Vrouw Maria -puunäyteanalyysi - Museovirasto
Vrouw Maria -puunäyteanalyysi - Museovirasto
Vrouw Maria -puunäyteanalyysi - Museovirasto
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
<strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> hylyltä kesällä 2007 nostetun puunäytteen<br />
kunnon ja puun hajottajamikrobien tutkimus<br />
sekä puun alkuaineanalyysi.<br />
Veijo Kinnunen<br />
Pro-gradu tutkielma<br />
Helsingin yliopisto<br />
Biotieteiden tiedekunta<br />
Bio-ja ympäristötieteiden laitos<br />
Akvaattisten tieteiden osasto<br />
Huhtikuu 2008
Tiedekunta/Osasto Fakultet/Sektion – Faculty Laitos Institution – Department<br />
Biotieteiden tiedekunta<br />
Bio- ja ympäristötieteiden laitos<br />
Tekijä Författare – Author<br />
Kinnunen, Veijo<br />
Työn nimi Arbetets titel – Title<br />
<strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> hylyltä kesällä 2007 nostetun puunäytteen kunnon ja puun hajottajamikrobien tutkimus sekä puun alkuaineanalyysi.<br />
Oppiaine Läroämne – Subject<br />
Hydrobiologia<br />
Työn laji Arbetets art – Level<br />
Pro gradu tutkielma<br />
Tiivistelmä Referat – Abstract<br />
Aika Datum – Month and year<br />
Huhtikuu 2008<br />
Sivumäärä Sidoantal – Number of pages<br />
70<br />
Pro gradu työssäni tutkin <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> hylyltä nostetun puunäytteen kuntoa ja puun hajottajien esiintymistä näytteessä. Näytteen<br />
kunnon selvittämiseksi määritin näytteen puulajin, puun kosteuspitoisuuden sekä tiheyden ja tarkastelin puuta röntgenkuvien sekä<br />
valo- ja elektronimikroskooppitutkimusten avulla. Lisäksi analysoin puun sisältämien rikin ja raudan määriä SEM-EDS menetelmällä<br />
ja selvitin puun hajottajamikrobien esiintymistä DNA-tutkimuksilla.<br />
Tutkimusten tarkoituksena oli perehtyä vettyneen arkeologisen puumateriaalin hajoamisen tutkimusmenetelmiin sekä saada tietoa<br />
hylkypuun hajoamisesta <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> hylyn ympäristössä. Hylkypuun kuntoa <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> hylyltä ei ole vastaavalla tavalla aikaisemmin<br />
selvitetty, lukuunottamatta vuonna 2003 tekemääni pienimuotoista esitutkimusta. Hylkypuun kunnon tutkimukset ovat<br />
ajankohtaisia sillä vaihtoehtoja <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> hylyn tulevaisuuden suhteen pohditaan parhaillaan. Mahdollisuuksina ovat esimerkiksi<br />
hylyn nostaminen pinnalle ja museoiminen yleisön nähtäville tai “in situ” konservointi, jolloin hylkyä esiteltäisiin yleisölle erilaisten<br />
visualisointitapojen avulla.<br />
Puunäyte osoittautui metsämännyksi (Pinus sylvestris) ja ikäisekseen se oli kohtalaisen hyvin säilynyt. <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> upposi vuonna<br />
1771, eikä ole syytä olettaa, että nyt tutkittu puunäyte olisi muualta kuin hylyltä peräisin. Se oli siis ennen nostamistaan maannut<br />
hylyn kannella 236 vuotta. Puun röntgentutkimuksella voitiin varmistaa ettei puussa ole laivamatoa (Teredo navalis), mikä olisi<br />
vakava uhka hylyn säilymiselle ja edellyttäisi nopeita toimenpiteitä säilymisen turvaamiseksi. Verrattaessa puun pinnasta otetun<br />
näytteen tiheyttä tuoreen männyn keskimääräiseen tiheyteen on näyte 23 % kevyempi, joten hajoamisen myötä se on menettänyt<br />
osan massastaan ja siten myös lujuudestaan. Puu olikin pinnastaan noin viiden mm:n syyvyydelle hyvin pitkälle hajonnut ja mikroskooppitutkimuksilla<br />
pinnan hajottajaksi todettiin jokin katkolahoa aiheuttava sieni. Syvemmällä puu on ehjempää, vaikka siellä<br />
havaittiin runsaasti eri asteisia bakteerien aiheuttamia hajoamisjälkiä. Bakteerit olivat selvästi levinneet syvemmälle puusolukkoon<br />
ydinsäteitä pitkin ja hajottaneet niiden tylppysoluja. Niitä esiintyi monin paikoin runsaasti myös ydinsäteitä reunustavien pitkittäisten<br />
putkisolujen onteloissa joiden sekundaariseinät olivat paikoitellen hajonneet. Bakteerien puusolukolle aiheuttamiin hajoamisjälkiin<br />
perustuvan morfologialuokituksen perusteella havaitut bakteerit voidaan luokitella eroosiobakteereiksi. Bakteereiden esiintymisestä<br />
puun pinnalla ja sisällä saatiin varmistus DNA-tutkimusten avulla. Näytteen sisäosista saatiin positiivinen tulos bakteereja tunnistavilla<br />
yleisalukkeilla ja pinnalta myös sulfaatin pelkistäjien alukkeilla. Lisäksi DNA-tutkimuksilla osoitettiin näytteessä olevan arkkeja.<br />
Alkuaineanalyysi osoitti, että puuhun on kertynyt sekä rikkiä että rautaa. Rikin määrä puussa oli keskimäärin 0,58 massaprosenttia<br />
ja suurimmillaan 1,31 massaprosenttia. Raudan pitoisuus oli keskimäärin 0,54 massaprosenttia. Tukholmaan museoidun Vasa -<br />
laivan pintapuussa on huomattavasti enemmän rikkiä, suurimmillaan 10 massaprosentin luokkaa, mikä on aiheuttanut puun konservointiongelmia.<br />
Portsmouthiin museoidun Mary Rose hylyn puurakenteissa on rikkiä noin yhden massaprosentin verran, mikä<br />
on vain hieman enemmän kuin nyt <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong>n puunäyttestä mitatut pitoisuudet. Näytteen sisältämien meriveden suolojen ja<br />
rikin määräsuhteet osoittivat, että rikkiä on selvästi rikastunut hylkypuuhun. Luultavasti tämä johtuu hapettomissa oloissa tapahtuvasta<br />
bakteerien aiheuttamasta sulfaatin pelkistyksestä ja puuhun helposti diffundoituvan rikkivedyn muodostumisesta. Vaikka rikin<br />
määrä hylkypuussa ei lähentelekään Vasa-laivan puuosien suuria pitoisuuksia, on se syytä ottaa huomioon suunniteltaessa<br />
mahdollisia hylyn tai sen puuosien noston jälkeisiä konservointitoimia. Sama pätee raudan suhteen.<br />
Nyt nostetun puunäytteen kunnon tutkimustuloksia ei voida sellaisenaan yleistää koskemaan koko hylyn kuntoa. <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong><br />
hylyn runko on tiettävästi tammea, jonka mikrobiologinen hajoaminen voi poiketa tutkitun mäntynäytteen hajoamisesta. Hylky on<br />
myös monimutkainen kokonaisuus, jossa on erilaisia mikroilmastoja missä olosuhteet puun hajomiselle saattavat poiketa huomattavasti<br />
puunäytteen ottopaikan olosuhteista. Hylyn rungon kunnon selvittämiseksi tarvitaankin lisätutkimuksia. Vaikka hylyltä ei<br />
voida ottaa suuria määriä näytteitä hylkyä vaurioittamatta, on mielestäni tarpeen selvittää hylyn kuntoa myös siitä harkitusti otettavien<br />
puunäytteiden avulla. Suosittelen varsinaisen runkopuun tutkimuksiksi ainakin valomikroskooppisia tutkimuksia ja puun<br />
alkuaineanalyysejä. Lisäksi on syytä jatkaa ei-kajoavien menetelmien, kuten veden alla tehtävien ultraäänitutkimusten kehittämistä<br />
sekä tässä aloitettujen DNA-tutkimusten tekemistä hajottabakteerien ja sienten lajien määrittämiseksi.<br />
Avainsanat – Nyckelord – Keywords<br />
<strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong>, hylkytutkimus, hylkypuu, katkolaho, eroosiobakteeri, Teredo navalis, rikki, rauta, SEM, SEM-EDS, LM, röntgen,<br />
alkuaineanalyysi<br />
Säilytyspaikka – Förvaringställe – Where deposited<br />
Viikin tiedekirjasto, <strong>Museovirasto</strong>n meriarkeologinen yksikkö, Turun maakuntamuseon kirjasto, Tvärminnen eläintieteellinen asema<br />
Muita tietoja – Övriga uppgifter – Additional information<br />
2
SISÄLTÖ<br />
1) JOHDANTO .......................................................................................................................................... 4<br />
1.1. TUTKIMUKSEN TAUSTAA................................................................................................................... 4<br />
1.2. TUTKIMUKSEN TARKOITUS ............................................................................................................... 5<br />
1.3. VROUW MARIA ................................................................................................................................. 6<br />
1.4. YMPÄRISTÖOLOSUHTEET VROUW MARIA HYLYLLÄ......................................................................... 8<br />
1.5. PUUNÄYTE ........................................................................................................................................ 9<br />
1.6. PUUN KOSTEUSPITOISUUS JA TIHEYS............................................................................................... 10<br />
1.7. PUUN RÖNTGENTUTKIMUS .............................................................................................................. 10<br />
1.8. PUUN MIKROSKOOPPITUTKIMUKSET ............................................................................................... 12<br />
1.8.1. Puun rakenne ja kemiallinen koostumus ................................................................................ 12<br />
1.8.2. Puun tunnistamisesta.............................................................................................................. 14<br />
1.8.3. Puun mikrobiologinen hajoaminen ........................................................................................ 15<br />
1.9. ALKUAINEANALYYSI ...................................................................................................................... 17<br />
1.9.1 Rikki ja rauta puuhylkyjen uhkana.......................................................................................... 17<br />
1.9.2. Rikin ja raudan kerääntyminen puusolukkoon meriympäristössä .......................................... 18<br />
1.9.3. Alkuaineanalyysin tausta ja teoriaa ....................................................................................... 21<br />
1.10. DNA-TUTKIMUKSET ..................................................................................................................... 22<br />
1.10.1. Arkit, bakteerit ja sienet ....................................................................................................... 22<br />
1.10.2. Mikrobien tunnistus DNA-tutkimusten avulla ...................................................................... 23<br />
2) AINEISTO JA MENETELMÄT ....................................................................................................... 24<br />
2.1. PUUN KOSTEUSPITOISUUS JA TIHEYS............................................................................................... 24<br />
2.2. RÖNTGENTUTKIMUS........................................................................................................................ 25<br />
2.3. PUUN MIKROSKOOPPITUTKIMUKSET ............................................................................................... 26<br />
2.3.1. Puulajimääritys ...................................................................................................................... 26<br />
2.3.2. Puun valomikroskooppitutkimukset (LM)............................................................................... 27<br />
2.3.3. Puun elektronimikroskooppitutkimukset (SEM) ..................................................................... 28<br />
2.3.4. Valo- ja elektronimikroskooppinäytteiden arviointi............................................................... 29<br />
2.4. ALKUAINEANALYYSI ...................................................................................................................... 30<br />
2.5. DNA-TUTKIMUKSET ....................................................................................................................... 31<br />
3) TULOKSET ......................................................................................................................................... 34<br />
3.1. PUUN KOSTEUSPITOISUUS JA TIHEYS............................................................................................... 34<br />
3.2. RÖNTGENTUTKIMUS........................................................................................................................ 35<br />
3.3. PUUN MIKROSKOOPPITUTKIMUKSET ............................................................................................... 36<br />
3.3.1. Puulajimääritys ...................................................................................................................... 36<br />
3.3.2. Puun valo- ja elektronimikroskooppitutkimukset ................................................................... 37<br />
3.4. ALKUAINEANALYYSI ...................................................................................................................... 48<br />
3.5. DNA-TUTKIMUKSET ....................................................................................................................... 51<br />
4) TULOSTEN TARKASTELU............................................................................................................. 53<br />
4.1. PUUN KOSTEUSPITOISUUS JA TIHEYS............................................................................................... 53<br />
4.2. PUUN RÖNTGENTUTKIMUS .............................................................................................................. 54<br />
4.3. PUUN MIKROSKOOPPITUTKIMUKSET ............................................................................................... 56<br />
4.3.1. Puulajimääritys ...................................................................................................................... 56<br />
4.3.2. Valo- ja elektronimikroskooppitutkimukset............................................................................ 56<br />
4.4. ALKUAINEANALYYSI ...................................................................................................................... 59<br />
4.5. DNA-TUTKIMUKSET ....................................................................................................................... 61<br />
4.6. YHTEENVETO.................................................................................................................................. 63<br />
KIITOKSET: ............................................................................................................................................. 65<br />
KIRJALLISUUS: ...................................................................................................................................... 66<br />
3
1) Johdanto<br />
1.1. Tutkimuksen taustaa<br />
Tämä työ sai alkunsa jo vuonna 2003, jolloin pääsin kolmanneksi sukeltajaksi Ari<br />
Ruuskasen ja Niko Napun mukaan <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> hylyllä tutkimusta tekevään biologiryhmään.<br />
Juha Flinkman oli myös perehtynyt hylyn tutkimuksiin ja hänen ehdotuksestaan<br />
aloin selvittää mahdollisuutta hylkypuuta hajottavien mikrobien tutkimuksiin. Silloisen<br />
Suomen Merimuseon henkilökunta kiinnostui esittämästäni tutkimussuunnitelmasta<br />
ja sain luvan tehdä alustavia kartoituksia hylyllä ja syvyyksistä jopa tuotiin pieni<br />
puupala pinnalle. Tästä puupalasta teimme Helsingin Yliopiston Kasvimuseolla Tuuli<br />
Timosen ja Pirkko Harjun kanssa ensimmäiset valomikroskooppileikkeet, joiden tuloksena<br />
syntyi tähän tutkimukseen johtanut esitutkimus (Ruuskanen ym. 2004).<br />
Esitutkimuksen valmistuttua jäivät nämä tutkimukset osaltani muutamaksi vuodeksi.<br />
Mutta viime kesänä <strong>Museovirasto</strong>n meriarkeologisen yksikön konservaattori Ulla Klemelä<br />
pyysi minua katsomaan elektronimikroskoopilla <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong>n hylylle MoSS<br />
projektin yhteydessä vuonna 2002 vietyjä puunäytteitä. Nämä näytteet piti suunnitelman<br />
mukaan analysoida vuonna 2007.<br />
Kesällä 2007 hylyllä kuitenkin vallitsivat erittäin huonot olosuhteet, eikä hylylle viisi<br />
vuotta aiemmin vietyjä näytteitä saatu tuotua ylös. Sen sijaan hylyn kannelta nostettiin<br />
pinnalle irtonainen pala varsinaista hylkypuuta ja päätimme meriarkeologisen yksikön<br />
tutkijoiden kanssa aloittaa sen tutkimukset. Näistä tutkimuksista aloin tehdä tätä poikkitieteellistä<br />
gradutyötäni, jossa yhdistyvät meribiologia, kasvianatomia ja mikrobiologia<br />
ja lisäksi mukana on hiukan fysiikkaa, kemiaa ja molekyylibiologiaa.<br />
Olen saanut työn tekemiseen runsaasti ohjausta sekä teknistä apua laitteiden ja kameroiden<br />
käyttöön. Ohjaamassa ja avustamassa on ollut oman alansa asiantuntijoita puuanatomian,<br />
mikrobiologian, alkuaineanalytiikan, puun röntgentutkimusten ja DNAtutkimusten<br />
aloilta sekä <strong>Museovirasto</strong>n meriarkeologisesta yksiköstä. Viimeksi mainittu<br />
myös rahoitti tutkimusta yhdessä Suomen Kulttuurirahaston kanssa.<br />
Osa työssä olevista kuvista on muiden kuin itseni ottamia. Näissä olen maininnut kuvaajat<br />
erikseen kuvatekstissä. Ne kuvat, joissa ei ole mainintaa kuvaajasta ovat omiani.<br />
4
1.2. Tutkimuksen tarkoitus<br />
Opinnäytetyöni koostuu useasta eri osatutkimuksesta, jotka saattavat vaikuttaa irrallisilta<br />
tai päällekkäisiltä. Kukin tutkimus antaisi jo yksin tehtynä varsin hyvin tietoa puunäytteen<br />
kunnosta, mutta tekemällä useita erilaisia tutkimuksia haluan saada siitä mahdollisimman<br />
tarkan kuvan sekä myös testata ja opetella hylkypuun kunnon tutkimuksissa<br />
käytettäviä menetelmiä.<br />
Sana puu on moniselitteinen ja sitä käytetään tavallisesti laajemmassa merkityksessä,<br />
kuin kuvaaman varsinaista puusolukkoa tai puuainetta. Käytän tässä työssä kuitenkin<br />
sanaa puu ajoittain myös silloin, kun tarkoitan varsinaista puusolukkoa.<br />
Mikroskooppitutkimusten avulla tarkoitukseni on määrittää näytteen puulaji ja selvittää<br />
puun kuntoa solutasolla. Käytän tutkimuksiin sekä valo- että elektronimikroskooppia,<br />
koska uskon niiden yhdessä antavan enemmän tietoa puun soluseinien kunnosta ja hajottajamikrobien<br />
esiintymisestä puussa, kuin kumpikaan yksin antaisi. Röntgentutkimuksilla<br />
taas haluan varmistaa, ettei puunäytteessä ole laivamatoa (Teredo navalis),<br />
joka on erittäin tehokas puun hajottaja meriympäristössä (Didžiulis 2007).<br />
Alkuaineanalyysien avulla yritän selvittää onko puunäytteeseen kerääntynyt rikkiä ja<br />
rautaa. Puuhun kerääntyneet rikki- ja rautayhdisteet voivat aiheuttaa konservointiongelmia<br />
pintaan nostetulle puuhylylle, kuten on käynyt esimerkiksi Vasa-laivan ja Mary<br />
Rosen hylyillä (Sandström ym. 2002; Sandström ym. 2005; Fors & Sandström 2006;<br />
Wetherall ym. 2007). Alkuaineanalyysin avulla voidaan saada viitteitä siitä, onko<br />
<strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> hylyllä odotettavissa vastaavia ongelmia, jos se päätetään nostaa pinnalle.<br />
DNA tutkimusten tarkoituksena on kokeilla onnistuuko mikrobi DNA:n eristäminen<br />
vettyneestä, 236 vuotta meren syvyyksissä maanneesta puunäytteestä, testata PCRtutkimusmenetelmiä<br />
