Biochimie Métabolique AC AM, SP & TBioMol.

BIOCHIMIE METABOLIQUE
ère ANNEE DE MEDECINE
2012
1 ère
METABOLISME DES ACIDES AMINES
SYNTHESE PROTEIQUE & TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
Pr. Alami – Ouahabi Naïma
1

Transaminases
Le métabolisme de l'azote
Métabolisme général des acides aminés
Les acides aminés du métabolisme sont tous des acides -aminés aminés de la série
L.
Les réactions du métabolisme qui concernent ces deux fonctions sont donc
communes à de nombreux acides aminés et constituent le métabolisme
général des acides aminés.
Ce métabolisme général comprend des transaminations, des
décarboxylations décarboxylations et des désaminations dont nous allons voir des exemples.
Le catabolisme des acides aminés conduit à des produits finaux différents
suivant les circonstances physiologiques,
glucose ou corps cétoniques à jeûn,
triglycérides de réserve en période de stockage,
gaz carbonique et énergie durant l'effort.
Les voies de gluconéogénèse, cétogénèse et lipogénèse à partir des acides
aminés forment des schémas généraux du catabolisme de ces substrats.
2

• Il existe toute une sous sous-classe classe d'enzymes qui catalysent le transfert de la fonction
amine entre les acides aminés et les acides -cétoniques
cétoniques : les transaminases.
• Ces enzymes permettent l'entrée des acides aminés glucoformateurs dans la
gluconéogénèse.
• Toutes ces enzymes ont pour coenzyme lié le phosphate de pyridoxal.
• Toutes Toutes ces enzymes sont régulées par le cortisol, qui induit leur synthèse dans les
cellules qui catabolisent des protéines.
3

Exemple de transaminase : aspartate aminotransférase
4

Glutamate déshydrogénase
5

Exemple de décarboxylase : Histidine décarboxylase
6

Mono Amine Oxydase = MAO
Les monoamine oxydases (MAO (MAO-A A et MAO MAO-B) B) sont des flavoprotéines de l'intestin, du foie, des
reins et de nombreux autres organes qui catalysent la désamination oxydative des amines
aromatiques contenues dans les aliments ou les produits de la digestion. Elles évitent la
pénétration de ces amines vasoconstrictives ou toxiques dans l'organisme comme la tyramine.
Les monoamine monoamine oxydases sont aussi présentes dans le système nerveux central, qui participent
au catabolisme des amines endogènes (noradrénaline).
L'eau oxygénée produite au cours de cette réaction est détruite par la catalase ou une
peroxydase.
7

Gluconéogénèse à partir des acides aminés
8

Lipogénèse à partir des acides aminés
9

Cétogénèse à partir des acides aminés
10

Métabolisme de l'ammoniac
12

Schéma de l'uréogénèse
L'uréogénèse est une voie métabolique exclusivement hépatique, dont les enzymes se répartissent
entre la matrice mitochondriale, le cytoplasme et les membranes du reticulum endoplasmique.
13

Les métabolismes propres des acides aminés
Le métabolisme des radicaux monocarbonés
26

La phosphoglycérate déshydrogénase est l’enzyme qui commence la voie métabolique de
synthèse de la sérine à partir du 3-phosphoglycérate, intermédiaire de la glycolyse
cytoplasmique.
• Le 3-phospho-hydroxypyruvate est ensuite transaminé par une sérine aminotransférase qui
produit une 3-phospho-L-sérine.
• Cette 3-phospho-L-sérine est enfin hydrolysée par une phosphatase qui permet d’aboutir à la
sérine.
• Par cette synthèse, ces enzymes conduisent à la sérine et au glycocolle, qui sont des
précurseurs
importants des radicaux monocarbonés, de la choline et de nombreux composés méthylés
ou formylés.
27

Le métabolisme des acides aminés glucoformateurs (Ala,
Ser, Thr, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Orn, Arg, His)
30

Précurseurs de l’α-cétoglutarate (schéma général)
36

Métabolisme des acides aminés soufrés (schéma général)
Métabolisme des acides aminés soufrés (schéma général)
37

Le produit de la réaction, cystéine sulfinate, sera ensuite transaminé, puis
perdra son SO2 et
le pyruvate restant conduira au cycle de Krebs ou, en cas de jeune, à la
gluconéogénèse.
• La cystéine est donc un acide aminé glucoformateur.
40

Le métabolisme des acides aminés branchés (Leu, Ile, Val) et de la lysine
(schéma général)
Deux transaminases spécifiques de la leucine et de l'isoleucine d'une part, de la
valine d'autre part font la transamination de ces aminoacides dans les mitochondries 41
(muscles, coeur, foie).

