Le moustique Culex pipiens, vecteur potentiel des virus ... - Toubkal
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L’UNIVERSITE MOHAMMED V-AGDAL<br />
FACULTE DES SCIENCES<br />
RABAT<br />
THESE DE DOCTORAT<br />
Présentée par<br />
Fadila Amraoui<br />
Discipline: Biologie<br />
Spécialité: Virologie - Entomologie<br />
N° d’ordre: 2589<br />
<strong>Le</strong> <strong>moustique</strong> <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong>, <strong>vecteur</strong> <strong>potentiel</strong> <strong>des</strong><br />
<strong>virus</strong> West Nile et fièvre de la vallée du Rift dans la<br />
région du Maghreb<br />
Devant le jury composé de:<br />
Président:<br />
Soutenue le 10 juillet 2012<br />
Saaïd Amzazi, Professeur à la faculté <strong>des</strong> Sciences, Rabat<br />
Examinateurs:<br />
Youssef Bakri, Professeur à la faculté <strong>des</strong> Sciences, Rabat<br />
Anna-Bella Failloux, Directeur du laboratoire Arbo<strong>virus</strong> et Insectes Vecteurs, Institut Pasteur, Paris, France<br />
M’hammed Sarih, Directeur du laboratoire Maladies Vectorielles, Institut Pasteur du Maroc<br />
M’hamed Tijane, Professeur à la faculté <strong>des</strong> Sciences, Rabat
Avant propos<br />
Cette thèse a été réalisée dans le cadre d’une collaboration entre le Laboratoire<br />
d’Immunologie et Biochimie à la Faculté <strong>des</strong> Sciences de Rabat, le Laboratoire <strong>des</strong><br />
Arbo<strong>virus</strong> et Insectes Vecteurs à l’Institut Pasteur à Paris, France et le Laboratoire<br />
<strong>des</strong> Maladies Vectorielles à l’Institut Pasteur du Maroc.<br />
<strong>Le</strong>s travaux de cette thèse ont été effectués sous la direction de Mr M’hamed<br />
Tijane, Mme Anna-Bella Failloux et Mr M’hammed Sarih.<br />
Je remercie vivement Mr M’hamed Tijane, Professeur à la Faculté <strong>des</strong> Sciences<br />
à Rabat et Directeur du Laboratoire Immunologie et Biochimie qui s’est toujours<br />
soucié de l’avancement de mes travaux tout au long de ces quatre années. Il a<br />
toujours fait preuve d’enthousiasme, de bonne humeur et d’encouragements qui<br />
m’ont remotivé dans les pério<strong>des</strong> difficiles.<br />
Je remercie du fond du coeur Mme Anna-Bella Failloux, Chef du Laboratoire<br />
Arbo<strong>virus</strong> et Insectes Vecteurs à l’Institut Pasteur à Paris aussi bien pour son<br />
encadrement exemplaire et complet que pour m’avoir accompagné amicalement et<br />
fraternellement dans ce cheminement. Merci pour ses précieux conseils, ses<br />
encouragements ainsi que pour les corrections et les relectures de ce manuscrit. Son<br />
énergie, ses compétences et sa constante disponibilité m’ont beaucoup aidé pour<br />
mener à bien ce travail.<br />
Je remercie chaleureusement Mr M’hammed Sarih, Responsable du<br />
Laboratoire <strong>des</strong> Maladies Vectorielles à l’Institut Pasteur du Maroc, de m’avoir fait<br />
confiance et proposé ce sujet alors même que je ne connaissais rien à l’entomologie.<br />
Merci pour son dynamisme, son soutien et ses conseils qui m’ont permis de mener à<br />
bien cette thèse.<br />
Je remercie le Professeur Saaïd Amzazi, Doyen de la Faculté <strong>des</strong> Sciences de<br />
Rabat, d’avoir accepté de présider ce jury et de critiquer ce travail.
Mes remerciements vont aussi à Mr Youssef Bakri, Professeur à la Faculté <strong>des</strong><br />
Sciences de Rabat d’avoir eu l’amabilité de lire et de juger ce travail.<br />
<strong>Le</strong>s travaux de cette thèse ont été financés par l’Institut Pasteur à Paris, dans le<br />
cadre d’un projet ACIP, sous la référence A-08-2009. Je profite de cette occasion<br />
pour remercier l’Institut Pasteur à Paris pour ce financement et aussi pour m’avoir<br />
accordé une bourse de stage durant une année au Laboratoire Arbo<strong>virus</strong> et Insectes<br />
Vecteurs.<br />
Je remercie le Centre National de la Recherche Scientifique et Technique de<br />
m’avoir accordé une bourse d’excellence pendant 18 mois et ce dans le cadre du<br />
programme <strong>des</strong> bourses de recherche initié par le ministère de l'Éducation Nationale,<br />
de l'Enseignement Supérieur, de la Formation <strong>des</strong> Cadres et de la Recherche<br />
Scientifique.<br />
J’adresse toute ma gratitude et reconnaissance à tous les collègues <strong>des</strong><br />
Instituts Pasteur à Alger et à Tunis qui ont participé activement à ce projet ACIP<br />
notamment, Messieurs Ali Bouattour, Ghazi Krida, Zoubir Harrat et Said Boubidi.<br />
Je remercie Mme Michèle Bouloy de m’avoir accueilli dans son unité de<br />
Génétique Moléculaire <strong>des</strong> Bunya<strong>virus</strong> à l’Institut Pasteur à Paris.<br />
Quoique je fasse, je ne peux remercier assez tous les membres du Laboratoire<br />
Arbo<strong>virus</strong> et Insectes Vecteurs: Marie Vazeille, Laurence Mousson, Karima Zouache,<br />
Jocelyne Alexandre et Camilo Arias Goeta. Merci pour ces qualités humaines et<br />
scientifiques. Merci à Louis Lambrechts, parti sans trop s’éloigner, pour ses précieux<br />
conseils.<br />
Je remercie Melle Najma Boudebouch du Laboratoire <strong>des</strong> Maladies Vectorielles<br />
pour son aide et le temps qu’elle a consacré pour moi.<br />
Je tiens à remercier Mme Chafika Faraj de l’Institut National d’Hygiène à Rabat<br />
et tous les membres de son équipe qui m’ont initié à l’entomologie.
Je remercie tout le personnel de santé publique qui a participé aux prospections<br />
<strong>des</strong> gîtes larvaires à Tanger, Marrakech, Mohammedia et Casablanca. Merci pour<br />
leur patience et aide ainsi que pour les récoltes abondantes de larves.<br />
Je ne saurais jamais remercier ma famille et mes amis pour leur soutien<br />
permanent, leurs encouragements tout au long de mes étu<strong>des</strong>, sans lequel je ne<br />
serai jamais arrivée à ce stade de réussite. Comme vous êtes nombreux je ne peux<br />
nommer tout le monde, mais je sais que vous vous reconnaitrez.
Articles publiés:<br />
Travaux scientifiques<br />
Fadila Amraoui, Ghazi Krida, Ali Bouattour, Adel Rhim, Jabeur Daaboub, Zoubir<br />
Harrat, Said-Chawki Boubidi, Mhamed Tijane, Mhammed Sarih, Anna-Bella Failloux<br />
(2012). <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong>, an experimental efficient vector of West Nile and Rift valley<br />
fever <strong>virus</strong>es in the Maghreb region. PLoS ONE 7(5): e36757.<br />
doi:10.1371/journal.pone.0036757<br />
Fadila Amraoui, Mhamed Tijane, Mhammed Sarih, Anna-Bella Failloux (2012).<br />
Molecular evidence of <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong> form molestus and hybrids <strong>pipiens</strong>/molestus in<br />
Morocco, North Africa. Parasites & Vectors 5: 83.<br />
doi:10.1186/1756-3305-5-83<br />
Communications:<br />
Fadila Amraoui, Ali Bouattour, Ghazi Krida, Zoubir Harrat, Said Boubidi, Mhamed<br />
Tijane, Mhammed Sarih, Anna-Bella Failloux. Vector competence of <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong> for<br />
West Nile and Rift Valley Fever <strong>virus</strong>es in the Maghreb region. 8-10 novembre 2011.<br />
Institut Pasteur International Network Meeting (Paris, France). Commented Poster.<br />
Fadila Amraoui, Ali Bouattour, Ghazi Krida, Zoubir Harrat, Said Boubidi, Mhamed<br />
Tijane, Mhammed Sarih, Anna-Bella Failloux. Vector competence of <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong> for<br />
West Nile and Rift Valley Fever <strong>virus</strong>es in the Maghreb region. 16-18 novembre<br />
2011. Journées Départementales de Virologie de l’Institut Pasteur de Paris (<strong>Le</strong><br />
Touquet, France). Communication affichée.
Résumé<br />
<strong>Le</strong> <strong>virus</strong> West Nile (VWN) et le <strong>virus</strong> de la fièvre de la vallée du Rift (VFVR) sont deux<br />
<strong>virus</strong> à ARN, transmis essentiellement par <strong>des</strong> <strong>moustique</strong>s.<br />
<strong>Le</strong> VWN (Flaviviridae, Flavi<strong>virus</strong>) est largement reparti dans le monde. Il est<br />
maintenu au sein d’un cycle enzootique faisant intervenir les oiseaux comme hôtes<br />
amplificateurs. L'infection de l'homme et <strong>des</strong> équidés est accidentelle et les deux<br />
hôtes sont considérés comme <strong>des</strong> culs de sacs épidémiologiques. Par ailleurs, le<br />
VFVR (Bunyaviridae, Phlebo<strong>virus</strong>) est présent en Afrique sub-saharienne, en Egypte<br />
et dans la péninsule arabique. <strong>Le</strong> cycle de transmission du VFVR est complexe, varie<br />
selon la région géographique et touchant essentiellement le bétail et l’homme.<br />
<strong>Le</strong> <strong>moustique</strong> <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong>, largement reparti en Afrique du Nord, a été incriminé<br />
dans la transmission de VWN et du VFVR dans d’autres régions du monde. Dans ce<br />
travail, les populations de Cx. <strong>pipiens</strong> récoltées au Maroc, en Algérie et en Tunisie<br />
ont été infectées avec le VWN et le VFVR avec un titre viral respectif de 10 7,8 et 10 8,5<br />
unité formant plage/mL. <strong>Le</strong>s taux d’infection disséminée (TID) et de transmission (TT)<br />
ont été évalués à j14 et j21 post-infection. Toutes les populations testées ont été<br />
capables de disséminer le VWN au-delà du tube digestif ainsi que libérer <strong>des</strong><br />
particules virales au niveau de la salive. <strong>Le</strong>s TID varient de 59.1% à 100% et les TT<br />
de 25% à 83.3 %. Pour le VFVR, 69,2% <strong>des</strong> populations testées développent une<br />
infection disséminée avec <strong>des</strong> TID variant de 6.2% à 38,1%, et 77,8% présentaient<br />
<strong>des</strong> salives infectieuses avec <strong>des</strong> TT allant de 10% à 47.1%.<br />
Par ailleurs, l’analyse moléculaire basée sur la diversité génétique de la région<br />
flanquante du microsatellite CQ11 a montré que Cx <strong>pipiens</strong> existe au Maroc sous la<br />
forme <strong>pipiens</strong>, la forme molestus et <strong>des</strong> formes hybri<strong>des</strong> <strong>pipiens</strong>/molestus. Ces<br />
différentes formes sont morphologiquement semblables mais présentent <strong>des</strong><br />
caractères bio-écologiques différents pouvant influencer la transmission vectorielle<br />
du VWN et du VFVR.<br />
Cx. <strong>pipiens</strong> est bon <strong>vecteur</strong> en conditions expérimentales pour le VWN et dans une<br />
moindre mesure, pour le VFVR. Cependant, les recherches doivent se poursuivre<br />
afin d’évaluer les compétences vectorielles respectives <strong>des</strong> différentes formes de Cx.<br />
<strong>pipiens</strong> ainsi que leurs préférences trophiques pour mieux appréhender leur rôles<br />
épidémiologiques. Ces données sont essentielles pour mesurer le risque<br />
d’introduction et d’installation de ces arboviroses dans le Maghreb, les pays du<br />
pourtour méditerranéen et également, en Europe.<br />
Mots clés: <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong>, <strong>virus</strong> West Nile, <strong>virus</strong> de la fièvre de la vallée du Rift,<br />
compétence vectorielle, taxonomie moléculaire, région du Maghreb.
Abstract<br />
West Nile <strong>virus</strong> (WNV) and Rift Valley fever <strong>virus</strong> (RVFV) are two emerging<br />
arbo<strong>virus</strong>es causing epidemics outside their natural range of distribution.<br />
WNV (Flaviviridae, Flavi<strong>virus</strong>) is one of the most broadly distributed arbo<strong>virus</strong>es in<br />
the world, being found on all continents. Recent outbreaks of WNV were recorded all<br />
over the Mediterranean region. WNV has been isolated from horses and birds in<br />
Algeria, Morocco and Tunisia, indicating an active circulation of the <strong>virus</strong> in this<br />
region. Emergences may occur when adequate vector and susceptible vertebrate<br />
host populations intersect under permissive climatic conditions. Moreover, RVFV<br />
(Bunyaviridae, Phlebo<strong>virus</strong>) is endemic to countries bordering the Maghreb region.<br />
Illegal importations of viremic livestocks along trade routes have been suspected to<br />
introduce the <strong>virus</strong> and initiate local viral transmission.<br />
<strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong> is widely found in North Africa. This species has been incriminated in<br />
the transmission of different arbo<strong>virus</strong>es including WNV and RVFV. In this context,<br />
we define the importance of Cx. <strong>pipiens</strong> as vector of both <strong>virus</strong>es in the Maghreb<br />
region. For such, we experimentally infected field collected populations of Cx. <strong>pipiens</strong><br />
from North Africa with WNV and RVFV at titers of 10 7,8 and 10 8,5 plaque forming<br />
units/mL. Disseminated infection and transmission rates were estimated 14-21 days<br />
following the exposure to the infectious blood-meal. We show that 14 days after<br />
exposure to WNV, all mosquito strains developed a high disseminated infection and<br />
were able to excrete infectious saliva. However, only 69.2% of mosquito strains<br />
developed a disseminated infection with RVFV Clone 13 strain, and among them,<br />
77.8% were able to deliver <strong>virus</strong> through saliva. We showed that Cx. <strong>pipiens</strong> from the<br />
Maghreb are efficient experimental vectors to transmit WNV and to a lesser extent,<br />
RVFV.<br />
Cx <strong>pipiens</strong> has two recognized forms ‘‘<strong>pipiens</strong>’’ and ‘‘molestus’’ which are<br />
morphologically indistinguishable with distinct behaviors and physiologies that may<br />
influence their vectorial status. In this study, we prospected for these forms in<br />
Morocco by using diagnostic primers <strong>des</strong>igned for the flanking region of microsatellite<br />
CQ11. We established the presence of both forms of Cx. <strong>pipiens</strong> and their hybrids in<br />
Morocco.<br />
Our findings should be confronted to parameters <strong>des</strong>cribing mosquito ecology and<br />
biology. Thus, North Africa should be considered as a bridge region between the<br />
Sub-Saharan region where both <strong>virus</strong>es are endemic circulating within a selvatic<br />
cycle and the northern latitu<strong>des</strong> such as Europe for emergence of vector borne<br />
pathogens. Unintentional introductions of birds or animals may have set the stage for<br />
the emergence of WNV and RVFV in Europe.<br />
Key words: <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong>, West Nile <strong>virus</strong>, Rift valley fever <strong>virus</strong>, vector<br />
competence, molecular identification, Maghreb region.
Ace2: Acetylcholine estérase 2<br />
ADN: Acide désoxyribonucléique<br />
Ae: Ae<strong>des</strong><br />
AN: anautogène<br />
ARN: Acide ribonucléique<br />
ARNi: ARN interférence<br />
ATP: Adénosine triphosphate<br />
AU: Autogène<br />
BSA: Bovine serum albumin<br />
C6/36: Cellules de <strong>moustique</strong> Ae<strong>des</strong> albopictus<br />
COI: Cytochrome oxydase I<br />
Cs: Culiseta<br />
Cx: <strong>Culex</strong><br />
Liste <strong>des</strong> abréviations<br />
DC-SIGN: Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin<br />
dNTP: Désoxynucléotide triphosphate<br />
FITC: Isocyanate de fluorescéine<br />
FVR: Fièvre de la vallée de Rift<br />
FWN: Fièvre West Nile<br />
Imd: Immune deficiency<br />
Jak: Janus kinase<br />
L: <strong>Le</strong>ishmania<br />
min: Minute<br />
mL: Millilitre<br />
NSs: Facteur de virulence<br />
P: Plamsodium<br />
PBS: Phsphate buffer salt<br />
Ph: Phlebotomus<br />
RE: Reticulum endoplasmique<br />
STAT: Signal Transducer and Activator of Transcription<br />
SVF: Serum de veau foetal<br />
UFP: Unité formant plage<br />
VUSU: <strong>virus</strong> Usutu<br />
Vero: Cellules de reins de singe<br />
VFVR: Virus de la fièvre de la vallée de Rift<br />
VWN: Virus West Nile<br />
µL: Microlitre
Liste <strong>des</strong> figures<br />
Figure 1. Mortalité humaine dûe aux maladies vectorielles.<br />
Figure 2. Quelques arthropo<strong>des</strong> <strong>vecteur</strong>s existants au Maghreb<br />
Figure 3. Distribution géographique du <strong>virus</strong> West Nile<br />
Figure 4. Schéma de la structure (a) et du génome (b) d’un Flavi<strong>virus</strong><br />
Figure 5. Analyse phylogénétique du <strong>virus</strong> West Nile<br />
Figure 6. Cycles de transmission du <strong>virus</strong> West Nile.<br />
Figure 7. Cycle de réplication <strong>des</strong> Flavi<strong>virus</strong><br />
Figure 8. Répartition de la fièvre de la vallée du Rift en Afrique, à Madagascar et<br />
dans la péninsule arabique chez l’animal et chez l’homme<br />
Figure 9. Schéma de la structure et du génome du <strong>virus</strong> de la fièvre de la vallée du<br />
Rift<br />
Figure 10. Analyse phylogénétique du <strong>virus</strong> de la fièvre de la vallée du Rift<br />
Figure 11. Cycles biologique du <strong>virus</strong> de la fièvre de la vallée du Rift<br />
Figure 12. Schéma montrant le cheminement du <strong>virus</strong> dans le corps d’un <strong>moustique</strong><br />
<strong>vecteur</strong><br />
Figure 13. La période d’incubation extrinsèque varie selon la température<br />
Figure 14. Cycle biologique de <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong><br />
Figure 15. Shéma récapitulatif <strong>des</strong> réactions antivirales chez la drosophile<br />
Figure 16. Mécanisme de l’ARN interférence<br />
Figure 17. Immunité antivirale innée et aquise chez l’homme<br />
Figure 18. Sites de récolte de Cx. <strong>pipiens</strong> au Maroc, en Algérie et en Tunisie<br />
Figure 19. Exemples de gîte larvaire de <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong>.<br />
Figure 20. Matériel utilisé lors de l’élevage de <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong>.<br />
Figure 21. Infections expérimentales <strong>des</strong> <strong>moustique</strong>s en laboratoire P3<br />
Figure 22. Femelle en cours de récupération de sa salive en utilisant la technique de<br />
salivation forcée<br />
Figure 23. Tissu de tête de <strong>moustique</strong> analysé par immunofluorescence
Figure 24. Taux de transmission et nombre moyen <strong>des</strong> particules virales présentes<br />
dans la salive de Cx <strong>pipiens</strong> “Tabarka” infecté oralement par le VWN (A) et le<br />
VFVR (B)<br />
Figure 25. Taux d’infection disséminée (A), taux de transmission (B) et nombre<br />
moyen de particules virales par salive (C) pour les populations naturelles de<br />
<strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong>, 14 jours après l’infection avec le <strong>virus</strong> West Nile<br />
Figure 26. Taux d’infection disséminée, taux de transmission et nombre moyen de<br />
particules virales par salive de <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong>, 14 (A, B, C) et 21 jours (D, E, F)<br />
après l’infection avec le <strong>virus</strong> de la fièvre de la vallée du Rift (souche avirulente<br />
Clone 13)<br />
Figure 27. Profils <strong>des</strong> produits d’amplification du microsatellite CQ11 de <strong>Culex</strong><br />
<strong>pipiens</strong> récolté à Casablanca (Maroc).
