Biochimie Métabolique AC AM, SP & TBioMol.
Biochimie Métabolique AC AM, SP & TBioMol.
Biochimie Métabolique AC AM, SP & TBioMol.
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
BIOCHIMIE METABOLIQUE<br />
ère ANNEE DE MEDECINE<br />
2012<br />
1 ère<br />
METABOLISME DES <strong>AC</strong>IDES <strong>AM</strong>INES<br />
SYNTHESE PROTEIQUE & TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE<br />
Pr. Alami – Ouahabi Naïma<br />
1
Transaminases<br />
Le métabolisme de l'azote<br />
Métabolisme général des acides aminés<br />
Les acides aminés du métabolisme sont tous des acides -aminés aminés de la série<br />
L.<br />
Les réactions du métabolisme qui concernent ces deux fonctions sont donc<br />
communes à de nombreux acides aminés et constituent le métabolisme<br />
général des acides aminés.<br />
Ce métabolisme général comprend des transaminations, des<br />
décarboxylations décarboxylations et des désaminations dont nous allons voir des exemples.<br />
Le catabolisme des acides aminés conduit à des produits finaux différents<br />
suivant les circonstances physiologiques,<br />
glucose ou corps cétoniques à jeûn,<br />
triglycérides de réserve en période de stockage,<br />
gaz carbonique et énergie durant l'effort.<br />
Les voies de gluconéogénèse, cétogénèse et lipogénèse à partir des acides<br />
aminés forment des schémas généraux du catabolisme de ces substrats.<br />
<br />
2
• Il existe toute une sous sous-classe classe d'enzymes qui catalysent le transfert de la fonction<br />
amine entre les acides aminés et les acides -cétoniques<br />
cétoniques : les transaminases.<br />
• Ces enzymes permettent l'entrée des acides aminés glucoformateurs dans la<br />
gluconéogénèse.<br />
• Toutes ces enzymes ont pour coenzyme lié le phosphate de pyridoxal.<br />
• Toutes Toutes ces enzymes sont régulées par le cortisol, qui induit leur synthèse dans les<br />
cellules qui catabolisent des protéines.<br />
3
Exemple de transaminase : aspartate aminotransférase<br />
4
Glutamate déshydrogénase<br />
5
Exemple de décarboxylase : Histidine décarboxylase<br />
6
Mono Amine Oxydase = MAO<br />
Les monoamine oxydases (MAO (MAO-A A et MAO MAO-B) B) sont des flavoprotéines de l'intestin, du foie, des<br />
reins et de nombreux autres organes qui catalysent la désamination oxydative des amines<br />
aromatiques contenues dans les aliments ou les produits de la digestion. Elles évitent la<br />
pénétration de ces amines vasoconstrictives ou toxiques dans l'organisme comme la tyramine.<br />
Les monoamine monoamine oxydases sont aussi présentes dans le système nerveux central, qui participent<br />
au catabolisme des amines endogènes (noradrénaline).<br />
L'eau oxygénée produite au cours de cette réaction est détruite par la catalase ou une<br />
peroxydase.<br />
<br />
7
Gluconéogénèse à partir des acides aminés<br />
8
Lipogénèse à partir des acides aminés<br />
9
Cétogénèse à partir des acides aminés<br />
10
Métabolisme de l'ammoniac<br />
12
Schéma de l'uréogénèse<br />
L'uréogénèse est une voie métabolique exclusivement hépatique, dont les enzymes se répartissent<br />
entre la matrice mitochondriale, le cytoplasme et les membranes du reticulum endoplasmique.<br />
13
Les métabolismes propres des acides aminés<br />
Le métabolisme des radicaux monocarbonés<br />
26
La phosphoglycérate déshydrogénase est l’enzyme qui commence la voie métabolique de<br />
synthèse de la sérine à partir du 3-phosphoglycérate, intermédiaire de la glycolyse<br />
cytoplasmique.<br />
• Le 3-phospho-hydroxypyruvate est ensuite transaminé par une sérine aminotransférase qui<br />
produit une 3-phospho-L-sérine.<br />
• Cette 3-phospho-L-sérine est enfin hydrolysée par une phosphatase qui permet d’aboutir à la<br />
sérine.<br />
• Par cette synthèse, ces enzymes conduisent à la sérine et au glycocolle, qui sont des<br />
précurseurs<br />
importants des radicaux monocarbonés, de la choline et de nombreux composés méthylés<br />
ou formylés.<br />
27
Le métabolisme des acides aminés glucoformateurs (Ala,<br />
Ser, Thr, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Orn, Arg, His)<br />
30
Précurseurs de l’α-cétoglutarate (schéma général)<br />
36
Métabolisme des acides aminés soufrés (schéma général)<br />
Métabolisme des acides aminés soufrés (schéma général)<br />
37
Le produit de la réaction, cystéine sulfinate, sera ensuite transaminé, puis<br />
perdra son SO2 et<br />
le pyruvate restant conduira au cycle de Krebs ou, en cas de jeune, à la<br />
gluconéogénèse.<br />
• La cystéine est donc un acide aminé glucoformateur.<br />
40
Le métabolisme des acides aminés branchés (Leu, Ile, Val) et de la lysine<br />
(schéma général)<br />
Deux transaminases spécifiques de la leucine et de l'isoleucine d'une part, de la<br />
valine d'autre part font la transamination de ces aminoacides dans les mitochondries 41<br />
(muscles, coeur, foie).
