Page 1 E N G LIS H D E U T S C H ITA LIA N O F R A N Ç A IS E S P ...

��� ��� ���
����� ��� ��� ���
�������
An enzyme immunoassay for the
quantitation of bone-specific alkaline
phosphatase (BAP) in human serum
Enzym-Immunassay zur Quantifizierung
knochenspezifischer alkalischer
Phosphatase (BAP) in Humanserum
Saggio immunoenzimatico per la
quantizzazione della fosfatasi alcalina
osso-specifica (BAP) nel siero umano
Un essai immunoenzymatique servant
quantifier la phosphatase alcaline
d’origine osseuse dans le sérum humain.
Enzimoinmunoanálisis para la
cuantificación de la fosfatasa
alcalina específica de los huesos
(Bone-specific Alkaline Phosphatase-BAP)
en el suero humano
Um imunoensaio enzimático para medir
a fosfatase alcalina específica do osso
(BAP) no soro humano
Et enzym immunoassay til kvanticering
af knoglespecifik alkalisk fosfatase
(BAP) i humant serum.
Enzymimmunoanalys för kvantitering
av benspecifikt alkaliskt fosfatas
(BAP) i mänskligt serum
Ανοσοπροσδιορισμός ενζύμου για
ποσοτικό προσδιορισμό της ειδικής
για τα οστά αλκαλικής φωσφατάσης
(BAP) στον ανθρώπινο ορό
������� ������� �������� �������� ������� ��������� ����� �������

QUICK GUIDE TO ASSAY STEPS
1. Add 125 µL Assay Buffer.
2. Add 20 µL Standards, Controls, and samples; swirl.
3. Incubate 3 hours ± 10 minutes at 20–28°C.
4. Wash 4 times with 1X Wash Buffer.
5. Add 150 µL 20–28°C Working Substrate Solution.
6. Incubate 30 ± 5 minutes at 20–28°C.
7. Add 100 µL Stop Solution and read optical density at 405 nm.
INTENDED USE
The Metra BAP immunoassay provides a quantitative measure of bone-specific alkaline phosphatase (BAP) activity in serum as an
indicator of osteoblastic activity. Measurement of BAP is intended for use as an aid in the:
� management of postmenopausal osteoporosis and Paget’s disease;
� monitoring of postmenopausal women on hormonal or bisphosphonate therapy;
� prediction of skeletal response to hormonal therapy in postmenopausal women.
SUMMARY AND EXPLANATION
The skeletal, or bone-specific, isoform of alkaline phosphatase is a tetrameric glycoprotein found on the cell surface of osteoblasts. 1
Osteoblasts are the cells responsible for synthesis of new bone matrix and its mineralization. The function of BAP has not been fully
elucidated, though its role in skeletal mineralization has been confirmed. 1,2,3
Bone is constantly undergoing a metabolic process called remodeling. 3,4 This includes a degradation process, bone resorption,
mediated by the action of osteoclasts, and a building process, bone formation, mediated by the action of osteoblasts. 3,4 Remodeling
is required for the maintenance and overall health of bone and is tightly coupled; that is, resorption and formation are in balance. 3,4
In abnormal states of bone metabolism this process becomes uncoupled and, when resorption exceeds formation, this results in a
net loss of bone which can lead to osteoporosis, 3,4 or to the disordered bone tissue of pagetic lesions. 5 The measurement of specific
biochemical markers of these remodeling events provides analytical data regarding the rate of bone metabolism or “turnover”. 3,4
Osteoporosis is a metabolic bone disease characterized by abnormal bone remodeling. It is a systemic skeletal disease characterized
by low bone mass and microarchitectural deterioration of bone tissue, with a consequent increase in susceptibility to fractures. 6
The most common type of osteoporosis occurs in postmenopausal women as a result of the estrogen deficiency produced by
the cessation of ovarian function. 3 Restoration of premenopausal estrogen levels by replacement therapy prevents bone loss and
osteoporosis. 3,6 Estrogens and a class of compounds known as bisphosphonates are antiresorptive therapies which can be used to
prevent bone loss or treat osteoporosis. 3,6,7
Osteoporosis can also result from attaining an inadequate peak bone mass during the growing years, an age-related imbalance of
bone remodeling with a net excess of resorption, and a number of clinical conditions and therapies which induce bone loss or bone
remodeling imbalances. 3 These include endocrine diseases such as hypogonadism, hyperthyroidism, hyperparathyroidism, and
hypercortisolism; renal failure; cancers metastatic to bone; gastrointestinal diseases related to nutrition and mineral metabolism;
connective tissue diseases; multiple myeloma; chronic immobilization, alcoholism, or tobacco use; and chronic therapy with heparin
or corticosteroids. 3
Paget’s disease of bone is a focal disorder resulting in pain and skeletal deformity in symptomatic patients. 5 Pagetic lesions are
characterized by bone matrix of highly abnormal structure arising from excessive rates of remodeling activity. The lesions occur
predominantly in the skull, spine, pelvis and long bones, and can result in fractures and neurological impairment. 5 The etiology of
Paget’s disease is unknown but hypotheses involving genetic and viral factors are compelling. 5 Bisphosphonates and calcitonin are
currently used to suppress the high rate of biochemical activity to normal levels, enabling restoration of normal bone structure. 9
As a quantitative measure of a marker of bone turnover, BAP provides useful information on bone remodeling in osteoporosis
and Paget’s disease, and changes in disease activity produced by antiresorptive therapy. 10-12 For the Metra BAP assay, antibody
technology was employed to produce a monoclonal antibody that demonstrates specificity for BAP. 10 The specificity of the
monoclonal antibody used in the assay allows for simple, convenient, reproducible and direct quantitation of BAP activity in serum.
PRINCIPLE OF THE PROCEDURE
Metra BAP is an immunoassay in a microtiter strip format utilizing a monoclonal anti-BAP antibody coated on the strip to capture
BAP in the sample. The enzyme activity of the captured BAP is detected with a pNPP substrate.
REAGENTS AND MATERIALS PROVIDED
96 Assays for Bone-specific Alkaline Phosphatase
Metra BAP EIA contains the following:
A BAP Standards A - F Parts 4395 through 4400 0.3 mL each
B (A = 0, B = 2, C = 20, D = 50, E = 80, F = 140 U/L BAP)
C BAP purified from osteosarcoma SAOS-2 cells in a buffered solution containing magnesium chloride,
D zinc sulfate, surfactant, carrier protein, blue dye, and sodium azide (0.05%) as a preservative.
E
F
L Low/High Controls Parts 4401, 4402 0.3 mL each
H BAP purified from osteosarcoma SAOS-2 cells in a buffered solution containing magnesium chloride, zinc sulfate, surfactant,
carrier protein, blue dye, and sodium azide (0.05%) as a preservative.
1
ENGLISH

q Coated Strips Part 4660 12 each
Purified murine monoclonal Anti-BAP IgG antibody adsorbed onto stripwells.
w Stop Solution Part 4702 15 mL
0.5N NaOH
e 10X Wash Buffer Part 4703 55 mL
Nonionic detergent in a buffered solution containing sodium azide (0.05%) as a preservative.
r Assay Buffer Part 4403 27 mL
A buffered solution containing magnesium chloride, zinc sulfate, surfactant, and sodium azide (0.05%) as a preservative.
t Substrate Buffer Part 4404 3 x 10 mL
A 2-amino-2-methyl-1-propanol solution containing HEDTA, magnesium chloride, zinc sulfate, and sodium azide (0.05%)
as a preservative.
y Substrate Tablets Part 0012 3 x 20 mg
p-Nitrophenyl phosphate
MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED
Micropipettes to deliver 20 µL and 100–300 µL
Items suitable for liquid measurement of 100–300 mL
Container for wash buffer dilution
Deionized or distilled water
Plate reader capable of Optical Density readings at A405 > 2.0
Quadratic calibration curve fitting software
WARNINGS AND PRECAUTIONS
1. For In Vitro Diagnostic Use.
2. Treat specimen samples as potentially biohazardous material. Follow Universal Precautions when handling contents of this kit
and any patient samples.
3. Dispose of containers and unused contents in accordance with Federal, State and Local regulatory requirements.
4. Use the supplied reagents as an integral unit prior to the expiration date indicated on the package label.
5. Store assay reagents as indicated.
6. Do not use Coated Strips if pouch is punctured.
7. Test each sample in duplicate.
8. 0.5N NaOH is considered corrosive and can cause severe burns. Do not ingest. Avoid contact with skin, eyes or clothing. If contact
is made, wash with water. If ingested, call a physician.
9. Sodium azide is used as a preservative. Incidental contact with or ingestion of buffers containing sodium azide may cause
irritation to the skin, eyes, or mouth. Only use buffers for intended purposes and avoid contact with acids. Sodium azide may
react with lead and copper plumbing to form highly explosive metal azides. Upon disposal, flush with a large volume of water
to prevent azide build-up.
10. The substrate buffer contains 2-amino-2-methyl-1-propanol and may cause irritation to the eyes and/or skin with prolonged
contact. Wear suitable protective clothing, gloves, and eye/face protection. Contacted areas should be immediately washed with
soap and water.
11. Use of multichannel pipets or repeat pipetors is recommended to ensure timely delivery of reagents.
12. For accurate measurement of samples, add samples and standards precisely. Pipet carefully using only calibrated equipment.
13. Dilute samples greater than 140 U/L in Assay Buffer and retest. Include the dilution factor in the final calculation.
14. This assay may be performed with any validated washing method.
REAGENT PREPARATION
Bring reagents and materials for the assay to 20–28°C before use. After removing the needed reagents
and materials, return unused items to 2–8°C.
Coated Strips
Remove Stripwell Frame and the required number of Coated Strips from the pouch (See table in ASSAY PROCEDURE Section).
Ensure that the pouch containing any unused strips is completely resealed.
Wash Buffer
Prepare required amount of 1X Wash Buffer (see table) by diluting 10X Wash Buffer concentrate 1:10 with deionized water.
Store at 20–28°C. Use 1X Wash Buffer within 21 days of preparation.
Working Substrate Solution
Prepare Working Substrate Solution within 1 hour of use. Put one Substrate Tablet into each required bottle of 20–28°C Substrate
Buffer (see table). Allow 30-60 minutes for tablet(s) to dissolve. Vigorously shake bottle(s) to completely mix. Discard remaining
Working Substrate Solution after use.
2

STORAGE
Store kit at 2–8°C. Do not freeze. Store unused reagents at 2–8°C. Equilibrate reagents to 20–28°C before use.
Store 1X Wash Buffer (10X diluted) at 20–28°C.
SPECIMEN COLLECTION AND STORAGE
Collect serum using standard venipuncture technique. Specimens should be collected without anticoagulants and in such a way
to avoid hemolysis. Allow the blood to clot and separate the serum by centrifugation. Serum can be stored for 5 days at 2–8°C,
at ≤ -40°C for 12 months, or at ≤ -80°C for 36 months. Do not subject samples to more than 3 freeze/thaw cycles.
“Off the clot” serum, serum separator tube serum, Na heparin plasma, and Li heparin plasma yield substantially equivalent results.
It is recommended that plasma samples not be prepared using chelating agents such as EDTA or citrate.
ASSAY PROCEDURE
Read entire product insert before beginning the assay.
See REAGENT PREPARATION before proceeding.
Determine amount of each reagent required for the number of strips to be used.
# of Strips 4 6 8 12
# of Samples (tested in duplicate) 8 16 24 40
Substrate (bottle) 1 1 2* 2*
1X Wash Buffer (mL) 100 150 200 300
*When more than one bottle or vial is to be used, combine the contents and mix prior to use.
Sample Incubation
1. Remove Stripwell Frame and the required number of Coated Strips from the pouch (see table) just prior to use. Ensure that the
foil pouch containing any unused strips is completely resealed.
2. Place desired number of Coated Strips in the Stripwell Frame. Label strips to prevent mix-up in case of accidental removal from
Stripwell Frame.
3. Add 125 µL Assay Buffer to each well.
4. Add 20 µL of Standard, Control or sample to each well. Do not mix with Assay Buffer by repeat pipetting. This step should be
completed within 30 minutes. Gently swirl strips to ensure mixing of sample and buffer.
5. Incubate for 3 hours (± 10 minutes) at 20–28°C.
6. Prepare Working Substrate Solution within 1 hour of use. Put one Substrate Tablet into each required bottle of 20–28°C Substrate
Buffer (see table). Allow 30–60 minutes for tablet(s) to dissolve. Vigorously shake bottle(s) to completely mix.
Washing Step
7. Prepare required amount of 1X Wash Buffer (see table) by diluting 10X Wash Buffer 1:10 with deionized water. Store at 20–28°C.
Use 1X Wash Buffer within 21 days of preparation.
8. Manually invert/empty strips. Add at least 250 µL of 1X Wash Buffer to each well and manually invert/empty strips. Repeat three
more times for a total of four washes. Vigorously blot the strips dry on paper towels after the last wash.
Substrate Incubation
9. Add 150 µL of Working Substrate Solution to each well. Discard remaining Working Substrate Solution after use.
10. Incubate for 30 minutes (± 5 minutes) at 20–28°C.
Stop/Read
11. Add 100 µL of Stop Solution to each well. Add Stop Solution in the same pattern and time intervals as the Substrate Solution
addition.
12. Read the optical density at 405 nm. Assure that no large bubbles are present in the wells and that the bottoms of the strips are
clean. Strips should be read within 15 minutes of Stop Solution addition.
13. Quantitation software with a quadratic calibration curve fitting equation must be used to analyze the Metra BAP assay results.
Equation: y = A + Bx + Cx 2
QUALITY CONTROL
The Certificate of Analysis included in this kit is lot specific and is to be used to verify that the results obtained by your laboratory
are similar to those obtained at Quidel. The optical density values are provided and are to be used as a guideline only. The results
obtained by your laboratory may differ.
Quality control ranges are provided. The control values are intended to verify the validity of the curve and sample results. Each
laboratory should establish its own parameters for acceptable assay limits. If the control values are NOT within your laboratory’s
acceptance limits, the assay results should be considered questionable and the samples should be repeated.
If the optical density of the Metra BAP Standard F is less than 1.0, the results should be considered questionable and the samples
should be repeated.
INTERPRETATION OF RESULTS
Sample results are expressed as U/L and do not need to be corrected for dilution (unless sample was diluted prior to testing).
In the Metra BAP assay, 1 Unit represents 1 µmol of pNPP hydrolyzed per minute at 25°C in 2-amino-2-methyl-1-propanol buffer.
3
ENGLISH

Representative Standard Curve
Standard BAP levels: 0, 2, 20, 50, 80, 140 U/L
LIMITATIONS OF THE PROCEDURE
HAMA Interference
Some individuals have antibodies to mouse antibodies (HAMA), which can cause interference in immunoassays that employ
antibodies derived from mice. In particular, it has been reported that serum samples from patients who have undergone therapy or
diagnostic procedures that include infusion of mouse monoclonal antibody may produce erroneous results. Therefore, Metra BAP
results for such patients should be used only in conjunction with results from some other diagnostic procedure and with information
available from the clinical evaluation of the patient.
Samples with significant elevations of liver alkaline phosphatase activity may cause aberrantly elevated results in the Metra BAP assay.
Paget’s patients who have low levels of disease may have bone-specific alkaline phosphatase levels that fall within the Metra BAP
reference range.
SAMPLE VALUES
BAP reference ranges have been established for normal males over 25 years of age (n = 126), normal premenopausal females
between the ages of 25 and 44 (n = 178), and normal postmenopausal females (n = 107). For the purposes of establishing
reference ranges, normal subjects were defined as:
� Basically healthy, no bone, endocrine or chronic disorders
� Regular menstrual cycles (premenopausal females)
� Not pregnant or breast feeding (females)
� Not currently taking any medication known to influence bone metabolism
Values may be influenced by such factors as low estrogen production, low calcium intake or low physical activity. 8 Estrogen
deficiency in postmenopausal women can result in elevated bone turnover. 3,4 Each laboratory should establish its own normal
reference range. The ranges are expressed as nonparametric reference intervals (90% CI).
4
Optical Density (405 nm)
3.0
2.0
1.0
Age (Yr) Range (U/L) Median
Females 25 - 44 Premenopausal 11.6 - 29.6 18.3
Females ≥ 45 Postmenopausal 14.2 - 42.7 25.0
Males ≥ 25 15.0 - 41.3 23.2
PERFORMANCE CHARACTERISTICS
Antibody Specifications
The bone-specific alkaline phosphatase antibody has selective, high affinity for the bone-specific alkaline phosphatase isoform, low
cross-reactivity to the liver form of alkaline phosphatase, and negligible binding of intestinal and placental isoenzymes.
AP Isoenzyme % Reactivity
Bone 100
Liver 3 – 8
Placental 0
Intestine 0.4
0.0
0 25 50 75 100 125 150
BAP (U/L)
Sensitivity
The minimum detection limit of the Metra BAP assay is 0.7 U/L, determined by the upper 3 SD limit in a zero standard precision study.
Recovery - Spike Recovery
Spike recovery was determined by adding a known quantity of purified BAP to serum samples with different levels of endogenous
BAP. Typical results are provided after spiking serum samples with low, medium, and high concentrations of BAP and assaying in
triplicate.

Endogenous (U/L) Added (U/L) Observed (U/L) Recovery (%)
13.4 15.7 29.1 99
17.6 37.5 55.3 99
27.2 57.2 88.1 106
Recovery - Linearity
Linearity was determined by serially diluting samples and comparing observed values with expected values. Typical results are
provided below.
Sample Dilution Factor Observed (U/L) Expected (U/L) Recovery (%)
1 neat 108.5 - -
1:2 51.1 54.2 94
1:4 25.8 27.1 99
1:6 18.0 18.1 99
2 neat 39.1 - -
1:2 20.1 19.5 103
1:4 10.3 9.8 105
1:6 6.7 6.5 103
3 neat 58.4 - -
1:2 29.9 29.2 102
1:4 15.7 14.6 108
1:6 9.7 9.7 100
Precision
Within-run precision was determined for ≥ 21 replicates of 3 samples on 3 plates from each of 3 kit lots (9 plates total). Betweenrun
precision was determined for 3 samples run in 6 separate plates from each of 3 kit lots (18 plates total). Typical results are
provided below.
BAP (U/L BAP) Within-run 1 CV% Between-run2 CV%
12 5.8 5.2
35 3.9 7.6
100 5.2 5.0
1 n=21
2 n=6 runs
Interfering Substances
The following substances were tested at the specified concentrations, and were found not to interfere with the assay.
Substance Concentration
Hemoglobin 500 mg/dL
Bilirubin 25 mg/dL
Triglycerides 1420 mg/dL
Total Protein 6.0 g/dL †
Total Protein 15.6 g/dL†
Total Protein 6.0 g/dL ‡
Total Protein 15.6 g/dL‡
† Protein with water
‡ Protein with BAP (BAP concentration = 43.6 U/L)
Drug Interferences
Various concentrations of drugs were added to three separate serum pools containing approximately 35, 70, and 105 U/L BAP and
assayed in triplicate. The drugs and the highest concentrations tested were:
Substance Highest Concentration
Etidronate 350 µg/mL
Estrogen 100 µg/mL
Ibuprofen 150 µg/mL
Acetominophen 350 µg/mL
Aspirin 350 µg/mL
Calcitonin - Human 80 µg/mL
Calcitonin - Salmon 80 µg/mL
Calcium 500 µg/mL
Norethindrone/ethynil estradiol mixture (oral contraceptive) 3 mg/mL
Vitamin D 400 IU/mL
5
ENGLISH

Accuracy
Comparative studies were performed to assess the correlations between measurements of serum bone-specific alkaline
phosphatase (BAP) obtained using the Metra BAP assay to results obtained using three currently marketed methods for measuring
total alkaline phosphatase (TAP) or BAP. The studies were conducted at an independent clinical investigational site, utilizing sera
from 114 patients with Paget’s disease and 464 healthy subjects. The first comparative method was a colorimetric technique for the
measurement of TAP. The correlation coefficient (r) obtained between this colorimetric method and the Metra BAP assay was 0.99.
The second comparative method was an electrophoresis method for the determination of BAP isoenzyme levels (r = 0.99). The
third comparative method was an immunoradiometric assay for the measurement of BAP (r = 0.99). Of the 114 patients diagnosed
with Paget’s disease, 101 patients had values greater than the upper limit of the reference ranges for the Metra BAP assay. Thirteen
patients had values less than the upper limit of the reference ranges.
CLINICAL STUDIES
Use of Metra BAP for Monitoring the Efficacy of Antiresorptive Therapy in Osteoporosis
A multicenter, randomized controlled trial was successfully conducted to establish the safety and efficacy of the Metra BAP assay
to monitor changes in serum BAP concentrations associated with amino-bisphosphonate (alendronate) antiresorptive therapy.
Subjects, drawn from a larger study of the efficacy of alendronate for treating osteoporosis, 7 were postmenopausal women, aged
45 to 84 years (mean 64 ± 7 years), diagnosed with osteoporosis (based on clinical presentation or baseline lumbar spine bone
mineral density [LSBMD] more than 2.5 standard deviations below the mean for mature premenopausal women). At baseline,
eligible subjects were randomized to receive either 10 mg alendronate and 500 mg calcium per day (ALN) or placebo and 500 mg
calcium per day (CTL). Serum specimens were obtained at baseline, 3, 6 and 12 months from all subjects.
Mean (± 1SD) baseline BAP concentration (14.6 ± 5.4 vs. 14.6 ± 4.6, p = 0.900) and LSBMD (0.74 ± 0.10 vs. 0.75 ± 0.09,
p = 0.751) were similar values for ALN and CTL. Distributions of baseline BAP values in ALN and CTL are depicted in the following
figure by proportion of the study population.
6
Proportion of Population (%)
30.0%
25.0%
20.0%
15.0%
10.0%
5.0%
0.0%
< 4.0
4.0 – 5.9
6.0 – 7.9
Distribution of BAP Levels At Baseline
8.0 – 9.9
10.0 – 11.9
12.0 – 13.9
BAP was significantly lower for ALN than CTL at 3 (9.6 ± 3.5 vs. 13.4 ± 4.0, p

The mean (± 1SD) BAP concentration in CTL subjects decreased modestly from baseline to -5.4% (± 19.1%) at 12 months
(p=0.00004) which may reflect the limited bone-sparing effect of calcium. 13
Mean BAP concentrations in ALN subjects decreased 30.5 ± 24.6% at 3 months, 42.8 ± 17.3% at 6 months, and 42.2 ± 19.2% at
12 months. Subjects in ALN were more likely than CTL subjects to demonstrate BAP losses exceeding minimum percent change 14
with 68.5%, 83.9%, and 86.1% of ALN and 9.5%, 15.9% and 9.0% of CTL individuals decreasing by ≥ 25% at the 3, 6, and 12
month timepoints. Distributions of the percent change from baseline in BAP values following 12 months in the ALN or CTL groups
are depicted in the following figure.
Proportion of Population (%)
30.0%
25.0%
20.0%
15.0%
10.0%
5.0%
0.0%
Distribution of Percent Change in BAP Levels Following 12 Months
Therapy with Alendronate (ALN) or Calcium (CTL)
< -70.0%
-70.0 to -60.1%
At 12 months, subjects in ALN had gained LSBMD compared to CTL (p < 0.00001) as shown in the following table.
Changes in LSBMD (Mean ± SD)
-60.0 to -50.1%
-50.0 to -40.1%
-40.0 to -30.1%
n Baseline (g/cm 2 ) 12 months (g/cm 2 ) ∆ (%)
CTL 159 0.75 ± 0.09 0.74 ± 0.09 -0.6 ± 3.4
ALN 121 0.74 ± 0.10 0.79 ± 0.10 5.5 ± 4.1
These results indicate that the Metra BAP assay is safe and effective for monitoring the antiresorptive effect of aminobisphosphonate
(alendronate) therapy among subjects diagnosed with osteoporosis.
Use of Metra BAP for Monitoring Hormonal Antiresorptive Therapy and Predicting Skeletal Response
(Bone Mineral Density) in Postmenopausal Women.
Monitoring Therapy:
A multicenter, randomized controlled trial was successfully conducted to establish the safety and efficacy of the Metra BAP assay
to monitor the changes in serum BAP concentrations associated with estrogen/progestin antiresorptive therapy. Increased bone
turnover and significant loss of bone are often associated with postmenopausal estrogen deficiency. Estrogen replacement has
been shown to effectively decrease bone turnover and protect existing bone mass. 3,6 Subjects were postmenopausal women,
aged 45 to 64 years (mean 56 ± 4 years), who had undergone natural or surgical menopause within the last 10 years. At baseline,
eligible subjects were randomized to either an active treatment group (HRT): Premarin® (0.625 mg daily) with placebo progestin,
Premarin® (0.625 mg daily) and an active progestin (Provera® 2.5 mg/day continuous, Provera® 10 mg/day cyclical, or micronized
progesterone 200 mg/day cyclical); or to the control group (CTL): placebo estrogen and placebo progestin. Serum specimens were
obtained at baseline and 12 months from all subjects.
Mean (± 1SD) baseline BAP concentration (20.7 ± 7.6 vs. 20.3 ± 6.8 U/L, p = 0.704) and LSBMD (0.97 ± 0.17 vs. 0.97 ± 0.15 g/cm 2 ,
p = 0.970) were similar for CTL and HRT. Distributions of baseline BAP values in HRT and CTL are depicted in the following figure by
proportion of the study population.
-30.0 to -20.1%
-20.0 to -10.1%
-10.0 to -0.1%
0.0 to 9.9%
12 Month CTL
12 Month ALN
Decreasing bone turnover % Change
Increasing bone turnover
10.0 to 19.9%
≥ 20.0%
7
ENGLISH

8
Proportion of Population (%)
≤ 9.0
9.1 – 11
11.1 – 13
Distribution of BAP Levels At Baseline
13.1 – 15
15.1 – 17
17.1 – 19
BAP was significantly lower for HRT than CTL at 12 months (13.3 ± 5.0 vs. 21.9 ± 7.9 U/L, p < 0.00001). Distributions of BAP
values following 12 months in the HRT and CTL groups are depicted in the following figure.
Proportion of Population (%)
30.0%
25.0%
20.0%
15.0%
10.0%
5.0%
0.0%
30.0%
25.0%
20.0%
15.0%
10.0%
5.0%
0.0%
Decreasing bone turnover U/L BAP
Increasing bone turnover
≤ 9.0
Distribution of BAP Levels Following 12 Months
Therapy with Estrogen/Progestin (HRT) or Placebo (CTL)
9.1 – 11
11.1 – 13
13.1 – 15
15.1 – 17
17.1 – 19
The mean (± 1SD) BAP concentration in CTL subjects increased slightly from baseline to +9.8% (± 33.2%) at 12 months
(p = 0.08) whereas BAP concentrations in HRT subjects decreased from baseline to -32.4 (± 21.5%) at 12 months (p < 0.00001).
Subjects in HRT were more likely than CTL subjects to demonstrate BAP losses exceeding minimum percent change 12 with 73.3%
of HRT and 3.4% of CTL individuals decreasing by ≥ 25% at the 12 month timepoint. Distributions of the percent change from
baseline in BAP values following 12 months in the HRT and CTL groups are depicted in the following figure.
19.1 – 21
19.1 – 21
21.1 – 23
21.1 – 23
23.1 – 25
23.1 – 25
25.1 – 27
25.1 – 27
27.1 – 29
27.1 – 29
CTL
HRT
Decreasing bone turnover U/L BAP
Increasing bone turnover
> 29
CTL
HRT
> 29

Distribution of Percent Change in BAP Levels Following 12 Months
Therapy with Estrogen/Progestin (HRT) or Placebo (CTL)
At 12 months, subjects in HRT had gained LSBMD compared to CTL (p

10
HRT Study - Linear Regression of the % change in
LSBMD and BAP from Baseline to 12 months
Contingency table analysis showed that a ≥ 25% decrease in BAP at 12 months was significantly associated (p < 0.0001) with a
positive skeletal response to HRT (gain in BMD) at 12 months. The binomial (second order approximation) 85% confidence intervals
for the sensitivity and specificity of using a 25% decrease in BAP for predicting a response to HRT are:
Sensitivity = 77% (95% CI 75%, 82%); Specificity = 61% (95% CI 41%, 78%).
These results indicate that the % change in BAP concentration can be used to predict the degree of skeletal response (BMD) to HRT
treatment.
LSBMD Percent Change to 12 months
15.0%
10.0%
5.0%
0.0%
-5.0%
-10.0%
-15.0%
-60.0% -40.0% -20.0%
ASSISTANCE
To place an order or for technical assistance, please contact a Quidel Representative at 800-524-6318 or 408-616-4301, Monday
through Friday, between 8:00 a.m. and 5:00 p.m., Pacific Time. Orders may also be placed by fax at 408-616-4310.
For services outside the U.S., please contact your local distributor.
y = -0.060x + 0.011
r = 0.51
p < 0.001
0.0% 20.0% 40.0% 60.0%
BAP Percent Change to 12 months

KURZANLEITUNG
1. 125 µl Testpufferlösung hinzugeben.
2. 20 µl Standardlösungen, Kontrollen und Proben hinzugeben und schwenken.
3. Bei 20–28 °C für 3 Stunden ± 10 Minuten inkubieren.
4. Viermal mit 1fach konzentriertem Waschpuffer waschen.
5. 150 µl der auf 20–28 °C gebrachten Substratlösung hinzugeben.
6. Bei 20–28 °C für 30 ± 5 Minuten inkubieren.
7. 100 µl Stopplösung hinzugeben und Absorbanz bei 405 nm ablesen.
VERWENDUNGSZWECK
Der Metra BAP Immunassay ermöglicht die quantitative Bestimmung der knochenspezifischen alkalischen Phosphataseaktivität
(BAP) in Serum, ein Indikator der Osteoblastenaktivität. Die BAP-Messung soll folgende Vorgänge unterstützen:
� Behandlung von Patienten mit postmenopausaler Osteoporose und Paget-Krankheit
� Überwachung postmenopausaler Patientinnen bei Hormon- oder Bisphosphonattherapien
� Prognose der skelettalen Reaktion auf Hormontherapien bei postmenopausalen Patientinnen
ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNGEN
Bei der skelett- oder knochenspezifischen Isoform der alkalischen Phosphatase handelt es sich um ein tetramerisches Glykoprotein,
das auf der Zellenoberfläche von Osteoblasten zu finden ist. 1 Osteoblasten sind Zellen, die für die Bildung neuer Knochenmatrix
und deren Mineralisation verantwortlich sind. Zwar ist der Funktionsmechanismus von BAP noch nicht vollständig bekannt, das
Mitwirken dieser Substanz bei der Skelettmineralisation ist jedoch bereits nachgewiesen. 1,2,3
Knochen unterliegen einem als Knochengeweberemodellierung bezeichneten Stoffwechselvorgang. 3,4 Dazu gehören ein
Abbauvorgang – eine durch Osteoklasten bewirkte Knochenresorption - und ein Aufbauvorgang, die durch Osteoblasten bewirkte
Knochenformation. 3,4 Die Remodellierung ist zum Erhalt der Gesamtintegrität des Knochens erforderlich und beruht auf einer
genau abgestimmten Kopplung, d.h. Resorptions- und Formationsvorgänge stehen in einem Gleichgewicht zueinander. 3,4 Bei einer
Störung des Knochenstoffwechsels tritt dieser Prozess aus dem Gleichgewichtszustand heraus, so dass es bei einem Übergewicht
an Resorption gegenüber Formationsvorgängen zu einem Gesamtverlust an Knochenmatrix kommt. 3,4 Dies wiederum kann zur
Osteoporose 3,4 oder zu den im Rahmen der Paget-Krankheit auftretenden Veränderungen des Knochengewebes führen. 5 Durch die
Bestimmung spezifischer biochemischer Marker dieser Remodellierungsprozesse kann die Geschwindigkeit bzw. der Umsatz (engl.
„turnover“) des Stoffwechsels ermittelt werden. 3,4
Osteoporose ist eine Knochenstoffwechselkrankheit, die durch Störungen der Knochengeweberemodellierung charakterisiert
ist. Es ist eine systemische Skeletterkrankung, die von einer geringen Knochenmasse und einem mikrostrukturellen Abbau des
Knochengewebes begleitet ist und somit zu einer erhöhten Frakturanfälligkeit führt. 6 Der häufigste Typ der Osteoporose tritt
bei postmenopausalen Frauen auf und wird von einem auf dem Ausbleiben der Ovarialfunktion beruhenden Östrogenmangel
verursacht. 3 Durch die Wiederherstellung der prämenopausalen Östrogenkonzentration mittels Substitutionstherapien kann ein
Abbau des Knochengewebes und Osteoporose verhindert werden. 3,6 Auf Östrogenen und den sog. Bisphosphonaten beruhende
antiresorptive Therapien können zur Vermeidung von Knochenschwund oder zur Behandlung von Osteoporose eingesetzt
werden. 3,6,7
Zudem kann Osteoporose ein Resultat einer inadäquaten maximalen Knochenmasse während der Wachstumsperiode sein
– einem altersbedingten Ungleichgewicht der Knochengeweberemodellierung, bei dem die Resorption übermäßig stark
ausgeprägt ist – und durch eine Reihe klinischer Erkrankungen und Therapien verursacht worden sein, die zu Knochenschwund
oder Störungen der Knochengeweberemodellierung führen. 3 Dazu gehören endokrine Erkrankungen wie z. B. Hypogonadismus,
Hyperthyreoidismus, Hyperparathyreoidismus, Hyperkortisolismus, renales Versagen, Knochenmetastasen, ernährungsbedingte
und auf dem Mineralstoffwechsel beruhende Gastrointestinalerkrankungen, Bindegewebskrankheiten, multiple Myelome,
chronische Immobilisation, Alkoholismus, Tabakmissbrauch sowie chronische Heparin- und Kortikosteroidtherapien. 3
Die Paget-Krankheit der Knochen ist eine fokale Störung, die bei symptomatischen Patienten zu Schmerzen und
Skelettdeformierungen führt. 5 Die im Rahmen der Paget-Krankheit auftretenden Veränderungen des Knochengewebes
zeichnen sich durch eine höchst anomal strukturierte Knochenmatrix aus, deren Anomalität durch eine übermäßig hohe
Remodellierungsaktivität verursacht wird. Die Läsionen treten hauptsächlich in Schädel, Wirbelsäule, Becken und den langen
Knochen auf und können zu Frakturen und neurologischen Störungen führen. 5 Die Ätiologie der Paget-Krankheit ist zwar
unbekannt, es werden jedoch genetische und virale Faktoren verantwortlich gemacht. 5 Eine Senkung der hohen biochemischen
Aktivität auf ein normales Niveau wird zur Zeit mit Hilfe von Bisphosphonaten und Calcitonin erreicht, wodurch eine normale
Knochenstruktur wiederhergestellt werden kann. 9
Als quantitativer Marker für den Knochenumsatz bietet BAP bei Osteoporose und Paget-Krankheit und bei Veränderungen der
Krankheitsaktivität infolge antiresorptiver Therapien wichtige Informationen zur Knochengeweberemodellierung. 10-12 Für den
Metra BAP Assay wurde mit Hilfe der Antikörpertechnologie ein monoklonaler Antikörper mit einer hohen BAP-Spezifität
entwickelt. 10 Diese Spezifität des monoklonalen Antikörpers ermöglicht es, die BAP-Aktivität in Serum auf einfache, bequeme,
reproduzierbare und direkte Weise zu bestimmen.
FUNKTIONSPRINZIP
Metra BAP ist ein auf Mikrotiterstreifen beruhender Immunassay, bei dem die in der Probe vorliegende BAP an die mit einem
monoklonalen Anti-BAP-Antikörper beschichteten Mikrotiterstreifen gebunden wird. Die Enzymaktivität des gebundenen BAP wird
mit Hilfe eines pNPP-Substrats bestimmt.
11
DEUTSCH

MITGELIEFERTE REAGENZIEN UND MATERIALIEN
96 Tests auf knochenspezifische alkalische Phosphatase (BAP)
Der Metra BAP Enzym-Immunassay enthält folgende Komponenten:
A BAP-Standardlösungen A - F Artikelnr. 4395 bis 4400 je 0,3 ml
B (A = 0, B = 2, C = 20, D = 50, E = 80, F = 140 E/L BAP)
C Von Osteosarkomzellen (SAOS-2) hergestelltes BAP in Pufferlösung mit Magnesiumchlorid, Zinksulfat,
D Tensid, Trägerprotein, blauem Farbstoff und Natriumazid (0,05 %) als Konservierungsmittel
E
F
L Niedrige/hohe Kontrolle Artikelnr. 4401, 4402 je 0,3 ml
H Von Osteosarkomzellen (SAOS-2) hergestelltes BAP in Pufferlösung mit Magnesiumchlorid, Zinksulfat, Tensid, Trägerprotein,
blauem Farbstoff und Natriumazid (0,05 %) als Konservierungsmittel
q Beschichtete Teststreifen Artikelnr. 4660 je 12
Gereinigter monoklonaler Anti-BAP-IgG-Antikörper von Mäusen absorbiert auf die Vertiefungen der Teststreifen
w Stopplösung Artikelnr. 4702 15 ml
0,5 N NaOH
e 10fach konzentrierter Waschpuffer Artikelnr. 4703 55 ml
Nicht ionisches Detergens in Pufferlösung mit Natriumazid (0,05 %) als Konservierungsmittel
r Testpufferlösung Artikelnr. 4403 27 ml
Gepufferte Lösung mit Magnesiumchlorid, Zinksulfat, Tensid und Natriumazid (0,05 %) als Konservierungsmittel
t Substratpuffer Artikelnr. 4404 3 x 10 ml
2-Amino-2-methyl-1-propanol-Lösung mit HEDTA, Magnesiumchlorid, Zinksulfat und Natriumazid (0,05 %) als
Konservierungsmittel
y Substrattabletten Artikelnr. 0012 3 x 20 mg
p-Nitrophenylphosphat
BENÖTIGTE MATERIALIEN (NICHT IM LIEFERUMFANG)
Mikropipetten zum Pipettieren von 20 µl und 100–300 µl
Geräte zum Abmessen von Flüssigkeiten im Volumenbereich von 100 bis 300 ml
Behälter für die Waschpufferverdünnung
Entionisiertes oder destilliertes Wasser
Plattenlesegerät für Absorbanzmessungen von A405 > 2,0
Software zum Anpassen quadratischer Kalibrierkurven
WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN
1. Zur In-vitro-Diagnostik
2. Proben als potenziell gefährliches biologisches Material behandeln. Beim Arbeiten mit diesem Kit und den Proben allgemein
gültige Vorsichtsmaßnahmen befolgen.
3. Behälter und ungenutzte Inhaltsstoffe gemäß den Anforderungen bundesweit, landesweit und örtlich geltender
Bestimmungen entsorgen.
4. Die mitgelieferten Reagenzien als eine zusammengehörende Einheit vor dem auf der Verpackung angegebenen Verfallsdatum
verwenden.
5. Die Reagenzien des Assays wie angegeben lagern.
6. Die beschichteten Teststreifen nicht verwenden, wenn der Beutel beschädigt ist.
7. Jede Probe mit Duplikaten testen.
8. 0,5 N NaOH ist ätzend und kann zu schweren Verbrennungen führen. Nicht einnehmen. Berührung mit Haut, Augen und
Kleidung vermeiden. Bei Berührung mit Wasser abwaschen. Bei Einnahme einen Arzt konsultieren.
9. Natriumazid wird als Konservierungsstoff verwendet. Der unbeabsichtigte Kontakt mit Pufferlösungen, die Natriumazid
enthalten, bzw. deren Einnahme kann zu Reizungen der Haut, der Augen oder des Mundes führen. Die Pufferlösungen nur für
die vorgesehenen Verwendungszwecke einsetzen und den Kontakt mit Säuren vermeiden. Natriumazid kann beim Kontakt
mit Kupfer- und Bleirohren hochexplosive Metallazide bilden. Bei der Entsorgung mit viel Wasser nachspülen, um eine
Anreicherung von Aziden zu vermeiden.
10. Der Substratpuffer enthält 2-Amino-2-methyl-1-propanol und kann bei anhaltendem Kontakt Reizungen der Augen und/oder
der Haut verursachen. Geeignete Schutzkleidung, Handschuhe und Augen-/Gesichtsschutz tragen. Betroffene Bereiche nach
dem Kontakt sofort mit Wasser und Seife waschen.
11. Für ein zügiges und effizientes Dosieren von Flüssigkeiten wird der Gebrauch von Mehrkanalpipetten empfohlen.
12. Zum Gewährleisten genauer Messungen bei der Zugabe der Proben und Standardlösungen genau arbeiten. Beim Pipettieren
vorsichtig vorgehen und nur kalibrierte Geräte verwenden.
13. Proben mit über 140 E/l mit Testpufferlösung verdünnen und erneut bestimmen. Den Verdünnungsfaktor bei den
Berechnungen berücksichtigen.
14. Für dieses Assay kann eine beliebige anerkannte Waschmethode eingesetzt werden.
12