Liste <strong>des</strong> tableaux<br />
Tableau I. <strong>Le</strong>s cas humains et équins recensés dans la région du Maghreb depuis<br />
l’emergence du <strong>virus</strong> West Nile en 1994<br />
Tableau II. Principales épidemies de la fièvre de la vallée du Rift<br />
Tableau III. Sensibilité <strong>des</strong> animaux au <strong>virus</strong> de la fièvre de la vallée du Rift<br />
Tableau IV. Caractères éco-physiologiques <strong>des</strong> membres du complexe Cx. <strong>pipiens</strong><br />
Tableau V. Marqueurs moléculaires utilisés pour identifier certains membres du<br />
complexe Cx. <strong>pipiens</strong><br />
Tableau VI.Gîtes larvaires échantillonnés en 2010 en Algérie, au Maroc et en Tunisie<br />
Tableau VII. Gîtes larvaires échantillonnés dans différentes régions du Maroc durant<br />
l’été 2010<br />
Tableau VIII. Espèces de larves identifiées dans <strong>des</strong> gites larvaires riches en<br />
matières organiques<br />
Tableau IX. Identification moléculaire <strong>des</strong> populations de Cx. <strong>pipiens</strong> provenant de<br />
Tanger, Casablanca/Mohammedia et Marrakech
Sommaire<br />
Introduction et rappels bibliographiques ............................................................... 1<br />
1. La situation <strong>des</strong> maladies vectorielles dans la région du Maghreb ......................... 2<br />
1.1. <strong>Le</strong>s maladies vectorielles ................................................................................. 2<br />
1.2. <strong>Le</strong>s agents infectieux circulants au Maroc, en Algérie et en Tunisie ................ 3<br />
1.2.1. <strong>Le</strong>s protozoaires....................................................................................................... 4<br />
1.2.2. <strong>Le</strong>s bactéries ............................................................................................................ 5<br />
1.2.3. <strong>Le</strong>s arbo<strong>virus</strong> ............................................................................................................ 5<br />
2. <strong>Le</strong> <strong>virus</strong> West Nile ................................................................................................... 8<br />
2.1. Historique ......................................................................................................... 8<br />
2.2. La structure et le génome ................................................................................. 9<br />
2.3. <strong>Le</strong>s lignages ................................................................................................... 10<br />
2.4. <strong>Le</strong> cycle de transmission ................................................................................ 12<br />
2.5. <strong>Le</strong> cycle de réplication virale .......................................................................... 13<br />
2.6. Pathogénèse et vaccin ................................................................................... 14<br />
3. <strong>Le</strong> <strong>virus</strong> de la fièvre de la vallée du Rift ................................................................ 16<br />
3.1. Historique ....................................................................................................... 16<br />
3.2. La structure et le génome ............................................................................... 18<br />
3.3. <strong>Le</strong> cycle de transmission ................................................................................ 21<br />
3.4. <strong>Le</strong> cycle de réplication virale .......................................................................... 22<br />
3.4. Pathogénèse et vaccin ................................................................................... 23<br />
4. <strong>Le</strong>s <strong>vecteur</strong>s du VWN et VFVR ............................................................................ 25<br />
4.1. La transmission vectorielle et la notion de capacité vectorielle ...................... 25<br />
4.2. <strong>Le</strong>s <strong>vecteur</strong>s du VWN ..................................................................................... 27<br />
4.3. <strong>Le</strong>s <strong>vecteur</strong>s du VFVR ................................................................................... 27<br />
4.4. <strong>Le</strong> complexe <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong>............................................................................. 28<br />
4.4.1. Position systématique ........................................................................................... 28<br />
4.4.2. Bio-écologie ............................................................................................................ 29<br />
4.4.3. <strong>Le</strong>s membres du complexe Cx. <strong>pipiens</strong> ............................................................. 30<br />
5. L’immunité antivirale ............................................................................................. 34<br />
5.1. Chez le <strong>moustique</strong> .......................................................................................... 34<br />
5.1.1. La voie Toll .............................................................................................................. 34
5.1.2. La voie Imd ............................................................................................................. 34<br />
5.1.3. La voie Jak/STAT................................................................................................... 35<br />
5.1.4. L’ARN interférence ................................................................................................ 35<br />
5.2. Chez l’homme ................................................................................................ 36<br />
6. Objectifs de la thèse ............................................................................................. 38<br />
Matériels et métho<strong>des</strong> ............................................................................................ 40<br />
1. Sites de récolte <strong>des</strong> <strong>moustique</strong>s ........................................................................... 41<br />
2. Elevage <strong>des</strong> <strong>moustique</strong>s ....................................................................................... 42<br />
3. Infections expérimentales avec les <strong>virus</strong> WN et FVR ........................................... 44<br />
3.1. <strong>Le</strong>s populations de <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong> ............................................................................ 44<br />
3.2. <strong>Le</strong>s souches virales ................................................................................................... 45<br />
3.3. <strong>Le</strong> repas sanguin infectieux ...................................................................................... 45<br />
3.4. La salivation forcée ........................................................................................ 46<br />
3.5. <strong>Le</strong> titrage <strong>des</strong> salives ...................................................................................... 47<br />
3.6. L’immunofluorescence indirecte sur squashs de tête ..................................... 47<br />
4. <strong>Le</strong>s analyses statistiques ...................................................................................... 49<br />
5. Taxonomie moléculaire de <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong> au Maroc ............................................. 49<br />
5.1. Populations de Cx. <strong>pipiens</strong> ............................................................................. 49<br />
5.2. Extraction de l’ADN génomique ...................................................................... 50<br />
5.3. Réaction PCR ................................................................................................. 50<br />
Résultats et discussion .......................................................................................... 52<br />
1. Compétence vectorielle de <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong> vis-à-vis du <strong>virus</strong> West Nile et <strong>virus</strong> de la<br />
fièvre de la vallée du Rift .......................................................................................... 53<br />
1.1. Résultats ........................................................................................................ 53<br />
1.1.1. Réceptivité au VWN ................................................................................... 53<br />
1.1.2. Réceptivité au VFVR .................................................................................. 57<br />
1.2. Discussion ...................................................................................................... 60<br />
Article 1: <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong>, an experimental efficient vector of West Nile and Rift valley<br />
fever <strong>virus</strong>es in the Maghreb region ......................................................................... 63<br />
2. <strong>Le</strong> statut taxonomique du complexe <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong> au Maroc ............................... 72
2.1. Résultats ........................................................................................................ 72<br />
2.2. Discussion ...................................................................................................... 74<br />
Article 2: Molecular evidence of <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong> form molestus and hybrids<br />
<strong>pipiens</strong>/molestus in Morocco, North Africa ................................................................ 76<br />
Conclusions et perspectives ................................................................................. 81<br />
Références bibliographiques ................................................................................ 85
Introduction et rappels bibliographiques<br />
1
1. La situation <strong>des</strong> maladies vectorielles dans la région du Maghreb<br />
1.1. <strong>Le</strong>s maladies vectorielles<br />
<strong>Le</strong>s maladies vectorielles sont <strong>des</strong> maladies pour lesquelles l’agent infectieux<br />
(<strong>virus</strong>, bactérie, protozoaire ou helminthe) est transmis d’un individu infecté à un<br />
autre, principalement par l’intermédiaire d’un arthropode hématophage (insecte ou<br />
acarien) (Rodhain & Perez, 1985). Il s’agit d’une transmission biologique ou active<br />
car l’agent infectieux accomplit un cycle d’amplification ou de développement au<br />
préalable chez l’arthropode <strong>vecteur</strong>, à la différence d’une transmission mécanique ou<br />
passive qui se traduit par un simple transport de l’agent pathogène.<br />
<strong>Le</strong>s maladies vectorielles sont largement répandues en zone intertropicale, elles se<br />
rencontrent également en zone tempérée voire septentrionale mais restent<br />
relativement rares. Cependant, les maladies vectorielles peuvent générer de fortes<br />
mortalités et morbidités chez l’homme (Figure 1; WHO, 2004). A l’exception de<br />
certaines maladies humaines comme la dengue urbaine, la plupart <strong>des</strong> maladies à<br />
transmission vectorielle sont <strong>des</strong> zoonoses (touchent les animaux) où l'homme est le<br />
plus souvent un hôte accidentel. Ces maladies ont une importance sanitaire et socio-<br />
économique qui s’est accentuée avec les changements que subit le monde. En effet,<br />
les changements climatiques et anthropiques déclenchent l’émergence, la<br />
réémergence ou la recru<strong>des</strong>cence inattendue de certaines maladies vectorielles.<br />
C’était le cas de l’introduction du VWN (CDC, 1999) en Amérique du Nord,<br />
l'apparition du <strong>virus</strong> de l'encéphalite japonaise en Australie (Mackenzie, 1999) et<br />
l’émergence du <strong>virus</strong> Usutu (VUSU) en Europe centrale (Weissenböck et al., 2001).<br />
2
Figure 1. Mortalité humaine dûe aux maladies vectorielles. La carte montre la mortalité attribuée<br />
aux maladies à transmission vectorielle en fonction <strong>des</strong> pays (WHO, 2004).<br />
1.2. <strong>Le</strong>s agents infectieux circulants au Maroc, en Algérie et en Tunisie<br />
Dans la région du Maghreb, plusieurs maladies vectorielles sont présentes et<br />
importantes sur le plan de la santé publique. Elles sont dûes à <strong>des</strong> <strong>virus</strong>, <strong>des</strong><br />
bactéries ou <strong>des</strong> protozoaires et sont transmises par <strong>des</strong> arthropo<strong>des</strong> <strong>vecteur</strong>s,<br />
principalement <strong>des</strong> <strong>moustique</strong>s, <strong>des</strong> tiques, <strong>des</strong> phlébotomes, <strong>des</strong> moucherons<br />
(Culicoï<strong>des</strong>), <strong>des</strong> poux ou <strong>des</strong> puces (Figure 2). La situation relative à ces maladies<br />
est abordée ci-<strong>des</strong>sous selon la nature de l’agent infectieux.<br />
3
Figure 2. Quelques arthropo<strong>des</strong> <strong>vecteur</strong>s existants au Maghreb<br />
(a) Moustique (Culicidae), (b) Tique dure (Ixodidae), (c) Tique molle (Argasidae), (d) Phlébotome<br />
(Psychodidae) (e) Culicoï<strong>des</strong> (Ceratopogonidae), (f) Poux (Pediculidae), (g) Puce (Pulicidae).<br />
1.2.1. <strong>Le</strong>s protozoaires<br />
Dans la région du Maghreb, le paludisme est causé par deux parasites du<br />
genre Plasmodium: P. falciparum et P. vivax. Toutes les espèces de Plasmodium<br />
sont transmises par les <strong>moustique</strong>s du genre Anopheles. La Tunisie et le Maroc ont<br />
été respectivement certifiés exempts de paludisme en 1979 et en 2010 (Weekly<br />
Epidemiological Record, 2010). Quant à l’Algérie, le paludisme y est endémique mais<br />
à faible taux de transmission et le pays est en phase d’élimination du parasite (World<br />
Malaria report, 2011). Cependant, la région du Maghreb reste vulnérable à la<br />
maladie en raison de la persistance de <strong>vecteur</strong>s et la coexistence d'un réservoir<br />
constitué par les cas importés de l’Afrique subsaharienne (Aoun et al., 2010), comme<br />
l’attestent les deux cas autochtones à P. falciparum répertoriés au Maroc (EpiSouth<br />
Weekly Epi Bulletin, 2010).<br />
Quatre espèces de <strong>Le</strong>ishmania circulent dans la région du Maghreb et sont<br />
responsables de leishmaniose cutanée et/ou viscérale: L. infantum (Harrat & Belkaid,<br />
2003; Postigo,2010), L. major (Benikhlef et al., 2004; Chelbi et al., 2009; Rhajaoui,<br />
2011), L. tropica (Guilvard et al., 1991; Kharfi et al., 2003; Mihoubi et al., 2008;<br />
Postigo, 2010) et L. killicki, (Rioux et al., 1986; Harrat et al., 2009). <strong>Le</strong>s <strong>vecteur</strong>s<br />
d’importance les plus répandus sont Phlebotomus papatasi, Ph. sergenti et Ph.<br />
perniciosus.<br />
4
D’autres protozoaires du genre Babesia et Theileria (Darghouth et al., 1996; El<br />
Haj et al., 2002; Bouattour et al., 2004) qui sont transmis par <strong>des</strong> tiques au bétail<br />
constituent une entrave majeure au développement de l’élevage dans la région et<br />
dans d’autres régions du monde (Morzaria, 1991).<br />
1.2.2. <strong>Le</strong>s bactéries<br />
<strong>Le</strong>s bactéries sont transmises essentiellement par <strong>des</strong> tiques, <strong>des</strong> poux ou <strong>des</strong><br />
puces et appartiennent aux genres: Anaplasma (Verhulst et al., 1983), Ehrlichia<br />
(Sarih et al., 2005), Bartonella (Bitam et al., 2008; Boudebouch et al., 2011), Borrelia<br />
(Sarih et al., 2009; Bouattour et al., 2010) et Rickettsia (Sarih et al., 2008; Bitam et<br />
al., 2009). En 2003, Yersinia pestis, agent responsable de la peste qui est transmis à<br />
l’homme par l’intermédiaire de puces infectées, réapparait en Algérie (Bertherat et<br />
al., 2007) où elle continue à se manifester (Bitam et al., 2010).<br />
1.2.3. <strong>Le</strong>s arbo<strong>virus</strong><br />
<strong>Le</strong>s <strong>virus</strong> qui sont transmis par <strong>des</strong> arthropo<strong>des</strong> hématophages sont qualifiés<br />
d’arbo<strong>virus</strong> (arthropod-borne <strong>virus</strong>). <strong>Le</strong>s arbo<strong>virus</strong> appartiennent à cinq familles de<br />
<strong>virus</strong>: Togaviridae, Bunyaviridae, Flaviviridae, Rhabdoviridae et Reoviridae. Il en<br />
existe plus de 500 espèces dont une centaine peut être pathogène pour l’homme.<br />
Dans le grand Maghreb, la fièvre catarrhale est une maladie virale affectant les<br />
ruminants domestiques et sauvages. Elle est due à un Orbi<strong>virus</strong> (Reoviridae)<br />
transmis par certaines espèces du genre Culicoi<strong>des</strong> (moucherons hématophages).<br />
En 1956, la maladie fait son apparition en Afrique du Nord, précisément au Maroc<br />