ja yrittää näytteessä mahdollisesti esiintyvien mikrobien tunnistamista<br />
ryhmätasolle: arkit - bakteerit - sienet. Mikäli arkkeja ja bakteereita löytyy, yritän<br />
selvittää onko näytteessä sulfaatin pelkistäjiä, sillä niiden läsnäolo puussa mahdollistaisi<br />
pelkistyneiden rikkiyhdisteiden kertymisen puuhun.<br />
Lisäksi määritän puun kosteusprosentin ja tiheyden, joiden avulla voidaan myös tehdä<br />
päätelmiä puun hajoamisasteesta. Puun kosteuspitoisuuden ja tiheyden mittausta käytettiin<br />
yhtenä puun kunnon arviointimenetelmänä Suomen Merimuseon koordinoimassa<br />
5
MoSS-projektissa vuosina 2001-2004, jossa <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> hylky oli mukana yhtenä<br />
tutkimuskohteena (Palma 2004).<br />
1.3. <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong><br />
Hollantilainen purjealus <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> oli matkalla Amsterdamista Pietariin syys- lokakuussa<br />
1771. Pimeänä ja myrskyisenä lokakuun kolmannen päivän yönä laiva eksyi<br />
kurssiltaan ja osui karille Saaristomeren eteläosassa. Karilleajossa syntyneet vauriot<br />
eivät johtaneet aluksen välittömään uppoamiseen ja miehistö pystyi purjehtimaan vuotavan<br />
laivan turvaan läheisen luodon rantaan. Usean päivän ajan miehistö yritti pumpata<br />
laivaa tyhjäksi vedestä ja pelastaa sen lastia. He viettivät yönsä maissa palaten päivisin<br />
laivan ja sen lastin pelastustöihin, kunnes lokakuun yhdeksännen aamun valjetessa laiva<br />
oli kadonnut. Edellisenä iltana keli oli muuttunut huonoksi ja etelän ja kaakon välinen<br />
tuuli oli voimistunut. Laiva oli yön aikana irronnut kiinnityksistään ja ajelehtinut ulos<br />
merelle, missä se upposi (Leino 2002; Pelanne & Tikkanen 2007).<br />
<strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong>n hylkyä ei yrityksistä huolimatta löydetty sen uppoamisen jälkeen ja sen<br />
olinpaikka pysyi arvoituksena aina vuoteen 1999 asti. Kesäkuun 28 päivä, systemaattisten<br />
etsintöjen tuloksena, Rauno Koivusaari kumppaneineen löysi <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong>n hylyn<br />
41 metrin syvyydestä Saaristomeren eteläosasta (kuva 1). Hylky makasi pohjassa kokonaisena<br />
ja purjehdusasennossa ja vaikutti hyvin säilyneeltä (Leino 2002; Pelanne &<br />
Tikkanen 2007).<br />
<strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> hylky on Suomen valtion omaisuutta ja sen hoidosta ja tutkimuksista vastaa<br />
<strong>Museovirasto</strong>. Hylyllä on tehty meriarkeologisia tutkimuksia sen löytämisestä lähtien<br />
ja sen kuntoa on kartoitettu Suomen Merimuseon koordinoiman laajan kansainvälisen<br />
MoSS-projektin yhteydessä vuosina 2001-2004. <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> oli yksi neljästä merkittävästä<br />
eurooppalaisesta hylystä, joita MoSS-projetissa tutkittiin (Alvik & Tikkanen<br />
2004; Pelanne & Tikkanen 2007).<br />
<strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> hylky on edelleen ajankohtainen ja se on saanut huomiota osakseen myös<br />
julkisuudessa, sillä sen lastin mukana on tiettävästi ollut Venäjän keisarinna Katariina<br />
Suurelle matkalla olleita arvokkaita maalauksia. Hylyn saama julkisuus lienee tutkimusten<br />
jouduttamisen kannalta ollut myönteinen asia, mutta julkisuudessa on myös liikkunut<br />
hyvin epärealistisia arvioita liittyen hylyn nostoon ja museointiin. On ymmärrettävää,<br />
että yleisö haluaisi nähdä hylyn museoituna, mutta ennen kuin tähän päästään, on<br />
6
hylyllä tehtävä huomattavasti enemmän sen kuntoon liittyvää tutkimusta, kuin tähän<br />
mennessä on tehty. Tämä on tärkeää jotta ei hätäilemällä tuhottaisi sitä meriarkeologista<br />
aarretta, mikä nyt näyttää säilyneen hyvin.<br />
<strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> hylyn sijainti vaikuttaa merkittävästi tutkimusten etenemiseen. Se sijaitsee<br />
hyvin avoimella paikalla, missä jo kohtalainen tuuli estää sukellustukialuksen toiminnan<br />
(kuva 1). Sukeltajat voivat tavallisella paineilmalla sukeltaessaan toimia vain<br />
rajoitetun ajan (n. 15-20 minuuttia) kerrallaan hylyllä, eikä tällaisia sukelluksia yleensä<br />
voi tehdä kuin kaksi kertaa päivässä lyhyen ajanjakson aikana. Erityiskoulutuksella ja<br />
seoskaasuilla sukellettaessa voidaan sukellusaikoja jonkin verran pidentää. Mutta kun<br />
kuvitellaan sitä työmäärää, mikä tarvittaisiin hylyn ja sen lastin nostamiseen niitä vahingoittamatta,<br />
on helppo ymmärtää miksi nostoa ei haluta kiirehtiä.<br />
Nykyinen suuntaus vedenalaisten muinaisjäännösten säilyttämisessä on ”in situ” konservointi,<br />
eli muinaisjäännösten säilymisen varmistaminen siinä ympäristössä, missä ne<br />
löydettäessä ovat (Gregory 1998; Curci 2006). Tätä mahdollisuutta tutkitaan myös<br />
<strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> hylyn kohdalla pinnalle nostamisen vaihtoehtona. In situ konservointiin<br />
liittyvät myös erilaiset hylyn visualisointihankkeet, joiden avulla tietoa hylystä voidaan<br />
tuoda yleisön nähtäville (Leino ym. 2004; Pelanne & Tikkanen 2007).<br />
Kuva 1: <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> hylyn sijainti Saaristomeren eteläosassa. Kuva: Mikko Rautala, <strong>Museovirasto</strong>.<br />
7
1.4. Ympäristöolosuhteet <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> hylyllä<br />
Itämeri on murtovettä, jonka pintaveden suolapitoisuus vaihtelee jokisuistojen lähes<br />
makeasta vedestä Kattegatin 20-35 promillen (‰) suolapitoisuuteen. Suomenlahden<br />
länsiosassa ja Saaristomeren eteläosassa pintaveden suolapitoisuus on noin 6-7 ‰. Koska<br />
Itämeri on Tanskan salmien kautta yhteydessä Kattegatiin ja Pohjanmereen, virtaa<br />
sieltä jonkin verran suolaista vettä Itämereen. Suolaisempi vesi on raskaampaa ja se<br />
pysyttelee omana kerroksenaan pohjan tuntumassa. Itämerelle onkin tyypillistä suolapitoisuuden<br />
kerrostuneisuus, jonka harppauskerros eli halokliini on noin 60-80 metrin<br />
syvyydessä varsinaisella Itämerellä ja Suomenlahden länsiosan syvänteissä. Koska Itämeri<br />
on matala vesiallas, keskisyvyyden ollessa 54 metriä, ei tätä suolapitoisuuden kerrostuneisuutta<br />
havaita matalilla alueilla (Aniansson 1989; Myrberg ym. 2006).<br />
Myös Itämeren pintavesi kerrostuu lämpötilaerojen takia kesäaikaan. Kesällä pintavesi<br />
lämpenee noin 16- 20 °C:een ja koska lämpimän veden tiheys on pienempi kuin kylmän<br />
alusveden, muodostuu vesipatsaaseen lämpötilakerrostuneisuus. Tämän kerroksen jyrkkä<br />
vaihettumisvyöhyke eli termokliini on kesäisin noin 15-20 metrin syvyydessä ja sen<br />
alla veden lämpötila jää usein 4-6 °C:een. Sekä suolaisuuden, että lämpötilan aiheuttama<br />
vesipatsaan kerrostuneisuus on hyvin voimakas. Termokliini eristää tehokkaasti<br />
pintaveden syvävedestä ja halokliini päällään olevan makeamman veden syvännevedestä.<br />
Tästä seuraa, että syvällä vesi on kylmää vuoden ympäri, ja veteen liuenneiden ravinteiden<br />
ja kaasujen vaihto pintaveden kanssa on kesäaikaan rajoittunutta (Aniansson<br />
1989; Myrberg ym. 2006).<br />
Lämpimässä ja valoisassa pintakerroksessa on kesäisin käynnissä voimakas kasviplanktonin<br />
perustuotanto, josta suuri osa aikaa myöten päätyy eri muodoissa meren pohjaan,<br />
missä sitä hajottavat erilaiset pohjaeläimet ja mikrobit. Tämän orgaanisen aineksen hajotustoiminnan<br />
ja eri vesikerrosten välisen rajoittuneen veteen liuenneiden kaasujen<br />
vaihtumisen seurauksena voi termokliinin eristämästä syvästä vedestä kesän aikana kulua<br />
happi loppuun. Syksyllä pintaveden jäähtyessä tämä termokliini kuitenkin purkautuu,<br />
jolloin pinta ja syvävesi sekoittuvat ja syvävesi hapettuu jälleen. Halokliinin esiintymisessä<br />
ei sen sijaan ole samanlaista vuodenaikaisvaihtelua, joten sen alla olevassa<br />
syvännevedessä voi olla pidempiaikainen happikato (Niemi 1984; Aniansson 1989).<br />
Merentutkimuslaitos teki <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> hylyn ympäristössä ympäristöolosuhteiden vuodenaikaisseurantaa<br />
syyskuun 2002 ja elokuun 2003 välisenä aikana. Hylyllä vallitsee<br />
8
merialueelle tyypillinen, edellä kuvatusta vesipatsaan lämpötilakerrostuneisuudesta johtuva<br />
vuodenaikaisvaihtelu lämpötilan, suolapitoisuuden ja veteen liuenneen hapen määrien<br />
suhteen. Loppusyksyllä 2002 hylkyä ympäröivän veden happipitoisuus oli alle 1<br />
ml/l, kunnes lokakuun 23 päivä kerrostuneisuus murtui ja vesipatsas sekoittui pohjaan<br />
saakka. Tämän jälkeen hapen määrä pysyi korkeana (noin 8 ml/l) aina huhtikuun puoliväliin<br />
2003 asti, jolloin vesipatsas alkoi jälleen kerrostua. Kesän 2003 aikana hapen<br />
määrä väheni melko tasaisesti syksyyn asti, saavuttaen noin 2 ml/l arvon (Hietala ym.<br />
2004).<br />
Lämpötila hylyllä vaihteli talven -0,4 °C:sta syystäyskierron aikaan mitattuun 8,1<br />
°C:een. Lämpötila pysyi nollan asteen tuntumassa koko talven ajan eikä kesälläkään<br />
noussut juuri kuutta astetta korkeammalle. Suolaisuus pohjalla vaihteli 5,5 ja 6,6 promillen<br />
välillä ollen suurimman osan vuodesta lähellä korkeinta lukemaa. Veden pH<br />
vaihteli 7,03 ja 7,16 välillä (Hietala ym. 2004).<br />
1.5. Puunäyte<br />
Tutkimuksessa tarkasteltava puunäyte nostettiin <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> hylyn kannelta<br />
25.7.2007. Näytteen toi pintaan Merentutkimuslaitoksen erikoistutkija Juha Flinkman,<br />
joka oli kesän 2007 tarkastusmatkalla kuvaamassa hylkyä. Näyte on hylyn kannelta sen<br />
oikean laidan keskiosassa maannut irtonainen puupala ja se lienee peräisin kannelle<br />
romahtaneesta takilasta tai partaasta (kuva 2a). Puu on pituussuunnassa haljennut ja sen<br />
pidempi osa on noin 84 cm pitkä, 11 cm leveä ja 8 cm korkea (kuvat 2 b ja 2c).<br />
Kuva 2: a) Kannelta nostetun irtonaisen puupalan sijaintialue on piirroksessa punaisen ympyrän kohdalla.<br />
b) ja c) Näytepala on haljennut pituussuuntaan kahdeksi erilliseksi palaksi. Piirros a) Tiina Mertanen,<br />
kuvat b) ja c) Ulla Klemelä.<br />
9
1.6. Puun kosteuspitoisuus ja tiheys<br />
Puu on hyvin huokoista materiaalia, joka on suurelta osin rakentunut pitkittäisistä putkisoluista,<br />
joista osa on onttoja ilman solun sisältöä (kuva 3a). Putkisolut osallistuvat<br />
aineiden kuljetukseen puun osasta toiseen ja niitä reunustaa pääasiassa selluloosa- ja<br />
ligniinipitoinen soluseinä. Lisäksi puussa on mm. poikittaisia ydinsäteitä, jotka lisäävät<br />
sen huokoisuutta. Kun puu joutuu veden alle, täyttyvät nämä ontelot vähitellen vedellä<br />
eli puu vettyy. Puun hajotessa osa sen soluseinistä häviää ja puuhun voi imeytyä enemmän<br />
vettä. Tällöin sen kosteusprosentti kasvaa ja tiheys pienenee. Mittaamalla ja laskemalla<br />
puun kosteusprosentti ja tiheys voidaan tehdä päätelmiä puun hajoamisasteesta.<br />
Puun kosteuspitoisuuden ja tiheyden mittausta käytettiin yhtenä puun kunnon arviointimenetelmänä<br />
myös Suomen Merimuseon koordinoimassa MoSS-projektissa. Siinä tutkittiin<br />
muun muassa ympäristöolosuhteiden vaikutusta veden alle vietyyn puuhun kolmen<br />
merkittävän Eurooppalaisen puuhylyn uppoamispaikalla. Hylyiltä otettiin pohjaan<br />
viedystä puusta näytteet kolmen tai viiden kuukauden ja 12 kuukauden pohjassa olon<br />
jälkeen. Yksi tutkitusta hylyistä oli tässä tutkimuksessa mukana oleva <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong><br />
hylky (Palma 2004). Olen koonnut tutkimuksen tausta-aineistoksi MoSS projektissa<br />
mukana olleille puuhylyille viedyistä mäntynäytteistä tehdyt vesipitoisuuden ja tiheyden<br />
tulosten vaihteluvälit ja laskenut tulosten keskiarvot taulukkoon 1.<br />
Taulukko 1: MoSS projektissa kolmelle puuhylylle vietyjen puunäytteiden kosteuspitoisuus (MC) ja<br />
tiheys (R). <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong>lta ja Burgzand Noord hylyiltä otettiin ensimmäiset näytteet kolmen kuukauden<br />
pohjassa olon jälkeen ja Darsser Kogge hylyltä viiden kuukauden jälkeen. Keskiarvojen perässä on suluissa<br />
mainittu mittausten määrä. Taulukko tehty Palma 2004 perusteella ja siinä on mukana arvot vain<br />
mäntynäytteistä.<br />
Vaihteluväli 3/5kk Keskiarvo 3/5kk Vaihteluväli 12kk Keskiarvo 12 kk<br />
Hylky MC (%) R (g/cm3) MC (%) R (g/cm3) MC (%) R (g/cm3) MC (%) R (g/cm3)<br />
<strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> 146,5-170,3 0,42-0,47 162,96 (5) 0,44 (5) 145,3-208,1 0,36-0,47 175,72 (5) 0,42 (5)<br />
Darsser Kogge 104,4-236,7 0,33-0,58 161,58 (5) 0,46 (5) 157-177,3 0,41-0,45 165,98 (4) 0,43 (4)<br />
Burgzand Noord 71,6-127,7 0,51-0,72 106,78 (5) 0,59 (5) 69,6-157,2 0,45-0,74 132,65 (4) 0,53 (4)<br />
1.7. Puun röntgentutkimus<br />
Röntgenkuvaamalla puunäyte voidaan nähdä onko siihen iskenyt yksi hylkypuun pahimmista<br />
vihollisista, laivamato (Teredo navalis) (Didžiulis 2007). Harhaanjohtavasta<br />
nimestään huolimatta laivamato kuuluu nilviäisten pääjaksoon (Mollusca) ja simpukoiden<br />
(Bivalvia) luokkaan. Sen kuori on eläimen hoikan matomaisen osan toisessa päässä<br />
10
ja kuoren avulla se kaivertaa tiensä puun sisälle. Laivamadolla on pelaginen eli vapaassa<br />
vedessä elävä toukka. Asetuttuaan puuhun toukka alkaa kasvaa aikuiseksi, joka elää<br />
koko lopun elämänsä samassa puussa. Se pystyy käyttämään ravintonaan puun selluloosaa,<br />
mutta se myös suodattaa sifoneillaan planktonia ympäröivästä vedestä (Storer ym.<br />
1979, Hoppe 2002). Laivamato kaivertaa puuhun halkaisijaltaan noin 1cm:n kokoisia<br />
käytäviä, jotka se verhoaa kalkkikuorella. Nämä käytävät näkyvät paljain silmin, kun<br />
niitä on paljon, mutta satunaiset käytävät saa parhaiten varmistettua puun röntgenkuvauksella.<br />
Itse laivamato voi kasvaa yli 45 cm:n mittaiseksi (Storer ym. 1979; Didžiulis<br />
2007).<br />
Laivamatoa ei toistaiseksi ole tavattu pohjoiselta Itämereltä, mutta Ruotsin länsirannikolla<br />
sekä Tanskan ja Saksan rannikolla sitä esiintyy Kattegatin alueelta aina Malmö-<br />
Rostock linjalle asti (Bonsdorff 2006; Westin ym. 2006; Didžiulis 2007). Myös Pohjanmereltä<br />
sitä on havaittu Weserin estuaarion matalista suolapitoisuuksista Bremerhavenin<br />
sataman alueella pohjois Saksassa (Tuente ym. 2002). Laivamadon leviämistä<br />
varsinaiselle Itämerelle vaikeuttaa Itämeren matala suolapitoisuus, sillä lisääntyäkseen<br />
eläin vaatii vähintään 11 ‰:n suolapitoisuuden (Norman 1977). Aikuinen yksilö kuitenkin<br />
sietää epäsuotuisia ympäristöolosuhteita varsin hyvin ja selviää pitkiä aikoja<br />
hengissä myös viiden promillen suolapitoisuudessa (Miller 1926). Altistuessaan ilmalle<br />
tai makealle vedelle se voi suojautua onkaloonsa sulkemalla kaksi ovenkaltaista kalkkilevyä,<br />
jolloin se voi pysyä hengissä jopa kolme viikkoa (Hoppe 2002). Myös laivamadon<br />
pelaginen toukka selviää noin viiden promillen suolapitoisuudessa (Hoagland<br />
1986).<br />
Laivamato ja sen tekemät käytävät voidaan nähdä röntgenkuvista erinomaisesti (Tuente<br />
ym. 2002). Röntgentutkimuksia käytettiin myös MoSS-projektissa, jossa laivamatoa<br />
löydettiin Alankomaiden Waddenin meren länsiosassa sijaitsevan Burgzand Noord 10<br />
hylyn röntgennäytteistä. Hylylle vietiin tammi ja mäntynäytteitä, jotka otettiin ylös<br />
kolmen ja 12 kuukauden kuluttua. Jo kolmen kuukauden näytteissä havaittiin viitteitä<br />
laivamadon hyökkäyksestä, mutta erityisen selviä jäljet olivat 12 kuukauden mäntynäytteessä.<br />
<strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> hylyltä tutkituissa vastaavissa näytteissä ei laivamatoa havaittu<br />
(Palma 2004).<br />
Toinen pohjoisen pallonpuoliskon valtamerissä yleinen ja puuta nopeasti tuhoava eläin<br />
on äyriäisiin (Crustacea) kuuluva porasiira (Limnoria lignorum, Limnoria sp.). Porasiira<br />
11
ei kuitenkaan pysty elämään Itämeren suolapitoisuuksissa, sillä jo 6,5 ‰ suolapitoisuus<br />
on sille vuorokauden kuluessa tappava (Miller 1926). Porasiira ei myöskään pysty porautumaan<br />
puuhun alle 10 promillen suolapitoisuudessa (Eltringham 1961). Itämeren<br />
tuntumasta porasiiraa on tavattu ainakin Ruotsin länsirannikolta Kristinebergin meribiologisen<br />
tutkimusaseman edustalta, missä suolapitoisuus vaihtelee 26 - 34 promillen välillä<br />
(Westin ym. 2006). Myös porasiiran esiintyminen puunäytteessä on mahdollista<br />
varmistaa röntgenkuvista.<br />
Röntgenkuvista on voidaan myös nähdä puuhun diffundoituneita raudan ja muiden metallien<br />
suoloja (Lehmann ym. 2005; Leena Tomanterä 2007, henk. koht. tiedonanto).<br />
Tämä perustuu siihen, että läpivalaistaessa esinettä tai organismia röntgensäteillä on sen<br />
sisältämillä raskaammilla alkuaineilla, kuten metalleilla säteilyn vaimeneminen suurempaa,<br />
kuin kevyillä alkuaineilla (Lehmann ym. 2005). Röntgenkuvassa nämä alueet,<br />
jotka ovat läpäisseet vähemmän säteilyä, nähdään vaaleina ja enemmän säteilyä läpäisseet<br />
alueet tummina (Holmberg & Perkkiö 1988). Käytännössä tämä siis tarkoittaa, että<br />
puuaines hyvin säteilyä läpäisevänä on kuvissa tummempi kuin sen sisältämät metallisuolat.<br />
Koska röntgentutkimukset eivät tuhoa tutkittavaa materiaalia, ovat ne hyvin<br />
käyttökelpoisia arkeologisissa tutkimuksissa (Lehmann ym. 2005).<br />
1.8. Puun mikroskooppitutkimukset<br />
1.8.1. Puun rakenne ja kemiallinen koostumus<br />
Tutkimuksessa tarkasteltava puu tiedettiin aikaisessa vaiheessa havupuuksi, joten keskityn<br />
tässä kappaleessa kuvaamaan lähinnä havupuun puusolukon rakennetta ja kemiallista<br />
koostumusta. Käsittelen aihetta myös vain siinä laajuudessa, mitä tarvitaan tutkimuksen<br />
kannalta oleellisten puun hajoamiseen liittyvien asioiden ymmärtämiseksi.<br />
Havupuun rungon puusolukko muodostuu suurimmaksi osaksi pitkittäisistä putkisoluista<br />
(trakeidit), jotka toimivat veden ja siihen liuenneiden aineiden kuljetusreittinä puun<br />
juurista lehtiin ja myös tukisolukkona. Putkisolut ovat suippopäisiä ja niitä sanotaan<br />
suippusoluiksi (prosenkyymisolut). Lisäksi puussa on tylppäpäisiä varasto- ja eritesoluja,<br />
joita sanotaan tylppysoluiksi (parenkyymisolut). Niitä on esimerkiksi ydinsäteissä ja<br />
pihkatiehyissä, eivätkä ne yleensä ole puutuneita. Rungon poikkileikkauksessa nähdään<br />
sisäkkäisiä vuosilustoja eli vuosirenkaita. Ne muodostuvat ohutseinäisiä suurionteloisia<br />
soluja sisältävästä kevätpuusta ja paksuseinäisiä ja pienionteloisia soluja sisältävästä<br />
12
kesäpuusta. Kevätpuu syntyy kasvukauden alussa nopean kasvuvaiheen aikana ja kasvun<br />
myöhemmin hidastuessa on tuloksena kesäpuuta (Fagerstedt ym. 2005; Jääskeläinen<br />