Précurseurs
de l’acétoacétate
Les acides aminés qui sont dégradés par les voies de β-oxydation, libèrent de
l’acétyl-CoA, lequel peut être le substrat du cycle de Krebs, mais aussi dans le
foie à jeun, de la cétogénèse. Mais il s’agit d’acides aminés peu abondants
(tryptophane, lysine, isoleucine)
• La leucine est le principal acide aminé cétogène parce que son métabolisme
conduit entièrement à l’HMG-CoA
43

Le métabolisme des acides aminés aromatiques (Phe, Tyr, Trp) (schéma général)
• Dans le déficit en phénylalanine hydroxylase, le catabolisme normal devient impossible.
• Une autre transaminase transforme alors la phénylalanine en phényl pyruvate.
• Ce dernier donne ensuite plusieurs métabolites, phénylacétate, phényllactate,
• qui sont neurotoxiques et responsables de l'oligophrénie phénylpyruvique.
• La détoxification de ces derniers se fait par une glutamoconjuguaison du phénylacétate.
46

La phénylalanine hydroxylase catalyse la transformation irréversible de
phénylalanine en tyrosine.
Le déficit en phénylalanine hydroxylase est responsable de l’oligophrénie phénylpyruvique
ou phénylcétonurie.
Les dérivés du catabolisme de la phénylalanine (phénylpyruvate) sont
directement toxiques pour les neurones.
En cas de déficit en phénylalanine hydroxylase, ce catabolisme commence par
une transamination qui conduit au phénylpyruvate, puis au phénylacétate ou au
phényllactate.
47

La transamination de la tyrosine est une réaction d’une aminotransférase spécifique,
qui catalyse le transfert de la fonction amine de la tyrosine vers l’α-cétoglutarate
qu’elle transforme en glutamate, tandis que la tyrosine donne un parahydroxyphénylpyruvate.
• La tyrosine transaminase a pour coenzyme le phosphate de pyridoxal.
• Le parahydroxyphényl-pyruvate peut être métabolisé par une décarboxylation
suivie d’une oxydation.
Le produit de la réaction s’appelle l’homogentisate, qui sera ensuite oxydé en
maléyl-acétoacétate, puis isomérisé en fumaryl-acétoacétate et en fin scindé en
fumarate et en acétoacétate.
49

Les autres molécules azotées: Métabolisme des porphyrines
50

Biosynthèse des porphyrines (schéma général)
52

Bilirubine libre (indirecte)
•La dégradation de l'hème dans le système réticulo endothélial assure 85 % de la
production de la bilirubine libre.
• Le reste provient de la dégradation des autres chromoprotéines (cytochromes,
catalases, ...)
• La bilirubine libre est insoluble dans l'eau. En conséquence, elle est liée à une
lysine de la sérumalbumine pour son transport dans le plasma.
• Le taux de cette bilirubine « libre » est de 5 à 17 µmol/L (3 à 10 mg/L).
• La bilirubine est captée par les hépatocytes, conjuguée par l'UDP-glucuronosyl
transférase et excrétée dans la bile .
53

Métabolisme de la créatine
Précurseurs du phosphate de créatine
Le phosphate de créatine est synthétisé dans les cellules à partir des acides aminés.
54

STRUCTURE DE LA CHROMATINE
Condensation de la chromatine dans les cellules
somatiques
la molécule d’ADN nucléaire est fortement associée à des
protéines pour constituer la la chromatine.
Les complexes protéines-ADN sont appelés nucléosomes.
Le nucléosome contient de l’ADN enroulé autour d’un
« core » constitué de 8 protéines appelées histones
2x (H2A H2B, H3 et H4).
56

Les histones sont des protéines de petit poids moléculaire
(11-14 k Da);
Les histones sont riches en acides aminés basiques (+);
L’histone H1 n’appartient pas au nucléosome, mais permet le
contact entre deux nucléosomes.
L’ enroulements successif de 6 nucléosomes forme des structures
de type solénoïde.
Les solénoïdes forment des domaines (boucles de solénoïdes) de
60 kb (60. 000 pb).
Les boucles de solénoïdes s’enroulent ou s’empilent afin de
former une mini bande chromosomale
Les mini bandes s’empilent pour former un chromosome
57

Le projet du Génome Humain
le séquençage complet des 3 10 9 pb en
juin 2001
Chez l’homme :
•3 10 9 pb,
•100.000 gènes,
•46 chromosomes
(2 x 23)
58

LES TOPOISOMÉRASES
Les topoisomérases sont des enzymes qui modifient le
nombre d’enlacements. Elles augmentent ou diminuent le
nombre de supertours dans les molécules d’ADN double
brin.
Les topoisomérases de type I: Coupent transitoirement et
ressoudent un seul brin d’ADN double brin. Ils peuvent
agir sur de l’ADN superenroulé positif ou négatif.
Les topoisomérases II : coupent de manière transitoire
les deux brins de l’ADN, puis les ressoudent et agissent
uniquement sur l’ADN superenroulé négatif (exemple:
gyrase bactérienne).
Les topoisomérases I & II permettent de désenrouler
(relacher) l’ADN.
61

Rôle des topoisomérases
Les deux types de topoisomérases ont une
importance capitale dans la réplication , la
transcription et la recombinaison de l’ADN. chez les
procaryotes et les eucaryotes.
Ces enzymes sont également la cible d’agents
médicamenteux, soit par exemple :
•les agents anti-bactériens de la classe des quinolones
qui inhibent les gyrases bactériennes
•ou les agents anti-cancéreux, (le taxol )qui agissent
en tant que anti topo isomérases I.
Exemple de poison anti topoisomérase I : ts HMG
62

INFORMATION GENETIQUE
Expression Génétique :
Transcription &Traduction
Réplication & Cycle Cellulaire
63

