Le moustique Culex pipiens, vecteur potentiel des virus ... - Toubkal

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Figure 21. Infections expérimentales des moustiques en laboratoire P3 3.4. La salivation forcée Au terme de la période d’incubation qui a été définie à 14 jours pour le VWN, 14 et 21 jours pour le VFVR, les femelles sont immobilisées par le froid, les ailes et les pattes sont arrachées puis le proboscis est introduit dans un cône contenant 5 µL de sérum de veau fœtal (SVF; figure 22). Après 45 min, le contenu du cône est mis en suspension dans 45 µL du milieu Leibovitz L15 (Gibco, Invitrogen) à 10 % de SVF. Les salives et les femelles ayant salivé sont conservées à -80°C jusqu’à leur analyse. Le nombre de particules virales a été estimé en UFP/salive. Le taux de transmission (TT) représente le nombre de femelles ayant une salive infectée sur le nombre total de femelles testées. 46
Figure 22. Femelle en cours de récupération de sa salive en utilisant la technique de salivation 3.5. Le titrage des salives forcée. Les cellules Vero sont cultivées, dans des plaque à 6 puits, en milieu de cultureDulbecco’s Minimum Eaggle medium Glutamax (Gibco, Invitrogen) supplémenté en SVF à 10% et en antibiotiques (pénicilline 1000 UI/mL et streptomycine 1 mg/mL). Le lendemain de la confluence des cellules, le tapis cellulaire est infecté avec des dilutions de 10 en 10 de la salive dans du milieu de culture. Un volume de 250 µL est utilisé comme inoculum et adsorbé pendant 1 h à 37°C. Par la suite, on rajoute du milieu de culture à 2% SVF, 1% antibiotique- antimycotique (Gibco, Invitrogen) et 1% d’agarose. Les cellules sont incubées à 37°C et dans une atmosphère à 5 % de CO2 pendant 4 (VWN) ou 5 jours (VFVR). Au terme de la période d’incubation, le milieu gélifié est éliminé et les cellules sont fixées et colorées avec une solution contenant du cristal violet (0,2%), de la formaldéhyde (10%) et de l’éthanol (20%). Les plaques sont lavées à l’eau puis séchées et les plages de lyses sont comptées. Le nombre de particules virales dans chaque salive est exprimé en UFP/salive. 3.6. L’immunofluorescence indirecte sur squashs de tête La détection du virus se fait par immunofluorescence indirecte sur squash de tête des moustiques (Kuberski & Rosen, 1977). Pour ce faire, les femelles sont décapitées à l’aide d’un scalpel sur une lame de verre à la fin de la salivation. Une 47
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L’UNIVERSITE MOHAMMED V-AGDAL FAC
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Mes remerciements vont aussi à Mr
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