VORBEREITUNG DER REAGENZIEN
Die Reagenzien und Materialien vor dem Test auf 20–28 °C bringen. Nach der Entnahme der erforderlichen
Reagenzien und Materialien die nicht mehr benötigten Komponenten wieder auf 2–8 °C bringen.
Beschichtete Teststreifen
Den Teststreifenträger und die benötigte Anzahl beschichteter Teststreifen aus dem Beutel entnehmen (siehe Tabelle unter
TESTVERFAHREN). Darauf achten, dass der Beutel, sofern er ungenutzte Teststreifen enthält, wieder richtig verschlossen wird.
Waschpuffer
Das benötigte Volumen des 1fach konzentrierten Waschpuffers (siehe Tabelle) vorbereiten, indem 10fach konzentrierter Waschpuffer
im Verhältnis 1:10 mit entionisiertem Wasser verdünnt wird. Bei 20–28 °C aufbewahren. Den 1fach konzentrierten Waschpuffer
innerhalb von 21 Tage nach dem Ansetzen verwenden.
Substratlösung
Die Substratlösung 1 Stunde vor Gebrauch ansetzen. In jede benötigte Substratpufferflasche (siehe Tabelle), die auf 20–28 °C
gebracht wurde, eine Substrattablette geben. Die Tablette(n) 30–60 Minuten lang auflösen lassen. Die Flasche(n) kräftig schütteln,
um eine vollständige Auflösung zu erzielen. Verbleibende Substratlösung nach dem Gebrauch entsorgen.
LAGERUNG
Das Kit bei 2–8 °C aufbewahren. Nicht einfrieren. Nicht gebrauchte Reagenzien bei 2–8 °C aufbewahren. Die Reagenzien vor dem
Gebrauch auf 20–28 °C bringen. Den 1fach konzentrierten Waschpuffer (10fach verdünnt) bei 20–28 °C aufbewahren.
ENTNAHME UND AUFBEWAHRUNG DER PROBEN
Das Serum mit Hilfe einer standardmäßigen Venenpunktion entnehmen. Die Proben sollten ohne Antikoagulanzien aufbewahrt
werden, jedoch so, dass keine Hämolysereaktionen auftreten. Das Blut koagulieren lassen und das Serum durch Zentrifugieren
trennen. Das Serum kann bei 2–8 °C 5 Tage, bei ≤ –40 °C 12 Monate und bei ≤ –80 °C 36 Monate lang aufbewahrt werden.
Die Proben dürfen nicht häufiger als dreimal eingefroren/aufgetaut werden.
Mit Serum, das vom Koagulum entnommen wurde („Off-the-clot“-Serum), im Serum-Trennröhrchen vorliegendes Serum,
Na-Heparin-Blutplasma und Li-Heparin-Blutplasma werden weitgehend vergleichbare Ergebnisse erzielt. Plasmaproben sollten
nicht mit Komplexbildnern wie EDTA oder Citrat vorbereitet werden.
TESTVERFAHREN
Vor der Durchführung des Tests die gesamte Packungsbeilage lesen.
Vor dem Fortfahren die unter VORBEREITUNG DER REAGENZIEN gegebenen Informationen einsehen.
Die Volumina der verschiedenen Reagenzien bestimmen, die für eine bestimmte Anzahl von Teststreifen
benötigt werden.
Anz. der Teststreifen 4 6 8 12
Anz. der Proben (Bestimmung in Duplikaten) 8 16 24 40
Substrat (Flasche) 1 1 2* 2*
1fach-Waschpuffer (ml) 100 150 200 300
*Werden mehrere Flaschen oder Fläschchen benötigt, deren Inhalt zusammenschütten und vor dem Gebrauch mischen.
Inkubation der Proben
1. Den Teststreifenträger und die benötigte Anzahl der beschichteten Teststreifen unmittelbar vor Gebrauch aus dem Beutel
entnehmen (siehe Tabelle). Darauf achten, dass der Beutel, sofern er ungenutzte Streifen enthält, wieder richtig verschlossen wird.
2. Die gewünschte Anzahl der beschichteten Teststreifen in den Teststreifenhalter legen. Die Teststreifen beschriften, damit sie nicht
vertauscht werden können, sollte der Teststreifenträger unbeabsichtigt entfernt werden.
3. 125 µl Testpufferlösung in jede Vertiefung geben.
4. 20 µl Standardlösung, Kontrolle oder Probe in jede Vertiefung geben. Nicht durch wiederholtes Aufziehen in der Pipette
mischen. Dieser Schritt sollte innerhalb von 30 Minuten abgeschlossen werden. Die Teststreifen vorsichtig
schwenken, um eine gründliche Mischung von Probe und Pufferlösung zu erreichen.
5. Bei 20–28 °C 3 Stunden (± 10 Minuten) inkubieren.
6. Die Substratlösung innerhalb 1 Stunde vor dem Gebrauch ansetzen. In jede benötigte Substratpufferflasche (siehe Tabelle),
die auf 20–28 °C gebracht wurde, eine Substrattablette geben. Die Tablette(n) 30–60 Minuten auflösen lassen. Die Flasche(n)
kräftig schütteln, um eine vollständige Auflösung zu erzielen.
Waschen
7. Das benötigte Volumen des 1fach konzentrierten Waschpuffers (siehe Tabelle) vorbereiten, indem 10fach konzentrierter
Waschpuffer im Verhältnis 1:10 mit entionisiertem Wasser verdünnt wird. Bei 20–28 °C aufbewahren. Den 1fach konzentrierten
Waschpuffer innerhalb von 21 Tage nach dem Ansetzen verwenden.
8. Die Teststreifen manuell umdrehen/entleeren. Mindestens 250 µl des 1fach konzentrierten Waschpuffers in jede Vertiefung
geben und die Teststreifen manuell umdrehen/entleeren. Diesen Vorgang dreimal wiederholen, um insgesamt viermal zu
waschen. Die Teststreifen nach dem letzten Waschschritt durch kräftiges Ausschlagen auf ein Papierhandtuch trocknen.
Inkubieren des Substrats
9. 150 µl der Substratlösung in jede Vertiefung geben. Verbleibende Substratlösung nach dem Gebrauch entsorgen.
10. Bei 20–28 °C 30 Minuten (± 5 Minuten) inkubieren.
13
DEUTSCH

Hinzugeben der Stopplösung und Ablesen des Ergebnisses
11. 100 µl der Stopplösung in jede Vertiefung geben. Die Zugabe der Stopplösung sollte auf die gleiche Weise und mit dem
gleichen zeitlichen Ablauf erfolgen wie die Zugabe der Substratlösung.
12. Die Absorbanz bei 405 nm ablesen. Darauf achten, dass sich in den Vertiefungen keine größeren Blasen befinden und dass die
Unterseite der Teststreifen sauber ist. Die Ergebnisse sollten innerhalb von 15 Minuten nach der Zugabe der Stopplösung
abgelesen werden.
13. Zum Analysieren des Metra BAP Testergebnisses muss eine Quantifizierungssoftware zum Anpassen quadratischer
Kalibrierkurven verwendet werden.
Gleichung: y = A + Bx + Cx 2
QUALITÄTSKONTROLLE
Das diesem Kit beiliegende Analysezertifikat ist nicht spezifischer Natur und soll nachweisen, dass die von Ihrem Labor ermittelten
Ergebnisse denen von Quidel entsprechen. Die gegebenen Absorbanzwerte sollen lediglich als Richtwerte dienen. Die von Ihrem
Labor erhaltenen Ergebnisse können davon abweichen.
Die im Rahmen der Qualitätskontrolle zu verwendenden Bereiche sind angegeben. Die Kontrollwerte haben die Aufgabe, die
Gültigkeit der Kurve und der Probenergebnisse zu bestätigen. Jedes Labor sollte eigene Kriterien festlegen, nach denen die
Testergebnisse anzunehmen sind. Wenn die Kontrollwerte nicht innerhalb der zulässigen Grenzwerte Ihres Labors liegen, sollten
die Testergebnisse in Frage gestellt und die Proben wiederholt werden.
Wenn die Absorbanz der Metra BAP Standardlösung F unter 1,0 liegt, sollten die Testergebnisse in Frage gestellt und die Proben
wiederholt werden.
AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE
Die Probenergebnisse können in E/l angegeben werden und müssen nicht mit dem Verdünnungsfaktor korrigiert werden (es sei
denn, die Probe wurde vor dem Test verdünnt).
Eine Einheit (E) des Metra Assays entspricht 1 µmol pNPP, hydrolysiert bei 25 °C pro Minute in 2-Amino-2-methyl-1-propanol-
Pufferlösung.
Repräsentative Standardkurve
BAP-Konzentration der Standardlösungen: 0, 2, 20, 50, 80, 140 E/l
Optische Dichte (405 nm)
3,0
2,0
1,0
GRENZEN DER METHODE
HAMA-Interferenzen
0,0
0 25 50 75 100 125 150
BAP (E/l)
Einige Patienten haben Antikörper gegen Mausantikörper (HAMA), die sich bei Immunassays, die aus Maus-Antikörpern hergestellt
wurden, störend auswirken können. Besonders bei Serumproben von Patienten, die mit therapeutischen oder diagnostischen
Verfahren unter Verwendung von Infusionen mit monoklonalen Maus-Antikörpern behandelt wurden, wurden falsche Ergebnisse
beobachtet. Die Ergebnisse des Metra BAP Assays sollten für derartige Patienten nur im Zusammenhang mit den Ergebnissen
anderer diagnostischer Verfahren und mit anderen klinischen Daten des Patienten verwendet werden.
Bei Proben mit signifikant erhöhter alkalischer Leber-Phosphatase-Aktivität können mit dem Metra BAP Assay ungewöhnlich
hohe Ergebnisse erhalten werden.
Patienten mit Paget-Krankheit, bei denen die Krankheit nicht sehr stark ausgeprägt ist, können BAP-Konzentrationen aufweisen,
die noch innerhalb des Referenzbereichs des Metra BAP Assays liegen.
BEISPIELCWERTE
Die BAP-Referenzbereiche wurden für normale Männer im Alter über 25 Jahren (n = 178), normale prämenopausale Frauen im
Alter zwischen 25 und 44 Jahren (n = 178) und normale postmenopausale Frauen (n = 107) ermittelt. Für die Bestimmung der
Referenzbereiche wurden normale Probanden wie folgt definiert:
� Grundsätzlich gesund, ohne endokrine oder chronische Erkrankungen bzw. Knochenerkrankungen
� Regelmäßiger Menstruationszyklus (prämenopausale Frauen)
� Keine schwangeren oder stillenden (Frauen)
� Keine Medikationen, von denen bekannt ist, dass sie den Knochenstoffwechsel beeinflussen
14

Beeinflusst werden die Werte durch Faktoren wie geringe Östrogenproduktion, geringe Kalziumaufnahme oder geringe physische
Aktivität. 8 Ein bei postmenopausalen Frauen auftretender Östrogenmangel kann zu einem erhöhten Knochenumsatz führen. 3,4
Jedes Labor sollte eigene Referenzbereiche für normale Patienten festlegen. Die Bereiche sollten in Form von nicht parametrischen
Referenzintervallen (90 % KI) angegeben werden.
Alter (Jahre) Bereich (E/l) Median
Frauen 25 – 44 Prämenopausal 11,6 – 29,6 18,3
Frauen ≥ 45 Postmenopausal 14,2 – 42,7 25,0
Männer ≥ 25 15,0 – 41,3 23,2
LEISTUNGSMERKMALE
Antikörper-Spezifikationen
Der BAP-Antikörper ist gegenüber der knochenspezifischen alkalischen Phosphatase-Isoform selektiv und hochaffin, zeigt eine
geringe Kreuzaktivität zur hepatischen Form der alkalischen Phosphatase und weist gegenüber intestinalen und plazentaren
Isoenzymen eine vernachlässigbare Bindungsaffinität auf.
AP-Isoenzym % Reaktivität
Knochen 100
Leber 3 – 8
Plazenta 0
Darm 0,4
Sensitivität
Das Nachweisgrenze des Metra BAP Assays beträgt 0,7 E/l und wurde im Rahmen einer Nullstandard-Präzisionsstudie an der
3fachen Standardabweichung festgelegt.
Wiedergewinnung – maximale Wiedergewinnung
Die maximale Wiedergewinnung (engl. „spike recovery“) wurde dadurch ermittelt, dass eine bekannte Menge gereinigter BAP zu
Serumproben mit unterschiedlichen Konzentrationen endogener BAP hinzugegeben wurde. Im Folgenden sind typische Ergebnisse
aufgeführt, die nach der Zugabe von geringen, mittleren und hohen BAP-Konzentrationen zu Serumproben und anschließender
Bestimmung von Triplikaten erhalten wurden.
Endogen (E/l) Zugabe (E/l) Gefunden (E/l) Wiedergew. (%)
13,4 15,7 29,1 99
17,6 37,5 55,3 99
27,2 57,2 88,1 106
Wiedergewinnung – Linearität
Die Linearität wurde ermittelt, indem eine serielle Verdünnungsreihe der Proben erstellt wurde und die gemessenen Werte mit den
erwarteten Werten verglichen wurden. Die Ergebnisse sind im Folgenden dargestellt.
Probe Verdün-nung Gefunden (E/l) Erwartet (E/l) Wieder-gew. (%)
1 unverdünnt 108,5 - -
1:2 51,1 54,2 94
1:4 25,8 27,1 99
1:6 18,0 18,1 99
2 unverdünnt 39,1 - -
1:2 20,1 19,5 103
1:4 10,3 9,8 105
1:6 6,7 6,5 103
3 unverdünnt 58,4 - -
1:2 29,9 29,2 102
1:4 15,7 14,6 108
1:6 9,7 9,7 100
Präzision
Die Präzision „in der Serie“ wurde für ≥ 21 Replikate von 3 Proben auf 3 Plättchen von 3 verschiedenen Kitchargen (insgesamt 9
Plättchen) ermittelt Die Präzision „von Serie zu Serie“ wurde durch die Bestimmung von 3 Proben auf 6 einzelnen Plättchen von 3
verschiedenen Kitchargen (insgesamt 18 Plättchen) ermittelt. Die Ergebnisse sind im Folgenden dargestellt.
BAP (E/l) In der Serie 1 (CV %) Von Serie zu Serie 2 (CV %)
12 5,8 5,2
35 3,9 7,6
100 5,2 5,0
1 n = 21 2 n = 6 Serien
15
DEUTSCH

Störsubstanzen
Die folgenden Substanzen wurden mit den angegebenen Konzentrationen getestet. Sie stellen keine Störungen für diesen Assay dar.
16
Substanz Konzentration
Hämoglobin 500 mg/dl
Bilirubin 25 mg/dl
Triglyceride 1.420 mg/dl
Gesamteiweiß 6,0 g/dl †
Gesamteiweiß 15,6 g/dl †
Gesamteiweiß 6,0 g/dl ‡
Gesamteiweiß 15,6 g/dl ‡
† Eiweiß mit Wasser
‡ Eiweiß mit BAP (BAP-Konzentration= 43,6 E/l)
Arzneimittelinterferenzen
Zu den drei Serumproben mit ungefähr 35, 70 und 105 E/l BAP wurden verschiedene Konzentrationen von Arzneimitteln
hinzugegeben. Danach wurden sie als Triplikate getestet. Folgende Arzneimittel und Maximalkonzentrationen wurden untersucht:
Substanz Maximalkonzentration
Etidronat 350 µg/ml
Östrogen 100 µg/ml
Ibuprofen 150 µg/ml
Acetaminophen 350 µg/ml
Aspirin 350 µg/ml
Calcitonin – human 80 µg/ml
Calcitonin – Lachs 80 µg/ml
Kalzium 500 µg/ml
Norethisteron-Äthinylöstradiol-Mischung (orales Kontrazeptivum) 3 mg/ml
Vitamin D 400 IE/ml
Genauigkeit
Zur Bewertung der Korrelation zwischen den BAP-Bestimmungen in Serum, die mit dem Metra BAP Assay durchgeführt wurden,
und den Ergebnissen von drei anderen im Handel erhältlichen Tests zur Bestimmung der alkalischen Gesamtphosphatase (TAP)
oder BAP wurden Vergleichsstudien durchgeführt. Diese Studien wurden an einem unabhängigen klinischen Forschungszentrum
durchgeführt und umfassten Serumproben von 114 Patienten mit der Paget-Krankheit und 464 gesunden Probanden. In der
ersten Vergleichsstudie wurde die TAP-Konzentration mit einer kolorimetrischen Methode bestimmt. Der Korrelationskoeffizient
(r) zwischen dieser kolorimetrischen Methode und dem Metra BAP Assay betrug 0,99. Der zweite Vergleich bestand in einer
Elektrophoresebestimmung der BAP-Isoenzym-Konzentrationen (r = 0,99). In einem dritten Vergleich wurde die BAP-Konzentration
mit einem Radioimmunassay bestimmt (r = 0,99). Von den 114 Patienten mit diagnostizierter Paget-Krankheit lagen die Werte bei
101 Patienten über dem oberen Grenzwert der Referenzbereiche, die für das Metra BAP Assay festgelegt wurden. Bei 13 Patienten
lagen die Werte unter dem oberen Grenzwert der Referenzbereiche.
KLINISCHE STUDIEN
Überwachung der Wirksamkeit antiresorptiver Therapien bei Osteoporose mit dem Metra BAP Assay
Zur Bestimmung der Zuverlässigkeit und Wirksamkeit des Metra BAP Assays bei der Überwachung von Änderungen der BAP-
Konzentrationen in Serum, die bei antiresorptiven Bisphosphonat-(Alendronat)-Therapien auftreten, wurde eine randomisierte,
kontrollierte Multizenterstudie durchgeführt. Die Probanden, die von einer größeren Studie über die Wirksamkeit von Alendronat
bei der Behandlung von Osteoporose stammten 7 , waren postmenopausale Frauen im Alter zwischen 45 und 84 Jahren (Mittel
64 ± 7 Jahre), bei denen Osteoporose diagnostiziert wurde (beruhend auf der klinischen oder Basislinien-Knochenmineraldichte
der Lendenwirbelsäule [LSBMD], über 2,5 Standardabweichungen unter dem Mittelwert für reife, prämenopausale Frauen). Die
geeigneten Probanden wurden an der Basislinie randomisiert und erhielten entweder 10 mg Alendronat und 500 mg Kalzium
täglich (ALN) oder ein Plazebo und 500 mg Kalzium täglich (CTL). Die Serumproben wurden von allen Probanden an der Basislinie
sowie nach 3, 6 und 12 Monaten entnommen.
Die mittlere (± 1 SA) BAP-Basislinienkonzentration (14,6 ± 5,4 vs. 14,6 ± 4,6, p = 0,900) und LSBMD (0,74 ± 0,10 vs.
0,75 ± 0,09, p = 0,751) waren vergleichbar für ALN und CTL. In der folgenden Abbildung ist die Verteilung der BAP-
Basislinienwerte in der ALN- und CTL-Gruppe als prozentualer Anteil der Studienpopulation dargestellt.

Anteil an der Population (%)
Verteilung der BAP-Werte (Basislinie)
Nach 3 (9,6 ± 3,5 vs. 13,4 ± 4,0, p

18
Anteil an der Population (%)
Verteilung der prozentualen BAP-Änderungen nach 12 Monaten
Therapie mit Alendronat (ALN) oder Kalzium (CTL)
< -70,0%
-70,0 bis -60,1%
-60,0 bis -50,1%
Wie in der folgenden Abbildung dargestellt, trat bei den Probanden der ALN-Gruppe im Vergleich zur CTL-Gruppe nach 12 Monaten
eine LSBMD-Zunahme auf (p < 0,00001).
LSBMD-Änderungen (Mittelwert ± SA)
-50,0 bis -40,1%
-40,0 bis -30,1%
n Basislinie (g/cm 2 ) 12 Monate (g/cm 2 ) ∆ (%)
CTL 159 0,75 ± 0,09 0,74 ± 0,09 -0,6 ± 3,4
ALN 121 0,74 ± 0,10 0,79 ± 0,10 5,5 ± 4,1
Diese Ergebnisse zeigen, dass der Metra BAP Assay zur Überwachung der antiresorptiven Wirkung von Aminobisphosphonat-
(Alendronat-)-Therapien bei Probanden mit diagnostizierter Osteoporose zuverlässig und wirksam ist.
Überwachung antiresorptiver Hormontherapien und Prognose der skelettalen Reaktion
(Knochenmineraldichte) bei postmenopausalen Frauen mit Hilfe des Metra BAP Assays
Überwachung der Therapie:
Zur Bestimmung der Zuverlässigkeit und Wirksamkeit des Metra BAP Assays für die Überwachung von Änderungen der BAP-
Konzentrationen in Serum, die bei antiresorptiven Östrogen-/Progestin-Therapien auftreten, wurde eine randomisierte, kontrollierte
Multizenterstudie durchgeführt. Ein postmenopausaler Östrogenmangel geht häufig mit einem erhöhten Knochenumsatz und
einem signifikanten Knochenschwund einher. Es wurde gezeigt, dass durch eine Östrogenersatztherapie der Knochenumsatz
wirksam gesenkt und die vorhandene Knochenmasse geschützt werden kann. 3,6 Bei den Probanden handelte es sich um
postmenopausale Frauen im Alter zwischen 45 und 64 Jahren (Mittelwert 56 ± 4 Jahre) mit natürlicher oder chirurgischer
Menopause in den letzten 10 Jahren. Die geeigneten Probanden wurden an der Basislinie randomisiert und entweder einer aktiven
Behandlungsgruppe (HRT) (Premarin® [0,625 mg täglich] mit Plazebo-Progestin, Premarin® [0,625 mg täglich] und aktivem
Progestin [Provera® 2,5 mg/Tag und kontinuierlich, Provera® 10 mg/Tag zyklisch oder mikronisiertes Progesteron 200 mg/Tag
zyklisch] oder der Kontrollgruppe (CTL) (Plazebo-Östrogen und Plazebo-Progestin) zugewiesen. Die Serumproben wurden von
allen Probanden an der Basislinie und nach 12 Monaten entnommen.
Die mittlere (± 1 SA) BAP-Basislinienkonzentration (20,7 ± 7,6 vs. 20,3 ± 6,8 E/L, p = 0,704) und LSBMD (0,97 ± 0,17 vs.
0,97 ± 0,15 g/cm2 , p = 0,970) waren in der HRT- und CTL-Gruppe ähnlich. In der folgenden Abbildung ist die Verteilung der BAP-
Basislinienwerte in der HRT- und CTL-Gruppe als prozentualer Anteil der Studienpopulation dargestellt.
Verteilung der BAP-Werte (Basislinie)
CTL
HRT
30,0%
Anteil an der Population (%)
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
-30,0 bis -20,1%
verringerter Knochenumsatz % Änderung
erhöhter Knochenumsatz
≤ 9,0
9,1 bis 11
11,1 bis 13
13,1 bis 15
15,1 bis 17
17,1 bis 19
19,1 bis 21
-20,0 bis -10,1%
21,1 bis 23
-10,0 bis -0,1%
23,1 bis 25
0,0 bis 9,9%
25,1 bis 27
12 Monate CTL
12 Monate ALN
verringerter Knochenumsatz E/I BAP
erhöhter Knochenumsatz
10,0 bis 19,9%
27,1 bis 29
≥ 20,0%
> 29

Die BAP-Werte waren in der HRT-Gruppe nach 12 Monaten signifikant niedriger als in der CTL-Gruppe (13,3 ± 5,0 vs. 21,9 ±
7,9 E/L, p < 0,00001). In der folgenden Abbildung sind die Verteilungen der BAP-Werte in der HRT- und CTL-Gruppe nach
12 Monaten dargestellt.
Anteil an der Population (%)
Verteilung der BAP-Werte nach 12 Monaten
Therapie mit Östrogen/Progestin (HRT) oder Plazebo (CTL)
Die mittlere (± 1 SA) BAP-Konzentration nahm in den Probanden der CTL-Gruppe nach 12 Monaten von der Basislinie etwas auf
+9,8 % (± 33,2 %) zu (p=0,00004), wogegen die BAP-Konzentrationen in den Probanden der HRT-Gruppe im gleichen Zeitraum
von der Basislinie auf –32,4 (± 21,5 %) abnahm (p < 0,00001). Bei den Probanden der HRT-Gruppe traten im Vergleich zur CTL-
Gruppe mit einer höheren Wahrscheinlichkeit BAP-Abnahmen auf, die über einer prozentualen Mindeständerung 12 lagen (73,3 %
in der HRT-Gruppe und 3,4 % in der CTL-Gruppe, Abnahme um ≥ 25 % nach 12 Monaten). In der folgenden Abbildung sind die
Verteilungen der prozentualen BAP-Änderungen von der Basislinie in der HRT- und CTL-Gruppe nach 12 Monaten dargestellt.
Anteil an der Population (%)
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
≤ 9,0
9,1 bis 11
11,1 bis 13
Verteilung der prozentualen BAP-Änderungen nach 12 Monaten
Therapie mit Östrogen/Progestin (HRT) oder Plazebo (CTL)
Wie in der folgenden Abbildung dargestellt, trat bei den Probanden der HRT-Gruppe im Vergleich zur CTL-Gruppe nach 12 Monaten
eine LSBMD-Zunahme auf (p < 0,00001).
LSBMD-Änderungen (Mittelwert ± SA)
13,1 bis 15
15,1 bis 17
17,1 bis 19
verringerter Knochenumsatz E/I BAP
erhöhter Knochenumsatz
< -70,0%
-70,0 bis -60,1%
-60,0 bis -50,1%
-50,0 bis -40,1%
-40,0 bis -30,1%
n Basislinie (g/cm 2 ) 12 Monate (g/cm 2 ) ∆ (%)
CTL 58 0,97 ± 0,17 0,95 ± 0,16 –1,6 ± 2,8
HRT 262 0,97 ± 0,15 1,00 ± 0,15 +3,5 ± 2,8
Diese Ergebnisse zeigen, dass der Metra BAP Assay zur Überwachung der antiresorptiven Wirkung von Hormonersatztherapien bei
postmenopausalen Frauen zuverlässig und wirksam ist.
-30,0 bis -20,1%
19,1 bis 21
-20,0 bis -10,1%
21,1 bis 23
-10,0 bis -0,1%
23,1 bis 25
0,0 bis 9,9%
25,1 bis 27
10,0 bis 19,9%
27,1 bis 29
CTL
HRT
verringerter Knochenumsatz % Änderung
erhöhter Knochenumsatz
> 29
HRT
≥ 20,0% CTL
19
DEUTSCH

Prognose der skelettalen Reaktion:
Die prozentuale Abnahme der BAP-Werte von der Basislinie zum 12-Monate-Zeitpunkt ist in der folgenden Abbildung nach Quartil
für die HRT-Gruppe dargestellt. Die Probanden im höchsten Quartil (Q1: größte prozentuale Abnahme) zeigten den größten LSBMD-
Anstieg als Reaktion auf die HRT-Therapie.
20
% LSBMD- Änderung bis 12 Monate (+/- SEM)
HRT-Gruppe – prozentuale BAP-Änderung nach 12 Monaten nach
Quartil und die entsprechende prozentuale LSBMD-Änderung über den gleichen Zeitraum
Die lineare Regression (y = –0,060x + 0,011, r = –0,51, p < 0,001) zwischen der prozentualen BAP-Änderung von der Basislinie
bis zum 12-Monate-Zeitpunkt und der prozentualen BMD-Änderung von der Basislinie bis zum 12-Monate-Zeitpunkt ist für alle
Probanden der Studie (Plazebo und Behandlung) in der folgenden Abbildung dargestellt.
LSBMD- Änderung bis 12 Monate
6
5
4
3
2
1
0
Q1 (-66,5 bis -45,9) Q2 (-45,9 bis -36,0)
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
-5,0%
-10,0%
p < 0,001
HRT-Studie – lineare Regression der prozentualen LSBMD- und BAP-
Änderungen von der Basislinie bis zum 12-Monate-Zeitpunkt
Eine auf Kontigenz-Tabellen beruhende Analyse hat gezeigt, dass zwischen einer BAP-Abnahme ≥ 25 % nach 12 Monaten
und einer positiven skelettalen Reaktion auf HRT (BMD-Zunahme) über den gleichen Zeitraum ein signifikanter (p < 0,0001)
Zusammenhang besteht. Die binomialen (Approximation 2. Ordnung) 85-%-Konfidenzintervalle für die Sensitivität und Spezifität
einer 25%igen BAP-Abnahme lauten zum Prognostizieren der Reaktion auf HRT wie folgt:
Sensitivität = 77 % (95 % KI 75 %, 82 %); Spezifität = 61 % (95 % KI 41 %, 78 %).
Diese Ergebnisse zeigen, dass die skelettale Reaktion (BMD) auf die HRT-Behandlung anhand der prozentualen Änderung der
BAP-Konzentration prognostiziert werden kann.
KUNDENDIENST
Zum Aufgeben einer Bestellung oder für technischen Kundendienst wenden Sie sich unter +1 408 616 4301, Montags bis
Freitags zwischen 8:00 und 17:00 Uhr (PST) an eine Quidel Vertretung. Bestellungen können unter +1 408 616 4310 auch
per Fax aufgegeben werden.
Informationen zum Serviceangebot außerhalb der USA erhalten Sie von Ihrer Vertretung vor Ort.
Q3 (-36,0 bis -23,8) Q4 (-23,8 bis 167,3)
Quartile der BAP-Änderungen (%) bis 12 Monate
-15,0%
-60,0% -40,0% -20,0%
y = -0,060x + 0,011
r = 0,51
p < 0,001
0,0% 20,0% 40,0% 60,0%
BAP-Änderung bis 12 Monate

GUIDA VELOCE PER LE FASI DEL SAGGIO
1. Aggiungere 125 µL di tampone del saggio.
2. Aggiungere 20 µL di standard, di campioni di controllo e di campioni, quindi agitare.
3. Incubarli per 3 ore ± 10 minuti a 20–28°C.
4. Lavarli 4 volte con tampone di lavaggio 1X.
5. Aggiungere 150 µL di soluzione di substrato attiva a 20–28°C.
6. Incubarla per 30 ± 5 minuti a 20–28°C.
7. Aggiungere 100 µL di soluzione bloccante e leggere i risultati della densità ottica a 405 nm.
FINALITÀ D’USO:
Il saggio immunoenzimatico Metra BAP fornisce una misura quantitativa dell’attività della fosfatasi alcalina osso-specifica
(bone-specific alkaline phosphatase, BAP) nel siero come indicatore dell’attività osteoblastica. La misura di BAP è prevista
per l’uso come ausilio:
� nella gestione dell’osteoporosi della postmenopausa e del morbo di Paget;
� nel monitoraggio delle donne in postmenopausa che fanno uso di una terapia ormonale o a base di bisfosfonato;
� nella previsione di una risposta scheletrica alla terapia ormonale in donne in postmenopausa.
SOMMARIO E SPIEGAZIONE
L’isoformio scheletrico, o osso-specifico della fosfatasi alcalina è una glicoproteina tetramerica riscontrata nella superficie cellulare
degli osteoblasti. 1 Gli osteoblasti sono le cellule responsabili della sintesi della matrice del nuovo osso e della sua mineralizzazione.
La funzione di BAP non è stata spiegata completamente, sebbene sia stato confermato il suo ruolo nella mineralizzazione
scheletrica. 1,2,3
L’osso è costantemente sottoposto a un processo metabolico denominato rimodellazione. 3,4 Tale processo comprende una fase
di degradazione, riassorbimento dell’osso, mediato dall’azione degli osteoclasti, e una fase di generazione, formazione dell’osso,
mediata dall’azione degli osteoblasti. 3,4 La rimodellazione è necessaria per il mantenimento, in generale per la salute dell’osso ed è
strettamente abbinata; vale a dire che il riassorbimento e la formazione sono bilanciati. 3,4 In condizioni anormali del metabolismo
dell’osso, questo processo non va di pari passo e quando il riassorbimento supera la formazione, si ha una perdita netta dell’osso,
che può portare all’osteoporosi 3,4 o alla comparsa di lesioni pagetiche nel tessuto osseo con disordini. 5 La misurazione dei marcatori
biochimici specifici di tali casi di rimodellazione fornisce i dati analitici relativi al tasso di metabolismo osseo o “ricambio”. 3,4
L’osteoporosi è una malattia metabolica dell’osso caratterizzata da una rimodellazione anormale dell’osso. Si tratta di una malattia
scheletrica sistemica, caratterizzata da minore massa ossea e deterioramento della microarchitettura del tessuto osseo, con
un conseguente aumento della suscettibilità alle fratture. 6 Il tipo maggiormente comune di osteoporosi si verifica in donne in
postmenopausa in seguito alla mancanza di estrogeni causata dalla cessazione della funzione ovarica. 3 Il ripristino dei livelli di
estrogeno in premenopausa con una terapia sostitutiva impedisce la perdita ossea e l’osteoporosi. 3,6 Gli estrogeni e una classe di
composti conosciuti come bisfosfonati rappresentano delle terapie anti-riassorbenti che possono essere usate per impedire la perdita
ossea o per curare l’osteoporosi. 3,6,7
È possibile anche che l’osteoporosi provochi una massa ossea con picco inadeguato durante gli anni di crescita, uno squilibrio della
rimodellazione dell’osso riferito all’età con un eccesso netto di riassorbimento e numerose condizioni cliniche e terapie che inducono
la perdita ossea o gli squilibri della rimodellazione dell’osso. 3 Queste comprendono malattie endocrine quali ipogonadismo,
ipertiroidismo, iperparatiroidismo, ipercortisonismo; blocco renale; tumori metastatici dell’osso; malattie gastrointestinali riferite al
metabolismo della nutrizione e minerale; malattie del tessuto connettivo; mieloma multiplo; immobilizzazione cronica, alcolismo o
uso di tabacco e terapia cronica con eparina o corticosteroidi. 3
Il morbo di Paget dell’osso costituisce un disordine focale che provoca dolore e deformità scheletrica in pazienti sintomatici. 5 Le
lesioni pagetiche, caratterizzate da matrice ossea dalla struttura estremamente anormale, nascono da tassi eccessivi dell’attività di
rimodellazione. Le lesioni si verificano in modo predominante nel cranio, nella colonna vertebrale, nella pelvi e nelle ossa lunghe e
possono causare fratture e un peggioramento neurologico. 5 L’eziologia del morbo di Paget non è accertata, ma vengono avvalorate
le ipotesi che comprendono fattori genetici e virali. 5 Attualmente vengono usati i bisfosfonati e la calcitonina per eliminare il tasso
elevato di attività biochimica a livelli normali, che consente il ripristino della struttura ossea normale. 9
Come misura quantitativa di un marcatore del ricambio osseo, BAP fornisce informazioni utili sulla rimodellazione ossea in pazienti
affetti da osteoporosi e morbo di Paget e sulle modifiche nell’attività della malattia prodotte da una terapia anti-riassorbente. 10-12
Per il saggio Metra BAP è stata impiegata la tecnologia degli anticorpi allo scopo di produrre un anticorpo monoclonale che dimostri
la specificità di BAP. 10 La specificità dell’anticorpo monoclonale usato nel saggio consente la quantificazione in modo semplice,
comodo, riproducibile e diretto dell’attività di BAP in siero.
PRINCIPIO DELLA PROCEDURA
Metra BAP è un saggio immunoenzimatico in formato di striscia per microtitolazione che utilizza un anticorpo monoclonale
anti-BAP rivestito sulla striscia al fine di catturare la BAP nel campione. L’attività enzimatica della BAP catturata viene rilevata con
un substrato di pNPP.
21
ITALIANO

REAGENTI E MATERIALI FORNITI
96 saggi per fosfatasi alcalina osso-specifica
Metra BAP EIA contiene i seguenti materiali e reagenti:
A Standard BAP A - F Codici da 4395 a 4400 0,3 mL ciascuno
B (A = 0, B = 2, C = 20, D = 50, E = 80, F = 140 U/L BAP)
C BAP viene purificata dalle cellule dell’osteosarcoma SAOS-2 in una soluzione tamponata contenente cloruro di magnesio,
D solfato di zinco, tensioattivo, proteina carrier, colorante blu e azide di sodio (0,05%) come conservante.
E
F
L Campioni di controllo Codici 4401, 4402 0,3 mL ciascuno
H inferiori/superiori
BAP purificata dalle cellule dell’osteosarcoma SAOS-2 in una soluzione tamponata contenente cloruro di magnesio, solfato di
zinco, tensioattivo, proteina carrier, colorante blu e azide di sodio (0,05%) come conservante.
q Strisce rivestite Codice 4660 12 pezzi
Anticorpo monoclonale IgG Anti-BAP murino purificato assorbito nei telai Stripwell.
w Soluzione bloccante Codice 4702 15 mL
0,5N NaOH
e Tampone di lavaggio 10X Codice 4703 55 mL
Detergente non ionico in una soluzione tamponata contenente azide di sodio (0,05%) come conservante.
r Tampone del saggio Codice 4403 27 mL
Soluzione tamponata contenente cloruro di magnesio, solfato di zinco, tensioattivo e azide di sodio (0,05%) come conservante.
t Tampone del substrato Codice 4404 3 x 10 mL
Soluzione di 2-amino-2-metil-1-propanolo contenente HEDTA, cloruro di magnesio, solfato di zinco e azide di sodio (0,05%)
come conservante.
y Tavolette di substrato Codice 0012 3 x 20 mg
Fosfato di p-Nitrofenile.
MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI
Micropipette per la fornitura di 20 µL e 100-300 µL
Elementi adatti per la misurazione di liquidi da 100-300 mL
Contenitore per la diluizione del tampone di lavaggio
Acqua deionizzata o distillata
Lettore per piastra in grado di effettuare letture alla densità ottica di A405 > 2,0
Software per adattamento della curva di calibrazione quadratica
AVVERTENZE E PRECAUZIONI
1. Per uso diagnostico In Vitro.
2. Trattare i campioni come materiale a potenziale rischio biologico. Seguire le precauzioni generali durante la manipolazione
del contenuto di questo kit e di qualunque campione paziente.
3. Smaltire i contenitori e il contenuto inutilizzato in conformità con i requisiti delle normative federali, statali e locali.
4. Usare i reagenti forniti come un’unità integrale prima della data di scadenza indicata sull’etichetta della confezione.
5. Conservare i reagenti del saggio come indicato.
6. Non usare le strisce rivestite se la busta protettiva è danneggiata.
7. Sottoporre a test ciascun campione in duplicato.
8. 0,5N NaOH è considerato corrosivo e può causare gravi ustioni. Non ingerirlo. Evitare il contatto con la cute, gli occhi o gli
indumenti. Se avviene il contatto, lavare con acqua. Se ingerito, consultare un medico.
9. L’azide di sodio viene usato come conservante. Il contatto o l’ingestione accidentale di tamponi contenenti azide di sodio può
causare irritazioni alla cute, agli occhi o alla bocca. Usare esclusivamente i tamponi per gli scopi previsti ed evitare il contatto con
gli acidi. È possibile che l’azide di sodio reagisca con tubazioni in rame e in piombo e formi azidi metallici altamente esplosivi.
Dopo lo smaltimento, lavare con una grande quantità di acqua per impedire l’accumulo di azide.
10. Il tampone del substrato contiene 2-amino-2-metil-1-propanolo e, in caso di contatto prolungato, può provocare irritazione
agli occhi e/o alla cute. Indossare adeguati indumenti di protezione, guanti e protezioni per occhi/viso. Occorre lavare
immediatamente con sapone e acqua le aree entrate in contatto.
11. Si consiglia l’uso di pipette multicanale o di pipettatori a ripetizione per garantire la fornitura veloce dei reagenti.
12. Per una misurazione accurata dei campioni, aggiungere accuratamente i campioni e gli standard. Pipettare attentamente,
usando esclusivamente apparecchiature calibrate.
13. Diluire i campioni maggiori di 140 U/L nel tampone del saggio ed effettuare di nuovo il test. Comprendere il fattore di diluizione
nel calcolo finale.
14. È possibile eseguire questo saggio con qualunque metodo di lavaggio omologato.
22

PREPARAZIONE DEI REAGENTI
Prima dell’uso, portare i reagenti e i materiali per il saggio a 20–28°C. Dopo la rimozione dei reagenti e
materiali necessari, conservare gli elementi inutilizzati a 2–8°C.
Strisce rivestite
Rimuovere dalla busta protettiva il telaio Stripwell e il numero necessario di strisce rivestite (fare riferimento alla tabella nella sezione
PROCEDURA DEL SAGGIO). Verificare che la busta protettiva contenente eventuali strisce inutilizzate venga risigillata completamente.
Tampone di lavaggio
Preparare la quantità necessaria di tampone di lavaggio 1X (fare riferimento alla tabella) diluendo con acqua deionizzata il
tampone di lavaggio concentrato in un rapporto di 1:10. Conservare a 20–28°C. Utilizzare il tampone di lavaggio 1X entro 21
giorni dalla preparazione.
Soluzione di substrato attiva
Preparare la soluzione di substrato attiva entro 1 ora dall’utilizzo. Porre una tavoletta di substrato in ciascun flacone necessario di tampone
di substrato a 20–28°C (fare riferimento alla tabella). Lasciar trascorrere 30–60 minuti per consentire alle tavolette di dissolversi. Agitare
accuratamente i flaconi al fine di miscelarli completamente. Dopo l’uso, gettare la rimanente soluzione di substrato attiva.
CONSERVAZIONE
Conservare i kit a 2–8°C. Non congelare. Conservare i reagenti inutilizzati a 2–8°C. Prima dell’uso, equilibrare i reagenti a 20–28°C.
Conservare il tampone di lavaggio 1X (diluito 10X) a 20–28°C.
PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI
Prelevare il siero adottando una tecnica di venopuntura standard. È necessario prelevare i campioni senza usare anticoagulanti
e in modo da evitare l’emolisi. Lasciare che il sangue coaguli e separare il siero tramite centrifugazione. È possibile conservare il
siero per 5 giorni a 2–8°C, a ≤ -40°C per 12 mesi, oppure a ≤ -80°C per 36 mesi. Non sottoporre i campioni a più di 3 cicli di
congelamento/decongelamento.
Il siero senza coaguli, quello in provetta proveniente da un separatore per siero, il plasma di eparina Na e il plasma di eparina Li forniscono
sostanzialmente risultati equivalenti. Si sconsiglia di preparare i campioni di plasma facendo uso di chelanti quali EDTA o citrato.
PROCEDURA DEL SAGGIO
Prima di iniziare il saggio, leggere completamente l’inserto fornito con il prodotto.
Prima di procedere, fare riferimento a PREPARAZIONE DEI REAGENTI.
Determinare la quantità necessaria di ciascun reagente per il numero di strisce da usare.
# di strisce 4 6 8 12
# di campioni (sottoposti a test in duplicato) 8 16 24 40
Substrato (flacone) 1 1 2* 2*
Tampone di lavaggio 1X (mL) 100 150 200 300
*Quando viene usato più di un flacone o di una fiala, unire i contenuti e miscelarli prima dell’uso.
Incubazione del campione
1. Rimuovere il telaio Stripwell dalla busta protettiva e il numero necessario di strisce rivestite (fare riferimento alla tabella)
immediatamente prima dell’uso. Verificare che la busta protettiva metallizzata contenente qualunque striscia inutilizzata venga
risigillata completamente.
2. Porre il numero desiderato di strisce rivestite nel telaio Stripwell. Etichettare le strisce per evitare di fare confusione nel caso di
una rimozione accidentale dal telaio Stripwell.
3. Aggiungere 125 µL di tampone del saggio in ciascun pozzetto.
4. Aggiungere 20 µL di standard, campione di controllo o campione in ciascun pozzetto. Non miscelarli con il tampone del saggio
pipettando nuovamente. È necessario completare questa fase entro 30 minuti. Agitare delicatamente le strisce per
garantire la miscelazione del campione e del tampone.
5. Incubare per 3 ore (± 10 minuti) a 20–28°C.
6. Preparare la soluzione di substrato attiva entro 1 ora dall’utilizzo. Porre una tavoletta di substrato in ciascun flacone necessario
di tampone di substrato a 20–28°C (fare riferimento alla tabella). Lasciar trascorrere 30–60 minuti per consentire alle
tavolette di dissolversi. Agitare accuratamente i flaconi al fine di miscelarli completamente.
Fase di lavaggio
7. Preparare la quantità necessaria di tampone di lavaggio 1X (fare riferimento alla tabella) diluendo con acqua deionizzata il
tampone di lavaggio concentrato in un rapporto di 1:10. Conservare a 20–28°C. Utilizzare il tampone di lavaggio 1X entro
21 giorni dalla preparazione.
8. Capovolgere/svuotare manualmente le strisce. Aggiungere a ciascun pozzetto almeno 250 µL di tampone di lavaggio
1X e capovolgere/svuotare le strisce. Ripetere la procedura per altre tre volte, per un totale di quattro lavaggi. Asciugare
accuratamente le strisce su carta assorbente dopo l’ultimo lavaggio.
Incubazione del substrato
9. Aggiungere a ciascun pozzetto 150 µL di soluzione attiva di substrato. Dopo l’uso, gettare la rimanente soluzione di substrato attiva.
10. Incubare per 30 minuti (± 5 minuti) a 20–28°C.
23
ITALIANO