Définitions :
La double hélice
Expression Génétique
64

L’acide désoxyribonucléique (ADN ou DNA), constitué de deux
chaînes de nucléotides monophosphates, liés chacun par une
liaison ester entre son carbone 3’ et le carbone 5’ du nucléotide
suivant.
Ces deux chaînes de nucléotides sont unies entre elles par des
liaisons hydrogènes pour former un hybride en forme de double
hélice dont les deux brins sont : antiparallèles & complémentaires.
Chaque adénine (A) d’un des deux brins est liée par deux liaisons
hydrogène avec une thymine (T) de l’autre brin, et chaque guanine
(G) d’un brin est liée par trois liaisons hydrogène avec une cytosine
(C) de l’autre brin.
De sorte que si on désigne les nucléotides par les lettres A, C, G et T
en fonction des bases azotées qu’ils contiennent, on peut lire sur
cette figure le texte suivant :
AGAGTCGTCTCGAGTCA...
...TCTCAGCAGAGCTCAGT
65

• Écrire à la suite les lettres A, C, G et T dans l’ordre où on rencontre les
nucléotides sur l’un des brins de l’ADN de l’extrémité 5’ à l’extrémité 3’
aboutit à un texte.
• Le texte ainsi transcrit contient toute l’information nécessaire pour la
synthèse d’une protéine). C’est pourquoi on appelle ce brin d’ADN le brin «
sens ». L’autre brin est le brin complémentaire ou brin « antisens ».
• L’ensemble de l’information génétique transmise par chacun des parents à
un enfant (génome haploïde) est contenue ainsi en 3 x 10 9 nucléotides.
•Ces 3 x 10 9 nucléotides d’information génétique constituent
des gènes = séquences codantes = exons = cadres ouvert de lecture (Open
Reading Frames = ORF).
•Ces gènes sont copiés dans le noyau en tRNA ou rRNA ou mRNA =
Transcription.
•Seuls les mRNA sont traduit dans le cytoplasme en protéines = Traduction.
66

Gène
67

•Pour permettre la biosynthèse d’une protéine, il doit y avoir dans la
structure de l’ADN, une séquence de nucléotides qui constitue le
gène de cette protéine.
•Il existe des séquences régulatrices = éléments régulateurs ou
promoteur:
généralement proximal en amont du gène
Le promoteur peut être en aval ou distal du gène et ne devient
proximal que lors de la transcription et ceci via des remaniements
structuraux de la chromatine).
Le promoteur est une séquence non-transcrite et non-traduite.
•Une région génique ou locus peut contenir une suite variable
d’exons (ORFs transcrites et traduites) et d’introns ( sequences
non-codantes)
• L’ensemble des mécanismes qui à partir de la séquence du gène
(ADN) conduisent à la production d’un acide ribonucléique (ARN) est
désigné sous le terme de Transcription
ARNm proteine == traduction
Transcription & traduction == expression génétique.
68

Brin sens & Brin antisens
•Tout le DNA n’est pas transcrit seuls les gènes = exons = ORFs Sont
transcrits.
•En plus même si l’ADN est double brin seul un brin est transcrit ou
copié en mRNA.
•Le mRNA est complémentaire & antiparallèle au brin d’ADN transcrit
(nommé: Brin antisens)
•Le mRNA est identique à l’autre brin non transcrit
(nommé: Brin sens).
5’….AGCTTAACGCGTA…. 3’ Brin DNA sens=
non transcrit=informatif.
3’….TCGAATTGCGCAT…. 5’ Brin de DNA
Transcription
antisens=transcrit.
5’….AGCUUAACGCGUA…. 3’ mRNA
69

1.A. La transcription
70

• Les nucléotides qui précèdent l’exon contiennent de nombreuses
séquences reconnues par des protéines nucléaires qui permettent
le début (initiation) & la régulation de la transcription. C’est le
promoteur
• On distingue en particulier :
— vers -20 -30 (20 à 30 nucléotides en amont de l’exon 1 en
direction de l’extrémité 5’ du brin sens) une séquence TATATA
appelée « boîte TATA », qui est spécifiquement reconnue par la
protéine TFIID, cofacteur de la RNA-polymérase II ;
— vers -80 une séquence GGCCCATCCAT à la fois « boîte CAT ou
CAAT » et « boîte GC », sur laquelle viennent se fixer d’autres
protéines de la transcription (CTF et Sp-1) ;
— de nombreuses autres séquences sont des sites de fixation des
protéines régulatrices de la transcription. Par exemple, une
séquence TRE (TGACTCA) au début de la troisième ligne de la
sequence, sur laquelle vont se fixer des protéines de la famille AP-1
pour activer la transcription.
71

Cis- et trans-régulateurs
72

Initiation de la transcription
73

• Vers la fin du gène la RNA-polymérase rencontre une
séquence 3’-TTATTT-5’ qu’elle reconnaît comme un
signal de fin d’activité. La transcription s’arrête en effet
peu après ce signal qui est transcrit en AAUAAA.
• La RNA-polymérase quitte l’ADN et libère le transcrit
d’ARN qui contient l’information génétique recopiée
pour permettre l’expression du gène sous forme de
protéine.
78

Modifications du transcrit
79

Excision - épissage
80

Formation du lasso
81

Codon
82

Code génétique
83

• La séquence codante est une suite de codons dont
chacun permet d’incorporer spécifiquement un acide
aminé dans la synthèse d’une protéine.
• Le code génétique est le même pour tous les êtres
vivants de la biosphère (universel). Il existe quelques
variations (codons propres à la biosynthèse des protéines
dans les mitochondries).
• Le code génétique comporte 61 codons pour signifier les
20 acides aminés qui participent à la synthèse des
protéines :
chaque acide aminé peut être codé par plusieurs codons
(de un à six) qui diffèrent en général par leur troisième
nucléotide. On dit que le code est dégénéré.
84