& Sundqvist 2007).<br />
Varsinaisen puuaineksen eli ksyleemin ulkopuolella on rungossa yhden solukerroksen<br />
paksuinen jälsi, joka saa aikaan rungon paksuuskasvun sekä puuaineksen että puun kuoren<br />
suuntaan. Jällen ulkopuolella on kuoren sisin osa nila, joka on erikoistunut yhteyttämistuotteiden<br />
kuljetukseen lehdistä puun muihin osiin. Monien havupuiden puussa on<br />
myös pihkatiehyitä ja puun pinnasta säteittäisesti sisäänpäin kulkevia kapeita ydinsäteitä<br />
(kuva 3a). Ydinsäteet toimivat kuljetusreittinä nilan ja puuaineksen välillä ja muun muassa<br />
yhteyttämistuotteet pääsevät kulkemaan tätä reittiä nilasta puuhun. Puun putkisolujen<br />
seinissä on myös huokosia, jotka mahdollistavat aineiden liikkumisen solusta toiseen<br />
(Fagerstedt ym. 2005; Jääskeläinen & Sundqvist 2007).<br />
Puuvartisilla kasveilla on jäykät puutuneet soluseinät. Soluseinien jäykkyys johtuu pääasiassa<br />
niiden sisältämästä puuaineesta eli ligniinistä sekä ligniinin, selluloosan ja hemiselluloosan<br />
keskinäisestä järjestäytymisestä soluseinärakenteessa. Ligniini on soluseinässä<br />
limittäin selluloosan ja hemiselluloosan kanssa (Kärkkäinen 2003; Jääskeläinen &<br />
Sundqvist 2007).<br />
Putkisolujen seinä koostuu useasta eri kerroksesta (kuva 3b). Solujen välinen keskilevy<br />
eli välilamelli muodostuu pääasiassa ligniinistä ja pektiiniaineista. Sen sisäpuolella on<br />
primääriseinä, jossa on ligniiniä ja hemiselluloosaa sekä jonkin verran selluloosaa. Nämä<br />
kaksi kerrosta ovat hyvin ohuita ja yhdessä ne muodostavat yhdistetyn välilamellin.<br />
Sisimpänä on kolmekerroksinen (S1, S2 ja S3) sekundääriseinä, jossa selluloosaa on<br />
hemiselluloosaa enemmän ja lisäksi siinä on jonkin verran ligniiniä. Vaikka ligniiniä on<br />
sekundääriseinässä suhteellisesti vähemmän kuin yhdistetyssä välilamellissa, on sekundääriseinässä<br />
sen paksuuden takia määrällisesti eniten ligniiniä koko puun soluseinässä<br />
(Kärkkäinen 2003; Jääskeläinen & Sundqvist 2007).<br />
13
Kuva 3: Havupuun puusolukon rakenne yksinkertaistettuna. a) Leikkaussuunnat ja b) Soluseinän eri kerrokset.<br />
Selluloosamikrofibrillit ovat suuntautuneet sekundääriseinän eri kerroksissa eri suuntiin. Primääriseinässä<br />
mikrofibrillit eivät ole samalla tavoin järjestäytyneet.<br />
Tuoreen puun soluseinistä voi jopa 40 % olla vettä. Soluseinien sisältämien kuivaaineiden<br />
osuudet vaihtelevat eri puulajien välillä sekä lajien sisällä kasvupaikasta ja<br />
kasvuolosuhteista riippuen. Vaihtelua esiintyy myös yksilöstä toiseen. Männyn puuaines<br />
sisältää keskimäärin 40 % selluloosaa, 25-30 % hemiselluloosaa ja 25-30 % ligniiniä<br />
(Jääskeläinen & Sundqvist 2007).<br />
1.8.2. Puun tunnistamisesta<br />
Puulajin tunnistamiseksi näytettä pitää yleensä tarkastella useammalta eri kantilta (kuva<br />
3a). Tavallisin tarkastelusuunta on poikkileikkaus, josta saadaan jo määritettyä onko<br />
kyseessä havu- vai lehtipuu. Havupuun tuntomerkkeinä poikkileikkauksessa nähdään<br />
säteensuuntaisesti tasaisesti järjestäytyneet putkisolut ja tarkkarajaiset vuosilustot sekä<br />
kapeat ydinsäteet. Useissa havupuissa on myös pihkatiehyitä. Lehtipuun puusolukon<br />
rakenne on monipuolisempi monine eri solutyyppeineen. Useiden lehtipuiden kevät- ja<br />
kesäpuut ovat samankaltaisia ja siten vuosilustojen rajat ovat huonommin erottuvia.<br />
Myös niiden ydinsäteet ovat monimuotoisempia, kuin havupuilla (Timonen 2000; Fagerstedt<br />
ym. 2005).<br />
Poikkileikkauksen lisäksi pitää useimmiten tarkastella tangentin ja säteen suuntaisia<br />
leikkeitä. Tangentin suunnasta voidaan havupuilla nähdä onko puussa yksirivisten ydinsäteiden<br />
lisäksi monirivisiä pihkatiehyellisiä ydinsäteitä. Säteen suuntaisesta leikkeestä<br />
14
nähdään onko ydinsäteiden putkisoluissa soluseinäpaksunnoksia ja millaisia ristikenttien<br />
huokoset ovat (Timonen 2000; Fagerstedt ym. 2005).<br />
1.8.3. Puun mikrobiologinen hajoaminen<br />
Puun hajottajamikrobeita ovat sienet ja bakteerit, jotka maan pinnalla ovat hyvin tehokkaita<br />
kuolleen puun hajottajia. Mikäli puu on joutunut kosteaan ympäristöön, kuten<br />
suohon, järveen tai meren pohjaan, sen hajoaminen hidastuu huomattavasti. Itämeren<br />
pohjoisosissa puu säilyy veden syvyyksissä sitä paremmin, mitä syvemmälle se on päätynyt,<br />
johtuen syvällä vallitsevasta matalasta lämpötilasta ja maan päälisiin olosuhteisiin<br />
verrattuna vähäisestä hapen määrästä (Björdal ym. 1999).<br />
Puun hajoaminen alkaa heti puun kuoltua. Maan päällä tehokkaimpia puun hajottajia<br />
ovat kantasienet (Basidiomycetes). Niiden aiheuttama hajoaminen voidaan jakaa morfologian<br />
mukaan valko- ja ruskolahoon (Blanchette ym. 1990; Eriksson ym. 1990). Kantasieniä<br />
ei tavata vedenalaisista ympäristöistä, sillä ne tarvitsevat runsaasti happea elintoimintoihinsa<br />
(Blanchette ym. 1990; Eriksson ym. 1990; Nilsson 1999). Sen sijaan<br />
katkolahoa aiheuttavat kotelosienet (Ascomycetes) ja vaillinaissienet (Deuteromycetes,<br />
Fungi imperfecti) pystyvät hajottamaan puuta myös veden alla (Blanchette ym. 1990;<br />
Eriksson ym. 1990; Björdal ym. 1999; Kärkkäinen 2003)<br />
Valkolaho on yleinen sienten aiheuttama hajoamisen muoto maan pinnalla. Se on saanut<br />
nimensä siitä, että sienet hajottavat aluksi puun ligniinin, jolloin jäljelle jää vaalea selluloosa.<br />
Ligniinin hajottua valkolahottajat voivat iskeä selluloosan ja hemiselluloosan<br />
kimppuun. Ne pystyvät myös hajottamaan elävää puuta (Blanchette ym. 1990; Eriksson<br />
ym. 1990; Kärkkäinen 2003).<br />
Ruskolahottajat ovat erikoistuneet hajottamaan puun soluseinien selluloosaa ja hemiselluloosaa<br />
mutta vähemmässä määrin ligniiniä, jolloin jäljelle jääneen ligniinin takia puu<br />
näyttää ruskealta. Ruskolahottajat iskevät alkuvaiheessa erityisesti puusolujen sekundaariseinän<br />
S2 kerrokseen edeten soluontelon suunnasta kohti ligniinipitoisempaa keskilevyä.<br />
Pidemmälle hajotessaan puu muuttuu pieneksi kuution muotoisista paloista<br />
koostuvaksi puruksi (Blanchette ym. 1990; Eriksson ym. 1990; Kärkkäinen 2003).<br />
Katkolahoa aiheuttavat sienet ovat sopeutuneet hajottamaan puuta myös hyvin kosteissa<br />
ympäristöissä ja tätä lahoa on havaittu muun muassa meren pohjaan joutuneiden hylky-<br />
15
jen puurakenteissa (Björdal ym. 1999). Paljain silmin katsottuna se muistuttaa ruskolahoa.<br />
Katkolahossa puu pehmenee ja hajoaa aluksi pinnastaan, mistä hajoaminen etenee<br />
hitaasti syvemmälle puun sisään. Sienirihma kaivautuu puusolun sekundaariseinän S2<br />
kerrokseen ja muodostaa lieriön muotoisia onteloita, jotka seuraavat S2 kerroksen selluloosamikrofibrillien<br />
rakennetta. Käytävien muodostumisen lisäksi tapahtuu soluseinien<br />
eroosiota soluontelon suunnasta keskilevyä kohti. Katkolahottajat pystyvät hajottamaan<br />
sekä selluloosaa että ligniiniä, mutta näiden hajoamisessa on eroa lehti- ja havupuiden<br />
välillä; lehtipuilla selluloosan on havaittu hajoavan ligniiniä herkemmin, kun taas havupuilla<br />
asia on päinvastoin. Katkolaho näyttääkin hajottavan lehtipuuta nopeammin kuin<br />
havupuuta (Eriksson ym. 1990). Katkolahottajia tavataan usein yhdessä puuta hajottavien<br />
bakteerien kanssa (Kim & Singh 2000; Kärkkäinen 2003).<br />
Bakteerit ovat ensimmäisiä kuolleeseen puuhun tunkeutuvia mikrobeja sekä maan pinnalla,<br />
että veden alla. Osa bakteereista hyödyntää puun tylppysolujen sisältöä, osa taas<br />
hajottaa varsinaista soluseinäainesta. Bakteerit iskevät usein helposti hajoaviin ydinsäteiden<br />
tylppysoluihin ja leviävät ydinsäteitä pitkin syvemmälle puusolukkoon. Ne myös<br />
hajottavat soluseinien välisiä huokosia ja voivat siirtyä ydinsäteiden tylppysoluista ristikentän<br />
huokosten kautta pitkittäisiin putkisoluihin (Blanchette ym. 1990; Eriksson ym.<br />
1990).<br />
Bakteerit voivat iskeä myös puun putkisoluihin ja hajottaa niiden soluseinien selluloosaa<br />
aiheuttaen soluseinien eroosiota. Nämä bakteerit ovat puun hajoamismorfologian<br />
mukaan nimetty eroosiobakteereiksi (Eriksson ym. 1990; Kärkkäinen 2003).<br />
Eroosiobakteerien hyökkäys alkaa soluontelon suunnasta puusolun sekundaariseinään ja<br />
se voi johtaa koko sekundaariseinän hajoamiseen, jolloin jäljelle jäävät vain primääriseinä<br />
ja keskilevy. Eroosiobakteerit pystyvät jossain määrin hajottamaan myös ligniiniä,<br />
jolloin hajoaminen voi jatkua yhdistetyn välilamellin alueelle (Blanchette ym. 1990;<br />
Eriksson ym. 1990). Eroosiobakteerien ja katkolahottajien aiheuttamia hajoamisjälkiä<br />
voi olla vaikea erottaa toisistaan, varsinkin jos bakteerien aiheuttama soluseinien eroosio<br />
on edennyt pitkälle. Alkuvaiheessa bakteerien aiheuttama eroosio eroaa katkolahon<br />
aiheuttamasta siten, että bakteerien hajottama soluseinä näyttää raidalliselta tai uurteiselta<br />
(Kim & Singh 2000). Eroosiobakteerit pystyvät myös hajottamaan puuta vähähappisessa<br />
ympäristössä veden alla, joten ne ovat potentiaalisia hylkypuun hajottajia (Gregory<br />
1998; Björdal 1999; Nilsson 1999; Kim & Singh 2000).<br />
16
Eroosiobakteereiden lisäksi ovat puun soluseinien hajoamismorfologian mukaan nimensä<br />
saaneet tunneli- (tunneling) ja kuoppabakteerit (cavitation). Tunnelibakteerit tekevät<br />
nimensä mukaan tunnelimaisia käytäviä soluseiniin ja ne pystyvät myös hajottamaan<br />
ligniiniä. Lisäksi ne voivat hajottaa suoja-ainein käsiteltyä puuta. Ne kuitenkin tarvitsevat<br />
runsaasti happea, eikä niitä juurikaan ole tavattu vettyneestä puusta (Blanchette ym.<br />
1990; Eriksson ym. 1990; Kärkkäinen 2003).<br />
Puun hajoaminen veden alla on huomattavasti hitaampaa kuin maan pinnalla ja vaikeammin<br />
hajoavat, runsaasti ligniiniä sisältävät keskilevyt jäävät näissä olosuhteissa helposti<br />
muuten hajonneen puun ehjäksi tukirangaksi. Katkolahon tai eroosiobakteerien<br />
hajottama vettynyt puu voi kosteana näyttää silmämääräisesti katsottuna lähes normaalilta,<br />
mutta puun lujuus heikkenee ja kuivuessaan se hajoaa helposti (Florian 1981;<br />
Björdal 1999; Björdal & Nilsson 2001).<br />
Kuivumisen aiheuttamaa kutistumista ja hajoamista puussa voidaan ehkäistä puuhun<br />
imeytettävien konservointiaineiden avulla eli korvaamalla puun sisältämä vesi, jolloin<br />
puu säilyttää muotonsa. Yleisesti käytetään polyetyleeniglykolia (PEG) eri vahvuisina<br />
liuoksina (Grattan & Clarke 1987).<br />
Bakteerien ja sienten aiheuttaman hajoamisen merkitys vettyneiden puuesineiden konservoinnin<br />
kannalta vaihtelee hajoamistyypistä ja hajoamisen laajuudesta riippuen.<br />
Eroosiobakteerien ja katkolahottajien aiheuttama hajoaminen voi ydinsäteiden tylppysolujen<br />
ja putkisolujen välisten huokosten hajotessa aluksi parantaa konservointiaineiden<br />
tunkeutumista puusolukkoon. Mutta hajoamisen edetessä pidemmälle bakteerien<br />
jäljiltä jää puun soluonteloihin osittain hajonnutta jäännösmateriaalia, mikä voi haitata<br />
konservointiaineiden pääsyä puuhun (Björdal, ym. 1999).<br />
1.9. Alkuaineanalyysi<br />
1.9.1 Rikki ja rauta puuhylkyjen uhkana<br />
Meren pohjassa maanneeseen puuhun kerääntyneiden rikin ja raudan on pinnalle noston<br />
jälkeen todettu aiheuttavan ongelmia puuesineiden ja puuhylkyjen konservoinnissa.<br />
Tunnetuimpia esimerkkejä näistä ongelmista ovat Vasa-laivan ja Mary Rosen hylyt,<br />
joiden puun pintarakenteisiin on noston jälkeen syntynyt rikkisaostumia. Molempien<br />
hylkyjen rakenteissa on havaittu myös rautasuoloja. Rautaionit katalysoivat rikkihapon<br />
17
muodostumista pelkistyneistä rikkiyhdisteistä ja happamat olosuhteet edistävät puun<br />
selluloosan hajoamista. Näiden kahden alkuaineen esiintyminen hylkypuussa onkin pinnalle<br />
nostettujen puuhylkyjen säilymisen kannalta hyvin haitallista (Sandström ym.<br />
2002; Sandström ym. 2005; Fors & Sandström 2006; Wetherall ym. 2007).<br />
1.9.2. Rikin ja raudan kerääntyminen puusolukkoon meriympäristössä<br />
Merivesi sisältää erilaisia suoloja, joista runsaimmat ovat kloridi, natrium, sulfaatti,<br />
magnesium, kalsium ja kalium (taulukko 2). Vaikka meriveden suolapitoisuus vaihtelee<br />
alueellisesti, eri suolojen määräsuhteet ovat hyvin vakioita. Rikkiä on luontaisesti merivedessä<br />
varsin runsaasti sulfaatin muodossa; Itämeressä seitsemän promillen (‰) saliniteettialueella<br />
noin 0,5 g/l, josta alkuainerikkiä hieman alle 0,2 g/l. Rautaa Itämeren<br />
vedessä taas on vähän, vain 1-10 µg/l. Itämeressä on myös runsaasti ravinnesuoloja,<br />
joista tärkeimmät ovat typen ja fosforin suolat (Voipio & Perttilä 1984; Aniansson<br />
1989; Perttilä 2006).<br />
Taulukko 2: Meriveden suolojen yleisimpien ionien osuus ja niiden määrät valtameressä (S=35 ‰) ja<br />
Itämeressä (S=7 ‰). Taulukon arvot on laskettu Voipio & Perttilä 1984 ja Perttilä 2006 mukaan. Alkuainerikin<br />
osuus ja määrät on laskettu sulfaatin ja rikin molekyylipainojen perusteella.<br />
Aine % merivedessä g/kg valtameressä g/kg Itämeressä<br />
Kloridi Cl - 55,29 19,35 3,87<br />
Natrium Na + 30,80 10,78 2,156<br />
Sulfaatti<br />
2-<br />
SO 4 7,74 2,71 0,542<br />
Magnesium Mg 2+ 3,66 1,28 0,256<br />
Kalsium Ca + 1,17 0,41 0,082<br />
Kalium K + 1,14 0,4 0,08<br />
Rikki S 2,57 0,9 0,18<br />
Meren pohjaan päätyneeseen hylkypuuhun vaikuttavat erilaiset kemialliset, fysikaaliset<br />
ja biologiset tekijät kuin siihen sen kasvuaikana tai sen ollessa laivan rakenneosana ovat<br />
vaikuttaneet. Puun huokoinen solurakenne täyttyy merivedellä ja puusolukkoon pääsee<br />
hiljalleen diffundoitumaan vedessä olevia suoloja ja muita yhdisteitä. Näin meren pohjassa<br />
makaavan puun sisältämien aineiden määräsuhteet vähitellen muuttuvat.<br />
Puuhun voi bakteeritoiminnan seurauksena rikastua pelkistyneitä rikkiyhdisteitä. Sulfaatin<br />
pelkistäjäbakteerit käyttävät hapettomissa olosuhteissa sulfaattia elektronien vas-<br />
18
taanottajana molekylaarisen hapen sijaaan hajottaessaan orgaanista ainesta (Böttcher &<br />
Lepland 2000). Tuloksena syntyy veteen liuennutta rikkivetyä, joka voi kulkeutua puun<br />
soluonteloita pitkin syvemmälle puuhun, missä se muiden bakteerien toiminnan seurauksena<br />
voi muuttua edelleen kiinteiksi rikkiyhdisteiksi ja alkuainerikiksi (Sandström<br />
ym. 2002; Fors & Sandström 2006).<br />
Esimerkkinä bakteerien aiheuttama sulfaatin pelkistyminen ja rikkivedyn syntyminen<br />
orgaanisen aineksen hajotessa hapettomissa merenpohjan olosuhteissa (esim. Böttcher<br />
& Lepland):<br />
(CH 2 O) 106 (NH 3 ) 16 (H 3 PO 4 ) + 53SO 4 2- + 14H + → 106 HCO 3 - + 16NH 4 + + HPO 4 2- + 53H 2 S<br />
Hylkypuussa esiintyvä rauta on tavallisesti peräisin hylyssä olevien rautaesineiden, kuten<br />
sen rakentamisessa käytettyjen rautanaulojen ja pulttien tai tykinkuulien yms. esineiden<br />
korroosiosta. Korroosiossa muodostuneet rauta(II)ionit muodostavat rikkivedyn<br />
kanssa pyriittiä (FeS 2 ) ja muita sulfideja (Fors & Sandström 2006).<br />
Puun pysyessä meren pohjassa ei rikin ja raudan kertymisestä liene puulle suurtakaan<br />
haittaa, mutta ongelmia voi syntyä, jos se nostetaan pinnalle. Pinnalla joutuvat pelkistyneet<br />
rikkiyhdisteet tekemisiin hapen kanssa, jolloin ne hapettuvat rikkihapoksi ja kuivuessaan<br />
muodostavat kiinteitä suoloja. Tätä hapettumisreaktiota katalysoivat puussa<br />
esiintyvät rautaionit. Puun säilymisen kannalta hapon muodostuminen on haitallista,<br />
sillä alhainen pH aiheuttaa selluloosan hydrolyysiä ja selluloosan hajotessa puu heikkenee.<br />
Syntyneiden kiinteiden suolojen vaatima tilavuus on myös suurempi verrattuna<br />
pelkistyneisiin rikkiyhdisteisiin ja tämän tilavuuden lisäyksen takia puu voi halkeilla<br />
(Fors & Sandström 2006; Wetherall ym. 2007).<br />
Esimerkkinä pelkistyneen pyriitin hapettuminen ferrosulfaatiksi ja rikkihapoksi (esim.<br />
Sandström ym. 2005; Fors & Sandström 2006):<br />
FeS 2 (s) + 7 / 2 O 2 + (n+1)H 2 O → FeSO4*n H 2 O(s) + H 2 SO 4 (aq)<br />
Pinnalle nostetuista hylyistä yksi tunnetuimmista on Tukholmassa museoitu Vasa-laiva,<br />
joka upposi neitsytmatkallaan Tukholman sataman edustalle 32 metrin syvyyteen vuonna<br />
1628. Olosuhteet meren pohjassa suurkaupungin edustalla olivat laivan säilymisen<br />
kannalta hyvät; vesi syvällä oli kylmää ja runsaan orgaanisen aineksen hajotuksen takia<br />
19
myös hapetonta. Näissä oloissa eivät puuta hajottavat eliöt viihtyneet ja laiva on säilynyt<br />
erittäin hyvin (Fors & Sandström 2006; Vasamuseet 2008)<br />
Vasa-laivaa ympäröineissä hapettomissa oloissa on sulfaatin pelkistys kuitenkin ollut<br />
vilkasta ja pelkistyneitä rikkiyhdisteitä on kertynyt laivan rakenteisiin. Laivan rakenteista<br />
tehdyissä alkuaineanalyyseissä on havaittu rikkiä olevan runsaimmin puun pintaosassa<br />
uloimman senttimetrin alueella ja määrän vähentyvän huomattavasti syvemmälle<br />
mentäessä. Rikkiä mitattiin ensimmäisen senttimetrin syvyydeltä yleisesti 5-6 massaprosenttia<br />
ja suurimmillaan jopa 10 massaprosenttia, mutta jo puolentoista senttimetrin<br />
jälkeen aina yhdeksän cm:n syvyyteen asti rikkiä oli 1 massaprosentti tai alle. (Sandström<br />
ym. 2002; Fors & Sandström 2006)<br />
Toinen esimerkki museoiduista laivoista on Britannialainen sotalaiva Mary Rose, joka<br />
upposi vuonna 1545 Portsmouthin edustalla Britanniassa vaatien lähes 400 ihmishenkeä.<br />
Mary Rose upposi 14 metrin syvyyteen vuorovesialueelle ja vähitellen osa hylystä<br />
peittyi sedimentillä. Sedimentin yläpuolelle jääneet osat hajosivat nopeasti mm. laivamadon<br />
(Teredo navalis) takia. Sedimentin sisälle hautautuneet hylyn osat taas olivat<br />
paremmin suojassa hajottajilta ja säilyivät kohtalaisen hyväkuntoisina. Hylyn jäännökset<br />
on nostettu ylös ja museoitu Portsmouthiin Mary Rose museoon (Fors & Sandström<br />
2006; The Mary Rose Trust 2008)<br />
Mary Roselta tehtyjen rikkianalyysien perusteella hylyn rakenteissa on rikkiä noin 1<br />
massaprosentti pinnasta aina 20 cm:n syvyydelle asti. Samanlaista rikkipiikkiä kuin<br />
Vasa-laivalla ei puun pintaosissa ole havaittavissa. Tämän on arveltu johtuvan siitä, että<br />
Mary Rosella sedimentti on estänyt hapettoman meriveden pääsyn puurakenteisiin<br />
(Sandström ym. 2005; Fors & Sandström 2006; Wetherall ym. 2007).<br />
Kolmas esimerkki rikkiyhdisteiden esiintymisestä hylkypuussa on Weser jokeen Saksassa<br />
uponnut Bremen Cog. Laiva rakennettiin arviolta vuonna 1380 ja se löydettiin<br />
Bremenin sataman edustalta 1962. Sittemmin se on nostettu paloina pinnalle ja rakennettu<br />
uudelleen Saksan merimuseoon. Koska hylky on maannut niukasti sulfaattia sisältävässä<br />