Précurseurs<br />
de l’acétoacétate<br />
Les acides aminés qui sont dégradés par les voies de β-oxydation, libèrent de<br />
l’acétyl-CoA, lequel peut être le substrat du cycle de Krebs, mais aussi dans le<br />
foie à jeun, de la cétogénèse. Mais il s’agit d’acides aminés peu abondants<br />
(tryptophane, lysine, isoleucine)<br />
• La leucine est le principal acide aminé cétogène parce que son métabolisme<br />
conduit entièrement à l’HMG-CoA<br />
43
Le métabolisme des acides aminés aromatiques (Phe, Tyr, Trp) (schéma général)<br />
• Dans le déficit en phénylalanine hydroxylase, le catabolisme normal devient impossible.<br />
• Une autre transaminase transforme alors la phénylalanine en phényl pyruvate.<br />
• Ce dernier donne ensuite plusieurs métabolites, phénylacétate, phényllactate,<br />
• qui sont neurotoxiques et responsables de l'oligophrénie phénylpyruvique.<br />
• La détoxification de ces derniers se fait par une glutamoconjuguaison du phénylacétate.<br />
46
La phénylalanine hydroxylase catalyse la transformation irréversible de<br />
phénylalanine en tyrosine.<br />
Le déficit en phénylalanine hydroxylase est responsable de l’oligophrénie phénylpyruvique<br />
ou phénylcétonurie.<br />
Les dérivés du catabolisme de la phénylalanine (phénylpyruvate) sont<br />
directement toxiques pour les neurones.<br />
En cas de déficit en phénylalanine hydroxylase, ce catabolisme commence par<br />
une transamination qui conduit au phénylpyruvate, puis au phénylacétate ou au<br />
phényllactate.<br />
47
La transamination de la tyrosine est une réaction d’une aminotransférase spécifique,<br />
qui catalyse le transfert de la fonction amine de la tyrosine vers l’α-cétoglutarate<br />
qu’elle transforme en glutamate, tandis que la tyrosine donne un parahydroxyphénylpyruvate.<br />
• La tyrosine transaminase a pour coenzyme le phosphate de pyridoxal.<br />
• Le parahydroxyphényl-pyruvate peut être métabolisé par une décarboxylation<br />
suivie d’une oxydation.<br />
Le produit de la réaction s’appelle l’homogentisate, qui sera ensuite oxydé en<br />
maléyl-acétoacétate, puis isomérisé en fumaryl-acétoacétate et en fin scindé en<br />
fumarate et en acétoacétate.<br />
49
Les autres molécules azotées: Métabolisme des porphyrines<br />
50
Biosynthèse des porphyrines (schéma général)<br />
52
Bilirubine libre (indirecte)<br />
•La dégradation de l'hème dans le système réticulo endothélial assure 85 % de la<br />
production de la bilirubine libre.<br />
• Le reste provient de la dégradation des autres chromoprotéines (cytochromes,<br />
catalases, ...)<br />
• La bilirubine libre est insoluble dans l'eau. En conséquence, elle est liée à une<br />
lysine de la sérumalbumine pour son transport dans le plasma.<br />
• Le taux de cette bilirubine « libre » est de 5 à 17 µmol/L (3 à 10 mg/L).<br />
• La bilirubine est captée par les hépatocytes, conjuguée par l'UDP-glucuronosyl<br />
transférase et excrétée dans la bile .<br />
53
Métabolisme de la créatine<br />
Précurseurs du phosphate de créatine<br />
Le phosphate de créatine est synthétisé dans les cellules à partir des acides aminés.<br />
54
STRUCTURE DE LA CHROMATINE<br />
Condensation de la chromatine dans les cellules<br />
somatiques<br />
la molécule d’ADN nucléaire est fortement associée à des<br />
protéines pour constituer la la chromatine.<br />
Les complexes protéines-ADN sont appelés nucléosomes.<br />
Le nucléosome contient de l’ADN enroulé autour d’un<br />
« core » constitué de 8 protéines appelées histones<br />
2x (H2A H2B, H3 et H4).<br />
56
Les histones sont des protéines de petit poids moléculaire<br />
(11-14 k Da);<br />
Les histones sont riches en acides aminés basiques (+);<br />
L’histone H1 n’appartient pas au nucléosome, mais permet le<br />
contact entre deux nucléosomes.<br />
L’ enroulements successif de 6 nucléosomes forme des structures<br />
de type solénoïde.<br />
Les solénoïdes forment des domaines (boucles de solénoïdes) de<br />
60 kb (60. 000 pb).<br />
Les boucles de solénoïdes s’enroulent ou s’empilent afin de<br />
former une mini bande chromosomale<br />
Les mini bandes s’empilent pour former un chromosome<br />
57
Le projet du Génome Humain<br />
le séquençage complet des 3 10 9 pb en<br />
juin 2001<br />
Chez l’homme :<br />
•3 10 9 pb,<br />
•100.000 gènes,<br />
•46 chromosomes<br />
(2 x 23)<br />
58
LES TOPOISOMÉRASES<br />
Les topoisomérases sont des enzymes qui modifient le<br />
nombre d’enlacements. Elles augmentent ou diminuent le<br />
nombre de supertours dans les molécules d’ADN double<br />
brin.<br />
Les topoisomérases de type I: Coupent transitoirement et<br />
ressoudent un seul brin d’ADN double brin. Ils peuvent<br />
agir sur de l’ADN superenroulé positif ou négatif.<br />
Les topoisomérases II : coupent de manière transitoire<br />
les deux brins de l’ADN, puis les ressoudent et agissent<br />
uniquement sur l’ADN superenroulé négatif (exemple:<br />
gyrase bactérienne).<br />
Les topoisomérases I & II permettent de désenrouler<br />
(relacher) l’ADN.<br />
61
Rôle des topoisomérases<br />
Les deux types de topoisomérases ont une<br />
importance capitale dans la réplication , la<br />
transcription et la recombinaison de l’ADN. chez les<br />
procaryotes et les eucaryotes.<br />
Ces enzymes sont également la cible d’agents<br />
médicamenteux, soit par exemple :<br />
•les agents anti-bactériens de la classe des quinolones<br />
qui inhibent les gyrases bactériennes<br />
•ou les agents anti-cancéreux, (le taxol )qui agissent<br />
en tant que anti topo isomérases I.<br />
Exemple de poison anti topoisomérase I : ts HMG<br />
62
INFORMATION GENETIQUE<br />
Expression Génétique :<br />
Transcription &Traduction<br />
Réplication & Cycle Cellulaire<br />
63
Définitions :<br />
La double hélice<br />
Expression Génétique<br />
64
L’acide désoxyribonucléique (ADN ou DNA), constitué de deux<br />
chaînes de nucléotides monophosphates, liés chacun par une<br />
liaison ester entre son carbone 3’ et le carbone 5’ du nucléotide<br />
suivant.<br />
Ces deux chaînes de nucléotides sont unies entre elles par des<br />
liaisons hydrogènes pour former un hybride en forme de double<br />
hélice dont les deux brins sont : antiparallèles & complémentaires.<br />