Ribosome eucaryote
85

•
Polyribosomes
86

ARN de transfert
87

Cadre de lecture
88

Incorporation d’un acide aminé
• Un ARNt chargé vient se fixer sur le site A libre. Le codon du messager au
fond du site A va se lier complémentairement avec l’anticodon de l’ARNt du
nouvel acide aminé ce qui va permettre l’incorporation de cet acide aminé dans
le peptide en cours de synthèse.
89

Transfert du peptide
Le ribosome catalyse alors le transfert du peptide situé sur l’ARNt du site P sur
la fonction amine de l’acide aminé de l’ARNt du site A. Il utilise pour cela,
l’énergie de l’hydrolyse de la liaison ester riche en énergie entre le peptide et
l’ARNt du site P.
90

Translocation des codons
• L’ARNt libre du site peptidique quitte le ribosome.
• Le messager, l’ARNt restant et le peptide en cours de synthèse sont alors
déplacés (translocation) du site A vers le site P, sans qu’il y ait fusion de
l’hybride entre le codon et l’anticodon
91

Terminaison de la traduction
• Lorsque le site A se trouve en regard d’un codon nonsens
annonçant la fin de la traduction, le complexe va
se dissocier du messager en présence d’un dernier
cofacteur eRF.
• Les deux sous-unités du ribosome se dissocient, la
protéine synthétisée est libérée, ainsi que le dernier
ARNt.
92

Signal-peptide
• Lorsqu’une protéine est synthétisée, sa structure secondaire ou
tertiaire se construit au fur et à mesure de la traduction et elle est libérée
dans le cytoplasme.
• Lorsque cette protéine est destinée à être incorporée dans les
membranes ou les organites de la cellule, la partie codante de l’ARN
messager commence par une séquence de quelques acides aminés qui
sert d’adresse pour l’incorporation de cette protéine dans la membrane.
• Ces peptides orientent la destinée de la protéine : incorporation dans
les membranes (reticulum endoplasmique, appareil de Golgi, membrane
plasmique, lysosomes...), entrée dans les mitochondries, excrétion hors
de la cellule via l’appareil de Golgi, etc...
• Le signal-peptide est un peptide d’adressage situé à l’extrémité NH 2 -
terminale des protéines à excréter. Parce que sa fonction est de pénétrer
dans la membrane du reticulum endoplasmique, sa structure est riche en
acides aminés hydrophobes (Phe, Leu, Ile, Met, Val).
94

Polyribosomes liés
• Les polyribosomes qui se forment sur un messager comportant
un signal peptide ont une évolution légèrement différente. La
traduction s’arrête peu après la synthèse du signal-peptide, dès
que celui-ci apparaît hors de la structure du ribosome et se lie avec
la SRP (SRP = Signal Recognition Particle), qui inhibe l’élongation.
• Pour que l’élongation puisse se poursuivre, il faut que la SRP soit
reconnue spécifiquement par un récepteur de la membrane du
reticulum endoplasmique. Dès que cette liaison est établie, le
ribosome est lié par la ribophorine, toujours dans la membrane du
reticulum, près d’une protéine qui ouvre un pore à travers cette
membrane. Le SRP écarté, l’élongation va reprendre.
96

• Le peptide en cours de synthèse est alors dirigé à
travers cette membrane pour se développer dans la
lumière du reticulum endoplasmique.
• A la face interne de la membrane une
endopeptidase spécifique va couper le signal
peptide et la synthèse se poursuivra jusqu’à la
terminaison. La protéine sera enfin incorporée dans
une membrane ou exportée, à travers l’appareil de
Golgi, vers l’extérieur de la cellule.
• L’adressage des protéines vers les mitochondries
fait appel à un autre type de peptide d’adressage qui
conduit les peptides à traverser la membrane
mitochondriale.
97

modifications chimiques se produisent après l’incorporation
des acides aminés dans la structure primaire de la protéine
(traduction); on les appelle:
modifications post-traductionnelles.
• On distingue des modifications cotraductionnelles qui se
produisent alors que la traduction se poursuit encore et que le
peptide naissant est encore attaché au ribosome qui l’a
construit, des modifications post-traductionnelles proprement
dites qui ont lieu dans la cellule, dans les organites ou hors de
la cellule.
• On appelle protéine mature la forme chimique définitive que
la protéine montrera au moment où elle remplira sa fonction
dans l’organisme.
99

100

Addition de sucres: Glycosylation
101

102

103

Le cycle cellulaire
• La vie de la cellule se déroule entre deux mitoses. Chez les Mammifères,
cette période dure en moyenne 30 heures bien qu’il y ait des cellules dont la
vie soit très courte ou au contraire très longue.
• Durant ces trente heures la cellule traverse quatre phases :
— la phase G1 où le génome étant diploïde, chaque gène est représenté en
deux exemplaires. La chromatine est accessible aux RNA-polymérases qui
transcrivent les gènes en messagers, qui seront à leur tour traduits. Phase de
préparation à la synthèse d’ADN.
— vers la moitié du cycle commence la réplication de l’ADN : les DNA- DNA-
polymérases vont mettre environ 8 heures (phase S) pour recopier en double
l’ADN de chaque chromosome. Durant cette phase la transcription est
inhibée. Phase de synthèse d’ADN.
— puis la cellule entre en phase G2 où chaque gène est représenté en quatre
exemplaires. La chromatine est à nouveau accessible aux RNA-polymérases
qui recommencent à transcrire. Phase de réparation des mutations.
— enfin survient la mitose, qui donne naissance à deux cellules filles.
Chacune recevra une des copies identiques de l’ADN de chaque
chromosome et chaque gène y sera représenté en deux exemplaires.
104