virtaavassa jokivedessä, on sen puuhun kertynyt hyvin vähän rikkiä. Rikin määrä<br />
on suurimmillaan 0,15 massaprosenttia puun pinnassa ja syvemmällä sitä on vain<br />
0,05 massaprosenttia. Puun rautapitoisuus on samaa luokkaa tai hieman korkeampi<br />
(Fors & Sandström 2006).<br />
20
1.9.3. Alkuaineanalyysin tausta ja teoriaa<br />
Alkuaineanalyysejä on käytetty arkeologisissa tutkimuksissa, kun on haluttu selvittää<br />
historiallisten esineiden alkuperää tai aitoutta. Alkuaineanalyyseillä on myös saatu tietoja<br />
esineiden ja asuinpaikkojen sekä näihin liittyvän ihmistoiminnan historiasta. Nykyisin<br />
alkuaineanalyysejä käytetään yhä enemmän myös historiallisten esineiden hajoamiseen,<br />
konservointiin ja säilymiseen liittyvissä tutkimuksissa (Dietrich ym. 1998; Schreiner<br />
ym. 2007).<br />
Alkuaineanalyysi pyyhkäisyelektronimikroskoopilla ja siihen liitetyllä alkuaineanalysaattorilla<br />
perustuu näytteeseen johdetun elektronisuihkun näytteessä aikaansaaman<br />
röntgensäteilyn analysointiin. Nykyisin käytetään lähinnä SEM/EDS (Scanning Electron<br />
Microscopy/Energy Dispersive Analysis) menetelmää (Scott ym. 1995; Schreiner<br />
ym. 2007). Tässä röntgenmikroanalyysiksi kutsutussa menetelmässä näytteeseen johdetaan<br />
voimakas elektronisuihku, jolla ionisoidaan näytteen alkuaineiden atomeja. Atomin<br />
ionisoituessa sen sisemmiltä elektronikuorilta poistuu elektroneja. Kun näihin sisäkuorille<br />
syntyneisiin aukkoihin siirtyy elektroneja ulommilta kuorilta, vapautuu energiaa<br />
röntgensäteilynä. Kullakin alkuaineella on sille tyypillinen röntgensäteilyn energia ja<br />
eri alkuaineiden tunnistus perustuu tämän karakteristisen säteilyn mittaamiseen (Holmberg<br />
& Perkkiö 1988; Scott ym. 1995).<br />
SEM/EDS menetelmän etuna se, että sillä saadaan tarkasti selville missä kohtaa näytteessä<br />
tiettyä alkuainetta esiintyy. Nykyaikaiseen ESEM (Environmental SEM) tai<br />
LVSEM (Low Vacuum SEM) mikroskooppiin yhdistettynä menetelmää voidaan käyttää<br />
myös herkkiin biologisiin materiaaleihin ja näyte voidaan usein säilyttää alkuperäisessä<br />
kunnossa. Tällaisen ei-kajoavan menetelmän käyttö on historiallisten esineiden<br />
tutkimiseksi usein välttämätöntä niiden ainutkertaisuuden takia. Isoista kappaleista on<br />
kuitenkin otettava näytepala, johtuen analyyseissä tyypillisesti käytettävien elektronimikroskooppien<br />
näytekammioiden pienestä koosta. SEM/EDS menetelmällä saadaan<br />
myös tehtyä kvantitatiivisia analyyseja ja alkuainemäärityskohta voidaan samaan aikaan<br />
kuvata ja yhdistää kuvaan alkuainemäärityksen tulokset (Scott ym. 1995; Schreiner ym.<br />
2007).<br />
21
1.10. DNA-tutkimukset<br />
1.10.1. Arkit, bakteerit ja sienet<br />
Mikrobeista bakteerit ja arkit kuuluvat prokaryootteihin, eli esitumallisiin ja sienet eukaryootteihin,<br />
eli aitotumallisiin eliöihin. Sienten lisäksi eukaryootteihin kuuluvat yksisoluiset<br />
levät ja alkueläimet, sekä monisoluiset kasvit ja eläimet (Storer ym. 1979;<br />
Rikkinen 1999).<br />
Bakteerit ja arkit ovat yksisoluisia ja alkeellisempia eliöitä kuin aitotumalliset. Niillä ei<br />
ole lainkaan tumaa, vaan niiden DNA on rengasmaisena kromosomina solun sisällä<br />
(Mäkelä ym. 1993). Arkit ovat hyvin vanha ryhmä, jonka edustajia tavataan maapallon<br />
ääriolosuhteista, kuten hyvin suolaisista ympäristöistä tai kuumista lähteistä. Genomiltaan<br />
ne intronijaksoineen muistuttavat enemmän eukaryootteja kuin bakteereita, sijoittuen<br />
näiden kahden ryhmän välimaastoon (Keeling & Doolittle 1995). Arkkeja elää<br />
myös Itämeren pohjasedimenteissä ja ne lienevät hyvin tärkeä osa sedimenttien prokaryoottiyhteisöjä<br />
(Cifuentes ym. 2000; Edlund ym. 2006). Arkkeja on löydetty myös<br />
pelagiaalisena järvivedestä (Jurgens ym. 2000).<br />
Bakteerit puolestaan ovat hyvin monimuotoinen ja arkkeja paremmin tunnettu eliöryhmä<br />
ja niitä tavataan kaikkialta, missä elämä on mahdollista. Itämeressä bakteereilla on<br />
hyvin suuri merkitys muun muassa vapaan veden perus- ja sekundaarituotannossa, orgaanisten<br />
aineiden mineralisoimisessa, ja ilmakehän typen sidonnassa (Sandberg ym.<br />
2004; Moisander, ym. 2007) Typen sidontaan pystyvät sinilevien lisäksi myös eräät<br />
heterotrofiset bakteerit (Boström ym. 2007). Sedimenteissä bakteerit hajottavat orgaanista<br />
ainesta ja osallistuvat esimerkiksi typen, fosforin, rikin ja raudan kiertoihin<br />
(Moeslund & Thamdrup 1994; Tuominen ym. 1999; Podgórska & Mudryk 2003). Osa<br />
bakteereista elää kokonaan hapettomissa ympäristöissä, osa pelkästään hapellisissa,<br />
mutta monet pystyvät selviämään kummassakin (Mäkelä ym. 1993).<br />
Eukaryootit lienevät aikojen kuluessa kehittyneet prokaryoottisista eliöistä. Niiden<br />
DNA on solukalvon ympäröimässä tumassa ja on kaksisäikeinen. Kasvit ovat autotrofisia,<br />
eli pystyvät itse tuottamaan tarvitsemansa orgaaniset aineet, mutta eläimet ovat joitakin<br />
alkueläimiä lukuun ottamatta heterotrofisia eli toisenvaraisia (Storer ym. 1979;<br />
Klug & Cummings 2002). Sienet eivät ole kasveja eivätkä eläimiä vaan kuuluvat omaan<br />
sienikuntaansa. Kaikki sienet ovat heterotrofisia, eli toisenvaraisia, joten ne ottavat tar-<br />
22
vitsemansa energian ja hiilen hajottamalla ympäristönsä orgaanista ainetta. Sienten perintöaines<br />
on tumassa ja niillä on kitiinistä tai joskus selluloosasta muodostunut soluseinä.<br />
Suurin osa sienistä muodostaa pitkiä, joko väliseinättömiä tai väliseinällisiä rihmoja,<br />
joissa voi olla useita tumia (Rikkinen 1998).<br />
DNA:n lisäksi eliöiden soluissa on ribosomaalista RNA:ta sekä lähetti ja siirtäjä<br />
RNA:ta. Eukaryoottien ja prokaryoottien ribosomaalisen RNA:n (rRNA) eri muodot<br />
poikkeavat hieman kooltaan. Näitä eroja on nimetty rRNA molekyylien sedimentaatioominaisuuksien<br />
perusteella ns. Svedbergin vakioiden avulla. Prokaryooteilla erään<br />
rRNA molekyylin vakio on 16S ja eukaryooteilla vastaava on 18S. Ribosomaalisen<br />
RNA:n tutkimusta voidaan hyödyntää mikrobien lajien ja sukulaisuussuhteiden tunnistamisessa,<br />
sillä rRNA muuttuu evoluutiossa hyvin hitaasti (Mäkelä ym. 1993; Helms &<br />
Kilstrup 2001; Klug & Cummings 2002).<br />
1.10.2. Mikrobien tunnistus DNA-tutkimusten avulla<br />
Mikrobien tunnistamiseksi DNA-tutkimusten avulla täytyy mikrobi-DNA saada eristettyä<br />
ja puhdistettua tutkittavasta materiaalista. Käytännössä tutkittava materiaali ja mikrobien<br />
soluseinät, solukalvot ja sienillä myös tumakalvo pitää rikkoa, jotta DNA saadaan<br />
esiin. Tähän on olemassa kaupallisia kittejä, joilla näytteestä saadaan eluoitua sen<br />
sisältämä kokonais-DNA.<br />
Puhdistettu DNA-eluaatti sisältää vielä liian vähän DNA:ta, jotta siitä voitaisiin tehdä<br />
jatkotutkimuksia. Seuraava vaihe on DNA:n monistaminen. DNA:ta monistetaan PCRmenetelmällä,<br />
jossa haluttua DNA:ta rakennetaan DNA-polymeraasi entsyymin avulla<br />
DNA:n ”rakennuspalikoista”, nukleotideista. Mukana on oltava lyhyt DNA-aluke, jonka<br />
mukaan monistettava uusi DNA alkaa rakentua. Tässä vaiheessa voidaan näytteestä<br />
eristetystä kokonais-DNA:sta monistaa vain haluttua DNA:ta tietyille mikrobiryhmille<br />
suunnitelluilla DNA alukkeilla.<br />
Monistetun PCR-tuotteen pitäisi nyt sisältää runsaasti haluttua DNA:ta. Monistettu<br />
DNA voidaan tutkia geelielektroforeesin avulla, jossa erikokoiset DNA-säikeet kulkevat<br />
eri nopeudella sähkökentässä. Kun mukana on tunnetun pituiset molekyylipainomarkkerit,<br />
voidaan PCR-tuotteen geelille synnyttämiä DNA-juovia verrata molekyylipainomarkkereiden<br />
sisältämien DNA-palojen synnyttämiin juoviin. Näin nähdään onko onnistuttu<br />
monistamaan haluttua DNA:ta.<br />
23
Monistettua DNA:ta voidaan mikrobien tunnistamiseksi tutkia eri menetelmillä. Siitä<br />
voidaan esimerkiksi tehdä DGGE-analyysi (Denaturing Gradient Gel Elektrophoresis).<br />
DGGE perustuu siihen, että eri lajien välillä on eroja saman geenin emäsjärjestyksessä,<br />
vaikka geenin pituus olisikin sama (Muyzer & Smalla 1998). PCR monistetusta, tässä<br />
vaiheessa vielä useita lajeja sisältävästä DNA:sta voidaan siis erotella eri lajien DNAfragmentit<br />
erilleen ja näin saada selville, miten monimuotoinen yhteisö näytteessä elää.<br />
Lajien tunnistamiseksi voidaan elektroforeesien avulla saadut DNA-fragmentit sekvensoida,<br />
eli määrittää niiden emäsjärjestys, ja saatua emäsjärjestystä voidaan verrata tunnettujen<br />
lajien tietokantoihin (Amann ym. 1992; Helms & Kilstrup 2001; Helms ym.<br />
2004).<br />
Hajottajamikrobien tunnistus vettyneestä arkeologisesta puumateriaalista on osoittautunut<br />
ongelmalliseksi. Valo- ja elektronimikroskooppitutkimuksilla ei varsinkaan bakteerien<br />
ja arkkien suhteen pystytä lajitunnistukseen, vaan yleensä saadaan selville lähinnä<br />
minkä muotoisia ne ovat ja muodostavatko ne esimerkiksi ketjuja, rykelmiä tai ovat<br />
yksittäin. Erilaisilla leimaustekniikoilla (mm. FISH) voidaan mikroskooppitutkimuksillakin<br />
saada tarkempaa tietoa (Moter & Göbel 2000). Sienten tunnistamiseen mikroskooppisilla<br />
menetelmillä on paremmat mahdollisuudet, sillä sieniä on mahdollista tunnistaa<br />
sieni-itiöiden morfologian avulla. Joitakin hajottajasieniä onkin voitu tällä menetelmällä<br />
tunnistaa myös vettyneestä arkeologisesta puusta (Palma 2004).<br />
Vettyneen arkeologisen puun hajottajabakteerit on aiemmin jouduttu nimeämään niiden<br />
puulle aiheuttaman hajottajamorfologian mukaan (Björdal 1999) Aivan viime aikoina<br />
on myös arkeologisesta puumateriaalista onnistuttu eristämään eläviä hajottajabakteereita<br />
ja viljelemään niitä. Näitä bakteereja on myös pystytty nimeämään DNA tutkimusten<br />
avulla (Helms ym. 2004).<br />
2) Aineisto ja menetelmät<br />
2.1. Puun kosteuspitoisuus ja tiheys<br />
Puun kosteuspitoisuuden ja tiheyden määrittämistä varten puu punnittiin analyysivaa’alla<br />
ja kuivattiin uunissa Suomen merimuseon konservointilaboratoriossa Helsingissä.<br />
Puunäytteen kuivasi konservaattori Eero Ehanti. Tulokset laskettiin käyttäen<br />
allaolevia kaavoja. Kaavat ovat samat, mitä käytettiin MoSS projektissa puun kosteuspitoisuutta<br />
ja tiheyttä laskettaessa (Palma 2004).<br />
24
Kosteuspitoisuus (MC, Moisture Content):<br />
MC (%) = märkäpaino - kuivapaino * 100<br />
kuivapaino<br />
Tiheys (R):<br />
R (g/cm 3 ) =<br />
1 ,<br />
(Umax/100) + (1/1,5)<br />
jossa Umax = näytteen kosteuspitoisuus ja 1,5 = puun solumateriaalin keskimääräinen<br />
tiheys (ks. Palma 2004).<br />
Lisäksi laskettiin puun jäännöstiheys (rD)<br />
rD (%) = R * 100,<br />
0,43 g/cm 3<br />
jossa 0,43 g/cm 3 on tuoreen männyn keskimääräinen tiheys (Schniewind 1990)<br />
2.2. Röntgentutkimus<br />
Röntgenkuvat otettiin Suomen kansallismuseon konservointilaitoksella puunäytteen<br />
lyhyemmästä irtisahatusta osasta (kuva 4). Näytteistä tehtiin tavalliset vaakasuorat kuvat<br />
(3 kpl), joista yksi kuvattiin sivulta ja kaksi päältä, sekä yksi stereopari. Toinen stereoparin<br />
kuvista kuvattiin vaakasuoraan ja toinen 10° kallistettuna. Tällä menetelmällä<br />
voidaan tarkastella näytteitä kolmiulotteisesti kun kuvien katseluun käytetään erityistä<br />
stereokatselulaitetta.<br />
Kuvat otettiin Rich Seifert & Co röntgenkuvauslaitteella ja katsottiin tavallisella valopöydällä.<br />
Stereokuvien katseluun käytettiin Topcon stereokatselulaitetta. Kuvat ja niissä<br />
käytetyt filmikoot sekä kuvausasetukset on esitetty taulukossa 3.<br />
25
Kuva 4. Röntgenkuvattu puunäyte<br />
Taulukko 3: Röntgenkuvauksessa käytetyt filmit ja kuvausparametrit.<br />
Kuva nro. Filmi Kuvan koko mA kVs min<br />
3116 StrD4Pb 20*30 cm 4,5 90 3<br />
3117 StrD5Pb 30*40cm 4 80 1,5<br />
3118 StrD5Pb 30*40cm 4 80 2,5<br />
3119 StrD4Pb 20*30 cm 4 80 3<br />
2.3. Puun mikroskooppitutkimukset<br />
2.3.1. Puulajimääritys<br />
Puunäytteen lajimääritys tehtiin Helsingin Yliopiston Luonnontieteellisen keskusmuseon<br />
kasvimuseolla. Puulajin määrityksen saloihin minut perehdytti konservaattori Tuuli<br />
Timonen. Puunäytteestä otettiin noin 1 cm * 1 cm kokoinen pala, joka jäädytettiin -10<br />
°C lämpötilassa. Jäädytetystä palasta tehtiin jääleikemikrotomilla (Leica CM 3500) 18<br />
µm:n paksuiset leikkeet kolmesta eri suunnasta; poikkileikkaus, säteen sekä tangentin<br />
26
suunta (kuva 3a). Leikkeet värjättiin safraniinilla ja alcian sinisellä ja suljettiin kanapalsamiin<br />
objektilasille (ohje kappaleessa 2.3.2). Preparaattia tarkasteltiin Leica DM 2500<br />
valomikroskoopilla.<br />
2.3.2. Puun valomikroskooppitutkimukset (LM)<br />
Valomikroskooppitutkimusta (LM) varten puunäytteestä sahattiin yhden cm:n paksuinen<br />
poikkileike, josta leikattiin seitsemän noin 1 cm * 1 cm kokoista palaa puun säteen<br />
suuntaisesti. Näytepalat numeroitiin yhdestä seitsemään puupalan ulkoreunasta sisäreunaan<br />
päin (kuva 5). Näin saatiin tarkasteltavaksi koko puunäytteen poikkileikkauspinta.<br />
Näytepalojen mikroskooppitarkastelun ja tulosten käsittelyn helpottamiseksi ne jaettiin<br />
palaa 4 lukuun ottamatta A ja B alueisiin, joita ei kuitenkaan leikattu erilleen.<br />
Kuva 5: Puunäytteen poikkileikkauspinta, josta näkyy miten näytepalat on otettu. Palan 1 puoli on puun<br />
rungon ulko-osaa ja palan 7 puoli sisäosaa. Poikkiviiva kunkin näytepalan keskellä kuvaa mikroskopoinnissa<br />
ja tulosten käsittelyssä käytettyä jakoa palan A- ja B- alueeseen, jolloin A-alue on aina näytepalan 1<br />
puoli.<br />
Näytepalat jäädytettiin -10 °C lämpötilassa ja niistä leikattiin 18 µm paksut poikkileikkeet<br />
käyttäen Leica CM 3050 jääleikemikrotomia. Paloista 1 ja 2 tehtiin myös säteensuuntaiset<br />
leikkeet. Leikkeistä valmistettiin safraniinilla ja alcian sinisellä värjätyt kes-<br />
27
topreparaatit (taulukko 4). Safraniini värjää ligniinipitoiset soluseinät punaisiksi ja puutumattomat<br />
selluloosapitoiset seinät värjäytyvät alcian sinisellä sinisiksi. Leikkeet valmisti<br />
laboratoriomestari Pirkko Harju.<br />
Taulukko 4: Valomikroskooppileikkeiden värjäys, dehyrointi ja kiinnitys objektilasille.<br />
1 tippa safraniinia (1%, 50%:ssa etanolissa)<br />
huuhtelu tislatulla vedellä<br />
1 tippa alcian sinistä (1% alcian blue, tislatussa vedessä)<br />
huuhtelu tislatulla vedellä<br />
70 % etanoli<br />
94 % etanoli<br />
100% etanoli<br />
1 tippa Histo Clear (kirkastus)<br />
peitinlasin liimaus kanadapalsamilla<br />
Lisäksi osa leikkeistä jätettiin värjäämättä ja suljettiin glyseroliin. Näytteiden tarkastelu<br />
tehtiin kuitenkin pääasiassa kestopreparaateista. Leikkeistä tutkittiin soluseinien kuntoa<br />
ja hajottajamikrobien esiintymistä käyttäen Leica DM 2500 valomikroskooppia. Leikkeet<br />
kuvattiin mikroskooppiin liitetyllä Leica DC 500 digitaalikameralla käyttäen Live<br />
Image tietokoneohjelmaa.<br />
2.3.3. Puun elektronimikroskooppitutkimukset (SEM)<br />
Elektronimikroskooppitutkimukset tehtiin Helsingin Yliopiston Biotekniikan Instituutin<br />
elektronimikroskopian yksikössä. Näytteiden tutkimuksiin käytettiin pyyhkäisyelektronimikroskooppia<br />
(Scannig Electron Microscope, SEM) ja SEM-näytteet tehtiin samoista<br />
seitsemästä poikkileikepalasta kuin valomikroskooppileikkeet. SEM:illä katsottava pinta<br />
oli myös sama, josta valomikroskooppileikkeet oli leikattu jääleikemikrotomilla, joten<br />
se oli valmiiksi hyvin tasainen. Näytteet valmistettiin alla olevan ohjeen mukaan<br />
(taulukko 5), ja valmistus vastaa MoSS tutkimuksissa käytettyä menetelmää (Palma<br />
2004). Näytevalmistukseen antoi hyödyllisiä käytännön vinkkejä laboratoriomestari<br />
Mervi Lindman.<br />
28
Taulukko 5: Elektronimikroskooppinäytteiden fiksointi ja dehydrointi.<br />
Fiksointi yön yli 3% glutaraldehydissä (tislatussa vedessä)<br />
Osmikointi 2% osmiumliuoksessa 9 h (2% OSO 4 tislatussa vedessä)<br />
Pesu tislatulla vedellä 10 min<br />
Dehydrointi nousevalla alkoholisarjalla:<br />
50% etanoli 20 min<br />
70% etanoli 20 min<br />
96% etanoli 20 min<br />
100% etanoli yön yli<br />
100% etanoli 8 h<br />
Puulle ominaisen kuivumisen aiheuttaman kutistumisen ja halkeilun välttämiseksi dehydroidut<br />
näytepalat kuivattiin kriittisen pisteen kuivausmenetelmällä (CPD), jossa<br />
näytteissä oleva alkoholi korvattiin nestemäisellä hiilidioksidilla käyttäen Bal-Tec CPD<br />
030 CPD laitetta. Näytteet huuhdeltiin laitteen näytekammiossa hiilidioksidilla kahdeksan<br />
kertaa ja viimeisen huuhtelun jälkeen kammion paine ja lämpötila nostettiin hiilidioksidin<br />
kriittiseen pisteeseen (73,8 bar, 31 °C), jossa nestemäinen hiilidioksidi höyrystyi.<br />
Lopuksi höyry poistettiin kammiosta alentamalla kammion paine hitaasti normaalin<br />
ilmanpaineen tasolle.<br />
Kuivatut näytepalat liimattiin hopealiimalla (Agar) alumiinisille näytealustoille ja päällystettiin<br />
platinalla platinasputterissa (Agar). Valmiit näytteet säilytettiin eksikaattorissa,<br />
kunnes ne mikroskopoitiin. Näytteet tutkittiin käyttäen Zeiss DSM 962 pyyhkäisyelektronimikroskooppia<br />
(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany).<br />
2.3.4. Valo- ja elektronimikroskooppinäytteiden arviointi<br />
Mikroskooppinäytteiden arviointia varten jaoin kunkin näytepalan kahteen osaalueeseen<br />
A ja B (kuva 5), joista arvioin puun kuntoa sekä mikroskopoidessa, että jälkeenpäin<br />
valokuvista. Koska tällaiselle arvioinnille ei ollut olemassa asteikkoa, muokkasin<br />
Brittiläisestä laivamatojen esiintymisen arviointiin käytetystä asteikosta tähän<br />
tutkimukseen sopivan karkean asteikon (taulukko 6).<br />
29
Taulukko 6: Mikroskooppitutkimuksissa puun hajoamisen ja mikrobien esiintymisen arvioinnissa käytetty<br />
asteikko. HA=hajomisaste. Muokattu laivamadon esiintymisen arviointiin käytetystä asteikosta (British<br />
Standard (EN 275: 1992)<br />
HA Kuvaus<br />
0 ei hajoamista eikä mikrobeja havaittavissa<br />
1 lievää soluseinien hajoamista, mikrobeja 50 %:ssa soluja<br />
2.4. Alkuaineanalyysi<br />
Alkuaineanalyysi tehtiin SEM/EDS menetelmällä samasta puun poikkileikkauksesta,<br />
mistä otettiin näytteet mikroskooppitutkimuksiin. Analyysiin otettiin neljä palaa, joista<br />
kustakin analysoitiin alkuaineet kahdesta kohdasta (kuva 6). Lisäksi palasta 1 tehtiin<br />
tarkempi kvantitatiivinen määritys yhdeksästä eri kohdasta. Näytepalat oli säilytetty<br />
erillisissä muovipurkeissa jääkaapissa (+4 °C) hylyltä otetussa merivedessä kolmen<br />
kuukauden ajan. Kontrolleiksi otettiin näytepalat kahdesta tuoreesta eteläsuomessa kasvaneesta<br />