(Placidi, 1957). Depuis, la maladie reste absente jusqu’à son apparition en Tunisie<br />
en 1999 (sérotype 2), en Algérie en 2000 (sérotype 2) et finalement, au Maroc en<br />
2004 (sérotype 4). A partir de 2006, le sérotype 1 a été introduit dans la région du<br />
Maghreb et <strong>des</strong> foyers de la maladie continuent à être observés (2008, 2009, 2010,<br />
2011) (ProMED-mail, 2011).<br />
5
La fièvre West Nile a fait son apparition en Algérie en 1994 et était responsable<br />
de 20 cas dont 8 décès (<strong>Le</strong> Guenno et al., 1996). En 1997, une deuxième épidémie a<br />
été déclarée dans la région, en Tunisie, faisant 173 cas dont 8 décès (Triki et al.,<br />
2001). Au Maroc, c’est une épizootie qui a été rapportée en 1996 avec 42 équidés<br />
morts (El Harrak et al., 1997). Dès lors, le <strong>virus</strong> a sévi à plusieurs reprises au Maroc<br />
(2003, 2008 et 2010) et en Tunisie (2003, 2008 et 2011) laissant suggérer une<br />
circulation enzootique du <strong>virus</strong> (Tableau I; Schuffenecker et al., 2005; Garbouj et al.,<br />
2003; Figuerola et al., 2009; OIE 2010; ECDC 2011; Ben Hassine et al., 2011).<br />
Tableau I. <strong>Le</strong>s cas humains et équins recensés dans la région du Maghreb depuis l’emergence<br />
du <strong>virus</strong> West Nile en 1994<br />
Pays Période Région Nombres de cas<br />
Algérie 1994 (Aout-septembre) Timimoune 50 patients dont 20<br />
cas cliniques (8<br />
décès)<br />
Maroc 1996 (Aout- octobre) Kenitra et Larache 94 équidés (42<br />
morts) et 1 cas<br />
humain<br />
2003 (Septembre) Kenitra 9 équidés<br />
2010 (Août) Benslimane et<br />
Tunisie 1997 (Septembre -<br />
décembre)<br />
Mohammedia<br />
2003 (Juillet -octobre) Sfax, Mahdia, Monastir,<br />
16 équidés<br />
Sfax et Mahdia 173 cas humains (8<br />
Sousse et Gabés<br />
décès)<br />
31 cas humains<br />
2011 (Novembre) Province de Kebili 3 cas humains<br />
En 1965, la peste équine africaine apparait au Maroc et s’étend rapidement en<br />
Algérie et en Tunisie (Rabah, 1966; Mornet et al., 1967; Sers, 1967; Laaberki, 1969).<br />
6
<strong>Le</strong> <strong>virus</strong> réapparait au Maroc entre 1989 et 1991, avec une perte de 555 équins<br />
(Anonymous, 1992), le seul <strong>vecteur</strong> prouvé étant le moucheron Culicoi<strong>des</strong> imicola.<br />
La maladie épizootique hémorragique touche le bétail et le <strong>virus</strong> est transmis<br />
par <strong>des</strong> culicoï<strong>des</strong>. En 2004 et 2006, une mortalité et une morbidité associées au<br />
<strong>virus</strong> ont été rapportées au Maroc et en Algérie (ProMED-mail, 2006).<br />
Récemment, la fièvre à phlébotomes sicilienne a émergé en Algérie en 2008<br />
(Izri et al., 2008). <strong>Le</strong> VUSU et le VFVR, ne se sont jamais manifestés dans la région<br />
du Maghreb. Cependant, <strong>des</strong> sérologies positives ont été mises en évidence dans<br />
leSud marocain (Figuerola et al., 2009; Ayari-Fakhfakh et al., 2011; El-Harrak et al.,<br />
2011).<br />
7
2. <strong>Le</strong> <strong>virus</strong> West Nile<br />
2.1. Historique<br />
<strong>Le</strong> <strong>virus</strong> West Nile (VWN) ou <strong>virus</strong> du Nil occidental a été isolé pour la première<br />
fois en 1937 dans le district West Nile en Ouganda chez une femme souffrant d’une<br />
forte fièvre (Smithburn et al., 1940). Aujourd’hui, le <strong>virus</strong> est présent sur tous les<br />
continents à l’exception de l’Antarctique (Figure 3) faisant de lui le <strong>virus</strong> le plus<br />
répandu dans le monde (Kramer et al., 2008).<br />
Figure 3. Distribution géographique du <strong>virus</strong> West Nile (en gris) (Mackenzie et al., 2004; Smith,<br />
2007; Kilpatrick, 2011).<br />
La première épidémie dûe au VWN a été rapportée en Israël (1951-1952;<br />
Bernkopf et al., 1953) où les premieres manifestations neurologiques sévères ont été<br />
rapportées en1957 et en 1962(Hayes, 1989). <strong>Le</strong> VWN a également sévi en France<br />
(1962; Joubert et al., 1970) et en Afrique du Sud (1974, 1986-1984; McIntosh et al.,<br />
1976; Jupp et al., 1986).<br />
A partir de 1994, le VWN regagne de l’activité dans l’ancien monde et <strong>des</strong> premiers<br />
cas humains ont été rapportés en Algérie (<strong>Le</strong> Guenno et al., 1996). L’arbo<strong>virus</strong> révèle<br />
une pathogénicité plus importante et est à l’origine de plusieurs épiso<strong>des</strong><br />
8
épidémiques observés chez l’homme et/ou les chevaux. En 1996, une épidémie<br />
éclate à Bucarest (Roumanie) avec plus de 500 cas d'encéphalite dont 17 mortelles<br />
(Tsai et al., 1998). En 1999, 40 décès sont rapportés dans les villes de Volzskii et<br />
Volvograd, en Russie (Platonov et al., 2001) et en 2000, 8 décès rapportés en Israël<br />
(Weinberger et al., 2001). Une situation différente est observée au Maroc (1996), en<br />
Italie (1998) et en France (2000, 2003, 2004 et 2006) où le <strong>virus</strong> a touché<br />
essentiellement les chevaux (El Harrak et al., 1997; Cantile et al., 2000; Murgue et<br />
al., 2001b; Zeller et al., 2004; Durand et al., 2005).<br />
En 1999, le VWN est introduit à New York (USA), 62 cas d'encéphalite humaine (7<br />
décès), 20 cas équins (9 décès) ainsi qu’une grande mortalité aviaire ont été<br />
observés (Novello, 2000; Garmendia et al., 2001). Par la suite, le VWN va élargir son<br />
aire de distribution en atteignant l’ensemble <strong>des</strong> États-Unis ainsi qu’une grande<br />
partie du continent américain, du Canada (Pepperell et al., 2003) jusqu’en Argentine<br />
(Morales et al., 2006).<br />
En 2011, 712 et 110 cas ont été déclarés respectivement aux USA et Canada (CDC,<br />
2011; PHAC, 2011) et 303 cas sont recensés entre l’Europe et ses pays voisins<br />
(ECDC, 2011).<br />
2.2. La structure et le génome<br />
<strong>Le</strong> VWN est un Flavi<strong>virus</strong> de la famille <strong>des</strong> Flaviviridae. C’est un <strong>virus</strong> sphérique<br />
de 50 nm de diamètre. <strong>Le</strong> génome viral est un ARN simple brin de polarité positive,<br />
comportant un seul cadre ouvert de lecture d’environ 11 000 nucléoti<strong>des</strong>. Cet ARN<br />
code une polyprotéine d’environ 3400 aci<strong>des</strong> aminés dont les clivages co et post-<br />
traductionnels génèrent trois protéines structurales (protéines C de la capside, prM<br />
/M de la membrane et E de l’enveloppe) et sept protéines non structurales (NS1,<br />
NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5) nécessaires à la réplication virale et qui<br />
jouent <strong>des</strong> rôles importants dans la transcription virale, la traduction, la réplication, la<br />
maturation, et l'évasion immunitaire (Diamond et al., 2009). L’ARN viral est flanqué à<br />
ses deux extrémités de séquences non codantes (NC) nécessaires à l’initiation de la<br />
réplication et de la traduction (Figure 4).<br />
9
L’ARN viral se lie aux protéines de la capside et le tout est entouré d’une enveloppe<br />
dans laquelle sont ancrées 180 copies <strong>des</strong> protéines M et E fortement glycosylées<br />
(Mukhopadhyay et al., 2003).<br />
(a) (b)<br />
Figure 4. Schéma de la structure (a) et du génome (b) d’un Flavi<strong>virus</strong>. <strong>Le</strong> <strong>virus</strong> est enveloppé et<br />
son génome est un ARN simple brin de polarité positive codant pour 3 protéines structurales<br />
(Capside, Membrane et Enveloppe) et 7 protéines non structurales (Petersen &Roehrig, 2001).<br />
2.3. <strong>Le</strong>s lignages<br />
Des analyses phylogénétiques basées sur l’analyse <strong>des</strong> séquences<br />
nucléotidiques d’un fragment de 255 pb du gène codant pour la glycoprotéine E, ont<br />
montré que les isolats du VWN de différentes régions géographiques sont classés en<br />
deux lignages majeures (1 et 2), présentant 25 à 30% de différences nucléotidiques<br />
(Berthet et al., 1997; Lanciotti et al., 2002) et plusieurs sous-cla<strong>des</strong> ou clusters<br />
(Figure 5a; Berthet et al., 1997; Lanciotti et al., 1999; Savage et al., 1999; Scherret et<br />
al., 2001; Charrel et al., 2003).<br />
<strong>Le</strong> lignage 1 regroupe <strong>des</strong> souches qui circulent en Afrique de l’Ouest, Moyen Orient,<br />
Europe de l’Est, Amérique du Nord et Australie. <strong>Le</strong> lignage 2 a une répartition<br />
géographique restreinte; il circule en Afrique sub-saharienne et Madagascar.<br />
Récemment, il a été retrouvé en Europe et plus précisement, en Hongrie, en Grèce<br />
et en Italie (Bakonyi et al., 2006; Bagnarelli et al., 2011; Papa et al., 2011).<br />
D’autres souches du VWN ont été isolées et présentent <strong>des</strong> différences génétiques<br />
considérables par rapport aux deux lignages 1 et 2 (Figure 5b; Lvov et al., 2004); le<br />
lignage 3 inclût le <strong>virus</strong> Rabensburg isolé en République Tchèque en 1997 (Bakonyi<br />
10
et al., 2005), le lignage 4 est représenté par une seule souche isolée en Russie<br />
(Caucase en 1998; Bakonyi et al., 2005) et le lignage 5 correspond à une souche<br />
isolée en Inde en 1980 (Bondre et al., 2007).<br />
a b<br />
Figure 5. Analyse phylogénétique du <strong>virus</strong> West Nile (Lanciotti et al., 1999; Papa et al., 2011).<br />
11
2.4. <strong>Le</strong> cycle de transmission<br />
Après la découverte du VWN, <strong>des</strong> premiers travaux ont été conduits en Egypte,<br />
en couplant les volets entomologiques, vétérinaires et humains et ont révélé<br />
l’implication <strong>des</strong> <strong>moustique</strong>s de genre <strong>Culex</strong> comme <strong>vecteur</strong>s principaux et <strong>des</strong><br />
oiseaux comme principaux hôtes amplificateurs qui développent une virémie<br />
suffisante pour permettre l’infection <strong>des</strong> <strong>moustique</strong>s lors de la prise du repas de<br />
sang. Après une période d'incubation extrinsèque, le <strong>moustique</strong> peut infecter d’autres<br />
oiseaux. Ainsi, le <strong>virus</strong> est maintenu dans un cycle enzootique «oiseau-<strong>moustique</strong>-<br />
oiseau». Ces travaux ont montré également la présence d’infections «cul de sac»<br />
chez le cheval et l’homme qui sont incapables de développer une virémie suffisante<br />
pour permettre par la suite l’infection du <strong>moustique</strong> (Work et al., 1953, 1955; Hurlbut,<br />
1956; Hurlbut et al., 1956; Taylor et al., 1956).<br />
<strong>Le</strong> VWN a pu disséminer d’un pays à l’autre et d’un hémisphère à l’autre par<br />
l’intermédiaire <strong>des</strong> oiseaux migrateurs (Nir et al., 1967; Hannoun et al., 1969, 1972;<br />
Watson et al., 1972; Berthet et al., 1997). Dans le cas de l’introduction du <strong>virus</strong> de<br />
l’ancien vers le nouveau monde, il s’agit d’une introduction liée aux activités<br />
commerciales et non via la migration <strong>des</strong> oiseaux (Figure 6; Weaver & Barrett, 2004).<br />
D’autres cycles de transmission ont été décrits impliquant certains amphibiens ou<br />
reptiles comme hôtes amplificateurs (Kostyukov et al., 1985; Klenk et al., 2004).<br />
Figure 6. Cycle de transmission du <strong>virus</strong> West Nile. <strong>Le</strong> VWN est maintenu au sein d’un cycle<br />
enzootique «<strong>moustique</strong>-oiseaux» et la contamination de l’homme et du cheval est accidentelle.<br />
12
2.5. <strong>Le</strong> cycle de réplication virale<br />
La premiere étape du cycle viral est l’attachement <strong>virus</strong> sur la surface cellulaire<br />
qui implique une interaction entre la protéine d’enveloppe E et <strong>des</strong> récepteurs<br />
spécifiques de la surface cellulaire (Figure 7). <strong>Le</strong>s récépteurs DC-SIGN, alphaVbeta3<br />
integrin (Bogachek et al., 2010) et laminin-binding protein (Bogachek et al., 2008) ont<br />
été rapportés comme <strong>potentiel</strong> récepteurs. Un processus d’endocytose récepteur-<br />
dépendante conduit alors à l’internalisation de la particule virale dans une vésicule à<br />
clathrines (Chu & Ng, 2004). Une acidification de l’endosome s’opère entrainant un<br />
changement de conformation de la proteine E et induisant ainsi la fusion de<br />
l’enveloppe virale et de la membrane endosomale (Gollins & Porterfield, 1986). La<br />
nucléocapside est libérée dans le cytoplasme de la cellule hôte et l’ARN génomique<br />
est décapsidé. Ce dernier etant de polarité positive, fait office d’ARNm et est transcrit<br />
en une seule polyproteine. La maturation protéolytique de la polyprotéine virale, puis<br />
de ces produits de clivage, génère les trois protéines structurales et les sept<br />
protéines non-structurales.<br />
<strong>Le</strong>s protéines virales NS3 et l’ARN polymérase ARN-dépendante NS5 (Rice et al.,<br />
1986; Poch et al., 1989) s’associent probablement à <strong>des</strong> protéines cellulaires pour<br />
former un complexe de réplication réalisant la synthèse de brins d’ARN (-). Ceux-ci<br />
servent à leur tour de matrice pour la synthèse de brins d’ARN (+) <strong>des</strong>tinés soit à<br />
être traduits, soit à être encapsidés dans les virions en cours de maturation. <strong>Le</strong>s<br />
proteines de capside s’assemblent avec l’ARN viral pour former la nucléocapside.<br />
<strong>Le</strong>s nucléocapsi<strong>des</strong> nouvellement formées seraient ensuite internalisées dans la<br />
lumière du réticulum endoplasmique (RE) selon un processus de bourgeonnement.<br />
La membrane du RE, dans laquelle sont ancrées les protéines E et prM, formerait<br />
ainsi l’enveloppe <strong>des</strong> virions immatures. Ces derniers seraient ensuite transportés,<br />
dans <strong>des</strong> vésicules de sécrétion, vers l’appareil de Golgi. Dans le réseau trans-<br />
golgien, il a été démontré qu’une protéase cellulaire assure la maturation de<br />
l’enveloppe virale par le clivage de prM en M (Konishi & Mason, 1993). La libération<br />
<strong>des</strong> virions dans le milieu extracellulaire se ferait ensuite par exocytose au travers de<br />
la membrane plasmique (Mukhopadhyay et al., 2005).<br />
13
2.6. Pathogénèse et vaccin<br />
Figure 7. Cycle de réplication <strong>des</strong> Flavi<strong>virus</strong> (Samuel, 2002).<br />
Après une piqure de <strong>moustique</strong>, le flavi<strong>virus</strong> infecte les kératinocytes (Lim et al.,<br />
2011) et les cellules dendritiques de Langerhans migrent aux ganglions lymphatiques<br />
où le <strong>virus</strong> se réplique (Ho et al., 2001; Libraty et al., 2001; Wu et al., 2001),<br />
dissémine par la suite via la circulation sanguine et infecte le rein et la rate, où une<br />
deuxième réplication a lieu. Selon le niveau de virémie, le <strong>virus</strong> peut traverser la<br />
barrière hémato-encéphalique, atteindre le cerveau et cause la méningo-encéphalite.<br />
La période d’incubation de l’arbo<strong>virus</strong> chez l’homme varie entre 2 et 14 jours.<br />
L’infection chez l’homme est souvent asymptomatique. Dans le cas contraire, elle se<br />
traduit par un syndrome pseudogrippal; fièvre, céphalées, myalgies, arthralgies,<br />
asthénie, éruption cutanée, pharyngite, manifestations digestives (nausées,<br />
vomissement, diarrhée, douleurs abdominales). Près de 1 % <strong>des</strong> personnes<br />
développant <strong>des</strong> signes cliniques présentent <strong>des</strong> formes graves avec <strong>des</strong> troubles<br />
neurologiques de type méningites aigues ou encéphalites (Gallian et al., 2005).<br />
Chez les équidés, l’infection varie de simple syndrome pseudo-grippal à une<br />
encéphalite mortelle. <strong>Le</strong>s atteintes neurologiques touchent approximativement 10 %<br />
<strong>des</strong> chevaux infectés dont les signes cliniques sont les suivants: ataxie, contractions<br />
14
musculaires, paralysie partielle, cécité apparente, mouvements d’appui de la tête,<br />
grincements de dents, désorientation, convulsions. L’affaiblissement, généralement<br />
localisé au niveau <strong>des</strong> membres postérieurs, est parfois suivi de paralysie.<br />
L’infection chez les oiseaux est généralement asymptomatique à l’exception de<br />
certaines espèces telles que les oies et les corbeaux.L’atteinte neurologique se<br />
manifeste sous diverses formes allant d’une incapacité à se tenir debout à une<br />
paralysie <strong>des</strong> pattes et <strong>des</strong> ailes.<br />
<strong>Le</strong> traitement <strong>des</strong> infections dûes au VWN est purement symptomatique et<br />
aucun traitement spécifique n’est disponible actuellement. L’utilisation de la ribavirine<br />
et l’interferon α est discutable. En effet, la ribavirine inhibe la multiplication <strong>des</strong> <strong>virus</strong><br />
en s’incorporant en tant que nucléoside défectueux à la place <strong>des</strong> nucléosi<strong>des</strong><br />
corrects durant la réplication du <strong>virus</strong>.<br />
Lorsque le <strong>virus</strong> pénètre dans la circulation sanguine, les leucocytes produisent<br />
l’interféron α qui active les cellules environnantes infectées et non infectées afin<br />