105

106

107

Mutations génétiques & systèmes de réparations
LES TYPES DE MUTATION DE L’ADN.
• Les mutations sont définies comme un changement
transmissible dans le matériel génétique.
• Ces mutations peuvent concerner les cellules germinales
ou les cellules somatiques.
• Elles peuvent être spontanées ou consécutives à des
altérations des bases puriques ou pyrimidiques.
• Elles peuvent être provoquées par des dysfonctionnements
au cours de la réplication ou de la réparation de l’ADN.
• On peut classer les mutations selon l’étendue de la lésion
de l’ADN: les macrolésions et les microlésions.
108

Les macrolésions de l’ADN.
Dans ce groupe, on peut ranger:
- Les délétions (amputations de matériel génétique
d’amplitude variable).
- Les duplications.
- Les amplifications (multiplication de séquences.
- Les fusions de gènes.
- Les inversions (changement d’orientation tête-bêche d’un
segment variable d’ADN).
- Les insertions de séquences d’ADN.
109

Les microlésions.
Dans ce cadre, on range les mutations ponctuelles de
l’ADN.
délétion, insertion ou substitution, d’un nucléotide par
un autre.
La substitution d’une paire de bases par une autre peut
s’agir
d’une transition ou d’une transversion;
La transition: correspond au remplacement d’une base
purique par une autre base purique ou
une base pyrimidique par une autre base
pyrimidique.
La transversion: correspond au remplacement d’une
base purique est par une pyrimidine ou
d’une pyrimidine par une purine.
110

LES SYSTÈMES DE SAUVEGARDE ET RÉPARATEURS
DE L’ADN
GÉNÉRALITÉS.
Les erreurs de réplication ne sont pas totalement
réparées par édition
L’ADN est sensible à des agressions soit chimiques soit
physiques.
Ces agressions peuvent entraîner la perte de base, des
substitutions de nucléotides, des pont de thymine…
Des mécanismes puissants, cependant non infaillibles
sont présents dans la cellule pour déceler et corriger les
lésions de l’ADN.
111

L’excision-réparation de base.
Ce type de réparation est communément utilisé pour éliminer les
bases incorrectes (comme l’uracile) ou les bases transformées par
des agents alkylants.
Il comprend trois étapes successives:
Tout d’abord, une élimination de la base incorrecte par une
ADN N-glycosylase avec apparition d’un site
site AAP.
Puis, une coupure du brin d’ADN endommagé en 5’ du site
AP, créant ainsi un -OH OH (3’) ’) adjacent au site AP AP.
Enfin, l’extension à partir de cet -OH OH (3’) ’) par une ADN
polymérase est réalisée avec excision du site AP.
La soudure finale est assurée par une ADN ADN-ligase ligase.
112

L’excision L’excision-réparation réparation de nucléotide.
nucléotide
Bien que l’excision-réparation de base joue un rôle très important
comme processus de réparation de l’ADN, elle ne peut pas suffire à
corriger toutes les erreurs dans l’ADN.
En particulier, la disponibilité des ADN N-glycosylases ne peut pas être
étendue à toutes les altérations possibles des bases de l’ADN.
Un autre mécanisme plus flexible de réparation est impliqué. Ce
mécanisme est appelé excision excision--réparation réparation de de nucléotide. nucléotid Il est disponible
dans tous les organismes vivants et il implique les étapes suivantes:
Tout d’abord, la reconnaissance du dommage sur l’ADN.
Puis une liaison d’un complexe multi-protéique avec le site
endommagé.
Une double excision du brin endommagé suit avec coupure
plusieurs nucléotides en 5’ et en 3’ de celui-ci.
La lacune présente est comblée par une ADN polymérase.
Une soudure finale est ensuite assurée par une ADN-ligase.
113

Un tel système de réparation existe également chez les
cellules eucaryotes.
On connait d’ailleurs chez l’Homme,
des anomalies génétiques du système de réparation par
excision-réparation responsables de maladies
génétiques graves,
la xérodermie pigmentaire (entraînant une sensibilité
accrue aux rayons solaires et une augmentation du
risque de cancers cutanés),
mais aussi le syndrome de Bloom ou la maladie de
Fanconi.
114

115

Les recherches thérapeutiques
Le petit nombre de malades et le faible débouché commercial
qu'offrent les maladies rares telles que le XP
Mais depuis quelques années, les recherches se sont multipliées et
elles ont permis de mieux comprendre les mécanismes de la maladie.
Evolution des recherches:
En 1988: Caractéristiques cliniques génétiques et cellulaires.
Développement d'un test anténatal. anténatal. Activation des oncogènes dans les
tumeurs épithéliales isolées de malades atteints du XP
En 1990: Une carence en ADN hélicase serait responsable de certaines
formes formes de de XP XP et et du du syndrome syndrome de de Cockayne. Cockayne. Clonage Clonage du du gène et de
l'ADNc de groupe A du XP
En 1996: La thérapie génique envisageable. Une nouvelle technique de
correction génétique des cellules a été mise au point.
Elle permet, grâce à une construction rétrovirale, de produire des
lignées de fibroblastes de peau de malades au phénotype guéri.
Cela constitue donc une première étape vers la correction des
kératinocytes de malades et peut peut-être être un jour la production in vitro
d'un épithélium génétiquement corrigé pouvant servir de greffon.
En 1998: Comment l'absence d'interaction entre une hélicase et son
régulateur est à l'origine d'une maladie génétique.
En 2001: Reconstruction in vitro de peau de patients atteints de XP
116