männystä, joista kummastakin palasta analysoitiin alkuaineet kahdesta kohdasta.<br />
Alkuaineanalyysiä varten näytepalat ilmakuivattiin huoneenlämmössä 24 vuorokauden<br />
ajan. Kuivatuista paloista hiottiin analysoitava pinta tasaiseksi hiomapaperilla ja palat<br />
kiinnitettiin hiiliteipillä alumiininapeille. Palojen pinnalta napin pintaan tehtiin hopealiimalla<br />
sähköä johtava silta ja palat päällystettiin ohuella hiikalvolla käyttäen Bal-Tec<br />
CED030 hiilestyslaitetta. Kontrollinäytteiden pintaa ei tarvinnut hioa, sillä niiden pinta<br />
oli tasoitettu mikrotomilla.<br />
Näytteet analysoitiin Helsingin Yliopiston Biotekniikan instituutin elektronimikroskopian<br />
yksikössä käyttämällä Zeiss DSM 962 pyyhkäisyelektronimikroskooppia (Carl<br />
Zeiss, Oberkochen, Germany) ja siihen liitettyä Oxford Isis EDS-alkuainedetektoria<br />
(Oxford Instruments, UK). Analyysissä käytettiin korkeajännitettä 20 kV, työskentelyetäisyyttä<br />
25 mm ja 1000 kertaista suurennusta. Analyysilaitteistoa kalibroitiin 10 minuuttia,<br />
käyttämällä Micro-Analysis Consultants Ltd:n Fe-standardia 2928.<br />
Näytepalan 1 kvantitatiivinen analyysi tehtiin Turussa Top Analytica Oy:n Jeol JSM-<br />
6335F pyyhkäisyelektronimikroskoopilla (Jeol Ltd, Tokyo Japan) ja siihen liitetyllä<br />
Oxford Isis EDS-alkuainedetektorilla (Oxford Instruments, UK). Tässä analyysissä lait-<br />
30
teisto kalibroitiin käyttämällä kobolttia. Alkuaineanalyysin saloihin minua opastivat<br />
laboratoriomestari Mervi Lindman Helsingin Yliopistosta sekä laboratoriopäällikkö<br />
Jyrki Juhanoja Top Analytica Oy:stä.<br />
Alkuainetuloksista laskettiin näytteen sisältämien alkuainerikin ja -raudan suhteelliset<br />
osuudet eri syvyydellä näytteessä (kuva 6). Tulosten laskemisessa käytettiin näytteistä<br />
mitattujen rikki- ja rauta-atomien ionisaation purkautuessa syntyvien röntgensäteilyn<br />
intensiteettipiikkien arvoja. Piikkien intensiteetistä oli laskettu pois taustasäteily. Lisäksi<br />
näytteistä mitatuista intensiteettipiikeistä laskettiin kloridin, natriumin ja alkuainerikin<br />
määräsuhteet. Suhteista voidaan päätellä onko näytteeseen rikastunut rikkiä tai rautaa<br />
vai sisältääkö se näitä alkuaineita samassa suhteessa kuin merivesi.<br />
Kuva 6: Alkuaineanalyysin mittauskohdat puun poikkileikkauksessa.<br />
2.5. DNA-tutkimukset<br />
DNA-tutkimusten teossa minua ohjasi mikrobiologi Leone Montonen Helsingin Yliopiston<br />
Maatalous-metsätieteellisen tiedekunnan Soveltavan kemian ja mikrobiologian<br />
laitokselta.<br />
31
Näytteet DNA-tutkimuksia varten otettiin saman poikkileikkauksen kohdalta puunäytteestä,<br />
mistä mikroskooppitutkimuksetkin tehtiin. Näytteeksi otettiin puuainesta puun<br />
pintaosasta noin kahden cm:n syvyydelle asti sekä puun pinnalla ollutta biofilmiä kahdesta<br />
eri kohtaa (taulukko 7). Näytteet otettiin steriloidulla skalpellilla ja pakastettiin<br />
steriileihin eppendorf-putkiin (-20 °C).<br />
Taulukko 7: DNA-tutkimuksia varten puusta otetut näytteet ja niiden kuvaus.<br />
Näyte Kuvaus<br />
1 Puun pintaosaa, joka erittäin pehmeää ja pitkälle hajonnutta<br />
2 Samasta kohtaa kuin näyte 1, mutta 1-2 cm:n syvyydeltä, myös melko pehmeää<br />
3 Puun pinnalta limamaista vihertävää biofilmiä ja pinnan hajonnutta puuainesta<br />
4 Puun pinnalta vaaleampaa biofilmiä ja pinnan hajonnutta puuainesta<br />
Pakastetuista DNA-näytteistä eristettiin kokonais-DNA käyttäen PowerSoil DNAeristyskittiä<br />
(Mo Bio Laboratories, Inc. Carlsbad, CA, USA). Näytteestä 1 tehtiin rinnakkaiset<br />
1a ja 1b eristykset, muista yksi eristys kustakin. Yhteen eristykseen käytettiin<br />
0,25 g näytemateriaalia. Eristyksen jälkeen DNA-eluaatit (100 µl/näyte) pakastettiin<br />
jatkotutkimuksia varten.<br />
Pakastetuista eluaateista monistettiin DNA:ta PCR menetelmällä kolmella eri kerralla.<br />
Saadut PCR-tuotteet eroteltiin geelielektroforeesilla ja tuloksia verrattiin kaupallisiin<br />
molekyylipainomarkkereihin.<br />
Ensimmäisessä PCR monistuksessa näytteistä haettiin bakteereita ja arkkeja niitä tunnistavilla<br />
yleisalukkeilla. Toisessa monistuksessa käytettiin sieniä tunnistavia alukkeita<br />
(ITS) ja lisäksi bakteereista sulfaatin pelkistäjiä tunnistavia alukkeita. Sulfaatin pelkistäjiä<br />
haettiin, sekä yleisalukkeilla (SRB), että erään sulfaatin pelkistyksen avainentsyymin,<br />
dissimilatorisen sulfiitin reduktaasin (DSR) geenin alukkeiden avulla.<br />
Kolmannella kerralla monistettiin arkeista DNA:ta mahdollista DGGE ajoa varten jo<br />
monistetusta arkki-DNA:sta. Tässä ns. nested PCR menetelmässä käytettiin alukkeita,<br />
jotka tunnistavat emäsjärjestyksen aiemman PCR-tuotteen sisältä. Lisäksi kokeiltiin<br />
uudestaan sienten ja sulfaatin pelkistäjien (DSR) saamista esille eri reaktiolämpötilojen<br />
ja -aikojen avulla<br />
Kaikissa PCR monistuksissa käytettiin samoja reagensseja lukuun ottamatta alukkeita<br />
(primer). Käytetyt reagenssit on esitetty taulukossa 8 ja alukkeet taulukossa 9. PCR mo-<br />
32
nistuksissa käytetyt protokollat vaihtelivat hieman reaktiolämpötilojen ja -aikojen suhteen<br />
PCR ajosta toiseen. Protokollat on esitetty taulukossa 10. Elektroforeesigeelinä<br />
käytettiin 1,5 % agaroosigeeliä tehtynä 1x natriumboraattipuskuriin, paitsi kolmannessa<br />
PCR:ssä käytettiin sienille ja sulfaatin pelkistäjille (DSR) 1,5 % agaroosigeeliä tehtynä<br />
1x TAE-puskuriin. Kaikista näytteistä tehtiin laimennokset 1:1 ja 1:10.<br />
Taulukko 8: DNA-monistuksissa käytetty PCR-lios<br />
Reagenssi Määrä Selite<br />
Puskuri 10 µl F-511 for Dynazyme DNA-polymerase<br />
dNTP 2 µl 10 mM, nukleotidiseos<br />
polymeraasi 10 µl Dynazyme DNA-polymeraasi<br />
F-primer 10 µl Forvard primer<br />
R-primer 10 µl Reverse primer<br />
H 2 0 10 µl steriloitu milli-Q vesi<br />
Taulukko 9: DNA-monistuksissa käytetyt alukkeet (primer), mitä DNA:ta ne tunnistavat, sekä niiden<br />
monistaman tuotteen koko emäspareina (bp).<br />
PCR Forvard primer Reverse primer Tunnistaa bp (noin)<br />
PCR 1 fD1, 20 pmol/µl rD1, 20 pmol/µl bakteerit 1500<br />
PCR 1 ArUn4F, 20 pmol/µl A934b, 20 pmol/µl Arkit 900<br />
PCR 2 DSR1F, 20 pmol/µl DSR4R, 20 20 pmol/µl Dissimilatorinen sulfiitin reduktaasi 1900<br />
PCR 2 ITS1, 20 pmol/µl ITS4, 20 pmol/µl Sienet 700-900<br />
PCR 2 SRB385C, 20 pmol/µl 1387r, 20 pmol/µl Sulfaatin pelkistäjät, δ-proteobakteerit 1000<br />
PCR 3 Ar3F, 20 pmol/µl 9 C, 18,4 pmol/µl Arkit 900<br />
PCR 3 DSR1F, 20 pmol/µl DSR4R, 20 20 pmol/µl Dissimilatorinen sulfiitin reduktaasi 1900<br />
PCR 3 ITS1, 20 pmol/µl ITS4, 20 pmol/µl Sienet 700-900<br />
Taulukko 10: DNA-monistuksissa käytetyt PCR-reaktiolämpötilat ja -ajat<br />
PCR 1 PCR 2 PCR 3 Arkit PCR 3 DSR PCR 3 Sienet<br />
Vaihe T °C min. T °C min. T °C min. T °C min. T °C min.<br />
1 95 4 94 4 95 4 95 4 94 5<br />
2 94 1 94 1 92 1 94 1 94 1<br />
3 50 1 50 1 55 1 54 1 56 1<br />
4 72 2,5 72 2 72 3 72 2,5 72 1<br />
5 goto 2 40* goto 2 40* goto 2 35* goto 2 40* goto 2 40*<br />
6 72 10 72 10 72 10 72 10 72 10<br />
7 4 5 4 5 4 hold 4 20 4 20<br />
8 15 hold 15 hold<br />
Elektroforeesiajoissa käytetyt geelit valmistettiin sekoittamalla 3,75 g agaroosia ja 250<br />
ml puskuria ja kuumentamalla seosta mikroaaltouunissa 5 minuuttia. Tämän jälkeen<br />
geeliin lisättiin etidiumbromidia (7 µl / 250 ml), joka värjää DNA:n ultraviolettivalossa<br />
33
näkyväksi. Kuuma geeli valettiin vetokaapissa pipetointikaivot sisältävään muottiin ja<br />
jäähdytettiin kiinteäksi.<br />
Näytteet pipetoitiin geelin kaivoihin sellaisenaan ja laimennettuna 1:10 steriloituun milli-Q<br />
veteen latauspuskuri-värimarkkerin kanssa, (Blue/Orange Loading Dye, Promega<br />
Corporation, Madison WI, USA) 10 µl näytettä 4 µl puskuria. Lisäksi pipetoitiin negatiiviset<br />
kontrollit kuten näytteet, sekä molekyylipainomarkkeri (100 bp DNA ladder,<br />
N3231S, 0,5µg/µl, New England Bio Labs Inc, Ipswich MA, USA) sekoitettuna latauspuskuri-värimarkkeriin<br />
(1µl ladder, 9µl latauspuskuri-värimarkkeri). Viimeisessä<br />
PCR:ssä käytettiin edellä mainitun molekyylipainomarkkerin rinnalla lisäksi markkeria,<br />
joka sisälsi pidempiä DNA-fragmentteja aina 10000 emäspariin asti (Gene Ruler,<br />
#SMO331, 0,5µg/µl, Fermentas Inc, Ontario, Canada).<br />
Natriumboraattipuskuriin tehdyt geelit ajettiin 20 minuuttia jännitteellä 250 V ja TAEpuskuriin<br />
tehdyt geelit 120 V jännitteellä 1h 20 min Thermo EC 340 elektroforeesilaitteella.<br />
Geelit kuvattiin UV-valossa Kodak DC290 digitaalikameralla yhdistettynä Kodak<br />
Molecular Imaging Software-ohjelmistoon.<br />
3) Tulokset<br />
3.1. Puun kosteuspitoisuus ja tiheys<br />
Puunäyte, josta kosteuspitoisuus ja tiheys laskettiin, painoi ennen kuivausta 4,253 g ja<br />
kuivauksen jälkeen 1,236 g. Näiden arvojen perusteella kosteuspitoisuudeksi (MC) saatiin:<br />
MC = 4,253 g - 1,236 g * 100 = 238,6 %<br />
1,236g<br />
ja tiheydeksi (R) saatiin:<br />
R =<br />
1<br />
(238,6/100) + (1/1,5)<br />
= 0,33 g/cm 3<br />
34
ja puun jäännöstiheys (rD) oli siten:<br />
rD = 0,33 g/cm 3 * 100 = 77 %<br />
0,43 g/cm 3<br />
3.2. Röntgentutkimus<br />
Röntgenkuvat ovat hyvälaatuisia ja stereoparin kohdistaminen onnistui helposti. Kuvista<br />
näkyy, että puu on kokonaisuudessaan varsin hyväkuntoinen ja puun toisessa laidassa<br />
oleva reikä näkyy kuvissa selvästi (kuva 7). Puunäytteen kapeammassa päässä on puun<br />
sisään diffundoitunut jotain tunnistamatonta ainetta joka vaimentaa röntgensäteilyä ja<br />
näkyy kuvissa vaaleana alueena. Stereoparin perusteella tämä aine on jakautunut lähes<br />
tasaisesti koko puun paksuudelta, kuitenkin niin, että sitä on hieman enemmän puun<br />
suoran pinnan puolella kuin kuperan pinnan puolella. Puussa näkyy myös tunnistamaton<br />
säännöllisen muotoinen vaalea kuvio hieman puun keskeltä kohti puun kapeaa päätä.<br />
Laivamatoa tai sen käytäviä ei puussa ole.<br />
35
Kuva 7: Puunäytteen röntgenkuvat. Kuvaan on vertailun helpottamiseksi otettu mukaan myös normaali<br />
valokuva samasta näytepalasta. Kaksi alinta kuvaa muodostavat yhdessä stereoparin. Röntgenkuvat: Leena<br />
Tomanterä.<br />
3.3. Puun mikroskooppitutkimukset<br />
3.3.1. Puulajimääritys<br />
Näyte osoittautui metsämännyksi (Pinus sylvestris) eli samaksi kotoiseksi mäntylajiksi,<br />
joka kasvaa meidänkin metsissämme. Männylle tyypilliset tuntomerkit olivat helposti<br />
nähtävissä valomikroskooppileikkeissä. Poikkileikkeestä nähtiin selvästi suuret pihkatiehyet,<br />
joiden epiteelisolut ovat ohutseinäiset, tarkkarajaiset vuosilustot ja kevätpuun<br />
36
vaihettuminen jyrkästi kesäpuuksi. Säteen suuntaisesta leikkeestä nähtiin, että ristikentän<br />
huokoset ovat iso- eli ikkunahuokosia ja että ydinsäteen putkisoluissa on hammaspaksunnoksia.<br />
Tangentin suuntaisesta leikkeestä tarkasteltiin vielä pihkatiehyellisten<br />
ydinsäteiden korkeutta ja saatiin poissuljettua metsämännyn (P. sylvestris) amerikkalainen<br />
sukulainen amerikanpunamänty (P. resinosa), jonka pihkatiehyelliset ydinsäteet<br />
ovat matalammat kuin metsämännyllä (Hoadley 1990).<br />
3.3.2. Puun valo- ja elektronimikroskooppitutkimukset<br />
Esitän alla lyhyen kuvauksen mikroskooppitutkimusten havainnoista kustakin näytepalasta<br />
esimerkkikuvien kanssa. Näytteissä alue A on näytepalan 1 puoli puun poikkileikkauksessa<br />
ja alue B näytepalan 7 puoli (kuva 5). Syvyys on etäisyys (mm) näytepalan 1<br />
pinnasta syvemmälle rungon sisään. Mikroskooppitutkimusten tulokset olen tiivistänyt<br />
taulukossa 11.<br />
Näytepala 1, alue A (syv. n. 0-5mm, kuva 8):<br />
Näytteen 1 uloin reuna on pahasti hajonnutta ja hajottajana on ainakin jokin katkolahoa<br />
aiheuttava sieni, mutta seassa voi olla myös bakteereita (kuva 8a). Näytteen ulommaisen<br />
osan putkisolujen soluseinien S2-kerros on suurimmaksi osaksi hajonnut ja vain soluseinien<br />
keskilevyt ovat jäljellä, mutta nekin osaksi katkeilleet (kuva 8a). Sisempänä<br />
soluseinät ovat ehjempiä, mutta S2-kerroksen sisällä näkyy poikkileikkautuneita sienirihmoja<br />
ja niiden aiheuttamia onteloita (kuva 8b ja 8e). Säteensuuntaisessa leikkeessä<br />
nähdään myös katkolaholle tyypillinen sienirihmaston spiraalimainen leviäminen soluseinän<br />
selluloosamikrofibrillien suuntaisesti (kuva 8c).<br />
Poikkileikkeessä sienirihmaston esiintymisalueen raja on tarkka, minkä jälkeen soluseinät<br />
ovat melko ehjiä (kuva 8a ja 8d). Niissä kuitenkin on siellä täällä bakteerien aiheuttamaa<br />
hajoamista alkaen soluontelon suunnasta. Bakteereita on myös kerääntynyt soluonteloiden<br />
sisälle, vaikka niiden seinät eivät olisikaan hajonneet (kuva 8f). Bakteerit<br />
ovat keskittyneet ydinsäteisiin ja niitä reunustaviin putkisoluihin. Myös osassa pihkatiehyitä<br />
on bakteereita ja näissä tiehyiden tylppysolut ovat hajonneet.<br />
Näytepala 1, alue B (syv. n. 5-10 mm):<br />
Näytteessä 1 sisemmälle mentäessä on hajoaminen selvästi vähäisempää. Soluseinät<br />
ovat melko ehjiä, mutta soluonteloiden sisällä on siellä täällä runsaasti bakteereita.<br />
37
Ydinsäteet ovat myös pitkälle kolonisoituneet bakteereilla ja solut ovat hajonneet useasta<br />
kohtaa. Bakteerit ovat selvästi levinneet ydinsäteitä pitkin. Myös osassa pihkatiehyitä<br />
on bakteereita ja tiehyiden tylppysolut ovat hajonneet.<br />
Näytepala 2, alue A (syv. n. 10-15 mm, kuva 9):<br />
Näytteen 2 A-alueen putkisolujen soluseinät ovat suurimmaksi osaksi ehjiä (kuva 9d-<br />
9f). Soluonteloiden sisällä ja pihkatiehyissä on kuitenkin siellä täällä bakteerimassaa ja<br />
bakteerien aiheuttamaa eroosiota näkyy soluseinässä ontelon puolella (kuva 9a ja 9b).<br />
Myös ydinsäteissä näkyy bakteereita ja niiden tylppysolut ovat paikoitellen hajonneet.<br />
Soluseinien keskilevyt ovat ehjiä ja kokonaisuudessaan puu vaikuttaa varsin hyväkuntoiselta.<br />
Tässä osassa näytettä ei näytä olevan katkolahon aiheuttamaa hajoamista.<br />
Näytepala 2, alue B (syv. n. 15-20 mm, kuva 9):<br />
Näytteen 2 B-alue on hyvin samantapainen, kuin A-alue. Näytteen vasemmassa reunassa<br />
on kuitenkin alkavaa katkolahoa erään pihkatiehyen vieressä olevan kapean kesäpuun<br />
putkisolujen soluseinissä (kuva 9c).<br />
Näytepala 3, alue A (syv. n. 20-25 mm):<br />
Näytteen 3 A-alue on melko ehjää. Katkolahon rihmastoa ei näy, mutta bakteereita on<br />
sekä ydinsäteissä että siellä täällä putkisolujen onteloissa. Soluseinät vaikuttavat kuitenkin<br />
hyväkuntoisilta.<br />
Näytepala 3, alue B (syv. n. 25-30 mm, kuva 10):<br />
Näytteen 3 B-alue on selvästi enemmän hajonnut, kuin A-alue. Soluonteloissa on melko<br />
paljon bakteereita, jotka näyttävät levinneen puusolukon sisään ydinsäteitä pitkin (kuva<br />
10a ja 10f). Joissakin kohdissa ydinsäteet ja niitä reunustavien kevätpuun putkisolujen<br />
seinät ovat hajonneet (kuvat 10b-10d). Myös kesäpuun putkisolujen seinien S2 kerrokset<br />
ovat paikoitellen pitkälle hajonneet (kuva 10e). Siellä täällä soluonteloiden sisällä<br />
näkyy tunnistamatonta hyvin ohutta rihmaa, joka ei kuitenkaan vaikuta katkolahon rihmastolta.<br />
38
Näytepala 4, (syv. n. 30-35 mm, kuva 11):<br />
Näytepala 4 on kapeampi kuin muut palat, joten siinä ei ole kahta aluetta. Näyte on<br />
enemmän hajonnut oikeasta reunastaan (kuva 11a). Bakteerit ovat levinneet ydinsäteitä<br />
pitkin ja ydinsäteet ja niitä reunustavat putkisolut ovat paikoitellen pitkälle hajonneet,<br />
kuten myös useat pihkatiehyet (kuvat 11a-11d). Soluseinien S2 kerroksen hajoamista<br />
näkyy myös kesäpuun putkisolujen seinissä (kuva 11e). Kuten näytteessä kolme, on<br />
tässäkin näytteessä tunnistamatonta hyvin ohutta rihmaa, joka ei vaikuta katkolahon<br />
rihmastolta (kuva 11f).<br />
Näytepala 5, alue A (syv. n. 35-40 mm, kuva 12):<br />
Näytteen 5 A-alue on melko ehjä ja hajoaminen on keskittynyt lähinnä ydinsäteisiin ja<br />
niitä ympäröiviin putkisoluihin (kuva 12a). Hajottajina tällä alueella näyttäisivät olevan<br />
bakteerit, mutta tässäkin näytteessä on samaa tunnistamatonta ohutta rihmaa, kuten<br />
näytteissä 3 ja 4.<br />
Näytepala 5, alue B (syv. n. 40-45 mm, kuva 12):<br />
Näytteen 5 B-alue on huomattavasti pidemmälle hajonnut, kuin A-alue. Tämä kohta on<br />
kaikkein eniten hajonnut alue koko poikkileikkeen sisäosasta. Bakteereita näkyy runsaasti<br />
erityisesti ydinsäteissä ja niitä ympäröivissä putkisoluisissa, joiden soluseinät ovat<br />
pitkälle hajonneita (kuvat 12b-12f). Myös pihkatiehyiden epiteelisolut ovat monesta<br />
kohtaa hajonneet. Tässä osassa näytettä on myös katkolahon rihmastoa muistuttavaa<br />
rihmaa soluonteloissa.<br />
Näytepala 6, alue A (syv. n. 45-50 mm, kuva 13) ja alue B (syv. n. 50-55 mm, kuva 13)<br />
Näyte 6 on kokonaisuudessaan kohtalaisen hyväkuntoinen (kuva 13a ja 13d). Sen kummallakin<br />
puolella on kuitenkin lievää bakteerien aiheuttamaa hajoamista, joka on<br />
näyttää levinneen ydinsäteitä pitkin (kuvat 13b, 13c ja 13f). Ydinsäteiden ympärillä<br />
olevissa putkisoluissa näkyy myös jonkin verran hajoamista. Pihkatiehyet ovat tässä<br />
osassa suurimmaksi osaksi ehjiä (kuva 13e), mutta jotkut ovat hajonneet (kuvat 13b ja<br />
13c). Näytteen 6 hajonnein osa on keskimmäisen kesäpuun alueella (kuva 13c). Katkolahoa<br />
muistuttavaa rihmastoa on putkisolujen onteloissa vähän (kuvat 13b ja 13c).<br />
39
Näytepala 7, alue A (syv. n. 55-60 mm, kuva 14):<br />
Näytteen 7 A-alue on melko hyväkuntoinen (kuvat 14d-14f). Siellä täällä on kuitenkin<br />
merkkejä bakteereista, jotka näyttäisivät levinneen ydinsäteitä pitkin. Osassa ydinsäteitä<br />
reunustavia putkisoluja ovat soluseinät ja osassa pihkatiehyitä tylppysolut hajonneet.<br />
Katkolahoa ei tällä alueella havaittu.<br />
Näytepala 7, alue B (syv. n. 60-65 mm, kuva 14):<br />
Näytteen 7 B-alue, joka on myös koko poikkileikkauksen toinen ulkoreuna, on pahasti<br />
hajonnut (kuvat 14a-14c). Hajoaminen on samankaltaista, kuin näytepalan 1 A-alueen<br />
ulkoreunassa, eli vaikuttaa katkolahon aiheuttamalta ja tässä kohdassa näyttäisi olevan<br />
myös bakteereita. Hajonnein osa ei kuitenkaan vaikuta aivan niin leveältä, kuin näytepalassa<br />
1. Leikkeestä sitä on kuitenkin vaikea arvioida tarkasti, sillä kaikkein hajonnein<br />
osa on huuhtoutunut pois leikettä valmistettaessa.<br />
Sisempänä näytteessä on myös bakteerien aiheuttamaa hajoamista, joka on keskittynyt<br />
ydinsäteisiin ja niiden ympäristöön. Siellä täällä kauempanakin ydinsäteistä on soluonteloiden<br />
sisällä runsaasti bakteerimassaa. Monin paikoin myös pihkatiehyiden tylppysolut<br />
ovat hajonneet.<br />
40
Kuva 8: Näytepala 1. Kuvat a-c LM ja d-e SEM kuvia. a) ja d) Näytteen ulkopinta on hyvin hajonnut ja<br />