d’inhiber la synthèse protéique virale et d'autre part, de provoquer la décomposition<br />
de l'ARN viral. Au niveau <strong>des</strong> cellules de mammifères infectées par le VWN, la<br />
production d'interféron α est inhibée. Ainsi, le traitement par l'interféron permet de<br />
réactiver les cellules et par conséquent, les défenses immunitaires.<br />
Il n’existe pas de vaccin humain. Cependant, le <strong>virus</strong> inactivé est utilisé comme<br />
vaccin aux USA pour prévenir l’infection chez le cheval ainsi que d’autres vaccins<br />
chimériques exprimant les protéines de la membrane et de l’enveloppe (DeFilette et<br />
al., 2012).<br />
15
3. <strong>Le</strong> <strong>virus</strong> de la fièvre de la vallée du Rift<br />
3.1. Historique<br />
<strong>Le</strong> <strong>virus</strong> de la fièvre de la vallée du Rift (VFVR) a été isolé en 1930 lors d’une<br />
épizootie au Kenya qui a provoqué la mort de 3500 agneaux et 1200 brebis<br />
(Daubney et al., 1931). Pendant plusieurs années, le <strong>virus</strong> a continué à être<br />
responsable d’épizooties en Afrique de l’Est et du Sud. Ce n’est qu’en 1975, qu’une<br />
première épizootie-épidémie éclate en Afrique du Sud où l’infection humaine est<br />
associée pour la première fois à <strong>des</strong> symptômes de fièvre hémorragique et<br />
d’encéphalite (McIntosh et al., 1980).<br />
<strong>Le</strong> VFVR atteint l’Egypte en 1977, touchant 200 000 personnes et faisant 598 décès<br />
(El-Akkad, 1978; Meegan, 1979). Depuis lors, <strong>des</strong> épidémies se sont succédées<br />
dans toute l’Afrique sub-saharienne; en Mauritanie en 1987 en provoquant 1264 cas<br />
dont 224 décès (Digoutte et al., 1989), à nouveau en Egypte en 1993 (Arthur et al.,<br />
1993) et en 1997 (Abd El-Rahim et al., 1999), au Kenya (Nord-Est) et en Somalie<br />
(Sud) en 1997-98 faisant 478 décès (Anonymous, 1998). En outre, le <strong>virus</strong> s'est<br />
étendu pour la première fois hors d'Afrique, gagnant l’Arabie Saoudite et le Yémen<br />
en 2000 (Ahmed, 2000) et faisant respectivement 884 cas humains dont 124 décès<br />
et 1087 cas humains dont 121 décès.<br />
En 2006-2007, une vaste épidémie sévit en Afrique de l’Est: au Kenya (684 cas dont<br />
155 décès), en Tanzanie (264 cas dont 109 décès), en Somalie (114 cas dont 51<br />
décès) et au Soudan (601 cas dont 211 décès). En 2008, un foyer est notifié en<br />
Afrique du Sud ainsi qu’à Madagascar (17 morts et plus de 400 cas humains)<br />
(Tableau II).<br />
16
Tableau II. Principales épidemies de la fièvre de la vallée du Rift (Cêtre-Sossah & Albina, 2009)<br />
Aujourd’hui, la fièvre de la vallée de Rift est présente en Afrique, à Madagascar et<br />
dans la péninsule arabique. Cependant, dans certains pays africains, la maladie ne<br />
s’est jamais manifestée malgré les sérologies positives détectées dans le bétail<br />
(Figure 8).<br />
17
Figure 8. Répartition de la fièvre de la vallée du Rift en Afrique, à Madagascar et dans la<br />
péninsule arabique chez l’animal et chez l’homme (Chevalier et al., 2008).<br />
3.2. La structure et le génome<br />
<strong>Le</strong> VFVR, un Phlebo<strong>virus</strong> de la famille <strong>des</strong> Bunyaviridae, est un <strong>virus</strong> enveloppé<br />
de 90 à 110 nm de diamètre. <strong>Le</strong> génome du VFVR est un ARN simple brin de<br />
polarité négative et tri-segmenté: <strong>Le</strong> segment L (Large) code pour la protéine L qui<br />
est une ARN polymérase ARN dépendante. <strong>Le</strong> segment M (Medium) code pour une<br />
polyprotéine qui génère les glycoprotéines Gn, Gc et NSm après clivage post-<br />
traductionnel. <strong>Le</strong> segment S est traduit de manière ambisens : dans le sens du<br />
génome, il code pour une protéine non structurale NSs, et dans le sens<br />
antigénomique, pour la protéine N (Figure 9).<br />
Chaque ARN est associé à <strong>des</strong> protéines N et L et l’ensemble forme une<br />
ribonucléoprotéine. <strong>Le</strong>s glycoprotéines Gn et Gc sont deux protéines de surface qui<br />
s’insèrent dans la membrane du <strong>virus</strong>, formant <strong>des</strong> spicules de 5 à 10 nm de<br />
longueur. Elles ont <strong>des</strong> propriétés hémagglutinantes et sont responsables de la<br />
fixation de la particule virale à la surface <strong>des</strong> cellules cibles, après reconnaissance<br />
de leurs récepteurs (encore inconnus). La protéine non structurale NSm n’est pas<br />
essentielle pour le déroulement du cycle viral (Won et al., 2006; Gerrard et al., 2007)<br />
et son rôle est encore inconnu (Bouloy & Weber, 2010) tandis que la protéine NSs<br />
18
constitue le facteur de virulence. En effet, la proteine NSs forme <strong>des</strong> filaments dans<br />
le noyau de la cellule infectée et inhibe la transcription cellulaire.<br />
Figure 9. Schéma de la structure et du génome du <strong>virus</strong> de la fièvre de la vallée du Rift. <strong>Le</strong><br />
VFVR possede un génome de polarité négative ou ambisens et tri-segmenté (Segments L, M et S)<br />
(Pépin et al., 2010).<br />
<strong>Le</strong>s analyses phylogénétiques <strong>des</strong> séquences du segment M ont permis de<br />
définir trois lignées majeures: Afrique de l'Ouest, Afrique centrale-orientale et Egypte<br />
(Figure 10). Bien que la plupart <strong>des</strong> souches sont regroupées selon leur origine<br />
géographique, aucune corrélation entre le génotype viral et l'emplacement<br />
géographique n’a été observée (Bird et al., 2007).<br />
19
Figure 10. Analyse phylogénétique du <strong>virus</strong> de la fièvre de la vallée du Rift (Pépin et al., 2010).<br />
20
3.3. <strong>Le</strong> cycle de transmission<br />
<strong>Le</strong> cycle de la fièvre de la vallée de Rift fait intervenir <strong>des</strong> <strong>moustique</strong>s du genre<br />
Ae<strong>des</strong> et/ou <strong>Culex</strong>. <strong>Le</strong>s femelles infectées du genre Ae<strong>des</strong> sont capables de<br />
transmettre le <strong>virus</strong> à leurs <strong>des</strong>cendants (transmission verticale). <strong>Le</strong>s œufs sont<br />
capables de résister à la <strong>des</strong>siccation durant de longues pério<strong>des</strong> jusqu’à la saison<br />
<strong>des</strong> pluies suivantes. A la mise en eau, les œufs infectés éclosent et donnent <strong>des</strong><br />
adultes infectés. Lors d’un repas sanguin, la femelle transmet par piqure le <strong>virus</strong> aux<br />
animaux sauvages ou domestiques. C’est le cycle enzootique. <strong>Le</strong>s animaux infectés<br />
vont servir de source de contamination pour d’autres <strong>moustique</strong>s et vont être à<br />
l’origine d’épizootie et/ou d’épidémie.<br />
Une autre possibilité serait que le <strong>virus</strong> soit conservé au sein d’un réservoir naturel.<br />
Certains rongeurs ont été proposés comme réservoir possible en Afrique du Sud<br />
(Pretorius et al., 1997). <strong>Le</strong> VFVR a été également isolé d’animaux sauvages et de<br />
<strong>moustique</strong>s en forêt tropicale suggérant un cycle selvatique (Sall, 1999).<br />
<strong>Le</strong> <strong>virus</strong> est également transmis par aérosols à partir de liqui<strong>des</strong> biologiques ou de<br />
tissus d’animaux contaminés. C’est dans cette situation que l’homme se contamine<br />
en plus d’une transmission par <strong>des</strong> <strong>moustique</strong>s. Cependant, l’homme reste<br />
généralement considéré comme un “cul-de-sac épidémiologique”, car la transmission<br />
interhumaine n’a jamais pu être observée (Figure 11).<br />
21
Figure 11. Cycle biologique du <strong>virus</strong> de la fièvre de la vallée du Rift. <strong>Le</strong> maintien du <strong>virus</strong> se fait<br />
dans <strong>des</strong> œufs d’Ae<strong>des</strong> et/ou dans <strong>des</strong> rongeurs ou <strong>des</strong> ruminants sauvages qui seraient le réservoir<br />
animal. Suite à de fortes pluies, la pullulation <strong>des</strong> <strong>moustique</strong>s infectés entrainerait la contamination<br />
<strong>des</strong> animaux d’élevage, c’est l’épizootie. Si cette derniere s’intensifie et se déplace en zone urbaine<br />
par le déplacement du bétail contaminé, l’homme peut alors être touché, c’est l’épidémie.<br />
3.4. <strong>Le</strong> cycle de réplication virale<br />
Comme tous les <strong>virus</strong> à ARN négatif, le génome est transcrit et répliqué<br />
seulement quand les proteines N et L lui sont associées sous forme de<br />
ribonucleoproteines (RNPs). <strong>Le</strong>s RNPs se présentent sous forme circulaire et<br />
possedent une structure pseudo-hélicoidale. A la différence <strong>des</strong> ARN génomiques et<br />
anti-génomiques, les ARNm viraux possèdent à leur extremité 5’ une sequence<br />
additionnelle d’ARN coiffée et methylée d’origine cellulaire aquise par capture de<br />
coiffe (cap-snatching).<br />
Comme tous les Bunya<strong>virus</strong>, le cycle a lieu dans le cytoplasme. <strong>Le</strong> <strong>virus</strong> bourgeonne<br />
au niveau <strong>des</strong> membranes de l’appareil de Golgi. <strong>Le</strong> site de bourgeonnement semble<br />
être determiné par les glycoprotéines Gn et Gc qui possèdent <strong>des</strong> signaux<br />
d’adressage aux membranes golgiennes (Gerrard & Nichol, 2002).<br />
<strong>Le</strong>s glycoproteines de l’enveloppe semblent médier l’entrée du <strong>virus</strong> dans les cellules<br />
à travers <strong>des</strong> récepteurs qui pour la plupart <strong>des</strong> Bunya<strong>virus</strong>, restent à identifier<br />
22
(Bouloy & Weber, 2010).Cependant, une étude récente a montré que DC-SIGN sert<br />
de récepteur pour les Phlebo<strong>virus</strong> (Lozach et al., 2011).<br />
3.4. Pathogénèse et vaccin<br />
<strong>Le</strong> <strong>virus</strong> se réplique au niveau du foie, la rate et souvent le cerveau. Suite à une<br />
période d’incubation de 3 à 7 jours, l’homme développe une forme bénigne pseudo-<br />
grippale avec une hyperthermie, <strong>des</strong> céphalées, <strong>des</strong> myalgies et <strong>des</strong> nausées. Une<br />
proportion de personnes infectées de 3% à 20% développe <strong>des</strong> complications: une<br />
atteinte oculaire, une méningo-encéphalite ou une hépatite associée à un syndrome<br />
hémorragique. <strong>Le</strong>s lésions rétiniennes peuvent provoquer une baisse définitive de<br />
l’acuité visuelle voire la cécité. La méningo-encéphalite peut entraîner <strong>des</strong> lésions<br />
nerveuses irréversibles (Alrajhi et al., 2004). Ces deux formes sont rarement<br />
mortelles. A l’inverse, la fièvre hémorragique est fatale dans la moitié <strong>des</strong> cas et<br />
apparait 3 à 6 jours après le début de la maladie (Peters & Meegan, 1981).<br />
Chez les animaux, la sensibilité à l’infection varie selon l’âge et l’espèce (Tableau III).<br />
L’infection est rarement mortelle pour les adultes, mais provoque <strong>des</strong> avortements<br />
chez les femelles en gestation et une mortalité importante chez les jeunes animaux<br />
(Easterday, 1965; Shimshony & Barzilai, 1983).<br />
23
Tableau III. Sensibilité <strong>des</strong> animaux au <strong>virus</strong> de la fièvre de la vallée du Rift (<strong>Le</strong>fèvre, 1989)<br />
Hautement<br />
sensibles<br />
Agneaux<br />
Chevreaux<br />
Chiots<br />
Chatons<br />
Souris<br />
Hamsters<br />
Sensibles Modérément<br />
sensibles<br />
Veaux<br />
Moutons<br />
Bovins<br />
Chèvres<br />
Buffles<br />
Faiblement<br />
sensibles<br />
(infection<br />
inapparente)<br />
Chameaux<br />
Chevaux<br />
Porcs<br />
Chiens<br />
Chats<br />
Cobayes<br />
Lapins<br />
Résistants<br />
Oiseaux<br />
Reptiles<br />
Amphibiens<br />
Il n’existe aucun traitement spécifique pour la FVR. Chez l’homme, un<br />
traitement symptomatique est mis en place dans les cas sévères afin d’améliorer<br />
l’état général du patient. L’usage d’interférons (α et β) ou de ribavirine est discutable.<br />
<strong>Le</strong>s vaccins existants sont divisés en deux groupes: les souches vivantes et les<br />
souches inactivées. La souche neurotrope Smithburn (Smithburn, 1949) est une<br />
souche atténuée qui induit une immunité de longue durée après une seule<br />
inoculation mais provoque <strong>des</strong> avortements et/ou <strong>des</strong> malformations fœtales. Dans<br />
cette catégorie, on cite deux autres candidats, la souche MP12 (obtenue à partir de<br />
la souche ZH548 après 12 passages en présence de l’agent mutagène 5 fluoro-<br />
uracyl (Caplen et al., 1985) et la souche Clone 13 (souche naturellement atténuée).<br />
Un autre vaccin R566, est obtenu par réassortiments entre les deux souches<br />
Clone13 et MP12. <strong>Le</strong>s vaccins inactivés ont l’avantage de ne pas présenter d’effets<br />
néfastes mais l’immunité induite est de courte durée et nécessite <strong>des</strong> rappels<br />
annuels. La souche virale est généralement inactivée à l’aide de dérivé de formol<br />
comme la souche RVFV TSI-GSD-200 (Ikegami & Makino, 2009; Pépin et al., 2010;<br />
Boshra et al., 2011).<br />
24
4. <strong>Le</strong>s <strong>vecteur</strong>s du VWN et VFVR<br />
4.1. La transmission vectorielle et la notion de capacité vectorielle<br />
En conditions naturelles, le <strong>vecteur</strong> s’infecte lors d’un repas sanguin sur un hôte<br />
vertébré en phase de virémie. Par la suite, le <strong>vecteur</strong> devient infectant et peut<br />
transmettre le <strong>virus</strong> à un hôte naïf. En conditions de laboratoire, on reproduit ce cycle<br />
soit en utilisant <strong>des</strong> animaux comme hôtes donneurs ou receveurs soit en utilisant<br />
<strong>des</strong> métho<strong>des</strong> artificielles qui consistent en une infection orale du <strong>vecteur</strong> puis à une<br />
recherche du <strong>virus</strong> dans la salive. Ces deux techniques permettent d’évaluer<br />
l’aptitude d’un arthropode à s’infecter, amplifier et transmettre le <strong>virus</strong>, autrement dit,<br />
elles permettent d’évaluer la compétence vectorielle.<br />
Quand un <strong>moustique</strong> ingère un repas sanguin contenant du <strong>virus</strong> (Figure 12, site A),<br />
ce dernier se retrouve dans la lumière de l’intestin moyen (Figure 12, site B). La prise<br />
du repas sanguin initie l’excrétion d’enzymes protéolytiques ainsi que la formation<br />
d’une membrane chitineuse nommée “la matrice péritrophique” (Figure 12, site C) qui<br />
entoure le bol alimentaire et protège l’épithélium intestinal <strong>des</strong> enzymes de la<br />
digestion. Pendant ce temps, le <strong>virus</strong> doit pénétrer dans les cellules intestinales<br />
(Figure 12, site D) avant que la membrane péritrophique ne devienne complètement<br />
imperméable sinon il sera piégé dans le bol alimentaire et détruit. Après une phase<br />
de réplication dans les cellules de l’épithélium intestinal, les virions sont libérés dans<br />
la cavité générale et disséminent dans les différents organes avec l’hémolymphe<br />
(Figure 12, site E). Ainsi, le <strong>virus</strong> infecte le corps gras, les tubes de Malpighi (Figure<br />
12, site F), les ovaires (Figure 12, site G), la chaine nerveuse centrale et les glan<strong>des</strong><br />
salivaires (Figure 12, site H). Une fois la barrière salivaire franchie, le <strong>virus</strong> se<br />
retrouve dans la salive qui est alors injectée lors d’une piqure de la femelle<br />
infectante. A savoir qu’une femelle infectée le restera toute sa vie.<br />
<strong>Le</strong> temps nécessaire pour que le <strong>virus</strong> progresse dans un <strong>moustique</strong>, depuis son<br />
ingestion jusqu’à ce qu’il se retrouve dans la salive, est appelé la période<br />
d’incubation extrinsèque (PIE) qui est un paramètre sensible à la température. En<br />
effet, quand on augmente la température d’incubation, on diminue la PIE (Figure13).<br />
La compétence vectorielle dépend <strong>des</strong> interactions <strong>moustique</strong>-<strong>virus</strong> qui vont<br />
permettre ou empêcher le développement de l’agent infectieux dans le corps de<br />
l’arthropode. Elle dépend de facteurs intrinsèques essentiellement d’origine<br />
25
génétique (Beerntsen et al., 2000). Quant à la capacité vectorielle, elle dépend <strong>des</strong><br />
interactions <strong>moustique</strong>-<strong>virus</strong>-environnement et plus précisément, de la densité du<br />
<strong>vecteur</strong>, ses préférences trophiques, sa durée de vie, sa durée d’incubation<br />
extrinsèque pour l’agent infectieux…(Macdonald, 1957).<br />
Figure 12. Schéma montrant le cheminement du <strong>virus</strong> dans le corps d’un <strong>moustique</strong> <strong>vecteur</strong>.<br />
Aprés ingestion (A), le <strong>virus</strong> se retrouve dans le bol alimentaire et doit infecter les cellules intestinales<br />
(B, C et D) pour être libéré par la suite dans la cavité générale (E) et infecter les organes secondaires<br />
(F, G) y compris les glan<strong>des</strong> salivaires (H) (modifié à partir de Beerntsen et al., 2000).<br />
