Le moustique Culex pipiens, vecteur potentiel des virus ... - Toubkal

Figure 22. Femelle en cours de récupération de sa salive en utilisant la technique de salivation
3.5. Le titrage des salives
forcée.
Les cellules Vero sont cultivées, dans des plaque à 6 puits, en milieu de
cultureDulbecco’s Minimum Eaggle medium Glutamax (Gibco, Invitrogen)
supplémenté en SVF à 10% et en antibiotiques (pénicilline 1000 UI/mL et
streptomycine 1 mg/mL). Le lendemain de la confluence des cellules, le tapis
cellulaire est infecté avec des dilutions de 10 en 10 de la salive dans du milieu de
culture. Un volume de 250 µL est utilisé comme inoculum et adsorbé pendant 1 h à
37°C. Par la suite, on rajoute du milieu de culture à 2% SVF, 1% antibiotique-
antimycotique (Gibco, Invitrogen) et 1% d’agarose. Les cellules sont incubées à 37°C
et dans une atmosphère à 5 % de CO2 pendant 4 (VWN) ou 5 jours (VFVR). Au
terme de la période d’incubation, le milieu gélifié est éliminé et les cellules sont fixées
et colorées avec une solution contenant du cristal violet (0,2%), de la formaldéhyde
(10%) et de l’éthanol (20%). Les plaques sont lavées à l’eau puis séchées et les
plages de lyses sont comptées. Le nombre de particules virales dans chaque salive
est exprimé en UFP/salive.
3.6. L’immunofluorescence indirecte sur squashs de tête
La détection du virus se fait par immunofluorescence indirecte sur squash de
tête des moustiques (Kuberski & Rosen, 1977). Pour ce faire, les femelles sont
décapitées à l’aide d’un scalpel sur une lame de verre à la fin de la salivation. Une
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