siinä on runsaasti sienirihmastoa. b) ja e) Sekä kevät- että kesäpuun putkisolujen soluseinien S2 kerros<br />
katkolahottajan voimakkaasti hajottamaa, yhdistetty välilamelli ehjä. LM-kuvissa soluonteloissa ja -<br />
seinissä siniseksi värjäytynyttä sienirihmastoa. c) Säteensuuntaan pitkittäin leikattujen putkisolujen soluonteloissa<br />
sienirihmastot suuntautuneet soluseinän selluloosamikrofibrillien suuntaisesti. f) Bakteerimassaa<br />
ydinsäteen tylppysoluihin rajoittuvissa pitkittäisten putkisolujen soluonteloissa. LM kuvat T.<br />
Timonen ja V. Kinnunen. LM preparaatti P. Harju.<br />
41
Kuva 9: Näytepala 2. Kuvat a-c LM ja d-e SEM kuvia. a) ja b) Hyväkuntoista solukkoa, jossa kuitenkin<br />
siellä täällä mustaksi värjäytynyttä bakteerimassaa ja siniseksi värjäytynyttä sienirihmastoa ydinsäteiden<br />
ja pihkatiehyen tylppysoluissa sekä pitkittäisissä putkisoluissa. c) Ulomman, oikeanpuoleisen kesäpuun<br />
putkisolujen soluseinän S2-kerroksessa näkyy katkolahoa aiheuttavaa siniseksi värjäytynyttä sienirihmastoa,<br />
sisemmän kesäpuun putkisolujen seinissä ei näy sienirihmastoa. Yhdessä ylhäällä olevan ydinsäteen<br />
reunustamassa putkisolussa on tummaa bakteerimassaa. d) Tervettä puusolukkoa. Kevät- ja kesäpuun<br />
rajalla näkyy pihkatiehyt ehjine tylppysoluineen. e) ja f) Kesäpuun putkisolujen soluseinät ovat ehjät.<br />
Kuvassa f keskellä putkisolujen välissä ydinsäteen putkisoluja. LM kuvat T. Timonen ja V. Kinnunen.<br />
LM preparaatti P. Harju.<br />
42
Kuva 10: Näytepala 3. Kuvat a-c LM ja d-e SEM kuvia. a) - f) Paikoitellen pitkälle hajonnutta puusolukkoa.<br />
Tummaa bakteerimassa on runsaasti sekä ydinsäteiden tylppysoluissa että niitä reunustavissa pitkittäisissä<br />
putkisoluissa. Ydinsäteiden tylppysolujen ja putkisolujen väliset isohuokoset ovat monin paikoin<br />
kokonaan hajonneet. d) Kevätpuun putkisolujen soluonteloissa bakteerimassaa. e) Kesäpuun putkisoluja.<br />
Oikeanpuoleisten putkisolujen sekundaariseinät ovat paikoitellen hajonneet. f) Sauvamaisia bakteereja<br />
kevätpuun putkisolun soluontelossa soluseinän pinnalla. LM kuvat T. Timonen ja V. Kinnunen. LM preparaatti<br />
P. Harju.<br />
43
Kuva 11: Näytepala 4. Kuvat a-c LM ja d-e SEM kuvia. a) Ydinsäteitä pitkin puun sisään levinnyttä bakteerimassaa,<br />
joka on värjäytynyt mustaksi. b) Kaksi hajonnutta pihkatiehyttä, toinen kevätpuussa ja toinen<br />
kevät- ja kesäpuun rajalla. c) Bakteerimassaa ydinsäteen tylppysoluissa ja niitä ympäröivissä putkisoluissa.<br />
d) Yleiskuva kahden vuosiluston alueelta. Keskellä oleva kesäpuu on paikoitellen hajonnut ja vasemmalla<br />
alhaalla on hajonnut ydinsäde. e) Ehjää kesäpuuta, mutta keskellä muutama pitkälle hajonnut putkisolu.<br />
f) Tunnistamattomaksi jäänyttä ohutta rihmaa kevätpuun soluonteloissa. LM kuvat T. Timonen ja<br />
V. Kinnunen. LM preparaatti P. Harju.<br />
44
Kuva 12: Näytepala 5. Kuvat a-c LM ja d-e SEM kuvia. a) Yleiskuva näytteen 5 A-alueelta, jonka solukko<br />
on suurimmaksi osaksi ehjää. b) ja c) Näytteen B-alue on pitkälle hajonnutta erityisesti ydinsäteiden ja<br />
niitä ympäröivien putkisolujen kohdalta. d) - f) Ydinsäde ja sitä ympäröivät putkisolut ovat pitkälle hajonneet.<br />
LM kuvat T. Timonen ja V. Kinnunen. LM preparaatti P. Harju.<br />
45
Kuva 13: Näytepala 6. Kuvat a-c LM ja d-e SEM kuvia. a) Näyte 6 on kokonaisuudessaan varsin hyväkuntoinen.<br />
b) ja c) Ydinsäteissä ja niitä reunustavissa putkisoluissa on siellä täällä kuitenkin bakteerimassaa<br />
ja jonkin verran sienirihmastoa. Putkisolut ovat osin hajonneet. (kuva b=kuvan a oikeanpuoleisen<br />
kesäpuun alaosasta, kuva c=keskimmäisen kesäpuun alaosasta) d) Yleiskuva SEM:illä e) Ehjää kesäpuuta,<br />
jossa kaksi ehjää pihkatiehyttä f) Hajonnut ydinsäde kevätpuussa. LM kuvat T. Timonen ja V. Kinnunen.<br />
LM preparaatti P. Harju.<br />
46
Kuva 14: Näytepala 7. a) Näytteen B-alue (ulkoreuna) on pitkälle hajonnutta solukkoa, jossa on sekä<br />
sienirihmastoa, että bakteereita, jotka ovat edenneet syvemmälle puuhun ydinsäteitä pitkin. b) Siniseksi<br />
värjäytynyttä sienirihmastoa, jonka esiintymisraja kevätpuussa on melko tarkka. c) Katkolahottajan pitkälle<br />
hajottamaa kesäpuuta, jossa soluseinien S2-kerrokset ovat hajonneet, mutta solujen väliset keskilevyt<br />
ovat ehjät. Kevätpuussa näkyy solusienien sisällä sinisiä pilkkuja, jotka ovat poikkileikkautunutta<br />
sienirihmaa. Rihmastoa on myös soluonteloissa. d) - f) Näytteen A-alueella puusolukko on hyväkuntoista<br />
ja soluseinät ehjiä. LM kuvat T. Timonen ja V. Kinnunen. LM preparaatti P. Harju.<br />
47
Taulukko 11: Mikroskooppitutkimusten tulokset tiivistetysti. et = etäisyys puunäytteen yläpinnasta (mm).<br />
Hajoamisasteen (HA) kriteerit on esitetty taulukossa 3. S=sienirihmaa, B=bakteereita, S2=soluseinän<br />
selluloosakerros, KL=soluseinän keskilevy, YS=ydinsäde, PT=pihkatiehyt. + = mikrobeita havaittu, - = ei<br />
mikrobeita, = epävarma havainto.<br />
Näyte et (mm) HA S B S2 KL YS PT<br />
1 A 0-5 4 + + + + + +<br />
1 B 5-10 2 - + + - + +<br />
2 A 10-15 1 - + + - + +<br />
2 B 15-20 1 + + + - + +<br />
3 A 20-25 1 - + + - + -<br />
3 B 25-30 2 + + + + +<br />
4 30-35 2 + + + + +<br />
5 A 35-40 2 + + + + +<br />
5 B 40-45 3 + + + + +<br />
6 A 45-50 2 - + + + + +<br />
6 B 50-55 2 - + + + + +<br />
7 A 55-60 2 - + + + + +<br />
7 B 60-65 4 + + + + + +<br />
3.4. Alkuaineanalyysi<br />
Alkuaineanalyysi osoitti, että puuhun on kertynyt sekä rikkiä, että rautaa. Myös meriveden<br />
suoloja natriumia ja kloridia oli näytteissä enemmän, kuin pinnalta peräisin olevissa<br />
kontrollinäytteissä. Rikkiä ja rautaa oli eniten lähellä puun pintaa olevissa mittauspisteissä<br />
50mm ja 80mm kohdalla, minkä jälkeen niiden määrä väheni 160mm ja 210mm<br />
kohdalla (kuvat 15 ja 16). Rikin pitoisuus nousi uudestaan syvemmällä puussa. Ero rikin<br />
määrässä ei kuitenkaan ollut minkään mittauskohdan välillä suuri. Rautaa oli eniten<br />
näytteen uloimmassa osassa, minkä jälkeen sen määrässä ei ollut suurta vaihtelua (kuva<br />
16).<br />
Näytteiden sisältämät kloridin ja rikin sekä natriumin ja rikin määräsuhteet olivat huomattavasti<br />
pienemmät kuin meriveden vastaavat suhteet. Meriveden sisältämä kloridin<br />
ja rikin laskennallinen suhde on noin 22 ja natriumin ja rikin noin 12, kun näytteistä<br />
laskettu kloridin ja rikin suhde vaihteli 0,44 ja 2,45 välillä ja natriumin ja rikin suhde<br />
0,48 ja 1,53 välillä (kuva 17). Näytteistä laskettu kloridin ja natriumin suhde oli samaa<br />
luokkaa kuin merivedessä.<br />
Kontrollinäytteistä ensimmäisessä (K1) ei havaittu lainkaan rikkiä, eikä rautaa, mutta<br />
toinen (K2) sisälsi kumpaakin alkuainetta pieniä määriä. Myös hylkypuussa havaittujen<br />
meriveden suolojen määrät olivat kontrollinäytteissä hyvin pieniä (kuva 15).<br />
.<br />
48
Kuva 15: Näytteiden sisältämien alkuaineiden intensiteetit mittauspisteittäin. Näytenumerot ovat graafien<br />
oikeassa yläkulmassa, K=kontrollinäyte. Korkeat piin intensiteetit johtuvat näytteenvalmistuksen virheestä<br />
(ks. Tulosten tarkastelu kohta 4.4.)<br />
49
intensiteetti (cps)<br />
40<br />
35<br />
30<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0<br />
S<br />
Fe<br />
1a (50 mm)<br />
1b (80 mm)<br />
2a (160 mm)<br />
2b (210 mm)<br />
3a (280 mm)<br />
3b (340 mm)<br />
5a (520 mm)<br />
5b (600 mm)<br />
K1a<br />
K1b<br />
K2a<br />
K2b<br />
Kuva 16: Näytteiden sisältämien rikin ja raudan suhteellinen osuus eri mittauspisteissä. K=kontrollinäyte.<br />
Tulokset on laskettu vähentämällä mitatusta intensiteettipiikin huippuarvosta taustan säteily.<br />
25,00<br />
20,00<br />
suhde<br />
15,00<br />
10,00<br />
Cl/S<br />
Na/S<br />
Cl/Na<br />
5,00<br />
0,00<br />
1a<br />
1b<br />
2a<br />
2b<br />
3a<br />
3b<br />
5a<br />
5b<br />
1T<br />
meri<br />
näyte<br />
Kuva 17: Näytteiden ja meriveden sisältämien kloridin (Cl) ja natriumin (Na) määrän suhde rikin (S)<br />
määrään sekä kloridin ja natriumin vastaava määräsuhde. Näyte 1T on Top Analyticassa erikseen analysoitu<br />
näytepala.<br />
50
Taulukko 12: Näytepalan 1 kvantitatiivisen analyysin tuloksena mitatut alkuaineiden määrät (massa %)<br />
eri mittauskohdissa. Korkeat piin pitoisuudet johtuvat näytteenvalmistuksen virheestä (ks. Tulosten tarkastelu<br />
kohta 4.4.)<br />
Mittauskohta C O Na Mg Si S Cl Ca Fe Yht.<br />
Spot 68,88 27,48 0,30 0,00 0,00 1,31 0,73 0,03 1,27 100<br />
Alue 5000x 57,79 40,38 0,28 0,04 0,26 0,44 0,35 0,04 0,42 100<br />
Spot 69,24 29,48 0,28 0,07 0,12 0,31 0,38 0,04 0,08 100<br />
Spot 69,45 28,06 0,27 0,06 0,03 0,91 0,51 0,03 0,68 100<br />
Kesäpuu 750x 53,35 43,15 0,23 0,04 1,18 0,75 0,19 0,04 1,07 100<br />
Kevätpuu 750 56,01 34,19 0,17 0,05 8,59 0,37 0,15 0,04 0,44 100<br />
Spectrum 11 55,81 37,83 0,38 0,11 4,44 0,52 0,38 0,09 0,45 100<br />
Kesäpuu 2 uloin 5000x 58,16 39,41 0,37 0,08 0,85 0,31 0,52 0,10 0,19 100<br />
Kesäpuu sisäreuna 750 x 53,14 43,32 0,29 0,05 2,21 0,30 0,35 0,05 0,28 100<br />
Keskiarvo 60,20 35,92 0,29 0,06 1,96 0,58 0,40 0,05 0,54<br />
Max. 69,45 43,32 0,38 0,11 8,59 1,31 0,73 0,10 1,27<br />
Min. 53,14 27,48 0,17 0,00 0,00 0,30 0,15 0,03 0,08<br />
3.5. DNA-tutkimukset<br />
Ensimmäisessä PCR tutkimuksessa näytteestä etsittiin bakteereja ja arkkeja ja kaikissa<br />
näytteissä havaittiin molempia. Elektroforeesikuvassa (kuva 18) näkyvät bakteerit n.<br />
1500 emäsparin (bp) kohdalla ja arkit n. 900 emäsparin kohdalla.<br />
Kuva 18. Bakteerien ja arkkien elektroforeesikuva. B = bakteerit, A= arkit. Näytteiden molemmilla reunoilla<br />
olevissa kaivoissa on molekyylipainomarkkerit. 1000 bp sijainti näkyy viivan kohdalla kuvan oikeassa<br />
reunassa. (L. Montonen & V. Kinnunen)<br />
Toisessa PCR-tutkimuksessa näytteestä etsittiin sieniä ja sulfaatinpelkistäjiä. Sulfaatinpelkistäjien<br />
tunnistamiseksi käytettiin sekä sulfaatin pelkistyksen avainentsyymiä<br />
(DSR) koodaavan geenin aluketta, että sulfaatinpelkistäjien yleisaluketta (SRB). Näytteistä<br />
ei saatu lainkaan esille sieniä ja sulfaatinpelkistäjien DSR geenin osalta näytteet<br />
51
olivat myös negatiivisia, paitsi näyte 1 jäi epävarmaksi. SRB yleisaluke taas antoi näytettä<br />
2 lukuun ottamatta positiivisen tuloksen (kuva 19).<br />
Kuva 19. SRB:n elektroforeesikuva. Geelin oikeassa reunassa olevassa kaivossa on molekyylipainomarkkeri,<br />
johon on merkitty 1000 bp sijainti viivan kohdalle. (L. Montonen & V. Kinnunen)<br />
Kolmannessa PCR-tutkimuksessa arkeista pyrittiin jatkotutkimuksia varten monistamaan<br />
DNA:ta ensimmäisen arkki-PCR:n tuotteista. Tässä monistuksessa kaikissa näytteissä<br />
saatiin positiivinen tulos (kuva 20). Tutkimuksessa ei saatu sulfaatin pelkistäjien<br />
DSR geeniä eikä sieniä varmuudella esille, vaikka sulfaatin pelkistäjissä näytteen kolme<br />
ja sienissä näytteen neljä kohdalla geelissä näkyikin heikot juovat. Mahdollinen positiivinen<br />
tulos on kuitenkin epävarma.<br />
52
Kuva 20. Arkkien elektroforeesikuva. Näytteiden molemmilla reunoilla olevissa kahdessa vierekkäisessä<br />
kaivossa on molekyylipainomarkkerit. 1000 bp sijainti näkyy kuvan oikeassa reunassa olevan viivan<br />
kohdalla. (L. Montonen & V. Kinnunen)<br />
Yhteenveto PCR-tuloksista on esitetty taulukossa 13.<br />
Taulukko 13: Yhteenveto PCR tuloksista. + = havaittu. - = ei havaittu, = epävarma havainto. DSR =<br />
dissimilatorisen sulfiitin reduktaasi, SRB = sulfaatinpelkistäjät, yleisaluke.<br />
PCR-ajo Primerit Ryhmä Näyte 1 Näyte 2 Näyte3 Näyte 4<br />
PCR 1 fD1-rD1 bakteerit + + + +<br />
PCR 1 ArUn4F-A934b arkit + + + +<br />
PCR 2 DSR1F-DSR4R DSR - - -<br />
PCR 2 ITS1-ITS4 sienet - - - -<br />
PCR 2 SRB385C-1387r SRB + - + +<br />
PCR 3 Ar3F-9C arkit + + + +<br />
PCR 3 DSR1F-DSR4R DSR - - -<br />
PCR 3 ITS1-ITS4 sienet - - - <br />
4) Tulosten tarkastelu<br />
4.1. Puun kosteuspitoisuus ja tiheys<br />
Puun kosteuspitoisuus 238,6 % oli korkeampi, kuin keskimäärin MoSS projektin yhteydessä<br />
mitatuissa kolme/viisi kuukautta ja 12 kuukautta pohjassa maanneissa mäntynäytteissä<br />
(taulukko1). Myös tiheys 0,33 g/cm 3 oli pienempi, kuin MoSS projektin näytteissä<br />
ja näyte oli 23 % kevyempi kuin keskimääräinen tuore mänty on. Vaihteluvälit MoSS<br />
projektin näytteissä olivat kuitenkin melko suuret ja esimerkiksi yhdessä Darsser Kogge<br />
hylyn viiden kuukauden näytteessä kosteuspitoisuus ja tiheys olivat lähes samat, kuin<br />
nyt tutkitussa 236 vuotta pohjassa maanneessa hylkypuussa.<br />
53
Vesipitoisuuden ja tiheysmääritysten perusteella puunäyte sisältää enemmän kosteutta<br />
ja vähemmän puuainesta kuin vuoden pohjassa maanneet MoSS-projektin yhteydessä<br />
tutkitut puunäytteet, eli on niitä enemmän hajonnut. Ero MoSS-projektissa tutkittuihin<br />
näytteisiin on kuitenkin pieni. Tämä kertoo siitä, että vaikka puu on jonkin verran<br />
enemmän hajonnut, on se kuitenkin varsin hyvässä kunnossa.<br />
Mary Rose hylyltä ennen sen nostoa vuonna 1979 tehdyissä kosteusmittauksissa oli<br />
mukana näytteitä sekä hylyn varsinaisen rungon tammipuusta, että mäntyä olevasta hylyn<br />
rakenneosasta. Männyn kosteuspitoisuudeksi tutkimuksessa saatiin 225 % (Squirrel<br />
& Clarke 1987), minkä perusteella laskin puun tiheydeksi 0,34 g/cm 3 . Mary Rosen hylyn<br />
mäntynäyte on siis ennen hylyn nostoa ollut hyvin samanlainen kuin nyt tutkittu<br />
<strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong>n mäntynäyte. Mary Rose oli tuolloin maannut pohjassa 405 vuotta. Squirrel<br />
& Clarke (1987) toteavat kuitenkin tamminäytteiden osalta kosteuspitoisuuden vaihtelun<br />
olevan suurta hylyn eri osien välillä, joten näistä kahdesta eri hylyltä peräisin olevasta<br />
mäntynäytteestä ei välttämättä voi tehdä kovin pitkälle meneviä johtopäätöksiä.<br />
Puun tiheys verrattuna keskimääräiseen tuoreen männyn tiheyteen on 77 % eli puu on<br />
23 % tuoretta mäntyä kevyempi. Kuivattu näyte oli läheltä puun pintaosaa, missä mikroskooppitutkimusten<br />
perusteella oli soluseinistä eniten hajonnut puun selluloosapitoinen<br />
S2 kerros, mutta runsaasti ligniiniä sisältävä yhdistetty välilamelli oli melko ehjä.<br />
Suurin osa massan häviämisestä lienee siten soluseinien kiteistä selluloosaa ja tällainen<br />
puu on menettänyt hyvin paljon lujuudestaan. Olisi mielenkiintoista tehdä puunäytteestä<br />
vielä tiheysmäärityksiä myös syvemmältä ja lisäksi kemiallisia analyysejä soluseinien<br />
rakennekomponenttien hajoamisen selvittämiseksi.<br />
Tässä tutkimuksessa tehtyjen puun kosteuspitoisuuden ja tiheysmittauksen tuloksia arvioitaessa<br />
pitää ottaa huomioon, että näytepala oli otettu puun reunasta, missä esimerkiksi<br />
Mary Rose hylyn tamminäytteissä kosteuspitoisuus oli puun keskiosaa suurempi<br />
(Squirrel & Clarke 1987). On mahdollista, että tästäkin näytepalasta olisi saatu pienempiä<br />
kosteusarvoja syvemmältä puusta tehdyistä mittauksista.<br />
4.2. Puun röntgentutkimus<br />
Röntgentutkimuksen perusteella puu on hyväkuntoinen, eikä siinä ole merkkejä laivamadosta<br />
(Teredo navalis). Myöskään MoSS projektin yhteydessä <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> hylyltä<br />
röntgenkuvatuista, kolme ja 12 kuukautta pohjassa olleista puunäytteissä ei laivamatoa<br />
54
havaittu (Palma 2004). Tämän ja MoSS projektin yhteydessä tehtyjen tutkimusten perusteella<br />
voidaan melko varmasti sanoa, että laivamatoa ei esiinny <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong>n ympäristössä,<br />
sillä sen pelaginen toukka iskee hanakasti lähes mihin tahansa meren pohjassa<br />
saatavilla olevaan puuhun ja kolonisoituminen on nopeaa ja selvästi havaittavissa jo<br />
vuoden pohjassa maanneessa puussa (Palma 2004; Westin ym. 2006).<br />
En kuitenkaan pitäisi mahdottomana, etteikö laivamato voisi levitä varsinaisen Itämeren<br />
alueelle, missä suolapitoisuus on 6-7 promillea. Tulokaslajit pääsevät liikkumaan ja<br />
valtaamaan uusia elinalueita helposti laivojen painolastivesien mukana ja erityisesti<br />
tämä pätee vapaan veden lajeihin ja niihin lajeihin, joilla on planktinen toukkavaihe.<br />
Koska aikuinen laivamato ja sen toukkavaihe voivat selvitä hengissä jopa viiden promillen<br />
suolapitoisuudessa, voisi varsinaisella Itämerellä laivan painolastitankista veteen<br />
päässyt toukka periaatteessa iskeä sopivaan puuhun ja kasvaa siinä, jos tällainen puu<br />
sattuisi kyseisessä paikassa olemaan tarjolla. Leviämisen esteenä lienee lähinnä se, että<br />
lisääntyäkseen laivamato tarvitsee korkeamman, noin 11 promillen suolapitoisuuden<br />
(Norman 1977). Jos laivamato pääsisi leviämään Suomen rannikolle, olisi se varmasti<br />
vakava uhka rannikkomme puuhylyille. Mutta mikäli laivamato voisi helposti sopeutua<br />
varsinaisen Itämeren olosuhteisiin, olisi se luultavasti sieltä jo havaittu, koska laivamadolla<br />
on ollut sopeutumiseen tuhansia vuosia aikaa.<br />
Röntgenkuvissa puun kapeassa päässä havaittu vaaleana näkyvä aines jää tässä tutkimuksessa<br />
tunnistamatta. Kyseessä voi olla esimerkiksi raudan korroosiosta syntyneet ja<br />
puun sisään diffundoituneet suolat, joita havaittiin myös alkuainetutkimuksilla. Metallisuolat<br />
vaimentavat filmille pääsevää röntgensäteilyä tehokkaammin kuin puusolukon<br />
kevyemmät alkuaineet, jolloin niiden kohdalla filmi näyttää samanlaiselta, kuin näissä<br />
kuvissa havaitut vaaleat alueet (Leena Tomanterä 2007, henk. koht. tiedonanto). On<br />
mahdollista, että puunäytteen kapean pään lähellä hylyn kannella on ollut jokin rautaesine,<br />
joka on aikojen kuluessa korrodoitunut ja kenties hävinnyt kokonaan. Tosin tämä<br />
mahdollinen esine voi myös olla vieläkin kannella ja olisikin mielenkiintoista tarkistaa<br />
hylyn kansi puunäytteen ottokohdan vierestä.<br />
Puun toisessa päässä näkyvä reikä on tarkkarajainen, eikä sen ympärillä ole nähtävissä<br />
edellä mainitun kaltaista vaaleampaa ainesta. Reiässä ei todennäköisesti siis ole ollut<br />
rautaesinettä. Reikä kuitenkin lienee puussa jonkin liitoksen tai vastaavan kohdalla ja<br />
55
siinä on saattanut olla esimerkiksi köysi joka on aikojen kuluessa hävinnyt olemattomiin.<br />
Puunäytteen keskustasta hieman kapeaan päähän päin näkyvä tarkkarajainen vaalea<br />
jälki jää tässä tutkimuksessa tunnistamatta. Kyseessä voi olla esimerkiksi jonkin puussa<br />
kiinni olleen metallilaatan korrodoitumisesta syntynyt jälki.<br />
Kaiken kaikkiaan puunäytteen läpivalaisu röntgenillä on helppo ja luotettava tutkimus<br />
ja sillä saadaan mielestäni paljon hyödyllistä perustietoa arkeologisesta puuaineksesta.<br />