Figure 13. La période d’incubation extrinsèque varie selon la température. La période<br />
d’incubation extrinsèque est la durée nécessaire pour qu’une femelle de <strong>moustique</strong> devienne<br />
infectante après un repas sanguin infecté. Cette période diminue en augmentant la température<br />
d’incubation (Focks et al., 1995).<br />
26
4.2. <strong>Le</strong>s <strong>vecteur</strong>s du VWN<br />
Plus de 70 espèces de <strong>moustique</strong>s ont été trouvées naturellement infectées par<br />
le VWN, (Mononi et al., 2010). Cependant, elles ne sont pas toutes impliquées dans<br />
la transmission. En effet, une espèce naturellement infectée ne signifie pas<br />
automatiquement qu’elle soit vectrice. Elle a peut-être piqué un individu infecté et<br />
présentait du <strong>virus</strong> dans le repas de sang en cours de digestion.<br />
<strong>Le</strong>s espèces impliquées dans la transmission du VWN appartiennent essentiellement<br />
au genre <strong>Culex</strong>. En Afrique et au Moyen Orient, le principal <strong>vecteur</strong> est Cx.<br />
univittatus associé à Cx. antennatus et Cx. <strong>pipiens</strong> en Égypte (Taylor et al.,1956),<br />
Cx. <strong>pipiens</strong> en Israël (Nir et al., 1972) et <strong>Culex</strong> theileri en Afrique du Sud (McIntosh et<br />
al., 1967). En Europe et Russie, les principaux <strong>vecteur</strong>s sont Cx. <strong>pipiens</strong> et Cx.<br />
mo<strong>des</strong>tus (Mouchet et al., 1970; Berezin, 1971; Savage et al., 1999) et en Asie, il<br />
s’agit de Cx. tritaeniorhynchus, Cx. quinquefasciatus et Cx. vishnui (Pavri & Singh,<br />
1965; Akhter et al., 1982). Aux États-Unis, les espèces qui jouent un rôle dans la<br />
transmission du VWN sont Cx. tarsalis, Cx. <strong>pipiens</strong>, Cx. restuans, Cx. salinarius et<br />
Cx. erraticus au Nord (Andreadis et al., 2004; Lukacik et al.,2006; Gujral et al., 2007)<br />
et au Sud, Cx. quinquefasciatusassocié à Cx. nigripalpus à l’Est et Cx. tarsalis à<br />
l’Ouest (Reisen et al., 2004; Hayes et al., 2005a). Cx. nigripalpus, Cx. bahamensis et<br />
Cx. quinquefaciatus sont <strong>des</strong> <strong>vecteur</strong>s principaux du VWN en Amérique centrale et<br />
aux Caraïbes (<strong>Le</strong>françois et al., 2006; Barrera et al., 2008).<br />
4.3. <strong>Le</strong>s <strong>vecteur</strong>s du VFVR<br />
En Afrique de l’Est, les principales espèces qui ont été trouvées naturellement<br />
infectées appartiennent aux genres Ae<strong>des</strong> (Ae. cumminsii, Ae. circumluteolus, Ae.<br />
mcintoshi) et <strong>Culex</strong> (<strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong>, <strong>Culex</strong> neavii, Cx. zombaensis et <strong>Culex</strong><br />
antennatus), Mansonia africana, et Anopheles pharoensis (Hoogstraal et al., 1979;<br />
Meegan et al., 1980; Linthicum et al., 1985; Meegan & Bailey, 1989; Logan et al.,<br />
1991).<br />
En Afrique du Sud, le VFVR a été isolé d’Ae. circumluteolus, Ae. caballus, Ae. juppi,<br />
Ae. cinereus et de Cx. theileri (McIntosh & Jupp, 1981).<br />
27
En Afrique de l’Ouest, Ae. vexans arabiensis, Ae. ochraceus et Ae. dalzieli sont <strong>des</strong><br />
<strong>vecteur</strong>s enzootiques du <strong>virus</strong> au Sénégal où une autre espèce, Ae. vexans joue un<br />
rôle primordial dans le maintien du <strong>virus</strong> et notamment, dans la région de Ferlo<br />
(Fontenille et al., 1998; Chevalier et al., 2004). L’espèce Cx. poicilipes a été<br />
incriminée dans l’épizootie-épidémie de 1998 en Mauritanie (Diallo et al., 2005). Cx.<br />
quinquefacsiatus pourrait également jouer un rôle dans la transmission du VFVR<br />
(Marrama et al., 2005).<br />
Lors de l’épidémie du 1977 en Egypte, <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong> fut la seule espèce trouvée<br />
naturellement infectée (Meegan et al., 1980).<br />
En Arabie saoudite et au Yémen, deux espèces ont été trouvées naturellement<br />
infectés. Il s’agit de Ae. vexans arabiensis et Cx. tritaeniorhynchus tandis que Ae.<br />
caspius et Cx. <strong>pipiens</strong> sont soupçonnées de jouer un rôle dans le cycle<br />
épidémiologique du VFVR (Jupp et al., 2002; Miller et al., 2002).<br />
4.4. <strong>Le</strong> complexe <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong><br />
4.4.1. Position systématique<br />
<strong>Le</strong>s <strong>moustique</strong>s appartiennent à la classe <strong>des</strong> insectes, à l’ordre <strong>des</strong> diptères et<br />
à la famille <strong>des</strong> Culicidés. <strong>Le</strong>s <strong>moustique</strong>s sont cosmopolites et sont groupés en<br />
deux sous-familles, Culicinae et Anophelinae. Au Maroc, 42 espèces sont<br />
référencées et issues <strong>des</strong> genres: Anopheles, Ae<strong>des</strong>, Coquillettidia, <strong>Culex</strong>, Culiseta,<br />
Ochlerotatus, Orthopodomyia et Uranotaenia (Trari et al., 2002) dont l’espèce <strong>Culex</strong><br />
<strong>pipiens</strong>. Sa classification est la suivante:<br />
28
4.4.2. Bio-écologie<br />
Règne : Animalia<br />
Embranchement : Arthropoda<br />
Sous-embranchement : Hexapoda<br />
Classe : Insecta<br />
Sous-classe : Pterygota<br />
Ordre : Diptera<br />
Sous-ordre : Nematocera<br />
Famille : Culicidae<br />
Sous-famille : Culicinae<br />
Genre : <strong>Culex</strong><br />
Espèce : <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong><br />
La vie du <strong>moustique</strong> Cx. <strong>pipiens</strong> est composée de deux phases distinctes: une<br />
phase aquatique et une phase aérienne (Figure 14). Après l’accouplement, les<br />
femelles prendront un repas sanguin nécessaire à l’élaboration <strong>des</strong> œufs.<br />
Cependant, les femelles de Cx. <strong>pipiens</strong> peuvent produire une première ponte sans<br />
repas sanguin: elles sont dites autogènes. Elles utilisent les réserves accumulées<br />
durant leur stade larvaire. <strong>Le</strong>s œufs sont pondus dans l’eau, claire en général, mais<br />
on les trouve également dans les eaux polluées, chargées en matières organiques<br />
qui permettront aux larves de se nourrir. <strong>Le</strong>s œufs sont déposés en une nacelle qui<br />
flotte sur l’eau. L’éclosion se produit environ 24 h à 48 h après l’oviposition. <strong>Le</strong>s<br />
larves ont un mode de vie exclusivement aquatique, d’une durée de 5 à 6 jours. Elles<br />
subiront 4 mues avant de se transformer en nymphe. La nymphe ne se nourrit plus et<br />
de profon<strong>des</strong> modifications anatomiques s’opèrent. Aprés 2 à 3 jours, l’adulte est<br />
complètement formé dans son enveloppe nymphale. <strong>Le</strong> tégument se <strong>des</strong>sèche au<br />
contact de l’air et il se forme une déchirure en T sur sa face dorsale sous l’effet de<br />
l’augmentation de la pression interne. L’imago se dégage progressivement en se<br />
29
gonflant d’air pour s’envoler après un temps nécessaire au déplissage <strong>des</strong> ailes et<br />
<strong>des</strong> pattes par augmentation de la pression de l’hémolymphe.<br />
Figure 14. Cycle biologique de <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong>.<br />
4.4.3. <strong>Le</strong>s membres du complexe Cx.<strong>pipiens</strong><br />
<strong>Le</strong> complexe <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong> regroupe plusieurs espèces: Cx. <strong>pipiens</strong> Linnaeus,<br />
1758 avec ses deux formes; la forme <strong>pipiens</strong> et la forme molestus Forskll,1775, Cx.<br />
quinquefasciatus Say, 1823, Cx. pallens Coquillett 1898, Cx. globocoxitus<br />
Dobrotworsky 1953 et Cx. australicus Dobrotworsky et Drummond, 1953. D’autres<br />
espèces sont étroitement liées ou suggérées appartenir à ce complexe telles que,<br />
Cx. vagans Wiedemann 1828, Cx. fatigans Wiedemann 1828, Cx. Pervigilans Von<br />
Bergroth 1889 et Cx. torrentium Martini, 1925, (Vinogradova 2003; Smith & Fonseca,<br />
2004). <strong>Le</strong>s membres de ce complexe présentent <strong>des</strong> caractères morphologiques<br />
semblables avec <strong>des</strong> différences éco-physiologiques qui se traduisent par leur<br />
capacité à produire une première ponte sans prendre de repas sanguin (autogénie<br />
versus anautogénie), à s’accoupler dans <strong>des</strong> espaces fermés (sténogamie versus<br />
eurygamie), à entrer en diapause durant la période hivernale (hétérodyname versus<br />
homodyname) (Tableau IV).<br />
30
Chaque membre appartenant au complexe Cx. <strong>pipiens</strong> a une répartition<br />
géographique caractéristique. En effet, Cx. <strong>pipiens</strong> L. est présent en Europe, au Nord<br />
et au Sud de l’Afrique, en Asie non tropicale et en régions tempérées de l’Amérique<br />
du Nord et du Sud (Harbach et al., 1985; Vinogradova, 2000; Vinogradova, 2003).<br />
Cx. <strong>pipiens</strong> existe uniquement sous sa forme molestus au Japon, en Corée du Sud et<br />
en Australie (Vinogradova, 2000). Cx. quinquefasciatus est présent en région<br />
tropicale, subtropicale de l’Afrique et <strong>des</strong> Amériques et en Sud-Est de l’Asie et de<br />
l’Australie (Fonseca et al., 2006). Cx. pallens est distribué à l'Est de l'Oural à travers<br />
l'Asie tempérée (Fonseca et al., 2009). Cx. globocoxitus et Cx. australicus sont<br />
essentiellement limités à l’Australie. Cx. vagans est rencontrée en Chine, en Inde, en<br />
Corée, au Japon, et en Russie. Cx. fatigans et Cx. pervigilans sont rencontrés en<br />
Nouvelle Zélande et dans les îles avoisinantes (Belkin, 1968). Et finalement, Cx.<br />
torrentium est une espèce paléarctique présente en Europe et dans certaines<br />
régions asiatiques (Vinogradova, 2000).<br />
Tableau IV. Caractères éco-physiologique <strong>des</strong> membres du complexe Cx. <strong>pipiens</strong><br />
Membre du complexe Autogénie Sténogame (S)/<br />
Cx. <strong>pipiens</strong> forme <strong>pipiens</strong><br />
Cx. <strong>pipiens</strong> formemolestus<br />
Cx. quinquefasciatus<br />
Cx. pallens<br />
Cx. globocoxitus<br />
Cx. australicus<br />
Cx. vagans<br />
<strong>Culex</strong> fatigans<br />
Cx. pervigilans<br />
Cx. torrentium<br />
?: non renseigné.<br />
-<br />
+<br />
-<br />
-<br />
?<br />
-<br />
-<br />
?<br />
?<br />
-<br />
Eurygame (E)<br />
E<br />
S<br />
S<br />
S<br />
?<br />
E<br />
E<br />
?<br />
?<br />
E<br />
Diapause<br />
<strong>Le</strong> <strong>moustique</strong> <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong> L. existe sous deux formes: une forme molestus et<br />
une forme <strong>pipiens</strong>.La forme molestus est autogène (capable de réaliser une première<br />
ponte sans prendre de repas de sang), sténogame (peut s’accoupler dans <strong>des</strong><br />
+<br />
-<br />
-<br />
+<br />
-<br />
-<br />
+<br />
-<br />
?<br />
+<br />
31
espaces confinés) et reste en activité durant la période hivernale (homodynamique).<br />
A l’inverse, la forme <strong>pipiens</strong> est anautogène (exigeant toujours un repas de sang<br />
pour réaliser une ponte), eurygame (s’accouple en plein air) et entre en diapause<br />
pendant l’hiver (hétérodynamique). De plus, la forme molestus et la forme <strong>pipiens</strong> se<br />
développent respectivement dans <strong>des</strong> gites épigés et hypogés en Russie et aux USA<br />
(Byrne & Nichols, 1999; Huang et al., 2008). Cependant, les deux formes peuvent<br />
cohabiter dans <strong>des</strong> gites hypogés ainsi qu’en gites épigés (Chevillon et al., 1995;<br />
Gomes et al., 2009; Reusken et al., 2010). <strong>Le</strong>s deux formes semblent ne pas être<br />
isolées génétiquement et leurs hybri<strong>des</strong> sont présents aux USA, au Sud et au Nord<br />
de l’Europe (Fonseca et al., 2004; Gomes et al., 2009; Reusken et al., 2010). <strong>Le</strong>s<br />
deux formes présenteraient <strong>des</strong> préférences trophiques différentes, la forme <strong>pipiens</strong><br />
se nourrit principalement sur les oiseaux (ornithophile) et la forme molestus sur les<br />
mammifères (mammophile). Par ailleurs, les hybri<strong>des</strong> ont <strong>des</strong> préférences trophiques<br />
mixtes pour les oiseaux et les mammifères.<br />
Cx. <strong>pipiens</strong> L. est le seul membre du complexe <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong> présent en<br />
Afrique du Nord. C’est un <strong>vecteur</strong> compétent pour plusieurs agents pathogènes<br />
affectant l’homme et/ou l’animal tel est le cas du <strong>virus</strong> West Nile (Krida et al., 2010),<br />
le <strong>virus</strong> de la fièvre de la vallée de Rift (Hoogstraal et al., 1979; Meegan et al., 1980;<br />
Moutailler et al., 2008) et de filaires (Harb et al., 1993; Krida et al., 1998; Abdul-<br />
Hamid et al., 2009; Abdul-Hamid et al., 2011). <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong> L. a déjà été décrit dans<br />
cette région. Il s’agit de <strong>des</strong>criptions basées sur <strong>des</strong> caractères morphologiques,<br />
physiologiques, reproductifs et écologiques (Roubaud, 1939; Knight & Malek, 1951;<br />
Gaud, 1953; Vermeil, 1954; Rioux, 1958; Senevet et al., 1958; Rioux, 1965; Pasteur<br />
et al., 1977; Himmi et al., 1995). Dans les zone urbaines, les populations de Cx.<br />
<strong>pipiens</strong> colonisent les gites hypogés et ont été décrites comme autogènes,<br />
sténogames et anthropophiles. Des populations anautogènes ont été également<br />
observées en gites épigés. A l’inverse, Cx. <strong>pipiens</strong> est anautogène, sténogame et<br />
anthropophile ou ornithophile en zones rurales. Cependant, ces caractères restent<br />
limités et une identification basée sur les différences génétiques semble nécessaire<br />
pour distinguer les membres du complexe Cx. <strong>pipiens</strong>. Dans cet objectif, plusieurs<br />
techniques ont été développées (Tableau V).<br />
32
Tableau V. Marqueurs moléculaires utilisés pour identifier certains membres du complexe Cx.<br />
<strong>pipiens</strong><br />
Marqueur Membres du complexe Cx. <strong>pipiens</strong> Références<br />
Ribosomal Cx. <strong>pipiens</strong><br />
Cx. restuans<br />
Cx. salinarius<br />
Ribosomal Cx. <strong>pipiens</strong><br />
Cx. nigripalpus<br />
Nucléaire (Ace2) Cx. <strong>pipiens</strong><br />
Cx. quinquefasciatus<br />
Cx. pallens<br />
Cx. torrentium<br />
Cx. australicus<br />
Cx. pervigilans<br />
Nucléaire (Ace2) Cx. <strong>pipiens</strong><br />
Cx. quinquefasciatus<br />
Nucléaire (Ace2) Cx. pallens<br />
Cx. <strong>pipiens</strong> forme molestus<br />
Nucléaire (COI) Cx.<strong>pipiens</strong> forme <strong>pipiens</strong><br />
Cx.<strong>pipiens</strong> forme molestus<br />
Nucléaire (CQ11) Cx.<strong>pipiens</strong> forme <strong>pipiens</strong><br />
Cx.<strong>pipiens</strong> forme molestus<br />
Crabtree et al. (1995)<br />
Aspen et al. (2003)<br />
Smith & Fonseca (2004)<br />
Aspen & Savage (2003)<br />
Kasai et al. (2008)<br />
Shaikevich (2007)<br />
Bahnck & Fonseca (2006)<br />
33
5. L’immunité antivirale<br />
5.1. Chez le <strong>moustique</strong><br />
<strong>Le</strong>s insectes ne possédent que l'immunité innée pour lutter contre les<br />
pathogènes. La drosophile Drosophila melanogaster a servi de modèle pour étudier<br />
le système immunitaire <strong>des</strong> insectes notamment après le séquençage de son<br />
génome (Adams et al., 2000). Dans cette partie, nous allons evoqué que les voies<br />
inmpliquées dans la réponse antivirale.<br />
5.1.1. La voie Toll<br />
La voie Toll est impliqué dans la réponse antifongique et antibactérienne<br />
(Bactéries à Gram (+)) (<strong>Le</strong>maitre et al., 1996). Après fixation <strong>des</strong> ligands sur le<br />
récepteur Toll, la voie de transduction faisant intervenir l’adaptateur moléculaire<br />
MyD88 est activée induisant ainsi la degradation de l’inhibiteur Cactus. Cette<br />
dégradation permet la translocation de Dif (Drosophila immunity factor) dans le<br />
noyau et l’activation de la transcription de pepti<strong>des</strong> antimicrobiens tels la<br />
drosomycine et la défensine (Figure15; Hoffmann, 2003). En 2005, cette voie s’est<br />
révélée importante dans la réponse antivirale chez la Drosophile (Zambon et al.,<br />
2005). Des étu<strong>des</strong> plus récentes demontrent son implication chez le <strong>moustique</strong><br />
Ae<strong>des</strong> aegypti suite à une infection par le <strong>virus</strong> de la dengue (Xi et al., 2008).<br />
5.1.2. La voie Imd<br />
La voie Imd (Immune deficiency) est impliquée dans la production <strong>des</strong> pepti<strong>des</strong><br />
antimicrobiens dirigés contre les Bactéries à Gram (-). L’activation de cette voie se<br />
fait par la reconnaissance de motifs présents à la surface <strong>des</strong> bactéries par les<br />
recepteurs PGRP-LC et PGRP-LE, ce qui entraine une cascade de signalisation et<br />
active la synthèse de diptéricine cécropine, drosocine et attacine (Figure 15).Cette<br />
voie est également impliquée dans la réponse antivirale chez la drosophile (<strong>Le</strong>maitre<br />
et al., 1995).<br />
34
5.1.3. La voie Jak/STAT<br />
La voie Janus kinase/ Signal Transducer and Activator of Transcription<br />