Chaque adénine (A) d’un des deux brins est liée par deux liaisons<br />
hydrogène avec une thymine (T) de l’autre brin, et chaque guanine<br />
(G) d’un brin est liée par trois liaisons hydrogène avec une cytosine<br />
(C) de l’autre brin.<br />
De sorte que si on désigne les nucléotides par les lettres A, C, G et T<br />
en fonction des bases azotées qu’ils contiennent, on peut lire sur<br />
cette figure le texte suivant :<br />
AGAGTCGTCTCGAGTCA...<br />
...TCTCAGCAGAGCTCAGT<br />
65
• Écrire à la suite les lettres A, C, G et T dans l’ordre où on rencontre les<br />
nucléotides sur l’un des brins de l’ADN de l’extrémité 5’ à l’extrémité 3’<br />
aboutit à un texte.<br />
• Le texte ainsi transcrit contient toute l’information nécessaire pour la<br />
synthèse d’une protéine). C’est pourquoi on appelle ce brin d’ADN le brin «<br />
sens ». L’autre brin est le brin complémentaire ou brin « antisens ».<br />
• L’ensemble de l’information génétique transmise par chacun des parents à<br />
un enfant (génome haploïde) est contenue ainsi en 3 x 10 9 nucléotides.<br />
•Ces 3 x 10 9 nucléotides d’information génétique constituent<br />
des gènes = séquences codantes = exons = cadres ouvert de lecture (Open<br />
Reading Frames = ORF).<br />
•Ces gènes sont copiés dans le noyau en tRNA ou rRNA ou mRNA =<br />
Transcription.<br />
•Seuls les mRNA sont traduit dans le cytoplasme en protéines = Traduction.<br />
66
Gène<br />
67
•Pour permettre la biosynthèse d’une protéine, il doit y avoir dans la<br />
structure de l’ADN, une séquence de nucléotides qui constitue le<br />
gène de cette protéine.<br />
•Il existe des séquences régulatrices = éléments régulateurs ou<br />
promoteur:<br />
généralement proximal en amont du gène<br />
Le promoteur peut être en aval ou distal du gène et ne devient<br />
proximal que lors de la transcription et ceci via des remaniements<br />
structuraux de la chromatine).<br />
Le promoteur est une séquence non-transcrite et non-traduite.<br />
•Une région génique ou locus peut contenir une suite variable<br />
d’exons (ORFs transcrites et traduites) et d’introns ( sequences<br />
non-codantes)<br />
• L’ensemble des mécanismes qui à partir de la séquence du gène<br />
(ADN) conduisent à la production d’un acide ribonucléique (ARN) est<br />
désigné sous le terme de Transcription<br />
ARNm proteine == traduction<br />
Transcription & traduction == expression génétique.<br />
68
Brin sens & Brin antisens<br />
•Tout le DNA n’est pas transcrit seuls les gènes = exons = ORFs Sont<br />
transcrits.<br />
•En plus même si l’ADN est double brin seul un brin est transcrit ou<br />
copié en mRNA.<br />
•Le mRNA est complémentaire & antiparallèle au brin d’ADN transcrit<br />
(nommé: Brin antisens)<br />
•Le mRNA est identique à l’autre brin non transcrit<br />
(nommé: Brin sens).<br />
5’….AGCTTA<strong>AC</strong>GCGTA…. 3’ Brin DNA sens=<br />
non transcrit=informatif.<br />
3’….TCGAATTGCGCAT…. 5’ Brin de DNA<br />
Transcription<br />
antisens=transcrit.<br />
5’….AGCUUA<strong>AC</strong>GCGUA…. 3’ mRNA<br />
69
1.A. La transcription<br />
70
• Les nucléotides qui précèdent l’exon contiennent de nombreuses<br />
séquences reconnues par des protéines nucléaires qui permettent<br />
le début (initiation) & la régulation de la transcription. C’est le<br />
promoteur<br />
• On distingue en particulier :<br />
— vers -20 -30 (20 à 30 nucléotides en amont de l’exon 1 en<br />
direction de l’extrémité 5’ du brin sens) une séquence TATATA<br />
appelée « boîte TATA », qui est spécifiquement reconnue par la<br />
protéine TFIID, cofacteur de la RNA-polymérase II ;<br />
— vers -80 une séquence GGCCCATCCAT à la fois « boîte CAT ou<br />
CAAT » et « boîte GC », sur laquelle viennent se fixer d’autres<br />
protéines de la transcription (CTF et Sp-1) ;<br />
— de nombreuses autres séquences sont des sites de fixation des<br />
protéines régulatrices de la transcription. Par exemple, une<br />
séquence TRE (TG<strong>AC</strong>TCA) au début de la troisième ligne de la<br />
sequence, sur laquelle vont se fixer des protéines de la famille AP-1<br />
pour activer la transcription.<br />
71
Cis- et trans-régulateurs<br />
72
Initiation de la transcription<br />
73
• Vers la fin du gène la RNA-polymérase rencontre une<br />
séquence 3’-TTATTT-5’ qu’elle reconnaît comme un<br />
signal de fin d’activité. La transcription s’arrête en effet<br />
peu après ce signal qui est transcrit en AAUAAA.<br />
• La RNA-polymérase quitte l’ADN et libère le transcrit<br />
d’ARN qui contient l’information génétique recopiée<br />
pour permettre l’expression du gène sous forme de<br />
protéine.<br />
78
Modifications du transcrit<br />
79
Excision - épissage<br />
80
Formation du lasso<br />
81
Codon<br />
82
Code génétique<br />
83
• La séquence codante est une suite de codons dont<br />
chacun permet d’incorporer spécifiquement un acide<br />
aminé dans la synthèse d’une protéine.<br />
• Le code génétique est le même pour tous les êtres<br />
vivants de la biosphère (universel). Il existe quelques<br />
variations (codons propres à la biosynthèse des protéines<br />
dans les mitochondries).<br />
• Le code génétique comporte 61 codons pour signifier les<br />
20 acides aminés qui participent à la synthèse des<br />
protéines :<br />
chaque acide aminé peut être codé par plusieurs codons<br />
(de un à six) qui diffèrent en général par leur troisième<br />
nucléotide. On dit que le code est dégénéré.<br />
84
Ribosome eucaryote<br />
85
•<br />
Polyribosomes<br />
86
ARN de transfert<br />
87
Cadre de lecture<br />
88
Incorporation d’un acide aminé<br />
• Un ARNt chargé vient se fixer sur le site A libre. Le codon du messager au<br />
fond du site A va se lier complémentairement avec l’anticodon de l’ARNt du<br />
nouvel acide aminé ce qui va permettre l’incorporation de cet acide aminé dans<br />
le peptide en cours de synthèse.<br />
89
Transfert du peptide<br />
Le ribosome catalyse alors le transfert du peptide situé sur l’ARNt du site P sur<br />
la fonction amine de l’acide aminé de l’ARNt du site A. Il utilise pour cela,<br />
l’énergie de l’hydrolyse de la liaison ester riche en énergie entre le peptide et<br />
l’ARNt du site P.<br />
90