Röntgentutkimukset soveltuvat arkeologisen materiaalin tutkimuksiin erittäin hyvin,<br />
koska ne eivät tuhoa tutkittavaa puumateriaalia, joka yleensä on ainutkertainen.<br />
4.3. Puun mikroskooppitutkimukset<br />
4.3.1. Puulajimääritys<br />
<strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> hylyn kannelta pinnalle nostettu irtonainen puunäyte osoittautui metsämännyksi<br />
(Pinus sylvestris). Itse hylyn rungon uskotaan kuitenkin hyvin suurella todennäköisyydellä<br />
olevan tammea (Minna Leino 2008, henkilökohtainen tiedonanto). Puunäyte<br />
ei siis ole varsinaisen hylyn runkopuuta, joten se lienee peräisin jostain muusta<br />
hylyn rakenteesta, kuten partaasta tai takilasta. Tätä tukee myös se, että puunäyte nostettiin<br />
muiden kannella olevien irtonaisten puukappaleiden joukosta ja hylky sijaitsee sellaisessa<br />
paikassa, johon ei voi helposti joutua puuta hylyn ulkopuolelta. Lisäksi puunäytteessä<br />
olleet köyden, puutapin tms. reiät viittaavat vahvasti hylyn rakenneosaan.<br />
4.3.2. Valo- ja elektronimikroskooppitutkimukset<br />
Puunäytettä käsiteltäessä se vaikuttaa hyväkuntoiselta ohutta pintakerrosta lukuun ottamatta.<br />
Pintaosa on noin viiden mm:n paksuudelta niin pahasti hajonnut, että koskettaessa<br />
se hajoaa ja irtoaa. Myös mikroskooppileikkeitä tehdessä leikkeisiin jäi vain osa hajonneinta<br />
pintakerrosta, koska kaikkein hajonnein osa huuhtoutui värjättäessä pois. Puuta<br />
sahattaessa vaikutelma puun hyvästä kunnosta sai vahvistuksen, sillä poikkileikkauksen<br />
sahaaminen oli totista työtä. Puu myös tuoksui aivan kuin tuore puu, johon sekoittui<br />
lievä tervan tuoksu.<br />
Mikroskooppitutkimukset paljastivat puun hajonneimman pintaosan hajottajaksi jonkin<br />
katkolahoa aiheuttavan sienen. Katkolahon esiintymistapa näytteessä sopii hyvin sille<br />
56
tyypilliseen leviämiseen puun pintakerroksesta hitaasti puun sisäosiin päin (Blanchette<br />
ym. 1990). Preparaateista näkyi, että etenemisraja oli yllättävän jyrkkä ja että sienirihmasto<br />
ulottui puun pinnasta vain noin viiden millimetrin syvyydelle (näytepalat 1 ja 7).<br />
Valomikroskoopilla voitiin myös havaita poikkileikkautuneita sienirihmoja puun putkisolujen<br />
sekundääriseinän S2-kerroksessa ja säteen suuntaisessa leikkeessä sienirihmat<br />
näkyivät spiraalimaisena selluloosamikrofibrillien suuntaisesti. Edellä kuvattu esiintyminen<br />
on tyypillistä katkolahottajille (Eriksson ym. 1990; Kim & Singh 2000). Puun<br />
hajonneimpien pintaosien putkisolujen soluseinät olivat hajonneet kokonaan mukaan<br />
lukien primääriseinä ja keskilevy, mutta sisempänä sienen aiheuttamat vauriot rajoittuivat<br />
sekundaariseinään.<br />
Katkolahoa on aikaisemmin todettu Itämerestä Kraveln hylyltä (Björdal ym. 1999) ja<br />
viitteitä siitä saatiin myös MoSS projektin yhteydessä <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> hylylle viedyistä,<br />
vuoden pohjassa maanneista puunäytteistä (Palma 2004). Katkolahon esiintyminen<br />
<strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> hylyltä nostetussa puunäytteessä ei siis ole mikään yllätys. Katkolahoa<br />
aiheuttavat sienet pystyvät hajottamaan puuta tällaisessa vähähappisessa vesiympäristössä,<br />
missä valko- ja ruskolaho eivät selviä. <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> hylyllä vallitsevat ympäristöolosuhteet<br />
eivät kuitenkaan vaikuta olevan optimaaliset katkolahottajille. Puu on<br />
maannut meren pohjassa 236 vuotta, mutta vain noin viisi mm puun pintakerroksesta on<br />
katkolahon vaurioittamaa eli hajoaminen on varsin hidasta. Yhtenä syynä katkolahon<br />
hitaaseen etenemiseen lienee hylyllä ympäri vuoden vallitseva alhainen lämpötila.<br />
Myös havaitut bakteerien aiheuttamat vauriot puunäytteessä olivat odotettuja, sillä bakteerien<br />
aiheuttamasta hajoamisesta <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> hylyn ympäristössä saatiin viitteitä jo<br />
MoSS projektin yhteydessä hylyllä kolmen kuukauden ja vuoden pohjassa olleista puunäytteissä<br />
(Palma 2004). Myös muualla vastaavanlaisissa ympäristöissä on havaittu<br />
bakteerien aiheuttamaa hajoamista (Eriksson 1990; Björdal ym. 1999; Kim & Singh<br />
2000). Yllätys sen sijaan oli että bakteerien aiheuttamia vaurioita esiintyi niin laajasti<br />
koko puunäytteen alueella. Bakteerit olivat selvästi hyödyntäneet puun sisään johtavaa<br />
luonnollista reittiä, ydinsäteitä. Puutumattomat ydinsäteiden tylppysolut sisältöineen<br />
ovat ilmeisesti helppoa ja mieluista ravintoa bakteereille.<br />
Bakteerien siirtyminen ydinsäteissä tylppysoluista toiseen näyttää siis olevan bakteereille<br />
varsin helppoa. Bakteerien yleinen esiintyminen ydinsäteiden tylppysoluja reunustavissa<br />
pitkittäisissä putkisoluissa saattaa johtua siitä, että ydinsäteiden tylppysolujen ja<br />
57
pitkittäisten putkisolujen väliset ristikentän huokoset ovat suuria ja herkkiä rikkoutumaan.<br />
Ne ovat vaivaton reitti bakteerien etenemiselle puun sisään (Tuuli Timonen 2008,<br />
henkilökohtainen tiedonanto).<br />
Yleisesti käytetyn, morfologian mukaiselle hajoamisluokittelulle tyypillisten tuntomerkkien<br />
mukaan tulkitsen havaitun bakteerien aiheuttaman hajoamisen eroosiobakteerien<br />
aiheuttamaksi. Eroosiobakteerit leviävät tyypillisesti ydinsäteitä pitkin ja ne hajottavat<br />
ydinsäteiden tylppysoluja. Ydinsäteitä reunustavien putkisolujen sekundaariseinän<br />
hajoaminen myös alkaa yleensä soluontelosta ja bakteerit esiintyvät laikuttain solujen<br />
sisällä (Blanchette ym. 1990; Björdal ym. 1999; Kim & Singh 2000).<br />
Hajoamismorfologian mukaan nimetty puuta hajottavien bakteerien luokittelu on kuitenkin<br />
varsin epätarkka ja tietynlaista hajoamisjälkeä voivat todennäköisesti aiheuttaa<br />
useat bakteerilajit. Vettynyttä puuta hajottavia bakteereita on toistaiseksi tutkittu vähän<br />
ja lajien tunnistamiseksi sekä niiden rooliin puun hajoamisessa varmasti kiinnitetään<br />
tulevaisuudessa enemmän huomiota. DNA-tutkimukset ovat jatkossa yksi tapa määrittää<br />
paremmin lajeja tästäkin puunäytteestä.<br />
Kaikki näytepuussa havaitut hajoamisjäljet eivät kuitenkaan välttämättä ole syntyneet<br />
katkolahottajien tai eroosiobakteerien toimesta. Puu on saattanut kärsiä jo ennen laivan<br />
uppoamista muiden hajottajien aiheuttamista vaurioista, jotka ovat helpottaneet uusien<br />
mikrobien tunkeutumista puun sisäosiin. Tällaiseen vaurioon viittaa esimerkiksi näytepalan<br />
viisi B-alueella havaittu laaja repeämä. En kuitenkaan pystynyt mikroskooppinäytteistä<br />
tunnistamaan maan pinnan hajottajille, kuten valko- tai ruskolaholle tyypillisiä<br />
hajoamisjälkiä, joten kyseessä voi myös olla mekaaninen vaurio. On toki myös<br />
mahdollista, että havaitut eroosiobakteerit ovat vain olleet sillä kohtaa tehokkaampia.<br />
Havaittu puusolukon hajominen voi myös osittain johtua selluloosan kemiallisesta hydrolyysistä.<br />
Olen tulkinnut syvemmällä puun sisällä näkyvän mustan massan bakteereista<br />
ja niiden aiheuttamasta puun hajomisesta syntyneeksi jäännösmateriaaliksi sen sijainnin,<br />
partikkelien koon ja morfologian sekä DNA-tutkimusten perusteella. On kuitenkin<br />
mahdollista, että osa tästä materiaalista on pelkistyneitä ja saostuneita rikin ja raudan<br />
yhdisteitä, kuten pyriittiä. Pelkistyneet rikki ja rauta ovat alkuksi liukoisessa muodossa<br />
ja ne voivat kulkeutua puun sisälle ydinsäteitä pitkin. Ne voivat myös aiheuttaa havaitun<br />
kaltaista selluloosan kemiallista hajoamista (Hedges 1990). Asian selvittäminen vaatisi<br />
58
lisätutkimuksia, kuten tarkempia alkuaineanalyysejä. Olisi myös kiinnostavaa tarkastella<br />
mikroskooppisesti näkyykö röntgenkuvissa puun kapeassa päässä vaaleana havaitulla<br />
alueella mahdollisia raudan ja rikin aiheuttamia saostumia.<br />
Mikroskooppitutkimuksia tehdessäni huomasin tiettyjä eroja valo- ja pyyhkäisyelektronimikroskoopilla<br />
tehdyissä näytteissä. Yleisesti ottaen valomikroskooppi osoittautui<br />
paremmaksi tutkimusvälineeksi ja jos tutkimusten tekoon olisi vähemmän resursseja<br />
käytössä, käyttäisin ensisijaisena tutkimusmenetelmänä valomikroskopiaa. Sillä saatiin<br />
tässä tutkimuksessa paremmin ja herkemmin esiin putkisolujen sekundaariseiniin kaivautuneet<br />
sienirihmat ja ydinsäteissä majailevat bakteerimassat. Osittain tämä johtuu<br />
siitä, että leikkeet voidaan värjätä, jolloin esimerkiksi puutumattomat ja puutuneet soluseinät,<br />
bakteerit ja sienirihmat erottuvat toisistaan.<br />
SEM puolestaan antaa tarkemmin tietoa soluseinien hienorakenteesta ja bakteerien<br />
muodosta, koska sillä päästään suurempiin suurennoksiin. Lisäksi SEM:illä voidaan<br />
tarkastella näytettä ikään kuin kolmiulotteisena. Tässä tutkimuksessa käyttämäni näytteiden<br />
dehydrointi- ja kuivausmenetelmä on kuitenkin varsin aggressiivinen ja uskon<br />
sen aiheuttaneen esimerkiksi löyhästi puun soluonteloissa olleiden bakteerien huuhtoutumista<br />
pois näytteenvalmistuksen aikana. Tähän toisi parannuksen uudenaikaisempi,<br />
pienempää tyhjiötä käyttävä pyyhkäisyelektronimikroskooppi, jolla voidaan tarkastella<br />
kosteitakin näytteitä. Kummassakin mikroskopointimenetelmässä on haittapuolena niiden<br />
työläs ja erityisosaamista vaativa näytteenvalmistusprosessi.<br />
4.4. Alkuaineanalyysi<br />
<strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> hylyltä nostettu puunäyte sisälsi sekä rikkiä, että rautaa huomattavasti<br />
enemmän, kuin kontrollinäytteet (kuvat 15 ja 16). Näytteessä oli rikkiä myös suhteessa<br />
näytteen sisältämään kloridiin ja natriumiin enemmän kuin meriveden sisältämien ko.<br />
suolojen ja rikin suhde on. Tämän perusteella näytteen sisältämä rikki ei ole peräisin<br />
pelkästään puun sisään diffundoituneesta merivedestä, vaan rikkiä on rikastunut puuhun.<br />
Rikin rikastuminen on todennäköisesti anaerobisen bakteeritoiminnan tulosta. <strong>Vrouw</strong><br />
<strong>Maria</strong> hylyn ympärillä olevassa merivedessä on talviaikaan happea melko runsaasti,<br />
mutta kesäkerrostuneisuuden aikana happipitoisuus laskee hyvin alas (Hietala ym.<br />
2004). Tällöin on bakteerien aiheuttama anaerobinen sulfaatin pelkistys ja pelkistynei-<br />
59
den rikkiyhdisteiden rikastuminen puuhun mahdollista. Kannella maanneen puunäytteen<br />
alapinnalle tai puun sisään on myös saattanut syntyä sulfaatin pelkistystä suosivia hapettomia<br />
mikroympäristöjä.<br />
Oletusta, että rikkiä on rikastunut puuhun nimenomaan bakteeritoiminnan seurauksena<br />
tukevat puunäytteestä tehdyt DNA tutkimukset, joissa puunäytteen pinnalta havaittiin<br />
sulfaatin pelkistäjien DNA:ta. Lisäksi puunäytteen mikroskooppitutkimuksissa havaittiin<br />
puun sisäosista bakteereita ja bakteerien aiheuttamia hajoamisjälkiä puusolukossa.<br />
On mahdollista, että nämäkin bakteerit käyttävät anaerobista metaboliaa ja pystyvät<br />
pelkistämään sulfaattia.<br />
<strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> hylyltä nyt nostetussa puunäytteessä oli rikkiä kuitenkin huomattavasti<br />
vähemmän kuin Vasa-laivan puun pintaosissa. Vasa-laivan pintapuusta noin yhden<br />
cm:n syvyyteen on mitattu rikkiä jopa 10 massaprosenttia. Syvemmällä Vasa-laivan<br />
puussa rikkipitoisuus jää noin yhden massaprosentin tuntumaan tai alle (Sandström ym.<br />
2002; Fors & Sandström 2006). <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> hylyn puunäyte sisälsi rikkiä pinnasta<br />
yhden cm:n syvyyteen asti keskimäärin 0,58 massaprosenttia ja suurimmillaankin vain<br />
1,31 massaprosenttia (taulukko 12). Näytteen pinta- ja sisäosien välillä ei rikin määrässä<br />
havaittu suuria eroja (kuva 16). Myöskään Mary Rose hylyn puuosien pinnassa ei ole<br />
huomattu vastaavaa rikkipiikkiä kuin Vasa-laivan puussa vaan rikin pitoisuus on noin<br />
yhden massaprosentin luokkaa pinnasta aina 20 cm:n syvyydelle asti (Fors & Sandström<br />
2006). Tämä on vain hieman korkeampi rikkipitoisuus kuin <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> hylyn näytteestä<br />
mitattu. Virtaavaan jokiveteen uponneen Bremen Cog hylyn puussa rikkiä on<br />
näistä neljästä hylystä kaikkein vähiten. Sen puun pintaosissa rikkiä on noin 0,15 massaprosenttia<br />
ja syvemmällä vain 0,05 massaprosenttia.<br />
Erot rikin määrissä hylkyjen välillä selittyvät ainakin osittain niiden uppoamispaikoilla.<br />
Vasa-laiva upposi Tukholman sataman edustalle sellaiseen paikkaan, johon kerääntyi<br />
runsaasti orgaanista ainesta, jonka mikrobiologinen hajoaminen on mahdollistanut rikkivedyn<br />
muodostumisen ja sitä on aikojen kuluessa päässyt diffundoitumaan suuria<br />
määriä Vasa-laivan puurakenteisiin (Fors & Sandström 2006). Mary Rose ja <strong>Vrouw</strong><br />
<strong>Maria</strong> hylyt ovat virtauksille avoimilla paikoilla. Kummassakaan paikassa ei ole todennäköistä,<br />
että hylkyjä ympäröivät suuret vesimassat olisivat olleet vuosikausia kokonaan<br />
hapettomia, joten rikkivetyä ei ole päässyt muodostumaan vastaavalla tavalla, kuin Va-<br />
60
sa-laivan tapauksessa. Bremen Cog hylyllä virtaava jokivesi ja sen luontaisesti pienempi<br />
sulfaatin määrä meriveteen verrattuna lienee torjunut rikkivedyn muodostumista.<br />
Raudan määrä <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> hylyltä nostetussa puunäytteessä on suurempi, kuin kummassakaan<br />
kontrollinäytteessä (kuva 16). Suhteessa meriveden sisältämään raudan määrään<br />
puunäytteeseen oli kertynyt huomattavan paljon rautaa. Itämeren pintavedessä on<br />
rautaa noin 0,1-1 µg/100g (Voipio & Perttilä 1984). Tämä on häviävän pieni määrä verrattuna<br />
näytteestä mitattuun raudan määrään, joka on keskimäärin 0,54g/100g. Näytteen<br />
sisältämä rauta on luultavasti peräisin jonkin ympärillä olevan tai sen rakenteissa käytetyn<br />
rautaesineen korroosiosta. Röntgenkuvissa nähtävät vaaleat alueet puussa saattavat<br />
olla puuhun diffundoituneita rautaioneja (kuva 7).<br />
Alkuainemäärityksissä puunäytteestä mitatut piin korkeat intensiteetit eivät ole todellisia.<br />
Ne voitiin varmistaa artefaktiksi Top Analyticassa tehtyjen näytepalan 1 kvantitatiivisten<br />
tutkimusten yhteydessä, kun puunäytteen pinnalla nähtiin selvästi erillisiä piijyväsiä.<br />
Nämä partikkelit ovat peräisin puunäytteiden pinnan hionnassa käytetystä hiekkapaperista,<br />
joka on piikarbidia.<br />
4.5. DNA-tutkimukset<br />
Näytteistä ei DNA-tutkimusten avulla onnistuttu saamaan esille sieniä. Mikroskooppitutkimukset<br />
kuitenkin paljastavat, että näytteen pinnan hajonneimmassa osassa on runsaasti<br />
sienirihmaa (kuva 8 a-e). Syitä DNA-tutkimusten negatiiviseen tulokseen voi olla<br />
useita. Käytetty sienialuke ei ehkä tunnista niitä sienilajeja, joita näytteessä esiintyy. On<br />
myös mahdollista, että sienten DNA:ta ei saatu eristettyä näytteestä. Sienet ovat siinä<br />
mielessä hankalia, että vaikka sienirihmaa olisikin näytteessä, ei tumia (joissa DNA<br />
sijaitsee) välttämättä tule eristettävään näytteeseen, koska tumat eivät ole tasaisesti jakautuneita<br />
sienirihmoihin (Leone Montonen 2008, henkilökohtainen tiedonanto). Tällöin<br />
DNA-tutkimusten tulos jää negatiiviseksi. Tulosten luotettavuutta heikentää myös<br />
se, että kummallakaan tutkimuskerralla ei mukana ollut positiivista kontrollia, joten<br />
menetelmän toimivuutta ei voitu varmistaa. Sienten DNA:n esille saamiseksi kannattaa<br />
kuitenkin tehdä jatkotutkimuksia, jotta mikroskoopilla nyt havaitut sienet saataisiin nimettyä,<br />
jolloin niiden vaikutusta puun hajoamiseen voitaisiin paremmin arvioida. Jatkossa<br />
voisi kokeilla toisenlaista DNA:n eristysmenetelmää sekä erilaisia alukkeita.<br />
61
Bakteerien osalta ensimmäinen PCR antoi positiivisen tuloksen kaikista näytteistä. Hylkypuun<br />
kannalta olisi kiinnostava tietää, onko puussa rikin mikrobiologiseen muuttumiseen<br />
osallistuvia bakteereita. Näitä sulfaatinpelkistäjiä yritin saada esille käyttämällä<br />
dissimilatorisen sulfiitin reduktaasia (DSR) koodaavan geenin aluketta ja SRByleisaluketta.<br />
Sulfaatin pelkistäjiä ei saatu esille DSR-geeniä tunnistavan alukkeen avulla kummallakaan<br />
tutkimuskerralla. Toisella kerralla yritettiin optimoida PCR-olosuhteet käyttämällä<br />
korkeampaa reaktiolämpötilaa ja pidempää reaktioaikaa. Elektroforeesissa kokeiltiin<br />
TAE-puskuriin tehtyä geeliä, sillä sen arveltiin sopivan paremmin DSR:n pitkille PCR<br />
tuotteille kuin SB-puskuriin tehdyn geelin. Kumpikaan modifikaatio ei tuottanut tulosta.<br />
Samoin kuin sienten kohdalla, heikentää tässäkin negatiivisen tuloksen luotettavuutta<br />
positiivisen kontrollin puute.<br />
DSR-geenin koodaama entsyymi on avainentsyymi, joka esiintyy kaikissa sulfaatin pelkistäjissä.<br />
Se katalysoi sulfaatin pelkistyksen viimeistä reaktiota, sulfiitin pelkistymistä<br />
sulfidiksi (Pérez-Jiménez ym. 2001; Joulian ym. 2001). Koska tämä on rikin mikrobiologisen<br />
kierrossa hyvin tärkeä entsyymi, kertoisi sen esiintyminen suurella todennäköisyydellä<br />
rikkiyhdisteiden mikrobiologisesta muuttumisesta näytteessä. DSR-geenin<br />
omaavien bakteerien tutkimista olisikin syytä jatkaa näytteestä ja yrittää vielä optimoida<br />
PCR-olosuhteita.<br />
Sulfaatin pelkistäjistä saatiin kuitenkin viitteitä niitä tunnistavan yleisalukkeen (SRB)<br />
avulla. Tulos oli positiivinen puun pintaosista otetuissa näytteissä 1, 3 ja 4, mutta syvemmältä<br />
otetusta näytteestä 2, antoi SRB negatiivisen tuloksen. Hylyllä on kesäaikaan<br />
sulfaatin pelkistämistä suosivat olosuhteet, kuten merentutkimuslaitoksen mittaukset<br />
hylyllä osoittivat; happi kuluu hylkyä ympäröivästä vedestä miltei kokonaan loppuun<br />
kesäkerrostuneisuuden aikaan (Hietala ym. 2004). Talvisin vedessä on enemmän happea,<br />
mutta vaikka hylyn ympärillä olevassa vedessä olisikin runsaasti happea, voi näytepalan<br />
tuntumaan syntyä paikallisia hapettomia kohtia, missä sulfaatin pelkistys on<br />
mahdollista. Sulfaatin pelkistäjien esiintyminen näytteessä tukee päätelmää siitä, että<br />
alkuaineanalyysissä havaittu puuhun kertynyt rikki on peräisin sulfaattia pelkistävien<br />
mikrobien toiminnasta.<br />
62
Arkkeja havaittiin kaikista puupalasta otetuista näytteistä, myös syvemmältä puun sisältä,<br />
mistä sulfaatin pelkistäjiä ei havaittu. Arkit ovat mielenkiintoinen havainto, mutta<br />
juuri sen enempää niiden esiintymisestä puussa ei voidakaan sanoa. Ne, kuten havaitut<br />
bakteerit, eivät välttämättä ole puun hajottajia, vaan voivat käyttää sitä elinympäristönään<br />
ottaen tarvitsemansa orgaanisen aineen muualta kuin puusta, esimerkiksi veteen<br />
