TYÖN NIMI - Theseus

entsyymileimattu kaksoisvasta-aine sitoutuu inkuboinnin aikana näytteessä olevaan
vasta-aineeseen.
4.3.4 Substraatin lisäys
Substraattiliuokseen punnittiin p-Nitrophenyl phosphate -jauhetta 1,125 mg yhteen
millilitraan Dietanolamiini-MgCl2-liuosta, joka on kaupallinen valmis liuos. Punnitus
tehtiin vaakahuoneessa käsineet kädessä. Kahden tunnin jälkeen konjugaatin
lisäyksestä, levyt pestiin pesulaitteella ja huuhdeltiin vedellä kuten ensimmäisen
inkuboinnin jälkeen. Substraattiliuosta pipetoitiin 100 μl/kuoppa. Levyt peitettiin
muovikalvolla ja inkuboitiin lämpökaapissa 36 ± 1 ºC:ssa 30 ± 1 minuuttia.
Substraatti sitoutuu inkuboinnin aikana entsyymiin, joka katalysoi eli nopeuttaa
substraatin muuttumista reaktiotuotteeksi. Lopuksi kuoppiin pipetoitiin
natriumhydroksidia (2-M NaOH) 50 μl/kuoppa reaktion pysäyttämiseksi.
4.3.5 Pitoisuuden mittaus
Kun entsyymi katalysoi substraatin reaktiotuotteeksi, muodostuu värireaktio. Mitattu
absorbanssi on suoraan verrannollinen näytteessä olevaan vasta-ainepitoisuuteen.
Pitoisuuden mittaus tehtiin Tecan Spectrofluor -spektrofluorometrilla käyttäen
aallonpituutta 405. Ohjelma määrittää näytteiden pitoisuudet standardisuoran avulla.
Tulokset siirrettiin Tecan Magellan 3 -ohjelmasta Excel-ohjelmaan ja SPSS-tilasto-
ohjelmaan. Excelillä tarkistimme aineiston ja poistimme kaksi maksimiarvon
ylittävää näytettä.
4.3.6 Viitearvojen määrittäminen
Työterveyslaitoksen Kuopion aluetoimipiste määrittää IgM-vasta-aineiden viitearvot
tutkittaville mikrobeille siten, että 90 % persentiilin raja-arvon alapuolelle jää 90 %
terveistä henkilöistä. Määritimme arvot käyttämällä SPSS-tilasto-ohjelmaa.
Viitearvot on esitetty taulukossa 3. Määritimme myös joitakin aineistoa kuvaavia
tunnuslukuja, joita ovat keskiarvo, keskihajonta, mediaani, moodi, vinous ja
36