(Jak/STAT) est activée chez la drosophile par la fixation du ligand Unpaired (UPD)<br />
sur le récepteur Domless (Dome). Ceci entraine le recrutement <strong>des</strong> facteurs STATs<br />
localisés dans le cytoplasme et qui transitent dans le noyau où ils vont assurer la<br />
transcription de certains facteurs (Figure15). En 2005, l’implication de cette voie dans<br />
la réponse antivirale a été demontrée pour la premiere chez la drosophile (Dostert et<br />
al., 2005).<br />
Figure 15. Shéma récapitulatif <strong>des</strong> réactions antivirales chez la drosophile (Arjona et al., 2011).<br />
5.1.4. L’ARN interférence<br />
L’ARN interférence est la voie la plus etudiée en tant que réponse antivirale<br />
chez la drosophile. Elle a été decouverte chez les plantes en 1990 (Jorgensen and<br />
kaimenyi, 1990).<br />
35
<strong>Le</strong>s dsRNA sont fragmentés par une RNaseIII appelée Dicer2 en de nombreux petits<br />
fragments d’ARN appelés siRNA (small interfering RNA) de 20 à 25 paires de bases<br />
(Bernstein et al., 2001). R2D2 est le cofacteur de Dicer2 et va permettre la laison<br />
avec le compexe RISC (RNA- Induced Silencing Complex) contenant la proteine<br />
Argonaute2 (Ago2). <strong>Le</strong> complexe RISC guidé par le simple brin siRNA, va cibler de<br />
manière spécifique l’ARNm correspondant et entrainer sa dégradation (Figure16).<br />
Cette voie est activée chez Ae<strong>des</strong> aegypti après une infection par le <strong>virus</strong> de la<br />
dengue (Sanchez-Vargas et al., 2004; 2009) et également, chez <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong><br />
infecté par le VWN (Brackney et al., 2009).<br />
5.2. Chez l’homme<br />
Figure 16. Mécanisme de l’ARN interférence (Arjona et al., 2011).<br />
L’immunité innée et aquise limitent la replication du <strong>virus</strong> dans les organes<br />
périphériques (Figure 17). L’interferon (IFN) α/β agit comme agent antiviral et limite le<br />
transfert et la réplication juste après l’infection. <strong>Le</strong>s lymphocytes B et les anticorps de<br />
type IgM module la virémie sérique et prévient le passage au système nerveux<br />
central. De plus, le complément permet une réponse humorale et cellulaire efficace.<br />
36
L’IFNγ contrôle la réplication virale à travers <strong>des</strong> mécanismes antiviraux directs et<br />
contribue à la génération d’une immunité adaptative. <strong>Le</strong>s lymphocytes T (CD4+ et<br />
CD8+) participent à l’élimination du <strong>virus</strong> <strong>des</strong> organes periphériques. Quand le <strong>virus</strong><br />
traverse la barrière hémato-encéphalique, les cytokines CXCL10 et CCL5 et leur<br />
récepteurs CXCR3 et CCR5 aident à recruter les lymphocytes T et les monocytes<br />
vers le SNC pour éliminer le <strong>virus</strong> <strong>des</strong> cellules infectées (Samuel & Diamond, 2006)<br />
Figure 17. Immunité antivirale innée et aquise chez l’homme (Samuel & Diamond, 2006).<br />
37
6. Objectifs de la thèse<br />
L’émergence et la réémergence actuelles <strong>des</strong> maladies transmises par les<br />
arthropo<strong>des</strong> hématophages et notamment les arboviroses, représentent un risque<br />
majeur en santé animale et en santé publique (Gubler, 2002). L’expansion de ces<br />
maladies est en grande partie liée aux changements globaux dont l’intensification<br />
<strong>des</strong> échanges, l’instabilité politique, les changements climatiques, les changements<br />
de techniques agro-pastorales et l’urbanisation rendant ainsi les pays tempérés<br />
vulnérables aux maladies tropicales (Patz et al., 1996; Gratz, 1999).<br />
La fièvre West Nile (FWN) et la fièvre de la vallée de Rift (FVR) sont <strong>des</strong><br />
exemples d’arboviroses émergentes. <strong>Le</strong> <strong>virus</strong> West Nile (VWN) a longtemps été<br />
considéré comme peu pathogène (Rodhain & Perez 1985). Cependant, le VWN a<br />
regagné en activité dans le bassin méditerranéen à partir de 1994 et a suscité un<br />
grand intérêt dans les Amériques après son introduction aux USA en 1999 (Murgue<br />
et al., 2001a; Petersen & Hayes 2008). En parallèle, le <strong>virus</strong> de la fièvre de la vallée<br />
du Rift (VFVR) traditionnellement endémique à l’Afrique sub-saharienne a émergé<br />
dans la péninsule arabique en 2000 (Ahmed, 2000). Ces deux arbo<strong>virus</strong> ont montré<br />
leur capacité à s’établir en dehors de leur aire de répartition en assurant un cycle de<br />
transmission entre <strong>des</strong> <strong>vecteur</strong>s et <strong>des</strong> hôtes vertébrés locaux. Dans la région du<br />
Maghreb, le VWN a été responsable d’épidémies en Algérie (1994) et en Tunisie<br />
(1997) et d’épizooties au Maroc (1996) (<strong>Le</strong> Guenno et al., 1996; Triki et al., 2001; El<br />
Harrak et al., 1997). Dès lors, <strong>des</strong> cas humains et équins ont été recensés au Maroc<br />
et en Tunisie en 2003, 2010 et 2011 (Garbouj et al., 2003; Schuffenecker et al.,<br />
2005; Ben Hassine et al., 2011; ECDC 2011). Par contre, le VFVR n’a jamais sévi<br />
jusqu’à présent dans le grand Maghreb.<br />
<strong>Le</strong>s deux arbo<strong>virus</strong> sont transmis par <strong>des</strong> <strong>moustique</strong>s appartenant au complexe<br />
<strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong>. Seule l’espèce Cx. <strong>pipiens</strong> <strong>pipiens</strong> existe dans la région du Maghreb.<br />
Cx. p. <strong>pipiens</strong> comprend deux formes morphologiquement identiques: la forme<br />
<strong>pipiens</strong> et la forme molestus ayant <strong>des</strong> caractères éco-biologiques et <strong>des</strong><br />
préférences trophiques différentes pouvant influencer leurs rôles dans la<br />
transmission de certains agents pathogènes.<br />
38
C’est dans ce contexte que s’inscrit ce travail de thèse sur l’étude du <strong>moustique</strong><br />
Cx. <strong>pipiens</strong>, <strong>vecteur</strong> du VWN et VFVR dans la région du Maghreb.<br />
Ce travail a deux objectifs :<br />
i) évaluer la compétence vectorielle <strong>des</strong> populations de Cx. <strong>pipiens</strong> récoltées au<br />
Maroc, en Algérie et en Tunisie vis-à-vis <strong>des</strong> VWN et VFVR,<br />
ii) définir les formes de Cx.<strong>pipiens</strong> présentes dans la région du Maghreb en prenant<br />
le Maroc comme exemple.<br />
39
Matériels et métho<strong>des</strong><br />
40
1. Sites de récolte <strong>des</strong> <strong>moustique</strong>s<br />
Durant l’été 2010, la récolte <strong>des</strong> larves de <strong>moustique</strong>s a été conduite dans trois<br />
régions différentes du Maroc: au Nord (Tanger), au Centre (Casablanca et<br />
Mohammedia) et au Sud (Marrakech). La même opération a été réalisée en Algérie<br />
et en Tunisie (Figure 18).<br />
Figure 18. Sites de récolte de Cx. <strong>pipiens</strong> au Maroc, en Algérie et en Tunisie<br />
<strong>Le</strong>s récoltes <strong>des</strong> sta<strong>des</strong> préimaginaux sont réalisées dans chaque gîte larvaire<br />
(Figure 19), selon la méthode de dipping. Cela consiste à se mettre sur le bord du<br />
gîte contre le soleil et réaliser cinq à dix prélèvements (selon les dimensions du gîte),<br />
sans répéter les prélèvements au niveau du même point. <strong>Le</strong> prélèvement est effectué<br />
en plongeant dans l’eau une louche en plastique et en la retirant d’un mouvement<br />
uniforme, tout en évitant les remous. <strong>Le</strong>s larves récoltées sont transportées au<br />
laboratoire. <strong>Le</strong>s larves de stade 4 sont triées et identifiées morphologiquement sous<br />
une loupe binoculaire en utilisant la clé d’identification à entrées multiples établie par<br />
Brunhes et al. (2000).<br />
41
2. Elevage <strong>des</strong> <strong>moustique</strong>s<br />
Figure 19. Exemples de gîte larvaire de <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong>.<br />
Une fois les larves de Cx. <strong>pipiens</strong> identifiées, elles sont réparties dans <strong>des</strong> bacs<br />
en plastique (25cm x 25cm; Figure 20a), à raison de 200 larves/bac, contenant 1 litre<br />
d’eau déchlorée et 2-3 croquettes pour chat. Par la suite, les nymphes sont<br />
récupérées et placées individuellement dans un tube de 50 mL (Falcon; Figure 20b)<br />
contenant de l’eau. On ferme le tube avec un morceau de tulle. Après émergence,<br />
l’adulte est libéré dans une cage (Figure 20c) puis récupéré à l’aide d’un aspirateur à<br />
bouche (Figure 20d) pour former <strong>des</strong> couples (Male/femelle).<br />
Chaque couple est placé dans une boite en plastique d’un volume de 1 litre (Figure<br />
20e). La paroi interne de la boite est tapissée avec un papier buvard qui servira de<br />
support pour la femelle. <strong>Le</strong> couvercle de la boite est remplacé par une moustiquaire<br />
en tulle qui est tenue par un élastique. Deux morceaux de coton sont placés en<br />
continu sur la moustiquaire : le premier est imbibé de solution sucrée à 10% pour<br />
nourrir le couple et le deuxième est imbibé d’eau pour augmenter l’humidité au sein<br />
de la boite d’élevage. On met également à la disposition du couple un petit<br />
cristallisoir contenant de l’eau pour recevoir les pontes F1.<br />
Pour chaque population, 40 couples sont formés. Un premier lot de 20 couples ne<br />
reçoit pas de repas sanguin. Seuls les couples autogènes seront ainsi capables de<br />
produire une première ponte sans nécessiter un repas sanguin. Un second lot de 20<br />
couples est <strong>des</strong>tiné à recevoir un repas de sang. Pour ce faire, le sixième jour après<br />
42
émergence, les femelles sont laissées à jeun pendant 24h. Au septième jour, les<br />
femelles sont transférées dans une grande cage (30x30x30 cm) et un coquelet est<br />
mis à la disposition <strong>des</strong> femelles. Une fois que les femelles sont gorgées, elles sont<br />
placées individuellement dans <strong>des</strong> boites d’élevage et les pontes anautogènes sont<br />
récupérées.<br />
Pour chaque population, les adultes F0 ont été congelés à -20°C pour l’analyse<br />
moléculaire. <strong>Le</strong>s pontes F1 autogènes et anautogènes ont fait l’objet d’une<br />
évaluation de compétence vectorielle vis-à-vis de VWN et VFVR. Ces infections se<br />
font dans les conditions de sécurité qui relèvent de la manipulation d’un agent<br />
pathogène de classe 3. Pour ce faire, les pontes autogènes et anautogènes ont été<br />
envoyées à l’Institut Pasteur à Paris.<br />
(a) (b) (c)<br />
(d) (e)<br />
Figure 20. Matériel utilisé lors de l’élevage de <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong>.<br />
Bac en plastique (a), tube pour nymphe (b), cage d’élevage pour adultes (c) aspirateur à bouche (d) et<br />
boite d’élevage pour couple (e).<br />
43
3. Infections expérimentales avec les <strong>virus</strong> WN et FVR<br />
3.1. <strong>Le</strong>s populations de <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong><br />
<strong>Le</strong>s pontes F1 autogènes et anautogènes de chaque pays (Tableau VI) ont été<br />
mises à éclore dans de l’eau décolorée. <strong>Le</strong>s larves ont été élevées jusqu’au stade<br />
nymphale. <strong>Le</strong>s nymphes ont été récupérées et mises dans <strong>des</strong> cages en attendant<br />
l’émergence <strong>des</strong> adultes. Pour chaque population, deux types d’adultes sont<br />
obtenus: autogènes (AU) et anautogènes (AN).<br />
Une souche de Cx. <strong>pipiens</strong> ‘Tabarka’ récoltée en Tunisie et colonisée au laboratoire<br />
pendant plusieurs générations a été utilisée pour définir au préalable certains<br />
paramètres de la compétence vectorielle.<br />
Tableau VI.Gîtes larvaires échantillonnés en 2010 en Algérie, au Maroc et en Tunisie<br />
Pays Ville Site<br />
Algérie<br />
Maroc<br />
Tunisie<br />
Type de<br />
gîte<br />
Timimoune Urbain Hypogé<br />
Chellal Urbain Hypogé<br />
Oued El Ksob Péri- urbain Epigé<br />
Bechelga Rural Epigé<br />
Casablanca Urbain Hypogé<br />
Mohammedia Péri- urbain Hypogé<br />
Tabarka Urbain Epigé<br />
Nefza Rural Epigé<br />
Autogène<br />
(AU)<br />
Ou<br />
Anautogène<br />
(AN)<br />
Echantillon<br />
AU A1_AU<br />
AN A1_AN<br />
AU A2_AU<br />
AN A2_AN<br />
AU A3_AU<br />
AN A3_AN<br />
AU A4_AU<br />
AN A4_AN<br />
AU M1_AU<br />
AN M1_AN<br />
AU M2_AU<br />
AN M2_AN<br />
AU T1_AU<br />
AN T1_AN<br />
AU T2_AU<br />
AN T2_AN<br />
44
3.2. <strong>Le</strong>s souches virales<br />
La souche avirulente Clone 13 du VFVR, a été isolée d’un cas humain bénin en<br />
République Centre Africaine en 1974 (Muller et al., 1995). Cette souche avirulente<br />
est défective pour le facteur de virulence, la protéine NSs. En effet, le gène est<br />
délété de 70% de sa phase ouverte de lecture. La souche du VWN a été isolée d’un<br />
cheval infecté en Camargue en 2000 (Murgue et al., 2001b).<br />
<strong>Le</strong>s stocks viraux utilisés pour les infections orales <strong>des</strong> <strong>moustique</strong>s ont été produits<br />
après plusieurs passages (8 passages pour le VFVR et 4 passages pour le VWN) sur<br />
cellules Vero de rein de singe et un seul passage sur <strong>des</strong> cellules d’insectes C6/36<br />
(Ae<strong>des</strong> albopictus). <strong>Le</strong>s stocks viraux sont conservés à -80°C.<br />
<strong>Le</strong> titre viral <strong>des</strong> stocks viraux utilisé a été estimé en unité formant plage (UFP)/mL,<br />
par comptage <strong>des</strong> plages de lyse obtenues après infection de cellules Vero (Lignée<br />
cellulaire continue de rein de singe).<br />
3.3. <strong>Le</strong> repas sanguin infectieux<br />
<strong>Le</strong>s femelles âgées de 7 jours sont mises à jeun 24 h avant l’infection. <strong>Le</strong> repas<br />
artificiel est constitué de deux tiers de globules rouges (lavés et remis en suspension<br />
dans du tampon PBS) et un tiers de suspension virale. <strong>Le</strong> titre viral du repas<br />
infectieux est de 10 7,8 UFP/mL pour le VWN et de 10 8,5 UFP/mL pour le VFVR. Un<br />
phagostimulant, l’ATP, est rajouté dans le repas à une concentration de 5.10 -3 M. <strong>Le</strong>s<br />
femelles se gorgent à travers une membrane d’intestin de porc soutenant le sang<br />
infecté pendant 30 min. Ainsi, les femelles pleinement gorgées sont triées, placées<br />
dans <strong>des</strong> boites en carton et nourries avec un coton imbibé d’eau sucrée à 10 %<br />
(Figure 21).<br />
45
Figure 21. Infections expérimentales <strong>des</strong> <strong>moustique</strong>s en laboratoire P3<br />
3.4. La salivation forcée<br />
Au terme de la période d’incubation qui a été définie à 14 jours pour le VWN, 14<br />
et 21 jours pour le VFVR, les femelles sont immobilisées par le froid, les ailes et les<br />
pattes sont arrachées puis le proboscis est introduit dans un cône contenant 5 µL de<br />
sérum de veau fœtal (SVF; figure 22). Après 45 min, le contenu du cône est mis en<br />
suspension dans 45 µL du milieu <strong>Le</strong>ibovitz L15 (Gibco, Invitrogen) à 10 % de SVF.<br />
<strong>Le</strong>s salives et les femelles ayant salivé sont conservées à -80°C jusqu’à leur<br />
analyse. <strong>Le</strong> nombre de particules virales a été estimé en UFP/salive. <strong>Le</strong> taux de<br />
transmission (TT) représente le nombre de femelles ayant une salive infectée sur le<br />
nombre total de femelles testées.<br />
46
Figure 22. Femelle en cours de récupération de sa salive en utilisant la technique de salivation<br />
3.5. <strong>Le</strong> titrage <strong>des</strong> salives<br />
forcée.<br />
<strong>Le</strong>s cellules Vero sont cultivées, dans <strong>des</strong> plaque à 6 puits, en milieu de<br />
cultureDulbecco’s Minimum Eaggle medium Glutamax (Gibco, Invitrogen)<br />
supplémenté en SVF à 10% et en antibiotiques (pénicilline 1000 UI/mL et<br />
streptomycine 1 mg/mL). <strong>Le</strong> lendemain de la confluence <strong>des</strong> cellules, le tapis<br />
cellulaire est infecté avec <strong>des</strong> dilutions de 10 en 10 de la salive dans du milieu de<br />
culture. Un volume de 250 µL est utilisé comme inoculum et adsorbé pendant 1 h à<br />
37°C. Par la suite, on rajoute du milieu de culture à 2% SVF, 1% antibiotique-<br />
antimycotique (Gibco, Invitrogen) et 1% d’agarose. <strong>Le</strong>s cellules sont incubées à 37°C<br />
et dans une atmosphère à 5 % de CO2 pendant 4 (VWN) ou 5 jours (VFVR). Au<br />
terme de la période d’incubation, le milieu gélifié est éliminé et les cellules sont fixées<br />
et colorées avec une solution contenant du cristal violet (0,2%), de la formaldéhyde<br />
(10%) et de l’éthanol (20%). <strong>Le</strong>s plaques sont lavées à l’eau puis séchées et les<br />
plages de lyses sont comptées. <strong>Le</strong> nombre de particules virales dans chaque salive<br />
est exprimé en UFP/salive.<br />
3.6. L’immunofluorescence indirecte sur squashs de tête<br />
La détection du <strong>virus</strong> se fait par immunofluorescence indirecte sur squash de<br />
tête <strong>des</strong> <strong>moustique</strong>s (Kuberski & Rosen, 1977). Pour ce faire, les femelles sont<br />