liuenneesta orgaanisesta aineesta. Mikäli arkit voivat hapettomissa oloissa pelkistää<br />
sulfaattia, on niiden esiintyminen puussa samalla tavalla haitallista kuin sulfaattia pelkistävien<br />
bakteerienkin. Arkeille voisi tehdä jatkotutkimuksena DGGE:n, minkä erottamat<br />
DNA pätkät voisi lajien tunnistamiseksi sekvensoida ja verrata olemassa oleviin<br />
tietokantoihin.<br />
4.6. Yhteenveto<br />
Tässä tutkimuksessa selvitettiin <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> hylyn kannelta nostetun puunäytteen kuntoa<br />
eri menetelmillä. Puunäytteen kunnosta saatiin varsin hyvä käsitys. Näytteen pinta<br />
on noin viiden mm:n syvyydelle asti pahasti katkolahoa aiheuttavan sienen hajottama.<br />
Syvemmällä puun sisällä on eriasteisia bakteerien aiheuttamia hajoamisjälkiä ja siellä<br />
täällä havaittiin myös sienirihman tunkeutumista syvemmälle puusolukkoon. Bakteerit<br />
ovat selvästi levinneet syvemmälle puuhun ydinsäteitä pitkin. Bakteereita havaittiin<br />
puun sisältä ja pinnalta myös DNA-tutkimuksilla. Sisäosien bakteerit tulivat esille bakteerien<br />
yleisalukkeilla, ja pinnalta sulfaatin pelkistäjiä tunnistavilla alukkeilla. Vaikka<br />
mikroskooppitutkimukset paljastivat puun pintaosan hajottajiksi katkolahottajasienet, ei<br />
niitä tässä DNA-tutkimuksessa saatu esille. Puun pahinta uhkaajaa laivamatoa puussa ei<br />
havaittu, mikä on hylyn nykyisellä sijaintipaikalla säilymisen kannalta hyvä asia. Kosteuspitoisuuden<br />
ja tiheyden mittausten tulokset kertovat osaltaan, että puu on ikäisekseen<br />
hyvin säilynyt.<br />
Sulfaatin pelkistäjien läsnäolo puun pinnalla saattaa olla osaltaan vaikuttanut siihen, että<br />
näytteeseen on kerääntynyt rikkiä. Rikin määrä oli kuitenkin pieni verrattuna esimerkiksi<br />
Vasa-laivan puun pintaosiin. Myös rautaa oli kerääntynyt puunäytteeseen. Näiden<br />
kahden alkuaineen tiedetään aiheuttavan puun hajoamista pinnalle nostetuissa puuhylyissä,<br />
joten ne on hyvä ottaa huomioon suunniteltaessa <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> hylyn mahdollisen<br />
noston jälkeisiä konservointitoimia.<br />
63
<strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong>n hylky on monimuotoinen kokonaisuus, jossa on erilaisia mikroympäristöjä.<br />
Nyt tutkittu puunäyte on sijainnut hylyn kannella, missä vedenvaihto on hyvä verrattuna<br />
vaikka lastiruuman uumeniin tai muihin laivan sisäosiin. Hylyn runko on myös<br />
tiettävästi tammea, joka voi erota mikrobien aiheuttaman hajoamisen nopeuden suhteen<br />
nyt tutkitusta mäntynäytteestä. Näytteestä saadut tulokset eivät tästä syystä ole suoraan<br />
yleistettävissä koskemaan koko hylyn kuntoa, mutta siitä toki saadaan viitteitä puun<br />
hajoamisesta <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> hylyn ympäristössä ja yleisemminkin Suomen rannikon vedenalaisissa<br />
olosuhteissa.<br />
Mielestäni jatkossa hylyltä olisi hyvä ottaa harkitusti näytteitä sen rungon eri osista sekä<br />
mikroskooppisiin tutkimuksiin, että alkuainemäärityksiin. Näin saataisiin tietoa varsinaisen<br />
rungon eri osien kunnosta ja siihen kertyneiden rikin ja raudan määristä ja voitaisiin<br />
jo konservoinnin suunnitteluvaiheessa varautua mahdollisiin noston jälkeen ilmeneviin<br />
ongelmiin ja vähentää niiden aiheuttamia haittoja ja kustannuksia.<br />
64
KIITOKSET:<br />
Esitän lämpimät kiitokseni työn ohjaukseen osallistuneille henkilöille, joille kaikille oli<br />
yhteistä suuri kiinnostus tutkimusaihetta kohtaan. Tuuli Timonen ja Leone Montonen<br />
ansaitsevat erityiskiitoksen, sillä he jaksoivat omista kiireistään huolimatta opastaa työn<br />
suorittamisessa ja lukea ja tarkastaa kirjoittamaani tekstiä. Suurkiitos myös Pirkko Harjulle<br />
valomikroskooppileikkeiden teosta sekä Mervi Lindmanille ja Jyrki Juhanojalle,<br />
jotka auttoivat alkuaineanalyysien teossa. Kari Steffen ansaitsee kiitoksen DNA tutkimusten<br />
tekoon antamistaan resursseista, Leena Tomanterä puunäytteen röntgenkuvaamisesta<br />
ja röntgentutkimusten periaatteiden selvittämisestä ja Eero Ehanti puunäytteen<br />
kuivaamisesta ja mittaamisesta. Lisäksi kiitän <strong>Museovirasto</strong>n meriarkeologisesta yksiköstä<br />
Ulla Klemelää, Minna Leinoa sekä Marja Pelannetta kannustuksesta ja siitä, että<br />
jaksoitte odottaa työn hieman venähtänyttä valmistumista. Ja totta kai kiitokset myös<br />
Juha Flinkmanille ja muille näytteen nostoon osallistuneille sekä Ari Ruuskaselle, Niko<br />
Napulle ja Mari Salmiselle keiden ansiosta olen mukana näissä hommissa, sekä perheelle<br />
ja ystäville kaikesta tuesta työn aikana. Lisäksi kiitän tutkimusta rahoittaneita <strong>Museovirasto</strong>n<br />
meriarkeologista yksikköä ja Suomen Kulttuurirahastoa.<br />
65
KIRJALLISUUS:<br />
Alvik, R. & Tikkanen, S. 2004: Inroduction to the Final Report of the MoSS Project. -<br />
Julkaisussa: Cederlund, C.O. (toim.). MoSS Project Newsletters 2002:I - 2004: III.<br />
The National Board of Antiquities. Helsinki, Finland. s. 2-7<br />
Amann, R.I., Stromley, J., Devereux, R. Key, R. & Stahl, D.A. 1992: Molecular and<br />
Microscopic Identification of Sulfate Reducing Bacteria in Multispecies Biofilms.<br />
- Applied and Environmental Microbiology. 58: 614-623<br />
Aniansson, B. 1989: Pohjois-Euroopan meret, Pohjois-Euroopan ympäristö. - Raportti<br />
Pohjoismaiden neuvoston meriensuojelua käsittelevään kansainväliseen konferenssiin<br />
16. - 18. lokakuuta 1989.<br />
Björdal, C. G., Nilsson, T. & Daniel, G. 1999: Microbial decay of waterlogged archaeological<br />
wood found in Sweden. - International Biodeterioration & Biodegradation<br />
43: 63-71<br />
Blanchette, R.A., Nilsson, T. & Daniel, G. 1990: Biological Degradation of Wood.<br />
Teoksessa: Rowell. M. & Barbour, J.R. (toim.) - Archaeological Wood, Properties,<br />
Chemistry and Preservation. American Chemical Society. s. 141-174.<br />
Bonsdorff, E. 2006: Zoobenthic diversity-gradients in the Baltic Sea: Continuous postglacial<br />
succesion in a stressed ecosystem. - Journal of Experimental Marine Biology<br />
and Ecology 330: 383-391<br />
Boström, K.H., Riemann, L. Kühl, M. & Hagström, Å. 2007: Isolation and gene quantification<br />
of heterotrophic N 2 -fixing bacterioplankton in the Baltic Sea. - Environmental<br />
Microbiology 9 (1): 152–164.<br />
Böttcher, M., E. & Lepland, A. 2000: Biogeochemistry of sulphur in a sediment core<br />
from the west-central Baltic Sea: Evidence from stable isotopes and pyrite textures.<br />
- Journal of Marine Systems 25: 299-312<br />
Cifuentes, A., Antón, J., Benlloch, S., Donnelly, A., Herbert, R.A. & Rodríguez-Valera,<br />
F. 2000: Prokaryotic Diversity in Zostera noltii-Colonized Marine Sediments. -<br />
Appl Environ Microbiol. 66(4): 1715–1719.<br />
Curci, J. 2006: The Reburial of Waterlogged Archaeological Wood in the Wet Environments.<br />
- Technical Briefs in Historical Archaeology 1: 21-25.<br />
Dietrich, D., Heger, P. Bäucker, E. Nuys, G.J., Grafe, T. & Urban, G. 1998: SEM-,<br />
EDS- and GDOES investigations for the historical ferrous ore and slag from<br />
Sternmühlenthal valley in the outskirts of Chemnitz. - Fresenius J. Anal. Chem.<br />
381: 701-703<br />
Didžiulis, V. (2007): WWW-sivusto, NOBANIS – Invasive Alien Species Fact Sheet –<br />
Teredo navalis. – From: Online Database of the North European and Baltic Network<br />
on Invasive Alien Species - NOBANIS http://www.nobanis.org (2.3.2008).<br />
Edlund, A., Soule, T., Sjöling, S. & Jansson, J.K. 2006: Microbial community structure<br />
in polluted Baltic Sea sediments. - Environmental Microbiology 8 (2): 223-232.<br />
66
Eltringham, S.K. 1961: The Effect of Salinity Upon the Boring Activity and Survival of<br />
Limnoria (Isopoda). - J. Mar. Biol. Ass. UK. 41: 785-797<br />
Eriksson, K-E., Blanchette, R.A. & Ander, P. 1990: Microbial and Enzymatic Degradation<br />
of Wood and Wood Components. Springer-Verlag, Berlin, Germany. 407 s.<br />
Fagerstedt, K., Pellinen, K., Saranpää, P. & Timonen, T. 2005: Mikä puu - mistä puusta.<br />
- Yliopistopaino, Helsinki. 180 s.<br />
Fors, Y. & Sandström, M. 2006: Sulfur and iron in shipwrecks cause conservation conserns.<br />
- Chem. Soc. Rev. 35: 399-415<br />
Grattan, D.W. & Clarke, R.W. 1987: Conservation of waterlogged wood. Teoksessa:<br />
Pearson, C. (toim.) Conservation of marine archaeological objects. Butterworths,<br />
London. s. 164-206<br />
Gregory, D. 1998: Re-burial of timbers in the marine environment as a means of their<br />
long-term storage: experimental studies in Lynæs Sands, Denmark. - The International<br />
Journal of Nautical Archaeology 27 (4): 343-358.<br />
Hedges, J.I. 1990: The Chemistry of Archaeological Wood. Teoksessa: Rowell. M. &<br />
Barbour, J.R. (toim.) - Archaeological Wood, Properties, Chemistry and Preservation.<br />
American Chemical Society. s. 111-140.<br />
Helms, A.C., Martiny, A.C., Hoffman-Bang, J., Ahring,B.K. & Kilstrup, M. 2004: Identification<br />
of bacterial cultures from archaeological wood using molecular biological<br />
techniques. - International Biodeterioration & Biodegration 53: 79-88.<br />
Helms. A.C. & Killstrup, M. 2001: DNA based Identification of Bacteria Inhabiting<br />
Waterlogged Wooden Artefacts from the Nydam Bog. - 8th ICOM WOAM Conference,<br />
Stockholm.<br />
Hietala, R., Purokoski, T., Vuori, H., Roine, T., Rapo, J., Flinkman, J. 2004: The Physical<br />
and Chemical Measurements at The <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> Wreck Site from 12th September<br />
2002 to 26th August 2003. - Julkaisussa: Cederlund, C.O. (toim.). MoSS<br />
Project Newsletters 2002:I - 2004: III. The National Board of Antiquities. Helsinki,<br />
Finland. s. 32-36.<br />
Hoadley, R.B. 1990: Identifying Wood, Accurate results with simple tools. - The Taunton<br />
Press. 223 s.<br />
Holmberg, P. & Perkkiö, J. 1988: Biotieteiden fysiikkaa ja säteilyfysiikkaa. - Kandidaattikustannus<br />
Oy. Hanko. 463 s.<br />
Hoppe, K.N. 2002: Teredo navalis - The Cryptogenic Shipworm. Teoksessa: Leppäkoski,<br />
E., Gollasch, S. & Olenin, S. (Toim.) - Invasive Aquatic Species of Europe:<br />
Distribution, Impacts and Management. Kluwer Academic Publishers. s.116-119<br />
Joulian, C., Ramsing, N.B. & Ingvorsen, K. 2001: Congruent Phylogenies of Most<br />
Common Small-Subunit rRNA and Dissimilatory Sulfite Reductase Gene Sequences<br />
Retrieved from Estuarine Sediments. - Appl Environ Microbiol. 67 (7): 3314–<br />
3318.<br />
67
Jurgens, G., Glöckner, F-O., Amann, R., Saano, A., Montonen, L., Likolammi, M. &<br />
Münster, U. 2000: Identification of novel Archaea in bacterioplankton of a boreal<br />
forest lake by phylogenetic analysis and fluorescent in situ hybridization. FEMS<br />
Microbiology Ecology 34 (1): 45–56.<br />
Jääskeläinen, A-S. & Sundqvist, H. 2007: Puun rakenne ja kemia. - Otatieto, Helsinki.<br />
142 s.<br />
Keeling, P.J. & Doolittle, W.F. 1995: Archaea: Narrowing the gap between prokaryotes<br />
and eukaryotes. - Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 5761-5764.<br />
Kim, Y. S. & Singh, A., P. 2000: Micromorphological characteristics of wood biodegradation<br />
in wet environments: a review. - IAWA Journal, Vol 21 (2): 135-155<br />
Klugg, W.S. & Cummings, M.R. 2002: Essentials of Genetics. - Prentice Hall Inc. New<br />
Jersey. USA<br />
Kärkäinen, M. 2003: Puutieteen perusteet. - Kustannusosakeyhtiö Metsälehti Karisto<br />
Oy, Hämeenlinna. 451 s.<br />
Lehmann, E. H., Vontobel P., Deschler-Erb, E. & Soares, M. 2005: Non-invasive studies<br />
of objects from cultural heritage. - Nuclear Instruments & Methods in Physics<br />
Recearch A 542: 68-75.<br />
Leino, M., Jöns, H., Wessman, S. & Cederlund, C.O. 2004: Final Report of the MoSS<br />
Project, Visualizing Underwater Cultural Heritage in the MoSS-project. - Julkaisussa:<br />
Final report Cederlund, C.O. (toim.). MoSS Project Newsletters 2002:I -<br />
2004:III. The National Board of Antiquities. Helsinki, Finland. s. 49-51.<br />
Leino, M. 2002: The Wreck of <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong>. - MoSS Project Newsletter 1: 13-17.<br />
Miller, R.C. 1926: Ecological Relations of Marine Wood-Boring Organisms in San<br />
Francisco Bay. - Ecology. 3: 247-254.<br />
Moeslund, L. & Thamdrup, B. 1994: Suflur and iron cycling in a coastal sediment: Radiotracer<br />
studies and seasonal dynamics. - Biogeochemistry 27: 129-152.<br />
Moisander, P.H., Paerl, H.W., Dyble, J. & Sivonen. K. 2007: Phosphorus limitation and<br />
diel control of nitrogen-fixing cyanobacteria in the Baltic Sea. - Mar. Ecol. Prog.<br />
Ser. 345: 41-50.<br />
Moter, A. & Göbel, U.B. 2000: Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct<br />
visualization of microorganisms. - Journal of Microbiological Methods 41 (2): 85-<br />
112.<br />
<strong>Museovirasto</strong> 2008: WWW-sivusto, http://www.nba.fi/fi/hylkytutkimukset_vm<br />
(29.3.2008)<br />
Muyzer, G. & Smalla, K. 1998: Application of denaturing gradient gel electrophoresis<br />
(DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology.<br />
- Antonie van Leeuwenhoek 73: 127-141.<br />
Myrberg, K., Leppäranta, M. & Kuosa, H. 2006: Itämeren fysiikka, tila ja tulevaisuus. -<br />
Yliopistopaino, Helsinki. 202 s.<br />
Mäkelä. O., Tiilikainen, A.S., Vaara, M., Vaheri, A. & Valtonen. V. (toim) 1993: Lääketieteellinen<br />
Mikrobiologia. Duodecim. Helsinki. 669 s.<br />
68
Niemi, Å. 1984: Ekosysteemin perustuotanto. - Teoksessa: Voipio, A. & Leinonen, M.<br />
(toim.). Itämeri. Kirjayhtymä. Helsinki. s. 73-77.<br />
Norman, E. 1977: The Geographical Distribution and the Growth of the Wood Boring<br />
Molluscs Teredo navalis L., Psiloteredo megotara (Hanley) and Xylophaga dorsalis<br />
(Turton) on the Swedish West Coast - Ophelia, 16(2): 233-250<br />
Palma, P. 2004: Final Report for the Monitoring theme of the MoSS Project. - Julkaisussa:<br />
Cederlund, C.O. (toim.). MoSS Project Newsletters 2002:I - 2004: III.<br />
The National Board of Antiquities. Helsinki, Finland. s. 8-37<br />
Pelanne, M. & Tikkanen, S. (toim.) 2007: <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> - Selvitys tutkimuksista, tuloksista<br />
ja tulevaisuuden eri vaihtoehdoista. - <strong>Museovirasto</strong>n meriarkeologinen yksikkö.<br />
Erikoispaino Oy, Helsinki. 165 s.<br />
Pérez-Jiménez, J.R., Young, L.Y. & Kerkhof, L.J. 2001: Molecular characterization of<br />
sulfate reducing bacteria in anaerobic hydrocarbon-degrading consortia and pure<br />
cultures using dissimilatory sulfite reductase (dsr AB) genes. - FEMS Microbiology<br />
Ecology 35. 145-150.<br />
Perttilä, M. 2006: Meriympäristön kemian perusteet. - MERI - Report Series of the Finnish<br />
Institute of Marine Recearch. No 53. 113 s.<br />
Podgórska, B. & Z.J. Mudryk, Z.J. 2003: Distribution and enzymatic ativity of heterotrophic<br />
bacteria decomposing selected macromolecular compounds in a Baltic Sea<br />
sandy beach. - Estuarine, Coastal and Shelf Science 56. 539-546.<br />
Rikkinen, J. 1999: Leviä, sieniä ja leväsieniä. Johdatus levien ja sienten monimuotoisuuteen.<br />
Yliopistopaino, Helsinki. 194 s.<br />
Ruuskanen, A., Nappu, N. & Kinnunen, V. 2003: Nauvo, Trunsjö <strong>Vrouw</strong> <strong>Maria</strong> – Hylky.<br />
Raportti hylyn biologisista kenttätutkimuksista. – Helsingin Yliopisto & <strong>Museovirasto</strong>,<br />
Meriarkeologian yksikkö. 37 s.<br />
Sandberg, J., Andesson, A., Johansson, S. & Wikner, J. 2004: Pelagic food web structure<br />
an carbon budget in the northern Baltic Sea: potential importance of terrigenous<br />
carbon. - Mar. Ecol. Prog. Ser. 268: 13-29.<br />
Sandström, M., Jalilehvand, F. Damian, E. Fors, Y., Gelius, U., Jones, M. & Salomé, M.<br />
2005: Sulfur accumulation in the timbers of King Henry VIII’s warship Mary Rose:<br />
A pathway in the sulfur cycle of conserwation concern. - PNAS 102 (40):<br />
14165-14170.<br />
Sandström, M., Jalilehvand, F., Persson, I., Gellus, U., Frank, P. & Hall-Roth, I. 2002:<br />
Deterioration of the seventeenth century warship Vasa by internal formation of<br />
sulphuric acid. - Nature. 415: 893-897.<br />
Schniewind, A. P. 1990: Physical and Mechanical Properties of Archaeological Wood.<br />
Teoksessa: Rowell. M. & Barbour, J.R. (toim.) - Archaeological Wood, Properties,<br />
Chemistry and Preservation. American Chemical Society. s. 89-109.<br />
Schreiner, M., Melcher, M. & Uhlir, K. 2007: Scanning electron microscopy and energy<br />
dispersive analysis: applications in the field of cultural heritage. - Anal. Bioanal.<br />
Chem. 387: 737-747<br />
69
Scott, V.D., Love, G. & Reed, S.J.B. 1995: Quantitative Electron-Probe Microanalysis.<br />
- Hartnolls Limited, Cornwall, Great Britain.<br />
Storer, T.I., Usinger, R.L., Stebbins, R.C. & Nybakken, J.W. 1979: General Zoology. -<br />
McGraw-Hill, Inc. USA<br />
Squirrel, J.P. & Clarke, R.W. 1987: An Investigation into the Condition and Conservation<br />
of the Hull of the Mary Rose. Part I: Assessment of the Hull Timbers. - Studies<br />
in Conservation 32: 153-162<br />
The Mary Rose Trust 2008: WWW-sivusto, http://www.maryrose.org (28.3.2008)<br />
Timonen, T. 2000: Introduction to Microscopic Wood Identification. - Yliopistopaino,<br />
Helsinki. 51 s.<br />
Tuente, U., Piepenburg, D. & Spindler, M. 2002: Occurence and settlement of the<br />
common shipworm Teredo navalis (Bivalvia: Teredinidae) in Bremerhaven harbours,<br />
northern Germany. - Helgol. Mar. Res. 56: 87-94<br />
Tuominen, L., Mäkelä, K., Lehtonen, K.K., Haahti, H., Hietanen, S. & Kuparinen, J.<br />
1999: Nutrient Fluxes, Porewater Profiles and Denitrification in Sediment Influenced<br />
by Algal Sedimentation and Bioturbation by Monoporeia affinis. - Estuarine,<br />
Coastal and Shelf Science 49 (1). 83-97.<br />
Vasamuseet 2008: WWW-sivusto, http://www.vasamuseet.se (28.3.2008)<br />
Voipio, A. & Perttilä, M. 1984: Murtoveden ominaisuuksia. - Teoksessa: Voipio, A. &<br />
Leinonen, M. (toim.). Itämeri. Kirjayhtymä. Helsinki. s. 53-62.<br />
Westin, M., Rapp, A. & Nilsson, T. 2006: Field test of resistance modified wood to marine<br />
borers. - Wood Material Science and Engineering. 1: 34-38.<br />
Wetherall, K.M., Moss, R.M., Jones, A.M., Smith, A.D., Skinner, T., Pickup, D.M.<br />
Goatham, S.W., Chadwick, A.V. & Newport, R.J. 2007: Sulfur and iron speciation<br />
in recently recovered timbers of the Mary Rose revealed via X-ray absoption<br />
spectroscopy. - J. Archaeol. Sci. doi:10.1016/j.jas.2007.09.007 (artikkeli painossa)<br />
70