Arresto/Lettura
11. Aggiungere a ciascun pozzetto 100 µL di soluzione bloccante. Aggiungere soluzione bloccante dello stesso tipo e a intervalli di
tempo uguali all’aggiunta della soluzione di substrato.
12. Leggere la densità ottica a 405 nm. Garantire che nei pozzetti non sia presente alcuna bolla grande e che le estremità inferiori
delle strisce siano pulite. È necessario leggere le strisce entro 15 minuti dall’aggiunta della soluzione bloccante.
13. È necessario fare uso del software di quantizzazione con equazione di adattamento della curva di calibrazione quadratica
per l’analisi dei risultati del saggio Metra BAP.
Equazione: y = A + Bx + Cx 2
CONTROLLO DI QUALITÀ
Il certificato di analisi compreso in questo kit è specifico per il lotto e deve essere usato per verificare che i risultati ottenuti dal
laboratorio siano simili a quelli ottenuti da Quidel. Vengono forniti valori della densità ottica che sono da usare esclusivamente
come direttiva. È possibile che i risultati ottenuti dal laboratorio differiscano.
Vengono forniti i valori di gamma per il controllo di qualità. I valori di controllo sono destinati a verificare la validità della curva e i
risultati del campione. È necessario che ciascun laboratorio stabilisca i propri parametri per la definizione dei limiti di accettazione
del saggio. Se i valori di controllo NON sono all’interno dei limiti di accettazione del laboratorio, i risultati del saggio devono essere
considerati discutibili e si dovranno ripetere i campioni.
Se la densità ottica di Metra BAP Standard F è inferiore a 1,0, i risultati devono essere considerati discutibili e si dovranno ripetere i campioni.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
I risultati dei campioni sono espressi come U/L e non necessitano di correzione per la diluizione (a meno che il campione non
sia stato diluito prima del test).
Nel saggio Metra BAP, 1 unità rappresenta 1 µmol di pNPP idrolizzato per minuto a 25°C in un tampone di 2-amino-2-metil-1propanolo.
Curva standard rappresentativa
Livelli standard BAP: 0, 2, 20, 50, 80, 140 U/L
LIMITI DELLA PROCEDURA
Interferenza HAMA
Alcuni individui hanno anticorpi anti-anticorpo di topo (HAMA), che possono causare interferenze nei saggi immunologici che
impiegano anticorpi derivati dai topi. In particolare è stato riscontrato che i campioni di siero di pazienti che sono stati sottoposti a
terapia o a procedure diagnostiche che comprendono l’infusione di anticorpo monoclonale di topo possono fornire risultati errati.
Pertanto, per alcuni pazienti, si dovranno usare i risultati Metra BAP solo unitamente ai risultati provenienti da altre procedure
diagnostiche e con informazioni disponibili della valutazione clinica del paziente.
I campioni con elevazioni significative di attività di fosfatasi alcalina del fegato possono provocare risultati elevati in modo aberrante
nel saggio Metra BAP.
I pazienti affetti dal morbo di Paget con bassi livelli di tale malattia possono avere livelli di fosfatasi alcalina osso-specifica che
rientrano nella gamma di riferimento di Metra BAP.
RISULTATI DEL CAMPIONE
I valori di riferimento BAP sono stati stabiliti per uomini normali con oltre 25 anni di età (n = 126), donne normali in premenopausa
di età compresa fra 25 e 44 anni (n = 178) e donne normali in postmenopausa (n = 107). Per gli scopi della determinazione dei
valori di riferimento, i soggetti normali sono stati definiti come:
� fondamentalmente sani, nessun disordine delle ossa, endocrino o cronico
� con cicli mestruali regolari (donne in premenopausa)
� nessuna gravidanza o allattamento al seno (donne)
� nessuna assunzione di farmaci attualmente accertata che influenzi il metabolismo osseo
24
Densità ottica (405 nm)
3,0
2,0
1,0
0,0
0 25 50 75 100 125 150
BAP (U/L)

È possibile che i valori siano influenzati da alcuni fattori come bassa produzione di estrogeni, minore assunzione di calcio o minore
attività fisica. 8 La mancanza di estrogeni in donne in postmenopausa può causare un elevato ricambio osseo. 3,4 È necessario che
ciascun laboratorio stabilisca il proprio valore normale di riferimento. I valori vengono espressi come intervalli di riferimento non
parametrici (90% CI).
Età (Anni) Valore (U/L) Medio
Donne 25 - 44 Premenopausa 11,6 - 29,6 18,3
Donne ≥ 45 Postmenopausa 14,2 - 42,7 25,0
Uomini ≥ 25 15,0 - 41,3 23,2
CARATTERISTICHE DEL METODO
Specifiche dell’anticorpo
L’anticorpodella fosfatasi alcalina osso-specifica ha un’elevata affinità selettiva per l’isoformio della fosfatasi alcalina osso-specifica, minore
reattività crociata rispetto alla forma epatica della fosfatasi alcalina e legame irrilevante con gli isoenzimi intestinali e della placenta.
Isoenzima AP Reattività in %
Osso 100
Fegato 3 - 8
Placenta 0
Intestino 0,4
Sensibilità
Il limite di rilevamento minimo del saggio Metra BAP è di 0,7 U/L, determinato dal limite superiore di 3 DS in uno studio di
precisione a standard zero.
Recupero – Recupero dei picchi
Il recupero dei picchi è stato determinato aggiungendo una quantità nota di BAP purificata ai campioni di siero con livelli diversi di
BAP endogena. I risultati tipici vengono forniti dopo aver testato campioni di siero con concentrazioni di BAP basse, medie ed elevate
e valutandoli in triplicato.
Endogeno (U/L) Aggiunto (U/L) Osservato (U/L) Recupero (%)
13,4 15,7 29,1 99
17,6 37,5 55,3 99
27,2 57,2 88,1 106
Recupero - Linearità
La linearità è stata determinata diluendo in modo seriale i campioni e confrontando i valori osservati con i risultati attesi. I risultati
tipici vengono forniti di seguito.
Campione Fattore di diluizione Osservato (U/L) Atteso (U/L) Recupero (%)
1 non diluito 108,5 - -
1:2 51,1 54,2 94
1:4 25,8 27,1 99
1:6 18,0 18,1 99
2 non diluito 39,1 - -
1:2 20,1 19,5 103
1:4 10,3 9,8 105
1:6 6,7 6,5 103
3 non diluito 58,4 - -
1:2 29,9 29,2 102
1:4 15,7 14,6 108
1:6 9,7 9,7 100
Precisione
La precisione all’interno di una stessa corsa è stata determinata per ≥ 21 ripetizioni di 3 campioni su 3 piastre da ciascuno dei 3 lotti
di kit (9 piastre in totale). La precisione fra le corse è stata determinata dall’analisi di 3 campioni in 6 piastre separate da ciascuno dei
3 lotti di kit (18 piastre in totale). I risultati tipici vengono forniti di seguito.
BAP (U/L BAP) All’interno di una stessa corsa 1 CV% Fra le corse 2 CV%
12 5,8 5,2
35 3,9 7,6
100 5,2 5,0
1 n=21 2 n=6 corse
25
ITALIANO

Sostanze interferenti
Le seguenti sostanze sono state sottoposte a test alle concentrazioni specificate e non interferiscono con il saggio.
26
Sostanza Concentrazione
Emoglobina 500 mg/dL
Bilirubina 25 mg/dL
Trigliceridi 1420 mg/dL
Proteina totale 6,0 g/dL †
Proteina totale 15,6 g/dL†
Proteina totale 6,0 g/dL ‡
Proteina totale 15,6 g/dL‡
† Proteina con acqua
‡ Proteina con BAP (concentrazione di BAP = 43,6 U/L)
Interferenze di farmaci
Sono state aggiunte varie concentrazioni di farmaci a tre gruppi di siero separati, contenenti circa 35, 70 e 105 U/L BAP, che
sono stati analizzati in triplicato. I farmaci e le concentrazioni più elevate sottoposte a test sono state:
Sostanza Concentrazione più elevata
Etidronato 350 µg/mL
Estrogeno 100 µg/mL
Ibuprofene 150 µg/mL
Acetominofene 350 µg/mL
Aspirina 350 µg/mL
Calcitonina - umana 80 µg/mL
Calcitonina - del salmone 80 µg/mL
Calcio 500 µg/mL
Miscela di noretindrone/etinil- estradiolo (contraccettivo orale) 3 mg/mL
Vitamina D 400 IU/mL
Precisione
Sono stati eseguiti studi comparativi per valutare le correlazioni fra le misure della fosfatasi alcalina osso-specifica del siero (BAP)
ottenute usando il saggio Metra BAP rispetto ai risultati ottenuti usando i tre metodi attualmente contrassegnati per la misurazione
della fosfatasi alcalina totale (TAP) o BAP. Gli studi sono stati condotti in un sito per indagine clinica indipendente, utilizzando i sieri
di 114 pazienti con il morbo di Paget e di 464 soggetti sani. Il primo metodo comparativo è stata una tecnica colorimetrica per la
misurazione di TAP. Il coefficiente di correlazione (r) ottenuto fra tale metodo colorimetrico e il saggio Metra BAP è stato di 0,99. Il
secondo metodo comparativo è stato un metodo di elettroforesi per la determinazione dei livelli dell’isoenzima di BAP (r = 0,99).
Il terzo metodo comparativo è stato un saggio immunoradiometrico per la misurazione di BAP (r = 0,99). Dei 114 pazienti affetti
dal morbo di Paget, 101 pazienti avevano valori maggiori rispetto al limite superiore dei valori di riferimento per il saggio Metra BAP.
Tredici pazienti avevano valori inferiori rispetto al limite superiore dei valori di riferimento.
STUDI CLINICI
Uso di Metra BAP per il monitoraggio dell’efficacia della terapia anti-riassorbente nell’osteoporosi
Uno studio policentrico, randomizzato e controllato è stato condotto con successo per stabilire la sicurezza e l’efficacia del saggio
Metra BAP, al fine di monitorare i cambiamenti nelle concentrazioni di BAP nel siero associate a una terapia anti-riassorbente con
amino-bisfosfonato (alendronato). I soggetti, prelevati da uno studio più ampio sull’efficacia dell’alendronato per il trattamento
dell’osteoporosi, 7 erano donne in postmenopausa, con un’età compresa tra 45 e 84 anni (media 64 ± 7 anni), affette da osteoporosi
(basata sulla presentazione clinica o sulla densità minerale dell’osso della colonna vertebrale lombare [LSBMD] con oltre 2,5
deviazioni standard sotto la media delle donne mature in premenopausa). Al momento della partenza, i soggetti idonei sono stati
randomizzati in modo da ricevere 10 mg di alendronato e 500 mg di calcio al giorno (ALN) oppure un placebo e 500 mg di calcio al
giorno (CTL). I campioni di siero sono stati ottenuti alla partenza, a 3, 6 e 12 mesi da tutti i soggetti.
La concentrazione media di BAP alla partenza (± 1DS) (14,6 ± 5,4 in contrapposizione a 14,6 ± 4,6, p = 0,900) e quella di LSBMD
(0,74 ± 0,10 in contrapposizione a 0,75 ± 0,09, p = 0,751) erano valori simili sia per ALN che per CTL. Le distribuzioni dei valori
BAP alla partenza in ALN e CTL sono descritte nella seguente figura in proporzione rispetto alla popolazione dello studio.

Proporzione della popolazione (%)
Distribuzione dei livelli BAP alla partenza
BAP era significativamente più bassa per ALN che per CTL a 3 (9,6 ± 3,5 in contrapposizione a 13,4 ± 4,0, p

28
Proporzione della popolazione (%)
Distribuzione del cambio di percentuale nei livelli BAP dopo 12 mesi
Terapia con alendronato (ALN) o calcio (CTL)
CTL a 12 mesi
ALN a 12 mesi
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
< -70,0%
-70,0 to -60,1%
A 12 mesi, i soggetti del gruppo ALN hanno aumentato la LSBMD se confrontati con quelli del CTL (p < 0,00001) come mostrato
nella seguente tabella.
Modifiche in LSBMD (media ± DS)
-60,0 to -50,1%
-50,0 to -40,1%
-40,0 to -30,1%
n Alla partenza (g/cm 2 ) 12 mesi (g/cm 2 ) ∆ (%)
CTL 159 0,75 ± 0,09 0,74 ± 0,09 -0,6 ± 3,4
ALN 121 0,74 ± 0,10 0,79 ± 0,10 5,5 ± 4,1
Questi risultati indicano che il saggio Metra BAP è sicuro ed efficace per il monitoraggio dell’effetto anti-riassorbente della terapia
dell’amino-bisfosfonato (alendronato) fra soggetti affetti da osteoporosi.
Uso di Metra BAP per il monitoraggio della terapia ormonale anti-riassorbente e per la previsione della
risposta scheletrica (densità minerale dell’osso) in donne in postmenopausa
Terapia di monitoraggio:
Uno studio policentrico, randomizzato e controllato, è stato condotto con successo per stabilire la sicurezza e l’efficacia
del saggio Metra BAP, al fine di monitorare i cambiamenti delle concentrazioni di BAP nel siero associate a una terapia
anti-riassorbente con estrogeni/progestina. L’accresciuto ricambio osseo e la perdita significativa dell’osso sono spesso associati
alla mancanza di estrogeni in postmenopausa. La sostituzione degli estrogeni ha dimostrato di diminuire efficacemente il ricambio
dell’osso e di proteggere la massa ossea esistente. 3,6 I soggetti erano donne in postmenopausa, con un’età compresa tra 45 e 64 anni
(in media 56 ± 4 anni), che hanno subito una menopausa naturale o chirurgica negli ultimi 10 anni. Alla partenza, i soggetti idonei
sono stati randomizzati in un gruppo di trattamento attivo (HRT) con: Premarin® (0,625 mg al giorno) con progestina placebo,
Premarin® (0,625 mg al giorno) e una progestina attiva (Provera® 2,5 mg/al giorno, con continuità, Provera® 10 mg/al giorno,
ciclicamente o progesterone micronizzato 200 mg/al giorno, ciclicamente); oppure in un gruppo di controllo (CTL) con: estrogeno
placebo e progestina placebo. I campioni di siero sono stati ottenuti alla partenza e a 12 mesi da tutti i soggetti.
La concentrazione media di BAP alla partenza (± 1DS) (20,7 ± 7,6 in contrapposizione a 20,3 ± 6,8 U/L, p = 0,704) e quella di
LSBMD (0,97 ± 0,17 in contrapposizione a 0,97 ± 0,15 g/cm2 , p = 0,970) erano simili per i gruppi CTL e HRT. Le distribuzioni dei
valori BAP alla partenza in HRT e CTL sono descritte nella seguente figura in proporzione rispetto alla popolazione dello studio.
Distribuzione dei livelli BAP alla partenza
CTL
HRT
30,0%
Proporzione della popolazione (%)
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
-30,0 to -20,1%
Diminuzione del ricambio osseo Cambio in % Aumento del ricambio osseo
≤ 9,0
9,1 – 11
11,1 – 13
13,1 – 15
15,1 – 17
17,1 – 19
Diminuzione del ricambio osseo U/L BAP
Aumento del ricambio osseo
19,1 – 21
-20,0 to -10,1%
21,1 – 23
-10,0 to -0,1%
23,1 – 25
0,0 to 9,9%
25,1 – 27
10,0 to 19,9%
27,1 – 29
≥ 20,0%
> 29

BAP era significativamente più basso per HRT che per CTL a 12 mesi (13,3 ± 5,0 in contrapposizione a 21,9 ± 7,9 U/L,
p < 0,00001). Le distribuzioni dei valori di BAP dopo 12 mesi nei gruppi HRT e CTL sono descritte nella seguente figura.
Proporzione della popolazione (%)
Distribuzione dei livelli BAP dopo 12 mesi
Terapia con estrogeni/progestina (HRT) o placebo (CTL)
La concentrazione media di BAP (± 1DS) nei soggetti CTL è aumentata leggermente rispetto alla partenza al +9,8% (± 33,2%) a
12 mesi (p = 0,08), mentre le concentrazioni di BAP nei soggetti HRT è diminuita dal momento della partenza a –32,4 (± 21,5%)
a 12 mesi (p < 0,00001). I soggetti del gruppo HRT erano quelli che, più probabilmente dei soggetti CTL, dimostravano delle perdite
di BAP oltre il cambio minimo di percentuale 12 , con il 73,3% di individui HRT e il 3,4% di individui CTL, diminuendo di ≥ 25% a
12 mesi. Le distribuzioni del cambio di percentuale rispetto alla partenza nei valori BAP dopo 12 mesi nei gruppi ALN o CTL sono
descritte nella seguente figura.
Proporzione della popolazione (%)
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
≤ 9,0
9,1 – 11
11,1 – 13
Distribuzione del cambio di percentuale nei livelli BAP dopo
12 mesi terapia con alendronato (ALN) o calcio (CTL)
A 12 mesi, i soggetti del gruppo HRT hanno aumentato la LSBMD se confrontati con quelli del CTL (p 29
CTL
HRT
≥ 20,0%
29
ITALIANO

Previsione della risposta scheletrica:
La seguente figura descrive la diminuzione in % dei valori di BAP dalla partenza a 12 mesi per quartile per il gruppo trattato con
trattamento attivo HRT. I soggetti nel quartile più elevato (Q1: massima diminuzione %) hanno mostrato il massimo aumento di
LSBMD in risposta a HRT.
30
Cambio in % di LSBMD a 12 mesi (+/- SEM)
Gruppo HRT – Valori del cambio in % di BAP a 12 mesi stratificati per
quartile e corrispondente cambio in % di LSBMD a 12 mesi
La seguente figura fornisce l’analisi di regressione lineare (y = -0,060x + 0,011, r = -0,51, p < 0,001) del cambio in percentuale
dalla partenza a BAP a 12 mesi e il cambio in percentuale dalla partenza della BMD a 12 mesi per tutti i soggetti dello studio
(placebo e trattati).
Cambio di percentuale di LSBMD a 12
6
5
4
3
2
1
0
Q1 (-66,5 to -45,9) Q2 (-45,9 to -36,0)
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
-5,0%
-10,0%
Studio HRT – Regressione lineare del cambio di % di
LSBMD e BAP dalla partenza a 12 mesi
-15,0%
-60,0% -40,0% -20,0%
L’analisi della tabella di contingenza ha mostrato che una diminuzione di ≥ 25% in BAP a 12 mesi era significativamente associata
(p < 0,0001) a una risposta scheletrica positiva rispetto a HRT (aumento in BMD) a 12 mesi. Gli intervalli di confidenza binomiale
dell’85% (approssimazione di second’ordine) per la sensibilità e la specificità dell’uso di una diminuzione del 25% di BAP per la
previsione di una risposta a HRT sono:
Sensibilità = 77% (95% CI 75%, 82%); Specificità = 61% (95% CI 41%, 78%).
Questi risultati indicano che il cambio % della concentrazione di BAP può essere utilizzato per prevedere il grado di risposta
scheletrica (BMD) al trattamento di HRT.
ASSISTENZA
Per emettere un ordine oppure per ricevere assistenza tecnica, contattare un funzionario Quidel al numero verde +1 408-616-4301,
dal lunedì al venerdì, dalle 8:00 alle 17:00, ora degli stati del Pacifico. È possibile trasmettere gli ordini anche per fax al numero
+1 408-616-4310.
Per servizi al di fuori degli Stati Uniti, contattare il distributore locale.
p < 0,001
Q3 (-36,0 to -23,8) Q4 (-23,8 to 167,3)
Quartili per cambio di % in BAP a 12 mesi
y = -0,060x + 0,011
r = 0,51
p < 0,001
0,0% 20,0% 40,0% 60,0%
Cambio di percentuale di BAP a 12 mesi

GUIDE RAPIDE DES ÉTAPES DE L’ESSAI
1. Ajouter 125 µL de tampon.
2. Ajouter 20 µL de solutions étalon, solutions témoin, et échantillons ; brasser.
3. Incuber pendant 3 heures ± 10 minutes à 20 – 28 °C.
4. Laver 4 fois avec le tampon de lavage 1X.
5. Ajouter 150 µL de solution de substrat active à 20 – 28 °C.
6. Incuber pendant 30 heures ± 5 minutes à 20 – 28 °C.
7. Ajouter 100 µL de solution d’arrêt et lire la densité optique à 405 nm.
APPLICATION
L’essai immunoenzymatique de la phosphatase alcaline osseuse Metra BAP fournit une mesure quantitative de l’activité sérique
de la phosphatase alcaline d’origine osseuse et sert d’indicateur de l’activité ostéoblastique. La mesure de la phosphatase alcaline
osseuse est destinée comme aide à la :
� Prise en charge de l’ostéoporose post-ménopausique et de la maladie de Paget ;
� Surveillance des femmes ménopausées sous traitement hormonal ou traitement par bisphosphonate ;
� Prédiction de la réaction osseuse au traitement hormonal chez les femmes ménopausées.
APERÇU ET EXPLICATION
L’isoforme squelettique ou d’origine osseuse de la phosphatase alcaline est une glycoprotéine tétramérique qui se trouve à la surface
cellulaire des ostéoblastes. 1 Les ostéoblastes sont les cellules responsables de la synthèse de la nouvelle matrice osseuse et de la
minéralisation. La lumière n’a pas été complètement faite sur la fonction de la phosphatase alcaline osseuse, bien que son rôle en
matière de minéralisation osseuse ait été confirmé. 1,2,3
L’os est perpétuellement sujet à un processus métabolique appelé remaniement. 3,4 Ce dernier comprend la résorption osseuse,
induite par l’action des ostéoclastes, et un processus de formation, la formation osseuse, induite par l’action des ostéoblastes. 3,4 Le
remaniement osseux est nécessaire au maintien et à la santé de l’os et il y est étroitement associé ; cela signifie que la résorption
et la formation sont équilibrées. 3,4 Dans les cas de métabolisme osseux anormaux ce processus est dissocié et, quand la résorption
est supérieure à la formation, ceci entraîne une déminéralisation osseuse nette qui peut conduire à l’ostéoporose, 3,4 ou au tissu
osseux désordonné des lésions de la maladie de Paget. 5 La mesure de marqueurs biochimiques spécifiques de ces événements de
remaniement fournit des données analytiques concernant le degré de métabolisme osseux ou « vitesse de renouvellement ». 3,4
L’ostéoporose est une maladie métabolique des os qui se caractérise par un remaniement osseux anormal. C’est une maladie
systémique du squelette caractérisée par une masse osseuse basse et une altération de la microarchitecture du tissu osseux, à
l’origine d’une diminution de la résistance aux fractures. 6 Le type d’ostéoporose le plus fréquent est celui qui touche les femmes
ménopausées suite à la carence en œstrogènes induite par la cessation de la fonction ovarienne. 3 Le rétablissement des taux
d’œstrogènes précédant la ménopause par le traitement de substitution empêche la déminéralisation osseuse et l’ostéoporose. 3,6
Les œstrogènes et une classe de composés connus sous le nom de bisphosphonates sont des traitements inhibiteurs de la résorption
osseuse, qui peuvent être utilisés pour prévenir la déminéralisation osseuse ou traiter l’ostéoporose. 3,6,7
L’ostéoporose peut également résulter d’un volume maximal et inadéquat du tissu osseux atteint pendant les années de croissance,
d’un déséquilibre du remaniement osseux dû à l’âge, présentant un excès de résorption significatif et un certain nombre de
conditions cliniques et traitements qui induisent l’ostéopénie ou des déséquilibres du remaniement osseux. 3 Ces derniers incluent les
maladies endocriniennes telles que l’hypogonadisme, l’hyperthyroïdie, l’hyperparathyroïdisme, et l’hypercortisolisme ; l’insuffisance
rénale ; les ostéosarcomes métastatiques ; les maladies gastrointestinales liées à la nutrition et au métabolisme minéral ; les
maladies des tissus conjonctifs ; le myélome multiple ; l’immobilisation chronique, l’alcoolisme, l’usage du tabac, et le traitement
chronique à l’héparine ou aux corticostéroïdes. 3
La maladie osseuse de Paget est un trouble focal entraînant des douleurs et une déformation squelettique chez les patients souffrant
des symptômes. 5 Les lésions de la maladie de Paget sont caractérisées par une matrice osseuse d’une structure fortement anormale
résultant de taux excessifs de l’activité de remaniement. Les lésions apparaissent principalement au niveau du crâne, de la colonne
vertébrale, du bassin et des os longs, et elles peuvent entraîner des fractures et une détérioration neurologique. 5 L’étiologie de
la maladie de Paget est inconnue mais des hypothèses impliquant des facteurs génétiques et viraux sont probantes. 5 On utilise
actuellement les bisphosphonates et la calcitonine pour ramener le taux élevé d’activité biochimique à des taux normaux, ce qui
permet la restauration de la structure osseuse normale. 9
La phosphatase alcaline osseuse fournit, en tant que mesure quantitative d’un marqueur de la vitesse de renouvellement osseux,
des informations utiles sur le remaniement osseux dans le cas de l’ostéoporose et de la maladie de Paget, et sur les changements
induits par traitements inhibiteurs de la résorption osseuse sur l’évolution de la maladie. 10-12 Pour le dosage de la phosphatase
alcaline osseuse Metra BAP, on a employé une technologie à base d’anticorps pour produire des anticorps monoclonaux démontrant
la spécificité de la phosphatase alcaline osseuse. 10 La spécificité de l’anticorps monoclonal utilisée dans l’essai permet une
quantification simple, reproductible, pratique et directe de l’activité sérique de la phosphatase alcaline osseuse.
PRINCIPE DU PROCÉDÉ
La phosphatase alcaline osseuse Metra BAP est un essai immunoenzymatique sur plaque de microtitration employant un
anticorps monoclonal anti-phosphatase alcaline osseuse, lequel est enduit sur la plaque pour capturer la phosphatase alcaline
osseuse contenue dans l’échantillon. L’activité enzymatique de la phosphatase alcaline osseuse capturée est détectée à l’aide
d’un substrat pNPP.
31
FRANÇAIS

RÉACTIFS ET MATÉRIAUX FOURNIS
96 essais pour la phosphatase alcaline d’origine osseuse
L’EIA de la phosphatase alcalcaline osseuse Metra BAP contient les éléments suivants :
A Solutions étalon de Articles 4395 à 4400 de 0,3 ml chacun
B phosphatase alcaline
C osseuse A à F,
D (A = 0, B = 2, C = 20, D = 50, E = 80, F = 140 U/L de phosphatase alcaline osseuse)
E Phosphatase alcaline osseuse purifiée des cellules d’ostéosarcome SAOS-2 dans une solution tamponnée contenant du
F chlorure de magnésium, du sulfate de zinc, un agent de surface, une protéine-support, un colorant bleu, et de l’azoture de
sodium (0,05 %) comme conservateur.
L Solutions témoin à Articles 4401, 4402 de 0,3 ml chacun
H concentration
faibles/élevées
Phosphatase alcaline osseuse purifiée des cellules d’ostéosarcome SAOS-2 dans une solution tamponnée contenant du
chlorure de magnésium, du sulfate de zinc, un agent de surface, une protéine-support, un colorant bleu, et de l’azoture de
sodium (0,05 %) comme conservateur.
q Plaques enduites Article 4660 12 chacun
Anticorps monoclonal de souris anti-phosphatase alcaline osseuse de type IgG purifié, absorbé par les puits de la microplaque.
w Solution d’arrêt Article 4702 15 ml
NaOH 0,5N
e Tampon de lavage X10 Article 4703 55 ml
Détergent non-ionique dans une solution tampon contenant de l’azoture de sodium (0,05 %) comme conservateur.
r Tampon d’essai Article 4403 27 ml
Solution tamponnée contenant du chlorure de magnésium, du sulfate de zinc, un agent de surface, et de l’azoture de sodium
(0,05 %) comme conservateur.
t Substrat tampon Article 4404 3 × 10 ml
Solution de 2-amino-2-méthyl-1-propanol contenant du chlorure de magnésium HEDTA, du sulfate de zinc, et un azoture de
sodium (0,05 %) comme conservateur.
y Substrat en comprimés Article 0012 3 × 20 mg
p-Nitrophényl phosphate.
MATÉRIAUX NÉCESSAIRES NON FOURNIS
Micropipettes pour l’injection de 20 µL et 100 à 300 µL
Eléments appropriés à la mesure de 100 à 300 ml de liquide
Récipient pour dilution de tampon de lavage
Eau dé-ionisée ou distillée
Lecteur de plaque capable de mesurer la densité optique à A405 > 2,0
Un logiciel avec ajustement des courbes à étalonnage quadratique
AVERTISSEMENTS ET PRÉCAUTIONS
1. Pour diagnostic in vitro.
2. Traiter les prélèvements d’échantillons comme du matériel potentiellement nocif. Suivre les précautions standard lors de la
manipulation du contenu de ce trousseau et de tous les échantillons de patients.
3. Eliminer les récipients et leur contenu inutilisé conformément aux dispositions réglementaires du gouvernement fédéral, de
l’Etat et de la localité.
4. Utiliser les réactifs fournis intégralement avant la date de péremption indiquée sur l’étiquette de l’emballage.
5. Suivre les recommandations concernant la conservation des réactifs de l’essai.
6. Ne pas utiliser les plaques enduites si la poche est percée.
7. Tester chaque échantillon en double.
8. Le NaOH 0,5N est considéré corrosif et peut provoquer des brûlures graves. Ne pas ingérer. Eviter le contact avec la peau, les yeux
ou les vêtements. En cas de contact, laver à l’eau. En cas d’ingestion, appeler un médecin.
9. L’azoture de sodium est utilisé comme conservateur. Un contact accidentel ou une ingestion de tampons contenant de l’azoture
de sodium peut provoquer une irritation de la peau, des yeux, ou de la bouche. Utiliser les tampons uniquement à des fins
prévues et éviter le contact avec les acides. L’azoture de sodium peut réagir avec les conduites en plomb et en cuivre pour former
des azides métalliques très explosifs. Lors de la mise au rebut, rincer à grande eau pour éviter une accumulation d’azoture.
10. Le tampon de substrat contient du 2-amino-2-méthyl-1-propanol et peut causer des irritations des yeux et/ou de la peau en
cas de contact prolongé. Porter un vêtement, des gants et un appareil de protection des yeux /du visage appropriés. Les zones
ayant été en contact avec le produit doivent être rincées immédiatement à l’eau et au savon.
11. L’utilisation de pipettes multi-canaux ou de robots pippeteurs est recommandée pour assurer la distribution rapide des réactifs.
12. Pour une mesure exacte des échantillons, ajouter les échantillons et les solutions étalon avec précision. Pipetter avec soin, en
utilisant uniquement un équipement étalonné.
32

13. Diluer les échantillons supérieurs à 140 U/L dans le tampon essai et tester à nouveau. Inclure le facteur de dilution dans le calcul final.
14. Cet essai peut être effectué avec n’importe quelle méthode de lavage validée.
PRÉPARATION DES RÉACTIFS
Amener les réactifs et matériaux de l’essai à une température de 20 à 28 °C avant l’utilisation. Après avoir
enlevé les réactifs et matériaux nécessaires, remettre les éléments inutilisés à une température de 2 à 8 °C.
Plaques enduites
Retirer le support des puits de la microplaque et le nombre nécessaire de plaques enduites de la poche (Se référer au tableau de la
section PROCÉDURE DE L’ESSAI). S’assurer que la poche contenant toutes plaques inutilisées est complètement fermée.
Tampon de lavage
Préparer la quantité nécessaire de tampon de lavage 1X (voir tableau) en diluant 10X le concentré de lavage à 1/10 avec de l’eau
dé-ionisée. Conserver entre 20 et 28 °C. Utiliser le tampon de lavage 1X dans un délai de 21 jours de préparation.
Solution de substrat active
Préparer la solution de substrat active dans un délai d’une heure d’utilisation. Placer un comprimé de substrat dans chaque flacon
nécessaire de substrat tampon à température ambiante (voir tableau). Attendre 30 à 60 minutes jusqu’à dissolution du(des)
comprimé(s). Secouer le(s) flacon(s) énergiquement pour mélanger complètement. Jeter le reste de la solution de substrat active
après utilisation.
CONSERVATION
Conserver le trousseau à une température de 2 à 8 °C. Ne pas congeler. Conserver les réactifs inutilisés à une température de 2 à 8 °C.
Equilibrer les réactifs à 20 – 28 °C avant utilisation. Conserver le concentré de lavage 1X (dilué 10X) à 20 – 28 °C.
PRÉLÈVEMENT DE SPÉCIMENS ET CONSERVATION
Prélever le sérum à l’aide de la technique de ponction veineuse standard. Les spécimens doivent être prélevés sans anticoagulant
de manière à éviter l’hémolyse. Attendre que le sang coagule et séparer le sérum par centrifugation. Le sérum peut être conservé
pendant 5 jours entre 2 et 8 °C, à ≤ -40 °C pendant 12 mois, ou à ≤ -80 °C pendant 36 mois. Ne pas soumettre les échantillons à
plus de 3 cycles de congélation/décongélation.
Le sérum « hors caillot », le sérum recueilli sur tube séparateur de sérum, le plasma recueilli sur héparine Na et le plasma recueilli
sur héparine Li produisent des résultats essentiellement équivalents. Il est recommandé de ne pas préparer les échantillons de
plasma à l’aide d’agents complexants tels que l’EDTA ou le citrate.
PROCÉDÉ DU DOSAGE
Lire la notice produit dans son intégralité avant de commencer l’essai.
Voir PREPARATION DES REACTIFS avant de poursuivre.
Déterminer la quantité de chaque réactif nécessaire pour le nombre de plaques à utiliser.
Quantité de plaques 4 6 8 12
Quantité d’échantillons (testés en double) 8 16 24 40
Substrat (flacon) 1 1 2* 2*
Tampon de lavage 1X (ml) 100 150 200 300
*Lorsque plus d’un flacon ou d’une fiole est utilisé, associé les contenus et mélanger avant d’utiliser.
Incubation d’échantillon
1. Retirer le support des puits de la plaque de microtitration et le nombre nécessaire de plaques enduites de la poche (voir tableau)
avant utilisation. S’assurer que la poche en aluminium contenant toutes les plaques inutilisées est complètement fermée.
2. Placer le nombre désiré de plaques enduites dans le support des puits. Libeller les plaques pour éviter de les confondre en cas de
retrait accidentel du support des puits.
3. Ajouter 125 µL de tampon essai à chaque puits.
4. Ajouter 20 µL de solution étalon, de solution témoin ou d’échantillon à chaque puits. Ne pas mélanger au tampon essai
en pipettant à plusieurs reprises. Cette étape doit être réalisée dans un délai de 30 minutes. Brasser délicatement les
plaques pour garantir le mélange de l’échantillon et du tampon.
5. Incuber pendant 3 heures (± 10 minutes) à 20 – 28 °C.
6. Préparer la solution de substrat active dans un délai d’une heure d’utilisation. Placer un comprimé de substrat dans chaque
flacon nécessaire de substrat tampon à 20 – 28 °C (voir tableau). Attendre 30 à 60 minutes jusqu’à dissolution du(des)
comprimé(s). Secouer le(s) flacon(s) énergiquement pour mélanger complètement.
Etape du lavage
7. Préparer la quantité nécessaire de tampon de lavage 1X (voir tableau) en diluant 10X le tampon de lavage à 1/10 avec de l’eau
dé-ionisée. Conserver entre 20 et 28 °C. Utiliser le tampon de lavage 1X dans les 21 jours de préparation.
8. Inverser/vider manuellement les plaques. Ajouter au moins 250 µL de tampon de lavage 1X à chaque puits, et inverser/vider
manuellement les plaques. Répéter cette opération trois fois de plus pour arriver à un total de quatre lavages. Décanter
énergiquement les plaques à sec sur des essuie-tout après le dernier lavage.
Incubation du substrat
9. Ajouter 150 µL de solution de substrat active à chaque puits. Jeter le reste de la solution de substrat active après utilisation.
10. Incuber pendant 30 minutes (± 5 minutes) à 20 – 28 °C.
33
FRANÇAIS

Arrêt/Lecture
11. Ajouter 100 µL de solution d’arrêt à chaque puits. Ajouter la solution d’arrêt selon le même modèle et les mêmes intervalles de
temps que pour l’ajout de la solution de substrat.
12. Lire la densité optique à 405 nm. S’assurer qu’aucune grosse bulle ne soit présente dans les puits et que les fonds de plaques
soient propres. Les plaques doivent être lues dans les 15 minutes suivant l’ajout de la solution d’arrêt.
13. Un logiciel de quantification avec une équation d’ajustement des courbes à étalonnage quadratique doit être utilisé pour
analyser les résultats de la phosphatase alcaline osseuse de l’essai Metra BAP.
Équation : y = A + Bx + Cx 2
CONTRÔLE DE QUALITÉ
Le certificat d’analyse compris dans ce trousseau est spécialement conçu pour le lot et doit être utilisé pour vérifier que les résultats
obtenus par votre laboratoire sont semblables à ceux obtenus par Quidel. Les valeurs de densité optique sont fournies, et elles
doivent être utilisées comme référence uniquement. Les résultats obtenus par votre laboratoire peuvent être différents.
Les plages de contrôle de qualité sont fournies. Les valeurs de contrôle sont destinées à vérifier la validité du tracé et les résultats
de l’échantillon. Chaque laboratoire devrait établir ces propres paramètres en matière de limites d’essais acceptables. Si les valeurs
de contrôle ne sont PAS dans les limites d’acceptation de votre laboratoire, résultats de l’essai doivent être remis en question, et les
prélèvements recommencés.
Si la densité optique de la solution étalon F de phosphatase alcaline Metra BAP est inférieure à 1,0, les résultats doivent être remis en
question, et les prélèvements recommencés.
INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
Les résultats des prélèvements sont exprimés en U/L et n’ont pas besoin d’être corrigés pour la dilution (à moins que l’échantillon
n’ait été dilué avant le test).
Dans le dosage de la phosphatase alcaline osseuse Metra BAP, 1 unité représente 1 µmol de pNPP hydrolysée par minute à 25 °C
dans un tampon de 2-amino-2-méthyl-1-propanol.
Courbe de concordance représentative
Taux standard de phosphatase alcaline osseuse : 0, 2, 20, 50, 80, 140 U/L
LIMITATIONS DU PROCÉDÉ
Interférences HAMA
Certaines personnes ont des anticorps humains anti-souris (HAMA), qui peuvent provoquer des interférences dans les immunoessais
employant des anticorps dérivés de souris. Il a notamment été signalé que les prélèvements de sérum de patients ayant subit un
traitement ou des procédés de diagnostic comprenant l’infusion d’anticorps monoclonaux de souris peuvent être à l’origine de
résultats erronés. Les résultats de la phosphatase alcaline osseuse Metra BAP de tels patients doivent par conséquent être utilisés
uniquement en conjonction avec les résultats d’un autre procédé de diagnostic, et avec les informations provenant de l’évaluation
clinique du patient.
Les prélèvements présentant des élévations marquées de l’activité de la phosphatase alcaline hépatique peuvent provoquer des
résultats élevés aberrants dans le dosage de la phosphatase alcaline Metra BAP.
Les patients qui sont atteints de la maladie de Paget et présentent de faibles taux de maladie peuvent avoir des taux de phosphatase
alcaline d’origine osseuse dans la plage de référence de la phosphatase alcaline Metra BAP.
VALEURS D’ÉCHANTILLON
Les plages de référence de la phosphatase alcaline ont été établies pour des hommes normaux âgés de plus de 25 ans (n = 126),
des femmes non ménopausées normales âgées de 25 à 44 ans (n = 178), et des femmes ménopausées normales (n = 107). Dans
l’optique d’établir des plages de référence, les sujets normaux furent définis comme :
34
Densité optique (405 nm)
3,0
2,0
1,0
0,0
0 25 50 75 100 125 150
Phosphatase alcaline osseuse (U/L)