Translocation des codons<br />
• L’ARNt libre du site peptidique quitte le ribosome.<br />
• Le messager, l’ARNt restant et le peptide en cours de synthèse sont alors<br />
déplacés (translocation) du site A vers le site P, sans qu’il y ait fusion de<br />
l’hybride entre le codon et l’anticodon<br />
91
Terminaison de la traduction<br />
• Lorsque le site A se trouve en regard d’un codon nonsens<br />
annonçant la fin de la traduction, le complexe va<br />
se dissocier du messager en présence d’un dernier<br />
cofacteur eRF.<br />
• Les deux sous-unités du ribosome se dissocient, la<br />
protéine synthétisée est libérée, ainsi que le dernier<br />
ARNt.<br />
92
Signal-peptide<br />
• Lorsqu’une protéine est synthétisée, sa structure secondaire ou<br />
tertiaire se construit au fur et à mesure de la traduction et elle est libérée<br />
dans le cytoplasme.<br />
• Lorsque cette protéine est destinée à être incorporée dans les<br />
membranes ou les organites de la cellule, la partie codante de l’ARN<br />
messager commence par une séquence de quelques acides aminés qui<br />
sert d’adresse pour l’incorporation de cette protéine dans la membrane.<br />
• Ces peptides orientent la destinée de la protéine : incorporation dans<br />
les membranes (reticulum endoplasmique, appareil de Golgi, membrane<br />
plasmique, lysosomes...), entrée dans les mitochondries, excrétion hors<br />
de la cellule via l’appareil de Golgi, etc...<br />
• Le signal-peptide est un peptide d’adressage situé à l’extrémité NH 2 -<br />
terminale des protéines à excréter. Parce que sa fonction est de pénétrer<br />
dans la membrane du reticulum endoplasmique, sa structure est riche en<br />
acides aminés hydrophobes (Phe, Leu, Ile, Met, Val).<br />
94
Polyribosomes liés<br />
• Les polyribosomes qui se forment sur un messager comportant<br />
un signal peptide ont une évolution légèrement différente. La<br />
traduction s’arrête peu après la synthèse du signal-peptide, dès<br />
que celui-ci apparaît hors de la structure du ribosome et se lie avec<br />
la SRP (SRP = Signal Recognition Particle), qui inhibe l’élongation.<br />
• Pour que l’élongation puisse se poursuivre, il faut que la SRP soit<br />
reconnue spécifiquement par un récepteur de la membrane du<br />
reticulum endoplasmique. Dès que cette liaison est établie, le<br />
ribosome est lié par la ribophorine, toujours dans la membrane du<br />
reticulum, près d’une protéine qui ouvre un pore à travers cette<br />
membrane. Le SRP écarté, l’élongation va reprendre.<br />
96
• Le peptide en cours de synthèse est alors dirigé à<br />
travers cette membrane pour se développer dans la<br />
lumière du reticulum endoplasmique.<br />
• A la face interne de la membrane une<br />
endopeptidase spécifique va couper le signal<br />
peptide et la synthèse se poursuivra jusqu’à la<br />
terminaison. La protéine sera enfin incorporée dans<br />
une membrane ou exportée, à travers l’appareil de<br />
Golgi, vers l’extérieur de la cellule.<br />
• L’adressage des protéines vers les mitochondries<br />
fait appel à un autre type de peptide d’adressage qui<br />
conduit les peptides à traverser la membrane<br />
mitochondriale.<br />
97
modifications chimiques se produisent après l’incorporation<br />
des acides aminés dans la structure primaire de la protéine<br />
(traduction); on les appelle:<br />
modifications post-traductionnelles.<br />
• On distingue des modifications cotraductionnelles qui se<br />
produisent alors que la traduction se poursuit encore et que le<br />
peptide naissant est encore attaché au ribosome qui l’a<br />
construit, des modifications post-traductionnelles proprement<br />
dites qui ont lieu dans la cellule, dans les organites ou hors de<br />
la cellule.<br />
• On appelle protéine mature la forme chimique définitive que<br />
la protéine montrera au moment où elle remplira sa fonction<br />
dans l’organisme.<br />
99
100
Addition de sucres: Glycosylation<br />
101
102
103
Le cycle cellulaire<br />
• La vie de la cellule se déroule entre deux mitoses. Chez les Mammifères,<br />
cette période dure en moyenne 30 heures bien qu’il y ait des cellules dont la<br />
vie soit très courte ou au contraire très longue.<br />
• Durant ces trente heures la cellule traverse quatre phases :<br />
— la phase G1 où le génome étant diploïde, chaque gène est représenté en<br />
deux exemplaires. La chromatine est accessible aux RNA-polymérases qui<br />
transcrivent les gènes en messagers, qui seront à leur tour traduits. Phase de<br />
préparation à la synthèse d’ADN.<br />
— vers la moitié du cycle commence la réplication de l’ADN : les DNA- DNA-<br />
polymérases vont mettre environ 8 heures (phase S) pour recopier en double<br />
l’ADN de chaque chromosome. Durant cette phase la transcription est<br />
inhibée. Phase de synthèse d’ADN.<br />
— puis la cellule entre en phase G2 où chaque gène est représenté en quatre<br />
exemplaires. La chromatine est à nouveau accessible aux RNA-polymérases<br />
qui recommencent à transcrire. Phase de réparation des mutations.<br />
— enfin survient la mitose, qui donne naissance à deux cellules filles.<br />
Chacune recevra une des copies identiques de l’ADN de chaque<br />
chromosome et chaque gène y sera représenté en deux exemplaires.<br />
104
105
106
107
Mutations génétiques & systèmes de réparations<br />
LES TYPES DE MUTATION DE L’ADN.<br />
• Les mutations sont définies comme un changement<br />
transmissible dans le matériel génétique.<br />
• Ces mutations peuvent concerner les cellules germinales<br />
ou les cellules somatiques.<br />
• Elles peuvent être spontanées ou consécutives à des<br />
altérations des bases puriques ou pyrimidiques.<br />
• Elles peuvent être provoquées par des dysfonctionnements<br />
au cours de la réplication ou de la réparation de l’ADN.<br />
• On peut classer les mutations selon l’étendue de la lésion<br />
de l’ADN: les macrolésions et les microlésions.<br />
108
Les macrolésions de l’ADN.<br />
Dans ce groupe, on peut ranger:<br />
- Les délétions (amputations de matériel génétique<br />
d’amplitude variable).<br />
- Les duplications.<br />
- Les amplifications (multiplication de séquences.<br />
- Les fusions de gènes.<br />
