Le moustique Culex pipiens, vecteur potentiel des virus ... - Toubkal
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Figure 22. Femelle en cours de récupération de sa salive en utilisant la technique de salivation<br />
3.5. <strong>Le</strong> titrage <strong>des</strong> salives<br />
forcée.<br />
<strong>Le</strong>s cellules Vero sont cultivées, dans <strong>des</strong> plaque à 6 puits, en milieu de<br />
cultureDulbecco’s Minimum Eaggle medium Glutamax (Gibco, Invitrogen)<br />
supplémenté en SVF à 10% et en antibiotiques (pénicilline 1000 UI/mL et<br />
streptomycine 1 mg/mL). <strong>Le</strong> lendemain de la confluence <strong>des</strong> cellules, le tapis<br />
cellulaire est infecté avec <strong>des</strong> dilutions de 10 en 10 de la salive dans du milieu de<br />
culture. Un volume de 250 µL est utilisé comme inoculum et adsorbé pendant 1 h à<br />
37°C. Par la suite, on rajoute du milieu de culture à 2% SVF, 1% antibiotique-<br />
antimycotique (Gibco, Invitrogen) et 1% d’agarose. <strong>Le</strong>s cellules sont incubées à 37°C<br />
et dans une atmosphère à 5 % de CO2 pendant 4 (VWN) ou 5 jours (VFVR). Au<br />
terme de la période d’incubation, le milieu gélifié est éliminé et les cellules sont fixées<br />
et colorées avec une solution contenant du cristal violet (0,2%), de la formaldéhyde<br />
(10%) et de l’éthanol (20%). <strong>Le</strong>s plaques sont lavées à l’eau puis séchées et les<br />
plages de lyses sont comptées. <strong>Le</strong> nombre de particules virales dans chaque salive<br />
est exprimé en UFP/salive.<br />
3.6. L’immunofluorescence indirecte sur squashs de tête<br />
La détection du <strong>virus</strong> se fait par immunofluorescence indirecte sur squash de<br />
tête <strong>des</strong> <strong>moustique</strong>s (Kuberski & Rosen, 1977). Pour ce faire, les femelles sont<br />
décapitées à l’aide d’un scalpel sur une lame de verre à la fin de la salivation. Une<br />
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