décapitées à l’aide d’un scalpel sur une lame de verre à la fin de la salivation. Une<br />
47
dizaine de têtes sont ainsi placées sur la lame et écrasées à l’aide d’une seconde<br />
lame. <strong>Le</strong>s lames sont séchées à l’air libre pendant 10 min puis fixées dans un bain<br />
d’acétone pur à -20°C pendant 20 min. Par la suite, les lames sont séchées et<br />
conservées à -80°C jusqu’à réalisation de la réaction d’immunofluorescence.<br />
L’anticorps primaire est une ascite de souris anti-<strong>virus</strong> diluée au PBS 1X (l’ascite<br />
anti-VFVR est diluée au 1/200 et l’ascite anti-VWN, au 1/100) qu’on dépose sur les<br />
squashs de tête. <strong>Le</strong>s lames sont incubées 30 min à 37°C en chambre humide puis<br />
rincées 3 fois avec du PBS 1X et séchées.<br />
L’anticorps secondaire est une immunoglobuline anti-souris couplée à la fluorescéine<br />
(FITC) dilué au 1/100 et additionnée de bleu d’Evans. <strong>Le</strong> mélange est déposé sur les<br />
lames qui sont traitées de la même façon qu’auparavant. A la fin <strong>des</strong> rinçages, les<br />
préparations sont montées entre lame et lamelle avec du tampon phosphate<br />
glycériné à 10 % et à pH 8. La lecture <strong>des</strong> lames se fait sous microscope à<br />
épifluorescence. <strong>Le</strong>s tissus infectés apparaissent en vert fluorescent et les tissus non<br />
infectés en rouge (Figure 23).<br />
<strong>Le</strong> taux d’infection disséminée (TID) représente le nombre de femelles ayant <strong>des</strong><br />
squashs de tête positifs rapportés au nombre total de femelles testées. <strong>Le</strong>s femelles<br />
présentant un squash de tête positif sont capables d’assurer la dissémination virale<br />
au-delà du tube digestif.<br />
(a) (b)<br />
Figure 23. Tissus de tête de <strong>moustique</strong> analysé par immunofluorescence.Tissu infecté (a) et<br />
tissu non infecté (b)<br />
48
4. <strong>Le</strong>s analyses statistiques<br />
<strong>Le</strong>s taux d’infection disséminée et de transmission ont été comparés par le test<br />
exact de Fisher et les titres moyens <strong>des</strong> particules virales dans les salives ont été<br />
comparés en utilisant le test de Kruskall-Wallis et celui de Wilcoxon Rank-sum.<br />
5. Taxonomie moléculaire de <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong> au Maroc<br />
5.1. Populations de Cx. <strong>pipiens</strong><br />
L’échantillonnage <strong>des</strong> larves (F0) a été conduit à Tanger, Casablanca,<br />
Mohammedia et Marrakech. <strong>Le</strong>s gîtes larvaires sont hypogés ou épigés et classés en<br />
fonction de l’habitat: urbain (centre-ville), périurbain (à la périphérie de la ville) et<br />
rural (en retrait de toute agglomération humaine; Tableau VII). <strong>Le</strong>s métho<strong>des</strong><br />
d’échantillonnage et d’élevage sont détaillées dans la partie 1.<br />
49
Tableau VII. Gîtes larvaires échantillonnés dans différentes régions du Maroc durant l’été 2010<br />
Ville Site Gîte<br />
Tanger Urbain Epigé<br />
Périurbain Epigé<br />
Rural Epigé<br />
Casablanca/ Mohammedia Urbain Epigé<br />
Urbain Hypogé<br />
Périurbain Epigé<br />
Marrakech Périurbain Epigé<br />
5.2. Extraction de l’ADN génomique<br />
Rural Epigé<br />
Rural Hypogé<br />
L’ADN <strong>des</strong> individus adultes de génération F0 est extrait par la technique<br />
DNAzol. Pour ce faire, chaque <strong>moustique</strong> est broyé au piston dans 250 µL de<br />
DNAzol puis le broyat est centrifugé 15 min à 15 000 rpm à +4°C. Après cette<br />
première étape où les protéines ont été précipitées, on transvase le surnageant dans<br />
un nouveau tube et on ajoute 125 µL d’éthanol 100 %. On agite doucement 1 à 2 min<br />
à température ambiante avant de centrifuger 15 min à 15 000 rpm à +4°C. On<br />
élimine délicatement le surnagent sans perdre le culot d’ADN qu’on lave avec 200 µL<br />
d’éthanol 70 %, puis on met les tubes à centrifuger pendant 15 min à 15 000 rpm à<br />
+4°C. Pour bien nettoyer le culot d’ADN, on réalise cette opération de lavage une<br />
deuxième fois. Pour finir, on sèche le culot jusqu’à évaporation complète de l’éthanol<br />
et on le reprend dans 30 µL d’eau pour préparation injectable (EPPI).<br />
5.3. Réaction PCR<br />
L’identification génétique <strong>des</strong> adultes appartenant au complexe Cx. <strong>pipiens</strong><br />
repose sur l’amplification de la région flanquante du microsatellite CQ11 (Bahnck &<br />
Fonseca, 2006). <strong>Le</strong>s amorces utilisées sont les suivantes: pipCQ11R 5‘-<br />
50
CATGTTGAGCTTCGGTGAA-3’, molCQ11R 5‘-CCCTCCAGTAAGGTATCAAC-3’ et<br />
CQ11F2 5‘-GATCCTAGCAAGCGAGAAC-3’. <strong>Le</strong> mix est composé <strong>des</strong> deux amorces<br />
anti-sens à une concentration finale de 0,15 µM, l’amorce sens à 0,25 µM, du<br />
tampon (1X), <strong>des</strong> dNTP à 250 µM, du MgCl2 à 1,5 mM, de la BSA (Bovine serum<br />
slbumin) à 0,135µg/µL, d’une unité de Taq polymerase et de 5 µL de l’extrait d’ADN.<br />
<strong>Le</strong> programme d’amplification commence par 15 min à 94°C, 35 cycles de 94°C<br />
pendant 30s, 54°C pendant 30s et 72°C pendant 40s et pour finir, une phase<br />
d’élongation de 5 min à 72°C.<br />
<strong>Le</strong>s produits de PCR sont séparés par électrophorèse sur un gel d’agarose à 2%.<br />
51
Résultats et discussion<br />
52
1. Compétence vectorielle de <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong> vis-à-vis du <strong>virus</strong> West Nile et <strong>virus</strong><br />
de la fièvre de la vallée du Rift<br />
1.1. Résultats<br />
1.1.1. Réceptivité au VWN<br />
Des femelles de génération F6 de la souche Cx. <strong>pipiens</strong> ”Tabarka”, originaire<br />
de Tunisie, ont été exposées à un repas infectieux contenant du VWN à 10 7.8<br />
UFP/mL. Des lots de 20 femelles ont été sacrifiés à 1, 2, 3, 6, 9, 14 et 21 jours après<br />
l’infection expérimentale. <strong>Le</strong>s salives ont été récoltées en utilisant la technique de<br />
salivation forcée puis titrées sur cellules Vero. La figure 24A donne le taux de<br />
transmission (TT) et le nombre moyen de particules virales par salive exprimé en<br />
Log10 UFP/salive. <strong>Le</strong> VWN est détecté dans la salive dès le 3 ème jour après<br />
l’infection. A ce jour, le TT est de 5% et augmente légèrement jusqu’à J9 post-<br />
infection (pi). A J14 pi, 40% <strong>des</strong> salives testées sont infectées avec un nombre<br />
moyen de particules virales qui est de 1,9 ± 1,2 log10UFP. Chez les femelles<br />
sacrifiées une semaine après (J21 pi), le TT a doublé, il a atteint 80% tandis que le<br />
nombre de particules infectieuses a légèrement diminué (1,7 ± 0,9 log10UFP). Ainsi,<br />
le jour 14 pi a été choisi pour évaluer les taux de transmission et d’infection<br />
disséminée (TID) du VWN pour les populations naturelles de Cx. <strong>pipiens</strong>.<br />
Des femelles de chaque population ont été exposées à un repas infectieux<br />
contenant du VWN à 10 7.8 UFP/mL. Quatorze jours après l’infection orale <strong>des</strong><br />
femelles, toutes les populations testées développent une infection disséminée et<br />
présentent <strong>des</strong> salives infectées. <strong>Le</strong>s TID varient de 59,1% à 100% (Figure 25A) et<br />
les TT de 25% à 83,3% (Figure 25B). <strong>Le</strong> nombre de particules infectieuses varient de<br />
1,0 ± 0,6 log10PFU à 3,5 log10PFU (Figure 25C).<br />
Pour chaque site de récolte, on compare les TID et TT, de la population autogène<br />
(AU) et de la population anautogène (AN). <strong>Le</strong> statut <strong>des</strong> femelles (AU ou AN)<br />
n’influence pas le TID ni le TT à l’exception de deux cas pour lesquels une différence<br />
significative entre les femelles AU et AN a été observée; les TID <strong>des</strong> populations M1<br />
(Maroc-Casablanca) (test exact de Fisher: p=0,02) et les TT <strong>des</strong> populations M2<br />
(Maroc-Mohammedia) (test exact de Fisher: p=0,01). Egalement, le nombre moyen<br />
53
de particules infectieuses par salive ne présente pas de différence significative (test<br />
de Kruskall-Wallis: p>0,05).<br />
54
Figure 24. Taux de transmission et nombre moyen <strong>des</strong> particules virales présentes dans la<br />
salive de Cx <strong>pipiens</strong> ”Tabarka” infecté oralement par le VWN (A) et le VFVR (B)<br />
55
Figure 25. Taux d’infection disséminée (A), taux de transmission (B) et nombre moyen de<br />
particules virales par salive (C) pour les populations naturelles de <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong>, 14 jours<br />
après l’infection avec le <strong>virus</strong> West Nile<br />
56
1.1.2. Réceptivité au VFVR<br />
Des femelles de la souche Cx. <strong>pipiens</strong> ”Tabarka” ont été exposées à un repas<br />
infectieux contenant du VFVR à 10 8,5 UFP/mL. <strong>Le</strong>s résultats obtenus sont présentés<br />
dans la figure 24B. <strong>Le</strong> VFVR est détecté à partir de J3 après l’infection avec un TT<br />
de 10% et 1,3 ± 0,2 log10UFP/salive. <strong>Le</strong> TT reste stable jusqu’à J14 pi pour atteindre<br />
son maximum à J21 pi qui est de 40%. Parallèlement à cela, le nombre moyen de<br />
particules virales dans la salive est à son maximum à J6 avec 1,6 ± 0,4 log10 UFP et<br />
diminue progressivement de J9 à J21. Pour les populations récoltées sur le terrain,<br />
les taux d’infection disséminée (TID) et de transmission (TT) ont été estimés à J14 et<br />
à J21 pi.<br />
<strong>Le</strong>s populations ont été exposées à un repas infectieux contenant du VFVR à<br />
10 8,5 UFP/mL. Quatorze jours après infection, 69,2% <strong>des</strong> populations testées (9/13)<br />
développent une infection disséminée avec <strong>des</strong> TID variant de 6,2% à 38,1% (Figure<br />
26A). Parmi les 9 populations ayant <strong>des</strong> TID positifs, 77,8% (7/9) présentaient <strong>des</strong><br />
salives infectieuses avec <strong>des</strong> TT allant de 10% à 47,1% (Figure 26B). Pour les<br />
populations A1-AU (Algérie-Timimoune autogène) et T1-AN (Tunisie-Tabarka<br />
anautogène), le <strong>virus</strong> a pu disséminer chez les femelles au-delà du tube digestif mais<br />
n’a pas pu infecter les glan<strong>des</strong> salivaires et se concentrer dans la salive. <strong>Le</strong>s<br />
populations AU et AN, ne montrent pas de différence significative en ce qui concerne<br />
les TID et les TT (test exact de Fisher: p>0,05) à l’exception de la population T1 pour<br />
les TT (test exact de Fisher: p=0,004). Par ailleurs, la plupart <strong>des</strong> TT positifs sont<br />
observés chez les femelles AU (6 populations AU et une seule AN) avec un nombre<br />
de particules virales qui varie de 0,6 ± 0,5 log10UFP à 1,7 ± 0,7 log10UFP/salive<br />
(Figure 26C).<br />
En augmentant la période d’incubation extrinsèque de 14 à 21 jours, on note que<br />
78,6% <strong>des</strong> populations testées (11/14) développent une infection disséminée dont<br />
les taux varient de 5% à 36% (Figure 26D). 91% (10/11) <strong>des</strong> populations<br />
présentaient <strong>des</strong> salives infectées. <strong>Le</strong>s TT varient de 6,2% à 50% (Figure 26E). De<br />
plus, aucune différence significative entre les femelles AU et AN n’a été observée<br />
quand on compare les TID et les TT (test exact de Fisher: p>0,05). Sur la totalité <strong>des</strong><br />
populations testées, 78,6% (11/14) présentaient <strong>des</strong> particules virales dans leurs<br />
salives dont le nombre varie de 0,3 log10UFP à 2,4 log10UFP/salive (Figure 26F).<br />
57
L’augmentation de la période d’incubation extrinsèque (PIE) a fait augmenter la<br />
proportion <strong>des</strong> populations avec <strong>des</strong> TID et TT non nuls (de 69,2% à 78,6% pour les<br />
TID et de 53,8% à 78,6% pour les TT). De plus, le nombre de particules virales dans<br />
la salive augmente également en fonction de la PIE même si statistiquement cette<br />
différence n’est pas significative (test de Wilcoxon Rank-sum: p>0,05).<br />
<strong>Le</strong>s femelles autogènes étaient plus capables d’assurer la dissémination et la<br />
transmission du VFVR à J14 et J21, avec <strong>des</strong> pourcentages respectifs de 61,5% et<br />
57,1%.<br />
Pour chaque population, les paramètres évalués à J14 (TID et TT) ont été<br />
comparés entre les infections avec le VWN et le VFVR. Pour les TID, toutes les<br />
populations présentaient <strong>des</strong> différences significatives entre les deux <strong>virus</strong> (test exact<br />
de Fisher: p
Figure 26. Taux d’infection disséminée, taux de transmission et nombre moyen de particules<br />
virales par salive de <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong>, 14 (A, B, C) et 21 jours (D, E, F) après l’infection avec le<br />
<strong>virus</strong> de la fièvre de la vallée du Rift (souche avirulente Clone 13)<br />
59
1.2. Discussion<br />
<strong>Le</strong> <strong>moustique</strong> <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong> est omniprésent dans la région du Maghreb et est<br />
suspecté dans la transmission du VWN et VFVR. Ce travail a permis de démontrer<br />
que les populations de Cx. <strong>pipiens</strong> récoltés au Maroc, en Algérie et en Tunisie sont<br />
très réceptives au VWN et dans une moindre mesure au VFVR.<br />
Après un repas infectieux, le <strong>virus</strong> ingéré doit franchir d’abord la barrière<br />
intestinale. Pour ce faire, le <strong>virus</strong> doit infecter les cellules du tube digestif et gagner<br />
l’hémocèle. Par la suite, le <strong>virus</strong> doit atteindre les glan<strong>des</strong> salivaires et se concentrer<br />
dans la salive, il s’agit de la barrière salivaire. La salive infectée est injectée lors de la<br />
prise de repas sanguin sur un hôte vertébré. L’ensemble <strong>des</strong> barrières peuvent<br />
s’opposer au passage du <strong>virus</strong> (barrières physiques et immunité) et leur efficacité<br />
détermine le degré de compétence vectorielle d’une espèce donnée. Pour les deux<br />
<strong>virus</strong>, VWN et VFVR, la période d’incubation extrinsèque est de 3 jours pour la<br />
colonie de Cx. <strong>pipiens</strong> ”Tabarka”, durée nécessaire à cette espèce pour devenir<br />
infectante après l’ingestion du <strong>virus</strong>.<br />
<strong>Le</strong>s populations de <strong>moustique</strong>s testées dans cette étude ont été collectées<br />
dans 8 sites différents de la région du Maghreb. Infectées oralement avec le VWN,<br />
toutes les populations étaient capables de développer une infection disséminée et de<br />
transmettre le <strong>virus</strong>. Ces résultats obtenus sont en accord avec le rôle important que<br />
joue Cx. <strong>pipiens</strong> dans le cycle de transmission du VWN. <strong>Le</strong>s TID varient de 59% à<br />
100% et les TT de 25% à 100%. <strong>Le</strong> nombre de particules virales dans la salive est<br />
variable et peut atteindre 12800 particules. Pour chaque couple <strong>virus</strong>-<strong>vecteur</strong>, la<br />
compétence vectorielle varie en fonction de la température, la durée d’incubation et<br />
la dose virale. Dans ce travail, le titre viral est de 10 7.8 UFP/mL et la température<br />
d’incubation est de 28°C. Ces deux facteurs affectent la dissémination virale<br />
(Anderson et al., 2010). En effet, la dose nécessaire pour infecter un <strong>vecteur</strong> doit<br />
dépasser le seuil minimum d’infectivité qui est de 10 5 UFP/mL pour Cx. <strong>pipiens</strong><br />
(Turell et al., 2000). Quant aux températures élevées, elles amplifient la réplication<br />
virale (Reisen et al., 2006).<br />
Bien que Cx. <strong>pipiens</strong> présente une compétence vectorielle variable en fonction de la<br />
région géographique (Vaidyanathan &Scott, 2007; Reisen et al., 2008; Kilpatrick et<br />
60
al., 2010), les populations de Cx. <strong>pipiens</strong> du Maghreb, se distinguent par une<br />
compétence comparable d’une région à l’autre.<br />
Pour les infections avec le VFVR, on a utilisé la souche clone 13 qui est une<br />
souche avirulente avec une délétion de 70% du gène NSs qui joue un rôle important<br />
dans la pathogenèse du VFVR (Billecocq et al., 2004; <strong>Le</strong> May et al., 2004) ainsi que<br />
dans la réplication virale dans les <strong>moustique</strong>s. En effet, les <strong>moustique</strong>s infectés avec<br />
une souche virulente du VFVR montrent <strong>des</strong> taux d’infection disséminée plus<br />
important (Moutailler et al., 2010).<br />
Lors de cette étude, les <strong>moustique</strong>s infectés oralement avec le VFVR, ont été<br />
incubés à 28°C pendant 14 jours ou 21 jours. A J14 post-infection, 69,2% <strong>des</strong><br />
populations testées ont développé une infection disséminée dont les taux ont pu<br />
atteindre 38,1%. Ces taux sont plus importants que ceux obtenus auparavant avec<br />
<strong>des</strong> populations de Cx. <strong>pipiens</strong> récoltées en Tunisie (Moutailler et al., 2008) et qui<br />
restent inférieurs à ceux <strong>des</strong> colonies de laboratoire (Faran et al., 1988). La plupart<br />