- Les inversions (changement d’orientation tête-bêche d’un<br />
segment variable d’ADN).<br />
- Les insertions de séquences d’ADN.<br />
109
Les microlésions.<br />
Dans ce cadre, on range les mutations ponctuelles de<br />
l’ADN.<br />
délétion, insertion ou substitution, d’un nucléotide par<br />
un autre.<br />
La substitution d’une paire de bases par une autre peut<br />
s’agir<br />
d’une transition ou d’une transversion;<br />
La transition: correspond au remplacement d’une base<br />
purique par une autre base purique ou<br />
une base pyrimidique par une autre base<br />
pyrimidique.<br />
La transversion: correspond au remplacement d’une<br />
base purique est par une pyrimidine ou<br />
d’une pyrimidine par une purine.<br />
110
LES SYSTÈMES DE SAUVEGARDE ET RÉPARATEURS<br />
DE L’ADN<br />
GÉNÉRALITÉS.<br />
Les erreurs de réplication ne sont pas totalement<br />
réparées par édition<br />
L’ADN est sensible à des agressions soit chimiques soit<br />
physiques.<br />
Ces agressions peuvent entraîner la perte de base, des<br />
substitutions de nucléotides, des pont de thymine…<br />
Des mécanismes puissants, cependant non infaillibles<br />
sont présents dans la cellule pour déceler et corriger les<br />
lésions de l’ADN.<br />
111
L’excision-réparation de base.<br />
Ce type de réparation est communément utilisé pour éliminer les<br />
bases incorrectes (comme l’uracile) ou les bases transformées par<br />
des agents alkylants.<br />
Il comprend trois étapes successives:<br />
Tout d’abord, une élimination de la base incorrecte par une<br />
ADN N-glycosylase avec apparition d’un site<br />
site AAP.<br />
Puis, une coupure du brin d’ADN endommagé en 5’ du site<br />
AP, créant ainsi un -OH OH (3’) ’) adjacent au site AP AP.<br />
Enfin, l’extension à partir de cet -OH OH (3’) ’) par une ADN<br />
polymérase est réalisée avec excision du site AP.<br />
La soudure finale est assurée par une ADN ADN-ligase ligase.<br />
112
L’excision L’excision-réparation réparation de nucléotide.<br />
nucléotide<br />
Bien que l’excision-réparation de base joue un rôle très important<br />
comme processus de réparation de l’ADN, elle ne peut pas suffire à<br />
corriger toutes les erreurs dans l’ADN.<br />
En particulier, la disponibilité des ADN N-glycosylases ne peut pas être<br />
étendue à toutes les altérations possibles des bases de l’ADN.<br />
Un autre mécanisme plus flexible de réparation est impliqué. Ce<br />
mécanisme est appelé excision excision--réparation réparation de de nucléotide. nucléotid Il est disponible<br />
dans tous les organismes vivants et il implique les étapes suivantes:<br />
Tout d’abord, la reconnaissance du dommage sur l’ADN.<br />
Puis une liaison d’un complexe multi-protéique avec le site<br />
endommagé.<br />
Une double excision du brin endommagé suit avec coupure<br />
plusieurs nucléotides en 5’ et en 3’ de celui-ci.<br />
La lacune présente est comblée par une ADN polymérase.<br />
Une soudure finale est ensuite assurée par une ADN-ligase.<br />
113
Un tel système de réparation existe également chez les<br />
cellules eucaryotes.<br />
On connait d’ailleurs chez l’Homme,<br />
des anomalies génétiques du système de réparation par<br />
excision-réparation responsables de maladies<br />
génétiques graves,<br />
la xérodermie pigmentaire (entraînant une sensibilité<br />
accrue aux rayons solaires et une augmentation du<br />
risque de cancers cutanés),<br />
mais aussi le syndrome de Bloom ou la maladie de<br />
Fanconi.<br />
114
115
Les recherches thérapeutiques<br />
Le petit nombre de malades et le faible débouché commercial<br />
qu'offrent les maladies rares telles que le XP<br />
Mais depuis quelques années, les recherches se sont multipliées et<br />
elles ont permis de mieux comprendre les mécanismes de la maladie.<br />
Evolution des recherches:<br />
En 1988: Caractéristiques cliniques génétiques et cellulaires.<br />
Développement d'un test anténatal. anténatal. Activation des oncogènes dans les<br />
tumeurs épithéliales isolées de malades atteints du XP<br />
En 1990: Une carence en ADN hélicase serait responsable de certaines<br />
formes formes de de XP XP et et du du syndrome syndrome de de Cockayne. Cockayne. Clonage Clonage du du gène et de<br />
l'ADNc de groupe A du XP<br />
En 1996: La thérapie génique envisageable. Une nouvelle technique de<br />
correction génétique des cellules a été mise au point.<br />
Elle permet, grâce à une construction rétrovirale, de produire des<br />
lignées de fibroblastes de peau de malades au phénotype guéri.<br />
Cela constitue donc une première étape vers la correction des<br />
kératinocytes de malades et peut peut-être être un jour la production in vitro<br />
d'un épithélium génétiquement corrigé pouvant servir de greffon.<br />
En 1998: Comment l'absence d'interaction entre une hélicase et son<br />
régulateur est à l'origine d'une maladie génétique.<br />
En 2001: Reconstruction in vitro de peau de patients atteints de XP<br />
116
117
Les réparations post post-réplicatives<br />
réplicatives.<br />
Si le système de réparation par excision-resynthèse de l’ADN est<br />
débordé, et surtout si les zones d’ADN à réparer coïncident avec la<br />
présence de fourches de réplication, il est évident que le brin<br />
porteur de la lésion devient impropre à servir de matrice.<br />
Dans de telles conditions, le brin parental contiendra un dimère de<br />
thymine et l’autre brin fils contiendra une lacune, on parle de<br />
lacune post-réplicative. C’est une lésion grave de l’ADN.<br />
Pour traiter de telles lésions, un système de réparation approprié va<br />
protéines Rec<br />
être mis en oeuvre. Il s’agit du système des protéines<br />
Rec (pour<br />
Recombinaison). Ce système de réparation fait donc intervenir une<br />
recombinaison.<br />
La recombinaison correspond à un échange d’ADN ente deux<br />
segments homologues. Cette correction fera également intervenir<br />
le système de réparation par excision-resynthèse de l’ADN.<br />
Chez E. coli, la production de la protéine de recombinaison appelée<br />
RecA est réduite dans les conditions normales. Ceci est lié à une<br />
répression de la synthèse par un répresseur protéique appelé LexA 118<br />
(voir contrôle de la transcription).
