jaune Jaune - 475
65 Site 3 Petite Verte Verte - 425
66 Site 2 Moyenne Marron Marron - 375
67 Site 1 Grande Marron Marron foncé Marron 425
68 Site 2 Moyenne Jaune Jaune - 500
69 Site 3 Petite Rouge Rose - 525
70 Site 2 Moyenne Grise Verte - 475
71 Site 1 Moyenne Blanche Blanche - 375
72 Site 2 Petite Marron Marron - 425
73 Site 2 Moyenne Violette Violette - 375
74 Site 1 Moyenne Marron Marron - 475
75 Site 1 Petite Blanche Blanche - 375
76 Site 3 Moyenne Rose Rose - 425
77 Site 1 Grande Rouge Rouge - 375
78 Site 2 Grande Jaune Jaune - 475
79 Site 3 petite Jaune Jaune - 375
80 Site 1 Petite Blanche Blanche - 500
81 Site 3 Petite Rouge Rose - 425
82 Site 1 Grande Violette Violette - 425
Site 1 : forêt primaire, Site 2 : forêt moyennement dégradée, Site 3 : forêt dégradée.

Name : ANDRIAMBOLOLONA
Firstname : Tokiniaina
Title : Biological and chemical studies of secondary metabolites from telluric
Actinomycetes of Ankafobe forest.
ABSTRACT
A total of 82 strains with distinct characteristics of telluric Actinomycetes was isolated
from 15 rhisospheric soil samples collected in different sites of Ankafobe forest by three
isolation methods. Of these isolates, 33 were isolated from soil samples of pristing forest ; 26
from medium impact and 23 from high impact.
These isolates were fermented in solid media to product extracts rich in secondary
metabolites. Extraction was carried out with the ethanol to 50%. Antimicrobial activity of
these extracts was detected using agar diffusion method against pathogenic strains of bacteria
and yeast. 42 among 82 tested extracts were found to be active against test organisms
selectively against Gram-positive organisms than Gram-negative organisms. Antimalaria
activity showed that only 3 extracts out of 82 inhibited the growth of Plasmodium falciparum.
The extract 74 (from strain 74) presenting a board spectrum of activity against
Staphylococcus aureus (with MIC value 1.25mg/ml and MBC 10mg/ml), was the subject of
chemical study. Bioguided fractionation of the extract 74 was allowed to obtain 5 active
fractions against Staphylococcus aureus. The combination of the two techniques (TLC-
biautography and revelation of the plates with specific chemicals) showed that molecules
responsible of extract 74’s activity are terpenic nature associated with undetermined
compounds.
Keys words : telluric Actinomycetes, secondary metabolites, antimicrobial activity,
antimalaria.
Advisors : Pr RAHERIMANDIMBY Marson
Dr RASOLOMAMPIANINA Rado

Nom : ANDRIAMBOLOLONA
Prénom : Tokiniaina
Titre : Etudes biologiques et chimiques des métabolites secondaires
d’Actinomycètes telluriques : cas de la forêt d’Ankafobe.
RESUME
Un total de 82 souches se rapprochant par leurs aspects macroscopiques des
Actinomycètes telluriques a été isolé à partir de 15 échantillons de sols rhizospheriques de
différents sites de la forêt d’Ankafobe en utilisant trois méthodes d’isolement. Parmi ces
isolats, 33 ont été isolés à partir des échantillons de sol de forêt primaire, 26 à partir de forêt
moyennement dégradée et 23 autres à partir de la forêt dégradée.
Ces souches ont été cultivées par fermentation solide afin de produire des extraits
riches en métabolites secondaires. L’extraction a été effectuée avec de l’éthanol à 50%.
L’activité antibactérienne des extraits de métabolites secondaires a été mise en évidence par
un test antibiogramme, en utilisant la technique de diffusion sur gélose sur des souches de
bactéries et de levure pathogènes. La plupart des extraits (42 sur les 82 testés) ont présenté
une activité inhibitrice à l'égard des souches bactériennes testées. Les extraits semblent être
plus actifs sur les bactéries à Gram positifs que sur les bactéries à Gram négatifs. Le test
antimalaria a montré que 3 extraits sur les 82 inhibent le développement de Plasmodium
falciparum.
L’extrait 74 (issu de la souche 74), présentant une activité importante sur
Staphylococcus aureus avec une CMI égale à 1,25mg/ml et une CMB proche de 10mg/ml, a
fait l’objet d’étude chimique. Le fractionnement bioguidé de l’extrait 74 a permis d’avoir 5
fractions actives sur Staphylococcus aureus. La combinaison des deux techniques (CCM-
bioautographie et révélation des plaques avec des réactifs spécifiques) permet de montrer que
les molécules responsables de l’activité de l’extrait 74 sont de nature terpénique associée à
des composés non déterminés.
Mots-clés : Actinomycètes telluriques, métabolites secondaires, activité antibactérienne,
antimalaria.
Encadreurs : Pr RAHERIMANDIMBY Marson
Dr RASOLOMAMPIANINA Rado