<strong>des</strong> populations (77,8%) sont capables de transmettre le <strong>virus</strong> avec un nombre<br />
maximal de particules virales de 620 particules par salive. La barrière intestinale<br />
semble être la plus importante barrière pour la dissémination du <strong>virus</strong> (Hardy et al.,<br />
1983). En effet, le <strong>virus</strong> est incapable de la franchir pour aller infecter les glan<strong>des</strong><br />
salivaires d’où la compétence vectorielle modérée de Cx. <strong>pipiens</strong> vis à vis du VFVR<br />
(Turell et al., 1984). Quand on augmente la période d’incubation à 21 jours, 78,6%<br />
<strong>des</strong> populations de <strong>moustique</strong>s développent une infection disséminée dont 91%<br />
présentent <strong>des</strong> salives infectées. Ainsi, en incubant les <strong>moustique</strong>s infectés une<br />
semaine de plus, certaines populations finissent par transmettre le <strong>virus</strong> (Faran et al.,<br />
1987).<br />
Pour chaque site de récolte, deux populations de femelles ont été testées,<br />
autogène (AU) et anautogène (AN). <strong>Le</strong>s deux formes ne possèdent pas la même<br />
compétence vectorielle (Farajollahi et al., 2011). En effet, les résultats obtenus<br />
montrent que les femelles AU étaient plus capables d’assurer la dissémination et la<br />
transmission du VFVR, 14 jours après l’infection tandis que les femelles AN l’étaient<br />
à J21 pi. On peut suggérer que les épizooties sont initiées par <strong>des</strong> <strong>moustique</strong>s de<br />
genre Ae<strong>des</strong> et Ochlerotatus qui sont abondants en zones rurales (Rioux, 1958;<br />
Senevet & Andarelli, 1963; Krida et al., 2012). L’espèce Ae<strong>des</strong> vexans en Afrique de<br />
61
l’Ouest est capable de transmettre le <strong>virus</strong> à ses <strong>des</strong>cendants qui vont initier le cycle<br />
de transmission (Fontenille et al., 1995; Zeller et al., 1997; Fontenille et al., 1998;<br />
Traore-Laminaza et al., 2001).<br />
D’autres épizooties sont associées aux <strong>moustique</strong>s du genre <strong>Culex</strong>. En se basant sur<br />
nos résultats, on peut suggérer que les <strong>moustique</strong>s AN participent faiblement à la<br />
transmission du VFVR dans les zones rurales. <strong>Le</strong>s <strong>moustique</strong>s AU peuvent jouer le<br />
rôle de <strong>vecteur</strong>-pont et transmettre le VFVR aux animaux et à l’homme. Ainsi, un<br />
cycle épizootique/épidémique peut être initié quand les <strong>moustique</strong>s AU deviennent<br />
abondants.<br />
La région du Maghreb présente une frontière commune avec la Mauritanie où la<br />
FVR circule sous forme d’enzooties. En 2010, le <strong>virus</strong> a été rapporté dans une région<br />
extrêmement aride de la Mauritanie qui avoisine le Maroc et l’Algérie. Ceci, justifie la<br />
crainte d’une introduction du <strong>virus</strong> dans cette région (El Mamy et al., 2011). En effet,<br />
l’introduction du VFVR en Egypte 1977 et en Arabie saoudite 2000 était liée au trafic<br />
du bétail (Sall et al., 1998; Abd El-Rahim, 1999).<br />
62
Article 1: <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong>, an experimental<br />
efficient vector of West Nile and Rift valley<br />
fever <strong>virus</strong>es in the Maghreb region<br />
63
2. <strong>Le</strong> statut taxonomique du complexe <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong> au Maroc<br />
2.1. Résultats<br />
Afin d’identifier <strong>des</strong> gîtes larvaires de Cx.<strong>pipiens</strong> parmi ceux prospectés, <strong>des</strong><br />
échantillons de larves ont été prélevés et identifiés morphologiquement. <strong>Le</strong>s gîtes<br />
riches en matières organiques et souvent constitués d’eaux usées sont <strong>des</strong> gîtes<br />
caractéristiques de Cx. <strong>pipiens</strong>. Ce type de gîte est également colonisé par l’espèce<br />
Culiseta longiareolata. Dans certains gîtes, les deux espèces cohabitent. Dans la<br />
zone rurale de Marrakech, une autre espèce Cx. laticinctus est également présente<br />
(Tableau VIII).<br />
<strong>Le</strong>s populations de larves de Cx. <strong>pipiens</strong> ont été récoltées dans 9 gîtes différents à<br />
travers trois régions du Maroc: Tanger, Casablanca/Mohammedia et Marrakech.<br />
Ensuite, ces larves ont été triées puis mis en élevage jusqu’au stade adulte. Au total,<br />
214 adultes ont été caractérisés au niveau moléculaire. La figure 27 montre les<br />
profils caractéristiques de Cx. <strong>pipiens</strong> <strong>pipiens</strong>, Cx. <strong>pipiens</strong> molestus et leurs hybri<strong>des</strong>.<br />
La forme <strong>pipiens</strong> (200/200pb) représente 52,3% <strong>des</strong> adultes analysés, la forme<br />
molestus (250/250pb) représente 22% et la forme hybride (200/250pb) constitue<br />
25,7%. <strong>Le</strong>s résultats obtenus montrent, pour la première fois, la présence de Cx.<br />
<strong>pipiens</strong> sous la forme molestus au Maroc, ainsi que la présence <strong>des</strong> formes hybri<strong>des</strong><br />
entre la forme <strong>pipiens</strong> et la forme molestus en Afrique du Nord. Indistinctement, les<br />
trois formes coexistent dans les gites hypogés et épigés, dans la zone urbaine<br />
périurbaine et rurale et à travers le Maroc (Tableau IX).<br />
72
Tableau VIII. Espèces de larves identifiées dans <strong>des</strong> gites larvaires riches en matières<br />
organiques<br />
Ville Nombre de sites<br />
prospectés<br />
Espèces présentes<br />
Tanger Urbain 2 Cx. <strong>pipiens</strong><br />
Suburbain 6 Cx. <strong>pipiens</strong> (4)<br />
Culiseta longiareolata (2)<br />
Rural 3 Cx. <strong>pipiens</strong> (2)<br />
Marrakech Urbain 0 -<br />
Casablanca/<br />
Mohammedia<br />
Cs. longiareolata (1)<br />
Suburbain 1 Cx <strong>pipiens</strong> et Cs.<br />
Longiareolata<br />
Rural 6 Cx. laticinctus (5)<br />
Cx. <strong>pipiens</strong>, Cs. longiareolata<br />
et Cx. laticinctus (1)<br />
Urbain 2 Cx. <strong>pipiens</strong><br />
Suburbain 2 Cx. <strong>pipiens</strong><br />
Figure 27. Profils <strong>des</strong> produits d’amplification du microsatellite CQ11 de <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong> récolté<br />
à Casablanca (Maroc). M: marqueurs de poids moléculaire (100pb), 1: <strong>Culex</strong>. <strong>pipiens</strong> molestus du<br />
Japon, 2: Cx. <strong>pipiens</strong> forme molestus, 3: forme hybride, 4: Cx. <strong>pipiens</strong> forme <strong>pipiens</strong>.<br />
73
Tableau IX. Identification moléculaire <strong>des</strong> populations de Cx. <strong>pipiens</strong> provenant de Tanger,<br />
Casablanca/Mohammedia et Marrakech<br />
Ville Site Gîte H (%) M (%) P (%) Mâle Femelle Total<br />
Tanger Urbain Epigé 21,7 8,7 69,6 13 10 23<br />
Périurbain Epigé 13 34,8 52,2 11 12 23<br />
Rural Epigé 29,2 8,3 62,5 12 12 24<br />
Casablanca/ Urbain Epigé 51,8 17,2 31 15 14 29<br />
Mohammedia Urbain Hypogé 15,6 59,4 25 17 15 32<br />
Périurbain Epigé 28,6 17,8 53,6 14 14 28<br />
Marrakech Périurbain Epigé 30,4 8,7 60,9 12 12 23<br />
Rural Epigé 17,4 4,3 78,3 12 11 23<br />
Rural Hypogé 11,1 33,3 55,6 5 4 9<br />
(H: forme hybride; M: forme molestus; P: forme <strong>pipiens</strong>)<br />
2.2. Discussion<br />
Cette étude fournit une première évidence moléculaire de la présence de <strong>Culex</strong><br />
<strong>pipiens</strong> sous la forme molestus, la forme <strong>pipiens</strong> et leurs hybri<strong>des</strong> au Maroc. La<br />
forme molestus a été décrite pour la première fois en Egypte. C’est une forme<br />
autogène, sténogame et qui colonise les sites hypogés dans les zones urbaines<br />
(Byrne & Nichols, 1999). Dans ce travail, les deux formes sont détectées dans les<br />
zones urbaines, sub-urbaine et rurales. De plus, elles cohabitent dans les sites<br />
épigés et hypogés comme cela a déjà été rapporté en gites épigés au Sud de<br />
l’Europe et aux USA (Chevillon et al., 1995; Fonseca et al.,2004; Gomes et al., 2009)<br />
ainsi qu’en gites hypogés au Nord de l’Europe (Reusken et al., 2010). <strong>Le</strong>s formes<br />
hybri<strong>des</strong> ont été essentiellement rapportées aux USA (Fonseca et al., 2004; Huang<br />
et al., 2008) et au Sud de l’Europe (Gomes et al., 2009). Dans cette étude, les<br />
hybri<strong>des</strong> sont présents dans tous les gites échantillonnés. Ils ont une importance<br />
épidémiologique de part leurs préférences trophiques intermédiaires. En effet, ils<br />
piquent <strong>des</strong> hôtes aviaires et mammaliens, jouant ainsi le rôle de <strong>vecteur</strong>s ponts et<br />
74
transmettant les pathogènes comme le VWN <strong>des</strong> oiseaux à l’homme (Spielman,<br />
2001; Fonseca et al., 2004; Hamer et al., 2008).<br />
75
Article 2: Molecular evidence of <strong>Culex</strong><br />
<strong>pipiens</strong> form molestus and hybrids<br />
<strong>pipiens</strong>/molestus in Morocco, North Africa<br />
76
Conclusions et perspectives<br />
81
Ce travail a permis d’étudier le complexe <strong>Culex</strong> <strong>pipiens</strong> dans la région du<br />
Maghreb. Un premier volet avait pour objectif l’évaluation de la compétence<br />
vectorielle de Cx. <strong>pipiens</strong> vis-à-vis de deux arbo<strong>virus</strong>; le <strong>virus</strong> West Nile (VWN) et le<br />
<strong>virus</strong> de la fièvre de la vallée de Rift (VFVR). <strong>Le</strong> second volet a permis d’identifier les<br />
différentes formes de Cx. <strong>pipiens</strong> présentes dans le grand Maghreb.<br />
Ce travail s’est inscrit dans le cadre d’un projet s’interessant à la région du<br />
Maghreb qui constitue une zone séparant l’Afrique subsaharienne et l’Europe et<br />
pouvant permettre la transition ou l’émergence de certains arbo<strong>virus</strong> dont le VWN et<br />
le VFVR. Au sein d’un groupe constitué d’équipes pluridisciplinaires du Maroc, de<br />
l’Algerie, de la Tunsisie et de la France et regroupant <strong>des</strong> entomologistes, <strong>des</strong><br />
virologistes et <strong>des</strong> vétérinaires, nous avons montré que la transmission vectorielle est<br />
possible dans cette région surtout pour le <strong>moustique</strong> Cx. <strong>pipiens</strong> qui a été fortement<br />
suspecté dans la transmission du VWN et du VFVR (Faraj et al., 2006; Krida et al.,<br />
1997).<br />
<strong>Le</strong> VWN a émergé d’une façon inattendue dans la région du Maghreb à partir<br />
de 1994 où il a été responsable de cas neurologiques sévères chez l’homme et le<br />
cheval. Par ailleurs, le VFVR ne s’est pas encore manifesté dans cette région.<br />
Cependant, <strong>des</strong> sérologies positives ont mis en évidence une circulation de cet<br />
arbo<strong>virus</strong> dans le Sud marocain chez <strong>des</strong> dromadaires (El Harrak et al., 2011).<br />
Cx. <strong>pipiens</strong> est largement réparti dans la région du Maghreb. Ses larves ont été<br />
retrouvées dans une très grande variété de gîtes, hypogés ou épigés, urbains, peri-<br />
urbains ou ruraux. Dans ce travail, nous avons montré que Cx. <strong>pipiens</strong> dans la région<br />
du Maghreb est un bon <strong>vecteur</strong> expérimental du VWN et dans une moindre mesure<br />
pour le VFVR. Par conséquent, cette espèce pourrait jouer un rôle important dans la<br />
transmission de ces deux arbo<strong>virus</strong> sur l’ensemble de la région maghrébine.<br />
Nos résultats montrent que les deux <strong>virus</strong> ne sont pas transmis avec la même<br />
efficacité. A chacune <strong>des</strong> étapes de sa progression dans l’insecte, depuis son<br />
ingestion jusqu’à sa sécrétion dans la salive, le <strong>virus</strong> doit faire face à différentes<br />
barrières. Elles peuvent concerner l’entrée du <strong>virus</strong> dans les tissus cibles grâce à la<br />
reconnaissance spécifique du <strong>virus</strong> par un récepteur membranaire, l’efficacité de<br />
82
éplication virale régulée par les réponses antivirales du <strong>moustique</strong>, la sortie du <strong>virus</strong><br />
<strong>des</strong> tissus où il s’est répliqué. L’efficacité de franchissement <strong>des</strong> différentes barrières<br />
se traduit par une différence de compétence vectorielle (Kramer & Ebel, 2003). En<br />
laboratoire, le VWN est plus efficacement transmis par Cx. <strong>pipiens</strong> que ne l’est le<br />
VFVR. Hormis la compétence vectorielle, d’autres facteurs en relation avec la<br />
biologie et l’écologie du <strong>moustique</strong> sont à prendre en compte dans l’évaluation <strong>des</strong><br />
risques de transmission. En effet, la seule fois que le VWN a été détecté chez <strong>des</strong><br />
<strong>moustique</strong>s, c’était en 1968 sur un pool de <strong>moustique</strong>s du genre <strong>Culex</strong> récoltés au<br />
sud de l’Algérie, bien avant l’émergence de cette fièvre dans la région du Maghreb<br />
(Pilo-Moron et al., 1968).<br />
Nous avons montré que Cx. <strong>pipiens</strong> existe au Maroc sous la forme <strong>pipiens</strong>, la<br />
forme molestus et la forme hybride <strong>pipiens</strong>/molestus. Cette dernière forme a été mise<br />
en évidence pour la première fois en Afrique du Nord. La forme molestus est<br />
autogène (capable de produire une première ponte sans repas de sang)<br />
contrairement à la forme <strong>pipiens</strong> qui est anautogène. Nous avons donc évalué la<br />
compétence vectorielle vis-à-vis du VWN et VFVR en tenant compte du statut <strong>des</strong><br />
femelles (autogènes ou anautogènes). Pour le VWN, aucune différence de<br />
compétence vectorielle n’a été observée entre les deux formes de l’espèce. Par<br />
contre, les femelles autogènes étaient plus efficaces à transmettrele VFVR. <strong>Le</strong>s<br />
différentes formes de Cx. <strong>pipiens</strong> présentent <strong>des</strong> différences génétiques, ce qui peut<br />
leur conférer <strong>des</strong> compétences vectorielles différentes (Farajollahi et al., 2011). Ceci<br />
a été mis en évidence pour Cx. <strong>pipiens</strong> infecté par le VWN dans le nouveau monde.<br />
En effet, les <strong>moustique</strong>s de la forme <strong>pipiens</strong> et les hybri<strong>des</strong> sont plus sensibles à<br />
l’infection par le VWN (Kilpatrick et al., 2010; Farajollahi et al., 2011). Suite à ce<br />
travail, il serait intéressent d’identifier la forme de Cx. <strong>pipiens</strong>, la plus efficace pour<br />
transmettre l’un ou l’autre <strong>des</strong> deux <strong>virus</strong> en utilisant un typage moléculaire au lieu de<br />
se baser sur le caractère d’autogénie. En effet, l’autogénie est un trait génétique<br />
mais qui est modulé par l’environnement de la larve et essentiellemnt la<br />
photopériode, l’abondance de la nourriture et celle <strong>des</strong> larves en gîte (Eldridge,<br />
1987).<br />
<strong>Le</strong>s préférences trophiques sont un caractère sous contrôle génétique<br />
(Bartholomay et al., 2010), qui diffère d’une espèce à l’autre et aussi, d’une forme à<br />
83
l’autre d’une même espèce. En effet, la forme <strong>pipiens</strong> est décrite comme ornithophile,<br />
la forme molestus comme mammophile et leurs hybri<strong>des</strong> auraient <strong>des</strong> préférences<br />
trophiques mixtes piquant à la fois les oiseaux et les mammifères. L’étude <strong>des</strong><br />
préférences trophiques serait un axe de recherche à développer pour mieux définir<br />
les contacts trophiques et ainsi, mieux définir le rôle <strong>vecteur</strong> de chaque forme de Cx.<br />
<strong>pipiens</strong>.<br />
En théorie, les arbo<strong>virus</strong> peuvent être introduits par <strong>des</strong> <strong>vecteur</strong>s infectés ou un<br />
hôte vertébré en phase de virémie. Pour le VWN, les oiseaux migrateurs ont été,<br />
depuis longtemps, suspectés d’être à l’origine de l’introduction du VWN dans de<br />
nouvelles zones (Zeller & Murgue, 2001). Dans la région du Maghreb, <strong>des</strong> sérologies<br />
positives ont été mises en évidence chez <strong>des</strong> oiseaux et chez l’homme au Maroc<br />
suggérant une circulation enzootique du <strong>virus</strong> (Figuerola et al., 2009).<br />
Dans le cas du VFVR, l’introduction par importation de produits animaux ainsi que<br />
par voyageur contaminé est également probable. Cependant, seul l’introduction par<br />
le bétail est confirmée (Sall et al., 1998; Abd El-Rahim et al., 1999). Ceci peut être<br />
possible à partir de la Mauritanie, un pays endémique pour le VFVR, vers les pays du<br />
Maghreb.<br />
Par conséquent, une surveillance <strong>des</strong> deux arbo<strong>virus</strong> doit être mise en place et de<br />
nombreux axes de recherche restent à être développés pour mieux définir la<br />
compétence <strong>des</strong> <strong>vecteur</strong>s, la réceptivité <strong>des</strong> animaux, les facteurs environnementaux<br />
conduisant à la survenue d’épizooties et les conditions de maintien du <strong>virus</strong> dans la<br />
nature (réservoirs).<br />
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