119
120
Le système S.O.S.<br />
Le système S.O.S. a été décrit initialement chez les<br />
bactéries. Il concerne au moins une vingtaine de gènes<br />
dont les produits protéiques sont impliqués dans les<br />
mécanismes de réparation et de recombinaison. Ce<br />
système est remarquable parce qu’il est inductible, c’està-dire<br />
mis en oeuvre par l’agression physique ou<br />
chimique.<br />
La protéine de recombinaison RecA joue un rôle central<br />
dans un tel mécanisme de sauvegarde.<br />
La synthèse de cette protéine est normalement réprimée<br />
par une protéine appelée LexA ou répresseur.<br />
Si un besoin important de protéine RecA apparaît, la<br />
répression est levée grâce à une propriété particulière de<br />
la protéine RecA qui est capable de cliver son<br />
121<br />
répresseur<br />
répresseur.
Biologie moléculaire du cancer<br />
Mécanisme de l’oncogénèse<br />
INTRODUCTION<br />
La survenue dans un organisme d'une tumeur cancéreuse est<br />
liée à l'émergence d'un clone cellulaire échappant aux lois qui<br />
régissent la prolifération et la cohabitation cellulaire normales.<br />
La cellule cancéreuse se caractérise par 2 propriétés<br />
fondamentales :<br />
1/ la capacité de se reproduire au delà des limites fixées par le<br />
renouvellement naturel du tissu auquel elle appartient et<br />
2/ le pouvoir de coloniser des territoires tissulaires<br />
normalement réservés à d'autres catégories cellulaires.<br />
Ces 2 propriétés sont communes à l'ensemble des cellules<br />
d'une même tumeur ce qui suggère que toute la population est<br />
issue d'une seule cellule devenue anormale.<br />
122
MECANISME DE L'ONCOGENESE<br />
L'ADN = siège des altérations successives<br />
L’origine monoclonale de la population de cellules formant<br />
une tumeur a pu être vérifiée dans de nombreux cas à l'aide<br />
de marqueurs génétiques<br />
L'analyse d'une tumeur maligne indique que toutes les<br />
cellules expriment la même forme et donc que la masse<br />
tumorale correspond à l'expansion d'un clone cellulaire.<br />
123
L'anomalie responsable de la transformation cancéreuse,<br />
virale ou non, est transmissible par division cellulaire et<br />
consiste en une altération majeure de l'information<br />
génétique, c'est à dire une mutation de l'ADN. Du reste, la<br />
majorité des agents carcinogènes s'avèrent être<br />
également des agents mutagènes.<br />
124
Filière virale<br />
Le chef de file des retrovirus tumorigènes est le Virus du<br />
Sarcome de Rous (RSV), virus à ARN, dont l'intégration dans<br />
le génome d' une cellule est possible grâce à la retrotranscriptase,<br />
(une enzyme qui permet la transcription de<br />
l'ARN en ADN).<br />
Son pouvoir transformant est entièrement contenu dans le<br />
gène src, dont l'insertion dans le génome de la cellule hôte<br />
peut provoquer la transformation cancéreuse. On en retrouve<br />
un équivalent dans le génome de toutes les cellules normales<br />
de l'hôte et de nombreuses autres espèces.<br />
Cet homologue cellulaire d'un oncogène viral est un gène<br />
cellulaire non transformant ou protooncogéne.<br />
125
Oncogenes Retroviraux<br />
Les proto oncogènes codent pour des protéines qui jouent un rôle<br />
central dans la stimulation de la division cellulaire. Les oncogènes<br />
d’origine retro virale sont classés en 4 groupes:<br />
1. Facteurs de croissance, (C-sis) & récepteurs de facteurs de<br />
croissance (C fms & CerbB);<br />
2. “GTP-binding proteins”, (C h-ras, C k-ras, C n-ras);<br />
3. “Tyrosine specific protein kinases” (C abl, C fes, C fgr, C fps,<br />
Cros, C src, and C yes);<br />
“ serine/threonine specific protein kinases” (C mil, C mos, C<br />
raf).<br />
4. “ Transcription regulators”(C fos, C jun, C erb A, C myc, C myb,<br />
&Cets).<br />
Les protéines produites par les Proto oncogènes, sont alterées<br />
par des mutations, infections viral, ou agents carcinogénique. Ces<br />
protéines oncogéniques codent pour des protéines modifiées et<br />
sur exprimées qui stimulent une division cellulaire anormale.<br />
126
Les protéines des antioncogènes<br />
•La protéine oncogénique p 105-Rb, codée par le gène<br />
"suppresseur" Rb appartient au système de contrôle de la<br />
prolifération cellulaire. Elle représente par exemple le point<br />
d'impact de l'activité de certains oncogènes comme le E1A,<br />
provenant des adenovirus. La protéine codée par cet oncogène<br />
d'origine virale (adénovirus) agit par formation d'un complexe avec<br />
p 105-Rb qui entraine l'inactivation de celle-ci.<br />
•La protéine p53 a été identifiée comme la protéine cellulaire qui se<br />
couple à l'antigène T, produit transformant du virus simien SV 40.<br />
La protéine p53 peut être considérée comme la « gardienne du<br />
génôme ".<br />
A la suite d'une lésion affectant l'ADN (rayonnement UV, exposition<br />
à un mutagène), elle agit comme un agent décisionnel qui<br />
provoquerait soit l'arrêt de la division cellulaire soit l'apoptose.<br />
L'ensemble de ces phénomènes contribue à la stabilité de<br />
l'intégrité génétique.<br />
127
Retinoblastome<br />