� Fondamentalement sains, sans trouble osseux, endocrinien, ou chronique
� Cycles menstruels réguliers (femmes non ménopausées)
� Pas enceinte ou allaitant (femmes)
� Ne prenant actuellement aucun médicament connu pour son influence sur le métabolisme.
Les valeurs peuvent être influencées par des facteurs tels qu’une faible production d’œstrogènes, un faible apport en calcium
ou une activité physique limitée. 8 La carence en œstrogènes chez la femme ménopausée peut entraîner une vitesse élevée de
renouvellement osseux. 3,4 Chaque laboratoire devrait établir sa propre plage de référence standard. Les plages sont exprimées en
tant qu’intervalles de référence non paramétriques (IC de 90 %).
Age (An) Plage (U/L) Moyenne
FEMMES 25 – 44 non ménopausées 11,6 – 29,6 18,3
FEMMES ≥ 45 ménopausées 14,2 – 42,7 25,0
Hommes ≥ 25 15,0 – 41,3 23,2
CARACTÉRISTIQUES DE PERFORMANCE
Spécifications anticorps
L’anticorps de la phosphatase alcaline d’origine osseuse fait preuve d’affinités spécifiques importantes pour l’isoforme de la
phosphatase alcaline d’origine osseuse, d’une réactivité croisée faible envers la forme hépatique de la phosphatase alcaline,
et d’une liaison négligeable des isoenzymes du placenta et des intestins.
Isoenzyme AP % de réactivité
Os 100
Foie 3 – 8
Placenta 0
Intestins 0,4
Sensibilité
La limite de détection minimale du dosage de la phosphatase alcaline Metra BAP, déterminée par la limite supérieure à 3 SD d’un
essai de précision utilisant zéro comme étalon, est de 0,7 U/L.
Récupération - Récupération maximale
La récupération maximale a été déterminée par l’ajout d’une quantité connue de phosphatase alcaline osseuse purifiée aux
prélèvements de sérum à différents niveaux de phosphatase alcaline osseuse d’origine endogène. Les résultats types sont fournis
après avoir surchargé les prélèvements de sérum avec des concentrations faibles, moyennes, et élevées de phosphatase alcaline
osseuse et avoir fait des essais en trois exemplaires.
Endogène (U/L) Ajouté (U/L) Observé (U/L) Récupération (%)
13,4 15,7 29,1 99
17,6 37,5 55,3 99
27,2 57,2 88,1 106
Récupération - Linéarité
La linéarité a été déterminée en diluant des échantillons en série et en comparant les valeurs observées avec les valeurs anticipées.
Des résultats types sont fournis ci-dessous.
Echantillon Facteur de dilution Observé (U/L) Anticipé (U/L) Récupération (%)
1 pur 108,5 - -
1:2 51,1 54,2 94
1:4 25,8 27,1 99
1:6 18,0 18,1 99
2 pur 39,1 - -
1:2 20,1 19,5 103
1:4 10,3 9,8 105
1:6 6,7 6,5 103
3 pur 58,4 - -
1:2 29,9 29,2 102
1:4 15,7 14,6 108
1:6 9,7 9,7 100
Précision
En cours de phase, on a déterminé la précision en testant un minimum de 21 réplicats de 3 prélèvements sur 3 plaques provenant
de chacun des 3 lots de kit (soit 9 plaques au total). Entre les phases, la précision a été établie par l’analyse de 3 prélèvements sur 6
plaques différentes provenant de chacun des 3 lots de kit (soit 18 plaques au total). Les résultats types sont fournis ci-dessous.
35
FRANÇAIS

phosphatase alcaline osseuse En cours de phase 1 CV % Entre les phases 2 CV %
(U/L de phosphatase alcaline osseuse)
12 5,8 5,2
35 3,9 7,6
100 5,2 5,0
1 n = 21 2 n = 6 phases
Substances interférantes
Les substances suivantes furent testées aux concentrations spécifiées, et se sont révélées ne pas interférer avec l’essai.
Substance Concentration
Hémoglobine 500 mg/dL
Bilirubine 25 mg/dL
Triglycérides 1420 mg/dL
Protéine totale 6,0 g/dL
Protéine totale 15,6 g/dL
Protéine totale 6,0 g/dL
Protéine totale 15,6 g/dL
† Protein with water
‡ Protéine avec phosphatase alcaline osseuse (concentration en phosphatase alcaline osseuse = 43,6 U/L)
Interférences médicamenteuses
Diverses concentrations de médicaments ont été ajoutées à trois différents pools de sérum contenant environ 35, 70, et 105 U/L de
phosphatase alcaline osseuse, testés en trois exemplaires. Les médicaments et les concentrations les plus élevées testées étaient :
Substance Concentration
la plus élevée
Etidronate 350 µg/ml
œstrogène 100 µg/ml
Ibuprofène 150 µg/ml
Acetominophène 350 µg/ml
Aspirine 350 µg/ml
Calcitonine - Humaine 80 µg/ml
Calcitonine - Saumon 80 µg/ml
Calcium 500 µg/ml
Norethindrone / mélange d’Ethynil Oestradiol (contraceptif oral) 3 mg/ml
Vitamine D 400 IU/ml
Exactitude
Des essais comparatifs ont été effectués pour évaluer les corrélations entre la mesure de la phosphatase alcaline d’origine
osseuse obtenue par le dosage de la phosphatase alcaline osseuse Metra BAP et les résultats obtenus à l’aide des trois méthodes
actuellement commercialisées pour la mesure de la phosphatase alcaline totale (PAT) ou la phosphatase alcaline osseuse. Les essais
ont été menés dans un centre de recherches clinique indépendant, à l’aide du sérum de 114 patients atteints de la maladie de Paget
et de 464 sujets sains. La première méthode comparative était une technique colorimétrique pour la mesure de la PAT. Le cœfficient
de corrélation (r) obtenu entre cette méthode colorimétrique et le dosage de la phosphatase alcaline osseuse Metra BAP était de
0,99. La deuxième méthode comparative était une méthode par électrophorèse pour la détermination des taux d’isoenzymes de la
phosphatase alcaline osseuse (r = 0,99). La troisième méthode comparative était un dosage immunoradiométrique pour la mesure
de la phosphatase alcaline osseuse (r = 0,99). Sur les 114 patients diagnostiqués atteints de la maladie de Paget, 101 patients
avaient des valeurs supérieures à la limite maximale des plages de référence du dosage de phosphatase alcaline osseuse Metra BAP.
Treize patients avaient des valeurs inférieures à la limite maximale des plages de référence.
ESSAIS CLINIQUES
Utilisation de la phosphatase alcaline osseuse Metra BAP pour la surveillance de l’efficacité du traitement
par inhibiteurs de la résorption osseuse dans le cas de l’ostéoporose
Un essai randomisé multicentrique a prouvé la fiabilité et l’efficacité du dosage de phosphatase alcaline osseuse Metra BAP en
matière de surveillance des changements de concentrations sériques de la phosphatase alcaline osseuse associée au traitement par
aminobisphosphonates, des inhibiteurs de la résorption osseuse (alendronate). Les sujets, tirés d’un essai de plus grande envergure
sur l’efficacité de l’alendronate dans le traitement de l’ostéoporose, 7 étaient des femmes ménopausées, âgées de 45 à 84 ans (en
moyenne de 64 ± 7 ans), chez lesquelles on a détecté l’ostéoporose (en se basant sur un tableau clinique ou une densité minérale
osseuse [DMO] de la colonne lombaire initiale, plus de 2,5 écarts type en dessous de la moyenne pour les femmes d’âge mûr non
ménopausées). A la ligne de base, on a randomisé les sujets admissibles, et administré, soit 10 mg d’alendronate et 500 mg de
calcium par jour (ALN), soit un placebo et 500 mg de calcium pour jour (CTL). Les échantillons de sérum furent obtenus de tous les
sujets à la ligne de base, à 3, 6 et 12 mois.
36

La moyenne (± 1 écart type) initiale de base de la concentration en phosphatase alcaline osseuse (14,6 ± 5,4 vs. 14,6 ± 4,6,
p = 0,900) et la DMO de la colonne lombaire (0,74 ± 0,10 vs. 0,75 ± 0,09, p = 0,751) avaient des valeurs d’ALN et de CTL
semblables. La répartition des valeurs de départ de la phosphatase alcaline osseuse dans l’ALN et CTL est illustrée dans le schéma
ci-après, proportionnellement avec la population étudiée.
Proportion de la population (%)
Répartition des taux de départ de la phosphatase alcaline osseuse
La phosphatase alcaline osseuse était nettement plus faible pour l’ALN que pour le CTL à 3 (9,6 ± 3,5 vs. 13,4 ± 4,0, p

38
Proportion de la population (%)
Répartition du pourcentage de changement des taux de phosphatase alcaline
osseuse après 12 mois traitement à l’alendronate (ALN) ou au calcium (CTL)
< -70,0%
-70,0 à -60,1%
A 12 mois, la DMO de la colonne lombaire des sujets du groupe ALN avait augmenté par rapport au groupe CTL (p < 0,00001),
comme l’indique le tableau suivant.
Changements en DMO de la colonne lombaire (moyenne ± écart type)
-60,0 à -50,1%
-50,0 à -40,1%
-40,0 à -30,1%
n Ligne de base (g/cm 2 ) 12 mois (g/cm 2 ) ∆ (%)
CTL 159 0,75 ± 0,09 0,74 ± 0,09 -0,6 ± 3,4
ALN 121 0,74 ± 0,10 0,79 ± 0,10 5,5 ± 4,1
Ces résultats indiquent que le dosage de phosphatase alcaline osseuse Metra BAP est fiable et efficace pour la surveillance de l’effet du
traitement par inhibiteurs de la résorption de l’aminobisphosphonate (alendronate) parmi les sujets diagnostiqués souffrant d’ostéoporose.
Utilisation de la phosphatase alcaline osseuse Metra BAP pour la surveillance du traitement hormonal par
inhibiteurs de la résorption osseuse et prédiction de la réaction osseuse (densité minérale osseuse) chez
les femmes ménopausées
Traitement de surveillance :
Un essai randomisé multicentrique a prouvé la fiabilité et l’efficacité du dosage de phosphatase alcaline osseuse Metra BAP en
matière de surveillance des changements des concentrations sériques de la phosphatase alcaline osseuse associée au traitement
par œstrogènes/progestatifs, des inhibiteurs de la résorption osseuse. L’augmentation de la vitesse de renouvellement osseux et la
déminéralisation importante sont souvent associées à la carence en œstrogènes suivant la ménopause. La substitution d’œstrogènes s’est
révélée accroître considérablement la vitesse de renouvellement osseux et protéger la masse osseuse existante. 3,6 Les sujets étaient des
femmes ménopausées, âgées de 45 à 64 ans (en moyenne de 56 ± 4 ans), qui avaient subit une ménopause naturelle ou chirurgicale au
cours des 10 dernières années. A la ligne de base, les sujets admissibles ont été randomisés, soit dans un groupe de traitement actif (THS)
: Premarin® (0,625 mg par jour) avec un progestatif placebo, Premarin® (0,625 mg par jour) et un progestatif actif (Provera® 2,5 mg/jour
en continu, Provera® 10 mg/jour en alternance, ou une progestérone micronisée 200 mg/jour en alternance) ; soit dans le groupe témoin
(CTL) : œstrogène placebo et progestatif placebo. Les échantillons sérum furent obtenus de tous les sujets à la ligne de base et à 12 mois.
La moyenne (± 1 écart type) initiale de base de la concentration en phosphatase alcaline osseuse (20,7 ± 7,6 vs. 20,3 ± 6,8, U/L
p = 0,704) et la DMO de la colonne lombaire (0,97 ± 0,17 vs. 0,97 ± 0,15 g/cm 2 , p = 0,970) étaient semblables pour ALN et
CTL. La répartition des valeurs de départ de la phosphatase alcaline osseuse dans le THS et CTL est illustrée dans le schéma suivant,
proportionnellement à la population étudiée.
Proportion de la population (%)
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
Vitesse de renouvellement
osseux décroissante
Répartition des taux de départ de la phosphatase alcaline osseuse
≤ 9,0
9,1 – 11
11,1 – 13
13,1 – 15
Vitesse de renouvellement
osseux décroissante
15,1 – 17
-30,0 à -20,1%
-20,0 à -10,1%
% de changement
17,1 – 19
19,1 – 21
21,1 – 23
Phosphatase alcaline
osseuse U/L
-10,0 à -0,1%
0,0 à 9,9%
CTL à12 mois
ALN à 12 mois
10,0 à 19,9%
≥ 20,0%
Vitesse de renouvellement
osseux croissante
23,1 – 25
25,1 – 27
27,1 – 29
CTL
THS
> 29
Vitesse de renouvellement
osseux croissante

La phosphatase alcaline osseuse était nettement inférieure pour le THS que le CTL à 12 mois (13,3 ± 5,0 vs. 21,9 ± 7,9 U/L,
p < 0,00001). La répartition des valeurs de phosphatase alcaline osseuse après 12 mois dans les groupes THS et CTL est illustrée
dans le schéma suivant.
Proportion de la population (%)
Répartition des taux de phosphatase alcaline osseuse après 12 mois
Traitement par œstrogènes/progestatifs (THS) ou placebo (CTL)
La concentration moyenne (± 1SD) en phosphatase alcaline osseuse chez les sujets sous CTL a légèrement augmenté de + 9,8 %
(± 33,2 %) par rapport à la valeur initiale de base à 12 mois (p = 0,08), alors que les concentrations chez les sujets du groupe THS
ont diminué de - 32,4 (± 21,5 %) par rapport à la ligne de base à 12 mois. Les sujets du groupe THS étaient plus susceptibles que
les sujets CTL de faire preuve de pertes en phosphatase alcaline osseuse supérieures au pourcentage de changement minimum 12 ,
avec une diminution ≥ 25 % de 73,3 %, des personnes sous THS et de 3,4 % des personnes sous CTL à 12 mois. La répartition du
pourcentage de changement des valeurs de la phosphatase alcaline osseuse par rapport à la ligne de base après 12 mois dans les
groupes THS et CTL est illustrée dans le schéma ci-après.
Répartition du pourcentage de changement des taux de phosphatase alcaline osseuse après
12 mois traitement par œstrogènes/progestatifs (THS) ou placebo (CTL)
Proportion de la population (%)
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
≤ 9,0
9,1 – 11
11,1 – 13
A 12 mois, la DMO de la colonne lombaire des sujets du groupe ALN avait augmenté par rapport au groupe CTL (p < 0,00001),
comme l’indique le tableau suivant.
Changements en DMO de la colonne lombaire (moyenne ± écart type)
13,1 – 15
Vitesse de renouvellement
osseux décroissante
< -70,0%
-70,0 à -60,1%
-60,0 à -50,1%
Vitesse de renouvellement
osseux décroissante
-50,0 à -40,1%
15,1 – 17
n Ligne de base (g/cm 2 ) 12 mois (g/cm 2 ) ∆ (%)
CTL 58 0,97 ± 0,17 0,95 ± 0,16 -1,6 ± 2,8
THS 262 0,97 ± 0,15 1,00 ± 0,15 +3,5 ± 2,8
17,1 – 19
Ces résultats indiquent que le dosage de phosphatase alcaline osseuse Metra BAP est fiable et efficace pour la surveillance de l’effet
inhibiteur de la résorption du traitement hormonal de substitution chez les femmes ménopausées.
19,1 – 21
21,1 – 23
Phosphatase alcaline
osseuse U/L
-40,0 à -30,1%
-30,0 à -20,1%
-20,0 à -10,1%
% de changement
-10,0 à -0,1%
23,1 – 25
25,1 – 27
27,1 – 29
CTL
THS
> 29
Vitesse de renouvellement
osseux croissante
0,0 à 9,9%
10,0 à 19,9%
THS
≥ 20,0% CTL
Vitesse de renouvellement
osseux croissante
39
FRANÇAIS

Prédiction de la réaction osseuse :
Le schéma ci-après illustre la diminution en % des valeurs de la phosphatase alcaline osseuse par rapport à la ligne de base à 12
mois par quartile pour le groupe traité par THS. Sujets du quartile le plus élevé (Q1 : diminution en % la plus forte) ont fait preuve
de la plus forte augmentation en DMO de la colonne lombaire en réaction au THS.
40
Groupe THS - Valeurs de % de changement de la phosphatase alcaline osseuse à 12 mois stratifiée
par % de changement quartile et correspondant de la DMO de la colonne lombaire à 12 mois
% de changement de DMO de la colonne
lombaire sur 12 mois (+/- SEM)
6
5
4
3
2
1
0
Q1 (-66,5 à -45,9) Q2 (-45,9 à -36,0)
p < 0,001
Le schéma suivant fournit une analyse de régression linéaire (y = -0,060x + 0,011, r = -0,51, p < 0,001) du pourcentage de
changement par rapport à la ligne de base à 12 mois de phosphatase alcaline osseuse et du pourcentage de changement par
rapport à la ligne de base à 12 mois de BMD pour tous les sujets de l’essai (sous placebo et traitement).
Pourcentage de changement de la DMO
de la colonne lombaire à 12 mois
Essai de THS - Régression linéaire du % de changement dans DMO de la
colonne lombaire et phosphatase alcaline osseuse, de la ligne de base à 12 mois
Le tableau d’étude de sensibilité aux hypothèses a démontré que l’augmentation de ≥ 25 % de phosphatase alcaline osseuse à
12 mois était nettement associée (p < 0,0001) à une réaction osseuse positive au THS (gain de BMD) à 12 mois. Les intervalles
de confiance binomiaux (approximation de deuxième ordre) de sensibilité et spécificité de 85 % relatifs à l’utilisation d’une
augmentation de 25 % de la phosphatase alcaline pour prédire une réaction au THS sont :
Sensibilité = 77 % (IC de 95 %, 75 %, 82 %) ; Spécificité = 61 % (IC de 95 % 41 %, 78 %).
Ces résultats indiquent que le % de changement de la concentration en phosphatase alcaline osseuse peut être utilisé pour prédire le
degré de réaction osseuse (BMD) au traitement THS.
ASSISTANCE
Pour passer une commande ou pour une assistance technique, veuillez contacter un représentant Quidel au +1 408-616-4301,
du lundi au vendredi, entre 8 h et 17 h, heure du Pacifique. Les commandes peuvent également être effectuées par télécopie au
+1 408-616-4310.
Pour des services en dehors des Etats-Unis, veuillez contacter votre distributeur local.
Q3 (-36,0 à -23,8) Q4 (-23,8 à 167,3)
Quartiles par % de changement de la phosphatase alcaline osseuse sur 12 mois
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
-5,0%
-10,0%
-15,0%
-60,0% -40,0% -20,0%
y = -0,060x + 0,011
r = 0,51
p < 0,001
0,0% 20,0% 40,0% 60,0%
Pourcentage de changement de la phosphatase
alcanine osseuse à 12 mois

GUÍA RÁPIDA DE LOS PASOS DEL ENSAYO
1. Añadir 125 µl de tampón de análisis.
2. Añadir 20 µl de patrones, controles y muestras; remover.
3. Incubar durante 3 horas ± 10 minutos a 20–28 °C.
4. Lavar 4 veces con tampón de lavado 1X.
5. Añadir 150 µl de solución de sustrato de trabajo a 20–28 °C.
6. Incubar durante 30 ± 5 minutos a 20–28 °C.
7. Añadir 100 µL de solución de parada y leer la densidad óptica a 405 nm.
USO PREVISTO
El inmunoensayo Metra BAP proporciona una medición cuantitativa de la actividad de la fosfatasa alcalina específica de los huesos
(BAP) en el suero como indicador de la actividad osteoblástica. La medición de la BAP está concebida para su uso como ayuda en:
� el tratamiento de la osteoporosis posmenopáusica y de la enfermedad de Paget;
� el control de mujeres posmenopáusicas en tratamiento hormonal o con bisfosfonatos;
� la predicción de la respuesta esquelética a la terapia hormonal en mujeres posmenopáusicas.
RESUMEN Y EXPLICACIÓN
La isoforma esquelética, o específica de los huesos, de la fosfatasa alcalina es una glucoproteína tetrámera que se encuentra en la
superficie celular de los osteoblastos. 1 Los osteoblastos son las células responsables de la síntesis de la nueva matriz ósea y de su
mineralización. La función de la BAP no se ha determinado plenamente, aunque se ha confirmado su papel en la mineralización
esquelética. 1,2,3
El hueso experimenta un proceso metabólico constante denominado remodelación. 3,4 La remodelación consiste en un proceso de
degradación, la reabsorción ósea, que está mediada por la acción de los osteoclastos, y un proceso de construcción, la formación
ósea, que está mediada por la acción de los osteoblastos. 3,4 La remodelación es necesaria para el mantenimiento y la salud general
de los huesos y es un proceso estrechamente acoplado, es decir, la reabsorción y la formación se encuentran en perfecto equilibrio. 3,4
En estados anómalos del metabolismo óseo, este proceso se desacopla y, cuando la reabsorción excede a la formación, provoca una
pérdida neta de hueso, lo cual puede inducir osteoporosis 3,4 o el tejido óseo desordenado de las lesiones pagéticas. 5 La medición
de los marcadores bioquímicos específicos de estos episodios de remodelación proporciona datos analíticos relativos a la tasa de
metabolismo óseo o “recambio”. 3,4
La osteoporosis es una enfermedad ósea metabólica caracterizada por una remodelación ósea anómala. Se trata de una
enfermedad esquelética sistémica caracterizada por una baja masa ósea y un deterioro microarquitectónico del tejido óseo, con el
consiguiente incremento de la posibilidad de experimentar fracturas. 6 El tipo más habitual de osteoporosis se produce en mujeres
posmenopáusicas como consecuencia de la deficiencia de estrógenos producida por la discontinuidad de la función ovárica. 3
El restablecimiento de los niveles de estrógenos premenopáusicos mediante terapia de reposición impide la pérdida ósea y la
osteoporosis. 3,6 Los estrógenos y una clase de compuestos conocidos como bisfosfonatos constituyen terapias de antirreabsorción
que pueden utilizarse para evitar la pérdida ósea o tratar la osteoporosis. 3,6,7
La osteoporosis también puede ser consecuencia de alcanzar una masa ósea máxima inadecuada durante los años de crecimiento,
un desequilibrio de la remodelación ósea, con un exceso neto de reabsorción, relacionado con la edad y una serie de dolencias
clínicas y terapias inductoras de pérdida ósea o desequilibrios de la remodelación ósea. 3 Entre estas últimas se cuentan
enfermedades endocrinas, como el hipogonadismo, el hipertiroidismo, el hiperparatiroidismo y el hipercorticalismo, insuficiencia
renal, cánceres con metástasis óseas; enfermedades gastrointestinales relacionadas con el metabolismo nutricional y mineral,
enfermedades del tejido conjuntivo, mieloma múltiple, inmovilización crónica, alcoholismo, tabaquismo y terapia crónica con
heparina o corticoesteroides. 3
La enfermedad ósea de Paget es un trastorno focal que provoca dolor y deformidad esquelética en pacientes sintomáticos. 5 Las
lesiones pagéticas se caracterizan por una matriz ósea con estructura muy anómala provocada por tasas excesivas de actividad de
remodelación. Las lesiones se producen principalmente en el cráneo, la columna vertebral, la pelvis y los huesos largos, y pueden
tener como consecuencia fracturas y deterioro neurológico. 5 La etiología de la enfermedad de Paget es desconocida pero las hipótesis
que suponen factores genéticos y víricos son convincentes. 5 Actualmente se utilizan bisfosfonatos y calcitonina para reducir el
elevado grado de actividad bioquímica a los niveles normales, lo que permite el restablecimiento de la estructura ósea normal. 9
Como determinación cuantitativa de un marcador de remodelación ósea, la BAP proporciona información útil sobre la remodelación
ósea en la osteoporosis y en la enfermedad de Paget, así como sobre los cambios producidos por el tratamiento antirreabsortivo
en la actividad de la enfermedad . 10-12 En el análisis Metra BAP, se empleó tecnología de anticuerpos para producir un anticuerpo
monoclonal que demostrara especificidad por la BAP. 10 La especificidad del anticuerpo monoclonal utilizado en el análisis permite
una cuantificación sencilla, cómoda, reproducible y directa de la actividad de la BAP en el suero.
PRINCIPIO DEL PROCEDIMIENTO
Metra BAP es un inmunoanálisis en formato de tira de microtítulación en el que se utiliza un anticuerpo monoclonal anti-BAP
recubierto en la tira para capturar la BAP de la muestra. La actividad enzimática de la BAP capturada se detecta con un sustrato pNPP.
41
ESPAÑOL

REACTIVOS Y MATERIALES PROPORCIONADOS
96 análisiss para fosfatasa alcalina específica de los huesos
Metra BAP EIA contiene lo siguiente:
A Patrones de BAP A - F Refs. 4395 a 4400 0,3 ml cada uno
B (A = 0, B = 2, C = 20, D = 50, E = 80, F = 140 U/L BAP)
C BAP purificada de células SAOS-2 de osteosarcoma en una solución tamponada que contiene cloruro de magnesio, sulfato de
D zinc, agente tensoactivo, proteína transportadora, colorante azul y azida sódica (0,05%) como conservante.
E
F
L Controles bajo/alto Refs. 4401, 4402 0,3 ml cada uno
H BAP purificada de células SAOS-2 de osteosarcoma en una solución tamponada que contiene cloruro de magnesio, sulfato de
zinc, agente tensoactivo, proteína transportadora, colorante azul y azida sódica (0,05%) como conservante.
q Tiras recubiertas Ref. 4660 12 cada uno
Anticuerpo anti-BAP IgG monoclonal de ratón purificado adsorbido en pocillos en tiras.
w Solución de parada Ref. 4702 15 mL
NaOH 0,5N
e Tampón de lavado 10X Ref. 4703 55 mL
Detergente no iónico en una solución tamponada que contiene azida sódica (0,05%) como conservante.
r Tampón de análisis Ref. 4403 27 mL
Solución tamponada que contiene cloruro de magnesio, sulfato de zinc, agente tensoactivo y azida sódica (0,05%) como
conservante.
t Tampón del sustrato Ref. 4404 3 x 10 mL
Solución de 2-amino-2-metil-1-propanol que contiene HEDTA, cloruro de magnesio, sulfato de zinc y azida sódica (0,05%)
como conservante.
y Pastillas de sustrato Ref. 0012 3 x 20 mg
Fosfato de p-nitrofenil.
MATERIALES NECESARIOS PERO NO PROPORCIONADOS
Micropipetas de 20 µL y 100–300 µL
Material adecuado para medir 100-300 mL de líquidos
Recipiente para dilución del tampón de lavado
Agua desionizada o destilada
Lector de placas capaz de efectuar lecturas de densidad óptica a A405 > 2,0
Software de ajuste de curva de calibración cuadrática
ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES
1. Para uso Diagnóstico in vitro.
2. Trate las muestras como material potencialmente biopeligroso. Respete las precauciones universales al manipular el contenido
de este kit y las muestras de los pacientes.
3. Deseche los recipientes y el contenido no utilizado de acuerdo con la normativa internacional, nacional y local.
4. Use los reactivos suministrados como una unidad integral antes de la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del envase.
5. Almacene los reactivos de análisis según lo indicado.
6. No emplee las tiras recubiertas si la bolsa está pinchada.
7. Analice cada muestra por duplicado.
8. El NaOH 0,5N se considera corrosivo y puede provocar quemaduras graves. No lo ingiera. Evite el contacto con la piel, los ojos y
la ropa. En caso de contacto, lave con agua. En caso de ingestión, solicite asistencia médica.
9. La azida sódica se utiliza como conservante. El contacto o la ingestión accidentales de tampones que contienen azida sódica
pueden provocar irritación en la piel, los ojos o la boca. Emplee únicamente los tampones para los fines previstos y evite
el contacto con ácidos. La azida sódica puede reaccionar con las tuberías de plomo y cobre y formar azidas metálicas muy
explosivas. Después de desecharlo, enjuague con agua abundante para evitar la acumulación de la azida.
10. El tampón de sustrato contiene 2-amino-2-metil-1-propanol y puede causar irritación en los ojos y en la piel con el contacto
prolongado. Use ropa protectora adecuada, guantes y protección ocular/facial. Las áreas que entren en contacto con el tampón
deben lavarse de inmediato con agua y jabón.
11. Diluya las muestras superiores a 140 U/L en tampón de análisis y repita la prueba. Incluya el factor de dilución en el cálculo final.
12. Se recomienda utilizar pipetas multicanal o pipeteros de repetición para garantizar una administración oportuna de los
reactivos.
13. Para una medición exacta de las muestras, añada las muestras y los patrones con precisión. Pipetee cuidadosamente utilizando
sólo equipo calibrado.
14. Este análisis puede realizarse con cualquier método de lavado homologado.
42

PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS
Ponga los reactivos y los materiales para el análisis a 20–28 °C antes de su uso. Tras retirar los reactivos y
materiales necesarios, vuelva a poner los elementos no utilizados a 2–8 °C.
Tiras recubiertas
Extraiga la estructura de pocillos en tiras y el número necesario de tiras recubiertas de la bolsa (véase la sección PROCEDIMIENTO DE
ANÁLISIS). Asegúrese de que la bolsa que contenga las tiras no utilizadas quede perfectamente sellada.
Tampón de lavado
Prepare la cantidad necesaria de tampón de lavado 1X (véase la tabla) diluyendo un concentrado 10X de tampón de lavado con
agua desionizada en una proporción 1:10. Guárdelo a 20–28 °C. Utilice el tampón de lavado 1X en las 21 días siguientes a su
preparación.
Solución sustrato de trabajo
Prepare la solución sustrato de trabajo en la hora anterior a su uso. Introduzca una pastilla de sustrato en cada frasco necesario
de tampón de sustrato a 20–28 °C (véase la tabla). Deje disolver las pastillas durante 30 y 60 minutos. Agite vigorosamente las
botellas para mezclar completamente. Deseche la solución de sustrato de trabajo restante tras su uso.
AMACENAMIENTO
Guarde el conjunto a 2–8 °C. No congele. Guarde los reactivos no utilizados a 2–8 °C. Equilibre los reactivos a 20–28 °C antes
de su uso. Guarde el tampón de lavado 1X (10X diluido) a 20–28 °C.
RECOGIDA Y ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS
Recoja el suero utilizando una técnica de venopunción normalizada. Las muestras deben recogerse sin anticoagulantes y de tal
modo que se evite la hemólisis. Deje que la sangre coagule y separe el suero mediante centrifugado. El suero puede guardarse
durante 5 días a 2–8 °C, a ≤ -40 °C durante 12 meses o a ≤ -80 °C durante 36 meses. No someta las muestras a más de 3 ciclos de
congelación/descongelación.
El suero “separado del coágulo”, el suero de las probetas separadoras de suero, el plasma con heparina sódica y el plasma con
heparina de litio producen resultados sustancialmente equivalentes. Se recomienda no preparar las muestras de plasma utilizando
quelantes como el EDTA o el citrato.
PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS
Lea todo el prospecto del producto antes de iniciar el análisis.
Vea PREPARACIÓN DE REACTIVOS antes de continuar.
Determine la cantidad necesaria de cada reactivo para el número de tiras que se vayan a utilizar.
Nº de tiras 4 6 8 12
Nº de muestras (analizadas por duplicado) 8 16 24 40
Sustrato (frasco) 1 1 2* 2*
Tampón de lavado 1X (mL) 100 150 200 300
*Cuando se vaya a utilizar más de un frasco o vial, combine el contenido y mezcle antes de usarlo.
INCUBACIÓN DE LAS MUESTRAS
1. Extraiga la estructura de pocillos de tiras y el número necesario de tiras recubiertas de la bolsa (véase la tabla) antes de usarlos.
Asegúrese de que la bolsa de papel de aluminio que contenga las tiras no utilizadas quede perfectamente sellada.
2. Introduzca el número deseado de tiras recubiertas en la estructura de pocillos en tiras. Etiquete las tiras para evitar la mezcla en
caso de extracción accidental de la estructura de pocillos.
3. Añada 125 µL de tampón de análisis a cada pocillo.
4. Añada 20 µL de patrón, control o muestra a cada pocillo. No mezcle con tampón de análisis volviendo a pipetear. Este paso
debe completarse en 30 minutos. Remueva suavemente las tiras para garantizar la mezcla de la muestra
y el tampón.
5. Incube durante 3 horas (± 10 minutos) a 20–28 °C.
6. Prepare la solución de sustrato de trabajo como máximo 1 hora antes de su uso. Introduzca una pastilla de sustrato en cada
frasco necesario de tampón de sustrato a 20–28 °C (véase la tabla). Deje disolver las pastillas durante 30 y 60 minutos. Agite
vigorosamente las botellas para mezclar completamente.
Paso de lavado
7. Prepare la cantidad necesaria de tampón de lavado 1X (véase la tabla) diluyendo de tampón de lavado 10X con agua
desionizada en una proporción 1:10. Guárdelo a 20–28 °C. Utilice el tampón de lavado 1X en las 21 días siguientes a su
preparación.
8. Invierta/vacíe manualmente las tiras. Añada como mínimo 250 µL de tampón de lavado 1X a cada pocillo e invierta/vacíe
manualmente las tiras. Repita tres veces más hasta un total de cuatro lavados. Seque vigorosamente las tiras sobre toallitas
de papel después del último lavado.
Incubación del sustrato
9. Añada 150 µL de solución sustrato de trabajo a cada pocillo. Deseche la solución de sustrato de trabajo restante tras su uso.
10. Incube durante 30 horas (± 5 minutos) a 20–28 °C.
43
ESPAÑOL

Parada/lectura
11. Añada 100 µL de solución de parada a cada pocillo. Añada solución de parada de la misma forma y en los mismos intervalos
de tiempo que en el caso de la solución sustrato.
12. Lea la densidad óptica a 405 nm. Asegúrese de que no hay burbujas grandes en los pocillos y que el fondo de las tiras está
limpia. Las tiras debe leerse en los 15 minutos siguientes a la adición de la solución de parada.
13. Debe utilizarse software de cuantificación con una ecuación de ajuste de curva de calibración cuadrática para analizar los
resultados del análisis Metra BAP.
Equación: y = A + Bx + Cx 2
CONTROL DE CALIDAD
El certificado de análisis incluido en este kit es específico de lote y ha de emplearse para verificar que los resultados obtenidos
por su laboratorio son similares a los obtenidos en Quidel. Se proporcionan los valores de densidad óptica, pero deberán utilizarse
únicamente a efectos orientativos. Los resultados obtenidos por su laboratorio pueden ser diferentes.
Se proporcionan los intervalos de control de calidad. Los valores de control están concebidos para verificar la validez de la curva y los
resultados de las muestras. Cada laboratorio debe establecer sus propios parámetros para límites de análisis aceptables. Si los valores
de control NO están dentro de los límites de aceptación de su laboratorio, los resultados del análisis deben considerarse cuestionables
y las muestras tendrán que repetirse.
Si la densidad óptica del patrón F de Metra BAP es inferior a 1,0, los resultados deberán considerarse cuestionables y habrán de
repetirse las muestras.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados de las muestras se expresan como U/L y no tienen que corregirse por dilución (a menos que la muestra se diluyera
antes del análisis).
En el análisis Metra BAP, 1 unidad representa 1 µmol de pNPP hidrolizado por minuto a 25 °C en tampón 2-amino-2-metil-1propanol.
Curva patrón representativa
Niveles de patrón de BAP: 0, 2, 20, 50, 80, 140 U/L
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
Interferencia de HAMA
Algunas personas tienen anticuerpos contra anticuerpos de ratón (HAMA), que pueden causar interferencia en los inmunoanálisis
que emplean anticuerpos procedentes de ratón. En particular, se ha publicado que muestras de suero de pacientes que han sido
sometidos a procedimientos terapéuticos o diagnósticos que incluyen la infusión de anticuerpos monoclonales de ratón pueden
producir resultados erróneos. Por consiguiente, para dichos pacientes, sólo deben utilizarse los resultados de Metra BAP junto con
los resultados de algún otro procedimiento diagnóstico y con información procedente de la evaluación clínica del paciente.
Muestras con elevaciones significativas de la actividad de la fosfatasa alcalina hepática pueden causar resultados anormalmente
elevados en el análisis Metra BAP.
Los pacientes con enfermedad de Paget que tienen niveles bajos de esta dolencia pueden presentar niveles de fosfatasa alcalina
específica de los huesos que entren dentro del intervalo de referencia de Metra BAP.
VALORES DE LA MUESTRA
Los intervalos de referencia de BAP se han establecido para varones normales mayores de 25 años (n = 126), mujeres
premenopáusicas normales con edades de 25 a 44 años (n = 178) y mujeres posmenopáusicas normales (n = 107).
A efectos de establecer los intervalos de referencia, las personas normales se definieron como:
� Básicamente sanos, sin trastornos óseos, endocrinos ni crónicos
� Ciclos menstruales regulares (mujeres premenopáusicas)
� Sin embarazo ni en período de lactancia (mujeres)
� Sin estar tomando en la actualidad ningún medicamento con influencia conocida en el metabolismo óseo.
44
Densidad óptica (405 nm)
3,0
2,0
1,0
0,0
0 25 50 75 100 125 150
BAP (U/L)

Los valores pueden verse influidos por factores como una baja producción de estrógenos, una escasa ingesta de calcio o poca
actividad física. 8 La carencia de estrógenos en mujeres posmenopáusicas puede tener provocar una elevada remodelación ósea. 3,4
Cada laboratorio deberá establecer su propio intervalo de referencia normal. Los intervalos se expresan como intervalos de referencia
no paramétricos (IC del 90%).
Edad (Años) Rango (U/L) Mediana
Mujeres 25 – 44 Premenopáusicas 11,6 – 29,6 18,3
Mujeres ≥ 45 Posmenopáusicas 14,2 – 42,7 25,0
Varones ≥ 25 15,0 – 41,3 23,2
CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO
Especificaciones del anticuerpo
El anticuerpo contra la fosfatasa alcalina específica de los huesos tiene una afinidad elevada y selectiva por la isoforma de la fosfatasa
alcalina específica de los huesos, baja reactividad cruzada con la forma hepática de la fosfatasa alcalina y una unión insignificante a
las isoenzimas intestinal y placentaria.
Isoenzima de FA % Reactividad
Ósea 100
Hepática 3 – 8
Placentaria 0
Intestinal 0,4
Sensibilidad
El límite de detección mínimo del análisis Metra BAP es de 0,7 U/L, determinado por el límite superior de 3 DE en un estudio de
precisión de patrón cero.
Recuperación - Recuperación de concentración máxima
La recuperación de las concentraciones máximas se determinó añadiendo una cantidad conocida de BAP purificada a muestras de
suero con diferentes niveles de BAP endógena. Se presentan los resultados habituales después de cromatografiar muestras séricas
con concentraciones bajas, medias y bajas de BAP y analizarlas por triplicado.
Endógena (U/L) Añadida (U/L) Observada (U/L) Recuperación (%)
13,4 15,7 29,1 99
17,6 37,5 55,3 99
27,2 57,2 88,1 106
Recuperación - Linealidad
La linealidad se determinó diluyendo en serie las muestras y comparando los valores observados con los valores esperados. A
continuación se muestran los resultados típicos.
Muestra Factor de dilución Observada (U/L) Esperado (U/L) Recuperación (%)
1 pura 108,5 - -
1:2 51,1 54,2 94
1:4 25,8 27,1 99
1:6 18,0 18,1 99
2 pura 39,1 - -
1:2 20,1 19,5 103
1:4 10,3 9,8 105
1:6 6,7 6,5 103
3 pura 58,4 - -
1:2 29,9 29,2 102
1:4 15,7 14,6 108
1:6 9,7 9,7 100
Precisión
La precisión intra-análisis se determinó analizando ≥ 21 repeticiones de 3 muestras en 3 placas de cada uno de los tres lotes del kit
(total, 9 placas). La precisión inter-análisis se determinó para 3 muestras analizadas en 6 placas independientes de cada uno de los
tres lotes del kit (18 placas en total). A continuación se muestran los resultados típicos.
BAP (U/L BAP) Intra-análisis 1 VC % Inter-análisis 2 VC %
12 5,8 5,2
35 3,9 7,6
100 5,2 5,0
1 nº = 21 2 nº = 6 análisis
45
ESPAÑOL

Sustancias que interfieren
Se analizaron las siguientes sustancias a las concentraciones especificadas, y no se observó interferencia en el análisis.
Sustancia Concentración
Hemoglobina 500 mg/dL
Bilirrubina 25 mg/dL
Triglicéridos 1.420 mg/dL
Proteínas totales 6,0 g/dL †
Proteínas totales 15,6 g/dL †
Proteínas totales 6,0 g/dL ‡
Proteínas totales 15,6 g/dL ‡
† Proteína con agua
‡ Proteína con BAP (concentración de BAP = 43,6 U/L)
Interferencias de medicamentos
Se añadieron varias concentraciones de medicamentos a tres mezclas séricas independientes que contenían aproximadamente 35,
70 y 105 U/L de BAP y se analizaron por triplicado. Los medicamentos y las concentraciones mayores analizadas fueron:
Sustancia Concentración más elevada
Etidronato 350 µg/ml
Estrógeno 100 µg/ml
Ibuprofeno 150 µg/ml
Paracetamol 350 µg/ml
Aspirina 350 µg/ml
Calcitonina - Humana 80 µg/ml
Calcitonina - Salmón 80 µg/ml
Calcio 500 µg/ml
Mezcla de noretindrona/etinilestradiol (anticonceptivo oral) 3 mg/ml
Vitamina D 400 IU/ml
Precisión
Se realizaron estudios comparativos para evaluar las correlaciones entre las determinaciones de fosfatasa alcalina específica de
los huesos (BAP) sérica obtenidas utilizando el análisis Metra BAP y los resultados obtenidos utilizando tres métodos existentes
actualmente en el mercado para medir la fosfatasa alcalina total (Total Alkaline Phosphatase - TAP) o BAP. Los estudios se efectuaron
en un centro de investigación clínica independiente utilizando suero de 114 pacientes con la enfermedad de Paget y 464 personas
sanas. El primer método comparativo fue una técnica colorimétrica para la medición de la TAP. El coeficiente de correlación (r)
obtenido entre dicho método colorimétrico y el análisis Metra BAP fue de 0,99. El segundo método comparativo fue un método
electroforético para la determinación de los niveles de isoenzimas de BAP (r = 0,99). El tercer método comparativo consistió en un
análisis inmunorradiométrico para la determinación de la BAP (r = 0,99). De los 114 pacientes diagnosticados con la enfermedad de
Paget, 101 pacientes presentaron valores superiores al límite superior de los intervalos de referencia para el análisis Metra BAP. Trece
pacientes tuvieron valores inferiores al límite superior de los intervalos de referencia.
ESTUDIOS CLÍNICOS
Uso de Metra BAP para el control de la eficacia de la terapia antirreabsortiva en la osteoporosis
Se llevó a cabo con éxito un ensayo aleatorizado, controlado y multicéntrico con objeto de establecer la seguridad y la eficacia del
análisis Metra BAP para controlar los cambios de las concentraciones séricas de BAP asociados con la terapia antirreabsortiva de
aminobisfosfonato (alendronato). Los pacientes, procedentes de un estudio más extenso para determinar la eficacia del alendronato
en el tratamiento de la osteoporosis, 7 fueron mujeres posmenopáusicas de 45 a 84 años (media de 64 ± 7 años), diagnosticadas
de osteoporosis (en función de la presentación clínica o de una densidad mineral ósea de la columna lumbar [Lumbar Spine
Bone Mineral Density - LSBMD] inicial más de 2,5 desviaciones estándar por debajo de la media para mujeres premenopáusicas
maduras). Al comienzo, se aleatorizaron las pacientes idóneas a recibir o bien 10 mg de alendronato y 500 mg de calcio al día (ALN)
o bien placebo y 500 mg de calcio al día (CTL). Se obtuvieron muestras de suero de todas las pacientes al comienzo y a los 3, 6 y
12 meses.
La concentración iniciales medias de BAP (± 1 DE) (14,6 ± 5,4 frente a 14,6 ± 4,6; p = 0,900) y la LSBMD (0,74 ± 0,10 frente
a 0,75 ± 0,09; p = 0,751) presentaron valores similares para ALN y CTL. En la siguiente figura se muestran las distribuciones de
valores iniciales de BAP con ALN y CTL por proporción de la población estudiada.
46