117

Les réparations post post-réplicatives
réplicatives.
Si le système de réparation par excision-resynthèse de l’ADN est
débordé, et surtout si les zones d’ADN à réparer coïncident avec la
présence de fourches de réplication, il est évident que le brin
porteur de la lésion devient impropre à servir de matrice.
Dans de telles conditions, le brin parental contiendra un dimère de
thymine et l’autre brin fils contiendra une lacune, on parle de
lacune post-réplicative. C’est une lésion grave de l’ADN.
Pour traiter de telles lésions, un système de réparation approprié va
protéines Rec
être mis en oeuvre. Il s’agit du système des protéines
Rec (pour
Recombinaison). Ce système de réparation fait donc intervenir une
recombinaison.
La recombinaison correspond à un échange d’ADN ente deux
segments homologues. Cette correction fera également intervenir
le système de réparation par excision-resynthèse de l’ADN.
Chez E. coli, la production de la protéine de recombinaison appelée
RecA est réduite dans les conditions normales. Ceci est lié à une
répression de la synthèse par un répresseur protéique appelé LexA 118
(voir contrôle de la transcription).

119

120

Le système S.O.S.
Le système S.O.S. a été décrit initialement chez les
bactéries. Il concerne au moins une vingtaine de gènes
dont les produits protéiques sont impliqués dans les
mécanismes de réparation et de recombinaison. Ce
système est remarquable parce qu’il est inductible, c’està-dire
mis en oeuvre par l’agression physique ou
chimique.
La protéine de recombinaison RecA joue un rôle central
dans un tel mécanisme de sauvegarde.
La synthèse de cette protéine est normalement réprimée
par une protéine appelée LexA ou répresseur.
Si un besoin important de protéine RecA apparaît, la
répression est levée grâce à une propriété particulière de
la protéine RecA qui est capable de cliver son
121
répresseur
répresseur.

Biologie moléculaire du cancer
Mécanisme de l’oncogénèse
INTRODUCTION
La survenue dans un organisme d'une tumeur cancéreuse est
liée à l'émergence d'un clone cellulaire échappant aux lois qui
régissent la prolifération et la cohabitation cellulaire normales.
La cellule cancéreuse se caractérise par 2 propriétés
fondamentales :
1/ la capacité de se reproduire au delà des limites fixées par le
renouvellement naturel du tissu auquel elle appartient et
2/ le pouvoir de coloniser des territoires tissulaires
normalement réservés à d'autres catégories cellulaires.
Ces 2 propriétés sont communes à l'ensemble des cellules
d'une même tumeur ce qui suggère que toute la population est
issue d'une seule cellule devenue anormale.
122

MECANISME DE L'ONCOGENESE
L'ADN = siège des altérations successives
L’origine monoclonale de la population de cellules formant
une tumeur a pu être vérifiée dans de nombreux cas à l'aide
de marqueurs génétiques
L'analyse d'une tumeur maligne indique que toutes les
cellules expriment la même forme et donc que la masse
tumorale correspond à l'expansion d'un clone cellulaire.
123

L'anomalie responsable de la transformation cancéreuse,
virale ou non, est transmissible par division cellulaire et
consiste en une altération majeure de l'information
génétique, c'est à dire une mutation de l'ADN. Du reste, la
majorité des agents carcinogènes s'avèrent être
également des agents mutagènes.
124

Filière virale
Le chef de file des retrovirus tumorigènes est le Virus du
Sarcome de Rous (RSV), virus à ARN, dont l'intégration dans
le génome d' une cellule est possible grâce à la retrotranscriptase,
(une enzyme qui permet la transcription de
l'ARN en ADN).
Son pouvoir transformant est entièrement contenu dans le
gène src, dont l'insertion dans le génome de la cellule hôte
peut provoquer la transformation cancéreuse. On en retrouve
un équivalent dans le génome de toutes les cellules normales
de l'hôte et de nombreuses autres espèces.
Cet homologue cellulaire d'un oncogène viral est un gène
cellulaire non transformant ou protooncogéne.
125

Oncogenes Retroviraux
Les proto oncogènes codent pour des protéines qui jouent un rôle
central dans la stimulation de la division cellulaire. Les oncogènes
d’origine retro virale sont classés en 4 groupes:
1. Facteurs de croissance, (C-sis) & récepteurs de facteurs de
croissance (C fms & CerbB);
2. “GTP-binding proteins”, (C h-ras, C k-ras, C n-ras);
3. “Tyrosine specific protein kinases” (C abl, C fes, C fgr, C fps,
Cros, C src, and C yes);
“ serine/threonine specific protein kinases” (C mil, C mos, C
raf).
4. “ Transcription regulators”(C fos, C jun, C erb A, C myc, C myb,
&Cets).
Les protéines produites par les Proto oncogènes, sont alterées
par des mutations, infections viral, ou agents carcinogénique. Ces
protéines oncogéniques codent pour des protéines modifiées et
sur exprimées qui stimulent une division cellulaire anormale.
126