Origine Moléculaire & Genetique<br />
Perte de fonction du gène “RB”<br />
gène suppresseur de tumeurs<br />
mutation Germinale du gène suppresseur de<br />
tumeurs « RB »<br />
Substitution: C T<br />
chromosome 13<br />
inactivation de son expression<br />
Retinoblastome héréditaire ou sporadique,<br />
Cancer infantile<br />
cause des tumeurs multiples impliquant les<br />
deux yeux,<br />
Ou une tumeur isolé au niveau d’un oeil<br />
128
Neurofibromatoses<br />
Origine Moléculaire & Genetique<br />
Perte de fonction du gène “NF1”<br />
gène suppresseur de tumeurs<br />
locus du gène: sur le chromosome 17<br />
Le gène NF1 produit:<br />
la Neurofibromine<br />
(une protéine activatrice de la GTPase)<br />
Maladie génétique autosomique & dominante<br />
Cause des neurofibromes multiples<br />
& une prédisposition au tumeurs du système<br />
nerveux<br />
129
Interaction de la protéine P53 avec la double<br />
hélice d’ADN<br />
gène P53:<br />
localisé sur chromosome 17<br />
Code pour une protéine de 53 kD<br />
« DNA-binding nuclear protein »<br />
« Transcription factor »<br />
Facteur clef de la régulation du cycle<br />
cellulaire<br />
Perte de fonction de P53<br />
Cause des types multiples de cancer<br />
130
Catégories de thérapies géniques utilisées pour lutter<br />
contre le cancer.<br />
Introduction de gènes suppresseurs de tumeurs dans les cellules<br />
tumorales<br />
Déclencher ou augmenter la réaction immunitaire dans les cellules<br />
cancéreuses:<br />
• Introduction de gènes de cytrokines dans les cellules tumorales<br />
• Réintroduction des cellules génétiquement modifiée chez le patient<br />
Ainsi la production de Cytokine dans les cellules cancéreuses active leur<br />
immunité<br />
Augmenter l’antigenecité des cellules tumorales:<br />
• Introduire le gène de HLA-B7 dans les mélanomes malignes<br />
(via les vecteurs retroviraux , ou via le complexe DNA/Liposome)<br />
131<br />
• déclencher une forte réponse immunitaire allogénique au site tumoral.
Introduction of “gènes suicide” directement dans les tumeurs:<br />
• Le gène de la thymidine kinase du virus herpes simplex<br />
« HSV-TK gene ».<br />
• Cette kinase virale rend les cellules susceptible à être tuées par<br />
« Ganciclovir ».<br />
•Transfert Préférentiel du gène HSV-TK à la masse tumorale<br />
•éradication Complète de la masse tumorale par l’effet “bystander”<br />
Protéger le système hematopoietique du patient des effets toxique<br />
de la chimiothérapie à haute dose:<br />
• Introduction de gènes de résistance à la chimiothérapie :<br />
Le gène « MDR-1 » code pour une protéine (P glycoprotéine), utilisé<br />
une pompe (a multi drug efflux pump) qui enlève les agents chimiothérapeutique<br />
des cellules.<br />
132
TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE<br />
•CLONAGE<br />
•EXTR<strong>AC</strong>TION ADN, ARN<br />
•DIGESTION DE L’ADN PAR LES ENZYMES DE RESRTICTION<br />
•SEPARATION DE L’ADN & L’ARN SUR GEL D’AGAROSE<br />
•SEPARATION DES PROTEINES SUR GEL DE POLY<strong>AC</strong>RYL<strong>AM</strong>IDE<br />
•VISUALISATION DE L’ADN: COLORATION AU BROMURE<br />
D’ETHIDIUM<br />
•TRANSFERT DE L’ADN, L’ARN & LES PROTEINES SUR<br />
MEMBRANES DE NITROCELLULOSE « SOUTHERN, NORTHERN &<br />
WESTERN BLOTS »<br />
•MARQUAGE DES SONDES, HYBRIDATION & AUTORADIOGRAPHIE<br />
•SEQUENÇAGE D’ADN.<br />
•PCR<br />
•ORGANISMES TRANSGENIQUES<br />
•EMPREINTES D’ADN<br />
•RFLPS<br />
•HYBRIDATION IN SITU.<br />
133
134
135
136
137
LA PCR EN TEMPS RÉEL<br />
techni chniques ques moléculaires de génotypage en<br />
temps réel<br />
138
La ‘Polymerase<br />
Polymerase Chain Reaction Reaction’ ’ PCR :<br />
un outil crucial en diagnostic moléculaire<br />
permet une détection sensible et spécifique des cibles<br />
d’acides nucléiques.<br />
Le suivie en temps réel de la PCR:<br />
accélération et une simplification considérable<br />
des procédures de laboratoire<br />
quantification, l’amplification et la détection de<br />
mutations au niveau des séquences cibles.<br />
139
Le système Light Cycler RD<br />
Le système Light Cycler<br />
Le LC* est un appareil fondé sur<br />
le principe de PCR quantitative<br />
en temps réel.<br />
Il permet donc la détection et la<br />
quantification de marqueurs<br />
fluorescents dont l’émission est<br />
directement proportionnelle à la<br />
quantité d’amplicons générés<br />
pendant la réaction de PCR.<br />
Les mesures sont effectuées en<br />
phase exponentielle , plutôt qu’en<br />
point final<br />
Les systèmes de détection :<br />
-les agents se liant à l’ADN<br />
double brin<br />
( exp : SYBR Green I qui est un<br />
fluorophore capable de se lier au<br />
sillon mineur de l’ADN double<br />
brin )et ,<br />
-les sondes fluorescentes<br />
140
Les sondes fluorescentes :<br />
deux sondes ( Hybridization probes ) :<br />
Méthode de détection est basée sur le principe FRET<br />
(Fluorescence Resonance Energy Transfer):<br />
deux sondes oligonucléotidiques linéaires complémentaires à une<br />
séquence cible<br />
• 1ère sonde , dite sonde d’ancrage , bloquée à son extrémité 3’<br />
afin de prévenir son extension durant l’étape d’élongation et<br />