Proporción de población (%)
Distribución de los niveles iniciales de BAP
La BAP fue significativamente inferior para ALN que para CTL a los 3 (9,6 ± 3,5 frente a 13,4 ± 4,0; p < 0,00001), a los 6 (8,0 ± 3,0
frente a 13,2 ± 3,8; p < 0,00001) y a los 12 meses (7,8 ± 2,6 frente a 13,3 ± 3,9; p < 0,00001). En la siguiente figura se presentan
las distribuciones de los valores de BAP al cabo de 12 meses en los grupos de ALN y CTL.
Proporción de población (%)
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
40,0%
35,0%
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
< 4,0
4,0 – 5,9
6,0 – 7,9
8,0 – 9,9
10,0 – 11,9
12,0 – 13,9
Remodelación ósea decreciente U/L BAP
Remodelación ósea creciente
< 4,0
Distribución de los niveles de BAP al cabo de 12 meses
Tratamiento con alendronato (ALN) o calcio (CTL)
4,0 – 5,9
6,0 – 7,9
8,0 – 9,9
10,0 – 11,9
12,0 – 13,9
La concentración media de BAP (± 1 DE) en las pacientes tratadas con CTL descendió modestamente desde el valor inicial hasta un
-5,4% (± 19,1%) a los 12 meses (p = 0,00004), lo que puede reflejar el limitado efecto limitado ahorrador de hueso del calcio. 13
Las concentraciones medias de BAP en todas las pacientes tratadas con ALN se redujeron un 30,5 ± 24,6% a los 3 meses, un 42,8
± 17,3% a los 6 meses y un 42,2 ± 19,2% a los 12 meses. Las pacientes tratadas con ALN fueron más propensas que las tratadas
con CTL a mostrar pérdidas de BAP que sobrepasaran el cambio porcentual mínimo 14 , presentando una reducción ≥ 25% el 68,5%,
83,9% y 86,1% de las pacientes de ALN y el 9,5%, 15,9% y 9.0% de las pacientes tratadas con CTL a los 3, 6 y 12 meses. En la
siguiente figura se presentan las distribuciones del cambio porcentual respecto a los valores iniciales de BAP al cabo de 12 meses en
los grupos de ALN y CTL.
14,0 – 15,9
14,0 – 15,9
16,0 – 17,9
16,0 – 17,9
18,0 – 19,9
18,0 – 19,9
20,0 – 21,9
20,0 – 21,9
Comienzo CTL
Comienzo ALN
22,0 – 23,9
22,0 – 23,9
24,0 – 25,9
12 meses CTL
12 meses ALN
Remodelación ósea decreciente U/L BAP
Remodelación ósea creciente
24,0 – 25,9
47
ESPAÑOL

48
Proporción de población (%)
Distribución del cambio porcentual en los niveles de BAP al cabo de 12 meses
Tratamiento con alendronato (ALN) o calcio (CTL)
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
< -70,0%
-70,0 a -60,1%
A los 12 meses, las pacientes del grupo de ALN habían ganado LSBMD en comparación con las de CTL (p < 0,00001) según se
muestra en la tabla siguiente.
Cambios en la LSBMD (Media ± DE)
-60,0 a -50,1%
-50,0 a -40,1%
n Inicial (g/cm 2 ) 12 meses (g/cm 2 ) ∆ (%)
CTL 159 0,75 ± 0,09 0,74 ± 0,09 -0,6 ± 3,4
ALN 121 0,74 ± 0,10 0,79 ± 0,10 5,5 ± 4,1
-40,0 a -30,1%
Estos resultados indican que el análisis Metra BAP es seguro y eficaz para el control del efecto antirreabsortivo del tratamiento con
aminobisfosfonato (alendronato) entre las personas diagnosticadas de osteoporosis.
Uso de Metra BAP para el control del tratamiento antirreabsortivo hormonal y la previsión de la respuesta
esquelética (densidad mineral ósea) en mujeres posmenopáusicas
Control del tratamiento:
Se llevó a cabo con éxito un ensayo aleatorizado, controlado y multicéntrico con objeto de establecer la seguridad y la eficacia del
análisis Metra BAP para controlar los cambios de las concentraciones séricas de BAP asociados con la terapia antirreabsortiva con
estrógenos/progestina. El incremento de la remodelación ósea y la pérdida significativa de hueso suelen estar asociadas con una
carencia estrogénica posmenopáusica. Se ha demostrado que la reposición de estrógenos reduce con eficacia la remodelación ósea
y protege la masa ósea existente. 3,6 Las pacientes eran mujeres posmenopáusicas, con una edad de 45 a 64 años (media de 56 ± 4
años), que habían experimentado menopausia natural o quirúrgica en los últimos 10 años. Al comienzo, las pacientes idóneas fueron
aleatorizadas a uno de los siguientes grupos de tratamiento activo (HRT): Premarin® (0,625 mg diarios) con progestina placebo,
Premarin® (0,625 mg diarios) y progestina activa (Provera® 2,5 mg/día continuos, Provera® 10 mg/día cíclicos o progesterona
micronizada 200 mg/día cíclicos); o grupo de control (CTL): estrógeno placebo y progestina placebo. Se obtuvieron muestras
séricas iniciales y a los 12 meses de todas las pacientes.
La concentración inicial media de BAP (± 1 DE) (20,7 ± 7,6 frente a 20,3 ± 6,8 u/l; p = 0,704) y la LSBMD (0,97 ± 0,17 frente a
0,97 ± 0,15 g/cm2 ; p = 0,970) presentaron valores similares para CTL y HRT. En la siguiente figura se muestran las distribuciones
de los valores iniciales de BAP en el tratamiento con HRT y CTL por proporción de la población estudiada.
Distribución de los niveles iniciales de BAP
CTL
HRT
30,0%
Proporción de población (%)
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
-30,0 a -20,1%
Remodelación ósea decreciente Cambio
porcentual
Remodelación ósea creciente
≤ 9,0
9,1 – 11
11,1 – 13
13,1 – 15
15,1 – 17
17,1 – 19
19,1 – 21
-20,0 a -10,1%
21,1 – 23
-10,0 a -0,1%
23,1 – 25
0,0 a 9,9%
25,1 – 27
12 meses CTL
12 meses ALN
Remodelación ósea decreciente U/L BAP
Remodelación ósea creciente
10,0 a 19,9%
27,1 – 29
≥ 20,0%
> 29

La BAP fue significativamente inferior para la HRT que para el tratamiento con CTL a los 12 meses (13,3 ± 5,0 frente a 21,9 ±
7,9 u/l; p < 0,00001). En la siguiente figura se presentan las distribuciones de los valores de BAP al cabo de 12 meses en los grupos
de HRT y CTL.
Proporción de población (%)
Distribución de los niveles de BAP al cabo de 12 meses
Terapia con estrógeno/progestina (HRT) o placebo (CTL)
La concentración media de BAP (± 1 DE) en pacientes tratados con CTL aumentó ligeramente desde el valor inicial hasta el +9,8%
(± 33,2%) a los 12 meses (p = 0,08) mientras que las concentraciones de BAP en pacientes tratadas con HRT descendieron desde
los valores iniciales hasta -32,4 (± 21,5%) a los 12 meses (p < 0,00001). Las pacientes tratadas con HRT presentaron una mayor
tendencia que las de de CTL a mostrar pérdidas de BAP que sobrepasaran el cambio porcentual mínimo 12 ; el 73,3% de pacientes
de HRT y el 3,4% de las pacientes tratadas con CTL presentaron una reducción ≥ 25% a los 12 meses. En la siguiente figura se
presentan las distribuciones del cambio porcentual de los valores de BAP respecto al valor inicial al cabo de 12 meses en los grupos
de HRT y CTL.
Proporción de población (%)
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
≤ 9,0
9,1 – 11
11,1 – 13
Distribución del cambio porcentual en los niveles de BAP al cabo de 12 meses
Terapia con estrógeno/progestina (HRT) o placebo (CTL)
CTL
HRT
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
Al cabo de 12 meses, las pacientes tratadas con HRT habían ganado LSBMD en comparación con las de CTL (p < 0,00001),
como se muestra en la siguiente tabla.
Cambios en la LSBMD (Media ± DE)
13,1 – 15
15,1 – 17
n Inicial (g/cm 2 ) 12 meses (g/cm 2 ) ∆ (%)
CTL 58 0,97 ± 0,17 0,95 ± 0,16 -1,6 ± 2,8
HRT 262 0,97 ± 0,15 1,00 ± 0,15 +3,5 ± 2,8
Estos resultados indican que el análisis Metra BAP es seguro y eficaz para controlar el efecto antirreabsortivo de la terapia de
reposición hormonal en mujeres posmenopáusicas.
17,1 – 19
19,1 – 21
Remodelación ósea decreciente U/L BAP
Remodelación ósea creciente
< -70,0%
-70,0 a -60,1%
-60,0 a -50,1%
-50,0 a -40,1%
-40,0 a -30,1%
-30,0 a -20,1%
-20,0 a -10,1%
21,1 – 23
-10,0 a -0,1%
23,1 – 25
25,1 – 27
0,0 a 9,9%
27,1 – 29
10,0 a 19,9%
CTL
HRT
Remodelación ósea decreciente Cambio
porcentual
Remodelación ósea creciente
> 29
≥ 20,0%
49
ESPAÑOL

Previsión de la respuesta esquelética:
En la siguiente figura se describe la reducción porcentual de los valores de BAP desde el comienzo hasta los 12 meses por cuartil para
el grupo tratado con HRT. Las pacientes del cuartil más alto (C1: mayor reducción porcentual) presentaron la mayor ganancia de
LSBMD en respuesta al tratamiento con HRT.
50
Cambio porcentual de LSBMD a los 12 meses (+/- DEM)
Grupo de HRT - Valores de cambio porcentual en la BAP hasta los 12 meses estratificados por
cuartil y cambio porcentual correspondiente en la LSBMD a los 12 meses
En la siguiente figura se proporciona el análisis de regresión lineal (y = -0,060x + 0,011, r = -0,51; p < 0,001) del cambio
porcentual de la BAP desde el comienzo hasta los 12 meses y del cambio porcentual de la BMD desde el comienzo hasta los 12
meses para todas las pacientes del estudio (con placebo y tratadas).
Cambio porcentual de LSBMD a los 12 meses
6
5
4
3
2
1
0
15,0%
10,0%
C1 (-66,5 a -45,9) C2 (-45,9 a -36,0)
5,0%
0,0%
-5,0%
-10,0%
p < 0,001
Estudio de HRT - Regresión lineal del cambio porcentual en
LSBMD y BAP desde el comienzo hasta los 12 meses
El análisis mediante tablas de contingencia demostró que una reducción ≥ 25% de la BAP a los 12 meses estaba significativamente
asociada (p < 0,0001) con una respuesta esquelética positiva al HRT (ganancia de la densidad mineral ósea) a los 12 meses.
Los intervalos de confianza binómicos de un 85% (aproximación de segundo orden) para la sensibilidad y la especificidad de utilizar
una reducción del 25% en la BAP para predecir una respuesta al HRT son:
Sensibilidad = 77% (IC del 95%, 75%, 82%); Especificidad = 61% (IC del 95%, 41%, 78%).
Estos resultados indican que el cambio porcentual en la concentración de BAP puede utilizarse para predecir el grado de respuesta
esquelética (BMD) al tratamiento con HRT.
ASISTENCIA
Para realizar pedidos u obtener asistencia técnica, póngase en contacto con un representante de Quidel llamando a los teléfonos
+1 408-616-4301 de lunes a viernes entre las 8:00 a.m. y las 5:00 p.m., hora del Pacífico. También pueden efectuarse pedidos por
fax al número +1 408-616-4310.
Para servicios fuera de EE.UU., póngase en contacto con su distribuidor local.
C3 (-36,0 a -23,8) C4 (-23,8 a 167,3)
Cuartiles por cambio porcentual de BAP a los 12 meses
-15,0%
-60,0% -40,0% -20,0%
y = -0,060x + 0,011
r = 0,51
p < 0,001
0,0% 20,0% 40,0% 60,0%
Cambio porcentual de BAP a los 12 meses

GUIA DE CONSULTA RÁPIDA PARA OS PASSOS DO ENSAIO
1. Adicionar 125 µL de tampão de análise.
2. Adicionar 20 µL de padrões, controlos e amostras; agitar.
3. Incubar 3 horas ± 10 minutos à 20–28°C.
4. Lavar 4 vezes com tampão de lavagem 1X.
5. Adicionar 150 µL de solução de substrato de trabalho à 20–28°C.
6. Incubar 30 ± 5 minutos à 20–28°C.
7. Adicionar 100 µL de solução de paragem da reacção e ler a densidade óptica a 405 nm.
FINALIDADE
O imunoensaio Metra BAP proporciona uma medida quantitativa da actividade da fosfatase alcalina específica do osso (BAP)
no soro como um indicador da actividade osteoblástica. A medição da BAP destina-se a ser utilizada como auxiliar nas seguintes
situações:
� tratamento da osteoporose pós-menopausa e da doença de Paget;
� monitorização das mulheres depois da menopausa submetidas a terapêutica hormonal ou com bifosfonatos;
� previsão da resposta óssea à terapêutica hormonal nas mulheres depois da menopausa.
RESUMO E EXPLICAÇÃO
A isoforma esquelética, ou específica do osso, da fosfatase alcalina é uma glicoproteína tetramérica que se encontra na superfície das
células dos osteoblastos. 1 Os osteoblastos são as células responsáveis pela síntese da nova matriz óssea e pela sua mineralização.
A função da BAP não foi ainda completamente elucidada, embora o seu papel na mineralização óssea tenha sido confirmado. 1,2,3
O osso está constantemente sujeito a um processo metabólico designado por renovação. 3,4 Tal inclui um processo de degradação,
reabsorção óssea, mediado pela acção dos osteoclastos, e um processo de construção, formação óssea, mediado pela acção dos
osteoblastos. 3,4 A renovação é necessária para a manutenção e saúde geral do osso e está bem interligada; ou seja, a reabsorção e
a formação estão em equilíbrio. 3,4 Nos estados anormais do metabolismo ósseo este processo deixa de estar interligado e, quando
a reabsorção supera a formação, o resultado é uma perda líquida de osso que pode conduzir à osteoporose 3,4 ou a perturbações do
tecido ósseo nas lesões pagéticas. 5 A medição de marcadores bioquímicos específicos destes eventos de renovação proporciona
dados analíticos sobre a velocidade do metabolismo ósseo ou “renovação”. 3,4
A osteoporose é uma doença metabólica óssea caracterizada por uma renovação óssea anómala. É uma doença sistémica do
esqueleto caracterizada por uma baixa massa óssea e deterioração microarquitectónica do tecido ósseo, com o consequente
aumento da susceptibilidade às fracturas. 6 O tipo mais frequente de osteoporose ocorre nas mulheres após a menopausa como
resultado da deficiência de estrogénios produzida pela cessação da função dos ovários. 3 A reposição dos níveis de estrogénios
anteriores à menopausa pela terapêutica de substituição impede a perda óssea e a osteoporose. 3,6 A utilização de estrogénios e de
uma classe de compostos conhecidos como bifosfonatos constitui uma terapêutica que inibe a reabsorção e que pode ser utilizada
para impedir a perda óssea ou tratar a osteoporose. 3,6,7
A osteoporose pode também resultar do facto de não ser atingida uma massa óssea máxima durante os anos de crescimento, de
um desequilíbrio da renovação óssea relacionado com a idade, com um excesso líquido de reabsorção, e de uma série de situações
clínicas e terapêuticas que induzem a perda óssea ou desequilíbrios na renovação óssea. 3 Estas incluem doenças endócrinas como o
hipogonadismo, o hipertiroidismo, o hiperparatiroidismo e o hipercortisolismo; insuficiência renal; cancros com metástases ósseas;
doenças gastrointestinais relacionadas com a nutrição e o metabolismo dos minerais; doenças do tecido conjuntivo; mieloma
múltiplo; imobilização crónica, alcoolismo ou tabagismo; e terapêutica crónica com heparina ou corticosteróides. 3
A doença óssea de Paget é uma perturbação focal associada a dores e a deformações ósseas nos doentes sintomáticos. 5 As lesões
pagéticas caracterizam-se por uma matriz óssea de estrutura altamente anómala resultante da velocidade excessiva da actividade
de renovação. As lesões ocorrem predominantemente no crânio, na coluna, na bacia e nos ossos compridos, podendo provocar
fracturas e lesões a nível neurológico. 5 A etiologia da doença de Paget é desconhecida, mas as hipóteses que envolvem factores
genéticos e virais são convincentes. 5 Os bifosfonatos e a calcitonina são actualmente utilizados para reduzir a elevada taxa de
actividade bioquímica aos níveis normais, permitindo a reposição da estrutura óssea normal. 9
Como medida quantitativa de um marcador da renovação óssea, a BAP proporciona informações úteis sobre a renovação óssea
na osteoporose e na doença de Paget, e sobre as alterações na actividade da doença produzidas pela terapêutica que inibe a
reabsorção. 10-12 Para o ensaio Metra BAP recorreu-se a uma tecnologia de anticorpos para produzir um anticorpo monoclonal que
demonstra especificidade pela BAP. 10 A especificidade do anticorpo monoclonal utilizado no ensaio permite a quantificação simples,
conveniente, reprodutível e directa da actividade da BAP no soro.
PRINCÍPIO DO PROCEDIMENTO
O ensaio Metra BAP é um imunoensaio num formato de tira de microtitulação que utiliza um anticorpo monoclonal anti-BAP
revestido na tira para captar a BAP na amostra. A actividade enzimática da BAP captada é detectada com um substrato de pNPP.
51
PORTUGUÊS

REAGENTES E MATERIAIS FORNECIDOS
96 ensaios para fosfatase alcalina específica do osso
O kit Metra BAP EIA contém o seguinte:
A BAP Standards A - F Peças 4395 a 4400 0,3 mL cada
B (A = 0, B = 2, C = 20, D = 50, E = 80, F = 140 U/L BAP)
C BAP purificada proveniente de células SAOS-2 de osteossarcoma numa solução tamponada contendo cloreto de magnésio,
D sulfato de zinco, surfactante, proteína transportadora, corante azul e azida de sódio (0,05%) como conservante.
E
F
L Controlos inferiores/superiores Peças 4401, 4402 0,3 mL cada
H BAP purificada proveniente de células SAOS-2 de osteossarcoma numa solução tamponada contendo cloreto de magnésio,
sulfato de zinco, surfactante, proteína transportadora, corante azul e azida de sódio (0,05%) como conservante.
q Tiras revestidas Peça 4660 12 de cada
Anticorpo de IgG anti-BAP monoclonal murínico purificado absorvido em tiras de poços.
w Solução de paragem da reacção Peça 4702 15 mL
NaOH 0,5N
e Tampão de lavagem 10X Peça 4703 55 mL
Detergente não-iónico numa solução tamponada contendo azida de sódio (0,05%) como conservante.
r Tampão de análise Peça 4403 27 mL
Uma solução tamponada contendo cloreto de magnésio, sulfato de zinco, surfactante e azida de sódio (0,05%) como
conservante.
t Tampão de substrato Peça 4404 3 x 10 mL
Uma solução de 2-amino-2-metil-1-propanol contendo HEDTA, cloreto de magnésio, sulfato de zinco e azida de sódio (0,05%)
como conservante.
y Comprimidos de substrato Peça 0012 3 x 20 mg
p-nitrofenil fosfato.
MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS
Micropipetas para distribuição de 20 µL e 100 a 300 µL
Itens adequados para medição de líquidos de 100 a 300 mL
Recipiente para diluição do tampão de lavagem
Água desionizada ou destilada
Leitor de microplacas com capacidade de efectuar leituras da densidade óptica a A405 > 2,0
Software adequado a regressão da curva de calibração quadrática
ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES
1. Para diagnóstico in vitro.
2. Tratar as amostras como material que possa constituir perigo biológico. Seguir as precauções universais ao manusear o conteúdo
deste kit e quaisquer amostras dos doentes.
3. Eliminar os recipientes e o conteúdo não utilizado de acordo com os requisitos regulamentares federais, estaduais e locais.
4. Utilizar os reagentes fornecidos como uma unidade inteira antes da data de validade inscrita na etiqueta da embalagem.
5. Conservar os reagentes do ensaio conforme indicado.
6. Não utilizar as tiras revestidas se a bolsa estiver perfurada.
7. Analisar cada amostra em duplicado.
8. NaOH 0,5N é considerado corrosivo e pode provocar queimaduras graves. Não ingerir. Evitar o contacto com a pele, os olhos ou o
vestuário. Se houver contacto, lavar com água. Em caso de ingestão, consultar um médico.
9. A azida de sódio é utilizada como conservante. O contacto ou ingestão acidental de tampões contendo azida de sódio pode
provocar irritação na pele, nos olhos ou na boca. Utilizar os tampões apenas para os fins previstos e evitar o contacto com ácidos.
A azida de sódio pode reagir com as canalizações de chumbo e de cobre, formando azidas metálicas altamente explosivas.
Aquando da sua eliminação, deixe correr muita água de modo a evitar uma acumulação deste produto.
10. O tampão de substrato contém 2-amino-2-metil-1-propanol e poderá provocar irritação nos olhos e/ou pele em caso de
contacto prolongado. Utilizar vestuário de protecção, luvas e protecção ocular/facial adequados. As zonas que tenham estado
em contacto com este produto deverão ser imediatamente lavadas com água e sabão.
11. Diluir as amostras superiores a 140 U/L em tampão de análise e analisar novamente. Incluir o factor de diluição no cálculo final.
12. Para assegurar o fornecimento atempado dos reagentes, recomenda-se a utilização de pipetas multicanal ou de repetição.
13. Para uma medição precisa de amostras, adicionar as amostras e os padrões com precisão. Utilizar a pipeta com cuidado
recorrendo apenas a equipamento calibrado.
14. Este ensaio pode ser efectuado com qualquer método de lavagem validado.
52

PREPARAÇÃO DOS REAGENTES
Colocar os reagentes e os materiais destinados ao ensaio à temperatura de 20–28°C antes de os utilizar.
Depois de retirar os reagentes e materiais necessários, volte a colocar os materiais não usados à
temperatura de 2–8°C.
Tiras revestidas
Remover a armação das tiras de poços e retirar o número necessário de tiras revestidas da bolsa (ver quadro na secção
PROCEDIMENTO DE ENSAIO). Verificar se a bolsa que contém as tiras não usadas fica perfeitamente selada.
Tampão de lavagem
Preparar a quantidade necessária de tampão de lavagem 1X (ver quadro) diluindo o tampão de lavagem 10X concentrado na
proporção de 1:10 com água desionizada. Conservar a 20–28°C. Utilizar o tampão de lavagem 1X nas 21 dias seguintes à preparação.
Solução de substrato de trabalho
Preparar a solução de substrato de trabalho 1 hora antes da sua utilização. Colocar um comprimido de substrato em cada frasco
de tampão de substrato necessário à 20–28°C (ver quadro). Deixar os comprimidos dissolver durante 30 a 60 minutos. Agitar
vigorosamente os frascos para misturar completamente. Eliminar a solução de substrato de trabalho restante após a utilização.
ARMAZENAMENTO
Conservar o kit a 2–8°C. Não congelar. Conservar os reagentes não utilizados a 2–8°C. Equilibrar os reagentes até 20–28°C antes de
utilizar. Conservar o tampão de lavagem 1X (10X diluído) a 20–28°C.
COLHEITA E CONSERVAÇÃO DE AMOSTRAS
Efectuar a colheita do soro utilizando uma técnica de venipunctura padrão. As amostras devem ser colhidas sem anticoagulantes e
de forma a evitar a hemólise. Deixar o sangue coagular e separar o soro por centrifugação. O soro pode ser conservado durante 5 dias
a 2–8°C, a ≤ -40°C durante 12 meses ou a ≤ -80°C durante 36 meses. Não sujeitar as amostras a mais de 3 ciclos de congelação
e descongelação.
O soro “do coágulo”, o soro do tubo de separação do soro, o plasma de heparina Na e o plasma de heparina Li produzem resultados
substancialmente equivalentes. Recomenda-se que as amostras de plasma não sejam preparadas utilizando agentes de quelação
como o EDTA ou o citrato.
PROCEDIMENTO DE ENSAIO
Ler o folheto informativo completo antes de iniciar o ensaio.
Ver PREPARAÇÃO DOS REAGENTES antes de prosseguir.
Determine a quantidade de cada reagente necessário para o número de tiras que vão ser utilizadas.
N.º de tiras 4 6 8 12
N.º de amostras (analisadas em duplicado) 8 16 24 40
Substrato (frasco) 1 1 2* 2*
Tampão de lavagem 1X (mL) 100 150 200 300
*Quando se vai utilizar mais do que um frasco, combinar o conteúdo e misturar antes de utilizar.
Incubação da amostra
1. Remover a armação das tiras de poços e retirar o número necessário de tiras revestidas da bolsa (ver quadro) imediatamente
antes de utilizar. Verificar se a bolsa de papel de alumínio que contém as tiras não usadas fica perfeitamente selada.
2. Colocar o número pretendido de tiras revestidas na armação das tiras de poços. Rotular as tiras para evitar que se misturem em
caso de remoção acidental da armação das tiras de poços.
3. Adicionar 125 µL de tampão de análise a cada poço.
4. Adicionar 20 µL de padrão, controlo ou amostra a cada poço. Não misturar com tampão de análise por meio de pipetagem de
repetição. Este passo deverá estar concluído em 30 minutos. Agitar suavemente as tiras para assegurar a mistura
da amostra e do tampão.
5. Incubar durante 3 horas (± 10 minutos) a 20–28°C.
6. Preparar a solução de substrato de trabalho 1 hora antes da sua utilização. Colocar um comprimido de substrato em cada frasco
de tampão de substrato necessário à 20–28°C (ver quadro). Deixar os comprimidos dissolver durante 30 a 60 minutos. Agitar
vigorosamente os frascos para misturar completamente.
Passo de lavagem
7. Preparar a quantidade necessária de tampão de lavagem 1X (ver quadro) diluindo o tampão de lavagem 10X na proporção de
1:10 com água desionizada. Conservar a 20–28°C. Utilizar o tampão de lavagem 1X nas 21 dias seguintes à preparação.
8. Inverter/esvaziar manualmente as tiras. Adicionar pelo menos 250 µL de tampão de lavagem 1X a cada poço e inverter/esvaziar
manualmente as tiras. Repetir mais três vezes para um total de quatro lavagens. Secar as tiras comprimindo-as bem sobre
toalhas de papel após a última lavagem.
Incubação do substrato
9. Adicionar 150 µL de solução de substrato de trabalho a cada poço. Eliminar a solução de substrato de trabalho restante após a
utilização.
10. Incubar durante 30 minutos (± 5 minutos) a 20–28°C.
53
PORTUGUÊS

Parar/Ler
11. Adicionar 100 µL de solução de paragem a cada poço. Adicionar a solução de paragem seguindo o mesmo padrão e os mesmos
intervalos de tempo utilizados na adição da solução de substrato.
12. Ler a densidade óptica a 405 nm. Assegurar que não existem bolhas de grandes dimensões nos poços e que o fundo das tiras
está limpo. As tiras devem ser lidas 15 minutos depois da adição da solução de paragem da reacção.
13. É necessário utilizar software de quantificação com uma equação de regressão adequada a uma curva de calibração
quadrática para analisar os resultados do ensaio Metra BAP.
Equação: y = A + Bx + Cx 2
CONTROLO DE QUALIDADE
O Certificado de Análise incluído neste kit é específico do lote e deve ser utilizado para verificar se os resultados obtidos pelo seu
laboratório são semelhantes aos obtidos na Quidel Corporation. Os valores da densidade óptica são fornecidos e devem ser utilizados
apenas como linha de orientação. Os resultados obtidos pelo seu laboratório podem ser diferentes.
São fornecidos intervalos para o controlo de qualidade. Os valores de controlo destinam-se a verificar a validade da curva e os
resultados das amostras. Cada laboratório deve definir os seus próprios parâmetros para os limites aceitáveis dos ensaios. Se
os valores de controlo NÃO estiverem dentro dos limites de aceitação do seu laboratório, os resultados dos ensaios devem ser
considerados questionáveis e as amostras devem ser repetidas.
Se a densidade óptica do Metra BAP Standard F for inferior a 1,0, os resultados devem ser considerados questionáveis e as amostras
devem ser repetidas.
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
Os resultados das amostras são expressos como U/L e não necessitam de ser corrigidos para a diluição (a não ser que a amostra
tenha sido diluída antes das análises).
No ensaio Metra BAP, 1 unidade representa 1 µmol de pNPP hidrolizado por minuto a 25°C em tampão de 2-amino-2-metil-1-propanol.
Curva padrão representativa
Níveis padrão da BAP: 0, 2, 20, 50, 80, 140 U/L
LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO
Interferência da HAMA
Algumas pessoas têm anticorpos à proteína do rato (HAMA), que podem causar interferência nos imunoensaios que empregam
anticorpos derivados de ratos. Foi referido, em particular, que as amostras de soro de doentes que foram submetidos a terapêutica ou
a procedimentos de diagnóstico que incluem a perfusão de anticorpo monoclonal de rato podem produzir resultados erróneos. Por
este motivo, os resultados obtidos com o ensaio Metra BAP devem ser utilizados apenas em conjunto com os resultados de qualquer
outro procedimento de diagnóstico e com as informações disponíveis provenientes da avaliação clínica do doente.
As amostras com aumentos significativos da actividade da fosfatase alcalina hepática podem causar resultados aberrantemente
elevados no ensaio Metra BAP.
As pessoas com doença de Paget que têm baixos níveis da doença podem ter níveis de fosfatase alcalina específica do osso situados
dentro do intervalo de referência do ensaio Metra BAP.
VALORES DA AMOSTRA
Os intervalos de referência da BAP foram estabelecidos para homens normais com mais de 25 anos de idade (n = 126), mulheres
normais antes da menopausa com idades compreendidas entre os 25 e os 44 anos (n=178) e mulheres normais depois da
menopausa (n = 107). Para efeitos do estabelecimento dos intervalos de referência, os participantes normais foram definidos como:
� Basicamente saudáveis, sem distúrbios ósseos, endócrinos ou crónicos
� Ciclos menstruais regulares (mulheres antes da menopausa)
� Nem grávidas nem em fase de aleitamento (mulheres)
� Sem estarem actualmente a tomar qualquer medicação conhecida por influenciar o metabolismo ósseo
54
Densidade Óptica (405 nm)
3,0
2,0
1,0
0,0
0 25 50 75 100 125 150
BAP (U/L)

Os valores podem ser influenciados por factores como a baixa produção de estrogénio, baixa ingestão de cálcio ou actividade física
reduzida. 8 A deficiência de estrogénio nas mulheres após a menopausa pode ter como resultado uma renovação óssea aumentada. 3,4
Cada laboratório deve definir os seus próprios intervalos de referência normais. Os limites são expressos como intervalos de referência
não paramétricos (IC de 90%).
Idade (anos) Intervalos (U/L) Média
Mulheres 25 - 44 Antes da menopausa 11,6 – 29,6 18,3
Mulheres ≥ 45 Depois da menopausa 14,2 – 42,7 25,0
Homens ≥ 25 15,0 – 41,3 23,2
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO
Especificações do anticorpo
O anticorpo da fosfatase alcalina específica do osso tem uma elevada afinidade selectiva pela isoforma da fosfatase alcalina
específica do osso, uma baixa reactividade cruzada com a forma de fosfatase alcalina do fígado e uma ligação negligenciável das
isoenzimas intestinais e placentárias.
Isoenzima AP % Reactividade
Osso 100
Fígado 3 – 8
Placenta 0
Intestino 0,4
Sensibilidade
O limite de detecção mínimo do ensaio Metra BAP é 0,7 U/L, determinado pelo limite superior de 3 DP num estudo de precisão de
padrão zero.
Recuperação – Recuperação por fortificação
A recuperação por fortificação foi determinada adicionando uma quantidade conhecida de BAP purificada a amostras de soro com
diferentes níveis de BAP endógena. Os resultados típicos são fornecidos após a fortificação das amostras de soro com concentrações
baixas, médias e elevadas de BAP seguida de análise em triplicado.
Endógena (U/L) Adicionada (U/L) Observada (U/L) Recuperação (%)
13,4 15,7 29,1 99
17,6 37,5 55,3 99
27,2 57,2 88,1 106
Recuperação – Linearidade
A linearidade foi determinada diluindo amostras em série e comparando os valores observados com os valores esperados.
Os resultados típicos são apresentados a seguir.
Amostra Factor de diluição Observado (U/L) Esperado (U/L) Recuperação (%)
1 razão 108,5 - -
1:2 51,1 54,2 94
1:4 25,8 27,1 99
1:6 18,0 18,1 99
2 razão 39,1 - -
1:2 20,1 19,5 103
1:4 10,3 9,8 105
1:6 6,7 6,5 103
3 razão 58,4 - -
1:2 29,9 29,2 102
1:4 15,7 14,6 108
1:6 9,7 9,7 100
Precisão
A precisão intra ensaios e entre ensaios foi determinada analisando 3 amostras de soro em 9 ensaios. Os resultados típicos são
apresentados a seguir.
BAP (U/L BAP) Intra ensaios 1 CV% Entre ensaios 2 CV%
12 5,8 5,2
35 3,9 7,6
100 5,2 5,0
1 n=21 2 n=6 ensaios
55
PORTUGUÊS

Substâncias interferentes
As substâncias seguintes foram analisadas às concentrações especificadas, tendo sido concluído que não interferem com a análise.
Substância Concentração
Hemoglobina 500 mg/dL
Bilirrubina 25 mg/dL
Triglicéridos 1420 mg/dL
Proteína total 6,0 g/dL †
Proteína total 15,6 g/dL†
Proteína total 6,0 g/dL ‡
Proteína total 15,6 g/dL ‡
† Proteína com água
56
‡ Proteína com BAP (concentração de BAP = 43,6 U/L)
Interferências de fármacos
Foram adicionadas diversas concentrações de fármacos a três “pools” de soro separados contendo aproximadamente 35, 70 e 105
U/L de BAP e analisadas em triplicado. Os fármacos e as concentrações mais elevadas analisadas foram os seguintes:
Substância Concentração mais elevada
Etidronato 350 µg/mL
Estrogénio 100 µg/mL
Ibuprofeno 150 µg/mL
Acetominofeno 350 µg/mL
Aspirina 350 µg/mL
Calcitonina - Humana 80 µg/mL
Calcitonina - Salmão 80 µg/mL
Cálcio 500 µg/mL
Mistura de noretindrona/etinilestradiol (contraceptivo oral) 3 mg/mL
Vitamina D 400 IU/mL
Exactidão
Foram realizados estudos comparativos para avaliar as correlações entre as medições da fosfatase alcalina específica do osso (BAP)
no soro, obtidas utilizando o ensaio Metra BAP, e os resultados obtidos utilizando três métodos actualmente comercializados para
medir a fosfatase alcalina total (TAP) ou a BAP. Os estudos foram realizados num centro de investigação clínica independente,
utilizando soros de 114 doentes com doença de Paget e 464 participantes saudáveis. O primeiro método comparativo foi uma
técnica colorimétrica para a medição da TAP. O coeficiente de correlação (r) obtido entre este método colorimétrico e o ensaio Metra
BAP foi de 0,99. O segundo método comparativo foi um método de electroforese para a determinação dos níveis isoenzimáticos
de BAP (r = 0,99). O terceiro método comparativo foi um ensaio imunorradiométrico para a medição da BAP (r = 0,99). Dos 114
doentes diagnosticados com doença de Paget, 101 doentes apresentavam valores superiores ao limite superior dos intervalos de
referência do ensaio Metra BAP. Treze doentes apresentavam valores inferiores ao limite superior dos intervalos de referência.
ESTUDOS CLÍNICOS
Utilização do ensaio Metra BAP para monitorização da eficácia da terapêutica anti-reabsorção na
osteoporose
Foi realizado com sucesso um estudo randomizado multicêntrico para estabelecer a segurança e a eficácia do ensaio Metra BAP
para monitorizar as alterações nas concentrações séricas de BAP associadas à terapêutica anti-reabsorção com amino-bifosfonato
(alendronato). As participantes, retiradas de um estudo de maior dimensão sobre a eficácia do alendronato no tratamento da
osteoporose, 7 eram mulheres depois da menopausa, com idades compreendidas entre os 45 e os 84 anos (média 64 ± 7 anos),
diagnosticadas com osteoporose (com base na apresentação clínica ou na densidade mineral óssea basal na coluna lombar [LSBMD]
com mais de 2,5 desvios padrão abaixo da média para mulheres maduras antes da menopausa). Na linha basal, as participantes
elegíveis foram randomizadas para receberem 10 mg de alendronato e 500 mg de cálcio por dia (ALN) ou placebo e 500 mg de
cálcio por dia (CTL). Foram obtidas amostras de soro de todas as participantes na linha basal, aos 3, 6 e 12 meses.
A concentração média (± 1DP) de BAP na linha basal (14,6 ± 5,4 vs. 14,6 ± 4,6, p = 0,900) e LSBMD (0,74 ± 0,10 vs.
0,75 ± 0,09, p = 0,751) apresentaram valores semelhantes para o ALN e o CTL. As distribuições dos valores da BAP na linha basal
no ALN e no CTL estão ilustradas na figura seguinte, por proporção da população do estudo.