Les protéines des antioncogènes
•La protéine oncogénique p 105-Rb, codée par le gène
"suppresseur" Rb appartient au système de contrôle de la
prolifération cellulaire. Elle représente par exemple le point
d'impact de l'activité de certains oncogènes comme le E1A,
provenant des adenovirus. La protéine codée par cet oncogène
d'origine virale (adénovirus) agit par formation d'un complexe avec
p 105-Rb qui entraine l'inactivation de celle-ci.
•La protéine p53 a été identifiée comme la protéine cellulaire qui se
couple à l'antigène T, produit transformant du virus simien SV 40.
La protéine p53 peut être considérée comme la « gardienne du
génôme ".
A la suite d'une lésion affectant l'ADN (rayonnement UV, exposition
à un mutagène), elle agit comme un agent décisionnel qui
provoquerait soit l'arrêt de la division cellulaire soit l'apoptose.
L'ensemble de ces phénomènes contribue à la stabilité de
l'intégrité génétique.
127

Retinoblastome
Origine Moléculaire & Genetique
Perte de fonction du gène “RB”
gène suppresseur de tumeurs
mutation Germinale du gène suppresseur de
tumeurs « RB »
Substitution: C T
chromosome 13
inactivation de son expression
Retinoblastome héréditaire ou sporadique,
Cancer infantile
cause des tumeurs multiples impliquant les
deux yeux,
Ou une tumeur isolé au niveau d’un oeil
128

Neurofibromatoses
Origine Moléculaire & Genetique
Perte de fonction du gène “NF1”
gène suppresseur de tumeurs
locus du gène: sur le chromosome 17
Le gène NF1 produit:
la Neurofibromine
(une protéine activatrice de la GTPase)
Maladie génétique autosomique & dominante
Cause des neurofibromes multiples
& une prédisposition au tumeurs du système
nerveux
129

Interaction de la protéine P53 avec la double
hélice d’ADN
gène P53:
localisé sur chromosome 17
Code pour une protéine de 53 kD
« DNA-binding nuclear protein »
« Transcription factor »
Facteur clef de la régulation du cycle
cellulaire
Perte de fonction de P53
Cause des types multiples de cancer
130

Catégories de thérapies géniques utilisées pour lutter
contre le cancer.
Introduction de gènes suppresseurs de tumeurs dans les cellules
tumorales
Déclencher ou augmenter la réaction immunitaire dans les cellules
cancéreuses:
• Introduction de gènes de cytrokines dans les cellules tumorales
• Réintroduction des cellules génétiquement modifiée chez le patient
Ainsi la production de Cytokine dans les cellules cancéreuses active leur
immunité
Augmenter l’antigenecité des cellules tumorales:
• Introduire le gène de HLA-B7 dans les mélanomes malignes
(via les vecteurs retroviraux , ou via le complexe DNA/Liposome)
131
• déclencher une forte réponse immunitaire allogénique au site tumoral.

Introduction of “gènes suicide” directement dans les tumeurs:
• Le gène de la thymidine kinase du virus herpes simplex
« HSV-TK gene ».
• Cette kinase virale rend les cellules susceptible à être tuées par
« Ganciclovir ».
•Transfert Préférentiel du gène HSV-TK à la masse tumorale
•éradication Complète de la masse tumorale par l’effet “bystander”
Protéger le système hematopoietique du patient des effets toxique
de la chimiothérapie à haute dose:
• Introduction de gènes de résistance à la chimiothérapie :
Le gène « MDR-1 » code pour une protéine (P glycoprotéine), utilisé
une pompe (a multi drug efflux pump) qui enlève les agents chimiothérapeutique
des cellules.
132

TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
•CLONAGE
•EXTRACTION ADN, ARN
•DIGESTION DE L’ADN PAR LES ENZYMES DE RESRTICTION
•SEPARATION DE L’ADN & L’ARN SUR GEL D’AGAROSE
•SEPARATION DES PROTEINES SUR GEL DE POLYACRYLAMIDE
•VISUALISATION DE L’ADN: COLORATION AU BROMURE
D’ETHIDIUM
•TRANSFERT DE L’ADN, L’ARN & LES PROTEINES SUR
MEMBRANES DE NITROCELLULOSE « SOUTHERN, NORTHERN &
WESTERN BLOTS »
•MARQUAGE DES SONDES, HYBRIDATION & AUTORADIOGRAPHIE
•SEQUENÇAGE D’ADN.
•PCR
•ORGANISMES TRANSGENIQUES
•EMPREINTES D’ADN
•RFLPS
•HYBRIDATION IN SITU.
133

134

135

136

137

LA PCR EN TEMPS RÉEL
techni chniques ques moléculaires de génotypage en
temps réel
138

La ‘Polymerase
Polymerase Chain Reaction Reaction’ ’ PCR :
un outil crucial en diagnostic moléculaire
permet une détection sensible et spécifique des cibles
d’acides nucléiques.
Le suivie en temps réel de la PCR:
accélération et une simplification considérable
des procédures de laboratoire
quantification, l’amplification et la détection de
mutations au niveau des séquences cibles.
139

Le système Light Cycler RD
Le système Light Cycler
Le LC* est un appareil fondé sur
le principe de PCR quantitative
en temps réel.
Il permet donc la détection et la
quantification de marqueurs
fluorescents dont l’émission est
directement proportionnelle à la
quantité d’amplicons générés
pendant la réaction de PCR.
Les mesures sont effectuées en
phase exponentielle , plutôt qu’en
point final
Les systèmes de détection :
-les agents se liant à l’ADN
double brin
( exp : SYBR Green I qui est un
fluorophore capable de se lier au
sillon mineur de l’ADN double
brin )et ,
-les sondes fluorescentes
140