transporte en 3’ un fluorochrome donneur ( fluorescéine )<br />
qui émet une lumière verte à 530 nm lorsque excité par une<br />
source de lumière<br />
• une deuxième sonde d’hybridation marquée en 5’ avec le LC<br />
Red 640 (fluorochrome accepteur ).<br />
141
En solution, les deux sondes sont libres et<br />
séparées .<br />
Lorsque,lors de l’étape d’hybridation ,les<br />
deux sondes se fixent à leur séquences<br />
respectives ,…<br />
elles se trouvent très proches l’une de<br />
l’autre , cette proximité permet le transfert<br />
énergétique de la Fluorescéine verte par le<br />
FRET au fluorochrome accepteur rouge ...<br />
Et provoque son émission rouge détectée<br />
par le spectrofluorimètre .<br />
Pendant l’étape d’élongation, les sondes<br />
retournent de façon indépendante en<br />
solution ce qui supprime la fluorescence<br />
rouge .<br />
142
Les courbes de fusion :<br />
Chaque produit d’ADN double brin synthétisé à une température de fusion Tm<br />
spécifique définie comme étant la température à laquelle 50 % de l’ADN est<br />
sous forme double brin et 50% sous forme simple brin .<br />
Tm dépend essentiellement de la longueur du fragment d’ADN double brin et de<br />
la teneur en GC de ce fragment (et aussi du degré d’homologie entre les deux<br />
brins d’ADN<br />
Analyse des courbes de fusion utilisant le SYBR Green I :<br />
1/ le SYBR Green I est fluorescent tant qu’il est lié à l’ADN double brin ,<br />
2/ quand la température augmente l’ADN double brin se dissocie , ce qui<br />
entraîne la libération du SYBR Green dans le milieu et une diminution<br />
progressive de la fluorescence ,<br />
3/ lorsque 50% de l’ADN double brin sont dissociés , la fluorescence chute<br />
brutalement , c’est cette température qui correspond à la température de fusion<br />
du produit synthétisé.<br />
La température de fusion est obtenue , en traçant la dérivée première négative<br />
de la fluorescence en fonction de la température : elle correspond au maximum<br />
de la courbe<br />
143
Analyse des mutations par le LightCycler :<br />
• Par analyse des courbes de fusion en utilisant les sondes<br />
d’hybridation(oligonucléotides):<br />
• Les deux sondes sont normalement complémentaires à une<br />
région spécifique au niveau de la séquence amplifiée.<br />
• Si le gène amplifié présente une mutation ponctuelle au<br />
niveau de cette région , on peut avoir un ou plusieurs<br />
mésappariements (mismatches).<br />
• En effet la Tm ne dépend pas uniquement de la longueur et du<br />
contenu en GC, mais aussi du degré d’homologie entre les deux<br />
brins d’ADN.<br />
• Les sondes d’hybridation liés à l’ADN dans un appariement<br />
parfait nécessitent une Tm supérieure pour les séparer que ceux<br />
liées à l’ADN contenant des mésappariements qui le<br />
déstabilisent .<br />
• Le mismatch réduit donc la Tm de l’oligonucléotide,cette<br />
diminution peut être détectée grâce à l’analyse des courbes de 144<br />
fusion.
145
Diagnostique des maladies génétiques,<br />
Diagnostique génétique précoce des infections<br />
virales et du cancer:<br />
146
FISH<br />
147
FISH<br />
FDA-approved kit for HER-2 testing by FISH and follow the scoring and interpretation<br />
recommended by the manufacturer. In this procedure, the chromosome 17 centromere<br />
is marked with a green florescent signal and HER-2 gene with an orange florescent<br />
signal. A tumor is designated as “positive” for gene amplification if gene-tochromosome<br />
(17) ratio is >2.0<br />
148
Microarrays: Biopuces<br />
149
La biopuce à ADN est une plaque de verre ou de silicium sur laquelle sont gravées un<br />
grand nombre de microcuvettes.<br />
Sur chacune d’entre elles, on accroche une séquence de bases d’ADN, qui joue le rôle<br />
de sonde et qui est caractéristique d’un gène, d’une mutation ou d’une maladie.<br />
On prélève alors de l’ADN sur le patient et on le verse dans les microcuvettes.<br />
L’ADN-sonde se liera avec l’ADN du prélèvement si et seulement si les séquences sont<br />
complémentaires. On lave ensuite la biopuce.<br />
Pour permettre la lecture du résultat, on a préalablement accroché à l’extrémité de<br />
l’ADN du prélèvement une molécule fluorescente.<br />
Ainsi, dans les microcuvettes où il y a eu appariement, l’ADN du prélèvement est resté<br />
accroché à l’ADN-sonde et est visible à la lumière ultraviolette grâce à la molécule<br />
fluorescente.<br />
Dans les microcuvettes où il n’y a pas eu d’appariement, l’ADN du prélèvement a été<br />
enlevé par le lavage et il n’y a pas de signal lumineux.<br />
150
Tissue Microarrays<br />
151
Techniques de diagnostique génétique du cancer<br />
FISH<br />
PCR en temp réel<br />
microarrays ou Biopuces<br />
Permettent<br />
La détection des mutation de marqueurs<br />
génétiques de cancer<br />
La détection de l'amplification génique de<br />
marqueurs de métastase<br />
Orientent vers un pronostic plus précis<br />
Des choix thérapeutiques mieux ciblés<br />
Une meilleure prise en charge des patients<br />
cancereux<br />
Un diagnostic précoce ou préventif (PCR en temps<br />
réel & microarrays)<br />
152