Proporção da População (%)
Distribuição dos níveis de BAP na linha basal
A BAP foi significativamente menor para o ALN do que para o CTL ao fim de 3 (9,6 ± 3,5 vs. 13,4 ± 4,0, p

58
Proporção da População (%)
Distribuição da alteração percentual dos níveis de BAP ao fim de 12 meses
Terapêutica com alendronato (ALN) ou cálcio (CTL)
< -70,0%
-70,0 to -60,1%
Ao fim de 12 meses, as participantes do ALN tinham ganho LSBMD em comparação com o CTL (p < 0,00001), conforme indicado
no quadro seguinte.
Alterações na LSBMD (média ± DP)
-60,0 to -50,1%
-50,0 to -40,1%
n Linha basal (g/cm 2 ) 12 meses (g/cm 2 ) ∆ (%)
CTL 159 0,75 ± 0,09 0,74 ± 0,09 -0,6 ± 3,4
ALN 121 0,74 ± 0,10 0,79 ± 0,10 5,5 ± 4,1
-40,0 to -30,1%
Estes resultados indicam que o ensaio Metra BAP é seguro e eficaz na monitorização do efeito anti-reabsorção da terapêutica com
amino-bifosfonato (alendronato) entre as participantes diagnosticadas com osteoporose.
Utilização do ensaio Metra BAP na monitorização da terapêutica hormonal anti-reabsorção e na previsão
da resposta óssea (densidade mineral óssea) em mulheres depois da menopausa
Terapêutica de monitorização:
Foi realizado com sucesso um estudo randomizado multicêntrico para estabelecer a segurança e a eficácia do ensaio Metra BAP para
monitorizar as alterações nas concentrações séricas de BAP associadas à terapêutica anti-reabsorção com estrogénio/progestina.
O aumento da renovação óssea e a perda significativa de osso estão frequentemente associados à deficiência de estrogénio depois
da menopausa. Foi demonstrado que a substituição do estrogénio reduz eficazmente a renovação óssea e protege a massa óssea
existente. 3,6 As participantes eram mulheres depois da menopausa, com idades compreendidas entre os 45 e os 64 anos (média
56 ± 4 anos), que tinham atingido a menopausa natural ou cirúrgica nos últimos 10 anos. Na linha basal, as participantes elegíveis
foram randomizadas para um grupo de tratamento activo (terapêutica hormonal de substituição ou THS): Premarin® (0,625 mg
por dia) com progestina placebo, Premarin® (0,625 mg por dia) e uma progestina activa (Provera® 2,5 mg/dia contínua, Provera®
10 mg/dia cíclica ou progesterona micronizada 200 mg/dia cíclica); ou para o grupo de controlo (CTL): estrogénio placebo e
progestina placebo. Foram obtidas amostras de soro de todas as participantes na linha basal e aos 12 meses.
A concentração média (± 1DP) de BAP na linha basal (20,7 ± 7,6 vs. 20,3 ± 6,8 U/L, p = 0,704) e a LSBMD (0,97 ± 0,17 vs. 0,97
± 0,15 g/cm 2 , p = 0,970) foram semelhantes para o CTL e a THS. As distribuições dos valores da BAP na linha basal na THS e no CTL
estão ilustradas na figura seguinte, por proporção da população do estudo.
Proporção da População (%)
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
-30,0 to -20,1%
Diminuição da renovação óssea % alteração Aumento da renovação óssea
≤ 9,0
9,1 – 11
-20,0 to -10,1%
-10,0 to -0,1%
Distribuição dos níveis de BAP na linha basal
11,1 – 13
13,1 – 15
15,1 – 17
17,1 – 19
19,1 – 21
21,1 – 23
23,1 – 25
0,0 to 9,9%
25,1 – 27
12 meses CTL
12 meses ALN
Diminuição da renovação óssea U/L BAP
Aumento da renovação óssea
10,0 to 19,9%
27,1 – 29
≥ 20,0%
CTL
THS
> 29

A BAP foi significativamente menor na THS do que no CTL ao fim de 12 meses (13,3 ± 5,0 vs. 21,9 ± 7,9 U/L, p < 0,00001). As
distribuições dos valores da BAP ao fim de 12 meses nos grupos de THS e de CTL estão ilustradas na figura seguinte.
Proporção da População (%)
Distribuição dos níveis de BAP ao fim de 12 meses
Terapêutica com estrogénio/progestina (THS) ou placebo (CTL)
A concentração média (± 1DP) de BAP nas participantes do CTL aumentou ligeiramente da linha basal para +9,8% (± 33,2%) aos
12 meses (p=0,08), enquanto as concentrações de BAP nas participantes da THS diminuíram da linha basal para –32,4 (± 21,5%)
aos 12 meses (p < 0,00001). As participantes da THS demonstraram maior probabilidade do que as participantes do CTL para sofrer
perdas de BAP superiores à alteração percentual mínima 12 , com 73,3% das participantes da THS e 3,4% das participantes do CTL a
diminuir em ≥ 25% ao fim do período de 12 meses. As distribuições da alteração percentual em relação à linha basal nos valores da
BAP ao fim de 12 meses nos grupos de THS e de CTL estão ilustradas na figura seguinte.
Proporção da População (%)
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
≤ 9,0
9,1 – 11
11,1 – 13
Distribuição da alteração percentual dos níveis de BAP ao fim de 12 meses
Terapêutica com estrogénio/progestina (THS) ou placebo (CTL)
Ao fim de 12 meses, as participantes da THS tinham ganho LSBMD em comparação com o CTL (p < 0,00001), conforme indicado
no quadro seguinte.
Alterações na LSBMD (média ± DP)
13,1 – 15
15,1 – 17
n Linha basal (g/cm 2 ) 12 meses (g/cm 2 ) ∆ (%)
CTL 58 0,97 ± 0,17 0,95 ± 0,16 -1,6 ± 2,8
THS 262 0,97 ± 0,15 1,00 ± 0,15 +3,5 ± 2,8
Estes resultados indicam que o ensaio Metra BAP é seguro e eficaz na monitorização do efeito anti-reabsorção da terapêutica
hormonal de substituição (THS) nas mulheres depois da menopausa.
17,1 – 19
Diminuição da renovação óssea U/L BAP Aumento da renovação óssea
< -70,0%
-70,0 to -60,1%
-60,0 to -50,1%
-50,0 to -40,1%
-40,0 to -30,1%
Previsão da resposta óssea:
A figura seguinte ilustra a % de diminuição dos valores da BAP em relação à linha basal até 12 meses por quartil para o grupo
tratado com THS. As participantes no quartil mais elevado (Q1: maior % de diminuição) revelaram o maior ganho em LSBMD em
resposta à THS.
-30,0 to -20,1%
19,1 – 21
-20,0 to -10,1%
21,1 – 23
-10,0 to -0,1%
23,1 – 25
0,0 to 9,9%
25,1 – 27
27,1 – 29
10,0 to 19,9%
CTL
THS
Diminuição da renovação óssea % Change Aumento da renovação óssea
> 29
CTL
THS
≥ 20,0%
59
PORTUGUÊS

60
Percentagem de alteração na LSBMD até 12 meses
Grupo da THS – Valores da % de alteração na BAP até 12 meses estratificados
por quartil e correspondente % de alteração na LSBMD aos 12 meses
A figura seguinte apresenta a análise de regressão linear (y = -0,060x + 0,011, r = -0,51, p < 0,001) da alteração percentual em
relação à linha basal até 12 meses da BAP e da alteração percentual em relação à linha basal até 12 meses da densidade mineral
óssea (BMD) para todas as participantes do estudo (placebo e tratadas).
Percentagem de alteração na LSBMD até 12 meses
6
5
4
3
2
1
0
Q1 (-66,5 to -45,9) Q2 (-45,9 to -36,0)
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
-5,0%
-10,0%
Estudo da THS – Regressão linear da % de alteração na
LSBMD e na BAP em relação à linha basal até 12 meses
A análise do quadro de contingência revelou que uma diminuição ≥ 25% na BAP aos 12 meses estava significativamente associada
(p < 0,0001) a uma resposta óssea positiva à THS (ganho em BMD) aos 12 meses. Os intervalos de confiança de 85% binómicos
(aproximação de segunda ordem) para a sensibilidade e a especificidade de utilizar uma diminuição de 25% na BAP para prever a
resposta à THS são:
Sensibilidade = 77% (IC de 95%, 75%, 82%); Especificidade = 61% (IC de 95%, 41%, 78%).
Estes resultados indicam que a % de alteração na concentração de BAP pode ser utilizada para prever o grau de resposta óssea
(BMD) ao tratamento com THS.
ASSISTÊNCIA
Para fazer uma encomenda ou obter assistência técnica, contacte um Representante Quidel ligando para +1 408-616-4301,
de Segunda a Sexta-feira, entre as 8:00 e as 17:00, hora do Pacífico. As encomendas podem também ser feitas por fax para
+1 408-616-4310.
Para serviços fora dos EUA, contacte o seu distribuidor local.
p < 0,001
Q3 (-36,0 to -23,8) Q4 (-23,8 to 167,3)
Quartil por % alteração na BAP até 12 meses
-15,0%
-60,0% -40,0% -20,0%
y = -0,060x + 0,011
r = 0,51
p < 0,001
0,0% 20,0% 40,0% 60,0%
Quartil por % alteração na BAP até 12 meses

HURTIG VEJLEDNING I ANALYSENS TRIN
1. Tilsæt 125 µl analysebuffer.
2. Tilsæt 20 µl standarder, kontroller og prøvesubstans; omrystes.
3. Inkubér 3 timer ± 10 minutter ved 20–28°C.
4. Vask 4 gange med 1X vaskebuffer.
5. Tilsæt 150 µl brugssubstratopløsning ved 20–28°C.
6. Inkubér 30 ± 5 minutter ved 20–28°C.
7. Tilsæt 100 µl stopopløsning og aflæs optisk densitet ved 405 nm.
TILSIGTET ANVENDELSE
Metra BAP-immunoanalysen giver en kvantitativ måling af knoglespecifik alkalisk fosfatase (BAP)-aktivitet i serum som en
indikator for osteoblastaktiviteten. Målingen af BAP er beregnet som en hjælp til:
� behandling af postklimakteriel osteoporose og Pagets sygdom;
� overvågning af postklimakterielle kvinder i hormon- eller bisfosfonatbehandling;
� forudsigelse af skeletrespons på hormonbehandling i postklimakterielle kvinder.
OPSUMMERING OG FORKLARING
Den skeletale eller knoglespecifkke isoform af alkalisk fosfatase er et tetramert glykoprotein, der findes på celleoverfladen af
osteoblaster. 1 Osteoblaster er celler, der er ansvarlige for syntetiseringen af ny knoglematrix samt mineraliseringen af denne.
Funktionen af BAP er ikke fuldt belyst, men dens rolle i knoglernes mineralisering er blevet bekræftet. 1,2,3
Knogler gennemgår konstant en metabolisk proces, der kaldes remodellering. 3,4 Denne indbefatter en nedbrydningsproces
– knogleresorption - der medieres af osteoclasternes aktivitet, og en opbygningsproces, knogledannelsen, der medieres af
aktiviteten af osteoblasterne. 3,4 Remodellering er nødvendig for knoglevedligeholdelse og opretholdelse af knoglernes generelle
sundhedstilstand, og foregår i tæt sammenkædede processer, således at resorption og knogledannelse er i balance. 3,4 I anormale
knoglemetabolismetilstande er denne proces ikke sammenkædet, og når resorptionen overskrider knogledannelsen, resulterer det
i et nettotab af knoglemasse, hvilket kan føre til osteoporose, 3,4 eller til en tilstand med ødelagt knoglevæv forårsaget af ”Pagetrelaterede”
læsioner. 5 Måling af specifikke biokemiske markører, der indgår i disse remodelleringshændelser, tilvejebringer en række
analytiske data vedr. knoglens metabolisme eller ”omsætningshastighed”. 3,4
Osteoporose er en metabolisk knoglesygdom, der er karakteriseret ved abnorm knogleremodellering. Det er en systemisk
skeletsygdom der er karakteriseret ved lav knoglemasse og mikroarkitektonisk nedbrydning af knoglevæv med en tilhørende
stigende risiko for pådragelse af fraktur. 6 Den mest almindelige form for osteoporose forekommer i postklimakterielle kvinder som
følge af den østrogenmangel, der skyldes ophøret af den ovariale funktion. 3 Gendannelsen af det præklimakterielle østrogenniveau
ved hjælp af substitutionsterapi forhindrer knoglesvind og osteoporose. 3,6 Østrogener og en stofgruppe kaldet bisfosfonater er
antiresorptive behandlinger til forebyggelse af tab af knoglemasse eller til behandling af osteoporose. 3,6,7
Osteroporose kan også skyldes, at der i opvækstårene er dannet en utilstrækkelig maksimal knoglemasse (peak bone mass)
, en alders-relateret ubalance i knoglernes remodellering med en forhøjet nettoresorption og en række kliniske tilstande og
behandlinger, som medfører knogletab eller ubalance i knoglernes remodellering. 3 Disse omfatter endokrine lidelser, f.eks.
hypogonadisme, hyperthyreoidisme, hyperparathyreoidisme, og hypercortisolisme,nyresvigt, cancer med metastaser til knoglerne,
gastrointestinale lidelser med relation til ernærings- og mineralmetabolismen, bindevævssygdomme, multipel myeloma; kronisk
immobilisering, brug af tobak eller alkohol og kronisk behandling med heparin eller binyrebarkhormoner (kortikosteroider). 3
Paget’s knoglesygdom er en fokal lidelse, der medfører smerter og knogledeformitet i symptomatiske patienter. 5 “Pagetiske”
læsioner er kendetegnet ved en knoglematrix, der har en yderst abnorm struktur som følge af en overdreven remodelleringsaktivitet.
Læsionerne ses hovedsageligt i kraniet, columna, pelvis og de lange knogler og kan medfører frakturer og neurologisk svækkelse. 5
Ætiologien for Pagets sygdom er ukendt, men hypoteser, der involverer genetiske og virale faktorer er overbevisende. 5 Bisfosfonater
og kalcitonin anvendes for øjeblikket til at undertrykke det høje biokemiske aktivitetsniveau til et mere normalt niveau, hvilket
muliggør gendannelse af normal knoglestruktur. 9
Som en kvantitativ måling af en markør for knoglemassens omsætning, giver BAP nyttige oplysninger om knogleremodellering
ved osteoporose og Pagets sygdom og ændringer i sygdomsforløbet ved antiresorptiv behandling. 10-12 Til Metra BAP-analysen
er der anvendt antistofteknologi for at producere et monoklonalt antistof, der udviser specificitet over for BAP. 10 Specificiteten for
det monoklonale antistof, der anvendes i analysen, muliggør en enkel, hensigtsmæssig, reproducérbar og direkte kvantificering af
BAP-aktiviteten i serum.
PROCEDURENS PRINCIP
Metra-BAP er et immunoassay i mikrotiter-stripformat, der anvender et monoklonalt anti-BAP antistof coated på strippen til
opsamling af BAP i prøven. Enzymaktiviteten på den opsamlede BAP bestemmes ved hjælp af et pNPP-substrat.
61
DANSK

LEVEREDE MATERIALER OG REAGENSER
96 analyser til knoglespecifik alkalisk fosfatase
Metra-BAP EIA indeholder følgende:
A BAP standarder A - F Dele 4395 til 4400 0,3 ml hver
B (A = 0, B = 2, C = 20, D = 50, E = 80, F = 140 U/L BAP)
C BAP, der er oprenset fra osteosarkom SAOS-2-celler i en bufferopløsning indeholdende magnesiumklorid, zinksulfat,
D overfladeaktivt stof, transportprotein, blå farve og natriumazid (0,05%) som konserveringsmiddel.
E
F
L Lave/høje kontroller Delen 4401, 4402 0,3 ml hver
H BAP, der er oprenset fra osteosarkom SAOS-2-celler i en bufferopløsning indeholdende magnesiumklorid, zinksulfat,
overfladeaktivt stof, transportprotein, blå farve og natriumazid (0,05%) som konserveringsmiddel.
q Coatede strips Del 4660 12 af hver
Renset murin-monoklonalt Anti-BAP IgG antistof adsorberet på brøndstrips.
w Stopopløsning Del 4702 15 ml
0,5N NaOH
e 10X vaskebuffer Del 4703 55 ml
Nonionisk detergent i en bufferopløsning indeholdende natriumazid (0,05%) som konserveringsmiddel.
r Analysebuffer Del 4403 27 ml
En bufferopløsning indeholdende magnesiumklorid, zinksulfat, overfladeaktivt stof og natriumazid (0,05%) som
konserveringsmiddel.
t Substratbuffer Del 4404 3 x 10 ml
En 2-amino-2-methyl-1-propanolopløsning indeholdende HEDTA, magnesiumklorid, zinksulfat og natriumazid
(0,05%) som konserveringsmiddel.
y Substrattabletter Del 0012 3 x 20 mg
p-Nitrophenylphosphat.
NØDVENDIGE, MEN IKKE MEDLEVEREDE MATERIALER
Mikropipetter til levering af 20 µl og 100–300 µl
Egnede enheder til væskemåling af 100–300 ml
Beholder til vaskebufferfortynding
Ionbyttet eller destilleret vand
Pladelæser til optiske densitetsaflæsninger ved A405 > 2,0
Kurvetilpasningssoftware til kvadratisk kalibrering
ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER
1. Kun til In Vitro diagnostisk brug.
2. Prøverne skal behandles som potentielt biologisk farligt materiale. Følg gældende retningslinier for omgang med biologisk
risikomateriale ved håndtering af dette kit og alle patientprøver.
3. Beholdere og ikke anvendt indhold bortskaffes i overensstemmelse med nationale, regionale og lokale bestemmelser.
4. Brug de leverede reagenser som en integreret enhed, inden udløbsdatoen på pakningens etiket.
5. Opbevar analysereagenserne, som anvist.
6. Brug ikke coatede strips, hvis posen er punkteret.
7. Test hver prøve i to eksemplarer.
8. 0,5N NaOH anses for at være ætsende og kan medføre alvorlige forbrændinger. Må ikke indtages. Undgå kontakt med hud, øjne
og tøj. Hvis der sker kontakt, skylles med vand. Ved indtagelse tilkaldes læge.
9. Natriumazid anvendes som konserveringsmiddel. Tilfældig kontakt med eller indtagelse af buffer indeholdende natriumazid,
kan medføre irritation af hud, øjne eller mund. Brug kun bufferne til det tilsigtede formål, og undgå kontakt med syrer.
Natriumazid kan reagere med bly- og kobberinstallationer og danne højeksplosive metalazider. Efter bortskaffelse skylles med
rigeligt vand for at undgå azidophobning.
10. Substratbufferen indeholder 2-amino-2-methyl-1-propanol og kan forårsage irritation af øjne og/eller hud ved kontakt i længere
tidsrum. Brug egnet beskyttelsestøj, handsker og øjen-/ansigtsværn. Berørte områder skal omgående vaskes med vand og sæbe.
11. Brug af pipetter med flere kanaler eller repeat-pipetter anbefales for at sikre en rettidig tilsætning af reagenser.
12. Tilsæt prøver og standarder præcist for at sikre en nøjagtig prøveudmåling. Foretag omhyggelig afpipettering og kun ved hjælp
af kalibreret udstyr.
13. Fortynd prøver større end 140 U/L i analysebuffer, og test igen. Inkludér fortyndingsfaktoren i den endelige beregning.
14. Denne analyse kan udføres med enhver valideret vaskemetode.
62

KLARGØRING AF REAGENS
Reagenser og materialer til analysen skal bringes op på en temperatur på 20–28°C inden brug. Når de
nødvendige reagenser og materialer er taget ud, skal ubrugte materialer bringes tilbage på 2–8°C.
Coatede strips
Fjern brøndstripholderen, og tag det nødvendige antal coatede strips ud af posen (se tabellen i afsnittet ANALYSEPROCEDUREN).
Forvis dig om, at posen, der indeholder evt. ubrugte strips, lukkes fuldstændigt igen.
Vaskebuffer
Forbered den nødvendige mængde 1X vaskebuffer (se tabel) ved at fortynde 10X vaskebufferkoncentrat 1:10 med ionbyttet vand.
Opbevar ved 20–28°C. Brug 1X vaskebuffer inden for 21 dage efter forberedelse.
Brugssubstratopløsning
Forbered en substratopløsning inden før en time for brugen. Tilsæt en substrattablet i hver flaske med substratbuffer, der har
20–28°C (se tabel). Lad tabletten (erne) opløses i 30–60 minutter. Ryst flasken (erne) kraftigt for at sikre fuldstændig opblanding.
Kassér den resterende substratopløsning efter brug.
OPBEVARING
Opbevar kittet ved 2–8°C. Må ikke fryses. Opbevar ubrugte reagenser ved 2–8°C. Afbalancér reagenserne til 20–28°C inden brug.
Opbevar 1X vaskebuffer (10X fortyndet) ved 20–28°C.
PRØVEUDTAGNING- OG OPBEVARING
Udtag serum ved hjælp af standardteknik for venepunktur. Prøverne skal udtages uden antikoagulanter og på en sådan måde, at
hæmolyse undgås. Lad blodet størkne, og udskil serum ved centrifugering. Serum kan opbevares i 5 dage ved 2–8°C, ved ≤ -40°C i
12 måneder eller ved ≤ -80°C i 36 måneder. Udsæt ikke prøver for mere end 3 fryse/optøningscykler.
Serum der er “�ernet fra clottet”, serum fra serumseparationsrør, Na-heparinplasma og Li-heparinplasma medfører stort set identiske
resultater. Det anbefales, at plasmaprøver ikke præpareres ved brug af kelater, f.eks. EDTA eller citrat.
ANALYSEPROCEDUREN
Læs hele indlægssedlen inden analysen startes.
Se KLARGØRING AF REAGENS, inden du fortsætter.
Bestem hvor meget reagens der skal anvendes til det antal strips, der skal anvendes.
antal strips 4 6 8 12
antal prøver (testet i to eksemplarer) 8 16 24 40
Substrat (flaske) 1 1 2* 2*
1X vaskebuffer (ml) 100 150 200 300
*Når der skal bruges mere end en flaske eller et hætteglas, skal indholdet kombineres og blandes inden brug.
Inkubation af prøver
1. Fjern brøndstrip-holderen, og udtag det nødvendige antal coatede strips fra posen (se tabellen) umiddelbart inden brug.
Sørg for, at folieposen indeholdende ubrugte strips lukkes fuldstændigt igen.
2. Anbring det ønskede antal coatede strips i brøndstrip-holderen. Navngiv stripsene for at forhindre en sammenblanding i
tilfælde af, at de utilsigtet �ernes fra brøndstrip-holderen.
3. Tilsæt 125 µl analysebuffer til hver prøve.
4. Tilsæt 20 µl standard, kontrol eller prøve i hver brønd. Bland ikke med analysebuffer ved gentagen pipettering. Dette trin skal
afsluttes inden for 30 minutter. Ryst forsigtigt stripsene for at sikre blanding af buffer og prøver.
5. Inkubér i 3 timer ( ± 10 minutter) ved 20–28°C.
6. Forbered en brugssubstratopløsning inden før en time for brugen. Tilsæt en substrattablet i hver flaske med substratbuffer, der
har 20–28°C (se tabel). Lad tabletten (-erne) opløses i 30–60 minutter. Ryst flasken (-erne) kraftigt for at sikre fuldstændig
opblanding.
Vasketrin
7. Forbered den nødvendige mængde 1X vaskebuffer (se tabel) ved at fortynde 10X vaskebuffer 1:10 med ionbyttet vand.
Opbevar ved 20–28°C. Brug 1X vaskebuffer inden for 21 dage efter præparering.
8. Vend op og ned/tøm stripsene manuelt. Tilsæt mindst 250 µl 1X vaskebuffer i hver brønd og vend op og ned/tøm stripsene
manuelt. Gentag tre gange mere, så vaskeproceduren foretages fire gange i alt. Tør stripsene grundigt med papirservietter efter
den sidste vask.
Substratinkubation
9. Tilføj 150 µl brugssubstratopløsning i hver brønd. Kassér den resterende substratopløsning efter brug.
10. Inkubér i 30 minutter ( ± 5 minutter) ved 20–28°C.
Stop/aflæs
11. Tilsæt 100 µl stopopløsning i hver brønd. Tilsæt stopopløsning efter det samme mønster og tidsinterval som ved tilsætning af
substratopløsning.
12. Aflæs den optiske densitet ved 405 nm. Sørg for, at der ikke findes store bobler i brøndene, og at stripsene er rene. Stripsene skal
aflæses inden for 15 minutter efter tilsætning af stopopløsningen.
63
DANSK

13. Kvantificeringssoftware med en ligning for kurvetilpasning ved kvadratisk kalibrering skal anvendes til analysering af
resultaterne for Metra BAP-analysen.
Ligning: y = A + Bx + Cx 2
KVALITETSKONTROL
Analysecertifikatet i dette kit er lotspecifikt og skal anvendes til at bekræfte, at resultater opnået i dit laboratorium er identiske
med dem, der er opnået hos Quidel. De optiske densitetsværdier stilles til rådighed og skal alene anvendes som retningsgivende.
Resultater opnået i dit laboratorium kan variere.
Der medleveres kvalitetskontrolintervaller. Kontrolværdierne har til formål at verificere validiteten af kurve- og prøveresultaterne.
Hvert laboratorium skal etablere egne parametre for acceptable analysegrænser. Hvis kontrolværdierne IKKE ligger inden for
laboratoriets acceptable grænseværdier, skal analyseresultaterne betragtes som tvivlsomme, og prøverne skal gentages.
Hvis den optiske densitet for Metra BAP Standard F er mindre end 1,0, anses prøverne for tvivlsomme, hvorefter prøverne bør gentages.
FORTOLKNING AF RESULTATER
Prøveresultater udtrykkes som U/l og skal ikke korrigeres for fortynding (med mindre prøven er fortyndet inden testning).
I Metra BAP-analysen, repræsenterer 1 Unit 1 µmol pNPP hydrolyseret pr. minut ved 25°C i 2-amino-2-methyl-1-propanolbuffer.
Repræsentativ standardkurve
BAP standardniveauer: 0, 2, 20, 50, 80, 140 U/L
PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER
HAMA-interferens
Visse personer har antistoffer mod museantistoffer (HAMA), der kan forårsage interferens i immunoanalyser, som anvender
antistoffer udvundet fra mus. Det har særligt været rapporteret, at serumprøver fra patienter, der har modtaget behandling
eller diagnostiske procedurer omfattende infusion af monoklonalt museantistof, kan give fejlagtige resultater. Derfor bør Metra
BAP-resultaterne for sådanne patienter kun anvendes i sammenhæng med resultaterne fra en anden diagnostisk procedure og
tilgængelige resultater fra den kliniske evaluering af patienten.
Prøver med signifikant forhøjet alkalisk leverfosfatase-aktivitet kan medføre fejlagtigt forhøjede resultater i Metra BAP-analysen.
Paget-patienter med mild grad af sygdom, kan have knoglespecifikke alkaliske fosfatase-niveauer, der ligger inden for
referenceintervallet for Metra BAP.
PRØVEEKSEMPLAR VÆRDIER
Der er etableret BAP-referenceintervaller for normale mænd over 25 år (n = 126), normale præklimakterielle kvinder mellem
25 og 44 år (n = 178) og normale postklimakterielle kvinder (n = 107). Ved udarbejdelsen af referenceintervallerne blev normale
individer defineret som:
� Grundlæggende raske individer uden knogle-, endokrine-, eller kroniske lidelser.
� Regelmæssig menstruation (præklimakterielle kvinder)
� Ikke gravide eller ammende (kvinder)
� Individer, der ikke aktuelt tager medicin, der vides at påvirke knoglemetabolismen.
Værdierne kan påvirkes af faktorer som lav østrogenproduktion, lav kalciumindtagelse eller lav fysisk aktivitet. 8 Østrogenmangel i
postklimakterielle kvinder kan medføre en forhøjet knogleomsætning. 3,4 Hvert laboratorium bør etablere sit eget referenceinterval.
Intervallerne betegnes som nonparametriske referenceintervaller (90% CI).
Alder (år) Interval (U/L) Median
Kvinder 25 – 44 Præklimakterielle 11,6 – 29,6 18,3
Kvinder ≥ 45 Postklimakterielle 14,2 – 42,7 25,0
Mænd ≥ 25 15,0 – 41,3 23,2
64
Optisk Densitet (405 nm)
3,0
2,0
1,0
0,0
0 25 50 75 100 125 150
BAP (U/L)

PRÆSTATIONSKARAKTERISTIKA
Antistofspecifikationer
Det knoglespecifikke alkaliske fosfatase-antistof har selektiv, høj affinitet for den knoglespecifikke alkaliske fosfatase-isoform, lav
krydsreaktivitet med den alkaliske fosfatase, der findes i leveren, og en ubetydelig binding af intestinale og placenta-isoenzymer.
AP Isoenzym % Reaktivitet
Knogle 100
Lever 3 – 8
Placenta 0
Intestinal 0,4
Sensitivitet
Minimumsdetektionsgrænsen for Metra BAP-analysen er 0,7 U/L, der bestemmes af den øvre 3 SD-grænse i et præcisionsstudie
med en standard på nul.
Recovery – Spike recovery
Spike recovery blev bestemt ved at tilsætte en kendt mængde oprenset BAP i serumprøver med forskellige niveauer af endogent
BAP. Typiske resultater opnås ved at ’spike’ serumprøverne med lave, mellemhøje og høje koncentrationer af BAP og foretage tre
identiske analyser.
Endogent (U/L) Tilsat (U/L) Observeret (U/L) Recovery (%)
13,4 15,7 29,1 99
17,6 37,5 55,3 99
27,2 57,2 88,1 106
Recovery-linearitet
Lineariteten blev bestemt ved at foretage seriel fortynding af prøver og sammenligne konstaterede værdier med forventede værdier.
Typiske resultater angives herunder.
Prøve Fortyndingsfaktor Observeret (U/L) Forventet (U/L) Recovery (%)
1 ublandet 108,5 - -
1:2 51,1 54,2 94
1:4 25,8 27,1 99
1:6 18,0 18,1 99
2 ublandet 39,1 - -
1:2 20,1 19,5 103
1:4 10,3 9,8 105
1:6 6,7 6,5 103
3 ublandet 58,4 - -
1:2 29,9 29,2 102
1:4 15,7 14,6 108
1:6 9,7 9,7 100
Præcision
Præcision inden for kørsler blev bestemt ved ≥ 21 replikater af 3 prøver på 3 plader fra hver af 3 kitlots (i alt 9 plader). Præcision
mellem kørsler blev bestemt ved 3 prøver på 6 separate plater fra hver af 3 kitlots (i alt 18 plader). Typiske resultater angives
herunder.
BAP (U/l BAP) Under kørsel 1 CV% Mellem kørsler 2 CV%
12 5,8 5,2
35 3,9 7,6
100 5,2 5,0
1 n=21 2 n=6 kørsler
Interfererende substanser
Følgende substanser blev testet ved de angivne koncentrationer og blev ikke fundet at interferere med analysen.
Substans Koncentration
Hæmoglobin 500 mg/dl
Bilirubin 25 mg/dl
Triglycerider 1420 mg/dl
Totalprotein 6,0 g/dl †
Totalprotein 15,6 g/dl †
Totalprotein 6,0 g/dl ‡
Totalprotein 15,6 g/dl ‡
† Protein med vand
‡ Protein med BAP (BAP-koncentration = 43,6 U/L)
65
DANSK

Lægemiddelinterferenser
Diverse koncentrationer af lægemidler blev tilsat i tre separate pools af serum indeholdende ca. 35, 70 og 105 U/l BAP og analyseret
ved tre identiske prøver. Lægemidlerne og de højeste koncentrationer, der blev testet, var:
Substans Højeste koncentration
Etidronat 350 µg/ml
Østrogen 100 µg/ml
Ibuprofen 150 µg/ml
Acetominophen 350 µg/ml
Aspirin 350 µg/ml
Kalcitonin (human) 80 µg/ml
Kalcitonin (laks) 80 µg/ml
Kalcium 500 µg/ml
Noretindron/ethynil-østradiol mikstur (oral antikonception) 3 mg/ml
Vitamin D 400 IE/ml
Præcision
Der blev foretaget sammenlignende undersøgelser for at bedømme sammenhængen mellem målinger af serum med
knoglespecifik alkalisk fosfatase (BAP), opnået vha. Metra BAP-analysen med resultaterne fra tre kommercielt tilgængelige metoder
for måling af total alkalisk fosfatase (TAP) eller (BAP). Studierne blev udført på et uafhængigt laboratorium med anvendelse af
sera fra 114 patienter med Pagets sygdom og 464 raske forsøgspersoner. Den første sammenlignende metode var en kolorimetrisk
teknik til måling af TAP . Korrelationskoefficienten (r) mellem denne kolorimetriske metode og Metra BAP-analysen var 0,99. Den
anden sammenlignende metode var en elektroforesemetode til bestemmelse af BAP-isoenzymniveauer (r = 0,99). Den tredje
sammenlignende metode var en immun-radiometrisk analyse til måling af BAP (r = 0,99). Af de 114 personer med Pagets sygdom
havde 101 patienter værdier, der var højere end den øvre grænseværdi for referenceintervallerne i Metra BAP-analysen. Tretten
patienter havde værdier, der lå under den øvre grænse for referenceintervallerne.
KLINISKE UNDERSØGELSER
Brug af Metra BAP til overvågning af effektiviteten af antiresorptiv behandling ved osteoporose.
En vellykket, randomiseret, kontrolleret undersøgelse er blevet gennemført med henblik på bestemmelse af sikkerheden og
effektiviteten ved brug af Metra BAP-analysen til overvågning af ændringer i serum BAP-koncentrationerne i forbindelse med
antiresportiv behandling med aminobisfosfonat (alendronat). Testpersoner valgt fra en større undersøgelse af effektiviteten
af alendronat til behandling af osteoporese, 7 var postklimakterielle kvinder i alderen 45 til 84 år (gennemsnit 64 ± 7 år) med
diagnosen osteoporosis (baseret på klinisk forekomst eller en knoglemineraldensitet i columna lumbalis [LSBMD] ved forsøgsstart,
mere end 2,5 standardafvigelser under gennemsnittet for modne præklimakteriske kvinder). Ved forsøgsstart blev de egnede
testdeltagere randomiseret til at modtage enten 10 mg alendronat og 500 mg kalcium pr. dag (ALN) eller placebo og 500 mg
kalcium pr. dag (CTL) Der blev udtaget serumprøver fra deltagerne ved undersøgelsens start samt efter 3, 6 og 12 måneder.
Gennemsnitlig (± 1SD) BAP koncentration ved undersøgelsens start (14,6 ± 5,4 vs. 14,6 ± 4,6, p = 0,900) og LSBMD (0,74 ± 0,10
vs. 0,75 ± 0,09, p = 0,751) var tilsvarende for ALN og CTL. Fordelingen af BAP-værdier ved forsøgsstart i ALN og CTL er angivet i
følgende figur efter andel af den undersøgte population.
66
Andel af population (%)
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
< 4,0
4,0 – 5,9
Fordeling af BAP-niveauer ved forsøgsstart
6,0 – 7,9
8,0 – 9,9
10,0 – 11,9
12,0 – 13,9
Faldende knogleomsætning U/L BAP
Øget knogleomsætning
BAP var væsentligt lavere for ALN end CTL ved 3 (9,6 ± 3,5 vs. 13,4 ± 4,0, p

Andel af population (%)
Fordeling af BAP-niveauer efter 12 måneders
behandling med alendronat (ALN) eller kalcium (CTL)
12 mdr. CTL
12 mdr. ALN
Den gennemsnitlige (± 1SD) BAP-koncentration i CTL-forsøgsgruppen aftog moderat fra forsøgsstart til –5,4% (± 19,1%) ved
12 måneder (p=0,00004), hvilket muligvis afspejler den begrænsede knoglesparende effekt for kalcium. 13
Gennemsnitlige BAP-koncentrationer i ALN-forsøgspersonerne aftog 30,5 ± 24,6% ved 3 måneder, 42,8 ± 17,3% ved 6 måneder
og 42,2 ± 19,2% ved 12 måneder. Deltagerne i ALN-testgruppen havde en større tendens end CTL-deltagerne til at udvise
BAP-tab, der oversteg den procentvise minimumsændring med 14 68,5%, 83,9% og 86,1% for ALN, hvor 9,5%, 15,9% og 9,0% af
CTL-deltagerne faldt med ≥ 25% ved henholdsvis 3, 6 og 12 måneder. Fordelingerne af den procentvise ændring fra forsøgsstart i
BAP-værdier efter 12 måneder i ALN og CTL-grupperne er afbildet i følgende figur.
Andel af population (%)
40,0%
35,0%
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
< 4,0
4,0 – 5,9
6,0 – 7,9
Fordelingen af den procentvise ændring i BAP-niveauer efter 12 måneder
Behandling med alendronat (ALN) eller kalcium (CTL)
12 mdr. CTL
12 mdr. ALN
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
Ved 12 måneder, havde personerne i ALN øget LSBMD sammenlignet med CTL (p < 0.00001) som vist i nedenstående tabel.
Ændringer i LSBMD (gennemsnit ± SD)
8,0 – 9,9
n Forsøgsstart (g/cm 2 ) 12 måneder (g/cm 2 ) ∆ (%)
CTL 159 0,75 ± 0,09 0,74 ± 0,09 -0,6 ± 3,4
ALN 121 0,74 ± 0,10 0,79 ± 0,10 5,5 ± 4,1
Disse resultater antyder, at Metra BAP-analysen er sikker og effektiv til overvågning af den antiresorptive effekt
af amino-bisfosfonat (alendronat) i personer med diagnosen osteoporose.
10,0 – 11,9
Brugen af Metra BAP til overvågning af hormonel antiresorptiv behandling og forudsigelse af
skeletrespons (knoglemineraldensitet) i postklimakterielle kvinder
12,0 – 13,9
Faldende knogleomsætning U/L BAP
Øget knogleomsætning
< -70,0%
-70,0 til -60,1%
-60,0 til -50,1%
-50,0 til -40,1%
-40,0 til -30,1%
-30,0 til -20,1%
Faldende knogleomsætning % Ændring
Øget knogleomsætning
14,0 – 15,9
-20,0 til -10,1%
16,0 – 17,9
-10,0 til -0,1%
18,0 – 19,9
20,0 – 21,9
0,0 til 9,9%
22,0 – 23,9
10,0 til 19,9%
24,0 – 25,9
≥ 20,0%
67
DANSK

Overvågning af behandlingen:
En vellykket, randomiseret, kontrolleret multicenterundersøgelse er blevet gennemført med henblik på bestemmelse af sikkerheden
og effektiviteten ved brug af Metra BAP-analysen til overvågning af ændringer i serum BAP-koncentrationer i forbindelse med
østrogen/gestagen antiresorptiv behandling. Forøget knogleomsætning og signifikant tab af knoglevæv er ofte associeret med
postklimakteriel østrogenmangel . Det er vist, at østrogensubstitution er effektivt til at sænke knogleomsætningen og beskytte den
eksisterende knoglemasse, 3,6 Testpersonerne var postklimakterielle kvinder i alderen 45 til 64 år (gennemsnit 56 ± 4 år), som havde
gennemgået naturligt eller kirurgisk klimakterium inden for de sidste 10 år. Ved forsøgsstart blev egnede testdeltagere randomiseret
til en aktiv behandlingsgruppe (HRT): Premarin® (0,625 mg dagligt) med placebogestagen. Premarin® (0,625 mg dagligt) og
en aktiv gestagen (Provera® 2,5 mg/dag vedvarende, Provera® 10 mg/dag cyklisk eller mikroniseret progesteron 200 mg/dag
cyklisk); eller til en kontrolgruppe (CTL): placeboøstrogen og placebogestagen. Der blev udtaget serumprøver fra deltagerne ved
undersøgelsens start samt ved 12 måneder.
Den gennemsnitlige (± 1SD) BAP koncentration ved undersøgelsens start (20,7 ± 7,6 vs. 20,3 ± 6,8 U/l, p = 0,704) og LSBMD
(0,97 ± 0,17 vs. 0,97 ± 0,15 g/cm 2 , p = 0,970) var tilsvarende for CTL og HRT. Fordelingen af BAP-værdier ved forsøgsstart for ALN
og CTL er afbildet i følgende figur efter andel af den undersøgte population.
68
Andel af population (%)
≤ 9,0
9,1 – 11
Fordeling af BAP-niveauer ved forsøgsstart
11,1 – 13
13,1 – 15
15,1 – 17
17,1 – 19
BAP var væsentligt lavere for HRT end CTL ved 12 måneder (13,3 ± 5,0 vs. 21,9 ± 7,9 U/l, p < 0,00001) Fordelingerne af BAP-værdier
efter 12 måneder i HRT og CTL-grupperne er afbildet i følgende figur.
Andel af population (%)
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
Faldende knogleomsætning U/L BAP
Øget knogleomsætning
≤ 9,0
Fordeling af BAP-niveauer efter 12 måneders
behandling med østrogen/gestagen (HRT) eller placebo (CTL)
9,1 – 11
11,1 – 13
13,1 – 15
15,1 – 17
17,1 – 19
Den gennemsnitlige (± 1SD) BAP-koncentration i CTL-forsøgsgruppen steg moderat fra forsøgsstart til +9,8% (± 33,2%) ved
12 måneder (p=0,08), hvorimod BAP-koncentrationerne i HRT-forsøgspersonerne aftog fra forsøgsstart til –32,4 (± 21,5%)
ved 12 måneder (p < 0,00001). Deltagerne i HRT-testgruppen havde en større tendens end CTL-deltagerne til at udvise BAP-tab,
der oversteg den procentvise minimumsændring 12 , med 73,3% af HRT-deltagerne og 3,4% af CTL-deltagerne der udviste fald
på ≥ 25% ved 12 måneder. Fordelingerne af den procentvise ændring fra forsøgsstart i BAP-værdier efter 12 måneder i ALN og
CTL-grupperne er afbildet i følgende figur.
19,1 – 21
19,1 – 21
21,1 – 23
21,1 – 23
23,1 – 25
23,1 – 25
25,1 – 27
25,1 – 27
27,1 – 29
27,1 – 29
CTL
HRT
Faldende knogleomsætning U/L BAP
Stigende knogleomsætning
> 29
CTL
HRT
> 29

Fordeling af procentvis ændring i BAP-niveauer efter 12 måneders
behandling med østrogen/gestagen (HRT) eller placebo (CTL)
Ved 12 måneder havde deltagerne i HRT-gruppen øget LSBMD sammenlignet med CTL (p < 0.00001), som vist i følgende tabel:
Ændringer i LSBMD (gennemsnit ± SD)
n Forsøgsstart (g/cm 2 ) 12 måneder (g/cm 2 ) ∆ (%)
CTL 58 0,97 ± 0,17 0,95 ± 0,16 -1,6 ± 2,8
HRT 262 0,97 ± 0,15 1,00 ± 0,15 +3,5 ± 2,8
Disse resultater antyder, at Metra BAP-analysen er sikker og effektiv til overvågning af den antiresorptive effekt af
hormonbehandling af postklimakterielle kvinder.
Forudsigelse af skeletrespons:
I følgende figur afbildes %-faldet i BAP-værdierne fra forsøgsstart til 12 måneder efter kvartil for gruppen behandlet med HRT.
Testpersoner i øvre kvartil (Q1): største procentvise fald) udviste den største stigning af LSBMD som reaktion på HRT.
%Ændring LSBMD op til 12 mdr. (+/- SEM)
Andel af population (%)
6
5
4
3
2
1
0
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
< -70,0%
-70,0 til -60,1%
-60,0 til -50,1%
-50,0 til -40,1%
-40,0 til -30,1%
HRT-gruppen – Værdier for %-ændring i BAP op til 12 måneder fordelt efter
kvartil og tilsvarende %-ændring i LSBMD ved 12 måneder.
På følgende figur angives den lineære regressionsanalyse (y = -0,060x + 0,011, r = -0,51, p < 0,001) for den procentvise ændring
fra forsøgsstart op til 12 måneder med BAP og procentændringen fra forsøgsstart til 12 måneder for BMD for alle deltagerne i
undersøgelsen (placebo og behandlede).
-30,0 til -20,1%
Faldende knogleomsætning % Ændring
Øget knogleomsætning
Q1 (-66,5 til -45,9) Q2 (-45,9 til -36,0)
p < 0,001
-20,0 til -10,1%
-10,0 til -0,1%
0,0 til 9,9%
10,0 til 19,9%
CTL
HRT
≥ 20,0%
Q3 (-36,0 til -23,8) Q4 (-23,8 til 167,3)
Kvartiler efter %-ændring i BAP til 12 måneder
69
DANSK

70
LSBMD procentændring til 12 mdr..
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
-5,0%
-10,0%
HRT-undersøgelsen – lineær regression for den procentvise ændring i
LSBMD og BAP fra forsøgsstart op til 12 måneder.
-15,0%
-60,0% -40,0% -20,0%
En kontingenstabelanalyse påviste, at der var væsentlig sammenhæng mellem et fald på ≥ 25% i BAP ved 12 måneder
(p < 0,0001) og en positiv skeletrespons på HRT (stigning i BMD) ved 12 måneder De binominale (anden ordens approksimering)
85% konfidensintervaller for sensitiviteten og specificiteten ved anvendelse af en 25% reduktion af BAP til forudsigelse af en
reaktion på HRT er:
Sensitivitet = 77% (95% CI 75%, 82%); Specificitet = 61% (95% CI 41%, 78%).
Disse resultater antyder, at den procentvise ændring af BAP-koncentrationen kan anvendes til forudsigelse af skeletrespons (BMD)
på HRT-behandling.
+ASSISTANCE
Hvis du ønsker at afgive bestilling eller har tekniske spørgsmål, skal du rette henvendelse til en repræsentant for Quidel på
+1 408-616-4301 fra mandag til fredag mellem klokken 8.00 og 17.00 (Pacific time). Bestilling kan også afgives pr. fax
på +1 408-616-4310.
For serviceydelser uden for USA kontaktes den lokale distributør.
y = -0,060x + 0,011
r = 0,51
p < 0,001
0,0% 20,0% 40,0% 60,0%
BAP procentændr. til 12 mdr

