2.2. Optinen mikroskopia
2.2. Optinen mikroskopia
2.2. Optinen mikroskopia
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
<strong>2.2.</strong> <strong>Optinen</strong> <strong>mikroskopia</strong><br />
Lähdekirjallisuus:<br />
Flewitt and Wild: Physical Methods for Materials Characterization,<br />
Second edition, IOP publishing Ltd, 2003.
Historiaa<br />
Mikroskoopin keksimistä ei ole dokumentoitu kovin hyvin,<br />
joten on vaikea jäljittää optisen mikroskoopin varsinaista<br />
keksijää tai tarkkaa syntyajankohtaa. Ensimmäinen<br />
valokuva tunnistettavasta mikroskoopista on kuitenkin<br />
otettu 1625. 1600-luvulla komponenttimikroskoopit<br />
rakentuivat linssiyhdistelmästä, johon kuuluivat objektiivi ja<br />
okulaari. Tällaisia mikroskooppeja käyttivät monet, mutta<br />
kuvanlaatu oli kovin heikko.<br />
Toinen, samoihin aikoihin käytetty kuvantamisvaihtoehto oli<br />
"simplex-mikroskooppi", jossa oli yksi linssi kuten<br />
suurennuslaseissa. Tällaista instrumenttia käytti Anthonie<br />
van Leeuwenhoek noin vuonna 1700. Samaa suurennosta<br />
käyttäen simplexillä saatiin paljon tarkempi kuva kuin<br />
komponenttimikroskoopilla.<br />
Komponenttimikroskooppi<br />
(John Cuff in 1750)
Valon luonne
Mikroskooppi ja<br />
geometrinen optiikka<br />
Tärkeimmät mikroskoopin komponentit ovat<br />
objektiivit, okulaarit, kondensori, kollektorilinssi,<br />
välilinssit, polarisaattori ja analysaattori, sekä<br />
erityyppiset prismat.<br />
Valon kulkua tarkastellaan käyttämällä mallina<br />
yksittäisiä valonsäteitä.<br />
Valonsäteiden oletetaan kulkevan Huygensin<br />
periaatteen mukaan aaltorintaman normaalin<br />
suuntaisesti.<br />
Heijastumis- ja taittumislait (Snellin lait)<br />
Compound
Moderni mikroskooppi<br />
Illumination<br />
Condenser<br />
Objective<br />
Eyepiece
Erotuskyky<br />
Mikroskoopin kokonaissuurennos saadaan laskemalla objektiivin ja okulaarin suurennoksien tulo.<br />
Numeerinen apertuuri ilmoittaa avauskulman, jolla objektiivi pystyy kokoamaan valoa. Erotuskyky<br />
lisääntyy numeerisen apertuurin kasvaessa, koska tällöin kuvan muodostukseen osallistuvien<br />
säteiden määrä kasvaa.<br />
Erotuskyky (resolution) määrittää, miten lähekkäin olevat yksityiskohdat voidaan erottaa<br />
toisistaan.<br />
Kontrasti on yksitysikohtien tai yksityiskohdan ja taustan välinen kirkkausero.<br />
Diffraktio – erotusraja:<br />
C C<br />
<br />
sin NA<br />
C – vakio, tavallisesti 0.61 (koherenssi)<br />
– valon aallonpituus<br />
– linssin ja objektiivin välissä olevan aineen<br />
taitekerroin<br />
NA – numeerinen apertuuri
Airyn kiekot,<br />
säde:R=<br />
Rayleigh:n kiteeri<br />
kuvan erotuskyky: d=R<br />
Erotuskyvyn raja:<br />
400 nm<br />
NA 1.6<br />
150 nm<br />
Erotuskyky
Airy-kiekot:<br />
Erotuskyky<br />
Airy-diffraktiokuvion koko ja intensiteettijakauma riippuvat objektiivin ja kokoojalinssin<br />
numeerisesta apertuurista ja valon aallonpituudesta.
Erotuskyky<br />
Rayleighin kriteeri:<br />
Kaksi erillista pistettä voidaan juuri ja juuri erottaa toisistaan, kun niiden<br />
Airy-kiekkojen pienin etäisyys on sama kuin keskimmäisen kiekon säde.<br />
(sin = 1.22/D, jossa D on objektiivin läpimitta, erotuskyky ja <br />
aallonpituus)
Efektiivinen suurennus<br />
Efektiivinen suurennus =<br />
paljaan silmän erotuskyky<br />
mikroskoopin erotuskyky<br />
Paljaan silmän erotuskyky, eye 0.2 mm<br />
Efektiivinen suurennus M eff 0.2/0.00015 1300<br />
Kun käytetään paremman suurennuksen antavaa optiikkaa kuin efektiivinen<br />
suurennus, kuvasta saadaan suurempi, mutta uusia yksityiskohtia ei pystytä<br />
erottamaan.<br />
Kun käytetään CCD kameroita, täytyy laskuissa käyttää kameran erotuskykyä<br />
silmän erotuskyvyn sijasta.