Les sondes fluorescentes :
deux sondes ( Hybridization probes ) :
Méthode de détection est basée sur le principe FRET
(Fluorescence Resonance Energy Transfer):
deux sondes oligonucléotidiques linéaires complémentaires à une
séquence cible
• 1ère sonde , dite sonde d’ancrage , bloquée à son extrémité 3’
afin de prévenir son extension durant l’étape d’élongation et
transporte en 3’ un fluorochrome donneur ( fluorescéine )
qui émet une lumière verte à 530 nm lorsque excité par une
source de lumière
• une deuxième sonde d’hybridation marquée en 5’ avec le LC
Red 640 (fluorochrome accepteur ).
141

En solution, les deux sondes sont libres et
séparées .
Lorsque,lors de l’étape d’hybridation ,les
deux sondes se fixent à leur séquences
respectives ,…
elles se trouvent très proches l’une de
l’autre , cette proximité permet le transfert
énergétique de la Fluorescéine verte par le
FRET au fluorochrome accepteur rouge ...
Et provoque son émission rouge détectée
par le spectrofluorimètre .
Pendant l’étape d’élongation, les sondes
retournent de façon indépendante en
solution ce qui supprime la fluorescence
rouge .
142

Les courbes de fusion :
Chaque produit d’ADN double brin synthétisé à une température de fusion Tm
spécifique définie comme étant la température à laquelle 50 % de l’ADN est
sous forme double brin et 50% sous forme simple brin .
Tm dépend essentiellement de la longueur du fragment d’ADN double brin et de
la teneur en GC de ce fragment (et aussi du degré d’homologie entre les deux
brins d’ADN
Analyse des courbes de fusion utilisant le SYBR Green I :
1/ le SYBR Green I est fluorescent tant qu’il est lié à l’ADN double brin ,
2/ quand la température augmente l’ADN double brin se dissocie , ce qui
entraîne la libération du SYBR Green dans le milieu et une diminution
progressive de la fluorescence ,
3/ lorsque 50% de l’ADN double brin sont dissociés , la fluorescence chute
brutalement , c’est cette température qui correspond à la température de fusion
du produit synthétisé.
La température de fusion est obtenue , en traçant la dérivée première négative
de la fluorescence en fonction de la température : elle correspond au maximum
de la courbe
143

Analyse des mutations par le LightCycler :
• Par analyse des courbes de fusion en utilisant les sondes
d’hybridation(oligonucléotides):
• Les deux sondes sont normalement complémentaires à une
région spécifique au niveau de la séquence amplifiée.
• Si le gène amplifié présente une mutation ponctuelle au
niveau de cette région , on peut avoir un ou plusieurs
mésappariements (mismatches).
• En effet la Tm ne dépend pas uniquement de la longueur et du
contenu en GC, mais aussi du degré d’homologie entre les deux
brins d’ADN.
• Les sondes d’hybridation liés à l’ADN dans un appariement
parfait nécessitent une Tm supérieure pour les séparer que ceux
liées à l’ADN contenant des mésappariements qui le
déstabilisent .
• Le mismatch réduit donc la Tm de l’oligonucléotide,cette
diminution peut être détectée grâce à l’analyse des courbes de 144
fusion.

145

Diagnostique des maladies génétiques,
Diagnostique génétique précoce des infections
virales et du cancer:
146

FISH
147

FISH
FDA-approved kit for HER-2 testing by FISH and follow the scoring and interpretation
recommended by the manufacturer. In this procedure, the chromosome 17 centromere
is marked with a green florescent signal and HER-2 gene with an orange florescent
signal. A tumor is designated as “positive” for gene amplification if gene-tochromosome
(17) ratio is >2.0
148

Microarrays: Biopuces
149

La biopuce à ADN est une plaque de verre ou de silicium sur laquelle sont gravées un
grand nombre de microcuvettes.
Sur chacune d’entre elles, on accroche une séquence de bases d’ADN, qui joue le rôle
de sonde et qui est caractéristique d’un gène, d’une mutation ou d’une maladie.
On prélève alors de l’ADN sur le patient et on le verse dans les microcuvettes.
L’ADN-sonde se liera avec l’ADN du prélèvement si et seulement si les séquences sont
complémentaires. On lave ensuite la biopuce.
Pour permettre la lecture du résultat, on a préalablement accroché à l’extrémité de
l’ADN du prélèvement une molécule fluorescente.
Ainsi, dans les microcuvettes où il y a eu appariement, l’ADN du prélèvement est resté
accroché à l’ADN-sonde et est visible à la lumière ultraviolette grâce à la molécule
fluorescente.
Dans les microcuvettes où il n’y a pas eu d’appariement, l’ADN du prélèvement a été
enlevé par le lavage et il n’y a pas de signal lumineux.
150

Tissue Microarrays
151

Techniques de diagnostique génétique du cancer
FISH
PCR en temp réel
microarrays ou Biopuces
Permettent
La détection des mutation de marqueurs
génétiques de cancer
La détection de l'amplification génique de
marqueurs de métastase
Orientent vers un pronostic plus précis
Des choix thérapeutiques mieux ciblés
Une meilleure prise en charge des patients
cancereux
Un diagnostic précoce ou préventif (PCR en temps
réel & microarrays)
152