SNABBGUIDE TILL ANALYSENS STEG
1. Tillsätt 125 µl analysbuffert.
2. Tillsätt 20 µl standarder, kontrollvätskor och prover; virvla runt.
3. Inkubera tre timmar ±10 minuter vid 20–28 °C.
4. Tvätta fyra gånger med 1x tvättbuffert.
5. Tillsätt 150 µl 20–28 °C arbetssubstratlösning.
6. Inkubera 30 ±5 minuter vid 20–28 °C.
7. Tillsätt 100 µl stopplösning och avläs optisk densitet vid 405 nm.
AVSETT ANVÄNDNINGSOMRÅDE
Immunoanalysen Metra BAP ger ett kvantitativt mått på benspecifik alkalisk fosfatasaktivitet (BAP) i serum som en indikator på
osteoblastisk aktivitet. BAP-mätningen är avsedd för:
� användning som hjälpmedel vid postmenopausal osteoporos och Pagets sjukdom;
� övervakning av postmenopausala kvinnor som behandlas med hormoner eller bisfosfonat;
� prediktion av skelettets respons på hormonbehandling för postmenopausala kvinnor.
SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING
Skelettisoformen, eller den benspecifika isoformen av alkaliskt fosfatas är ett tetrameriskt glykoprotein som finns på cellytan i
osteoblaster. 1 Osteoblaster är de celler som svarar för syntes av ny benvävnad och benmineralisering. Det benspecifika alkaliska
fosfatasets funktion är inte helt klarlagd, men dess roll i benmineraliseringen har bekräftats. 1,2,3
Ben genomgår konstant en metabolisk process som kallas benremodellering. 3,4 Den omfattar en nedbrytande process,
benresorption, som utförs av osteoklaster, och en uppbyggande process, benformation, som utförs av osteoblaster. 3,4
Benremodelleringen är nödvändig för skelettets fortlevnad och kondition, och är nära sammankopplad – dvs. benresorptionen och
benformationen är i balans. 3,4 I abnorma fall av benmetabolism bryts balansen. Om resorptionen är större än formationen leder det
till benförlust som kan orsaka osteoporos, 3,4 eller till oregelbunden benvävnad (Pagets sjukdom). 5 Mätning av specifika biokemiska
värden för dessa remodelleringshändelser ger analytiska data angående benmetabolismens hastighet eller ”omsättning”. 3,4
Osteoporos är en metabolisk bensjukdom som karakteriseras av abnorm benremodellering. Det är en systemisk skelettsjukdom
som karakteriseras av låg benmassa och mikrostrukturell försvagning i benvävnaden, med ökad känslighet för benfrakturer som
följd. 6 Den vanligaste typen av osteoporos drabbar postmenopausala kvinnor som resultat av östrogenbrist när äggstockarnas
funktion upphör. 3 Hormonbehandling som återställer östrogennivåerna förhindrar benförlust och osteoporos. 3,6 Östrogener och en
klass föreningar som kallas bisfosfonater är antiresorptiva behandlingar som kan användas för att förhindra benförlust eller för att
behandla osteoporos. 3,6,7
Osteoporos kan också orsakas av otillräcklig högsta benmassa under tillväxtåren, en åldersrelaterad obalans i benremodelleringen
med nettoöverskott av resorption och ett antal kliniska tillstånd och behandlingar som leder till benförlust eller obalans i
benremodelleringen. 3 De omfattar endokrina sjukdomar som hypogonadism, hypertyreoidism, hyperparatyreoidism och
hyperkortisolism; njursvikt; metastatisk bencancer; gastrointestinala sjukdomar som är relaterade till näring och mineralmetabolism;
besläktade vävnadssjukdomar; multipelt myelom; kronisk förlamning; alkoholism eller tobaksbruk; och kronisk behandling med
heparin eller kortikosteroider. 3
Pagets bensjukdom är en allvarlig sjukdom med smärta och bendeformation som symptom. 5 Pagets sjukdom karakteriseras av
benvävnad med kraftigt abnorm struktur till följd av förhöjd benremodellering. Missbildningarna uppträder huvudsakligen i kraniet,
ryggraden, bäckenet och de långa benen, och kan leda till frakturer och neurologisk försämring. 5 Etiologin för Pagets sjukdom är
okänd, men trovärdiga hypoteser om ärftlighet och virus finns. 5 Bisfosfonat och kalcitonin används för närvarande för att dämpa den
biokemiska aktiviteten till normala nivåer så att normal benstruktur kan återställas. 9
Som ett kvantitativt mått på benomsättning ger BAP viktig information om benremodelleringen vid osteoporos och Pagets
sjukdom, och om förändringar i sjukdomsaktivitet till följd av antiresorptiv behandling. 10-12 För Metra BAP-analysen användes
antikroppteknik för att ge en monoklonal antikropp som visar specificiteten för BAP. 10 Specificiteten för den monoklonala
antikroppen som används i analysen möjliggör enkel, praktisk, reproducerbar och direkt kvantifiering av BAP-aktivitet i serum.
PROCEDURENS PRINCIP
Metra BAP är en immunoanalys i mikrotiter-remsformat med en monoklonal anti-BAP-antikropp på remsan för att infånga BAP i
provet. Enzymaktiviteten hos infångad BAP upptäcks med ett pNPP-substrat.
71
SVENSKA

MEDFÖLJANDE REAGENSER OCH MATERIAL
96 analyser för benspecifikt alkaliskt fosfatas (BAP)
Metra BAP EIA innehåller följande:
A BAP-standard A till F Komponent 4395 till 4400 0,3 ml/st
B (A = 0, B = 2, C = 20, D = 50, E = 80, F = 140 E/L BAP)
C BAP som renats från osteosarkom SAOS-2-celler i en buffrad lösning med magnesiumklorid, zinksulfat, surfaktant,
D bärarprotein, blått färgämne och natriumazid (0,05 %) som konserveringsmedel.
E
F
L Låga/höga kontroller Komponent 4401, 4402 0,3 ml/st
H BAP renat från osteosarkom SAOS-2-celler i en buffrad lösning med magnesiumklorid, zinksulfat, surfaktant, bärarprotein, blått
färgämne och natriumazid (0,05 %) som konserveringsmedel.
q Remsor med beläggning Komponent 4660 12 st
Renad mus-monoklonal Anti-BAP IgG-antikropp på Stripwell-remsor.
w Stopplösning Komponent 4702 15 ml
0,5N NaOH
e 10x tvättbuffert Komponent 4703 55 ml
Nonjonaktivt rengöringsmedel i buffertlösning med natriumazid (0,05 %) som konserveringsmedel.
r Analysbuffert Komponent 4403 27 ml
Buffertlösning som innehåller magnesiumklorid, zinksulfat, surfaktant och natriumazid (0,05 %) som konserveringsmedel.
t Substratbuffert Komponent 4404 3 x 10 ml
2-amino-3-metyl-1-propanollösning innehållande HEDTA, magnesiumklorid, zinksulfat och natriumazid (0,05 %) som
konserveringsmedel.
y Substrattabletter Komponent 0012 3 x 20 mg
p-nitrofenylfosfat.
NÖDVÄNDIGT MATERIAL SOM INTE MEDFÖLJER
Mikropipetter för 20 µl och 100 till 300 µl
Lämpliga mätkärl för 100 till 300 ml
Behållare för tvättbuffertspädning
Avjoniserat eller destillerat vatten
Plattläsare för avläsning av optisk densitet vid A405 > 2,0
Programvara för kurvpassning med kvadratisk kalibrering
VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER
1. För in vitro-diagnostik.
2. Behandla prover som biologiskt riskmaterial. Hantera satsens innehåll och patientprover med försiktighet.
3. Behållare och oanvänt innehåll ska kasseras i enlighet med gällande lagar och bestämmelser.
4. Medföljande reagenser används som en enhet fram till det utgångsdatum som anges på förpackningen.
5. Förvara analysreagenser enligt anvisningen.
6. Använd inte remsor med beläggning om det finns hål på förpackningen.
7. Dubbeltesta varje prov.
8. 0,5N NaOH är frätande och kan orsaka svåra brännskador. Får inte förtäras. Undvik kontakt med hud, ögon eller kläder. Tvätta
bort spilld 0,5N NaOH med vatten. Kontakta läkare vid förtäring.
9. Natriumazid används som konserveringsmedel. Tillfällig kontakt med eller förtäring av buffertlösningar med natriumazid kan
orsaka irritation på hud, ögon och i munnen. Använd bara buffertlösningarna för de avsedda ändamålen och undvik kontakt
med syror. Natriumazid kan reagera med bly- och kopparrör och bilda högexplosiva metallazider. Spola stora mängder vatten
när azider kasseras för att undvika azidansamling.
10. Substratbufferten innehåller 2-amino-2-mehyl-1-propanol och kan irritera ögon och/eller hud vid längre kontakt. Bär lämpliga
skyddskläder, handskar och ögon/ansiktsskydd. Kontaktade områden skall omedelbart tvättas med tvål och vatten.
11. Multikanal- eller repeterpipetter bör användas vid uppmätning av reagenser.
12. För korrekt provmätning ska exakta mängder prover och standarder tillsättas. Pipettera omsorgsfullt med kalibrerad utrustning.
13. Späd prover som är större än 140 E/l i analysbufferten och testa om. Ta med spädningsfaktorn i slutberäkningen.
14. Analysen utförs med någon validerad tvättmetod.
REAGENSFÖRBEREDELSER
Reagenser och material ska ha temperaturen 20–28 °C före analysen. När de reagenser och material som
behövs avlägsnats ska oanvända artiklar återställas till 2–8 °C.
72

Remsor med beläggning
Ta ut Stripwell-ramen och det antal remsor med beläggning som behövs från förpackningen (se tabellen i avsnittet ANALYSPROCEDUR).
Förpackningar med oanvända remsor måste återförslutas helt.
Tvättbuffert
Bered den rätta mängden 1x tvättbuffert (se tabell) genom att späda 10x tvättbuffertkoncentrat 1:10 med avjoniserat vatten.
Förvara vid 20–28 °C. Använd 1x tvättbufferten inom 21 dagar från beredningen.
Arbetssubstratlösning
Bered arbetssubstratlösningen högst en timme innan den ska användas. Lägg en substrattablett i varje flaska 20–28 °C
substratbuffert (se tabellen). Låt tabletten lösas upp i 30 till 60 minuter. Skaka flaskan/flaskorna kraftigt så att lösningen blandas
helt. Kassera överbliven arbetssubstratlösning efter användning.
FÖRVARING
Förvara satsen vid 2–8 °C. Får inte frysas. Förvara oanvänd reagens vid 2–8 °C. Låt reagensens temperatur stabiliseras vid 20–28 °C
före användning. Förvara 1x tvättbuffert (10x utspädd) vid 20–28 °C.
PROVTAGNING OCH PROVFÖRVARING
Ta serumprovet med vanlig venpunktion. Provet ska tas utan antikoagulant för att undvika hemolys. Låt blodet levra sig och avskilj
serumet med centrifugering. Serum kan förvaras i fem dagar vid 2–8 °C, i tolv månader vid -40 °C eller kallare och i 36 månader vid
-80 °C eller kallare. Prover får inte frysas och tinas mer än tre gånger.
Serum direkt från koagulatet, serum från serumrör, Na-heparinplasma och Li-heparinplasma ger väsentligen likvärdiga resultat.
Plasmaprover bör inte prepareras med kelatmedel (till exempel EDTA eller citrat).
ANALYSPROCEDUR
Läs hela produktbladet innan analysen påbörjas.
Läs avsnittet REAGENSBEREDNING före analysen.
Avgör hur mycket av varje reagens som behövs utifrån antalet remsor som ska användas.
Antal remsor 4 6 8 12
Antal prover (parprover) 8 16 24 40
Substrat (flaska) 1 1 2* 2*
1x tvättbuffert (ml) 100 150 200 300
*Om mer än en flaska används ska innehållet blandas före användning.
Provinkubering
1. Ta ut Stripwell-ramen och det antal remsor med beläggning som behövs från förpackningen (se tabellen). Förpackningar med
oanvända remsor måste återförslutas helt.
2. Placera önskat antal remsor med beläggning i Stripwell-ramen. Märk remsorna för att undvika att de blandas ihop om de tas
bort från Stripwell-ramen av misstag.
3. Tillsätt 125 µl analysbuffert i varje brunn.
4. Tillsätt 20 µl standard, kontrollvätska eller prov i varje brunn. Blanda inte med analysbuffert genom repeterpipettering. Detta
steg ska slutföras inom 30 minuter. Virvla försiktigt runt remsorna så att provet blandas ordentligt med
bufferten.
5. Inkubera tre timmar (± tio minuter) vid 20–28 °C.
6. Bered arbetssubstratlösningen högst en timme innan den ska användas. Lägg en substrattablett i varje flaska 20–28 °C
substratbuffert (se tabellen). Låt tabletten lösas upp i 30 till 60 minuter. Skaka flaskan/flaskorna kraftigt så att lösningen
blandas helt.
Tvättning
7. Bered rätt mängd 1x tvättbuffert (se tabell) genom att späda 10x tvättbuffert 1:10 med avjoniserat vatten. Förvara vid 20–28
°C. Använd 1x tvättbufferten inom 21 dagar från beredningen.
8. Vänd/töm remsorna för hand. Tillsätt minst 250 µl 1x tvättbuffert i varje brunn och vänd/töm remsorna för hand. Upprepa
ytterligare tre gånger (totalt fyra tvättningar). Torka av remsorna ordentligt på pappershandukar efter den sista tvättningen.
Substratinkubering
9. Tillsätt 150 µl arbetssubstratlösning i varje brunn. Kassera överbliven arbetssubstratlösning efter användning.
10. Inkubera 30 ± 5 minuter vid 20–28 °C.
Stopp/avläs
11. Tillsätt 100 µl stopplösning i varje brunn. Tillsätt stopplösningen i samma mönster och med samma tidsintervall som
substratlösningen tillsattes.
12. Avläs den optiska densiteten vid 405 nm. Kontrollera att det inte finns några stora bubblor i brunnarna och att remsornas
undersidor är rena. Remsorna ska avläsas inom 15 minuter från att stopplösningen tillsatts.
13. Kvantitativ programvara som använder en kurvpassningsekvation med kvadratisk kalibrering måste användas för att analysera
testresultat från Metra BAP.
Equation: y = A + Bx + Cx 2
73
SVENSKA

KVALITETSKONTROLL
Analyscertifikatet som medföljer produkten är partispecifik och ska användas för att intyga att laboratoriets resultat liknar dem
som erhålles på Quidel. De optiska densitetsvärdena är givna och ska endast användas som riktlinjer. Resultatet i ert laboratorium
kan avvika.
Kvalitetskontrollområden medföljer. Kontrollvärdena är avsedda att bekräfta kurvans och testresultatets giltighet. Varje laboratorium
ska upprätta egna parametrar för vad som är acceptabla analysvärden. Om kontrollvärdena INTE ligger inom laboratoriets
acceptansgränser, ska analysresultaten infrågasättas och proven ska upprepas.
Om den optiska densiteten för Metra BAP standard F är mindre än 1,0, ska resultatet infrågasättas och proverna bör upprepas.
RESULTATTOLKNING
Testresultat uttrycks i E/L och behöver inte korrigeras för utspädning (om inte provet späddes före testet).
I Metra BAP-analysen motsvarar en enhet en µmol pNPP-hydrolyserad per minut vid 25 °C i 2-amino-2-metyl-1-propanol-buffert.
Representativ standardkurva
BAP-standardnivåer: 0, 2, 20, 50, 80, 140 E/L
PROCEDURENS BEGRÄNSNINGAR
HAMA-interferens
Vissa personer har antikroppar mot mus-antikroppar (HAMA), som kan orsaka interferens i immunoanalyser som använder
antikroppar från möss. Det har framförallt rapporterats att serumprover från patienter som genomgått behandling eller diagnos
omfattande infusion av monoklonala antikroppar från möss kan ge felaktiga resultat. Därför ska Metra BAP-resultat från
sådana patienter bara användas i kombination med resultat från andra diagnosmetoder och med information från den kliniska
utvärderingen av patienten.
Prover med betydligt förhöjd alkalisk fosfatasaktivitet i levern kan orsaka felaktigt förhöjda resultat i Metra BAP-analysen.
Patienter med låg nivå av Pagets sjukdom kan ha värden för alkaliskt fosfatas som faller inom referensområdet för Metra BAP.
PROV VÄRDEN
Referensområden för BAP har fastställts för normala män över 25 års ålder (n = 126), normala premenopausala kvinnor mellan 25
och 44 års ålder (n = 178) och normala postmenopausala kvinnor (n = 107). För etableringen av referensområden definierades
följande normalsubjekt:
� friska, utan bensjukdomar eller endokrina eller kroniska sjukdomar
� med regelbunden menstruationscykel (premenopausala kvinnor)
� ej gravida eller ammande (kvinnor)
� ingen medicinering med känd inverkan på benmetabolismen.
Värdena kan påverkas av faktorer som låg östrogenproduktion, lågt kalciumintag eller låg fysisk aktivitet. 8 Östrogenbrist hos
postmenopausala kvinnor kan ge förhöjd benomsättning. 3,4 Varje laboratorium bör fastställa egna normalreferensområden.
Områdena uttrycks som icke-parametriska referensintervaller (90 % Cl).
Ålder (år) Område (E/L) Median
Kvinnor 25–44 Premenopausala 11,6–29,6 18,3
Kvinnor ≥ 45 Postmenopausala 14,2–42,7 25,0
Män ≥ 25 15,0–41,3 23,2
PRESTANDASPECIFIKATIONER
Antikroppspecifikationer
Den benspecifika alkaliska fosfatasantikroppen har selektiv hög affinitet för den benspecifika alkaliska fosfatasisoformen, låg
korsreaktivitet mot leverformen av alkaliskt fosfatas och försumbar bindning av intestinala och placentala isoenzymer.
74
Ooptisk densitet (405 nm)
3,0
2,0
1,0
0,0
0 25 50 75 100 125 150
BAP (E/L)

AP-isoenzym % reaktivitet
Ben 100
Lever 3–8
Placental 0
Intestin 0,4
Känslighet
Metra BAP-analysens minsta avkänningsgräns är 0,7 E/L, vilket avgörs av den övre 3-SD-gränsen i en precisionsstudie med
nollstandard.
Återhämtning – pik-återhämtning
Pik-återhämtningen avgjordes genom att en känd mängd renat BAP tillsattes i serumprover med olika nivåer endogent BAP. Typiska
resultat erhålls efter man taggat serumprover med låg, medelhög och hög koncentration av BAP och trippelanalyserat dessa.
Endogent (E/L) Tillsatt (E/L) Observerat (E/L) Återhämtning (%)
13,4 15,7 29,1 99
17,6 37,5 55,3 99
27,2 57,2 88,1 106
Återhämtning – linjäritet
Linjäriteten avgjordes genom att prover späddes seriellt. De observerade värdena jämfördes med förväntade värden. Typiska resultat
visas nedan.
Prov Spädnings-faktor Observerat (E/L) Förväntat (E/L) Återhämtning (%)
1 konc. 108,5 - -
1:2 51,1 54,2 94
1:4 25,8 27,1 99
1:6 18,0 18,1 99
2 konc. 39,1 - -
1:2 20,1 19,5 103
1:4 10,3 9,8 105
1:6 6,7 6,5 103
3 konc. 58,4 - -
1:2 29,9 29,2 102
1:4 15,7 14,6 108
1:6 9,7 9,7 100
Precision
Precision inom tester bestämdes för ≥ 21 replikat av 3 prov på 3 plattor från var och en av 3 partier (totalt 9 plattor). Precision
mellan tester bestämdes för 3 prov, som körts i 6 separata plattor från var och en av 3 partier (totalt 18 plattor). Typiska resultat
visas nedan.
BAP (E/L BAP) CV % Inom test 1 CV % mellan tester 2
12 5,8 5,2
35 3,9 7,6
100 5,2 5,0
1 n = 21 2 n = sex tester
Störande ämnen
Följande ämnen testades vid angiven koncentration och befanns inte störa analysen.
Ämne Koncentration
Hemoglobin 500 mg/dl
Bilirubin 25 mg/dl
Triglycerider 1420 mg/dl
Totalprotein 6,0 g/dl †
Totalprotein 15,6 g/dl †
Totalprotein 6,0 g/dl ‡
Totalprotein 15,6 g/dl ‡
† Protein med vatten
‡ Protein med BAP (BAP-koncentration = 43,6 E/L)
75
SVENSKA

Läkemedelsinterferens
Olika koncentrationer av läkemedel tillsattes i tre separata serumprover med ungefär 35, 70 och 105 E/L BAP och
trippelanalyserades. De läkemedel och högsta koncentrationer som testades var:
Ämne Högsta koncentration
Etidronat 350 µg/ml
Östrogen 100 µg/ml
Ibuprofen 150 µg/ml
Acetominophen 350 µg/ml
Aspirin 350 µg/ml
Kalcitonin – humant 80 µg/ml
Kalcitonin – lax 80 µg/ml
Kalcium 500 µg/ml
Blandning av noretindron/etynilestradiol (oralt preventivmedel) 3 mg/ml
Vitamin D 400 IU/ml
Noggrannhet
Komparativa studier utfördes för att utvärdera sambanden mellan mätningar av serumets benspecifika alkaliska fosfatas (BAP),
som erhållits genom MetraBAP-analys, och resultat som erhållits med tre för närvarande tillgängliga metoder för mätning av
totalt alkaliskt fosfatas (TAP) eller BAP. Studierna utfördes vid en oberoende klinisk undersökniningsanläggning med serum från
114 patienter med Pagets sjukdom och 464 friska personer. Den första jämförelsen var en kolorimetrisk teknik för TAP-mätning.
Korrelationskoefficienten (r), som fastställdes mellan den kolorimetriska metoden och Metra BAP-analysen, var 0,99. Den andra
komparativa metoden var en elektroforesmetod för att avgöra isoenzymnivåerna för BAP (r = 0,99). Den tredje komparativa
metoden var en immunoradiometrisk analys för att mäta BAP (r = 0,99). Av de 114 patienterna med diagnosen Pagets sjukdom
hade 101 patienter värden som var högre än den övre gränsen för referensområdena för Metra BAP-analysen. Tretton patienter hade
värden som var mindre än den övre gränsen för referensområdena.
KLINISKA STUDIER
Metra BAP-användning för övervakning av effekten av antiresorptiv behandling vid osteoporos
Ett slumpmässigt kontrollerat multicenterförsök utfördes framgångsrikt för att fastställa Metra-BAP-analysens säkerhet och
effektivitet att övervaka förändringar i BAP-koncentrationer i samband med antiresortptiv behandling med aminobisfosfonat
(alendronat). Testpersonerna, som togs från en mer omfattande studie av alendronatets effekt för osteoporosbehandling, 7 var
postmenopausala kvinnor mellan 45 och 84 års ålder (medel 64 ±7 år) med diagnosen osteoporos (utifrån en klinisk presentation
eller om baslinjen för ländryggradens mineraltäthet [LSBMD] var mer än 2,5 standardavvikelser under medelvärdet för mogna
premenopausala kvinnor). Vid baslinjen fick lämpliga testpersoner slumpmässigt antingen 10 mg alendronat och 500 mg kalcium
per dag (ALN) eller ett placebo och 500 mg kalcium per dag (CTL). Serumprover togs vid baslinjen och efter tre, sex och tolv
månader från alla testpersoner.
Medelvärdet (±1 SD) för BAP-koncentrationen vid baslinjen 14,6 ± 5,4 jämfört med 14,6 ± 4,6, p = 0,900) och LSBMD
(0,74 ± 0,10 jämfört med 0,75 ± 0,09, p = 0,751) hade liknande värden för ALN och CTL. Fördelningen av baslinjevärden för
BAP-värden i ALN och CTL avbildas i följande figur i proportion till studiepopulationen.
76
Del av populationen (%)
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
< 4,0
4,0 – 5,9
6,0 – 7,9
Fördelning av BAP-nivåer vid baslinjen
8,0 – 9,9
10,0 – 11,9
12,0 – 13,9
Minskande benomsättning E/l BAP
Ökande benomsättning
BAP var avsevärt lägre för ALN än CTL vid tre (9,6 ± 3,5 jämfört med 13,4 ± 4,0, p < 0,00001), sex (8,0 ± 3,0 jämfört med 13,2
± 3,8, p < 0,00001) och tolv månader (7,8 ± 2,6 jämfört med 13,3 ± 3,9, p < 0,00001). Fördelningen av BAP-värden efter tolv
månader i ALN- och CTL-grupperna visas i följande figur.
14,0 – 15,9
16,0 – 17,9
18,0 – 19,9
20,0 – 21,9
CTL, baslinje
ALN, baslinje
22,0 – 23,9
24,0 – 25,9

Del av populationen (%)
Fördelning av BAP-nivåer efter 12 månaders
behandling med alendronat (ALN) eller kalcium (CTL)
Medelvärdet (± 1 SA) för BAP-koncentrationen hos CTL-testpersoner hade minskat något från baslinjen till -5,4 % (± 19,1 %) vid
tolv månader (p = 0,00004) vilket visar kalciumets begränsade bensparande effekt. 13
Medelvärdet för BAP-koncentrationen hos ALN-testpersoner hade minskat 30,5 ± 24,6 % vid tre månader, 42,8 ± 17,3 %
vid sex månader och 42,2 ± 19,2 % vid tolv månader. Testpersoner i ALN-gruppen var mer benägna än dem i CTL-gruppen att
uppvisa BAP-förluster över den minsta procentförändringen 14 ; 68,5 %, 83,9 % och 86,1 % av ALN-personerna och 9,5 %, 15,9
%, och 9,0 % av CTL-personerna hade en minskning som var 25 % eller större efter tre, sex och tolv månader. Fördelningen av
procentförändringen av BAP-värden från baslinjen till tolv månader i ALN- och CTL-grupperna visas i följande figur.
Del av populationen (%)
40,0%
35,0%
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
< 4,0
4,0 – 5,9
Fördelning av procentförändring av BAP-nivåer efter 12 månaders
behandling med alendronat (ALN) eller kalcium (CTL)
Vid tolv månader hade testpersoner i ALN-gruppen förhöjd LSBMD jämfört med CTL-gruppen (p < 0,00001), vilket visas i följande
tabell.
Förändring i LSBMD (medel ± SD)
6,0 – 7,9
8,0 – 9,9
10,0 – 11,9
n Baslinje (g/cm 2 ) Tolv månader (g/cm 2 ) ∆ (%)
CTL 159 0,75 ±0,09 0,74 ±0,09 -0,6 ±3,4
ALN 121 0,74 ±0,10 0,79 ±0,10 5,5 ±4,1
12,0 – 13,9
Minskande benomsättning E/I BAP
Ökande benomsättning
< -70,0%
-70,0 till -60,1%
-60,0 till -50,1%
-50,0 till -40,1%
-40,0 till -30,1%
Resultaten visar att Metra-BAP-analysen är ett säkert och effektivt sätt att övervaka den antiresorptiva effekten av behandling med
aminobisfosfonat (alendronat) för testpersoner med diagnosen osteoporos.
-30,0 till -20,1%
14,0 – 15,9
-20,0 till -10,1%
16,0 – 17,9
-10,0 till -0,1%
18,0 – 19,9
20,0 – 21,9
0,0 till 9,9%
12 mån CTL
12 mån ALN
22,0 – 23,9
10,0 till 19,9%
24,0 – 25,9
12 mån CTL
12 mån ALN
Minskande benomsättning % förändring
Ökande benomsättning
≥ 20,0%
77
SVENSKA

Användning av Metra-BAP för övervakning av hormonell antiresorptiv behandling och prediktion av
skelettets respons (benmineraltäthet) hos postmenopausala kvinnor
Behandlingsövervakning:
Ett slumpmässigt kontrollerat multicenterförsök utfördes framgångsrikt för att fastställa Metra-BAP-analysens säkerhet och
effektivitet att övervaka förändringar i BAP-koncentrationer i samband med antiresorptiv behandling med östrogen/progestin.
Ökad benomsättning och betydande benförlust hör ofta ihop med postmenopausal östrogenbrist. Östrogenersättning har visats
minska benomsättningen effektivt och skydda befintlig benmassa. 3,6 Testpersonerna var postmenopausala kvinnor från 45 till
64 års ålder (medel 56 ± 4 år) som genomgått naturlig eller kirurgisk menopaus de senaste tio åren. Vid baslinjen placerades
lämpliga testpersoner slumpmässigt i en aktiv behandlingsgrupp (HRT): Premarin® (0,625 mg per dag) med placeboprogestin,
Premarin® (0,625 mg per dag) och ett aktivt progestin (Provera® 2,5 mg per dag kontinuerligt, Provera® 10 mg per dag cykliskt
eller mikroniserat progesteron 200 mg per dag cykliskt); eller i kontrollgruppen (CTL): placeboöstrogen och placeboprogestin.
Serumprover togs vid baslinjen och efter tolv månader från alla testpersoner.
Medelvärdet (±1 SD) för BAP-koncentrationen vid baslinjen (20,7 ±7,6 jämfört med 20,3 ±6,8 E/L, p = 0,704) och LSBMD
(0,97 ±0,17 jämfört med 0,97 ± 0,15 g/cm 2 , p = 0,970) hade liknande värden för CTL och HRT. Fördelningen av baslinjevärden för
BAP i HRT och CTL avbildas i följande figur i proportion till studiepopulationen.
78
Del av populationen (%)
≤ 9,0
9,1 – 11
Fördelning av BAP-nivåer vid baslinjen
11,1 – 13
13,1 – 15
15,1 – 17
BAP var avsevärt lägre för HRT än CTL vid tolv månader (13,3 ±5,0 jämfört med 21,9 ±7,9 E/L, p < 0,00001). Fördelningen av
BAP-värden efter tolv månader i HRT- och CTL-grupperna visas i följande figur.
Del av populationen (%)
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
Fördelning av BAP-nivåer efter 12 månaders
behandling med östrogen/progestin (HRT) eller placebo (CTL)
Medelvärdet (±1 SD) för BAP-koncentrationen hos CTL-testpersonerna ökade något från baslinjen till 9,8 % (±33,2 %) vid tolv
månader (p = 0,08) medan BAP-koncentrationen hos HRT-testpersoner minskade från baslinjen till -32,4 (±21,5 %) vid tolv
månader (p < 0,00001). Testpersoner i HRT-gruppen var mer benägna än dem i CTL-gruppen att uppvisa BAP-förluster över
den minsta procentförändringen 12 ; 73,3% av HRT-personerna och 3,4 % av CTL-personerna hade en minskning som var 25 %
eller större efter tolv månader. Fördelningen av procentförändringen av BAP-värden från baslinjen till tolv månader i HRT- och
CTL-grupperna visas i följande figur.
17,1 – 19
Minskande benomsättning E/I BAP
Ökande benomsättning
≤ 9,0
9,1 – 11
11,1 – 13
13,1 – 15
15,1 – 17
17,1 – 19
19,1 – 21
19,1 – 21
21,1 – 23
21,1 – 23
23,1 – 25
23,1 – 25
25,1 – 27
25,1 – 27
27,1 – 29
27,1 – 29
CTL
HRT
Minskande benomsättning E/I BAP
Ökande benomsättning
> 29
CTL
HRT
> 29

Del av populationen (%)
Fördelning av procentförändring av BAP-nivåer efter 12 månaders
behandling med östrogen/progestin (HRT) eller placebo (CTL)
Vid tolv månader hade testpersoner i HRT-gruppen förhöjd LSBMD jämfört med CTL-gruppen (p < 0,00001), vilket visas i följande
tabell.
Förändring i LSBMD (medel ± SD)
n Baslinje (g/cm 2 ) Tolv månader (g/cm 2 ) ∆ (%)
CTL 58 0,97 ±0,17 0,95 ±0,16 -1,6 ±2,8
HRT 262 0,97 ±0,15 1,00 ±0,15 +3,5 ±2,8
Resultaten visar att Metra-BAP-analysen är ett säkert och effektivt sätt att övervaka den antiresorptiva effekten av behandling med
hormonersättning hos postmenopausala kvinnor.
Prediktion av skelettets respons:
Följande figur visar den procentuella minskningen av BAP-värden från baslinjen till tolv månader efter kvartil för HRT-gruppen.
Testpersoner i den högsta kvartilen (K1: största procentuella minskning) visade störst ökning i LSBMD efter HRT-behandling.
% förändring LSBMD till 12 mån (+/- SEM)
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
< -70,0%
-70,0 till -60,1%
-60,0 till -50,1%
-50,0 till -40,1%
-40,0 till -30,1%
HRT-gruppen – värden för procentuell förändring av BAP till tolv månader, sorterade
efter kvartil och motsvarande procentuell förändring av LSBMD vid tolv månader
6
5
4
3
2
1
0
Följande figur visar linjär regressionsanalys (y = -0,060 x + 0,011, r = -0,51, p < 0,001) för den procentuella förändringen från
baslinjen till tolv månader för BAP och för BMD för alla testpersoner i studien (placebo och behandlade).
-30,0 till -20,1%
Minskande benomsättning % förändring
Ökande benomsättning
K1 (-66,5 till -45,9) K2 (-45,9 till -36,0)
p < 0,001
-20,0 till -10,1%
-10,0 till -0,1%
0,0 till 9,9%
10,0 till 19,9%
CTL
HRT
≥ 20,0%
K3 (-36,0 till -23,8) K4 (-23,8 till 167,3)
Kvartiler efter % förändring i BAP till 12 månader
79
SVENSKA

80
LSBMD % förändring till 12 mån
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
-5,0%
-10,0%
HRT-studie – linjär regression för procentuell förändring i
LSBMD och BAP från baslinjen till tolv månader
-15,0%
-60,0% -40,0% -20,0%
Analys av kontingenstabell visade att en minskning på 25 % eller mer för BAP vid tolv månader hade ett starkt samband (p
< 0,0001) med positiv skelettrespons på HRT (ökad BMD) vid tolv månader. De binomiala (andra gradens approximation)
85-procentigakonfidensintervallerna för känsligheten och specificiteten med en 25-procentig minskning av BAP för prediktion av
responsen på HRT är:
Känslighet = 77 % (95 % CI 75 %, 82 %); Specificitet = 61 % (95 % CI 41 %, 78 %).
Resultaten visar att den procentuella förändringen av BAP-koncentration kan användas för att förutse graden av skelettets respons
(BMD) på HRT-behandling.
SUPPORT
Kontakta en Quidel-representant på +1 408-616-4301, vardagar mellan 08.00 och 17.00 Pacific Time (GMT +9) för att beställa
eller för teknisk support. Beställning kan också göras via fax på +1 408-616-4310.
Utanför USA: kontakta en lokal distributör för Quidel-produkter.
y = -0,060x + 0,011
r = 0,51
p < 0,001
0,0% 20,0% 40,0% 60,0%
BAP % förändring till 12 mån

ΣΥΝΤΟΜΟΣ ΟΔΗΓΟΣ ΒΗΜΑΤΩΝ ΤΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ
1. Προσθέστε 125 µL Assay Buffer (Ρυθμιστικό διάλυμα ανάλυσης).
2. Προσθέστε 20 µL Standards (Πρότυπα), Controls (μάρτυρες) και δείγματα. Αναδεύστε.
3. Επωάστε 3 ώρες ± 10 λεπτά σε 20–28°C.
4. Πλύνετε 4 φορές με Wash Buffer (Ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης) 1X.
5. Προσθέστε 150 µL Working Substrate Solution σε 20–28°C.
6. Επωάστε 30 ± 5 λεπτά σε 20–28°C.
7. Προσθέστε 100 µL Stop Solution (∆ιάλυμα διακοπής) και διαβάστε την οπτική πυκνότητα στα 405 nm.
ΠΡΟΟΡΙΖΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ
Ο ανοσοπροσδιορισμός Metra BAP παρέχει ποσοτική μέτρηση της ενεργότητας της ειδικής για τα οστά αλκαλικής φωσφατάσης
(BAP) στον ορό ως δείκτη της οστεοβλαστικής δραστηριότητας. Η μέτρηση της BAP προορίζεται να χρησιμοποιηθεί ως βοήθεια στη:
� διαχείριση της μετεμμηνοπαυσικής οστεοπόρωσης και της νόσου Paget
� παρακολούθηση των μετεμμηνοπαυσιακών γυναικών σε ορμονική θεραπεία ή θεραπεία διφωσφονικών.
� πρόβλεψη της ανταπόκρισης του σκελετού σε ορμονική θεραπεία στις μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες
ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΚΑΙ ΕΞΗΓΗΣΗ
Η σκελετική ή ειδική για το οστό ισομορφή της αλκαλικής φωσφατάσης είναι τετραμερής γλυκοπρωτεΐνη που βρίσκεται στην
κυτταρική επιφάνεια των οστεοβλαστών. 1 Οι οστεοβλάστες είναι κύτταρα που ευθύνονται για τη σύνθεση νέας μεσοκυττάριας ουσίας
των οστών και για την εναπόθεση ανόργανων αλάτων σε αυτά. Η λειτουργία της BAP δεν έχει διαλευκανθεί πλήρως, μολονότι ο ρόλος
της στην εναπόθεση ανόργανων αλάτων στο σκελετό έχει επιβεβαιωθεί. 1,2,3
Τα οστά υποβάλλονται διαρκώς σε μεταβολική διαδικασία που ονομάζεται ανάπλαση . 3,4 Αυτή συμπεριλαμβάνει την απορρόφηση,
μία διαδικασία αποικοδόμησης του οστού, στην οποία μεσολαβεί η δράση των οστεοκλαστών, και την οστεογένεση, μία διαδικασία
δόμησης, στην οποία μεσολαβεί η δράση των οστεοβλαστών. 3,4 Η ανάπλαση απαιτείται για τη συντήρηση και τη γενικότερη υγεία του
οστού ενώ οι δύο διαδικασίες είναι στενά συνδεδεμένες, δηλαδή η απορρόφηση και η οστεογένεση βρίσκονται σε ισορροπία. 3,4 Σε μη
φυσιολογικές καταστάσεις μεταβολισμού των οστών, η διαδικασία αυτή παύει να αποτελεί ζεύγος και όταν η απορρόφηση ξεπερνά
την οστεογένεση το αποτέλεσμα είναι η καθαρή απώλεια οστού, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε οστεοπόρωση 3,4 ή σε διαταραγμένο
οστικό ιστό από κακώσεις της νόσου Paget. 5 Η μέτρηση ειδικών βιοχημικών δεικτών αυτών των διαδικασιών ανάπλασης παρέχει
αναλυτικά δεδομένα σχετικά με το ρυθμό του μεταβολισμού των οστών ή της “ανακύκλωσης”. 3,4
Η οστεοπόρωση είναι μία νόσος του μεταβολισμού των οστών, που χαρακτηρίζεται από παθολογική ανάπλαση. Είναι μία νόσος
του περιφερικού σκελετού, που χαρακτηρίζεται από χαμηλή οστική μάζα και αποσύνθεση της μικροαρχιτεκτονικής του οστικού
ιστού, η οποία έχει ως συνέπεια την αύξηση της ευαισθησίας σε κατάγματα. 6 Ο πιο κοινός τύπος οστεοπόρωσης εμφανίζεται σε
μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες ως αποτέλεσμα της ανεπάρκειας οιστρογόνων που προέρχεται από την παύση λειτουργίας των
ωοθηκών. 3 Η επιστροφή στα επίπεδα οιστρογόνων προ της εμμηνόπαυσης με θεραπεία αντικατάστασης παρεμποδίζει την απώλεια
οστού και την οστεοπόρωση. 3,6 Τα οιστρογόνα και μία κατηγορία σκευασμάτων γνωστά ως διφωσφονικά είναι αντιαπορροφητικές
θεραπείες, που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να παρεμποδίσουν την απώλεια οστού ή να θεραπεύσουν την οστεοπόρωση. 3,6,7
Η οστεοπόρωση μπορεί επίσης να προκληθεί από την αδυναμία απόκτησης επαρκούς μέγιστης οστικής μάζας κατά τα χρόνια
της ανάπτυξης, από μια ηλικιακά σχετιζόμενη διαταραχή της οστικής ανάπλασης, στην οποία παρατηρείται υπερβολική οστική
απορρόφηση, και από μία σειρά κλινικών καταστάσεων και θεραπειών, οι οποίες προκαλούν απώλεια οστού ή διαταραχές στην
ανάπλαση οστού. 3 Αυτές συμπεριλαμβάνουν ασθένειες του ενδοκρινικού συστήματος, όπως υπογοναδισμό, υπερθυρεοειδισμό,
υπερπαραθυρεοειδισμό, νεφρική ανεπάρκεια, καρκίνους με μεταστάσεις στα οστά, γαστρεντερικές παθήσεις που σχετίζονται με
τη διατροφή και το μεταβολισμό των ανόργανων αλάτων, ασθένειες του συνδετικού ιστού, πολλαπλά μυελώματα, χρονία ακινησία,
αλκοολισμό ή χρήση καπνού και χρόνια θεραπεία με ηπαρίνη ή κορτικοστεροειδή. 3
Η νόσος των οστών Paget είναι εστιακή διαταραχή, που προκαλεί πόνο και σκελετικές παραμορφώσεις σε συμπτωματικούς ασθενείς. 5
Οι κακώσεις της νόσου Paget χαρακτηρίζονται από μεσοκυττάρια ουσία οστών με ιδιαίτερα παθολογική δομή, που οφείλεται στον
υπερβολικό ρυθμό της αναπλαστικής δραστηριότητας. Οι κακώσεις εμφανίζονται κυρίως στο κρανίο, στη σπονδυλική στήλη, στην
πύελο και στα επιμήκη οστά και μπορεί να έχουν ως αποτέλεσμα κατάγματα και νευρολογική αναπηρία. 5 Η αιτιολογία της νόσου Paget
είναι άγνωστη αλλά υπάρχουν υποθέσεις που αφορούν γενετικούς και ιογενείς παράγοντες. 5 Επί του παρόντος, χρησιμοποιούνται
διφωσφονικά και καλσιτονίνη για την καταστολή του υψηλού ρυθμού βιοχημικής δραστηριότητας σε φυσιολογικά επίπεδα, γεγονός
που καθιστά εφικτή την αποκατάσταση της φυσιολογικής δομής του οστού. 9
Ως ποσοτική μέτρηση ενός δείκτη οστικής ανακύκλωσης, η BAP παρέχει χρήσιμες πληροφορίες σχετικά με την ανάπλαση
οστών στην οστεοπόρωση και στη νόσο Paget και σχετικά με τις μεταβολές της δραστηριότητας της νόσου, που προκαλούνται
από αντιαπορροφητική θεραπεία. 10-12 Η ανάλυση της BAP με τη μέθοδο Metra χρησιμοποιεί τεχνολογία αντισωμάτων για την
παραγωγή μονοκλωνικού αντισώματος, που δείχνει ειδικότητα έναντι της BAP. 10 Η ειδικότητα του μονοκλωνικού αντισώματος που
χρησιμοποιείται στην ανάλυση επιτρέπει την απλή, εύκολη, άμεση και επαναλήψιμη ποσοτική εκτίμηση της ενεργότητας της BAP
στον ορό.
ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ
Η Metra BAP είναι ανοσοπροσδιορισμός σε μορφή ταινίας μικροτίτλου που χρησιμοποιεί μονοκλωνικά anti-BAP αντισώματα τα
οποία βρίσκονται επιχρισμένα στην ταινία για να λάβει τη BAP του δείγματος. Η δραστικότητα του ενζύμου της ληφθείσας BAP
ανιχνεύεται με υπόστρωμα pNPP.
81

ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΚΑΙ ΥΛΙΚΑ
96 Αναλύσεις για ειδική για τα οστά αλκαλική φωσφατάση
Η Metra BAP EIA περιέχει τα παρακάτω:
A BAP Standards A - F Μέρη 4395 έως 4400 0,3 mL το καθένα
B (A = 0, B = 2, C = 20, D = 50, E = 80, F = 140 U/L BAP)
C BAP απομονωμένη από κύτταρα οστεοσαρκώματος SAOS-2 σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει ως χλωριούχο μαγνήσιο, θειικό
D ψευδάργυρο, τασιενεργό παράγοντα, πρωτεΐνη-φορέα, μπλε χρωστική και αζίδιο του νατρίου (0,05%) ως συντηρητικό.
E
F
L Low/High Controls Μέρη 4401, 4402 0,3 mL το καθένα
H (Μάρτυρες Low/High)
BAP απομονωμένη από κύτταρα οστεοσαρκώματος SAOS-2 σε ρυθμιστικό διάλυμα, που περιέχει χλωριούχο μαγνήσιο, θειικό
ψευδάργυρο, τασιενεργό παράγοντα, πρωτεΐνη-φορέα, μπλε χρώση και αζίδιο του νατρίου (0,05%) ως συντηρητικό.
q Coated Strips Μέρος 4660 12 τεμάχια
(Επιχρισμένες ταινίες)
Καθαρισμένο μονοκλωνικό αντίσωμα Anti-BAP IgG ποντικιού προσροφημένο στις ταινίες.
w Stop Solution Μέρος 4702 15 mL
NaOH 0,5N
e 10X Wash Buffer Μέρος 4703 55 mL
Μη ιοντικό απορρυπαντικό σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει αζίδιο του νατρίου (0,05%) ως συντηρητικό.
r Assay Buffer Μέρος 4403 27 mL
Ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει χλωριούχο μαγνήσιο, θειικό ψευδάργυρο, τασιενεργό παράγοντα και αζίδιο του νατρίου
(0,05%) ως συντηρητικό.
t Substrate Buffer Μέρος 4404 3 x 10 mL
∆ιάλυμα 2-αμινο-2-μεθυλ-1-προπανόλης που περιέχει χλωριούχο μαγνήσιο, θειικό ψευδάργυρο και αζίδιο του νατρίου (0,05%)
ως συντηρητικό.
y Substrate Tablets Μέρος 0012 3 x 20 mg
(∆ισκία υποστρώματος)
p-φωσφορικό νιτροφαινύλιο
ΥΛΙΚΑ ΠΟΥ ΑΠΑΙΤΟΥΝΤΑΙ ΑΛΛΑ ΔΕΝ ΠΑΡΕΧΟΝΤΑΙ
Μικροπιπέττες για χορήγηση 20 µL και 100–300 µL
Αντικείμενα κατάλληλα για μέτρηση υγρών όγκου 100–300 mL
∆οχείο για αραίωση ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης
Απιονισμένο ή αποσταγμένο νερό
Συσκευή για ανάγνωση οπτικής πυκνότητας πλακών στα A405 > 2,0
Λογισμικό με ικανότητα χάραξης δευτεροβάθμιας καμπύλης βαθμονόμησης
ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ
1. Για διαγνωστική χρήση In Vitro.
2. Αντιμετωπίστε τα αντιπροσωπευτικά δείγματα ως ενδεχομένως βιολογικά επικίνδυνα υλικά. Ακολουθήστε τις Γενικές
Προφυλάξεις, όταν χειρίζεστε περιεχόμενα αυτού του κιτ και δείγματα ασθενών.
3. Απαλλαχθείτε από τα δοχεία και τα μη χρησιμοποιημένα περιεχόμενά τους σύμφωνα με τις ομοσπονδιακές, κρατικές και τοπικές
ρυθμιστικές απαιτήσεις.
4. Χρησιμοποιήστε τα παρεχόμενα αντιδραστήρια ως ολοκληρωμένη μονάδα πριν από την ημερομηνία λήξης, που αναγράφεται
στην ετικέτα της συσκευασίας.
5. Φυλάξετε τα αντιδραστήρια ανάλυσης όπως ορίζεται.
6. Μη χρησιμοποιείτε τα Coated Strips, αν ο σάκος είναι διάτρητος.
7. Ελέγξτε κάθε δείγμα διπλά.
8. Το NaOH 0,5N θεωρείται διαβρωτικό και μπορεί να προκαλέσει σοβαρά εγκαύματα. Αποφύγετε την κατάποση. Αποφύγετε την
επαφή με το δέρμα, τα μάτια ή τα ρούχα. Αν υπάρξει επαφή, πλύνετε με νερό. Αν ληφθεί από το στόμα, καλέστε γιατρό.
9. Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Η τυχαία επαφή ή κατάποση ρυθμιστικών διαλυμάτων που περιέχουν
αζίδιο του νατρίου ενδέχεται να προκαλέσει ερεθισμό στο δέρμα, στα μάτια ή στο στόμα. Χρησιμοποιείτε ρυθμιστικά διαλύματα
για τους συγκεκριμένους μόνο σκοπούς και αποφύγετε την επαφή με οξέα. Το αζίδιο του νατρίου ενδεχομένως αντιδρά με
υδραυλικές σωληνώσεις από μόλυβδο ή χαλκό και πιθανόν να σχηματίσει ιδιαίτερα εκρηκτικά αζίδια μετάλλων. Κατά την
απόρριψη ξεπλύνετε με άφθονο νερό για να παρεμποδιστεί η δημιουργία αζιδίων.
10. Το ρυθμιστικό διάλυμα υποστρώματος περιέχει 2-αμινο-2-μεθυλ-1-προπανόλη και ενδέχεται να προκαλεί ερεθισμό στα
μάτια ή/και στο δέρμα μετά από παρατεταμένη επαφή. Φοράτε κατάλληλο προστατευτικό ιματισμό, γάντια και προστασία
ματιών/προσώπου. Οι περιοχές που έχουν προσβληθεί πρέπει να πλένονται αμέσως με σαπούνι και νερό.
11. Συνιστάται η χρήση πολυκαναλικών ή επαναληπτικών πιπεττών για την εξασφάλιση έγκαιρης χορήγησης αντιδραστηρίων.
12. Για την ακριβή μέτρηση δειγμάτων προσθέστε με ακρίβεια δείγματα και πρότυπα. Λάβετε με πιπέττα χρησιμοποιώντας μόνο
βαθμονομημένα όργανα.
82

13. Αραιώστε δείγματα με συγκέντρωση μεγαλύτερη από 140 U/L σε Assay Buffer και επαναλάβετε τον έλεγχο. Συμπεριλάβετε το
συντελεστή αραίωσης στον τελικό υπολογισμό.
14. Η ανάλυση αυτή μπορεί να διεξαχθεί με οποιαδήποτε αξιόπιστη μέθοδο πλύσης.
ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ
Πριν τη χρήση τα αντιδραστήρια και τα υλικά για την ανάλυση πρέπει να έλθουν σε θερμοκρασία 20–28°C.
Μετά την αφαίρεση των απαιτούμενων αντιδραστηρίων και υλικών, επιστρέψτε τα μη χρησιμοποιημένα
αντικείμενα σε θερμοκρασία 2–8°C.
Coated Strips
Αφαιρέστε το Stripwell Frame και τον απαιτούμενο αριθμό Coated Strips από το σάκο (βλ. πίνακα στην ενότητα ∆ΙΑ∆ΙΚΑΣΙΑ ΑΝΑΛΥΣΗΣ).
Βεβαιωθείτε ότι ο σάκος που περιέχει όλες τις μη χρησιμοποιημένες ταινίες σφραγίστηκε ξανά.
Wash Buffer
Παρασκευάστε την απαιτούμενη ποσότητα 1X Wash Buffer (βλ. πίνακα) αραιώνοντας πυκνό Wash Buffer 10X με απιονισμένο νερό σε
αναλογία 1:10. Φυλάξτε στους 20–28°C. Χρησιμοποιήστε το Wash Buffer 1X μέσα σε 21 μέρες από την παρασκευή.
∆ιάλυμα υποστρώματος εργασίας
Παρασκευάστε το Working Substrate Solution μία ώρα πριν τη χρήση. Τοποθετήστε ένα δισκίο υποστρώματος σε κάθε απαιτούμενη
φιάλη Substrate Buffer θερμοκρασίας δωματίου (βλ. πίνακα). Αφήστε 30-60 λεπτά για να διαλυθεί το δισκίο (ή τα δισκία).
Ανακινήστε τη φιάλη έντονα για να αναμειχθεί καλά το περιεχόμενο. Μετά τη χρήση απαλλαγείτε από το υπολειπόμενο Working
Substrate Solution.
ΦΥΛΑΞΗ
Φυλάξτε το κιτ στους 2–8°C. Μην καταψύχετε. Φυλάξτε τα μη χρησιμοποιημένα αντιδραστήρια στους 2–8°C. Πριν τη χρήση
εξισορροπήστε τα αντιδραστήρια στους 20–28°C. Φυλάξτε το Wash Buffer 1X (αραιωμένο 10X) στους 20–28°C.
ΣΥΛΛΟΓΗ ΚΑΙ ΦΥΛΑΞΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ
Συλλέξτε ορό χρησιμοποιώντας την τυπική τεχνική φλεβοπαρακέντησης. Τα δείγματα πρέπει να συλλέγονται χωρίς αντιθρομβωτικά
και με τρόπο ώστε να αποφεύγεται η αιμόλυση. Αφήστε το αίμα να πήξει και διαχωρίστε τον ορό με φυγοκέντρηση. Ο ορός μπορεί να
αποθηκευτεί για 5 μέρες στους 2–8°C, για 12 μήνες στους ≤ -40°C ή για 36 μήνες στους ≤ -80°C. Μην υποβάλλετε τα δείγματα σε
περισσότερους από 3 κύκλους ψύξης/τήξης.
Ο ορός “Off the clot”, ο διαχωριστής ορού, το πλάσμα ηπαρίνης Na και ηπαρίνης Li παρέχουν ουσιαστικά ισοδύναμα αποτελέσματα.
Συνιστάται τα δείγματα πλάσματος να μην παρασκευάζονται με χρήση χηλικών παραγόντων όπως το EDTA ή άλατα κιτρικού οξέος.
ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΑΝΑΛΥΣΗΣ
Πριν ξεκινήσετε την ανάλυση διαβάστε ολόκληρο το ένθετο του προϊόντος.
Πριν προχωρήσετε βλ. το τμήμα ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΩΝ.
Προσδιορίστε την ποσότητα κάθε αντιδραστηρίου που απαιτείται για τον αριθμό ταινιών που θα
χρησιμοποιηθούν.
Αριθμός ταινιών 4 6 8 12
Αριθμός δειγμάτων 8 16 24 40
(ελέγχονται εις διπλούν)
Υπόστρωμα (φιάλη) 1 1 2* 2*
Wash Buffer 1X (mL) 100 150 200 300
*Αν χρησιμοποιηθεί πάνω από μία φιάλη ή φιαλίδιο, προσθέστε τα περιεχόμενα και αναμίξτε πριν τη χρήση.
Επώαση δείγματος
1. Πριν τη χρήση αφαιρέστε το Stripwell Frame και τον απαιτούμενο αριθμό Coated Strips από το σάκο (βλ. τον πίνακα).
Βεβαιωθείτε ότι ο σάκος που περιέχει όλες τις μη χρησιμοποιημένες ταινίες σφραγίστηκε ξανά πλήρως.
2. Τοποθετήστε τον επιθυμητό αριθμό Coated Strips στο Stripwell Frame. Σημειώστε τις ταινίες με ετικέτα για να αποφύγετε τη
σύγχυση σε περίπτωση απομάκρυνσης από το Stripwell Frame.
3. Προσθέστε 125 µL Assay Buffer σε κάθε πηγαδάκι.
4. Προσθέστε 20 µL Standard, Control ή δείγμα σε κάθε πηγαδάκι. Μην αναμίξετε με Assay Buffer με επαναλαμβανόμενη
μεταφορά με πιπέττα. Το βήμα αυτό πρέπει να ολοκληρωθεί μέσα σε 30 λεπτά. Στροβιλίστε τις ταινίες ελαφρά για να
βεβαιωθείτε ότι το δείγμα και το ρυθμιστικό διάλυμα αναμείχθηκαν.
5. Επωάστε για 3 ώρες (± 10 λεπτά) στους 20–28°C.
6. Παρασκευάστε το Working Substrate Solution μία ώρα πριν τη χρήση. Τοποθετήστε ένα δισκίο υποστρώματος σε κάθε
απαιτούμενη φιάλη Substrate Buffer θερμοκρασίας δωματίου (βλ. τον πίνακα). Αφήστε 30–60 λεπτά για να διαλυθεί το δισκίο
(ή τα δισκία). Ανακινήστε τη φιάλη έντονα για να αναμειχθεί καλά το περιεχόμενο.
Βήμα πλύσης
7. Παρασκευάστε την απαιτούμενη ποσότητα 1X Wash Buffer (βλ. τον πίνακα) αραιώνοντας Wash Buffer 10X με απιονισμένο
νερό σε αναλογία 1:10. Φυλάξτε στους 20–28°C. Χρησιμοποιήστε το Wash Buffer 1X μέσα σε 21 μέρες από την παρασκευή.
8. Αντιστρέψτε/αδειάστε τις ταινίες χειροκίνητα. Προσθέστε τουλάχιστον 250 µL 1X Wash Buffer σε κάθε πηγαδάκι και
αντιστρέψτε/αδειάστε τις ταινίες χειροκίνητα. Επαναλάβετε άλλες τρεις φορές, δηλ. συνολικά τέσσερις πλύσεις. Μετά την
τελευταία πλύση στεγνώστε τις ταινίες καλά σε χάρτινες πετσέτες.
83

Επώαση υποστρώματος
9. Προσθέστε 150 µL Working Substrate Solution σε κάθε πηγαδάκι. Μετά τη χρήση απαλλαγείτε από το υπολειπόμενο Working
Substrate Solution.
10. Επωάστε για 30 λεπτά (± 5 λεπτά) στους 20–28°C.
Παύση/ανάγνωση
11. Προσθέστε 100 µL Stop Solution σε κάθε πηγαδάκι. Προσθέστε το Stop Solution με τον ίδιο τρόπο και στα ίδια χρονικά
διαστήματα που προσθέσατε το Substrate Solution.
12. ∆ιαβάστε την οπτική πυκνότητα στα 405 nm. Βεβαιωθείτε ότι δεν υπάρχουν μεγάλες φυσαλίδες στα πηγαδάκια και ότι το κάτω
μέρος των ταινιών είναι καθαρό. Οι ταινίες πρέπει να διαβαστούν μέσα σε 15 λεπτά από την προσθήκη του Stop Solution.
13. Το λογισμικό ποσοτικής εκτίμησης με εξίσωση καμπύλης βαθμονόμησης δευτέρου βαθμού πρέπει να χρησιμοποιηθεί για την
ανάλυση των αποτελεσμάτων ανάλυσης Metra BAP.
Εξίσωση: y = A + Bx + Cx 2
ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ
Το πιστοποιητικό ανάλυσης που υπάρχει στο κιτ αφορά τη συγκεκριμένη παρτίδα και χρησιμοποιείται για να επιβεβαιωθεί ότι τα
αποτελέσματα που αποκτήθηκαν από το εργαστήριό σας είναι ίδια με αυτά που αποκτήθηκαν από την Quidel. Οι τιμές οπτικής
πυκνότητας παρέχονται και χρησιμοποιούνται μόνο ως κατευθυντήρια οδηγία. Τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από το εργαστήριό
σας μπορεί να διαφέρουν.
Παρέχεται το εύρος ποιοτικού ελέγχου. Οι τιμές ελέγχου προορίζονται για να επιβεβαιωθεί η εγκυρότητα της καμπύλης και τα
αποτελέσματα του δείγματος. Κάθε εργαστήριο πρέπει να καθιερώνει τις δικές του παραμέτρους για αποδεκτά όρια ανάλυσης.
Αν οι τιμές ελέγχου ∆ΕΝ κυμαίνονται εντός των ορίων αποδοχής του εργαστηρίου σας, τα αποτελέσματα της ανάλυσης πρέπει να
θεωρηθούν αμφισβητήσιμα και τα δείγματα πρέπει να επαναληφθούν.
Αν η οπτική πυκνότητα του Προτύπου F Metra BAP είναι μικρότερη από 1,0, τα αποτελέσματα πρέπει να θεωρηθούν αμφισβητήσιμα
και τα δείγματα πρέπει να επαναληφθούν.
ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ
Τα αποτελέσματα των δειγμάτων εκφράζονται ως U/L και δεν χρειάζονται διόρθωση για την αραίωση (εκτός αν το δείγμα αραιώθηκε
πριν τη δοκιμασία).
Στην ανάλυση Metra BAP, η 1 μονάδα αντιπροσωπεύει 1 µmol pNPP υδρολυόμενο ανά λεπτό στους 25°C σε ρυθμιστικό διάλυμα
2-αμινο-2-μεθυλ-1-προπανόλης.
Αντιπροσωπευτική τυπική καμπύλη
Τυπικά επίπεδα BAP: 0, 2, 20, 50, 80, 140 U/L
ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ
Παρεμβολή HAMA
Ορισμένα άτομα έχουν αντισώματα στα αντισώματα ποντικιού (HAMA), η οποία μπορεί να προκαλέσει παρεμβολές στον
ανοσοπροσδιορισμό που αφορά αντισώματα, τα οποία προέρχονται από ποντίκια. Συγκεκριμένα, έχει αναφερθεί ότι δείγματα ορού
από ασθενείς που έχουν υποστεί θεραπεία ή διαγνωστικές διαδικασίες που συμπεριλαμβάνουν ένεση μονοκλωνικού αντισώματος
ποντικιού μπορεί να προκαλέσουν εσφαλμένα αποτελέσματα. Τα αποτελέσματα της Metra BAP για τέτοιους ασθενείς πρέπει για
το λόγο αυτό να χρησιμοποιούνται μόνο σε συνδυασμό με αποτελέσματα από κάποιες άλλες διαγνωστικές διαδικασίες και με
πληροφορίες που είναι διαθέσιμες από την κλινική αξιολόγηση του ασθενούς.
∆είγματα με σημαντικά αυξημένη ενεργότητα της αλκαλικής φωσφατάσης του ήπατος μπορεί να προκαλέσουν παρεκκλίνοντα υψηλά
αποτελέσματα στην ανάλυση Metra BAP.
Ασθενείς, που πάσχουν από τη νόσο Paget και έχουν χαμηλά επίπεδα ασθένειας, μπορεί να εμφανίζουν επίπεδα ειδικής για τα οστά
αλκαλικής φωσφατάσης, που να κυμαίνονται εντός του εύρους αναφοράς της Metra BAP.
84
3,0
2,0
1,0
0,0
0 25 50 75 100 125 150
BAP (U/L)

ΤΙΜΈΣ ΔΕΙΓΜΆΤΩΝ
Έχουν οριστεί διαστήματα αναφοράς BAP για υγιείς άνδρες ηλικίας 25 ετών (n = 126), για υγιείς προεμμηνοπαυσικές γυναίκες μεταξύ
25 και 44 ετών (n = 178) και για υγιείς γυναίκες μετά την εμμηνόπαυση (n = 107). Για λόγους ορισμού διαστημάτων αναφοράς, ως
φυσιολογικά άτομα ορίστηκαν:
� Τυπικώς υγιή, χωρίς παθήσεις των οστών, ενδοκρινικές ή χρόνιες παθήσεις
� Ομαλό έμμηνο κύκλο (σε προεμμηνοπαυσικές γυναίκες)
� Όχι έγκυες ή θηλάζουσες (γυναίκες)
� Χωρίς να λαμβάνουν επί του παρόντος φάρμακα που είναι γνωστό ότι επηρεάζουν το μεταβολισμό των οστών.
Οι τιμές μπορεί να επηρεάζονται από παράγοντες όπως χαμηλή παραγωγή οιστρογόνων, χαμηλή πρόσληψη ασβεστίου ή χαμηλή
σωματική δραστηριότητα. 8 Η ανεπάρκεια οιστρογόνων σε γυναίκες μετά την εμμηνόπαυση μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα την
αυξημένη ανακύκλωση οστών. 3,4 Κάθε εργαστήριο θα πρέπει να καθορίσει το δικό του διάστημα τιμών αναφοράς. Το εύρος
εκφράζεται ως μη παραμετρικά διαστήματα αναφοράς (διαστήματα εμπιστοσύνης 90%).
Ηλικία (Έτη) Εύρος (U/L) Μέσος
Γυναίκες 25 – 44 Προεμμηνοπαυσικές 11,6 – 29,6 18,3
Γυναίκες ≥ 45 Μετεμμηνοπαυσικές 14,2 – 42,7 25,0
Aντρες ≥ 25 15,0 – 41,3 23,2
ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ
Προδιαγραφές αντισώματος
Το αντίσωμα της ειδικής για τα οστά αλκαλικής φωσφατάσης παρουσιάζει επιλεκτική, υψηλή συγγένεια προς την ισομορφή που είναι
ειδική για τα οστά, χαμηλή διαντιδραστικότητα με την ηπατική μορφή αλκαλικής φωσφατάσης και αμελητέα πρόσδεση με εντερικά
και ισοένζυμα του πλακούντα.
Ισοένζυμο AP % Αντιδραστικότητα
Οστό 100
Ήπαρ 3 – 8
Πλακούντιο 0
Εντερικό 0,4
Ευαισθησία
Το ελάχιστο όριο ανίχνευσης της ανάλυσης Metra BAP είναι 0,7 U/L, το οποίο καθορίζεται από το ανώτατο όριο 3 SD σε μελέτη
ακριβείας μηδενικού προτύπου.
Ανάκτηση – Ανάκτηση Spike
Η ανάκτηση του spike (=επιπλέον ποσότητα που προστίθεται στην ήδη υπάρχουσα ποσότητα του δείγματος) καθορίζεται
προσθέτοντας μία γνωστή ποσότητα καθαρισμένης BAP στα δείγματα ορού με διαφορετικά επίπεδα ενδογενούς BAP. Τα τυπικά
αποτελέσματα προκύπτουν μετά την προσθήκη επιπλέον ποσότητας στην ήδη υπάρχουσα στα δείγματα ορού με χαμηλές, μέτριες
και υψηλές συγκεντρώσεις BAP και αναλύοντας εις τριπλούν.
Ενδογενής (U/L) Πρόσθετη (U/L) Παρατηρημένη (U/L) Ανάκτηση (%)
13,4 15,7 29,1 99
17,6 37,5 55,3 99
27,2 57,2 88,1 106
Ανάκτηση - Γραμμικότητα
Η γραμμικότητα καθορίζεται με διαδοχική αραίωση δειγμάτων και σύγκριση ανάμεσα στις παρατηρούμενες και αναμενόμενες τιμές.
Τα τυπικά αποτελέσματα δίνονται παρακάτω.
∆είγμα Συντελεστής αραίωσης Παρατηρημένη (U/L) Αναμενόμενη (U/L) Ανάκτηση (%)
1 neat 108,5 - -
1:2 51,1 54,2 94
1:4 25,8 27,1 99
1:6 18,0 18,1 99
2 neat 39,1 - -
1:2 20,1 19,5 103
1:4 10,3 9,8 105
1:6 6,7 6,5 103
3 neat 58,4 - -
1:2 29,9 29,2 102
1:4 15,7 14,6 108
1:6 9,7 9,7 100
85

Ακρίβεια
Η ακρίβεια εντός του ιδίου κύκλου προσδιορίστηκε για ≥ 21 επαναλήψεις 3 δειγμάτων σε 3 πλάκες σε κάθε μία από 3 παρτίδες
κιτ (συνολικά 9 πλάκες). Η ακρίβεια μεταξύ των κύκλων προσδιορίστηκε αναλύοντας 3 δείγματα σε 6 ξεχωριστές πλάκες σε κάθε
μία από 3 παρτίδες κιτ (συνολικά 18 πλάκες). Τα τυπικά αποτελέσματα δίνονται παρακάτω.
∆είγμα BAP (U/L BAP) Εντός του κύκλου 1 CV% Μεταξύ των κύκλων 2 CV%
1 12 5,8 5,2
2 35 3,9 7,6
3 100 5,2 5,0
1 n = 21 2 n = 6 κύκλοι
Παρεμβαλλόμενα υποστρώματα
Τα παρακάτω υποστρώματα δοκιμάστηκαν στις προσδιορισμένες συγκεντρώσεις και βρέθηκε ότι δεν παρεμβάλλονται στην ανάλυση.
Υπόστρωμα Συγκέντρωση
Αιμοσφαιρίνη 500 mg/dL
Χολερυθρίνη 25 mg/dL
Τριγλυκερίδια 1.420 mg/dL
Συνολική πρωτεΐνη 6,0 g/dL †
Συνολική πρωτεΐνη 15,6 g/dL †
Συνολική πρωτεΐνη 6,0 g/dL ‡
Συνολική πρωτεΐνη 15,6 g/dL ‡
† Πρωτεΐνη με νερό
‡ Πρωτεΐνη με BAP (συγκέντρωση BAP= 43,6 U/L)
Παρεμβολές φαρμάκων
Προστέθηκαν διαφορετικές συγκεντρώσεις φαρμάκων σε τρεις ξεχωριστές δεξαμενές ορού, που περιείχαν περίπου 35, 70,
και 105 U/L BAP και αναλύθηκαν εις τριπλούν. Τα φάρμακα και οι υψηλότερες συγκεντρώσεις που ελέγχθηκαν ήταν:
Ουσία Υψηλότερη συγκέντρωση
Etidronate 350 µg/mL
Οιστρογόνα 100 µg/mL
Ibuprofen 150 µg/mL
Acetominophen 350 µg/mL
Ασπιρίνη 350 µg/mL
Καλσιτονίνη- ανθρώπου 80 µg/mL
Καλσιτονίνη- σολομού 80 µg/mL
Ασβέστιο 500 µg/mL
Μείγμα οιστραδιόλης norethindrone/ethynil 3 mg/mL
(αντισυλληπτικό για λήψη από το στόμα)
Βιταμίνη D 400 IU/mL
Ακρίβεια
Έγιναν συγκριτικές μελέτες για να εκτιμηθούν οι συσχετίσεις ανάμεσα στις μετρήσεις της ειδικής για τα οστά αλκαλικής φωσφατάσης
στον ορό (BAP), που ελήφθησαν με χρήση της ανάλυσης Metra BAP, και στα αποτελέσματα, που ελήφθησαν με χρήση τριών μεθόδων
μέτρησης της συνολικής αλκαλικής φωσφατάσης (TAP) ή της BAP που κυκλοφορούν στην αγορά Οι μελέτες έγιναν σε ανεξάρτητο
κλινικό ερευνητικό περιβάλλον, χρησιμοποιώντας ορούς 114 ασθενών που πάσχουν από τη νόσο Paget και 464 υγιών ατόμων.
Η πρώτη συγκριτική μέθοδος ήταν μία χρωματομετρική τεχνική για τη μέτρηση της TAP. Ο συντελεστής συσχέτισης (r) ανάμεσα στη
χρωματομετρική μέθοδο και στην ανάλυση Metra BAP ήταν 0,99. Η δεύτερη συγκριτική μέθοδος ήταν μία μέθοδος ηλεκτροφόρησης
για τον προσδιορισμό των επιπέδων του ισοενζύμου BAP (r = 0,99). Η τρίτη συγκριτική μέθοδος ήταν μία ανοσοραδιομετρική
ανάλυση για τη μέτρηση της BAP (r = 0,99). Από τους 114 ασθενείς, στους οποίους έχει διαγνωστεί η νόσος Paget, οι 101
παρουσίαζαν τιμές υψηλότερες από το ανώτατο όριο των διαστημάτων αναφοράς της ανάλυσης Metra BAP. ∆εκατρείς ασθενείς
παρουσίαζαν τιμές χαμηλότερες από το ανώτατο όριο των διαστημάτων αναφοράς.
ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΜΕΛΕΤΕΣ
Χρήση της Metra BAP για παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας της αντιαπορροφητικής θεραπείας
στην οστεοπόρωση
Μία πολυκεντρική, τυχαιοποιημένη, ελεγχόμενη μελέτη διεξάχθηκε με επιτυχία για να εδραιωθεί η ασφάλεια και η
αποτελεσματικότητα της ανάλυσης BAP στην παρακολούθηση μεταβολών των συγκεντρώσεων BAP στον ορό, που σχετίζονται με την
αντιαπορροφητική θεραπεία αμινο-φωσφονικών αλενδρονικών). Τα άτομα, που επιλέχθηκαν από μία μεγαλύτερη μελέτη σχετικά
με την αποτελεσματικότητα των αλενδρονικών στη θεραπεία της οστεοπόρωσης, 7 ήταν γυναίκες μετά την εμμηνόπαυση ηλικίας
45 έως 84 ετών (μέσος όρος 64 ± 7 έτη), με διαγνωσμένη οστεοπόρωση (βασισμένη στην κλινική εικόνα ή με ποσότητα αναφοράς
της πυκνότητας ανόργανων αλάτων του οσφυϊκού οστού [LSBMD] χαμηλότερη από 2,5 τυπικές αποκλίσεις κάτω από το μέσο όρο των
ώριμων προεμμηνοπαυσικών γυναικών). Πριν την έναρξη της μελέτης, τα άτομα που πληρούσαν τις προϋποθέσεις τυχαιοποιήθηκαν
ως προς τη λήψη είτε 10 mg αλενδρονικών και 500 mg ασβεστίου ημερησίως (ALN), είτε placebo και 500 mg ασβεστίου ημερησίως
(CTL). Τα δείγματα ορού από όλα τα άτομα λήφθηκαν κατά την έναρξη, στους 3, 6 και 12 μήνες.
86

Η μέση (± 1SD) συγκέντρωση BAP κατά την έναρξη (14,6 ± 5,4 έναντι 14,6 ± 4,6, p = 0,900) και της LSBMD (0,74 ± 0,10 έναντι
0,75 ± 0,09, p = 0,751) παρουσίαζαν παρόμοιες τιμές για τις ομάδες ALN και CTL. Οι κατανομές των τιμών BAP κατά την έναρξη στις
ομάδες ALN και CTL απεικονίζονται στο ακόλουθο διάγραμμα ανάλογα με τον πληθυσμό της μελέτης.
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
< 4,0
4,0 – 5,9
Κατανομή των επιπέδων BAP κατά την έναρξη
6,0 – 7,9
8,0 – 9,9
10,0 – 11,9
Η BAP ήταν σημαντικά χαμηλότερη στην ALN από ότι στην CTL στους 3 (9,6 ± 3,5 έναντι 13,4 ± 4,0, p

88
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
Κατανομή της εκατοστιαίας μεταβολής στα επίπεδα BAP μετά από
θεραπεία 12 μηνών με αλενδρονικά (ALN) ή Ασβέστιο (CTL)
< -70,0%
-70,0 -60,1%
-60,0 -50,1%
-50,0 -40,1%
-40,0 -30,1%
Στους 12 μήνες, τα άτομα της ALN κέρδισαν LSBMD συγκριτικά με τα άτομα της CTL (p < 0,00001), όπως φαίνεται στον παρακάτω
πίνακα.
Μεταβολές στη LSBMD (Μέσος όρος ± Τυπική απόκλιση)
n Ποσότητα κατά την έναρξη (g/cm 2 ) 12 μήνες (g/cm 2 ) ∆ (%)
CTL 159 0,75 ± 0,09 0,74 ± 0,09 -0,6 ± 3,4
ALN 121 0,74 ± 0,10 0,79 ± 0,10 5,5 ± 4,1
Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η ανάλυση Metra BAP είναι ασφαλής και αποτελεσματική για την παρακολούθηση της
αντιαπορροφητικής επίδρασης της θεραπείας αμινο-διφωσφινικών (αλενδρονικών) στα άτομα που έχει διαγνωστεί οστεοπόρωση.
Χρήση της Metra BAP στην παρακολούθηση της ορμονικής αντιαπορροφητικής θεραπείας και στην
πρόβλεψη της σκελετικής ανταπόκρισης (Bone Mineral Density- Πυκνότητα ανόργανων αλάτων των
οστών) σε γυναίκες μετά την εμμηνόπαυση
Παρακολούθηση θεραπείας:
Μία πολυκεντρική, τυχαιοποιημένη ελεγχόμενη μελέτη διεξάχθηκε με επιτυχία για να εδραιωθεί η ασφάλεια και αποτελεσματικότητα
της ανάλυσης Metra BAP στην παρακολούθηση μεταβολών της συγκέντρωσης BAP στον ορό, που σχετίζονται με την
αντιαπορροφητική θεραπεία οιστρογόνου/προγεστίνης. Η αυξημένη ανακύκλωση οστών και η σημαντική απώλεια οστού συχνά
σχετίζονται με τη μετεμμηνοπαυσική ανεπάρκεια οιστρογόνου. Η αντικατάσταση οιστρογόνου έχει καταδειχθεί ότι μειώνει
αποτελεσματικά την ανακύκλωση των οστών και προστατεύει την υπάρχουσα οστική μάζα. 3,6 Τα άτομα ήταν γυναίκες μετά την
εμμηνόπαυση ηλικίας 45 έως 64 ετών (Μ.Ο. 56 ± 4 έτη), που έχουν υποστεί φυσική ή χειρουργική εμμηνόπαυση στο διάστημα των
10 τελευταίων ετών. Στη γραμμή αναφοράς, άτομα που πληρούν τις προϋποθέσεις, τυχαιοποιήθηκαν σε ομάδες ενεργής θεραπείας
(HRT): Premarin® (0,625 mg ημερησίως) με placebo προγεστίνης, Premarin® (0,625 mg ημερησίως) και ενεργή προγεστίνη
(Provera® 2,5 mg ανά ημέρα συνεχώς, Provera® 10 mg ανά ημέρα κυκλικά ή προγεστερόνη σε σκόνη 200 mg ανά ημέρα κυκλικά)
ή στην ομάδα ελέγχου (CTL): placebo οιστρογόνου και προγεστίνης. ∆είγματα ορού ελήφθησαν από όλα τα άτομα κατά την έναρξη
και στους 12 μήνες.
Η μέση (± 1SD) συγκέντρωση BAP κατά την έναρξη (20,7 ± 7,6 έναντι 20,3 ± 6,8U/L, p = 0,704) και της LSBMD (0,97 ± 0,17
έναντι 0,97 ± , 0,15 g/cm 2 , p = 0,970) ήταν ίδιες για CTL και HRT. Οι κατανομές των τιμών BAP κατά την έναρξη στις ομάδες HRT και
CTL απεικονίζονται στο ακόλουθο διάγραμμα ανάλογα με τον πληθυσμό της μελέτης.
-30,0 -20,1%
-20,0 -10,1%
-10,0 -0,1%
0,0 9,9%
10,0 19,9%
≥ 20,0%

30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
≤ 9,0
9,1 – 11
Κατανομή των επιπέδων BAP κατά την έναρξη
11,1 – 13
13,1 – 15
15,1 – 17
17,1 – 19
Η BAP ήταν σημαντικά χαμηλότερη στην ομάδα HRT συγκριτικά με τη CTL στους 12 μήνες (13,3 ± 5,0 έναντι 21,9 ± 7,9 U/L,
p < 0,00001). Οι κατανομές των τιμών BAP μετά από 12 μήνες στις ομάδες HRT και CTL απεικονίζονται στο παρακάτω διάγραμμα.
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
≤ 9,0
Κατανομή των επιπέδων BAP μετά από θεραπεία 12 μηνών
με οιστρογόνο/προγεστίνη (HRT) ή placebo (CTL)
9,1 – 11
11,1 – 13
13,1 – 15
15,1 – 17
Η μέση (± 1SD) συγκέντρωση BAP στα άτομα της CTL αυξήθηκε ελαφρά από την τιμή κατά την έναρξη σε +9,8% (± 33,2%) στους
12 μήνες (p = 0,08) ενώ οι συγκεντρώσεις BAP στα άτομα της HRT μειώθηκαν από την τιμή κατά την έναρξη σε –32,4 (± 21,5%)
στους 12 μήνες (p < 0,00001). Τα άτομα της ομάδας HRT ήταν πιο πιθανό από τα άτομα της CTL να εμφανίσουν απώλειες BAP,
που ξεπερνούν την ελάχιστη εκατοστιαία μεταβολή 12 , με 73,3% των ατόμων της HRT και 3,4% των ατόμων της CTL να εμφανίζουν
απώλεια ≥ 25% στους 12 μήνες. Οι κατανομές της εκατοστιαίας μεταβολής από την τιμή κατά την έναρξη στις τιμές BAP μετά από
12 μήνες στις ομάδες HRT και CTL απεικονίζονται στο παρακάτω διάγραμμα.
19,1 – 21
U/L BAP
17,1 – 19
19,1 – 21
U/L BAP
21,1 – 23
21,1 – 23
23,1 – 25
23,1 – 25
25,1 – 27
25,1 – 27
27,1 – 29
27,1 – 29
CTL
HRT
> 29
CTL
HRT
> 29
89

90
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
Κατανομή της εκατοστιαίας μεταβολής στα επίπεδα BAP μετά από θεραπεία
12 μηνών με οιστρογόνο/προγεστίνη (HRT) ή placebo (CTL)
< -70,0%
-70,0 -60,1%
-60,0 -50,1%
-50,0 -40,1%
-40,0 -30,1%
Στους 12 μήνες, τα άτομα της ομάδας HRT κέρδισαν LSBMD σε σχέση με τα άτομα της CTL (p

15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
-5,0%
-10,0%
Μελέτη HRT- Γραμμική παλινδρόμηση της εκατοστιαίας μεταβολής
των LSBMD και BAP από την ποσότητα αναφοράς στους 12 μήνες
-15,0%
-60,0% -40,0% -20,0%
Η ανάλυση του πίνακα παράπλευρων επιπτώσεων (Contingency) έδειξε ότι μία μείωση της BAP κατά ≥ 25% στους 12 μήνες
σχετίζεται σημαντικά (p < 0,0001) με τη θετική απόκριση του σκελετού στη HRT (αύξηση της BMD) στους 12 μήνες. Τα διωνυμικά
(προσέγγιση δευτέρου βαθμού) διαστήματα εμπιστοσύνης 85% για την ευαισθησία και την εξειδίκευση χρησιμοποίησης μίας μείωσης
25% της BAP για την πρόβλεψη της ανταπόκρισης στη HRT είναι:
Ευαισθησία = 77% (95% CI 75%, 82%). Εξειδίκευση= 61% (95% CI 41%, 78%).
Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η εκατοστιαία μεταβολή της συγκέντρωσης BAP μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην πρόβλεψη του
βαθμού ανταπόκρισης του σκελετού (BMD) στη θεραπεία HRT.
ΒΟΗΘΕΙΑ
Για παραγγελίες ή τεχνική υποστήριξη, επικοινωνήστε με τον αντιπρόσωπο Quidel στα τηλέφωνα +1 408-616-4301, ∆ευτέρα
έως Παρασκευή από 8:00 π.μ. έως 5:00 μ.μ., ώρα ∆υτικής Ακτής Ηνωμένων Πολιτειών. Παραγγελίες γίνονται επίσης με fax στο
+1 408-616-4310.
Για υπηρεσίες εκτός των ΗΠΑ παρακαλώ επικοινωνήστε με τον τοπικό διανομέα.
y = -0,060x + 0,011
r = 0,51
p < 0,001
0,0% 20,0% 40,0% 60,0%
91

REFERENCES
LITERATURVERWEISE
BIBLIOGRAFIA
RÉFÉRENCES
REFERENCIAS
BIBLIOGRAFIA
REFERENCER
REFERENSER
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ
1. Price CP. Multiple forms of human serum alkaline phosphatase: detection and quantitation. Ann.Clin.Biochem. 1993;30:
355-372.
2. Whyte MP. Hypophosphatasia and the role of alkaline phosphatase in skeletal mineralization. Endocr.Rev. 1994;15:439-461.
3. Riggs BL. Overview of osteoporosis. West.J.Med. 1991;154:63-77.
4. Garnero P, Delmas PD. Clinical usefulness of markers of bone remodeling in osteoporosis. In: Meunier PJ (ed.). Osteoporosis:
Diagnosis and management. London: Martin Dunitz, 1998:79-101.
5. Singer FR, Roodman GD. Paget’s disease of bone. In: Bilezikian JP, Raisz LG, Rodan GA (ed.). Principles of bone biology.
San Diego: Academic Press, 1996:969-977.
6. Consensus Development Statement. Who are candidates for prevention and treatment for osteoporosis? Osteoporos.Int.
1997;7:1-6.
7. Liberman UA, Weiss SR, Bröll J, et al. Effect of oral alendronate on bone mineral density and the incidence of fractures in
postmenopausal osteoporosis. N.Engl.J.Med. 1995;333:1437-1443.
8. Price CP, Thompson PW. The role of biochemical tests in the screening and monitoring of osteoporosis. Ann.Clin.Biochem.
1995;32:244-260.
9. Meunier PJ, Vignot E. Therapeutic strategy in Paget’s disease of bone. Bone 1995;17(Suppl.):489S-491S.
10. Gomez B, Jr., Ardakani S, Ju J, et al. Monoclonal antibody assay for measuring bone-specific alkaline phosphatase activity
in serum. Clin.Chem. 1995;41:1560-1566.
11. Pedrazzoni M, Alfano FS, Girasole G, et al. Clinical observations with a new specific assay for bone alkaline phosphatase:
A cross-sectional study in osteoporotic and pagetic subjects and a longitudinal evaluation of the response to ovariectomy,
estrogens, and bisphosphonates. Calcif.Tissue Int. 1996;59:334-338.
12. Garnero P, Shih WJ, Gineyts E, Karpf DB, Delmas PD. Comparison of new biochemical markers of bone turnover in late
postmenopausal osteoporotic women in response to alendronate treatment. J.Clin.Endocrinol.Metab. 1994;79:1693-1700.
13. Reid IR, Ames RW, Evans MC, Gamble GD, Sharpe SJ. Long-term effects of calcium supplementation on bone loss and fractures
in postmenopausal women: A randomized controlled trial. Am.J.Med. 1995;98:331-335.
14. Fraser CG. Data on biological variation: essential prerequisites for introducing new procedures? [Editorial] Clin.Chem.
1994;40:1671-1673.
15. Centers for Disease Control. Recommendations for prevention of HIV transmission in health-care settings. MMWR 1987;36
(suppl no. 2S):001.
92

���
�� ���
Manufactured by
Hergestellt von
Fabriqué par
Fabbricato da
Fabricado por
Fabricado por
Tillverkare
Fremstillet a
Κατασκευαστής
��� ���� � ������ ��� ��� ���
������ ����������� ����
������� �������
���������������������� ��
������� � ���
����� �������
����������������
������ �����������
��������� ������������
����� �������� �����
��� ������ �� ����� ���
Consult Instructions for Use
Gebrauchsanweisung beachten
Consultare le istruzioni per l’uso
Consulter la notice d’emploi
Consulte las instrucciones de uso
Consulte as instruções de utilização
Benyt brugsanvisninger
Läs bruksanvisningen
Συμβουλευθείτε τις οδηγίες χρήσης
For In Vitro Diagnostic Use
In Vitro Diagnosticum
Usage In Vitro
Per Uso Diagnostico In Vitro
Para Uso Diagnóstico In Vitro
Utilizar Apenas Em Diagnóstico In Vitro
För in-vitro diagnostiskt bruk
Til in Vitro diagnosticering
In vitro διαγνωστική ιατρική συσκευή
�
�� ���
���
Authorized Representative
Bevollmächtigter
Représentant agréé
Rappresentante autorizzato
Representante autorizado
Representante autorizado
Auktoriserad representant
Autoriseret repræsentan
Εξουσιοδοτημένος αντιπρόσωπος
στην Ευρωπαϊκή Κοινότητα
Temperature Limit
Temperaturlimit
Limite de température
Limite di temperatura
Límite de temperatura
Limite de temperatura
Temperaturgränser
Temperaturgrænse
Όριο θερμοκρασίας
���
����� ���������