Syvyysterävyys<br />
(Depth of field)<br />
Syvyysterävyys voidaan laskea kaavasta<br />
d1<br />
1.22<br />
h <br />
tan NAtan<br />
Hyvää syvyysterävyyttä ja hyvää erotuskykyä ei voida saavuttaa<br />
samanaikaisesti.
Syvyysterävyys<br />
(Depth of field)
Erotuskyky vs kontrasti
Palloaberraatio<br />
Kromaattinen aberraatio<br />
Astigmatismi<br />
Linssivirheet<br />
sin <br />
sin
Linssivirheet<br />
Lisätietoa optisesta aberraatiosta:<br />
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/lightandcolor/lenseshome.html
Kohtisuora valaistus<br />
brightness of image<br />
Vinokenttävalaistus,<br />
vinoilluminointi
Läpinäkymätön Mo-pinta,<br />
heijastunut valo<br />
Läpinäkyvä näyte, sironnut valo<br />
dark-field<br />
illumination<br />
oblique<br />
illumination<br />
bright-field<br />
illumination<br />
Pimeäkenttävalaistus<br />
Läpinäkyvä näyte:
Kemiallinen syövytys poistaa matriaalia<br />
pinnalta eri tavoin riippuen pinnan<br />
orientaatiosta ja faasien koostumuksesta.<br />
Syövytyksen avulla saadaan näytteestä<br />
näkyviin uusia yksityiskohtia.<br />
Syövytys
Valoa läpäisemätön näyte<br />
Polarisoitu valo<br />
Optisella mikroskoopilla otettu kuva<br />
Cd pinnasta.<br />
Kuva on otettu käyttäen polarisoitua valoa.
Värit saadaan näkyviin vain tasopolarisoidun valon avulla.<br />
Värit muuttuvat valon aallonpituuden ja intensiteetin muuttuessa.<br />
Johtuu tiettyjen aallonpituuksien absorboitumisesta<br />
Pleokroismi: eri aallonpituudet absorboituvat eri tavoin eri<br />
kidesuunnissa. Tämä voidaan havaita kääntämällä näytettä.<br />
Läpinäkyvä näyte, läpivalaisu:<br />
hbl<br />
plag<br />
Polarisoitu valo<br />
näytteen kierto 90 astetta <br />
plag<br />
hbl
Unpolarized light<br />
1. polarizer<br />
Plane polarized<br />
light<br />
Ei näytettä: valo ei läpäise kahta polarisaattoria,<br />
joiden polarisaatiotasot ovat toisiinsa nähden 90<br />
asteen kulmassa<br />
ei kuvaa.<br />
Anisotrooppinen näyte: muuttaa valon<br />
polarisaatiotasoa, jolloin valo läpäisee toisen<br />
polarisaattorin. Efekti riippuu valon aallonpituudesta.<br />
muodostuu värikuva<br />
Polarisoitu valo<br />
läpinäkyvä näyte<br />
analyzer<br />
(2. polarizer)<br />
Polarization plane<br />
rotated by sample<br />
Image
Vaihekontrasti<strong>mikroskopia</strong><br />
Vaihekontrastimenetelmällä voidaan<br />
värjäämättömien biologisten näytteiden<br />
(vaiheobjektit) kontrastia parantaa ilman, että<br />
resoluutio heikkenee merkittävästi.<br />
Vaiheobjekteista taipuvat säteet kokevat ¼<br />
aallonpituuden vaihesiirron, mutta suoraan läpi<br />
menevät säteet säilyvät muuttumattomina.<br />
Vaihekontrastimenetelmässä suoraan<br />
meneville säteille aiheutetaan lisäksi -¼<br />
aallonpituuden vaihesiirros, jolloin kuvatasossa<br />
nähdään objektin yksityiskohdat tummina<br />
valaistua taustaa vasten.<br />
As light travels through a sample, interaction with this medium causes its amplitude and phase to change in a way<br />
which depends on properties of the medium. Changes in amplitude = absorption of light, which gives rise to colours<br />
when it is wavelength dependent. The changes in phase are not directly observed by human eye, yet often these<br />
changes in phase carry a large amount of information.<br />
The phase variations introduced by the sample are preserved by the optical microscope, this information is lost in<br />
the process which measures the light. In order to make phase variations observable, it is necessary to combine the<br />
light passing through the sample with a reference so that the resulting interference reveals the phase structure of the<br />
sample.<br />
In optical microscopy many objects such as cell parts in protozoans, bacteria and sperm tails are essentially fully<br />
transparent unless stained (and therefore killed). The difference in densities and composition within these objects<br />
however often give rise to changes in the phase of light passing through them, hence they are sometimes called<br />
"phase objects". Using the phase-contrast technique makes these structures visible and allows their study with the<br />
specimen still alive.
Change language